CN107828808A

CN107828808A - 芍药tdc基因及其植物表达载体和应用

Info

Publication number: CN107828808A
Application number: CN201711121625.3A
Authority: CN
Inventors: 陶俊; 王荣; 刘定; 赵大球; 孙静
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2018-03-23

Abstract

本发明属于园艺栽培领域，具体涉及一种芍药TDC基因及其植物表达载体和应用。所述芍药TDC基因PlTDC，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明进一步公开了带有该基因的植物表达载体。本发明提供的芍药PlTDC是一个新的抗逆基因，该基因可提高植物的褪黑素积累水平，从而提高植物抗逆性。本发明构建的芍药‘紫凤羽’PlTDC基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，提高植物的褪黑素积累、创制抗逆性强的新种质。

Description

芍药TDC基因及其植物表达载体和应用

技术领域

本发明属于园艺栽培领域，具体涉及一种芍药TDC基因序列及其植物表达载体和应用。

背景技术

褪黑素是一种重要的吲哚胺化合物，广泛存在于几乎所有的生物体中。在动物中，褪黑素在调节昼夜节律，提高免疫力，抗衰老和抗癌等方面具有重要的功能。自1995年在植物中第一次检测到，褪黑激素已在许多植物物种中被发现，现在被认为是一种重要的能促进健康的天然物质，因为它在延缓衰老和抗氧化活性方面具有重要作用。此外，褪黑素在植物发育中起着关键作用，包括种子发芽、根系生长、开花、叶片衰老，以及植物抗逆性，例如提高耐热性和耐干旱性、耐盐性，减轻重金属的损害，保护植物免受紫外线辐射，改善它们抵御病原体感染的防御等。

目前在植物中褪黑素的合成路径已经研究的相当透彻，第一步反应色氨酸脱羧酶(TDC)催化色氨酸生成色胺，然后经过色胺5-羟化酶(T5H)催化生成5-羟色胺，又经5-羟色胺-N-乙酰转移酶(AANAT)生成N-乙酰-5-羟色胺，最后N-乙酰-5-羟色胺经羟基吲哚氧甲基转移酶(HIOMT)催化合成褪黑素。在这些酶中，TDC酶被认为是褪黑素合成过程中的第一个限速酶，它与褪黑素的合成密切相关，研究表明，过表达TDC基因可以提高5-羟色胺的含量，从而提高褪黑素的产量^[5]。然而，这些研究在药用植物和食品植物中得到了广泛的应用，而在观赏植物体内，关于TDC对褪黑素生物合成以及对植物抗逆性提高方面的意义仍然有待确定，并且少有文献报道使用转基因的方法来验证TDC基因的功能，同时转基因植物的其他性能也尚未得到系统的研究。

芍药为芍药科芍药属多年生宿根草本花卉，是我国的传统名花，被誉为“花中宰相”，距今已有4000多年的栽培历史。因其花大色浓，花型丰富，品种繁多，观赏价值极高，备受喜爱，被广泛应用于城市绿化、庭院、专类园等露地栽培中进行观赏。在我们前期试验中，我们在芍药花、叶、根中检测出了褪黑素，但对芍药中褪黑素的生物合成规律及其潜在的分子机制知之甚少，TDC基因的功能也有待研究。

在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将芍药TDC基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有强抗逆性的新种质，对于优良植物新品种的培育及在生产中的广泛应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提高植物的抗逆性，提供一个新的芍药‘紫凤羽’抗逆基因PlTDC及其植物表达载体和应用。

本发明采用的技术方案是：

芍药‘紫凤羽’抗逆基因PlTDC，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

芍药‘紫凤羽’抗逆基因PlTDC的植物表达载体，由本发明所述的芍药‘紫凤羽’抗逆基因PlTDC与中间植物表达载体pCAMBIA1301构成。

芍药‘紫凤羽’抗逆基因PlTDC植物表达载体，其构建方法如下：

(1)芍药‘紫凤羽’抗逆PlTDC的克隆：以芍药‘紫凤羽’盛开期花瓣为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计3′扩增引物3′RACE Outer PCR引物：5′-GTAGCAAACGATTATGGAG-3′(SEQ ID NO.2)和3′RACE Inner PCR引物：5′-GTTACTTGGATTGCTGTTG-3′(SEQ ID NO.3)以及5′扩增引物5′-GTTTCCGTGTCACCCAACTCAGAGCA-3′(SEQ ID NO.4)，进行PCR扩增。将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并回收，产物连接到pEASYTM-T5Zero Cloning Vector载体(北京全式金生物技术有限公司)，转化Trans-T1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆进行序列测定；

(2)植物表达载体pCAMBIA1301-PlTDC的构建：根据已经获得的TDC基因cDNA全长序列的基础之上，以芍药‘紫凤羽’cDNA为模板设计引物，进行PCR扩增，在PlTDC基因cDNA序列的上游和下游分别引入BamH I和Kpn I酶切位点，上游引物PlTDC-MF：5′-CGCGGATCCATGGGTAGTCTTGAAC-3′(SEQ ID NO.5)，下游引物PlTDC-MR：5′-GGGTACCCTAACACCCCTTGAGTAT-3′(SEQ ID NO.6)；PCR产物连接到pEASYTM-T5Zero CloningVector载体，转化Trans-T1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆、提取阳性质粒，BamH I和Kpn I双酶切的PlTDC片段与BamH I和Kpn I双酶切的pCAMBIA 1301连接、转化，提取阳性质粒，酶切，电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1301-PlTDC构建成功。

本发明还公开了所述芍药基因PlTDC在提高植物的抗逆性、创制抗逆新种质中的应用。

所构建的芍药基因PlTDC的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高植物褪黑素含量，从而提高植物抗性，创制抗逆新种质。方法如下：农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化；烟草叶片浸染及生根筛选；转基因植株检测及鉴定。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明提供的芍药‘紫凤羽’PlTDC是一个新的抗逆基因，该基因可提高植物的褪黑素积累水平，从而提高植物抗逆性。

2、本发明构建的芍药‘紫凤羽’PlTDC基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，提高植物的褪黑素积累、创制抗逆性强的新种质。

附图说明

图1琼脂糖凝胶电泳检测，图中：M1：DL2000；M2：DL15000；1：PlTDC基因的DNA序列扩增产物；2,3：PlTDC基因的cDNA序列扩增产物；4,5：pCAMBIA1301-PlTDC质粒双酶切产物。

图2植物表达载体pCAMBIA1301图谱。

图3转基因植株的鉴定，图中：A：野生型和转基因植株烟草表型；B：PCR鉴定；C：褪黑素含量积累水平；D：TDC相对表达量。WT:野生型植株；Line1，Line2，Line3：转基因植株。

图4干旱胁迫后烟草植株的表型及相关指标测定。图中：A：干旱胁迫后烟草植株的表型；B：DAB染色法观测H₂O₂积累水平；C：荧光探针法观测超氧阴离子积累水平；D：相对电导率；含水量；PSII原初光能转化效率；E：相关基因表达水平。WT:野生型植株；Line1，Line2：转基因植株。

图5高温胁迫后烟草植株的表型及相关指标测定。图中：A：干旱胁迫后烟草植株的表型；B：DAB染色法观测H₂O₂积累水平；C：荧光探针法观测超氧阴离子积累水平；D：相对电导率；含水量；PSII原初光能转化效率；E：相关基因表达水平。WT:野生型植株；Line1，Line2：转基因植株。

图6盐胁迫后烟草叶片的表型及相关指标测定。图中：A：不同盐浓度处理的烟草叶片表型；B：DAB染色法观测H₂O₂积累水平；C：荧光探针法观测超氧阴离子积累水平。

具体实施方式

实施例1.PlTDC的cDNA序列克隆

选用芍药‘紫凤羽’成熟期花瓣作为材料，参照MiniBEST Plant RNA ExtractionKit试剂盒(TaKaRa)说明书方法提取总RNA，取1μg总RNA反转录成cDNA。反转录体系：TotalRNA 1.0μL，3′RACE Adaptor(5μM)1.0μL，5×M-MLV Buffer 1.0μL，dNTP mixture(10mMeach)2μL，RNase Inhibitor(40U/μL)，Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(200U/μL)0.25μL，RNase Free ddH2O 4.5μL。反转录程序：42℃反应60min，70℃延伸15min。

以提取的叶片cDNA为模板，设计3′RACE Outer引物和3′RACE Inner引物进行PCR反应：3′RACE Outer PCR引物：5′-GTAGCAAACGATTATGGAG-3′(SEQ ID NO.2)，50μL反应体系：1×cDNA Dilution BufferⅡ8μL，Gene specific Outer Primer(10μM)2.0μL，3′RACEOuter引物2.0μL(10μM)，10×LA PCR BufferⅡ(Mg²⁺Plus)5.0μL，TaKaRa LA Taq(5U/μL)0.5μL，cDNA模板2.0μL,，ddH2O 30.5μL。反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，反应20个循环，72℃延伸10min。3′RACE Inner PCR引物：5′-GTTACTTGGATTGCTGTTG-3′(SEQ ID NO.3)，50μL反应体系：Outer PCR产物1.0μL，dNTPmixture(2.5mM each)8μL，10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Plus)5.0μL，Gene specific InnerPrimer(10μM)2.0μL，3′RACE Inner引物2.0μL，TaKaRa LA Taq(5U/μL)0.5μL，ddH2O31.5μL。反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min。将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并分离回收。

之后进行5′RACE PCR反应，反转录Ⅰ体系：RNA 1.0μL，5′-CDS Primer A 1.0μL，Sterile H2O 9.0μL，反应条件：72℃反应3min，42℃反应2min。反转录Ⅱ体系：上述反应液11μL，5×First-Strand Buffer 4.0μL，DTT(100mM)0.5μL，dNTP Mix(20mM)1.0μL，SMARTerⅡA oligonucleotide 1.0μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，SMARTScribe ReverseTranscriptase 2.0μL。反应程序：42℃反应90min，70℃反应10min。然后用50～70μLTricine-EDTA Buffer常温稀释cDNA 15min，反应液立即进行下一步实验。以cDNA为模板，设计5′RACE引物：5′-GTTTCCGTGTCACCCAACTCAGAGCA-3′(SEQ ID NO.4)，Clontech PCR反应体系：PCR-Grade Water 15.5μL，2×SeqAmp Buffer 25.0μL，SeqAmp DNA polymerase1.0μL，5'-RACE-Ready cDNA 2.5μL，10×UPM 5.0μL，5′-RACE TFR引物(10μM)1.0μL。反应程序：94℃变性30sec，72℃延伸3min，反应5个循环，94℃变性30sec，70℃反应30sec，72℃延伸3min，反应5个循环，94℃变性30sec，68℃反应30sec，72℃延伸3min，反应25个循环。PCR结束后使用1％的琼脂糖电泳检测，产物使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0凝胶回收试剂盒(TaKaRa)回收纯化，产物连接到pEASYTM-T5ZeroCloning Vector载体(Trans)，转化Trans-T1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆进行测序，序列测定为SEQ ID NO.1。

实施例2.植物表达载体pCAMBIA1301-PlTDC的构建

设计引物PlTDC-MF、PlTDC-MR进行PCR反应，在PlTDC cDNA序列的上游和下游分别引入酶切位点BamH I和Kpn I，PCR产物连接到pEASY^TM-T5Zero Cloning Vector载体，转化Trans-T₁感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆、提取阳性质粒，BamH I和Kpn I双酶切的PlTDC片段与BamH I和Kpn I双酶切的pCAMBIA1301连接、转化，提取阳性质粒，酶切，电泳检测并测序验证，具体步骤如下：上游引物PlTDC-MF：5′-CGCGGATCCATGGGTAGTCTTGAAC-3′(SEQ ID NO.5)，下游引物PlTDC-MR：5′-GGGTACCCTAACACCCCTTGAGTAT-3′(SEQ ID NO.6)。(1)根据已经获得的TDC基因cDNA全长序列的基础之上，以芍药‘紫凤羽’叶片cDNA作为模板，设计引物PlTDC-CF：5′-GTTGGGTGACACGGAAAC-3′(SEQ ID NO.7)和PlTDC-CR：5′-GACCGCAAATCTCAGCAT-3′(SEQ IDNO.8)进行PCR反应，25μL反应体系：10×LA PCR BufferⅡ(Mg²⁺Plus)2.5μL，PlTDC-CF、PlTDC-CR引物各1.25μL(10mM)，dNTP mixture(2.5mM each)2.0μL，TaKaRa LA Taq(5U/μL)0.25μL，cDNA模板2.0μL，ddH₂O 15.75μL；反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性5sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，反应35个循环，72℃延伸10min；PCR产物使用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0凝胶回收试剂盒(TaKaRa)回收纯化。

(2)取表达载体pCAMBIA1301质粒和含酶切位点的PlTDC胶回收产物分别用BamH I和Kpn I双酶切，20μL双酶切反应体系：0.5×K Buffer 2.0μL，质粒pCAMBIA1301或PlTDC胶回收产物10μL，BamH I 1.0μL，Kpn I 1.0μL，ddH₂O 6.0μL；37℃反应1.5h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0凝胶回收试剂盒(TaKaRa)回收纯化质粒pCAMBIA1301大片段和PlTDC大片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，20μL连接反应体系：10×T4ligase Buffer 1.0μL，T4DNAligase 1.0μL，pCAMBIA1301大片段1.0μL，PlTDC大片段10μL，ddH₂O 7μL；22℃室温连接15min后65℃水浴10min，取5μL连接产物转化Trans-T1感受态细胞，而后在附加0.05％卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA1301-PlTDC，对质粒进行双酶切(图2)，并测序验证。植物表达载体pCAMBIA1301-PlTDC构建成功。

实施例3.植物表达载体pCAMBIA1301-PlTDC遗传转化烟草及其抗逆能力鉴定

(一)农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化

从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于5mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃、200rpm培养至OD600值0.5，而后冰浴菌液30min，转至预冷的50mL离心管中，4℃、5000rpm、离心10min收集菌体，悬浮于10mL预冷的50mM CaCl₂(不含甘油)溶液中，4℃、5000rpm、离心10min，弃上清。悬浮于2.0mL预冷50mM CaCl₂(15％甘油)溶液中菌体即为感受态细胞，混匀后以100μL/管分装在1.5mL灭菌离心管中，液氮冷冻后-80℃保存待用。

取5μL表达载体质粒，加入100μL EHA105感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃热击5min，加入800μL无抗生素YEB液体培养基，28℃、200rpm预培养5h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆PCR检测，选取阳性克隆摇菌，用于烟草叶片转化。

(二)烟草叶片遗传转化与筛选

挑取农杆菌EHA 105单菌落于YEB液体培养基中(Rif 50mg/L，Kan 50mg/L)，28℃，200rpm培养过夜。取所摇菌液2mL加入50mL含有相同抗生素的液体YEB中，在相同条件下培养至OD600＝0.3-0.4。将摇好的菌倒入50mL离心管中，室温5000rpm，10min，弃上清备用。先在灭菌后的小三角瓶中加入400μL AS(乙酰丁香酮20mg/mL)，向离心管中加入5mL MS(MS液体基本培养基，不调pH，不加琼脂、蔗糖)将溶解菌体，用枪打匀，倒入加有400μL AS的小三角瓶中，然后加MS至50mL。向另一个灭菌小三角瓶中加入50mL MS(MS液体基本培养基，不调pH，不加琼脂、蔗糖)备用。取烟草的无菌苗叶片，切成小块(约1cm×1cm)，放入50mL加有MS小三角瓶中，共切100-150片叶片放入瓶中，将叶片倒入覆有纱布的烧杯，取经过滤后的叶片加入50mL MS+AS的小三瓶中，侵染8min，侵染时不断轻轻摇动；侵染完成后，滤去菌液，取出叶片，用无菌滤纸吸干叶片表面多余的菌液，接种于共培养培养基[MS+6-BA(6-苄基腺嘌呤)(3.0mg/L)+NAA(α-萘乙酸)(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+6.66％琼脂]中，暗培养3d；共培养结束后，转入抗性芽筛选分化培养基[MS+6-BA(3.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+6.66％琼脂+Cb(羧苄青霉素)(100mg/L)+Hyg(潮霉素B)(25mg/L)]中进行选择培养，两周继代一次，直到分化出芽；当分生不定芽达2cm以上时，切下不定芽，转入生根筛选培养基[1/2MS+IBA(吲哚-3-丁酸)(0.3mg/L)+蔗糖(30g/L)+6.66％琼脂+Cb(50mg/L)+Hyg(8mg/L)]进行生根筛选。

(三)转基因植株鉴定及抗逆性能力评价

(1)转基因植株鉴定：

①PCR鉴定：采集烟草叶片为材料，参照RNAiso Plus(Total RNA提取)试剂盒(TaKaRa)说明书方法提取总RNA，按照PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser试剂盒(TaKaRa)取1.0μg总RNA反转录成cDNA。将反转录所得的cDNA进行PCR扩增、电泳检测，以烟草Actin为内参基因，设计引物为：上游引物AtActin-F：5′-ACTGCTGAACGGGAAATT-3′(SEQ ID NO.9)，下游引物AtActin-R：5′-ATGGCTGGAACAGGACTT-3′(SEQ ID NO.10)；PlTDC扩增的上游引物PlTDC-CF：5′-GTTGGGTGACACGGAAAC-3′(SEQ IDNO.11)，下游引物PlTDC-CR：5′-GACCGCAAATCTCAGCAT-3′(SEQ ID NO.12)；25μL反应体系：10×RCR Buffer(Mg2+Plus)2.5μL，上游引物、下游引物各1.25μL(10mM)，dNTP mixture(2.5mM each)2.0μL，LA 高保真酶0.25μL，cDNA模板2.0μL，ddH2O 15.75μL；反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应35个循环，72℃延伸10min；使用1％琼脂糖凝胶电泳检测。从图4B中可以看出，野生型烟草植株中未扩增出PlTDC片段，而转PlTDC植株中能扩增出1条清晰明亮的条带，再次表明表达载体pCAMBIA1301-PlTDC已成功导入烟草。

(2)植株抗逆性能力评价：

①植株表型：

干旱胁迫：将经PCR鉴定成功的转基因苗置于22℃，10h光照/14h黑暗条件下干旱胁迫18d，而后观察植株的生长情况。图4为植株在干旱胁迫后的生长情况，野生型烟草植株的叶片出现了失水、萎蔫的干旱伤害症状，而转PlTDC植株的叶片表现良好，并未出现上述的干旱伤害症状。

高温胁迫：将经PCR鉴定成功的转基因苗置于42℃高温条件下胁迫处理72h，而后观察植株的生长情况。图5为植株在高温胁迫后的生长情况，野生型烟草植株的叶片出现了黄化、卷缩的高温伤害症状，而转PlTDC植株的叶片表现良好，并未出现上述的高温伤害症状。盐胁迫：用打孔器从健康的野生型和转基因烟草植株中提取叶片，并放入0mm、200mm、400mm、600mm和800mm的NaCl溶液中36h，而后观察叶片形态。图6为叶片在盐胁迫后的情况，野生型烟草叶片颜色变深，800mm NaCl溶液中叶片完全变成深褐色，而转PlTDC叶片褐色面积较少，表现出更强的耐盐能力。

②PlTDC基因表达水平

以烟草的叶片为材料，参照RNAiso Plus(Total RNA提取)试剂盒(TaKaRa)说明书方法提取总RNA，按照PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)取1.0μg总RNA反转录成cDNA。将反转录所得的cDNA按照 Tip GreenqPCR SuperMix试剂盒(Trans)进行qRT-PCR检测，以烟草Actin为内参基因，设计引物为：上游引物AtActin-F：5′-ACTGCTGAACGGGAAATT-3′(SEQ ID NO.9)；下游引物AtActin-R：5′-ATGGCTGGAACAGGACTT-3′(SEQ ID NO.10)；设计PlTDC基因引物为：上游引物PlTDC-QF：5′-GTTGGGTGACACGGAAAC-3′(SEQ ID NO.11)；下游引物PlTDC-QR：5′-GACCGCAAATCTCAGCAT-3′(SEQ ID NO.12)；25μL反应体系： Tip Green qPCR 12.5μL，cDNA模板2.0μL，上游引物、下游引物各1.0μL(10mM)，ddH2O 8.5μL；反应程序：94℃预变性30sec，然后94℃变性5sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应45个循环，溶解曲线65℃-95℃，每5sec升温0.5℃；采用公式2^-△△CT法计算基因的相对表达量。从图3D中可以看出，PlTDC在野生型烟草植株中的表达水平与转PlTDC植株相差较大，转PlTDC植株的表达水平显著高于野生型。

③相关基因的表达水平

以烟草的叶片为材料，参照RNAiso Plus(Total RNA提取)试剂盒(TaKaRa)说明书方法提取总RNA，按照PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)取1.0μg总RNA 反转录成cDNA。将反转录所得的cDNA按照 Tip GreenqPCR SuperMix试剂盒(Trans)进行qRT-PCR检测，以烟草Actin为内参基因，检测保护酶相关基因Cu/ZnSOD，POD，CAT，APX和衰老相关基因SAG，HIN1，CP1，CP2相对表达量。使用Primer5.0设计基因的特异型引物，分别是Cu/ZnSOD-F：5′-CACTTCACTCTTCTTTCCACG-3′(SEQ IDNO.13)，Cu/ZnSOD-R：5′-TGACAACGCCCTCAACAT-3′(SEQ ID NO.14)；POD-F：5′-TCGTATTTCTCCAACCTCA-3′(SEQ ID NO.15)，POD-R：5′-CCGAATGTCAATCCAAGT-3′(SEQ IDNO.16)；CAT-F：5′-CCTCGTGGTTTTGCTGTC-3′(SEQ ID NO.17)，CAT-R：5′-GGATTTAGGATTTGGCTTCA-3′(SEQ ID NO.18)；APX-F:5′-GATGTTCCCTTTCACCCT-3′(SEQ IDNO.19)，APX-R：5′-TCAGATAGACCCATTTGCTT-3′(SEQ ID NO.20)；SAG-F：5′-TCTGCTTTCGTCGTTGAT-3′(SEQ ID NO.21)，SAG-R：5′-GATTCTTCCCCACCTTTC-3′(SEQ IDNO.22)；HIN1-F：5′-TAGAAACCCCAACAAACG-3′(SEQ ID NO.23)，HIN1-R：5′-CTCCCAATAAAACCAAGC-3′(SEQ ID NO.24)；CP1-F：5′-GCCTCACAACAGAAGTAA-3′(SEQ IDNO.25)，CP1-R：5′-AATAGAGCCTTCTCACTG-3′(SEQ ID NO.26)；CP2-F：5′-CATACATGGCTGAAGGTG-3′(SEQ ID NO.27)，CP2-R：5′-ACAGGCTGGTTGGCTACT-3′(SEQ IDNO.28)。25μL反应体系： Tip Green qPCR 12.5μL，cDNA模板2.0μL，上游引物、下游引物各1.0μL(10mM)，ddH2O 8.5μL；反应程序：94℃预变性30sec，然后94℃变性5sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应45个循环，溶解曲线65℃-95℃，每5sec升温0.5℃；采用公式2^-△△CT法计算基因的相对表达量。从图4E和5E中可以看出，在高温和干旱胁迫下，保护酶相关基因在转PlTDC植株中的表达水平显著高于野生型烟草植株，而衰老相关基因在转PlTDC植株的表达水平显著低于野生型。

④其他生理指标

褪黑素的测定参照ELISA植物褪黑素试剂盒(PT10982)说明书进行。将烟草样品加液氮用研钵研磨均匀，称取0.1g样品冻干粉，置于1.5mL离心管中，加入1mL磷酸缓冲溶液(含5％甲醇，pH＝7.2)，摇晃均匀。将样品置于冰上，使用超声波细胞破碎仪100W(VCX-130,Sonics,美国)，超声30s，随后样品匀浆在4℃下10000g离心10min，取上清备用。随后，根据ELISA试剂盒(上海桥杜生物技术有限公司)测定褪黑素含量，使用SpectraMax M5读卡器(Molecular Devices Corporation,美国)读取OD值。

测定相对电导率时，称取1g叶片用含有适量蒸馏水的注射器抽真空至叶片沉底后加入试管中，试管中蒸馏水总体积20mL，常温下放置3h后采用电导率仪(雷磁DDS-307A，中国)测定电导率E1，同时测定蒸馏水(空白)的电导率E0；然后将试管封口后于沸水浴中煮沸30min，冷却后再测量电导率E2，按下列公式计算叶片相对电导率：相对电导率(％)＝(E1-E0)/(E2-E0)×100％。从图4D、图5D中可以看出，高温胁迫和干旱胁迫下的野生型烟草植株的相对电导率显著高于转PlTDC植株。

测定含水量时，取烟草叶片迅速称量鲜重Wf，将材料放入一信封内放入烘箱中，在105℃下杀青30min，然后将温度调到80℃烘至恒重，称取其干重Wd。自然含水量WC＝Wf-Wd/Wf×100％。

利用叶绿素荧光光谱仪测定叶绿素荧光参数(Heinz Walz GmbH91090Effeltrich，德国)。

采用DAB染色法观测高温、干旱、盐胁迫下H2O2的积累水平，将叶片浸没在使用50mM Tris-醋酸盐缓冲液(pH5.0)配成的0.1mg/mL的DAB染色液中，在黑暗条件下25℃放置24h，而后在95％的酒精中煮15min再进行拍照；另一方面，参照活体细胞氧化应激活性氧(ROS)原位染色试剂盒(超氧阴离子)(上海哈灵)说明书方法观测超氧阴离子的积累水平。从图4、图5、图6中可以看出，野生型烟草植株的DAB染色程度和ROS的荧光信号均较强，H₂O₂和超氧阴离子积累水平均显著高于转PlTDC植株。

综上所述，本发明构建了含有芍药抗逆基因PlTDC的植物表达载体pCAMBIA1301-PlTDC，其中PlTDC基因的DNA序列为首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高烟草植株褪黑素的积累，从而提高在高温、干旱、盐胁迫下的生长势。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 芍药TDC基因及其植物表达载体和应用

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1849

<212> DNA

<213> 芍药

<400> 1

acatgggatt atctttttac aaaaacaatt tcttactaaa acttctacat atcatgggta 60

gtcttgaaca tcccaactcc gctcccgcag atcctccttc ctctgttcca gaattcaacc 120

cattagatcc agaagaattc cgtaaacaag ctcatcaaat ggtggacttc attgccgatt 180

actataagaa tatcgagagt tacccagttt tgagccaagt tcaacctggt tatcttcgtg 240

ctcgcctccc ggaaactgca ccttaccggc ccgaatcttt tgacaccatt ctgaacgacg 300

tgaggaatga tatcattcct gggatgacgc attggttgag ccctaatttc tttgcattct 360

tcccggcgac ggtgagctcg gcggcgtttg tgggtgagat gctatgtacg gcttttaact 420

cggtggggtt taattggctt gcgtccccgg cagcgacgga gttggagatg gttgtcatgg 480

attggttagc taatatgctt aagctaccta aaatcttcat gttttcagga tcaggcggtg 540

gagtcataca aaacacaaca agcgaatcaa tactcgtgac acttatcgcg gcgagagatc 600

gatcactcaa caccatcgga tcagataaga taagcaaact cgtcgtctac agttcagatc 660

aaactcattc aacgttcaaa aaggcatgca aaattgctgg catattcccc tgcaacatca 720

gaacgatacc cacaacggtc gacacccatt tcgcgctgtc tccggtcctc ctccgcatga 780

ccatggaagc tgacgtgtca tctggatata tcccacttta tctctgtgca acggtcggga 840

caacttcaac cacgtccgta gatcctttac agagcctcgc tgacgtagca aacgattatg 900

gagtgtggtt gcacgtggac gctgcttacg gtggtaatgc gtgtatatgt cccgagtttc 960

gtcacttttt ggttgggatc gaacgagctg actcactcag tttgagccca cacaaatggt 1020

tattaagtta cttggattgc tgttgcttgt gggtgaagag accggatttg ttagtgaagg 1080

cattgagtac gaacccggag tatttgaaaa acaaaccgag tgagtcggac tcggtggtgg 1140

actacaaaga ttggcaggtg ggcacgggtc gaaaatttaa ggcggtgaga ctttggttcg 1200

ttttgcggag ttacgggatt acgaacctcc agagtcatat ccgatcggac gttcgaatgg 1260

cgaagatgtt tgaagggttt gtgagatccg acccgcggtt cgaaattgtg gttccgaggc 1320

tgttttcatt ggtgtgtttt cggctgactc gatgtgtgtg ctctgagttg ggtgacacgg 1380

aaacgatgaa tcggaagtta ctcgagtggg tgaacttaac tggacaggtt tatatgacgc 1440

acacgatagt tggtgggatg tacatgctga gatttgcggt cgggaccacc ctcacggaag 1500

agcgacacgt cattgcagcg tgggagttga taagaggagg agtagataaa atactcaagg 1560

ggtgttagta gttcgaattt gtttgatttt tgaacaagct caaaattgat tgattattgt 1620

tttgagtttt ttcatataaa gctttttgag tgggatacag tcaaaggaat tctaaggaat 1680

tcctctactc ttaaatagac tattaataag ggattgaatg gtaaataacc cgagccatgg 1740

gttttaaccc ttaaataatt ggctttaatg tgagtttagt ataaagggca tccgtaatga 1800

ttctgtataa ttgatcctgt atgtgagtga tattggggaa aaaaaaaaa 1849

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtagcaaacg attatggag 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttacttgga ttgctgttg 19

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtttccgtgt cacccaactc agagca 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatcca tgggtagtct tgaac 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gggtacccta acaccccttg agtat 25

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gttgggtgac acggaaac 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaccgcaaat ctcagcat 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

actgctgaac gggaaatt 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggctggaa caggactt 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gttgggtgac acggaaac 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaccgcaaat ctcagcat 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cacttcactc ttctttccac g 21

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgacaacgcc ctcaacat 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcgtatttct ccaacctca 19

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccgaatgtca atccaagt 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cctcgtggtt ttgctgtc 18

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggatttagga tttggcttca 20

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gatgttccct ttcaccct 18

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcagatagac ccatttgctt 20

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tctgctttcg tcgttgat 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gattcttccc cacctttc 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tagaaacccc aacaaacg 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ctcccaataa aaccaagc 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcctcacaac agaagtaa 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aatagagcct tctcactg 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

catacatggc tgaaggtg 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

acaggctggt tggctact 18

Claims

1.芍药TDC基因PlTDC，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.带有芍药TDC基因PlTDC的植物表达载体，其特征在于，由序列如SEQ ID NO.1的的芍药抗逆基因PlTDC与中间植物表达载体pCAMBIA1301构成。

3.权利要求1所述的芍药TDC基因PlTDC在提高植物的抗逆性、创制抗逆新种质中的应用。