CN113862297A - 花青素生物合成的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了花青素生物合成的组合物和方法。本发明利用植物花青素生物合成途径中的酶类基因DFR、LDOX、UFGT构建了花青素生物合成的载体以及含有该载体的宿主细胞，并将所述载体及宿主细胞用于花青素生物合成，为现有技术提供了一种不同的花青素生物合成方法。进一步地，通过DFR的不同底物的添加，本领域技术人员可获得不同颜色的花青素。

Description

花青素生物合成的组合物和方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及利用植物愈伤细胞进行花青素生物合成的组合物和方法。

背景技术

花青素是一类在植物中广泛存在的次级代谢产物，属于黄酮类物质。花青素赋予植物缤纷的色彩，在植物发育过程中，具有使植物免受紫外辐射、抗病原菌侵染等重要生理作用。同时，花青素在治疗心脏病和癌症，清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面具有重要疗效。因其呈色性能好、健康、安全，已被广泛地应用于食品、化妆品和医药等各个行业，更是植物界研究的热点领域。

目前，花青素的制备有多种方法。由于花青素广泛存在于苹果、葡萄、玉米、蓝莓和拟南芥等植物中，最直接的方式是通过物理或化学手段从植物中提取花青素。Blackhall等从新鲜的樱桃中提取花青素，确定了最佳的提取时间和温度分别为90min和37℃，使用100％酸化溶剂按液固比10:1(mL：g)进行提取时，得到的花青素产率最高(Blackhall ML,Berry R,Davies NW,Walls JT.Optimized extraction of anthocyanins from ReidFruits'Prunus avium'Lapins'cherries.Food Chem.2018Aug 1；256:280-285.)虽然从植物中可以提取得到花青素，但是直接提取受到季节、地域和植物生长的限制，如果需要用于大规模生产还要考虑其他的获取方式。

随着近几年的深入研究，逐渐明确了花青素在植物中的合成途径并确定了花青素合成的关键酶基因，这使得通过微生物合成的方式获得花青素成为可能，Solopova等使用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)作为新型宿主，以绿茶为底物生产具有高价值的花青素，结果表明除了预期的红紫色化合物——矢车菊色素和飞燕草色素外，由乳酸乳球菌以绿茶为底物产生了具有甲基化的橙色和黄色吡喃花青素(Solopova A,Tilburg A,FoitoA,et al.Engineering Lactococcus lactis for the production of unusualanthocyanins using tea as substrate[J].Metabolic Engineering,2019,54:160-169.)。利用微生物合成花青素解决了从植物中提取的诸多限制，但花青素在微生物中的合成通路、产量、有害副产物等问题仍需做进一步研究。

相较之下，通过植物细胞培养来生产花青素具有生产周期短、受自然环境影响小、目标物易于提取和纯化、天然无污染等优点。赵文佳通过试验选出了一株独特、新颖的青钱柳红色愈伤系，研究了其形态、生长和代谢方面的特性，并建立了红色细胞悬浮培养体系，用于花青素的生产(赵文佳.利青钱柳红色愈伤组织的诱导和筛选及细胞悬浮培养生产花青素[D].江西农业大学,2020.)。中国专利CN 107142276B公开了一种在作物种子胚乳合成花青素的转基因育种方法，通过在作物中转入包含6个表达结构蛋白的基因和2个表达转录因子的基因组合，获得种子胚乳为紫色的、合成花青素的转基因作物。中国专利CN105039360B公开了柑橘八氢番茄红素合成酶基因用于提高草莓花青素含量以及利用所述柑橘八氢番茄红素合成酶基因提高草莓花青素含量的方法。但现有技术中，仍然缺少可控性强、操作简单、纯度高的花青素生物合成方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了花青素生物合成的组合物和方法。

本发明利用植物花青素生物合成途径中的部分酶来构建高效的表达载体，将花青素合成所需的酶基因转入水稻愈伤组织中，通过植物愈伤细胞的培养获得花青素。

图1是植物中常见花色素苷生物合成途径(刘娟,冯群芳,张杰.二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)与花色的修饰[J].植物生理学报,2005,41(006):715-719.)，该途径内的不同酶类具有一定的时空表达特异性。经过多次试验证明，向植物中转入合成途径中的酶类DFR、ANS、3GT可能是本发明中较好的花青素生物合成路线选择。其中虚线方框内的路径为葡萄中花青素的合成路径，葡萄中与上述酶类对应的基因为：DFR、LODX、UFGT。

植物中花色素种类繁多，提供了各种颜色的选择空间，图1中，经过DFR催化的三种不同的反应底物二氢杨梅黄酮(DHM)、二氢槲皮素(DHQ)或二氢堪非醇(DHK)使愈伤组织最终呈现不同的颜色。本领域技术人员可根据野生型植物愈伤组织的本底颜色，选择不同的DFR催化底物，以获得不同颜色的花青素。

在一方面，本发明提供一种花青素生物合成的载体，所述载体包含DFR、LDOX、UFGT基因，所述DFR的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDOX的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述UFGT的的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

根据密码子的简并性，针对某一基因，本领域技术人员可以设计出多种可编码该基因的序列。本领域技术人员可根据转基因植物的密码子偏好性对某一基因序列进行优化。在某些实施方式中，为实现DFR、LDOX、UFGT基因在植物花青素合成途径中的作用，其编码序列分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所记载的序列至少具有大约60％的相似性、大约65％的相似性、大约70％的相似性、大约75％的相似性、大约80％的相似性、大约85％的相似性、大约90％的相似性或大约95％的相似性、大约96％的相似性、大约97％的相似性、大约98％的相似性、大约99％的相似性。

在某些实施方式中，所述载体还包括其他标记基因，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。

在某些实施方式中，所述载体可用于双子叶植物或单子叶植物的花青素生物合成。优选的植物物种包括：烟草、水稻等，特别优选的植物物种为水稻。在某些实施方式中，所述植物为水稻。

在另一方面，本发明提供一种含有所述花青素生物合成载体的宿主细胞，宿主细胞可选自大肠杆菌、农杆菌、植物细胞等可供所述载体复制或表达的细胞。

在某些实施方式中，所述的DFR、LDOX、UFGT基因可以分别位于2个或3个载体中，也可以位于同一个载体中，包含DFR、LDOX、UFGT基因的载体共存于所述宿主细胞中。在某些实施方式中，DFR、LDOX、UFGT基因分别位于2个不同载体中。

在某些实施方式中，所述宿主细胞用于双子叶植物或单子叶植物的花青素生物合成。在某些实施方式中，所述植物为水稻。

在另一方面，本发明提供一种花青素生物合成的方法，所述方法包括以下步骤：

1)构建含有如权利要求1所述的DFR、LDOX、UFGT基因的载体；

2)将步骤1)构建的载体转入植物愈伤组织中，获得含有DFR、LDOX、UFGT的愈伤组织；

3)添加DFR基因编码的酶的底物；

4)挑选显色的愈伤组织。

在某些实施方式中，还增加如下步骤，将挑选出的愈伤组织，于去除所述酶底物的培养基中培养1-5天；挑选颜色褪去的愈伤组织颗粒。在某些实施方式中，进一步增加如下步骤，对颜色褪去的愈伤组织颗粒，重复上述步骤3)、4)，直到所有愈伤组织颗粒均全部完全显色。

在某些实施方式中，所述筛选转基因植物的方法中，所述载体还包括其他的标记基因，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。

在某些实施方式中，所述花青素生物合成的方法中，所述酶的底物为二氢杨梅黄酮、二氢槲皮素或二氢堪非醇。在某些实施方式中，所述酶的底物为二氢槲皮素。

在某些实施方式中，所述花青素生物合成的方法中，所述用于花青素生物合成的植物为双子叶植物或单子叶植物。在某些实施方式中，所述植物为水稻。

本发明利用花青素合成途径中部分酶基因构建了花青素生物合成的载体以及含有该载体的宿主细胞，并将所述载体及宿主细胞用于植物花青素生物合成，为现有技术提供了一种不同的花青素生物合成方法。进一步地，通过DFR不同底物的添加，本领域技术人员可获得不同颜色的花青素。

附图说明

图1为花色素苷生物合成途径。

图2为pGP1.2-DFR载体图谱。

图3为pGP1.1-DFR载体图谱。

图4为EcoRI和HindIII双酶切验证载体pGP1.1-DFR，M：1KB DNA maker；1，2：双酶切验证载体pGP1.1-DFR。

图5为pCS1511-gfp载体图谱。

图6为pCS1511-hptII载体图谱。

图7为不同浓度DHQ处理对水稻愈伤组织的影响。

图8为DHQ显色结果，A：第一次筛选；B：第二次筛选；C：第三次筛选；D：第四次筛选；E完全显色颗粒；F：局部显色颗粒。

图9为不同细胞的抽提物在不同pH值下的颜色变化。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明提供了花青素生物合成的载体，以及含有所述载体的宿主细胞。构建载体及载体进入宿主细胞等分子生物学操作方法在本领域公知的技术手册(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001)中可获得。

宿主细胞可选自大肠杆菌、农杆菌、植物细胞等可供所述载体复制或表达的细胞。

本发明提供了利用上述载体及宿主细胞进行花青素生物合成的方法。

在转基因植物中用于基因表达的遗传构建物典型地包括驱动一条或多条多聚核苷酸表达的启动子、终止子和/或检测遗传构建物在被转化植物中存在的选择性标记序列。

本发明所提供的花青素生物合成的载体至少包含3个花青素合成途径所需酶的基因表达盒。在本发明的实施例中，所述基因表达盒具体由花青素合成途径中的DFR基因的表达盒，花青素合成途径中的LDOX基因的表达盒所组成，以及花青素合成途径中的UFGT基因的表达盒所组成。所述花青素合成途径中的DFR基因序列如序列表中序列1所示；所述花青素合成途径中的LDOX基因序列如序列表中序列2所示；所述花青素合成途径中的UFGT基因序列如序列表中序列3所示。

所述花青素合成途径中的DFR基因的表达盒是一个含有所述DFR基因及该基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段：启动子、被该启动子启动的DFR基因和终止子；所述花青素合成途径中的LDOX基因的表达盒是一个含有所述LDOX基因及该基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段：启动子、被该启动子启动的LDOX基因和终止子。所述花青素合成途径中的UFGT基因的表达盒是一个含有所述UFGT基因及该基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段：启动子、被该启动子启动的UFGT基因和终止子。

适用于本发明构建物的启动子可为任何可以启动基因在植物中转录的启动子，如在大多数植物组织中有活性的组成型启动子，组成型植物启动子的例子包括CaMV35S启动子、胆脂碱合成酶启动子和章鱼碱合成酶启动子和来自于玉米的Ubi1启动子。

在植物转化遗传构建物中普遍使用的终止子包括，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)终止子或章鱼肉碱合成酶终止子、玉米(Zeamays)醇溶蛋白基因终止子、水稻(Oryzasativa)ADP葡糖焦磷酸化酶终止子和马铃薯(Solanumtuberosum)PI-II终止子。

在植物转化中普遍使用的选择性标记基因包括赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(phophotransferase)II基因(NPTII)、赋予壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因、赋予Ignite(AgrEvo)和Basta(Hoechst)抗性的phosphinothricin乙酰基转移酶(bar基因)和赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。

所述基因表达盒可通过各种基因转移方式导入双子叶植物和/或单子叶植物。所述基因转移方式包括但不限于：电击法(电穿孔法)、基因枪法(微弹轰击法)、激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法、多聚物介导法、花粉管通导法、农杆菌转化法等。在本发明的实施例中采用的具体方法为农杆菌转化法。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，在本发明的实施例中具体为水稻。

实施例

1.实验材料与试剂

1.1试验材料

pCambia1302载体、pUC19载体：来自于浙江大学农生环分析测试中心实验室，为商业化载体。

pGP1.1载体：pCambia1302载体经过少量酶切位点修改后获得；

pGP1.2载体：在pUC19载体上添加了目的基因启动子和终止信号的表达盒；

水稻愈伤组织来源于：粳稻日本晴诱导(由江苏省农科院赠予)；

用于基因转化的农杆菌为：根瘤农杆菌EHA105；

二氢槲皮素(DHQ)：购于南京朗泽生物科技有限公司，99％。

培养箱型号：智能人工气候箱DRX-450B(宁波海曙赛福实验仪器厂)

摇床型号：DHZ-DA(江苏太仓市实验设备厂)

脱色摇床：TS-1脱色摇床(海门市麒麟医用仪器厂)

1.2常规培养基及试剂配方

30％次氯酸钠溶液：量取300ml NaClO，用蒸馏水定容至1000ml。

100mM AS：称取294.3mg As(乙酰丁香酮)，15ml DMSO溶解，1ml分装，-20℃保存。

激素溶液配制方法：

激素	溶解方法	母液浓度
			KT	少量稀碱(1M NaOH)溶解后定容	1mg/ml
6-BA	稀碱(同上)或盐酸溶解，再用蒸馏水定容	1mg/ml
			NAA	碱溶解(1M NaOH)，再用蒸馏水定容	1mg/ml
2，4-D	少量稀碱或酒精溶解，再用蒸馏水定容	0.25mg/ml

N₆培养基大量元素母液(20倍)：

KNO<sub>3</sub>	56.6g/L
		CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	3.32g/L(相当于CaCl<sub>2</sub> 2.506g/L)
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.70g/L(相当于MgSO<sub>4</sub> 1.807g/L)
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	8.0g/L
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	9.26g/L

B₅微量元素母液(100倍)：

KI	0.0750g/L
		H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	0.30g/L
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	1.0g/L
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.2g/L
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.025g/L
		CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.0025g/L
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.0025g/L

B₅有机母液：

烟酸	1mg/ml
		盐酸吡哆醇(VB<sub>6</sub>)	1mg/ml
盐酸硫胺素(VB<sub>1</sub>)	10mg/ml
		肌醇	10mg/ml

铁盐(100倍)：

FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.78g/L
		Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O	3.73g/L

AA大量元素母液(10倍)：

KCl	29.5g/L
		CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	1.5g/L
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.5g/L
		NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	1.5g/L

粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(每升含量)：

N6大量	50ml	B5微量	10ml	铁盐	10ml
						烟酸	1ml	盐酸吡哆醇	1ml	盐酸硫胺素	1ml
肌醇	10ml	L-pro	2.8g	CH	0.3g
						2，4-D	8ml	蔗糖	30g	Phytagel	4.5g
PH值	5.8

粳稻愈伤组织继代培养基(每升含量)：

N6大量	50ml	B5微量	10ml	铁盐	10ml
						烟酸	1ml	盐酸吡哆醇	1ml	盐酸硫胺素	1ml
肌醇	10ml	L-Glu	0.5g	L-pro	0.5g
						CH	0.3g	2，4-D	2ml
蔗糖	30g	Phytagel	4.5g	PH值	5.8

粳稻共培养培养基(每升含量)：

选择培养基每升含量：

粳稻分化培养基配方(每升含量)：

N6大量	50ml	B5微量	10ml	铁盐	10ml
						烟酸	1ml	盐酸吡哆醇	1ml	盐酸硫胺素	1ml
肌醇	10ml	L-Glu	0.5g	L-pro	0.5g
						CH	0.3g	6-BA，1mg/ml	3ml	NAA(1mg/ml)	0.5ml
蔗糖	30g	Phytagel	4.5g	PH值	5.8

粳稻生根培养基配方(每升含量)：

N6大量	25ml	B5微量	5ml	铁盐	5ml
						烟酸	0.5ml	盐酸吡哆醇	0.5ml	盐酸硫胺素	0.5ml
肌醇	5ml	蔗糖	20g	Phytagel	5g
						PH值	5.8

农杆菌生长的YEP液体培养基配方(每升含量)：

酵母提取物	10g
		蛋白胨	10g
NaCl	5g
		pH	7.0
Str	50mg
		Kan	30mg

悬浮农杆菌感染愈伤组织的培养基配方(AAM)每升含量：

物质名称对照

KT:激动素

6-BA：6-苄氨基嘌呤

NAA：萘乙酸

2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸

CH：酸水解酪蛋白

Phytagel：植物凝胶

L-pro：L型脯氨酸

MES：2-(N-吗啉)乙磺酸

Str：链霉素

Crab：羧苄青霉素钠

Hyg B：潮霉素B

Kan：卡那霉素

Tryptone powder：蛋白胨

2.基因的合成

参考水稻密码子偏好性，对DFR、LDOX、UFGT基因进行优化，由金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因合成。

2.1DFR基因合成序列(VVDFR4)

CCATGGGCTCTCAGAGCGAGACCGTGTGCGTGACAGGAGCAAGCGGCTTCATCGGCTCCTGGCTGGTCATGAGGCTGCTGGAGAGGGGATACACCGTGCGGGCAACAGTGAGAGACCCTACCAACGTGAAGAAGGTGAAGCACCTGCTGGATCTGCCAAAGGCCGAGACCCACCTGACACTGTGGAAGGCCGACCTGGCCGATGAGGGCAGCTTCGACGAGGCCATCAAGGGATGCACCGGCGTGTTCCACGTGGCAACACCAATGGACTTTGAGAGCAAGGACCCTGAGAACGAAGTGATCAAGCCCACCATCGAGGGCATGCTGGGCATCATGAAGTCCTGTGCTGCCGCCAAGACAGTGCGGAGACTGGTGTTTACCAGCTCCGCCGGCACAGTGAATATCCAGGAGCACCAGCTGCCCGTGTACGACGAGTCCTGCTGGTCTGATATGGAGTTCTGTCGGGCCAAGAAGATGACCGCCTGGATGTACTTCGTGAGCAAGACACTGGCCGAGCAGGCCGCCTGGAAGTATGCCAAGGAGAACAATATCGACTTCATCACCATCATCCCGACACTGGTGGTGGGCCCTTTTATCATGTCTAGCATGCCACCTTCTCTGATCACCGCCCTGAGCCCAATCACAGGCAATGAGGCCCACTATTCCATCATCCGGCAGGGCCAGTTCGTGCACCTGGACGACCTGTGCAACGCCCACATCTACCTGTTTGAGAATCCTAAGGCCGAGGGCAGGTATATCTGCTCCTCTCACGACTGCATCATCCTGGATCTGGCCAAGATGCTGCGCGAGAAGTACCCTGAGTATAACATCCCAACCGAGTTCAAGGGCGTGGACGAGAATCTGAAGTCCGTGTGCTTTAGCTCCAAGAAGCTGACAGATCTGGGCTTCGAGTTTAAGTATTCTCTGGAGGACATGTTTACCGGCGCCGTGGATACATGCAGAGCAAAGGGACTGCTGCCACCCTCCCACGAGAAGCCTGTGGACGGCAAGACCGGCGCGCC

2.2LDOX基因合成序列(VVLDOX)

CTCGAGATGGTGACCAGCGTGGCACCACGCGTGGAGTCCCTCAGCTCCTCTGGCATCCAGAGCATCCCAAAGGAGTACATCAGGCCACAGGAGGAGCTGACCTCCATCGGCAACGTGTTCGAGGAGGAGAAGAAGGACGAGGGCCCTCAGGTGCCAACAATCGACCTGAAGGACATCGAGTCCGAGGATGAGGTGGTGCGGGAGAGATGCAGGGAGGAGCTGAAGAAGGCCGCGATGGAGTGGGGCGTGATGCACCTGGTGAACCACGGCATCTCTGACGATCTGATCAATCGCGTGAAGGTGGCCGGCGAGACCTTCTTTAACCTGCCGATGGAGGAGAAGGAGAAGTACGCCAATGACCAGGCCAGCGGCAAGATCGCCGGCTATGGCTCTAAGCTGGCCAACAATGCCAGCGGCCAGCTGGAGTGGGAGGACTATTTCTTTCACCTGATCTTTCCCGAGGACAAGCGGGATATGACCATCTGGCCCAAGACACCTAGCGATTACGTGCCTGCCACCTGTGAGTATTCTGTGAAGCTGAGAAGCCTGGCCACAAAGATCCTGAGCGTGCTGTCCCTGGGACTGGGCCTGGAGGAGGGCAGGCTGGAGAAGGAAGTGGGAGGCATGGAGGAGCTGCTGCTCCAGAAGAAGATCAACTACTATCCTAAGTGCCCACAGCCTGAGCTGGCCCTGGGAGTGGAGGCACACACCGACGTGTCTGCCCTGACATTCATCCTGCACAACATGGTGCCTGGCCTCCAGCTGTTTTACGAGGGCAAGTGGGTGACCGCCAAGTGCGTGCCAAATAGCATCATCATGCACATCGGCGATACAATCGAGATCCTGTCCAACGGCAAGTATAAGTCTATCCTGCACCGCGGCCTGGTGAATAAGGAGAAGGTGCGGATCTCCTGGGCCGTGTTCTGCGAGCCCCCTAAGGAGAAGATCATCCTGAAGCCACTGCCCGAGACCGTGTCCGAGACAGAGCCACCCCTGTTCCCTCCAAGAACCTTTTCTCAGCACATCCAGCACAAGCTGTTTAGGAAGACACAGGAGGCCCTGCTGTCTAAGTGAAGTAGATGCCGACCGGATCC

2.3UFGT基因合成序列(VVUFGT2)

TCATGAGCCAGACCACAACCAACCCTCACGTGGCCGTGCTGGCATTCCCCTTTTCCACCCACGCAGCACCTCTGCTGGCAGTGGTGCGGAGACTGGCTGCCGCCGCCCCACACGCCGTGTTCAGCTTCTTTTCTACAAGCCAGTCCAACGCCAGCATCTTTCACGATTCCATGCACACCATGCAGTGCAATATCAAGAGCTACGACGTGTCCGATGGCGTGGCAGAGGGATACGTGTTCGCAGGCCGGCCTCAGGAGGACATCGAGCTGTTCATGCGGGCCGCCCCAGAGTCTTTTAGACAGGGCATGGTCATGGCAGTGGCAGAGACAGGCAGACCCGTGAGCTGTCTGGTGGCCGACGCCTTCATCTGGTTTGCCGCCGATATGGCCGCCGAGATGGGAGTGGCATGGCTGCCTTTTTGGACCGCCGGCCCAAACTCTCTGAGCACACACGTGTACACCGACGAGATCAGGGAGAAGATCGGCGTGTCCGGCATCCAGGGAAGGGAGGATGAGCTGCTGAATTTCATCCCCGGCATGTCTAAGGTGAGGTTTCGCGACCTCCAGGAGGGCATCGTGTTCGGCAACCTGAACAGCCTGTTTTCTCGGATGCTGCACAGAATGGGCCAGGTGCTGCCTAAGGCCACAGCCGTGTTCATCAACTCCTTTGAGGAGCTGGACGATTCTCTGACAAATGATCTGAAGAGCAAGCTGAAGACCTACCTGAACATCGGCCCATTCAATCTGATCACCCCCCCTCCAGTGATCCCCAATACAACCGGCTGCCTCCAGTGGCTGAAGGAGAGGAAGCCCACATCTGTGGTGTATATCAGCTTTGGCACCGTGACAACCCCACCTCCAGCCGAGCTGGTGGCCCTGGCCGAGGCCCTGGAGGCCTCCAGGGTGCCCTTCATCTGGTCTCTGAGGGACAAGGCCCGCGTGCACCTGCCTGAGGGCTTTCTGGAGAAGACACGCGGCTACGGAATGGTGGTGCCCTGGGCACCTCAGGCAGAGGTGCTGGCCCACGAGGCAGTGGGAGCCTTCGTGACCCACTGCGGCTGGAACTCTCTGTGGGAGAGCGTGGCAGGAGGCGTGCCACTGATCTGTCGGCCCTTTTATGGCGACCAGCGGCTGAATGGCAGAATGGTGGAGGATGCCCTGGAGATCGGCGTGAGAATCGAGGGCGGCGTGTTCACAGAGTCCGGCCTGATGTCTTGTTTTGATCAGATCCTGAGCCAGGAGAAGGGCAAGAAGCTGAGGGAGAACCTGGGCGCCCTGAGGGAGACCGCCGACAGGGCCGTGGGCCCAAAGGGCAGCTCCACAGAGAATTTCAAGACCCTGGTGGACCTGGTGTCCAAGCCCAAGGACGTGTGAAGGTG ACC

3.载体构建

3.1pGP1.2-DFR载体构建

VVDFR4两端含有酶切位点NcoI、AscI，通过这两个酶切位点将DFR基因插入到载体pGP1.2相同的位点上，并命名为pGP1.2-DFR。载体图谱见图2。经测序，载体构建成功。

3.2pGP1.1-DFR载体构建

通过EcoRI和HindIII双酶切pGP1.2-DFR将DFR基因表达框切下并转移至同样酶切位点剪切的载体pGP1.1上，并命名为pGP1.1-DFR，载体图谱见图3。图3中，启动子p35S和CaMV35S是一致的，仅标记不同，CaMV 35S2是一个增强的35S启动子，他们是来源于商业化载体pCambia1302。该载体作为中间载体出现，验证方法为EcoRI、HindIII双酶切验证，切割下条带在2kb左右，见图4。

3.3pCS1511-gfp(主功能载体)载体构建

通过BamHI和XhoI双酶切VVLDOX(合成时带上酶切位点)将LDOX基因切下并转移至同样酶切位点剪切的载体pGP1.1-DFR上，并命名为pCS1511-gfp。载体图谱见图5。经测序，载体构建成功。

3.4pCS1511-hptII(辅助载体)载体构建

该质粒的构建目标是引入hptII抗性基因以便进行相关筛选，通过BstEII和BspHI双酶切VVUFGT2(合成时带上酶切位点)将UFGT基因切下并转移至BstEII和NcoI(BspHI同尾酶)双酶切的载体pCambia1302上。因采用了同尾酶进行连接，故UTGT基因上游不再保留有酶切位点NcoI或BspHI，并命名为pCS1511-hptII。载体图谱见图6。经测序，载体构建成功。

4.初步筛选测试

4.1二氢槲皮素(DHQ)浓度筛选

二氢槲皮素，又名花旗松素、二氢栎皮素，工业制备主要从几个特定物种中提取，其中包括花旗松的叶片，为DFR基因的底物。因水稻自身DFR同源基因在日本晴水稻中可能处于突变状态，即无法行使原本的功能。因此，我们测试了外源添加二氢槲皮素对日本晴水稻愈伤组织的影响。我们向水稻固体继代培养基中添加DHQ母液至终浓度分别为0、4、8、20、40、80mg/L，接种入野生型水稻愈伤组织，正常培养1周后观察愈伤组织的表型。结果如图7。

图7结果表明，高浓度的DHQ会导致野生型细胞出现部分损伤而呈现褐化。相对的，低于20mg/L终浓度的DHQ在水稻固体继代培养基中不会造成愈伤组织的严重损伤，愈伤组织呈现正常的淡黄色。因固体培养时，平均分摊到每个细胞的培养基较多，而液体培养时，分摊相对较少。而DHQ是作为反应底物消耗的，所以，当液体培养时，需要的底物量就会相应增多，依据该原理，可设计出适合的底物浓度。

4.2筛选过程

4.2.1农杆菌感受态细胞的制备与转化

EHA105感受态细胞的制备：挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于5mL液体YEP培养基中，28℃摇菌(250rmp)20-24h。吸取400μL菌液，接种于20mL YEP培养基中，28℃摇菌(280rmp)至OD600值0.3左右(约4h)。将扩大繁殖的菌液分装到无菌10mL离心管中，冰浴10min。4℃，5000rmp离心5min，弃上层液体培养基。加入5mL冰浴预冷的0.15mol/L NaCl溶液，充分悬浮菌体，并冰浴30min。4℃，5000rmp离心5min，弃上层NaCl溶液。加入600μL冰浴预冷的0.02mol/L CaCl2溶液充分悬浮菌体，即得EHA105感受态细胞，用1.5mL离心管分装成100μl/管，4℃短期存放备用；加入20％的无菌甘油，-70℃放置可保存半年。

液氮冻融法转化农杆菌：向EHA105感受态细胞中加入至少300～500ng回收纯化的表达载体(pCS1511-gfp或pCS1511-hptII)，轻轻混匀，冰浴30min后液氮速冻1min。37℃热击3min，迅速置于冰上1-2min。加入800μL YEP培养基，28℃，100rmp复苏3h。4000rmp离心3min，吸掉800μL YEP培养基。混匀剩余菌液，涂抹于YEP(K+，Str+)平板，28℃倒置培养30-48h，由于农杆菌自身携带链霉素抗性基因，pCS1511-gfp和pCS1511-hptII的母载体pCambia1302含卡那霉素抗性基因，因此，在YEP(K+，Str+)平板上生长的菌落为阳性克隆。PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

4.2.2农杆菌培养小摇：取3ml YEP培养基于试管中，加入终浓度为30mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素，用无菌镊子夹取无菌20μl吸头点蘸一个单一健壮的阳性克隆菌落，放试管中加盖放30℃摇床200rpm转速过夜培养；

大摇：取30ml YEP培养基于100ml三角瓶中，加入终浓度为30mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素，从过夜小摇的菌液中吸取5μl，接种到培养基中，封口放入30℃摇床中，以200rpm转速过夜培养；

农杆菌激活培养：将大摇的菌液5000rpm离心5分钟以收集菌体，用AAM(含AS)培养基重悬，并调至OD600值为0.6±0.01，室温静置3.5小时。

4.2.3水稻愈伤组织诱导

挑选颗粒饱满的日本晴水稻种子，手工剥掉种皮，从中挑选表面没有霉斑的种子用蒸馏水浸泡10分钟，用75％的乙醇浸泡2分钟，倒掉乙醇，用30％次氯酸钠溶液浸泡30分钟，期间晃动5～6次。浸泡结束用无菌水洗涤5次，最后一次浸泡10分钟。将洗好的种子转移到无菌滤纸上晾干后，放入诱导培养基中。种子放入水稻诱导培养基时，应扁平摆放，胚应接触培养基表面，每皿15颗种子。培养皿封口放培养箱培养，培养条件：温度28℃；光照强度：全光照；光照时常：10h，黑暗时常14h。

4.2.4水稻愈伤组织继代

从诱导出的愈伤组织中挑颗粒规则，质地致密且小、颜色亮黄的愈伤组织继代到继代培养基上培养1周时间。

4.2.5农杆菌介导转化法

挑颗粒大小在2-3mm的愈伤组织于50ml无菌离心管中，愈伤组织体积量到离心管10ml刻度处。将激活处理好的农杆菌(分别携带p CS1511-gfp和pCS1511-hptII质粒)各取10ml，混匀后加到愈伤组织中，室温放于脱色摇床上，以50rpm摇动混匀，计时侵染50min。侵染结束吸干菌液，愈伤组织转移到无菌滤纸上晾干，放于带有滤纸的共培养培养基上于26℃黑暗培养2天。共培养结束用无菌水洗3遍，再用500mg/L的羧苄青霉素水溶液晃动洗涤15分钟，在滤纸上晾干，转到抑菌培养基上培养5天时间，转到筛选培养基上培养。

4.2.6初步筛选方法

潮霉素筛选：抑菌培养约1周后，愈伤组织恢复正常生理状态，将其转到带50mg/L潮霉素HygB的筛选培养基上培养约15天；待培养基上的新愈伤组织长出后，将新愈伤组织继代到新的筛选培养基上再次筛选。

4.2.7诱导显色

当进行到潮霉素第二次筛选后，按照如下步骤进行本彩色水稻愈伤组织筛选过程(悬浮系统)。DHQ诱导显色：将筛选培养基上的亮黄色、生理状态良好的愈伤组织转移到250ml三角瓶中，加入50ml含终浓度100mg/L DHQ的水稻液体继代培养基，26℃，130rpm摇床过夜培养。目视下，挑选颜色呈现灰绿色或深红色的愈伤组织即为显色成功的水稻愈伤组织，将这些愈伤组织的显色部分用无菌刀片切下后继代到悬浮培养基上培养。一般已经显色的愈伤组织在不含DHQ的培养基中培养3～5天即可消退相应颜色。待颜色退去后可重复进行筛选过程，直到所有颗粒均显色。筛选过程如图8所示。

根据图8结果，当筛选进行到第四代时，所有颗粒都能够完全显色，且颜色较之前筛选过程更深。关于局部显色的原因是因为农杆菌仅能侵染部分细胞，在一个愈伤组织团块中包含大量具有胞间连丝的水稻细胞，当其中含有具有潮霉素抗性的阳性细胞时，该团块往往就整体具有对潮霉素的抗性，从而在筛选培养基中生长。而基于本发明所述筛选方法的DHQ显色却能将这种差异区别出来，从而出现了上述局部显色的愈伤组织。因此，当愈伤组织完全显色时，表示该愈伤组织内部所有细胞均已经转入花青素生物合成相关的酶类基因。

4.3显色物质检测

为了测定显色物质是否为花青素，我们将显色的愈伤组织扩大培养一轮，重新进行显色，并使用纯水简单抽提细胞裂解液进行有色物成分的初步验证。此外，考虑到在细胞培养过程中正常愈伤组织也会偶发性的出现细胞褐化现象，为了区别该显色是否和褐化现象类似，我们进行了显色物质检测的简单实验。结果如图9。由图9中可知，显色物质确实是花青素物质，有着不同pH值显示不同颜色的特性。此外，该显色与褐化过程完全不同，且全阳性愈伤组织的红色深度要大于褐化细胞。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 杭州先端生物科技有限公司

江苏吉锐生物技术有限公司

<120> 花青素生物合成的组合物和方法

<141> 2021-09-29

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1014

<212> DNA

<213> Vitis vinifera

<400> 1

atgggttcac aaagtgaaac cgtgtgcgtc accggtgcct ccggtttcat cggttcatgg 60

ctggtcatga ggctcctgga gcgcggctac actgttcggg ccaccgttcg cgatccaact 120

aacgtgaaaa aagtgaagca tttgctggac ttgcccaaag cggagacgca tctgactctc 180

tggaaggcag atcttgctga tgaaggaagt ttcgatgaag ctattaaagg ctgcaccggc 240

gtcttccatg ttgccacacc catggatttt gaatcgaagg atcctgagaa tgaagtgata 300

aagccaacta ttgaagggat gttgggcata atgaaatcgt gtgctgccgc aaagactgtc 360

agaaggcttg tattcacatc ctccgcagga actgtgaaca ttcaagaaca ccaactgcca 420

gtgtacgatg aaagctgctg gagtgatatg gaattttgcc gggctaaaaa gatgactgca 480

tggatgtact ttgtctccaa gacactggct gagcaagctg catggaagta tgccaaggaa 540

aataacattg acttcatcac tatcataccg actcttgtgg ttggcccctt cataatgtca 600

tcaatgcctc caagcctcat aactgctctt tccccgatca ctggaaacga agctcattat 660

tcaattatac ggcagggcca atttgttcac ctggatgacc tctgcaatgc tcatatttac 720

ttgtttgaga atcctaaggc agagggacgt tacatttgct cctcccacga ttgtatcatt 780

ctcgatcttg caaaaatgct tagagaaaaa taccccgagt ataatatccc cacagagttc 840

aaaggtgttg atgagaactt gaagagtgtc tgtttctcct ccaagaagct gacagatttg 900

gggtttgagt ttaaatacag cttagaggac atgtttactg gagctgtgga cacatgccgg 960

gccaagggat tgcttccccc ttcacatgag aaacctgtag atggcaagac ctag 1014

<210> 2

<211> 1068

<212> DNA

<213> Vitis vinifera

<400> 2

atggtgactt cagtggctcc tagagttgag agcttgtcca gcagtgggat ccagtcaatc 60

cccaaagagt acatccgccc ccaagaagag ctcaccagca ttggcaatgt ctttgaggag 120

gagaagaagg atgaagggcc tcaggttcca actattgact tgaaggatat tgagtctgag 180

gacgaggtgg tccgggagag atgccgggag gagttgaaga aagctgccat ggagtggggt 240

gtgatgcacc ttgttaacca tggcatctct gatgacctta tcaaccgtgt taaggttgct 300

ggagagacct ttttcaatct ccccatggag gaaaaggaga agtatgctaa tgaccaggcc 360

tccggcaaga tcgctggcta tggcagcaag cttgccaaca atgctagtgg acagcttgag 420

tgggaggact acttcttcca cctcatcttc cctgaggaca agcgcgatat gaccatctgg 480

cctaagacac caagcgacta cgttccagca acctgtgagt actcggtgaa acttaggagc 540

ctggcaacca agatactatc ggtgctatcg cttgggttgg gattggaaga agggagacta 600

gaaaaggaag ttggtgggat ggaagagcta ctactccaaa agaagatcaa ctactacccc 660

aagtgtcccc agcctgaatt ggctctcggg gtggaagctc acactgacgt gagcgctctc 720

accttcatcc tccacaacat ggtacccggc ctgcaacttt tctatgaggg caagtgggtg 780

acagccaagt gtgtccccaa ctccatcatc atgcacattg gagacaccat agagattctc 840

agcaatggta agtacaagag tattcttcac aggggactgg tcaacaagga gaaggtgagg 900

atttcatggg cagttttctg cgagccgcct aaggagaaga tcatcctgaa gccactgcca 960

gagacggtgt ctgagactga gccaccactc ttcccacctc gcaccttttc ccaacatatt 1020

cagcacaagc tcttcaggaa gacccaggag gctctactct ccaaatga 1068

<210> 3

<211> 1371

<212> DNA

<213> Vitis vinifera

<400> 3

atgtctcaaa ccaccaccaa cccccatgtg gccgtcctgg ccttcccctt ctccacccat 60

gcagcccccc tccttgccgt cgttcgccgc cttgctgccg ctgcccctca tgcagtcttc 120

tccttcttca gcaccagcca atccaacgcc tccatcttcc acgactccat gcataccatg 180

caatgtaata tcaagtccta tgatgtgtcc gacggtgtgg ctgaggggta tgtgttcgcc 240

gggcggcccc aggaggatat tgagctgttc atgagggctg cgccggagag ctttaggcag 300

gggatggtga tggctgtggc cgagacaggg cggccagtga gctgcctggt ggctgacgca 360

ttcatttggt ttgctgcaga tatggcagca gagatggggg tggcttggct gccgttttgg 420

actgcagggc ctaactcact ctccacccat gtttacactg atgaaatcag agaaaagatt 480

ggagtttcag gcattcaagg ccgtgaagac gagctgctca atttcattcc cggaatgtct 540

aaagtacgtt ttcgcgacct gcaggaaggc atcgtgttcg gaaacctaaa ctcgctcttc 600

tcacgcatgc tccatcggat gggccaagtg ctacctaagg cgactgcagt tttcataaac 660

tccttcgagg agctcgacga ttccctaacc aatgatctca aatccaagct caagacgtac 720

ctcaatatcg gtccatttaa cctaataacc ccaccgccgg ttatacccaa cacaaccggc 780

tgcctccaat ggctcaaaga aagaaaaccc acctcggtcg tgtacattag ctttggcacc 840

gtcacgacac cacccccagc cgagcttgta gccctagctg aggcactgga ggcaagccgg 900

gtaccgttta tatggtccct aagggacaag gcaagggtgc atttgccaga aggtttcttg 960

gagaagacca gagggtacgg aatggtggtt ccatgggctc ctcaggcgga ggtcctagca 1020

catgaggcag ttggggcttt tgtaacacat tgtggatgga actcattgtg ggaaagcgtg 1080

gccggtgggg tacccttgat ttgcaggccc ttttatgggg accaaaggct caatgggagg 1140

atggtggagg atgctttgga gattggagtg agaattgaag gtggggtttt cacagagagt 1200

gggctaatga gttgctttga tcaaattctc tcacaagaaa aagggaagaa actgagggaa 1260

aatctgggag ccctaagaga gactgcagac agggcagttg gtcctaaagg gagttctact 1320

gagaatttca aaaccctggt ggatttagtg tcaaaaccaa aggatgtcta g 1371

<210> 4

<211> 1021

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ccatgggctc tcagagcgag accgtgtgcg tgacaggagc aagcggcttc atcggctcct 60

ggctggtcat gaggctgctg gagaggggat acaccgtgcg ggcaacagtg agagacccta 120

ccaacgtgaa gaaggtgaag cacctgctgg atctgccaaa ggccgagacc cacctgacac 180

tgtggaaggc cgacctggcc gatgagggca gcttcgacga ggccatcaag ggatgcaccg 240

gcgtgttcca cgtggcaaca ccaatggact ttgagagcaa ggaccctgag aacgaagtga 300

tcaagcccac catcgagggc atgctgggca tcatgaagtc ctgtgctgcc gccaagacag 360

tgcggagact ggtgtttacc agctccgccg gcacagtgaa tatccaggag caccagctgc 420

ccgtgtacga cgagtcctgc tggtctgata tggagttctg tcgggccaag aagatgaccg 480

cctggatgta cttcgtgagc aagacactgg ccgagcaggc cgcctggaag tatgccaagg 540

agaacaatat cgacttcatc accatcatcc cgacactggt ggtgggccct tttatcatgt 600

ctagcatgcc accttctctg atcaccgccc tgagcccaat cacaggcaat gaggcccact 660

attccatcat ccggcagggc cagttcgtgc acctggacga cctgtgcaac gcccacatct 720

acctgtttga gaatcctaag gccgagggca ggtatatctg ctcctctcac gactgcatca 780

tcctggatct ggccaagatg ctgcgcgaga agtaccctga gtataacatc ccaaccgagt 840

tcaagggcgt ggacgagaat ctgaagtccg tgtgctttag ctccaagaag ctgacagatc 900

tgggcttcga gtttaagtat tctctggagg acatgtttac cggcgccgtg gatacatgca 960

gagcaaaggg actgctgcca ccctcccacg agaagcctgt ggacggcaag accggcgcgc 1020

c 1021

<210> 5

<211> 1094

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctcgagatgg tgaccagcgt ggcaccacgc gtggagtccc tcagctcctc tggcatccag 60

agcatcccaa aggagtacat caggccacag gaggagctga cctccatcgg caacgtgttc 120

gaggaggaga agaaggacga gggccctcag gtgccaacaa tcgacctgaa ggacatcgag 180

tccgaggatg aggtggtgcg ggagagatgc agggaggagc tgaagaaggc cgcgatggag 240

tggggcgtga tgcacctggt gaaccacggc atctctgacg atctgatcaa tcgcgtgaag 300

gtggccggcg agaccttctt taacctgccg atggaggaga aggagaagta cgccaatgac 360

caggccagcg gcaagatcgc cggctatggc tctaagctgg ccaacaatgc cagcggccag 420

ctggagtggg aggactattt ctttcacctg atctttcccg aggacaagcg ggatatgacc 480

atctggccca agacacctag cgattacgtg cctgccacct gtgagtattc tgtgaagctg 540

agaagcctgg ccacaaagat cctgagcgtg ctgtccctgg gactgggcct ggaggagggc 600

aggctggaga aggaagtggg aggcatggag gagctgctgc tccagaagaa gatcaactac 660

tatcctaagt gcccacagcc tgagctggcc ctgggagtgg aggcacacac cgacgtgtct 720

gccctgacat tcatcctgca caacatggtg cctggcctcc agctgtttta cgagggcaag 780

tgggtgaccg ccaagtgcgt gccaaatagc atcatcatgc acatcggcga tacaatcgag 840

atcctgtcca acggcaagta taagtctatc ctgcaccgcg gcctggtgaa taaggagaag 900

gtgcggatct cctgggccgt gttctgcgag ccccctaagg agaagatcat cctgaagcca 960

ctgcccgaga ccgtgtccga gacagagcca cccctgttcc ctccaagaac cttttctcag 1020

cacatccagc acaagctgtt taggaagaca caggaggccc tgctgtctaa gtgaagtaga 1080

tgccgaccgg atcc 1094

<210> 6

<211> 1381

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tcatgagcca gaccacaacc aaccctcacg tggccgtgct ggcattcccc ttttccaccc 60

acgcagcacc tctgctggca gtggtgcgga gactggctgc cgccgcccca cacgccgtgt 120

tcagcttctt ttctacaagc cagtccaacg ccagcatctt tcacgattcc atgcacacca 180

tgcagtgcaa tatcaagagc tacgacgtgt ccgatggcgt ggcagaggga tacgtgttcg 240

caggccggcc tcaggaggac atcgagctgt tcatgcgggc cgccccagag tcttttagac 300

agggcatggt catggcagtg gcagagacag gcagacccgt gagctgtctg gtggccgacg 360

ccttcatctg gtttgccgcc gatatggccg ccgagatggg agtggcatgg ctgccttttt 420

ggaccgccgg cccaaactct ctgagcacac acgtgtacac cgacgagatc agggagaaga 480

tcggcgtgtc cggcatccag ggaagggagg atgagctgct gaatttcatc cccggcatgt 540

ctaaggtgag gtttcgcgac ctccaggagg gcatcgtgtt cggcaacctg aacagcctgt 600

tttctcggat gctgcacaga atgggccagg tgctgcctaa ggccacagcc gtgttcatca 660

actcctttga ggagctggac gattctctga caaatgatct gaagagcaag ctgaagacct 720

acctgaacat cggcccattc aatctgatca ccccccctcc agtgatcccc aatacaaccg 780

gctgcctcca gtggctgaag gagaggaagc ccacatctgt ggtgtatatc agctttggca 840

ccgtgacaac cccacctcca gccgagctgg tggccctggc cgaggccctg gaggcctcca 900

gggtgccctt catctggtct ctgagggaca aggcccgcgt gcacctgcct gagggctttc 960

tggagaagac acgcggctac ggaatggtgg tgccctgggc acctcaggca gaggtgctgg 1020

cccacgaggc agtgggagcc ttcgtgaccc actgcggctg gaactctctg tgggagagcg 1080

tggcaggagg cgtgccactg atctgtcggc ccttttatgg cgaccagcgg ctgaatggca 1140

gaatggtgga ggatgccctg gagatcggcg tgagaatcga gggcggcgtg ttcacagagt 1200

ccggcctgat gtcttgtttt gatcagatcc tgagccagga gaagggcaag aagctgaggg 1260

agaacctggg cgccctgagg gagaccgccg acagggccgt gggcccaaag ggcagctcca 1320

cagagaattt caagaccctg gtggacctgg tgtccaagcc caaggacgtg tgaaggtgac 1380

c 1381

Claims (12)

1.花青素生物合成的载体，所述载体包含DFR、LDOX、UFGT基因，所述DFR的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDOX的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述UFGT的的基因序列如SEQID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的载体，还包括其他标记基因。

3.如权利要求2所述的载体，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。

4.包含权利要求1-3所述任一载体的宿主细胞。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于：所述的DFR、LDOX、UFGT基因可以分别位于2个或3个载体中，也可以位于同一个载体中。

6.花青素生物合成的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建含有如权利要求1所述的DFR、LDOX、UFGT基因的载体；

2）将步骤1）构建的载体转入植物愈伤组织中，获得含有DFR、LDOX、UFGT的愈伤组织；

3）添加DFR基因编码的酶的底物；

4）挑选显色的愈伤组织。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：还增加如下步骤，将挑选出的愈伤组织，于去除所述酶底物的培养基中培养1-5天；挑选颜色褪去的愈伤组织颗粒。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：还增加如下步骤，对颜色褪去的愈伤组织颗粒，重复权利要求6的步骤3）、4），直到所有愈伤组织颗粒均全部完全显色。

9.如权利要求6-8所述任一的方法，其特征在于：所述步骤1）还包括其他的标记基因。

10.如权利要求9所述任一的方法，其特征在于：所述标记基选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。

11.如权利要求6-8,10所述的任一方法，其特征在于：所述酶的底物为二氢杨梅黄酮、二氢槲皮素或二氢堪非醇。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述酶的底物为二氢杨梅黄酮、二氢槲皮素或二氢堪非醇。

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