CN111909249A - 一种花青素合成调控转录因子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花青素合成调控转录因子PdMYB118，其能够高效特异地调控杨树花青素的生物合成，并且不激活原花青素的合成，可用于不同生态型杨树品种或其他植物的红叶表型创制，具备大规模开发和应用前景。

Description

一种花青素合成调控转录因子及其应用

技术领域

本发明属于植物转基因工程领域，具体地说，涉及一种花青素合成调控转录因子PdMYB118及其在创建红叶植物中的应用。

背景技术

杨树是重要的工业用材、城市绿化和生态保护树种，具有重要的经济价值和生态价值。杨树有很强的抗寒抗旱和耐盐碱特性，是北方以及土壤贫瘠地区的主要栽培和绿化树种。随着我国经济的发展，北方城市化进程的飞速发展对城市绿化树种、尤其是彩色树种的需求日益旺盛。南方的一些红色或彩色灌木绿化树种由于越冬性，生态适应以及价格等原因，很少在北方城市广泛应用。传统的杨树是一种绿叶树种，红叶杨树极少尤其是可以在北方越冬的红叶杨。因此，培育适合我国北方生态型的红叶杨不仅可以作为城市绿化树种还可以作为木材使用，具有重要的生态和经济双重价值。

花青素是植物最重要的色素之一，在植物的生长发育及环境适应中都起重要作用，因此植物中花青素的生物合成途径及其调控网络是近年来的研究热点。植物中花青素是在一系列花青素合成相关酶的催化下一步步合成，这些酶包括：chalcone synthase(CHS)、chalcone isomerase(CHI)、flavanone 3-hydroxylase(F3H)、flavanone 3’-hydroxylase(F3‘H)、flavonoid 3’5’-hydroxylase(F3’5’H)、dihydroflavonol 4-reductase(DFR)、anthocyanidin synthase(ANS)和UDP glucose flavonol 3-O-glucosyltransferase(UFGT)。这些花青素合成相关酶的基因表达受一类转录因子复合体MBW的调控。MBW复合体由三类不同的转录因子相互作用形成，包括MYB(PAP1,PAP2,MYB113,MYB114)、bHLH(TT8,GL3,EGL3)和一个WD40蛋白TTG1。这类转录因子复合体通过直接结合在花青素合成基因启动子来激活这些基因的表达，从而促进花青素的合成。其中，MYB转录因子起非常重要的作用。除了拟南芥中的PAP1/PAP2/MYB113/MYB114和玉米中的C1/Pl1之外，还在园艺观赏植物中鉴定了30多个MYBs，果树中鉴定出24个和蔬菜中鉴定出19个。虽然杨树中有192个MYBs，但是关于杨树花青素合成相关的MYB转录因子却不多，研究最多的是调控无色的原花青素合成的MYBs。原花青素一部分是用花青素的底物由leucoanthocyanidinreductase(LAR)催化合成，一部分是由花青素直接被anthocyanidin reductase(ANR)催化合成，因此原花青素的合成需要消耗花青素和花青素的底物。杨树中MYB134和MYB115是两个正调控原花青素合成的MYB转录因子。绿色的测序杨树PtrMYB119可以调控杨树花青素的生物合成，过表达该基因可以提高黄酮类物质及矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量。但是该转基因杨树叶片红色带黄，不是完全的红色，可能是由于该转录因子可以同时激活原花青素合成基因、导致花青素含量不足和其他黄酮类物质增加而引起的；同时只有温室苗的照片，移栽大田以及在野外生长时红叶的表型是否稳定也不得而知。因此，发掘和克隆高效稳定的调控杨树花青素生物合成的调控因子显得尤为重要。

发明内容

我们幸运地在2014年发现一个自然变异的红叶杨树，对该突变体进行了系统深入的研究，发现一个MYB转录因子在红叶杨突变体中上调高表达，从而激活一系列花青素合成基因(PtrCHS1、PtrCHI1、PtrF3H、PtrF3’H、PtrF3’5’H、PtrDFR2和PtrANS1)的表达导致红叶杨的形成。然后我们克隆到这个基因，经过序列比对，发现其和杨树MYB118在进化上最近，但是蛋白序列有明显的不同；而且和已报道的测序杨树PtrMYB119的相似性只有70％，因此我们将这个转录因子命名为PdMYB118。该转录因子氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MVSSLGVRKGAWTEEEDILLRKCVEKYGEGRWCQIPLKAGLNRCRKSCRMRWLNYLKPNVKRGLFSVGEVDLIIRLHKLLGNRWSLIAGRLPGRTANDVKNYWNTNLRKKVVSSTREAQPEPEPEPEPEPEPKSITKDNIIKPRPRNFKNLCWLGAGKGTPFINAGSQCGDDLCKPYSTIAFPPSDTDEVERMWWESLLDDKEINLTNSNSCQNSCLGSGSTANLEPINSLFVEDNPLGGIMIGDVFSDQGQNRWGDISFDADLWSLIDTEIDQQ(SEQ ID NO:1)。

该转录因子能够高效特异地调控杨树花青素的生物合成，可用于不同生态型杨树品种或其他植物的红叶表型创制，甚至可以用于花青素的生物合成。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种花青素合成调控转录因子，其为选自下组的蛋白质：

(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白质功能的由(a)衍生的蛋白质；

(c)与(a)限定的蛋白质序列有75％以上、优选80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、更优地98％以上同源性，且具有(a)蛋白质功能的由(a)衍生的蛋白质；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述氨基酸序列的衍生蛋白质。

为表述方便起见，将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质称为“PdMYB118”、“杨树花青素合成调控转录因子”或者“转录因子”。

本发明的第二个目的在于提供编码上述蛋白质的多核苷酸(或称基因)，上述多核苷酸(或称基因)选自：

(A)编码权利要求1所述花青素合成调控转录因子的多核苷酸；

(B)编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；

(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥75％、优选≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、更优地≥98％的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)中任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

优选地，编码PdMYB118的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2：

ATGGTAAGCTCATTAGGAGTAAGGAAAGGTGCATGGACCGAAGAGGAGGATATACTTCTACGGAAGTGCGTAGAGAAATATGGTGAAGGAAGATGGTGTCAAATTCCTCTCAAAGCAGGTTTGAATAGATGCAGGAAAAGCTGTAGAATGAGGTGGTTGAACTATCTTAAGCCAAATGTCAAGAGAGGGCTGTTTTCAGTGGGCGAAGTAGATTTGATTATCAGGCTACACAAGCTGCTTGGCAACAGGTGGTCATTGATTGCCGGTAGACTTCCAGGAAGAACAGCAAATGATGTAAAGAATTATTGGAACACAAACCTGCGTAAGAAGGTGGTTTCTAGCACTAGAGAAGCTCAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAAAATCAATAACAAAAGACAACATAATAAAGCCTCGACCTCGGAACTTCAAAAATTTATGTTGGTTAGGGGCTGGAAAAGGAACTCCATTTATTAATGCTGGTTCTCAATGTGGGGACGATCTTTGCAAGCCATATTCTACCATAGCATTTCCACCTTCCGATACCGATGAAGTTGAAAGGATGTGGTGGGAAAGCCTGTTAGATGACAAAGAAATTAATCTAACGAACAGCAACAGTTGTCAAAATAGTTGTCTGGGTTCTGGTTCCACAGCTAACCTAGAGCCCATCAACAGTCTTTTTGTAGAGGACAACCCACTAGGAGGGATAATGATTGGGGATGTGTTCTCTGACCAAGGACAAAATCGTTGGGGCGACATTTCTTTCGATGCAGACCTTTGGAGTCTAATCGATACAGAAATAGATCAACAATGA(SEQ ID NO:2)。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的表达盒、或者包含该表达盒的载体比如质粒。其中，所述表达盒至少包括上述基因序列和位于其上游的启动子比如35S启动子，优选还包括操纵子、终止子、复制子和筛选标记基因。

本发明的第四个目的在于提供上述的多核苷酸、表达盒、或者载体在促进植物合成花青素中的用途。优选在促进植物中花青素合成的同时不激活原花青素的合成。上述多核苷酸、表达盒、或者载体对于花青素生物合成的促进作用是通过上调植物中与花青素合成相关的基因(PtrCHS1、PtrCHI1、PtrF3H、PtrF3’H、PtrF3’5’H、PtrDFR2和/或PtrANS1)表达而实现的，但优选不上调原花青素合成关键基因(PtrANR1和/或PtrLAR1)的表达。

在一种实施方式中，上述用途是创建红叶植物。

优选地，上述植物包括木本植物或者草本植物。

上述木本植物可以是杨树比如山新杨、或者其他观叶树种，尤其是适合北方栽种的树种。上述草本植物例如是烟草、观叶植物或者蔬菜。

作为一种优选的实施方式，可以通过包括如下步骤的方法来构建红叶表型转基因植物比如红叶杨：

(1)通过PCR扩增上述多核苷酸比如PdMYB118基因，将扩增的基因片段连接于载体比如质粒上，构建得到PdMYB118过表达载体比如质粒，例如载体中包含序列SEQ ID NO:2和用于驱动SEQ ID NO:2表达的启动子比如35S启动子；

(2)将步骤(1)中构建的PdMYB118过表达载体转化入作为受体细胞的农杆菌感受态细胞中，得到农杆菌工程菌；

(3)使用步骤(2)中构建的农杆菌工程菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法(即农杆菌介导的转基因方法)将PdMYB118基因转入植物中，并对植物体进行分子水平鉴定，得到PdMYB118基因上调表达的阳性转基因植株，筛选出叶片红色的转基因植株。

优选上述步骤(1)中的载体比如质粒是双元表达载体系统。

上述步骤(2)中的农杆菌可以是农杆菌EHA105。

上述步骤(2)中的转化是冻融法。

本发明的PdMYB118在山新杨中过表达获得了可以在北方正常生长并红叶表型稳定的转基因红叶杨，解决了调控杨树花青素合成特异性、高效性和性状稳定性的问题，还解决了红叶杨树适合北方生长(即越冬性和耐逆性)的问题，因而可以创制出适合北方或需要越冬地区生长的红叶杨，作为绿化观赏树种以及木材。另外，该转录因子在烟草中过表达也可以使烟草变红，具备大规模开发和应用推广前景。

附图说明

图1显示了PdMYB118基因片段的琼脂糖凝胶电泳照片。

图2显示了PdMYB118蛋白序列比对。10、11、12为从杨树红叶突变体中克隆的PdMYB118的3个不同克隆；PtMYB118为测序杨树MYB118的蛋白序列。

图3显示了PdMYB118的中间载体PdMYB118-KS的结构示意图。

图4a显示了在杨树叶片原生质体中瞬时转化PdMYB118的过表达载体可以提高该基因的表达量。其中C代表阴性对照，M代表瞬时转化PdMYB118过表达载体的细胞。

图4b显示了花青素合成基因在PdMYB118过表达细胞中的表达情况。其中C代表阴性对照，M代表瞬时转化PdMYB118过表达载体的细胞。

图5显示了原花青素合成基因PtrANR1和PtrLAR1在瞬时转化PdMYB118过表达细胞中的相对表达量。其中C代表阴性对照，M代表瞬时转化PdMYB118过表达载体的细胞。

图6显示了PdMYB118激活花青素合成基因PtrCHS1、PtrDFR2和PtrANS1启动子(PtrCHS1-Pro、PtrDFR2-Pro和PtrANS1-Pro)的荧光素酶实验结果。其中C代表阴性对照，M代表共转PdMYB118过表达载体和启动子报告载体的细胞。

图7显示了PdMYB118过表达植物载体的结构示意图。其中，Ter，终止序列；NPTII，卡那霉素抗性基因；35S，35S启动子序列；PdMYB118，PdMYB118全长CDS序列；Ocs，终止子序列；GUS，GUS报告基因序列；Nos，终止子序列。

图8a显示了农杆菌介导的遗传转化方法得到的山新杨转基因株系的PCR检测琼脂糖凝胶电泳照片。其中M是Marker，P是PdMYB118过表达载体质粒，WT是野生型，L1、L2、L3、L7是个体转基因株系。

图8b显示了农杆菌介导的遗传转化方法得到的山新杨转基因株系的定量RT-PCR检测PdMYB118的结果。其中WT是野生型，L1、L2、L3、L7是个体转基因株系。

图9显示了L2和L7转基因株系生长2个月左右的转基因幼苗的红叶表型照片、叶片中花青素相对含量和PdMYB118基因表达的RT-qPCR检测结果。其中WT是野生型，L2和L7是个体转基因株系。

图10显示了生长2个月左右的过表达PdMYB118转基因杨树叶片中花青素合成相关基因的RT-qPCR检测结果。其中WT是野生型，L2和L7是个体转基因株系。

图11显示了转基因红叶杨(L7)培育一年后(2017年7-11月)的生长状态照片，在越冬后正常生长的叶片颜色红色依然保持红色。其中照片(a)显示红叶表型非常稳定；照片(b、c)显示同年秋季，转基因红叶杨叶片依然是红色，依然保持色彩鲜艳；但是作为对照的野生型叶片已经开始变黄，WT是野生型，L2和L7是个体转基因株系。

图12显示了转基因红叶杨在北方生长3年后(2019年4月)红叶表型稳定的照片。其中WT是野生型，L7是转基因株系。

图13显示了在烟草中过表达PdMYB118基因导致叶片变红的照片和分子检测结果。其中图(a)是转基因烟草的PCR检测凝胶电泳照片；图(b)是RT-PCR检测凝胶电泳照片，表明转基因烟草叶片中PdMYB118转录本明显上升；图(c)是转基因烟草的红叶表型与野生型对比照片；图(d)是转基因烟草叶片颜色变红与野生型对比照片；图(e)是转基因烟草和野生型背面的对比照片，WT是野生型，T代表转基因烟草。

具体实施方式

杨树是典型的绿叶植物，红叶突变体极为罕见，这是导致杨树花青素生物合成调控因子研究滞后的重要原因。我们在2014年意外发现一个自然变异的红叶杨树，嫁接后生长缓慢不易存活，保存一部分生物样品后就不幸死掉了。我们对该突变体进行了系统深入的研究，发现红叶突变体中花青素合成基因的表达显著上调，而原花青素合成基因的表达没有变化；分析花青素调控相关转录因子发现只有MYB118高表达而其他转录因子的表达下调表达，因此MYB118可能是高效特异激活红叶杨花青素生物合成的关键调控因子，这将有利于花青素的合成而减少花青素的消耗，从而更有利于积累更多的花青素，导致红叶杨的形成。因此，我们从红叶杨叶片中克隆了MYB118这个基因，通过氨基酸序列的比对发现，该转录因子和PtrMYB118同源，但是氨基酸序列还有一些差别，将该基因命名为PdMYB118。

然后我们深入研究PdMYB118调控花青素生物合成的生物学功能。转录因子一般通过结合基因的启动子来激活基因的表达，因此会进入细胞核发挥作用。我们通过研究PdMYB118蛋白的亚细胞定位发现PdMYB118定位在细胞核中，表明该蛋白和其他转录因子一样具有典型的核定位功能。为了验证PdMYB118是否可以激活杨树花青素合成基因的表达，我们通过在杨树叶片原生质体中瞬时表达PdMYB118，发现PdMYB118可以高效地激活杨树花青素合成相关基因(PtrCHS1、PtrCHI1、PtrF3H、PtrF3’H、PtrF3’5’H、PtrDFR2和PtrANS1)的表达，但并不激活原花青素合成关键基因的表达(PtrANR1和PtrLAR1)。另外，我们通过荧光素酶实验还发现PdMYB118可以直接激活花青素合成基因的启动子。这些结果表明我们从自然变异的红叶杨突变体中克隆的PdMYB118转录因子可以特异高效地激活杨树花青素合成基因的的表达，可以作为植物红叶或红色性状遗传改良的高效候选基因之一。

杨树由于其耐寒耐旱、耐盐碱、栽培养护成本低，是我国北方重要的绿化树种，而杨树都是绿叶树木，尚没有红叶杨树品种。因此，我们选择一个北方栽培品种山新杨为受体(该品种抗寒抗旱耐盐碱)，将35S启动子驱动的PdMYB118过表达载体通过农杆菌介导的转化方法导入山新杨中，从而创制适合北方生长的的红叶杨树。最终我们成功获得了PdMYB118高表达的转基因山新杨，这些转基因杨树在温室中就表现出明显的红叶表型，而且花青素合成关键基因在转基因红叶杨中都上调表达。为了检验转基因红叶杨在北方生长适应性，2016年4月我们将转PdMYB118的红叶杨移栽到北方城市烟台，3年来的试验证明转基因红叶杨可以在山东烟台越冬并且正常生长，更重要的是红叶表型稳定、持续时间长(从幼叶到老叶)而且颜色鲜艳亮丽。由于受体品种山新杨是雌株不育，果序自然脱落不飞絮，也不会产生种子，因此该转基因红叶杨的生物安全性高而且不污染环境；另外该转基因红叶杨可以进行无性繁殖，因此可以降低繁育栽培成本。我们创制的转PdMYB118红叶杨可作为广大北方城市的景观树种和绿化树种，同时也可以作为木材，因此具有重要的生态和经济双重价值。

PdMYB118还可用于其它生态型杨树品种或其他植物创制红叶表型以及用于花青素的生物合成。另外，通过将PdMYB118基因导入草本植物烟草中，发现其在烟草中过表达也可以使烟草变红，提示该基因可以用于创制草本植物例如观叶植物或者蔬菜的红叶表型。

我们从杨树的优良自然变异材料中深入挖掘鉴定优异基因，然后用于普通杨树品种的遗传改良，从而快速创制具有特定优良性状的新材料、新品系，以满足生产和社会迫切需求，这为今后杨树及其他植物的遗传改良提供新的思路和借鉴。

以下通过实施例检测PdMYB118对花青素生物合成基因的转录调控活性以及在植物红叶表型创制的高效性和稳定性，并对本发明的技术方案进行验证。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文的实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

在本文中，有时为了描述简便，会将蛋白比如PdMYB118蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于PdMYB118(基因)，用于描述转录因子功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该转录因子的基因，以此类推，这是本领域技术人员容易理解的。

本发明的杨树花青素合成调控转录因子PdMYB118由于氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

实施例

材料和方法

实施例中的引物合成及测序皆由上海博尚生物技术有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据试剂供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min。

实施例1从一个天然变异的红叶杨树突变体中克隆PdMYB118

我们在2014年意外发现一个自然变异的红叶杨树，研究发现：该突变体中花青素合成基因(PtrCHS1、PtrCHI1、PtrF3H、PtrF3’H、PtrF3’5’H、PtrDFR2和PtrANS1)都显著上调表达，但原花青素合成关键基因(PtrANR1和PtrLAR1)的表达没有变化，表明该突变体是由于花青素合成基因的特异性上调表达导致的。花青素合成基因在红叶杨突变体中高表达，表明可能存在调控这些基因的调控因子。于是我们分析了杨树花青素合成相关的调控因子的表达量，发现只有MYB118基因高表达，而其他转录因子基因的表达量都下调，提示红叶杨突变体中MYB118是激活花青素合成基因的关键调控因子。因此，我们从红叶杨树突变体叶片中克隆该基因，测序后发现和PtrMYB118同源，命名为PdMYB118，然后将PdMYB118基因连入中间载体中，以便于构建该基因的其他载体如：瞬时表达载体和植物过表达载体。具体步骤如下：

1.1突变体红叶杨叶片RNA的提取

(1)取适量红叶杨叶片，液氮研磨成粉末移入1.5mL Eppendorf管中；

(2)加入1mL RNAiso Reagent(TaKaRa，Japan)，混匀，室温静置10min；

(3)加入200μL氯仿，振荡混匀，室温静置10min；然后4℃，12000rpm，离心15min；离心机为Eppendorf的普通台式离心机。

(4)将上层液体转移至新的Eppendorf中，加入等体积异丙醇，4℃静置10min；然后4℃，12000rpm，离心10min；

(5)弃上清，向沉淀中加入1mL的75％乙醇清涤沉淀，12000rpm，离心5min；

(6)RNA沉淀室温下干燥后加30μl DEPC水溶解，-20℃保存。

1.2将RNA反转录为cDNA

反转录采用

II Reverse Transcriptase(南京唯赞生物)反应体系：

1.3从红叶突变体叶片cDNA中PCR扩增PdMYB118基因

设计PdMYB118基因的全长CDS引物，以红叶突变体叶片cDNA模板进行PCR扩增，反应体系：2μL cDNA模板，25μL 2×PCR buffer for KOD FX，10μL 2mM dNTPs，上下游引物各2μL，KOD FX(Toyobo,Japan)1μL,8μL水，共50μL。引物为：

正向PdMYB118-QF：5’-ATGGTAAGCTCATTAGGAGTAAGG-3’(SEQ ID NO:3)，

反向PdMYB118-QR：5’-TCATTGTTGATCTATTTCTGTATCG-3’(SEQ ID NO:4)。

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环；68℃保温10min；4℃，5min。PCR仪为Veriti^TM96(Applied Biosystems)。

PCR产物进行电泳检查，发现扩增出一条800bp左右的单一条带(见图1)。

1.4 PCR片段的回收和连入中间载体pBC KS

核酸片段的回收参照相应试剂盒(北京博大泰克)说明进行；取7μL回收的核酸片段和1μLpBC KS载体(用EcoR V单酶切)放到1.5mL的Eppendorf管中，加入1μL的10xT4DNALigase buffer和1μL的T4DNALigase(NEB，USA)，16℃连接过夜。

1.5 PdMYB118中间载体的大肠杆菌转化

(1)大肠杆菌DH5α感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)放置冰中融化(或室温片刻，待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中)，加入连接好PdMYB118中间载体，冰上静置30分钟；

(2)42℃水浴热激90sec，迅速放回冰上并静置2min；

(3)向离心管中加入900μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min；

(4)5000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块(若为蓝白斑筛选，则另外加入50μL X-Gal，10μL IPTG)，混匀并涂布到含氨苄霉素(100mg/L)的LB固体培养基上，于37℃培养箱过夜培养；

(5)第二天将白斑克隆挑到含氨苄霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床过夜培养。

1.6 PdMYB118中间载体质粒的提取和测序验证

质粒提取用天根公司提供的试剂盒进行，提好的质粒送上海博尚生物技术有限公司测序，发现3个克隆的核苷酸序列都一样，编码一个271个氨基酸的蛋白，序列比对发现和杨树PtrMYB118的蛋白序列相似性较高(参见图2)，然后将该基因命名为PdMYB118。同时获得PdMYB118的中间克隆载体PdMYB118-KS，其结构如图3所示。

实施例2利用杨树原生质体瞬时表达系统检测PdMYB118对花青素合成基因的转录调控活性

为了检测PdMYB118对杨树花青素合成基因的转录调控活性，构建了该基因的瞬时表达载体，然后瞬时转化杨树叶片原生质体，再通过RT-qPCR的方法检测花青素合成相关基因的表达，具体步骤如下：

2.1 PdMYB118瞬时转化载体的构建

(1)在40μl反应体系中，加入30μL测序验证正确的实施例1中构建的PdMYB118中间载体质粒PdMYB118-KS，5μL Buffer，BamHI和SalI各1μL(NEB)，用水补至40μL，37℃酶切2-3h；

(2)酶切完后，在反应体系中加入1μl 10×Loading Buffer混匀，在琼脂糖凝胶中电泳完毕，紫外灯下回收目的条带；

(3)目的条带的回收用胶回试剂盒进行(北京博大泰克)；

(4)将瞬时转化载体pGreenII 62-SK进行BamHI和SalI的双酶切，并进行回收；

(5)将酶切后的PdMYB118片段和pGreenII 62-SK载体进连接，得到瞬时转化载体pGreenII 62-SK-PdMYB118；

(6)连接好的载体转入大肠杆菌(上海唯地生物技术有限公司，卡那抗性，50mg/L)，并抽提质粒。

(7)将质粒进行测序验证，能测出PdMYB118完整序列，表明该基因的瞬时转化载体构建成功。

构建好的质粒再用大抽提试剂盒(QIAGEN)进行大抽提，质粒浓度稀释到1μg/μL。

2.2杨树叶片原生质体的分离和转化

(1)吸取酶解液(1％纤维素酶R10，0.4％离析酶R10，0.4M甘露醇，20mM KCl，20mMMES，pH 5.7。55℃水浴10min，冷却至室温后加入10mM CaCl2，5mMβ-巯基乙醇，0.1％BSA)15mL于培养皿中，用3M黑色胶带将杨树的叶片(约40片)粘去下表皮，置于酶解液中，确保被酶解液浸没，23℃黑暗培养3-4h，转速40rpm轻轻晃动；

(2)酶解后的混合液体用100-200目筛子过滤，用15mL圆底离心管收集过滤后的绿色液体；

(3)4℃，100g离心15min(台式离心机5810R/5415R，Eppendorf)，brake为3；

(4)轻轻吸去上清，加入4mL预冷的W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，5mM葡萄糖，0.03％MES，用KOH调PH至5.7，高温灭菌)重悬，4℃，100g离心1min，brake为3；

(5)轻轻吸去上清，加入4mL预冷的W5溶液重悬，冰上静置30min；

(6)室温，100g离心1min，brake为3，轻轻吸去上清，用适量MMG溶液(0.4M甘露醇，15mM MgCl₂，0.1％MES，用KOH调PH至5.7，高温灭菌)重悬；

(7)于2mL离心管中加入10μL质粒(10μg)，100μL原生质体，轻轻混匀；

(8)加入120μL PEG溶液(1g PEG4000，750μL H₂O，625μL 0.8M甘露醇，250μL1MCaCl₂)，轻轻混匀；23℃放置30min；

(9)先加入480μL W5溶液，慢慢混匀，然后再加入960μL W5溶液混匀后室温，100g离心1min；轻轻吸去上清，用1mLW5溶液重悬，黑暗，23℃放置6-18h。

2.3过表的PdMYB118原生质体的RT-qPCR分析

(1)将瞬时转化的原生质体离心收集；

(2)抽提原生质体的RNA，具体方法见实施例1；

(3)将RNA反转录成cDNA，具体方法见实施例1；

(4)定量RT-PCR：20μLReal-time PCR反应体系(96孔板冰上操作)：2μL cDNA模板，10μL 2×TransStart Top Green qPCR Super mix(北京全式金)，上下游引物各1μL，6μL水；引物见下表：

(5)Real-time PCR两步法扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火及延伸30s，40个循环。以杨树EF1β基因作为内标，ΔΔCt法计算。

检测结果如图4a、图4b和图5所示：瞬时转化PdMYB118的过表达载体可以高效地提高该基因在山新杨叶片原生质体中的表达(图4a)；PdMYB118过表达的细胞中花青素合成基因(PtrCHS1、PtrCHI1、PtrF3H、PtrF3’H、PtrF3’5’H、PtrDFR2和PtrANS1)都显著上调表达(图4b)，但原花青素合成关键基因PtrANR1和PtrLAR1的表达下调(图5)。因此，PdMYB118可以特异地激活花青素合成基因的表达而不能激活原花青素合成关键基因的表达。

实施例3荧光素酶实验检测PdMYB118对花青素合成基因启动子的激活作用

为了进一步研究PdMYB118对花青素合成基因的调控机制，我们选取了PtrCHS1、PtrDFR2和PtrANS1进行启动子的荧光素酶实验。我们从杨树基因组中克隆这几个基因的启动子，然后构建LUC报告基因载体，这些载体再分别和实施例2中的PdMYB118瞬时转化载体pGreenII 62-SK-PdMYB118配对转化杨树叶片原生质体，最后检测REN/LUC比值，具体步骤如下：

3.1杨树叶片基因组DNA的提取

(1)取新鲜幼嫩叶片，加入CTAB裂解液(1.4M NaCl，0.1M Tris·HCl，20mM Na·EDTA，2％CTAB，2％PVP，1％(V/V)β-Me)；

(2)用研磨仪破碎样品；

(3)于65℃水浴提取1h，冷却至室温；

(4)加入等体积氯仿∶异戊醇(24：1)混合液，翻转50次以上，10,000rpm离心10min；

(5)将上清转入1.5ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，-20℃20min后，10,000rpm，离心10min，弃上清；

(6)于沉淀中加入1ml 70％的乙醇洗涤，10,000rpm离心2min；倒掉上清液，通风干燥20min；

(7)DNA用水或TE溶解。

3.2花青素合成基因启动子的克隆和LUC报告载体的构建

(1)设计花青素合成基因启动子引物，如下表所示：

(2)以杨树基因组DNA为模板，分别用这三个启动子引物进行PCR，使用KOD高保真酶扩增；

(3)将PCR片段进行回收，连入中间载体，测序，并检验序列的正确性；

(4)将测序正确的启动子序列连入LUC报告载体pGreenII0800-LUC中；

(5)提取转化阳性克隆质粒，并进行测序验证；

(6)测序验证正确的质粒用质粒大抽试剂盒进行大抽，将质粒浓度调到1μg/μL。

上述克隆相关实验的具体步骤在实施例1中已有详细描述。

3.3将花青素合成基因启动子的LUC报告载体在杨树叶片原生质体中瞬时转化

用实施例2中构建的PdMYB118瞬时转化载体pGreenII 62-SK-PdMYB118分别和PtrCHS1、PtrDFR2和PtrANS1的启动子报告载体配对，共转化杨树叶片原生质体。对照为空的pGreenII 62-SK载体和启动子报告载体的共转化。杨树叶片原生质体的提取和转化步骤见实施例2。

3.4双荧光素酶实验(使用Promega双荧光素酶检测试剂盒进行)

(1)将培养16小时后的共转化原生质体收集；

(2)原生质体中加入300μLpassive lysis buffer，涡旋和离心；

(3)取20μL上清加入荧光酶标版中，加入40μL luciferase assay buffer，然后在酶标仪上(GLOMAX 20/20luminometer,Promega)测定LUC值；

(4)加入40μLStop and Glow Buffer，后值测定REN值；

(5)计算LUC/REN的比值。

结果如图6所示，PdMYB118可以直接结合这三个花青素合成基因的启动子，高效地激活这三个基因的启动子，从而直接调控这些基因的上调表达。

实施例4农杆菌工程菌的构建

以上实施例的结果表明，我们从红叶杨突变体中克隆的PdMYB118可以高效特异地激活杨树花青素合成基因的表达。为了利用该基因创制适合北方生态型的红叶杨新品种，我们构建了35S启动子驱动的PdMYB118植物过表达载体用于杨树的遗传转化。

4.1 PdMYB118中间载体的双酶切和回收

将PdMYB118的中间载体质粒PdMYB118-KS用BamHI和SalI双酶切，并进行回收。

4.2将PdMYB118酶切片段连入植物双元载体pCAMBIA2301S中

(1)将pCAMBIA2301S表达载体用BamHI和SalI双酶切，并进行回收；

(2)将步骤4.1中BamHI和SalI双酶切的PdMYB118片段和pCAMBIA2301S载体进行连接；

(3)连接好的载体转入大肠杆菌(上海唯地生物技术有限公司，卡那抗性，50mg/L)，并抽提质粒；

(4)将质粒进行测序验证，能测出PdMYB118完整序列表明该基因的植物表达载体构建成功PdMYB118-pCAMBIA2301S，其结构见图7。

载体构建所用的方法和试剂参见实施例1和3中的描述。

4.3用冻融法将PdMYB118的植物表达载体转入农杆菌EHA105中

(1)取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态(上海唯地生物技术有限公司)于冰上融化，每100μL感受态细胞加3μL的PdMYB118-pCAMBIA2301S质粒，冰上静置30min，液氮1min；

(2)37℃水浴热激5min，迅速放回冰上并静置5min；

(3)加入700μL不含抗生素的无菌LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h；

(4)6000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块，涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板上，倒置放28℃培养箱培养2-3天。

实施例5通过农杆菌介导法将PdMYB118过表达载体导入北方品种山新杨中

将实施例4中构建的含PdMYB118-pCAMBIA2301S的农杆菌用于山新杨的遗传转化，利用杨树叶片为外植体，具体步骤如下：

(1)接种含PdMYB118-pCAMBIA2301S的农杆菌EHA105菌种于30mL的LB液体培养基(含利福平100μg/mL，卡那霉素50μg/mL)中，28℃培养至OD₆₀₀＝0.5-0.6；

(2)在超净工作台中，将工作菌液转入离心管中，6000rpm离心5min，将收集到的菌体用液体MS培养液稀释至终浓度为OD₆₀₀＝0.2-0.4；

(3)取无菌杨树组培苗叶片，剪成大小约为1cm×1cm的小块，放入经MS稀释的农杆菌悬液中浸泡5-20min，其间可轻摇几次；

(4)将浸泡过的叶片取出置于无菌滤纸上，将吸附在其表面的菌液吸干后转移至共培养培养基(MS基本培养基+0.01mg/L TDZ+0.2mM/L乙酰丁香酮)，25℃黑暗条件下共培养48h；

(5)用无菌水清洗材料三次，转移到分化培养基上(MS基本培养基+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+0.01mg/L TDZ+400mg/L特美汀)，24℃培养；

(6)一周后，将外植体转移至筛选培养基(分化培养基+30mg/L卡那霉素)，每周更换一次新鲜的培养基；

(7)筛选培养30天左右，叶片外植体的转化细胞分化出抗性芽，待其长到5-6片叶时，转移到生根培养基上生根(MS基本培养基+0.1mg/L NAA+30mg/L卡那霉素)。

4周后，对再生植株进行PCR检测，确认PdMYB118过表达载体已导入北方品种山新杨植株中。

实施例6通过农杆菌介导法将PdMYB118过表达载体导入烟草中

为了检测PdMYB118在草本植物中能否促进花青素的合成，我们同时还将PdMYB118的过表达载体转入烟草中，具体步骤如下：

(1)取烟草无菌叶片，切成4～6mm的小块到无菌瓶中，加入含PdMYB118-pCAMBIA2301S的农杆菌菌液，感染10min，期间轻微振荡；

(2)取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液，将浸染过的外植体接种在共培养培养基上(MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA)，暗培养2d；

(3)将共培养的外植体转移到分化培养基上(MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+300mg/L头孢霉素+50mg/L卡那霉素)，25℃，光照培养。每隔3-4周继代一次，待转化后的外植体长出大量丛生芽；

(4)抗性芽长1～1.5cm时，从基部将芽切下，并转入到生根培养基上(MS+0.5mg/LIAA+300mg/L头孢霉素+50mg/L卡那霉素)诱导生根。

4周后，对再生植株进行PCR检测，确认PdMYB118过表达载体已导入烟草植株中。

实施例7过表达PdMYB118转基因杨树株系的分子鉴定

通过实施例5，我们获得了PdMYB118的转基因杨树，为了检验这些转基因株系是否为阳性，我们分别从基因组和转录水平进行检测。

7.1转基因杨树的PCR检测

(1)取实施例5中转基因幼苗的叶片，提取基因组DNA(详细步骤见实施例3)；

(2)在35S启动子区设计正向引物，在PdMYB118中设计反向引物，可以扩增出一条950bp的条带：

正向35S-F：5’-TGACGCACAATCCCACTATC-3’(SEQ ID NO:5)；

反向PdMYB118-R：5’-TCATTGTTGATCTATTTCTGTATCG-3’(SEQ ID NO:6)。

(3)以转基因幼苗叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系：1μL DNA模板，10μL 2×PCR buffer for KOD FX，4μL 2mM dNTPs，上下游引物各1μL，KOD FX(Toyobo,Japan)0.5μL，用水补足20μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环；68℃保温10min；4℃，5min。PCR仪为Veriti^TM96(Applied Biosystems)。

结果显示，在转基因株系中检测到了一条950bp的PCR特异条带，条带大小和过表达载体(PdMYB118-pCAMBIA2301S)中扩出的大小一致，如图8a所示。表明PdMYB118的过表达载体成功导入山新杨中。

7.2转基因杨树的RT-qPCR检测

(1)提取转基因杨树组培苗叶片RNA，反转为cDNA，具体步骤见实施例1；

(2)设计PdMYB118基因的定量如下引物：

正向PdMYB118-RTF：5’-GCAGGAAAAGCTGTAGAATGAGG-3’(SEQ ID NO:7)；

反向PdMYB118-RTR：5’-GGAGTTCCTTTTCCAGCTCTTAAC-3’(SEQ ID NO:8)。

(3)以转基因杨树组培苗cDNA为模板，进行定量RT-PCR：20μL Real-time PCR反应体系(96孔板冰上操作)：2μL cDNA模板，10μL 2×TransStart Top Green qPCR Super mix(北京全式金，)，上下游引物各1μL，6μL水；

(4)Real-time PCR两步法扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火及延伸30s，40个循环。以杨树EF1β基因作为内标，ΔΔCt法计算。

图8b显示了PdMYB118在不同转基因株系中都高表达，而在野生型受体中几乎不表达。因此，山新杨转基因株系的分子检测结果证明，我们已成功地将PdMYB118的过表达载体导入山新杨中，并且该基因可以过量表达。

实施例8过表达PdMYB118的转基因株系在温室中的红叶表型

选取L2和L7的个体转基因株系进行系统研究，将这两个株系移栽到温室(日温21℃-27℃，夜温15℃-18℃，光照14小时)中进行培养。如图9所示，生长2个月左右的转基因幼苗出现红叶的表型(图9a)，转基因杨树叶片正面和背面都为红色(图9b)。

然后测定转基因杨树叶片中的花青素含量：叶片液氮研磨后，取0.1g粉加入2mL0.1％HCl/甲醇，4℃抽提12h；10,000转离心10min；再用HCl/甲醇抽提一次，离心后将两次的抽提液合并；抽提液用等体积的水和氯仿稀释；最后在酶标仪上(GLOMAX20/20luminometer,Promega)测定水相的吸光值(530nm)；用每g鲜样的吸光值A₅₃₀每克鲜重(FW)来代表叶片中间花青素的含量。结果显示，转基因叶片中含有大量的花青素(参见图9c、图9d)。

另外，根据实施例7的方法，我们又通过RT-qPCR检测温室中转基因杨树中PdMYB118的表达量，结果表明生长2个月左右的温室苗中PdMYB118也过表达(图9e)。

实施例9转基因红叶杨中花青素合成相关基因的表达检测

按照实施例3中的方法，检测生长2个月左右的转基因红叶杨中花青素合成基因的表达。参见图10，发现花青素合成基因PtrCHS1、PtrF3’H、PtrDFR2和PtrANS1都显著上调表达，但原花青素合成关键基因PtrANR1和PtrLAR1的表达不受影响。这些结果表明转基因山新杨的红叶表型是由于过表达PdMYB118后该转录因子特异激活花青素合成基因的表达引起的。

实施例10验证PdMYB118转基因红叶杨在北方生长的红叶表型稳定性

众所周知，温室中的环境比较均一，各种生长条件都很适宜。然而大田环境变化多端，植物需要感知适应各种环境胁迫，所以温室中的表型和田间的表型有时常常不一样，转基因株系能否在北方正常越冬并且正常生长是评估本发明转基因技术的重要评价标准。为了检测转PdMYB118红叶杨在田间生长状态以及能否越冬，我们在2016年4月份将温室中的幼苗移载到山东烟台进行试验。到2017年7月我们可以看到转基因红叶杨(L7)可以成功越冬并且生长状态正常。如同野生型杨树那样，转基因杨树每年也按季节在冬天正常落叶，并且在春天正常发芽长叶。不同的是，转基因杨树的叶片颜色始终保持红色，表型非常稳定。在同年秋季(11月份)，转基因红叶杨叶片依然是红色，依然保持色彩鲜艳，如图11所示；但是作为对照的野生型叶片已经开始变黄。

直到2019年4月，转PdMYB118红叶杨己经在山东烟台正常生长了3年，经过3个冬季后生长依然正常，红叶表型依然鲜艳亮丽，参见图12的照片。这些数据表明，转PdMYB118红叶杨的越冬性很好，可以在北方正常生长，而且红叶表型非常漂亮而且非常稳定，我们的这些转基因株系完全可以作为北方城市的绿化或景观树种，应用价值非常巨大。

实施例11过表达PdMYB118基因转基因烟草的分子鉴定和表型分析

为了验证PdMYB118是否也能在草本植物中发挥促进花青素合成的调控功能，我们在烟草中过表达PdMYB118基因(见实施例6)。按照实施例7的方法，我们对获得的转基因烟草进行基因组的PCR检测和转录水平的RT-PCR检测(以烟草NtEF1α基因为内参，正向引物为5’-CTCCAAGGCTAGGTATGATG-3’，反向引物为5’-CTTCGTGGTTGCATCTCAAC-3’)。

如图13所示，转基因烟草的PCR检测表明该基因成功转入烟草中(图13a)，RT-PCR检测表明该PdMYB118基因在转基因烟草中明显过表达(图13b)，而且转基因烟草出现红叶表型，叶片颜色变红(图13c、d)。

以上实验结果表明，本发明的转录因子PdMYB118能够调控激活一系列花青素合成基因(PtrCHS1、PtrCHI1、PtrF3H、PtrF3’H、PtrF3’5’H、PtrDFR2和PtrANS1)的表达，但不会上调原花青素合成关键基因(PtrANR1和/或PtrLAR1)的表达，从而促进植物中花青素的生物合成，导致植物的绿色叶片转变为红叶表型，并且转基因植物的遗传性状稳定。这些植物包括木本植物杨树和草本植物烟草。

虽然上述实施例仅以山新杨和烟草为例对于转录因子PdMYB118的功能进行了验证，但本领域的技术人员应理解，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上做出各种改动或者修改，比如应用于其他植物比如观叶植物甚至蔬菜的红叶表型创建，由此所做的各种变形或者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种花青素合成调控转录因子及其应用

<130> SHPI1910239

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 275

<212> PRT

<213> 红叶杨树()

<400> 1

Met Val Ser Ser Leu Gly Val Arg Lys Gly Ala Trp Thr Glu Glu Glu

1 5 10 15

Asp Ile Leu Leu Arg Lys Cys Val Glu Lys Tyr Gly Glu Gly Arg Trp

20 25 30

Cys Gln Ile Pro Leu Lys Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser Cys

35 40 45

Arg Met Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Lys Pro Asn Val Lys Arg Gly Leu

50 55 60

Phe Ser Val Gly Glu Val Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Lys Leu Leu

65 70 75 80

Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr Ala

85 90 95

Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Asn Leu Arg Lys Lys Val Val

100 105 110

Ser Ser Thr Arg Glu Ala Gln Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro

115 120 125

Glu Pro Glu Pro Lys Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ile Ile Lys Pro Arg

130 135 140

Pro Arg Asn Phe Lys Asn Leu Cys Trp Leu Gly Ala Gly Lys Gly Thr

145 150 155 160

Pro Phe Ile Asn Ala Gly Ser Gln Cys Gly Asp Asp Leu Cys Lys Pro

165 170 175

Tyr Ser Thr Ile Ala Phe Pro Pro Ser Asp Thr Asp Glu Val Glu Arg

180 185 190

Met Trp Trp Glu Ser Leu Leu Asp Asp Lys Glu Ile Asn Leu Thr Asn

195 200 205

Ser Asn Ser Cys Gln Asn Ser Cys Leu Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Leu Glu Pro Ile Asn Ser Leu Phe Val Glu Asp Asn Pro Leu Gly Gly

225 230 235 240

Ile Met Ile Gly Asp Val Phe Ser Asp Gln Gly Gln Asn Arg Trp Gly

245 250 255

Asp Ile Ser Phe Asp Ala Asp Leu Trp Ser Leu Ile Asp Thr Glu Ile

260 265 270

Asp Gln Gln

275

<210> 2

<211> 828

<212> DNA

<213> 红叶杨树()

<400> 2

atggtaagct cattaggagt aaggaaaggt gcatggaccg aagaggagga tatacttcta 60

cggaagtgcg tagagaaata tggtgaagga agatggtgtc aaattcctct caaagcaggt 120

ttgaatagat gcaggaaaag ctgtagaatg aggtggttga actatcttaa gccaaatgtc 180

aagagagggc tgttttcagt gggcgaagta gatttgatta tcaggctaca caagctgctt 240

ggcaacaggt ggtcattgat tgccggtaga cttccaggaa gaacagcaaa tgatgtaaag 300

aattattgga acacaaacct gcgtaagaag gtggtttcta gcactagaga agctcaacca 360

gaaccagaac cagaaccaga accagaacca gaaccaaaat caataacaaa agacaacata 420

ataaagcctc gacctcggaa cttcaaaaat ttatgttggt taggggctgg aaaaggaact 480

ccatttatta atgctggttc tcaatgtggg gacgatcttt gcaagccata ttctaccata 540

gcatttccac cttccgatac cgatgaagtt gaaaggatgt ggtgggaaag cctgttagat 600

gacaaagaaa ttaatctaac gaacagcaac agttgtcaaa atagttgtct gggttctggt 660

tccacagcta acctagagcc catcaacagt ctttttgtag aggacaaccc actaggaggg 720

ataatgattg gggatgtgtt ctctgaccaa ggacaaaatc gttggggcga catttctttc 780

gatgcagacc tttggagtct aatcgataca gaaatagatc aacaatga 828

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atggtaagct cattaggagt aagg 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tcattgttga tctatttctg tatcg 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tgacgcacaa tcccactatc 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tcattgttga tctatttctg tatcg 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gcaggaaaag ctgtagaatg agg 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ggagttcctt ttccagctct taac 24

Claims (10)

1.一种花青素合成调控转录因子，其为选自下组的蛋白质：

(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白质功能的由(a)衍生的蛋白质；

(c)与(a)限定的蛋白质序列有75％以上、优选80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、更优地98％以上同源性，且具有(a)蛋白质功能的由(a)衍生的蛋白质；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述氨基酸序列的衍生蛋白质。

2.一种多核苷酸，其选自：

(A)编码权利要求1所述花青素合成调控转录因子的多核苷酸；

(B)编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；

(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥75％、优选≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、更优地≥98％的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)中任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，为SEQ ID NO:2。

4.包含如权利要求2或3所述多核苷酸的载体。

5.如权利要求2或3所述的多核苷酸、或者如权利要求4所述载体在促进植物合成花青素中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，用于创建红叶植物，所述植物是木本植物或者草本植物。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述植物是杨树。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述红叶植物的创建包括如下步骤：

(1)通过PCR扩增上述多核苷酸，将扩增的基因片段连接于载体上，构建得到PdMYB118过表达载体；

(2)将步骤(1)中构建的PdMYB118过表达载体转化入农杆菌感受态细胞中，得到农杆菌工程菌；

(3)使用步骤(2)中构建的农杆菌工程菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法将PdMYB118基因转入植物中，并对植物体进行分子水平鉴定，得到PdMYB118基因上调表达的阳性转基因植株，筛选出叶片红色的转基因植株。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，步骤(1)中构建的PdMYB118过表达载体包含序列SEQ ID NO:2和用于驱动SEQ ID NO:2表达的35S启动子。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，步骤(2)中的农杆菌是农杆菌EHA105。

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