CN115261505A - 一种与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，涉及杨树分子遗传育种技术领域；本发明在杨树第17号染色体发现与杨树花青素含量相关的主效QTL，并确定6个与杨树花青素含量相关的SNP。本发明的与杨树花青素含量相关QTL位点分子标记方法，为彩叶杨树创制和选育提供了新的选择，在加速杨树育种进程上有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传育种技术领域，特别涉及一种与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法。
背景技术
彩叶植物具有色彩鲜艳、观赏期长等特点，有助于提高城市绿化的观赏性。花青素、叶绿素、类胡萝卜素等天然色素含量变化是影响彩叶植物叶片颜色形成的决定因素。而花青素是引起叶片变红的主要原因，它主要积聚在营养组织皮下细胞层的液泡内，通过吸收潜在的破坏性UV-B辐射起到光保护的作用。花青素还可以作为抗氧化化合物，参与不同的化学机制，如从羟基释放氢原子或作为金属螯合剂，从而有效清除自由基和活性氧延缓衰老过程。花青素生物合成途径已经较为清晰，但是有关其生物合成的调控网络仍存在众多未知因素。
黑杨派(Aigeiros)杨树(Populus)在嫩叶期呈现嫩红色，是彩叶杨树重要的变异来源，目前已从中成功选育出全红杨、中红杨、彩虹杨等多个红叶芽变品种，但调控杨树叶色变异的原因仍是未知的。
因此，开发一种与杨树花青素含量相关数量性状位点(Quantitative traitlocus，QTL)分子标记方法，能够在DNA水平上对分离群体的花青素含量进行选择，为杨树彩叶分子育种提供基因组位点信息和标记资源，就成为该技术领域亟需解决的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，能够在DNA水平上对分离群体的花青素含量进行选择，为杨树彩叶分子育种提供基因组位点信息和标记资源。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种与杨树花青素含量相关数量性状(QTL)位点分子标记方法，包括以下步骤：
步骤1，丹红杨(Populus deltoides‘Danhong’)、通辽1号杨(Populus simonii‘Tongliao1’)和其F1代杂交群体叶片花青素含量的测定：
将丹红杨、通辽1号杨和其F1代杂交群体的嫩叶研磨并用盐酸甲醇溶液萃取，测量在530和657nm处花青素提取物的吸光度，计算花青素含量；
步骤2，利用丹红杨×通辽1号杨高密度遗传图谱对花青素含量进行QTL定位；
步骤3，对QTL位点单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)标记进行鉴定和候选基因挖掘；
步骤4，分析候选基因在不同个体内的表达水平；
步骤5，分析不同基因型下杂交亲本和子代的花青素含量是否存在显著差异。
优选地，步骤1中所述盐酸甲醇溶液组分体积比为1﹕99。
优选地，步骤2具体如下：利用MapQTL6.0软件的复合区间作图(MIM)模型对花青素含量进行数量性状位点(QTL)定位，以LOD值3.0为阈值，计算标记的表型变异解释率(Phenotypic variation explained，PVE)。
优选地，步骤2的结果如下：在第3连锁群的117.22cM处，检测到杨树花青素含量的QTL位点，标记lm5573的LOD值为7.80，解释表型变异率为14.0％，该QTL位点为主效QTL，其左右标记分别为np4600和lm5562。
优选地，步骤3具体如下：
通过将其比对至毛果杨3.0版参考基因组，发现：该标记区间内包含5个MYB转录因子，共包含181个SNP，其中，117个位于基因间隔区，35个位于内含子，21个位于外显子，8个位于UTR区。
优选地，步骤3中，发现5个与花青素含量相关的候选基因：Potri.017G125900(MYB113)、Potri.017G126000(MYB117)、Potri.017G125800(MYB118)、Potri.017G125600(MYB119)和Potri.017G125700(MYB120)。
优选地，步骤3中，进一步分析发现：位于PdMYB119(Potri.017G125600)UTR区(G/T突变)、内含子(C/T、A/G和T/C突变)和外显子区域(T/G、T/A突变)的6个位点的SNP均会引起花青素含量在不同基因型之间显著差异。
本发明的另一目的是提供上述与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法在杨树分子育种中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种调控杨树花青素含量的分子标记的应用，所述调控杨树花青素含量的主效QTL位点位于毛果杨参考基因组3.0版本17号染色体上的MYB119基因。
优选地，所述MYB119基因Chr17:13748379bp处G/T突变、Chr17:13748982bp处C/T突变、Chr17:13749137bp处A/G突变、Chr17:13749174bp处T/C突变、Chr17:13750836bp处T/G突变和Chr17:13750989bp处T/A突变。
优选地，所述MYB119基因用于彩叶杨树的选择育种。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明利用黑杨派丹红杨和青杨派小叶杨通辽1号杨的F1杂交群体SNP高密度遗传图谱，结合田间的F1群体叶片花青素含量数据，最终鉴定出杨树花青素含量相关的主效QTL位点和SNP标记。依据花青素含量相关的主效QTL紧密连锁的分子标记和SNP位点，能改定向培育花青素含量高的杨树品种，进而加速彩叶杨树的推广，为杨树彩叶分子育种提供位点信息和标记资源。
下面通过具体实施方式和附图对本发明作进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1为本发明实施例1发现的丹红杨、通辽1号杨和其杂交子代的叶片表型。
图2-1为本发明实施例1识别到的杨树叶片花青素含量主效QTL位点在丹红杨和通辽1号杨的联合遗传图谱第3连锁群上的位置。
图2-2为本发明识别到的lm5573标记区间内的候选基因。
图3为本发明识别到的lm5573标记候选基因在亲本和不同叶色的杂交子代叶片的表达水平。
图4为本发明识别到的PdMYB119基因范围内6个SNP位点不同基因型杂交子代花青素含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以下实施例中未进行详细说明。应当理解，以下文字仅仅用以描述本申请的一种或几种具体的实施方式，并不对本申请具体请求的保护范围进行严格限定，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
一种与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，包括以下步骤：
1.实验材料与方法
1.1实验材料
实验材料为丹红杨(Populus deltoides‘Danhong’)和通辽1号杨(Populussimonii‘Tongliao1’)及其238个F1杂交子代共240个株系，2018年种植于中国林业科学研究院苗圃(北京)，田间试验为三个区组，随机排列，每个小区三株。于2019年3月平茬，4-6月观察叶片颜色；
1.2花青素含量测定与统计
2019年5月采集顶端未完全展开幼嫩叶片，测定花青素含量，将研磨后的粉末于4℃下，用含0.1v％HCl的甲醇提取花青素，持续24小时，混合物12000g下离心10分钟，并收集上清液，使用紫外-可见分光光度计，在530和657nm处测量花青素提取物的吸光度,并利用公式计算花青素的含量：(A530-0.25×A657)/鲜重。
1.3 QTL定位
在已构建的丹红杨×通辽1号杨高密度遗传图谱基础上，利用MapQTL6.0软件的复合区间作图(MIM)模型，对花青素含量进行数量性状位点(QTL)定位，以LOD值3.0为阈值，计算标记的表型变异解释率(PVE)；
1.4候选基因和SNP筛选
比对毛果杨3.0版参考基因组挖掘QTL标记上、下游10kb范围内的所有基因，作为候选基因。依据以下标准过滤SNP数据集，即：SNP缺失率<0.1、最小等位基因频率>0.05、哈温平衡>0.001、个体SNP完整度>0.95、个体平均测序深度≥4；同时识别lm5573标记内的SNP，并确定可能与目标性状相关的候选基因和SNP位点；
1.5候选基因验证
使用RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒(Tiangen，Beijing，China)提取杂交亲本丹红杨、通辽1号杨和呈现不同叶色的杂交子代(5个红叶、5个绿叶)的总RNA，每份样品中1μg高质量的RNA，使用NEBNext R UltraTMRNA Library Prep Kit试剂盒(NEB,U.S.A)构建测序文库制备；然后，在Illumina Hiseq平台上生成150bp的配对端读数，首先，过滤原始序列，并使用TopHat v2.0.12比对到参考基因组，进行转录组测序，进一步验证分析其表达水平；
1.6候选SNP验证
根据过滤获得SNP数据集，对标记区间内的SNP识别，统计不同SNP位点基因型与花青素含量的关系，确定不同基因突变对花青素含量的影响；
2结果与分析
2.1杂交群体表型变异
如图1所示，为本发明发现的丹红杨、通辽1号杨和其杂交子代的叶片表型；首先对亲本和杂交群体进行了表型性状测定分析，丹红杨叶片成嫩红色，显微结构观察表明红色主要集中在叶片上表皮细胞(图1上左，标尺＝200μm)，而小叶杨叶片为绿色且叶片上表皮细胞为绿色(图1上右)，同时杂交群体叶色性状存在分离，它们较倾向于母本红色嫩叶(图1下左和图1下右)；亲本的花青素含量存在较大差异，杂交子代花青素含量的变异系数较大为0.683，子代的花青素平均含量为0.078，远高于亲本，见下表1。
表1丹红杨×通辽1号杨F1杂交群体花青素含量
2.2花青素含量的QTL分析
采用复合区间作图法(MIM)，对花青素含量进行QTL分析，结果如图2-1所示，为本发明识别到的杨树叶片花青素含量主效QTL位点在丹红杨和通辽1号杨的联合遗传图谱第3连锁群上的位置(A)；横坐标为标记之间的遗传距离，单位为厘摩(cM)；纵坐标为QTL的LOD值；发现：在第3连锁群的117.22cM处，检测到杨树花青素含量的QTL位点，标记lm5573的LOD值为7.80，解释表型变异率为14.0％，该QTL位点为主效QTL，其左右标记分别为np4600和lm5562；
2.3候选基因筛选
如图2-2所示，为本发明识别到的lm5573标记区间内的候选基因(B)；标记lm5573实际位于杨树基因组的第17号染色体，通过对其上下游10kb范围内的基因进行注释，发现5个可能与花青素含量相关的候选基因，即：Potri.017G125900(MYB113)、Potri.017G126000(MYB117)、Potri.017G125800(MYB118)、Potri.017G125600(MYB119)和Potri.017G125700(MYB120)；研究表明MYB可以与bHLH131、WD40形成MBW复合体，调控花青素或类黄酮的生物合成，因此，该位点是重要的调控位点，同时，结合转录组数据发现：除MYB120外的4个基因均有差异表达，其中，MYB119在不同株系表达量最高，且在红叶的丹红杨和红叶杂交子代中高表达，如图3所示，为本发明识别到的lm5573标记候选基因在亲本和不同叶色的杂交子代叶片的表达水平，横坐标为个体，纵坐标为表达水平；Pd：丹红杨，PdsR：红叶杂交子代，PdsG：绿叶杂交子代，Ps：通辽1号杨；
2.4候选SNP筛选
进一步筛选标记lm5573范围内的SNP位点，共发现181个SNP，其中117个位于基因间隔区，35个位于内含子，21个位于外显子，8个位于UTR区；进一步分析发现：位于PdMYB119(Potri.017G125600)的UTR区(13748379bp处G/T)、内含子(13748982bp处C/T、13749137bp处A/G、13749174bp处T/C)和外显子区域(13750836bp处T/G、13750989bp处T/A)的每个位点的突变均会产生3种基因型，6个位点的碱基突变，均会引起花青素含量在不同基因型之间显著差异，如图4所示，为本发明识别到的PdMYB119基因范围内6个SNP位点不同基因型杂交子代花青素含量。ns：无显著性差异，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001。
综上所述，可以得出杨树17号染色体MYB119是调控杨树花青素积累和叶片变红的重要基因，同时确定其基因上Chr17:13748379bp处G/T突变、Chr17:13748982bp处C/T突变、Chr17:13749137bp处A/G突变、Chr17:13749174bp处T/C突变、Chr17:13750836bp处T/G突变和Chr17:13750989bp处T/A突变，都影响杨树花青素的积累；lm5573和SNPs位点可以作为彩叶杨树改良筛选的分子标记，应用于杨树分子育种过程中。
本发明基于对丹红杨×通辽1号杨F1杂交群体进行数量性状位点定位，鉴定到了杨树花青素含量相关QTL位点标记lm5573，其位于连锁群3和基因组的17号染色体上。
本发明提供的与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，揭示了调控花青素合成位点，具有重要意义；以杂交群体为基础进行数量性状定位挖掘关键调控标记和基因，有利于解析叶色形成的调控机制和创制彩叶种质。
本发明以幼叶颜色为红色的黑杨派美洲黑杨丹红杨为母本和叶片颜色为绿色的青杨派小叶杨通辽1号杨为父本进行杂交，构建F1代杂交群体，利用构建的单核苷酸多态性标记高密度遗传图谱挖掘花青素相关位点，对丰富杨树花青素的调控提供新的见解，为创造彩色叶杨树新种质提供理论依据。
虽然以上对本发明目的构思和实施例作了详尽说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明做出各种改进和变换，而这种改进和变换仍然应当属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，包括以下步骤：
步骤1，丹红杨和通辽1号杨中花青素含量的测定：
将丹红杨和通辽1号杨的嫩叶研磨并用盐酸甲醇溶液萃取，测量在530和657nm处花青素提取物的吸光度，计算花青素含量；
步骤2，利用丹红杨×通辽1号杨高密度遗传图谱进行QTL定位；
步骤3，对QTL位点单核苷酸多态性(SNP)标记进行鉴定和候选基因挖掘；
步骤4，分析候选基因在不同个体内的表达水平；
步骤5，分析不同基因型下杂交亲本和子代的花青素含量是否存在显著差异。
2.如权利要求1所述与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，其特征在于：步骤1中所述盐酸甲醇溶液组分体积比为1﹕99。
3.如权利要求1所述与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，其特征在于：步骤2具体如下：利用MapQTL6.0软件的复合区间作图模型对花青素含量进行数量性状位点定位，以LOD值3.0为阈值，计算标记的表型变异解释率。
4.如权利要求1所述与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，其特征在于：步骤2的结果如下：在第3连锁群的117.22cM处，检测到杨树花青素含量的QTL位点，标记lm5573的LOD值为7.80，解释表型变异率为14.0％，该QTL位点为主效QTL，其左右标记分别为np4600和lm5562。
5.如权利要求1所述与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，其特征在于：步骤3具体如下：通过将其比对至毛果杨3.0版参考基因组，发现：该标记区间内包含5个MYB转录因子，共包含181个SNP，其中，117个位于基因间隔区，35个位于内含子，21个位于外显子，8个位于UTR区。
6.如权利要求1所述与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，其特征在于：步骤3中，发现5个与花青素含量相关的候选基因：Potri.017G125900(MYB113)、Potri.017G126000(MYB117)、Potri.017G125800(MYB118)、Potri.017G125600(MYB119)和Potri.017G125700(MYB120)。
7.如权利要求1所述与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，其特征在于：步骤3中，进一步分析发现：位于PdMYB119(Potri.017G125600)UTR区(G/T突变)、内含子(C/T、A/G、T/C突变)和外显子区域(T/G、T/A突变)的6个位点的SNP均会引起花青素含量在不同基因型之间显著差异。
8.如权利要求1-7所述与杨树花青素含量相关数量性状位点分子标记方法，在杨树分子育种中的应用。
9.一种调控杨树花青素含量的分子标记的应用，所述调控杨树花青素含量的主效数量性状位点位于毛果杨参考基因组3.0版本17号染色体上的MYB119基因。
10.如权利要求9所述调控杨树花青素含量的分子标记的应用，其特征在于：所述MYB119基因Chr17:13748379bp处G/T突变、Chr17:13748982bp处C/T突变、Chr17:13749137bp处A/G突变、Chr17:13749174bp处T/C突变、Chr17:13750836bp处T/G突变和Chr17:13750989bp处T/A突变；所述MYB119基因用于彩叶杨树的选择育种。
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