CN113151560A - 一种筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记及其方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记，所述分子标记为SNP分子标记组合，由SNP1和SNP2两个SNP位点组成，其中，所述SNP1位于杨树基因组ALMT12基因下游第1182位碱基，具有A/T多态性；所述SNP2位于杨树基因组WRKY32基因上游第94位碱基，具有A/C多态性，上述两个位点组成的分子标记组合，能够在杨树幼苗期精准高效地筛选高气孔密度以及高光合效率的树种，缩短杨树育种周期。本发明还公开了用于检测上述分子标记的引物组及其应用、标记的获得方法、预测杨树气孔密度和光合效率的方法及杨树遗传改良方法等，能够显著提高杨树优异种质资源的选育效率。

Description

一种筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记及其方法 和应用

技术领域

本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种快速、精准筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记、试剂盒及其辅助育种方法和应用。

背景技术

杨树是一种在全球广泛分布的工业用材与生态树种，是世界人工林建设的第一大树种，具有早期速生、适应性强、分布广、品种多、易杂交、易改良遗传性、易繁殖等优点，广泛应用于集约栽培，是再生生物资源和森林碳汇的重要组成部分。光合作用直接影响森林生物量的积累，是决定林木生产力最重要的生理过程之一。

气孔是植物叶片或茎表面的小气孔，由一对保卫细胞组成，气孔作为树木与外界进行气体交换的直接通道，能够平衡叶片内部的水分蒸腾与碳获取。气孔表型的多样性，尤其是其密度的改变，可以改变光合作用的效率，从而影响植物内部光合色素的积累和生长发育。因此，对杨树的气孔密度及光合效率进行遗传改良，具有十分重要的理论及应用价值。

但是，杨树作为多年生树种，如果以传统的杂交育种方式进行遗传改良，需要经过杂交、回交等多个世代，耗费时间较长且表型选育稳定性差。随着现代分子育种技术的不断发展，从分子水平对杨树进行遗传改良成为一种新的趋势。

单核苷酸多态性(SNP)标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，被公认为是最新的第三代DNA分子标记，以广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。然而，受到不同实验群体的遗传背景差异、奠基者效应、多基因互作效应、基因-环境互作效应、不完全选择/平衡选择效应、遗传标记数量的限制以及连锁不平衡等因素的干扰，导致目前杨树气孔密度、光合效率遗传改良实践中仍然缺少功能明确、效应显著的、可直接应用的分子标记。

因此，有必要发掘通用的、效应显著的、准确的、与杨树气孔密度和光合效率相关的分子标记，以提高杨树目标性状的选育精度和杨树优异种质资源的选育效率。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，通过全基因组关联分析的方法，发掘了与杨树气孔密度和光合效率显著相关的分子标记，同时获得了与气孔密度和光合效率相关的分子标记的基因型组合类型，能够在分子水平对杨树的气孔密度和光合效率做出精准评价，在杨树幼苗期精准、高效地筛选高气孔密度、高光合效率杨树品种，缩短杨树育种周期。此外，还提供了用于检测分子标记的引物组及其应用等，能够早期、快速、低成本、有效的预测杨树的气孔密度和光合效率，为杨树分子标记辅助选择育种提供了有效手段，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

第一方面，提供了一种筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记，所述分子标记为SNP分子标记组合，其由SNP1和SNP2两个SNP位点组成，

其中，所述SNP1位于杨树基因组ALMT12基因下游第1182位碱基，具有A/T多态性；

所述SNP2位于杨树基因组WRKY32基因上游第94位碱基，具有A/C多态性。

第二方面，提供一种了用于检测第一方面所述分子标记的引物组，所述引物组包括用于扩增SNP1位点的引物对和用于扩增SNP2位点的引物对，

其中，所述用于扩增SNP1位点的引物对为P1和P2，所述引物P1具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，所述引物P2具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

所述用于扩增SNP2位点的引物对为P3和P4，所述引物P3具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，所述引物P4具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

第三方面，提供了一种第一方面所述的分子标记或第二方面所述的引物组在杨树选育中的用途，优选在选育高气孔密度、高光合效率杨树品种中的用途。

第四方面，提供了一种第一方面所述的分子标记的获得方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，选择杨树群体，测定表型性状；

步骤2，提取杨树群体的基因组DNA；

步骤3，获得与气孔密度和光合效率相关的分子标记。

第五方面，提供了一种预测杨树气孔密度和光合效率的方法，所述方法包括检测杨树个体第一方面所述分子标记的基因型组合类型的步骤，

优选地，所述杨树为毛白杨。

第六方面，提供了一种杨树遗传改良的方法，所述方法包括继代选育第一方面所述分子标记的基因型组合类型为TT-AC的个体，淘汰其它基因型组合类型个体的步骤。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记，所涉及的两个SNP位点是在全基因组水平上与杨树气孔密度和光合效率显著关联的SNP位点，能够在分子水平对杨树的气孔密度和光合效率做出精准评价，提高育种精度；

(2)本发明提供的筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记，能够在杨树幼苗期精准高效地筛选高气孔密度以及高光合效率的树种，缩短杨树育种周期；

(3)本发明提供的筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记，适用范围广，效应显著，能够显著提高杨树优异种质资源的选育效率。

附图说明

图1示出本发明实施例1中所述的不同基因型组合类型对毛白杨种质资源群体气孔密度的基因型效应图；

图2示出本发明实施例1中所述的不同基因型组合类型对毛白杨种质资源群体光合效率的基因型效应图。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

全基因组关联分析是指在全基因组范围内寻找与目标性状显著相关的遗传变异。全基因组关联分析的原理是连锁不平衡，即在全基因组范围内总会存在一个SNP与引起性状的致因突变存在连锁不平衡，通过检测该SNP就可以缩小或识别出影响性状的基因组位置。

本发明人发现，在植物领域的全基因组关联分析中，进行单个SNP的关联分析研究时，只有很小一部分数量性状的遗传变异可以被少量显著的SNP所解释，因为单个SNP的作用太小，很难通过严格的检验标准。

因此，本发明的第一方面，提供了一种筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记，所述分子标记为SNP分子标记组合，其由SNP1和SNP2两个SNP位点组成，

其中，所述SNP1位于杨树基因组ALMT12基因下游第1182位碱基，具有A/T多态性；

所述SNP2位于杨树基因组WRKY32基因上游第94位碱基，具有A/C多态性。

在本发明中，所述杨树基因组的版本为杨树参考基因组v3.0(http:// popgenie.org/)。

根据本发明一种优选的实施方式，所述SNP1位于如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第5193位，

所述SNP2位于如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第2407位。

其中，ALMT12基因位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第501～4011位，WRKY32基因位于SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的第2501～8115位。

在本发明中，铝活化苹果酸转运蛋白(Aluminium-activated malatetransporters,ALMTs)在苹果酸的积累与转运过程中有着非常重要的作用，参与重金属胁迫、矿质营养、离子稳态、渗透势调节以及保卫细胞调节等多种生物过程，而且与植物多种非生物胁迫的抵御过程相关。此外，在拟南芥中，AtALMT9主要在保卫细胞中表达，该基因编码的离子通道定位于液泡膜，控制气孔开闭；AtALMT12是质膜定位的苹果酸转运蛋白，调节气孔的关闭，该基因的功能缺失型突变体表现出对ABA、CO₂和黑暗诱导的气孔关闭不敏感的表现型。

WRKY32为N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的新型转录调控因子，它能够与(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)发生特异性作用，调节启动子中含W-box元件的调节基因和/或功能基因的表达，从而参与植物的各种防卫反应，调节植物的生长发育等。

优选地，ALMT12蛋白编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3中所示，WRKY32蛋白编码氨基酸序列如SEQ ID NO：4中所示。

在进一步优选的实施方式中，所述杨树为毛白杨。

其中，杨树是木本植物的模式物种，开发提高杨树光合效率和气孔密度的分子标记，可以为相关重要基因的科学研究提供良好的材料。

杨树分为青杨派、白杨派、黑杨派、胡杨派和大叶杨派，其中，白杨派中的毛白杨是中国特有的乡土树种，分布广泛，以黄河流域中、下游为中心分布区，在我国北方林业生产和生态环境建设中占有重要地位，是北方地区森林培育的先锋树种，因此本发明中优选选择毛白杨作为研究对象。

在本发明中，SNP1位点对应的三种基因型为AA、TT和AT，AA基因型为杨树该位点为A的纯合体，TT基因型为杨树该位点为T的纯合体，AT基因型为杨树该位点为A和T的杂合体。

SNP2位点对应的三种基因型为AA、CC和AC，AA基因型为杨树该位点为A的纯合体，CC基因型为杨树该位点为C的纯合体，AC基因型为杨树该位点为A和C的杂合体。

在更进一步优选的实施方式中，在SNP1位点的基因型为TT，且在SNP2位点的基因型为AC(即分子标记的基因型组合为TT-AC)的杨树个体，具有最大的气孔密度和最高的光合效率；

在SNP1位点的基因型为AA，且在SNP2位点的基因型为AA(即分子标记的基因型组合为AA-AA)的杨树个体，具有最小的气孔密度和最低的光合效率。

本发明人研究发现，通过检测杨树个体的基因组DNA是否具有上述分子标记，能够有效地确定其气孔密度大小和光合速率高低。具体地，如上所述，在SNP1位点的基因型为TT，且在SNP2位点的基因型为AC的杨树个体，其气孔密度最大，光合效率最高；在SNP1位点的基因型为AA，且在SNP2位点的基因型为AA的杨树个体，其气孔密度最小，光合效率最低。从而，检测到待测杨树个体的SNP分子标记组合为TT-AC基因型组合时，则能够确定其气孔密度较大，光合效率较高；检测到待测杨树个体的SNP分子标记组合为AA-AA基因型组合时，则能够确定其气孔密度较小，光合效率较低。由此，可以根据实际育种需求对杨树进行早期选择，进一步提高育种的效率和准确性。

在本发明中，当采用针对上述分子标记的特异性引物对待测杨树基因组DNA进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，通过对PCR产物进行测序，能够有效地确定待测杨树的气孔密度大小和光合效率高低。具体地，当测序结果为TT-AC基因型组合时，可以确定待测杨树的气孔密度较大，光合效率较高；当测序结果为AA-AA基因型组合时，可以确定待测杨树的气孔密度较小，光合效率较低。

本发明的第二方面，提供了一种用于检测第一方面所述分子标记的引物组，所述引物组包括用于扩增SNP1位点的引物对和用于扩增SNP2位点的引物对，

其中，所述用于扩增SNP1位点的引物对为P1和P2，所述引物P1具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，所述引物P2具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

所述用于扩增SNP2位点的引物对为P3和P4，所述引物P3具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，所述引物P4具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

优选地，所述引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，引物P4的核苷酸序列如SEQID NO：8所示。

在本发明中，利用上述引物对能够有效地对待测杨树上述与气孔密度和光合效率相关的分子标记所在核苷酸片段进行PCR扩增，进而通过直接测序或电泳能够有效实现对该分子标记的检测，确定待测杨树是否具有该分子标记。因此，上述用于检测分子标记的引物组，能够有效用于杨树分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地筛选高气孔密度、高光合效率杨树的优良品种。

优选地，在SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的5'端和3'端分别增加1～20个碱基并能得到基本相同DNA片段(上游和下游引物之间的DNA序列相同)的引物对，均包括在本发明的引物对中。

本发明的第三方面，提供了一种第一方面所述的分子标记或第二方面所述的引物组在杨树选育中的用途，优选在选育高气孔密度、高光合效率杨树品种中的用途。

本发明的第四方面，提供了一种第一方面所述的分子标记的获得方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，选择杨树群体，测定表型性状。

在本发明中，选取自然生长的毛白杨个体组成的种质资源群体作为获得分子标记的分析群体，所述群体优选包括104株个体。

其中，所述表型性状包括气孔密度和光合效率，所述气孔密度可以按照现有技术中常用的方法测定，例如：先用胶带清理毛白杨叶片背面的纤毛，再将指甲油均匀涂抹在叶背，待风干后撕下放置于显微镜下观察，每个样品选取三个不重叠的区域进行拍照，利用ImageJ软件提取照片表型进行分析测定。

所述光合效率采用现有技术中常用的方法测定，例如：采用LI-6400XT便携式光合作用测量系统测量得到。

步骤2，提取杨树群体的基因组DNA。

其中，对群体中每个个体的叶片组织进行DNA提取，可以采用现有技术中常用的方法或DNA提取试剂盒进行，例如：利用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen China,Shanghai,China)试剂盒。

优选地，采用紫外分光光度计和凝胶电泳进行DNA质量检测，将检验合格的DNA放置于-20℃保存，以用于后续分型测定。

步骤3，获得与气孔密度和光合效率相关的分子标记。

在本发明中，优选采用全基因组关联分析的方法获得与气孔密度和光合效率相关的分子标记，更优选按照包括下述步骤的方法进行：

步骤3-1，在全基因组水平鉴定单核苷酸多态性位点，并获得SNP位点的基因型。

对每个个体的DNA进行重测序获得原始数据，对其进行质量控制，并将质量控制后的数据比对到杨树参考基因组v3.0上(http://popgenie.org/)，在全基因组水平鉴定单核苷酸多态性位点(SNP)，并获得SNP位点的基因型。

其中，所述质量控制的标准是：(i)去除掉含有≥10％未识别核苷酸的读取(reads)；(ii)去除掉碱基质量＜5的数量＞50％的reads；(iii)去除掉＞10nt比对到适配器(adapter)的reads，允许≤10％的错配；(iv)删除在文库构建过程中通过PCR扩增产生的推定PCR重复片段(两个完全相同的配对的read1和read2)。

步骤3-2，对全基因组水平的SNPs进行筛选，获得高质量SNPs标记集合。

其中，优选利用vcftools软件对全基因组SNP进行筛选，筛选的条件为：最小等位基因频率MAF(Minor Allele Frequency)＞0.05，缺失基因型MG(Missing Genotype)＜0.2。

步骤3-3，对全基因组高质量SNPs与杨树表型性状进行关联分析，获得显著关联的SNP位点。

在本发明中，优选采用Efficient Mixed-Model AssociCTioneXpedited(EMMAX)软件中的混合线性模型(Mixed linear model,MLM)，对全基因组高质量SNPs集合与杨树表型性状进行关联分析，获得与气孔密度、光合效率显著关联的SNP位点。

步骤3-4，检验不同基因型组合的杨树个体表型的差异显著性。

在本发明中，优选采用F-test和Student’s t-test检验(P≤0.05)两种方法检验不同基因型组合的杨树表型的差异显著性。

在本发明中，当毛白杨个体上述分子标记组合的基因型组合为TT-AC时，对应的气孔密度最大、光合效率最高；当毛白杨个体上述分子标记组合的基因型组合为AA-AA时，对应的气孔密度最小、光合效率最低。

本发明的第五方面，提供了一种预测杨树气孔密度和光合效率的方法，所述方法包括检测杨树上述分子标记的基因型组合类型的步骤，

其中，所述杨树优选为毛白杨，

优选地，所述预测杨树气孔密度和光合效率的方法包括以下步骤：

步骤i，以待测杨树的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物。

其中，所述扩增优选采用第二方面所述的引物组进行。

步骤ii，根据扩增产物，确定待测杨树相应分子标记的基因型组合类型。

其中，确定待测杨树相应分子标记的基因型组合类型的方法包括但不限于测序。

步骤iii，根据待测杨树的分子标记的基因型组合类型预测杨树的气孔密度大小和光合效率高低。

其中，若待测杨树的分子标记的基因型组合类型为TT-AC，则其气孔密度最大、光合效率最高；若待测杨树的分子标记的基因型组合类型为AA-AA，则其气孔密度最小、光合效率最低。

本发明的第六方面，提供了一种杨树遗传改良的方法，所述方法包括继代选育上述分子标记的基因型组合类型为TT-AC的个体，淘汰其它基因型组合类型个体的步骤。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记

1、试验群体

毛白杨正常生长条件下的种质资源群体：2019年3月，在山东省冠县通过嫁接克隆的方法获得104株毛白杨一年生自然群体，抽样种群几乎代表了毛白杨全部的自然分布区域。

2、气孔密度和光合效率的测定

气孔密度测定方法如下：先用胶带清理毛白杨叶片背面的纤毛，再将指甲油均匀涂抹在叶背，待风干后撕下放置于显微镜下观察，每个样品选取三个不重叠的区域进行拍照，利用ImageJ软件提取照片表型。

光合效率测定方法：采用LI-6400XT便携式光合作用测量系统测量得到。

3、DNA的提取

按照DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen China，Shanghai，China)试剂盒所述步骤提取毛白杨种质资源群体中叶片组织的基因组DNA。

采用紫外分光光度计和凝胶电泳进行DNA质量检测，将检验合格的DNA放置于-20℃保存。

4、获得与气孔密度和光合效率相关的分子标记

(1)对毛白杨种质资源群体每株个体的DNA进行重测序获得原始数据(RawdCTa)，对DNA原始数据进行质量控制(Quality Control)后得到干净数据(CleandCTa)；

其中，DNA重测序为双末端测序，所述测序的深度为30×；所述测序采用IlluminaGA2重测序平台；

质量控制的标准是：(i)去除掉含有≥10％未识别核苷酸的读取(reads)；(ii)去除掉碱基质量＜5的数量＞50％的reads；(iii)去除掉＞10nt比对到适配器(adapter)的reads，允许≤10％的错配；(iv)删除在文库构建过程中通过PCR扩增产生的推定PCR重复片段(两个完全相同的配对的read1和read2)；

利用Burrows-WheelerAlignerv0.7.5a-r405(默认参数)将每个样本的cleandCTa比对到杨树参考基因组v3.0(http://popgenie.org/)上；利用SAMtoolsv1.1过滤掉低质量reads(MQ＜20)；利用Genome Analysis Toolkit(GCTK)v4.0鉴定全基因组单核苷酸多态性位点(SNP)，参数如下：SNP:QD<5.0||MQ<40.0||FS>60.0||SOR>3.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0；Indel:QD<5.0||FS>200.0||SOR>10.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0；利用Vcftools_0.1.13得到双等位SNPs。

最终，利用104株毛白杨种质资源群体得到最小等位基因频率(Minor AlleleFrequency，MAF)＞0.05，缺失基因型(Missing Genotype,MG)＜0.2的共计13,063,406个SNPs。

(2)利用vcftools软件对全基因组SNP进行筛选，得到803,837个SNP的集合，筛选的条件为：MAF＞0.05，MG＜0.2，连锁不平衡(r²)<0.2，杂合频率<95％；利用该SNP集合通过Admixture v1.3.0软件进行群体结构分析；K值的范围是1-10，在K＝3时，取得最小交叉验证误差值。

(3)使用Efficient Mixed-Model AssociCTioneXpedited(EMMAX)软件中的混合线性模型(Mixed linear model，MLM)，进行步骤(2)筛选得到的SNP集合与104株毛白杨种质资源群体SNP-表型性状关联分析，确定与气孔密度和光合效率显著关联的SNP位点；

其中，利用EMMAX软件计算亲缘关系，作为随机效应的方差-协方差矩阵，以步骤(2)中的群体结构作为固定效应。

经过上述筛选，获得2个SNP位点与毛白杨种质资源群体的气孔密度和光和效率显著相关，P≤1.24E-06。其中，两个SNP位点具体分别位于如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第5193位和如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第2407位。

(4)采用F-test和Student’s t-test检验(P≤0.05)两种方法检验不同基因型组合的毛白杨表型的差异显著性，发现基因型组合为TT-AC的个体相较于基因型组合为AA-AA的个体，能够显著提高毛白杨种质资源群体中个体的气孔密度和光合效率。

通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站在线保守结构域比对工具发现ALMT12基因第106～1476位碱基编码一个铝活化苹果酸转运体结构域，WRKY32基因第616～780位碱基编码一个WRKY DNA结合域，第1132～1299位碱基编码一个DNA结合域。

按照上述步骤获得的与气孔密度和光合效率相关的分子标记的基因型组合类型及其基因型数据，结果如表1所示：

表1

由表1可知，当SNP1位点的基因型为TT，SNP2位点的基因型为AC，即基因型组合类型为TT-AC时，对应的毛白杨个体的气孔密度最大，光合效率最高，相应个体的气孔密度(441.51±91.57n/μm²)与整个群体平均气孔密度(371.77±78.95n/μm²)相比提高18.76％，相应个体的光合效率(13.42±3.93μmol CO₂ m^-2s^-1)与整个群体平均光合效率(10.40±4.16μmol CO₂ m^-2s^-1)相比提高29.07％。

当SNP1位点的基因型为AA，SNP2位点的基因型为AA，即基因型组合类型为AA-AA时，对应的毛白杨个体的气孔密度最小，光合效率最低，相应个体的气孔密度(299.89±37.04n/μm²)与整个群体平均气孔密度(371.77±78.95n/μm²)相比降低19.33％，相应个体的光合效率(5.22±2.79μmol CO₂ m^-2s^-1)与整个群体平均光合效率(10.40±4.16μmol CO₂m^-2s^-1)相比降低49.77％。

其他基因型组合类型的个体(包括TT-CC、TT-AA、AA-AC、AA-CC、AT-AC、AT-CC、AT-AA)，表现为气孔密度和光合效率适中(分别为344.31±21.82n/μm²，11.56±0.74μmol CO₂m^-2s^-1)。

进一步地，不同基因型组合类型对毛白杨气孔密度、光合效率的基因型效应分别如图1和2所示，由图1和2可以看出，毛白杨上述分子标记的基因型组合类型为TT-AC的个体具有最大的气孔密度和最高的净光合速率，毛白杨上述分子标记的基因型组合类型为AA-AA的个体具有最小的气孔密度和最低的净光合速率。

实验例

实验例1对分子标记组合的有效性进行验证

在2年生毛白杨种质资源群体(300株，山东冠县基地)随机选取45株具有不同基因型组合类型的毛白杨个体，通过采集叶片进行组织培养，2个月获得相应组培苗，利用上述方法进行气孔密度和净光合速率的测定，结果如表2所示。

表2

由表2可知，当SNP1位点的基因型为TT，SNP2位点的基因型为AC时，对应的毛白杨个体的气孔密度最大，光合效率最高，相应个体的气孔密度(372.29±9.91n/μm²)与整个群体平均气孔密度(336.09±37.28n/μm²)相比提高10.77％，相应个体的光合效率(15.80±1.67μmol CO₂ m^-2s^-1)与整个群体平均光合效率(11.69±3.78μmol CO₂ m^-2s^-1)相比提高35.19％。

当SNP1位点的基因型为AA，SNP2位点的基因型为AA时，对应的毛白杨个体的气孔密度最小，光合效率最低，相应个体的气孔密度(292.05±22.75n/μm²)与整个群体平均气孔密度(336.09±37.28n/μm²)相比降低13.10％，相应个体的光合效率(7.51±2.23μmolCO₂ m^-2s^-1)与整个群体平均光合效率(11.69±3.78μmol CO₂ m^-2s^-1)相比降低35.76％。

其他基因型类型的个体(包括TT-CC、TT-AA、AA-AC、AA-CC、AT-AC、AT-CC、AT-AA)，表现为气孔密度和光合效率适中(分别为343.93±15.59n/μm²，11.76±0.82μmol CO₂ m^-2s^-1)。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京林业大学

<120> 一种筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记及其方法和应用

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5510

<212> DNA

<213> 核苷酸序列（Populus tomentosa）

<400> 1

ttatttaata taaaactatt aattcttgtg attttatttc atagcttaga ttcttgactt 60

aaagtagttc tttgatagaa attaaactct gaattaaccg tattcatatc ctccataatt 120

ctgcaacttc ttcaatgcca tgaattatga tcttgcctag ccactttgca ccgataaaga 180

agcaaatgtc acgagtggaa acctttccaa gtactgatca atgcttgtga tgataatttg 240

aagtactttc tggaggaagc aaatctaaac acataaccaa gaatgaaaaa gaaaattaat 300

gactcaacat tttatcatgt ggttagaaat atatataaac tatttaacaa cataatcaag 360

aaaatacaca atatctctct aatatgttta taaatgattt aaaaaataat gatattaagc 420

cagcaacata gccagagaaa tgttatcact tgccatccag gtggaattat gtcatttttc 480

tttttcagca taatcttttg gtttgcaaac gctactcatt tactcttttg gtggaaagga 540

aaaaaaaata aaaaatagga gctctgatca attagctgaa atactcgaag catatatatg 600

aacaagctgg tagagttaac ataatttgaa cacaaacatg aatacattaa aagaacaagg 660

aatcaatagt aaaagttgca ttatatgatc aggaatataa actcactcag ttccaaaaga 720

ataacagaaa gtaataagct agctaagtaa cgataacaat ggagtatagc ccaatatcct 780

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gggttttaaa atttacaata acctcatctc cgggtttaaa ctctttaaag catgctatcc 900

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tactcagctg tggcctcaac accttcctct ctgctgcttc cgatcttgaa ttttcattag 1080

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gacatttaaa cgaatattaa ttaaattatg gattttatca attaagatgg cggggaaaaa 1500

gagataaaac ttgctatgaa gcatctttct aagttagtcc atactaacca tacagcgtgc 1560

accctaacgt tgttattgta aaatttccaa ggtatattga tcaggaaaac ataatgttta 1620

atattaagtt tggaagataa tataatgata cctgaatttc agattgcaaa catccatgta 1680

aagctacaac agtgtaaccg aaatgacgaa gaacggctcc tagtttcaca tactgttgcc 1740

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ttattaaaat attcattgac acaagctgca agatttaaat tgacatcaaa ttgttacaag 2040

aagccattgg aaaaagcaaa taaaggaata cagaaaattt gaaggaaatg aaatattcag 2100

aaagagcaat tcttggtttt gatgttgcat gcataccttc aatagattta gctagccctt 2160

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caacaaacat tattttatta gaatctttta catgttccat aagaaattgt tcccaaagtg 2820

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gggactagag gtcataaata tttgaaatta tgatcagatg ctcttcagat aaatcttaag 3000

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aatcttttgt gacatggaat gaactttaaa ctatttccat cgagcaacat cctagaagac 3120

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ggtcgacacc cttaaccctc tatatatata aatgaggtga ttgatctaag aagcaaaagg 3840

ttagattaat gtgtatattt ggaaacaggt aagatgatta atcttgggtg ttgtgcgttg 3900

ttaattaatt aagttaaaga aatgattcat acataatcaa tgacagggaa agtattaaag 3960

aaatagtgtt gcttctcgga atgctagtgg ggagttttga tgtgatatga gaactccaac 4020

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gtcttatagt atatattaaa acaaatacat ttttgtttta ttgatgaacg ttaatggagg 4260

tttctatacg agagcccccc ccgtaaagag gattcaccat gtgttaggac ttaggtgcta 4320

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cccaaagaga gtccgaatgc ttcattactg tcattaatat ttgtgtctga aggatgccca 4440

acaattcaga tttccacata taattaatta agagaggtgg agtggaaatt cagacttgag 4500

taggtattta cgcccattct gtagaacaag caccgttaag cctcttattg catcaatttt 4560

atttatttat tttttaaaaa tcgttgaata tttatgctag ttacaagaga atctttgtct 4620

tgcatttaaa ttaaatttac aacagtattg aaataaataa aaaatctaat catttagccc 4680

ttgtttagaa acgcgattca gatattattt tttaaaattt aaattttttg atttaaaaag 4740

aattttttta ttgttttgat gtgttgatat taaaaataat ttttttaaaa taataaaaaa 4800

ttattttaat gtatttccaa ataaaaatca ctttaaaaaa caaccattat tagattttga 4860

attatacttt taattataag agataattat tgatatttca aagagattaa cctgcattaa 4920

ttcaggcatg gtattatccc cgaagtgcag ggacaaatct acattattga atatatttgc 4980

atcaagagtc ctgtggtctt ataaatataa atcacacata atggcaatat ggtaataacg 5040

gaagggaaaa aggaagcaca agtcattctc agattacgat agttttctaa attcaaggaa 5100

catgtgatgg tggagtggcc ttcttaacta gtttgattga cccatttttc ggtctcttgg 5160

aagtttggaa attaacgagc ccataattaa ttaagggctc ttcatctaaa gttctccaga 5220

aaaaaaaaaa aaaaaaaaac attagaacac gtaaaatcta gagcctatga aactgattaa 5280

tggcagggtt aatcaaaacg ttgtggatat ttgtgttttt aggttcaaac agaggttggt 5340

ttgggagagc ctaaacttga tttgaaatta tgaagttgat gtcgtggttg aggatgctga 5400

cacgctgcac tgttgggtac tcagcagtgc accgccggtt aaccactgag agagaggtga 5460

ggaagttttg tttgacatga aaagtgaagc tggaaccacc catcattaag 5510

<210> 2

<211> 8614

<212> DNA

<213> 核苷酸序列（Populus tomentosa）

<400> 2

ttttggtgta aagagcaaaa tcactattat attgtttatg tgaatattat tttttagtac 60

gtgagtaata tttttttcaa agtgttttag ttttggttaa tggttgtttg aaaaagaaaa 120

gtaatgagaa agaatgaaag gagaaattta ttgagtttta ttatttctaa ttttttgtta 180

ttaatatagg tgatcgggtc agcttgcgta tacctcgact aatctcacag gtcttaaaat 240

taacgaccat gtaaaccttc agtgaccatc atattagcaa tcatagggct tgaacctaag 300

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atttattatt tctagttgaa attacatttt atttgtttat gttgattttg ctgtattaga 420

aaatttaact ataaaaaatg gcattttaag aatcaaaaca ctgaatttgt gacagctcgt 480

aacttcattt acgagaaata tcgaagaact aagctactaa tctacataaa attacaagta 540

ttattaaatt atttttcaaa ttaattcatt cataaagact aataatttac aatgaagtcc 600

ggctaatggg tgttcttagg acacttgtta aaaatcattt acaatattct tttgttaagt 660

ttattgtaaa cactcaaaaa atattactat atgaaatatt acttatttaa tgtctttaat 720

taatattatt cattttaatt cccttttaat aaaaatcaat aataaattga atttaataaa 780

taccctcaga atctcaaata atactccata agtttttcat agacaactac ctctatctaa 840

acttatagaa ttcgaactag attattttgc atacattaca ttgcgtgtta gatcactttt 900

caacaaaaaa aatatctagg tgtggctaat actttttcta gtagaggatc aaataaaaaa 960

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caaaacaaat aacaataaaa tacaaggtcc aaaattgata taaatataaa ttgaaggaca 1140

caattgtttt ttgaaagagt tggcatgaaa tttaaggcta ggaaataaaa aagagaaaga 1200

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aattacccct cattcaaata tattacaaaa aaattgcatg aaaaggactt atgtgcccct 1500

aactgtaagt tttattcttt ttgcttttaa gagcaatgta atcattttat cgtgcattca 1560

aagtgttaaa agactgaaaa actcttcttc ctaattttaa attttaatag tatgtaagtc 1620

attacactat ttatttaaaa tataaagaat ttatttgttt ccgagtaata tgataataac 1680

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aaatgacaaa ataataatct tactgttgca atccatgtga agtttcacta ctaattaatt 1800

aaaaaaattt atcaccaata aaataattat taatgcttca aatcaattta tactttcctt 1860

tttagccata gaatttatta taaaaattta aaaatgctgc tatgtaaaat aacacttatc 1920

caatatctat aatcttttat tattattatt attattatta ttattattat tatccaataa 1980

taaatgaatt tgaataatgt ttaatgatta cccaaattgt aatagttatt ttttgccata 2040

tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tataactccc ttttccattt 2100

agcacttcat gaaaaagcaa ttgatgtttc aataagatct tacatgtttg ctgcaaatat 2160

tttcgaaaaa aactagaatg tctcatcttg ttggagcacc atcatgctac ctccattcca 2220

gccaacacat gtgatacttc ttctcttcct ccaccattaa tgaatgtacc accgcatgcc 2280

aagttcctat gattatttaa aagcaatcat acttcattct catctggtcc gtccatatta 2340

ttgattcgcc atgtcctaag ctccttcttt ttttcttgtc aaaaattcaa ttcaaataat 2400

aataataata ataataaata catatccttg agatgcttgc tagtgtccac catatcctat 2460

aatttataat ttactcctgt gtactatgac tgtttgcatg taggaattaa agatgcgagg 2520

caaaaaaagg gccacctgcg ccgttaagcg aacccgcgag tcacgatcac ctaaacaaac 2580

ggagaaatga acggcgttgg ttcccaacac tcacgtcacg tcctcaaaac accacgagtc 2640

aattctagtc aaagacacag ataccctcac tggaaaagca aagcgaagca tctaaaaagc 2700

cgattaatcg gtttcggttt tccatttcgg tacagtgtat aaagggcagt tgtaactgtt 2760

ttcgaacttt actcaagtgg ccatggcaaa gagtgagagc ttcgaagctc tcgaagtgca 2820

aaataatgaa cagaaacgac aaggaaatga acaaaacaat ggtaattttg tagaagaaga 2880

ggaattagaa ggcgattata ttgaggaaga ggaggaggag gagatgaggg aggggcaagt 2940

ggaaacccta acggtggtgc cgtcttcttc cacggcgata ctatcgaagg agaatgatca 3000

gcatgtaggt aggttttttc tttattaatt tctttttgtt tgtgtttttg tttttatttt 3060

tttgaatttc tgtagatgat ctggcagggt tgaaaggaaa ttcagcgttg aaaacgcacg 3120

tggaagctga attcaaggtt aggcgcgcca gataatatat ttatttattc ccctttcttt 3180

tgtgatcatt ttttaacaat ttgtgatgct ttaattattt ctatatgcat gttactaacg 3240

cgtagtcttc caaatttgtc tgtttaaata gaattttttg agaactggtg tgtaatttgt 3300

tgttactgat ggaaagtttt agttctagga tttaaggaga tgatgaagta atttgttctt 3360

agggtttagg ttttatcact agaagttatt gattgtcagt gaaaactttt ataaccggaa 3420

ggagagactc aacttaagca tcaataagga aatttcaatg attttgattt cgagtataac 3480

ctgaaagttt atatgccatt gacagagagt ttgatttctg ggtcttgtgg ttgtctctga 3540

aatcagaagg ggtgaagact ttgtcagttg gtaaattctg tgatgaattt caacttggtt 3600

tctgacctga gtgatcacaa ccaacactct caatgtgata caaatttctt ccgtttcaca 3660

ttactcggta gttatctttt ttatgttttt gcctgctggc aaggtttaga acaaatttca 3720

aatatgttgg atcatatata aaacaatgtt tctgaggcat ggaccaacct aacaaatcac 3780

aataagtcag tgagagcgct ttatgccttt cctaaaattt ctagatgtac acttcagtga 3840

acttcccatt tgcatgaaca ttagatcata ttcacaaact tttacctgct tagtacaatt 3900

taagtctggc aaatctatga tttttttagt tgtgcatttt ctttcttttt ttcataggag 3960

caagtagggt tgtcgcacca ggaagttctg ggaagcgtaa cagcccagag tgctaaagcc 4020

cagacccaaa atcagcttcc accttctgta tgtccaactt cctcatcaga actgtcacta 4080

acttctgtta ctcaaccttt atcatctgct ccaagtccaa ctccaccaga aaaaagattg 4140

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attgttaata aaggaatgca cagtcatcca cctcggaaga ataacagcac tagggaaagt 4440

aggagtggat tatctgttgg gcctattttg cagactactg taactgagca tactgtcaga 4500

atgctcaagg attcagaacc agtcacattg tcaatagaac ctgcacaaga aacactgaca 4560

gtttctgaaa gaaaacgaca gagttcaagc agctcggacg agaacaagga aactcaaaac 4620

aaagaggagg atgtcagtga acctgagcca aaacgaaggc aagttttccc atcaatttgg 4680

tttccacaaa ttttatttct tagtgatgtt agcacttctt actgttcttc tgtaaaggca 4740

ctgttggaga tttaatatat atttttttgc tcatttctga ccagattgaa gaagggaaac 4800

ttagagtgtt caaaggctgt tttaaaaccc ggaaaaaaac ctaaatttgt cgtgcatgca 4860

gcaggtgacg tggggatctc aggtgatgga tatagatggc gcaagtatgg acagaagatg 4920

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tttccacatt tatttcaata tagttgtaaa taaggaagag agggataaaa cttaaaatgt 5520

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aaattaaggt atggcagact ctcatgaggc actgctgtta gtgtaatgcg gtggtgactt 5640

ggttcatttg gtgctgtcat aatgataagc catcagagtt ctgacagctc ggcttccttt 5700

tgtggagatt gctaagattt gtgctttacc tattccagag ctggcatgga agcttcagat 5760

ggaacagtat tctaatacgg gtagattaca ataacccacc taggtatcat gaaattacat 5820

gaaccaccca aaagtttgaa gatttgacaa actccctatt atacccaaaa tgcccctagt 5880

tactatttag aaagaacaat agttaaggta aaggagtaac taatgcttga tgattcaaag 5940

gggtggagtt gacttattca tattcttgca cttacgtttg caccgtgtat ttttccattt 6000

tgttcaggca tgtcactgtt ttcatacttt gtaagcgcat tcattcttga aagaaaagaa 6060

aaaaagaagg gagaggaggg gggttgtagt gtcttgtagg aatatgcagc ttggcaagtc 6120

cttatggtat gcctccttat ctgccaattt aaagagtaag ccttgaatat aactagttca 6180

tgatgcaaag gaattctagt tatgatttgg gtatcatgag cagtgaaaat agtatcattt 6240

ccatttaaga tgtcaagaag gtggccttct ggtgtttaga tgggtaaaat ccagctgaat 6300

tgttggcttt aagttttggg ccactatgtt caagatgtaa gttggttccc aggtagtgat 6360

tcttggagga tctgggcttc atgagggaaa ttacttcttt ggtttgacct ttttaatatc 6420

ttttgtagat tttaaatgga tatttatgat ttgaactttc atttctgaaa gttgagggaa 6480

atatattgta ttttcatgcc cagttgggac tcaggcaaag atccctcctc tctcttaatc 6540

tcagcacgtg ttcctactat aaagggcaag gtgatctgct cctggttttt ttgttcgcta 6600

aactataatt ccaatccctt ggatgtattt cagcccactc aatccctttt taacaagatg 6660

atagcatctt tagcttgctc aaataacaac tctataagaa ccttagggtt tttggtcagt 6720

gcatgtggtc tcagctatca tttcatgtaa atgctagagg cgctttccat tgaactgttc 6780

caagagtctc agttcagaaa actctgaagg tacttatttt tagtataaaa tagatggtat 6840

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ttaaccccac aactgcatgt cttgccatgc gagtgacttg taaagtagga aactgccaga 7080

tagaaactgg tcctgtgctt acttcctcta gatcgtcact agcctgtgcc tattgatata 7140

ctttggagtt agatcctgaa aaccaccttg ctgcacgggc tttacaacat tgcttttgca 7200

tgcgatatct gtccctctgt atttaaatga ctcttcagag ccgatgattc aaactctgtg 7260

atcaaggatt tttgttgaat ctcgacctca ttaaattggg ggagtgcctt acagaataat 7320

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agtggtcggt gggcaaagaa ggcgaattaa ctggtgaaac ccttgatctt gggggtgaga 7740

aggaggcggc gatagaatca gctcggacac ttctgagcat tgggtttgaa atcaaacctt 7800

gctgaaaagc tgaaaagatc ccttctgtct aggttactgt ataaagatta ccagtgggct 7860

gccctcattt atatgaaaat catgtagctt tctttcaatg taagttatca ggtttgagga 7920

tgtcttttcc tttcttcttc ttcagtattt cagctgtata tttggtgttg tacaacctcc 7980

ccgactctga aacagccaaa tagtagtgga aaacggagaa tttgtttgca tcccttttcc 8040

ttgtcttgat tgagaccctt ttcaatatct ccatatctgg gagcagcttt ctcatttttt 8100

ctgcggtaga catggtataa ttaagacagt tagaaattac ttgaaattca atataatgaa 8160

tattattatt ttgtttaaga tctgatgttc aaaaactagc ctgcagattg tctgaaagaa 8220

aactgcattt gtagaaaaaa ttggacagct aatatctcca gaatatacac atacaagaga 8280

ggaggagaac tttaaggatt tggaagacca ggcatccatc aattattgtc tcagttctcc 8340

tcaccagatc ggtaggatca tataaaatga tgcggggcaa tgaagatctc ccaaggcagt 8400

gtatccatca gtcattattt tattttattt tattcaaatc gtgaaacagg cataccctac 8460

aagcatgtct tgtcctgagg gaacatcaaa ttgtctccac tggtcagctg agagatttga 8520

gctgtcatgc aacttctaag ttctctggcg tgctgacaaa gaatttgaga tatgtacagc 8580

aagttttgag ttcgagtcag gacgtgcata tttt 8614

<210> 3

<211> 528

<212> PRT

<213> ALMT12蛋白编码氨基酸序列（Populus tomentosa）

<400> 3

Met Glu Leu Val Met Pro Ile Ser Ala Lys Glu Asn Leu Lys Lys Asn

1 5 10 15

Met Lys Ala Phe Ser Glu Lys Ser Lys Arg Phe Pro Gly Leu Leu Trp

20 25 30

Arg Thr Val Trp Arg Val Gly Arg Asp Asp Pro Arg Arg Val Val His

35 40 45

Ala Leu Lys Val Gly Leu Ser Leu Thr Leu Val Ser Leu Leu Tyr Leu

50 55 60

Leu Glu Pro Leu Phe Lys Gly Ile Gly Gln Asn Ala Ile Trp Ala Val

65 70 75 80

Met Thr Val Val Val Val Leu Glu Phe Thr Ala Gly Ala Thr Leu Cys

85 90 95

Lys Gly Leu Asn Arg Gly Leu Gly Thr Leu Leu Ala Gly Ser Leu Ala

100 105 110

Phe Leu Thr Gly Tyr Ile Ala Glu Lys Thr Gly Leu Val Phe Arg Ala

115 120 125

Val Phe Ile Gly Ala Ala Val Phe Val Ile Gly Thr Ala Thr Thr Tyr

130 135 140

Met Arg Phe Phe Pro Tyr Ile Lys Arg Asn Tyr Asp Tyr Gly Val Leu

145 150 155 160

Ile Phe Leu Leu Thr Phe Asn Leu Ile Thr Val Ser Ser Tyr Arg Val

165 170 175

Ser Asn Val Leu Lys Ile Ala His Glu Arg Phe Tyr Thr Ile Ala Ile

180 185 190

Gly Cys Gly Val Cys Leu Val Met Thr Leu Phe Ile Phe Pro Ile Trp

195 200 205

Ser Gly Glu Asp Leu His Asn Ser Thr Val Ile Lys Leu Glu Gly Leu

210 215 220

Ala Lys Ser Ile Glu Ala Cys Val Asn Glu Tyr Phe Asn Asp Val Glu

225 230 235 240

Lys Glu Lys Thr Gln Asp Lys Ser Pro Glu Asp Pro Ile Tyr Lys Gly

245 250 255

Tyr Lys Ala Val Leu Asp Ser Lys Ser Gln Asp Glu Thr Leu Ala Leu

260 265 270

His Ala Ser Trp Glu Pro Arg His Ser Arg His Cys Arg Tyr Pro Trp

275 280 285

Gln Gln Tyr Val Lys Leu Gly Ala Val Leu Arg His Phe Gly Tyr Thr

290 295 300

Val Val Ala Leu His Gly Cys Leu Gln Ser Glu Ile Gln Thr Pro Gln

305 310 315 320

His Cys Arg Val Leu Phe Lys Asp Pro Cys Ile Arg Val Thr Asn Glu

325 330 335

Leu Ser Lys Ala Leu Met Glu Leu Ala Asn Ser Ile Arg Asn Arg Arg

340 345 350

His Cys Ser Pro Glu Ile Leu Ser Asp Asn Leu His Glu Ala Leu Gln

355 360 365

Asp Leu Asn Asn Ala Leu Lys Ser Gln Pro Arg Leu Phe Leu Gly Ser

370 375 380

Asn Asn Asn Gln Ala Thr Asn Met Leu Ala Val Ala Ala Ala His Ala

385 390 395 400

Asn Ser Ser Gln Lys Arg Glu Lys Tyr Asn Gly Val Ser Leu Pro Ser

405 410 415

Phe Lys Thr Asp Asn Ser Ala Leu Leu Glu Trp Lys Ser Lys Arg Met

420 425 430

Asn Asn Glu His Ser Arg Ser Glu Ala Ala Glu Arg Lys Val Leu Arg

435 440 445

Pro Gln Leu Ser Lys Ile Ala Ile Thr Ser Leu Glu Phe Ser Glu Ala

450 455 460

Leu Pro Phe Ala Ala Phe Ala Ser Leu Leu Val Glu Thr Val Ala Arg

465 470 475 480

Leu Asp Asn Ile Ile Glu Glu Val Glu Glu Leu Gly Arg Ile Ala Cys

485 490 495

Phe Lys Glu Phe Lys Pro Gly Asp Glu Val Ile Val Asn Phe Lys Thr

500 505 510

Gln Lys Val Asn Val Thr Leu Asn His Phe Ser Ser Gln Gly Gly Glu

515 520 525

<210> 4

<211> 518

<212> PRT

<213> WRKY32蛋白编码氨基酸序列（Populus tomentosa）

<400> 4

Met Ala Gly Ser Glu Ser Phe Glu Ala Leu Glu Val Gln Asn Asn Glu

1 5 10 15

Gln Lys Arg Gln Gly Asn Glu Gln Asn Asn Gly Asn Phe Val Glu Glu

20 25 30

Glu Glu Leu Glu Gly Asp Tyr Ile Glu Glu Glu Glu Glu Ser Gln Leu

35 40 45

Ser Glu Leu Gln Gln Leu Val Glu Leu Pro Ser Ser Gln Val Glu Glu

50 55 60

Glu Met Arg Asp Gly Gln Val Glu Thr Leu Thr Val Val Pro Ser Ser

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Leu Ser Lys Glu Asn Asp Gln His Val Gly Leu Lys

85 90 95

Gly Asn Ser Ala Leu Lys Thr His Val Glu Ala Glu Phe Lys Glu Gln

100 105 110

Val Gly Leu Ser His Gln Glu Val Leu Gly Ser Val Thr Ala Gln Ser

115 120 125

Ala Lys Ala Gln Thr Gln Tyr Gln Leu Pro Pro Ser Ala Cys Pro Thr

130 135 140

Ser Ser Ser Glu Leu Ser Leu Thr Ser Val Thr Gln Pro Ile Ser Ser

145 150 155 160

Ala Pro Ser Pro Thr Pro Pro Glu Lys Arg Leu Ser Pro Pro Glu Val

165 170 175

Lys Asn Ala Cys Ile Pro Glu Ala Gly His Gln Ser Ser Ala Lys Leu

180 185 190

Lys Ala Leu His Val Pro Val Ala Arg Thr Ser Ile Pro Asp Gly Tyr

195 200 205

Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys Ser Pro Lys Gly Ser

210 215 220

Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Cys Cys Ala Lys Lys Ile

225 230 235 240

Glu Cys Ser Asp His Ser Gly Arg Val Ile Glu Ile Val Asn Lys Gly

245 250 255

Met His Ser His Pro Pro Arg Lys Asn Asn Ser Thr Arg Glu Ser Arg

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Val Gly Pro Ile Leu Gln Thr Thr Val Thr Glu Arg

275 280 285

Thr Val Arg Met Leu Lys Asp Ser Glu Pro Val Thr Leu Ser Ile Glu

290 295 300

Pro Ala Gln Glu Thr Pro Thr Val Ser Glu Arg Lys Arg Gln Ser Ser

305 310 315 320

Ser Ser Ser Asp Glu Asn Lys Glu Thr Gln Ile Lys Glu Glu Asp Val

325 330 335

Gly Glu Pro Glu Pro Lys Arg Arg Leu Lys Lys Gly Asn Leu Glu Cys

340 345 350

Ser Lys Ala Asn Leu Lys Pro Gly Lys Lys Thr Lys Phe Val Val His

355 360 365

Ala Ala Gly Asp Val Gly Ile Ser Gly Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys

370 375 380

Tyr Gly Gln Lys Met Val Lys Gly Asn Pro His Pro Arg Asn Tyr Tyr

385 390 395 400

Arg Cys Thr Ser Ala Gly Cys Pro Val Arg Lys His Ile Glu Thr Ala

405 410 415

Val Asp Asn Thr Asn Ala Val Ile Ile Thr Tyr Lys Gly Val His Asp

420 425 430

His Asp Met Pro Val Pro Lys Lys Arg His Gly Pro Pro Ser Ala Pro

435 440 445

Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ser Leu Ser Ser Leu Pro Ile

450 455 460

Lys Lys Thr Asp Thr Leu Gln Asn Gln Val Ala Ser Thr Gln Trp Ser

465 470 475 480

Val Gly Lys Glu Gly Glu Leu Thr Gly Glu Thr Leu Asp Leu Gly Gly

485 490 495

Glu Lys Glu Ala Ala Ile Glu Ser Ala Arg Thr Leu Leu Ser Ile Gly

500 505 510

Phe Glu Ile Lys Pro Cys

515

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 引物P1（人工序列）

<400> 5

agaacacggg ggactatgga gctggtcatg ccgatat 37

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物P2（人工序列）

<400> 6

acccccgggg atcctttctc ccccctgaga agaaaaat 38

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物P3（人工序列）

<400> 7

agaacacggg ggactatggc agggagtgag agctt 35

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物P4（人工序列）

<400> 8

acccccgggg atcctgcaag gtttgatttc aaacccaatg 40

Claims (9)

1.一种筛选高气孔密度、高光合效率杨树的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SNP分子标记组合，由SNP1和SNP2两个SNP位点组成，其中，

所述SNP1位于杨树基因组ALMT12基因下游第1182位碱基，具有A/T多态性；

所述SNP2位于杨树基因组WRKY32基因上游第94位碱基，具有A/C多态性。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述SNP1位于如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第5193位；

所述SNP2位于如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第2407位。

3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，在SNP1位点的基因型为TT，且在SNP2位点的基因型为AC的杨树个体，相较于在SNP1位点的基因型为CT，且在SNP2位点的基因型为AA的杨树个体，具有较大的气孔密度和较高的光合效率。

4.一种用于检测权利要求1至3之一所述分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于扩增SNP1位点的引物对和用于扩增SNP2位点的引物对，

其中，所述用于扩增SNP1位点的引物对为P1和P2，所述引物P1具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，所述引物P2具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

所述用于扩增SNP2位点的引物对为P3和P4，所述引物P3具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，所述引物P4具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

5.一种权利要求1至3之一所述的分子标记或权利要求4所述的引物组在杨树选育中的用途，优选在选育高气孔密度、高光合效率杨树品种中的用途。

6.一种权利要求1至3之一所述的分子标记的获得方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，选择杨树群体，测定表型性状；

步骤2，提取杨树群体的基因组DNA；

步骤3，获得与气孔密度和光合效率相关的分子标记。

7.一种预测杨树气孔密度和光合效率的方法，其特征在于，所述方法包括检测杨树个体权利要求1至3之一所述分子标记的基因型组合类型的步骤，

优选地，所述杨树为毛白杨。

8.根据权利要求7所述预测杨树气孔密度和光合效率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤i，以待测杨树的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；

步骤ii，根据扩增产物，确定待测杨树相应分子标记的基因型组合类型；

步骤iii，根据待测杨树的分子标记的基因型组合类型预测杨树的气孔密度大小和光合效率高低。

9.一种杨树遗传改良的方法，其特征在于，所述方法包括继代选育权利要求1至3之一所述分子标记的基因型组合类型为TT-AC的个体，淘汰其它基因型组合类型个体的步骤。

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