BR112014031416B1 - Método de identificação de uma planta de soja ou um germoplasma de soja com resistência acentuada a nematoide de cisto - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA PRIMEIRA PLANTA DE SOJA, MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UMA PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, MÉTODO PARA MELHORAR A RESISTÊNCIA AO NEMATOIDE DE CISTO. A presente invenção fornece várias composições e métodos para identificar e selecionar plantas com resistência acentuada a nematoide de cisto de soja (SCN). São também fornecidos plantas transgênicas, partes de planta, sementes, e métodos para uso das mesmas compreendendo um polinucleotídeo heterólogo ligado funcionalmente a um promotor ativo na planta, bem como métodos para produzir tais plantas e métodos de uso, sendo que o dito polinucleotídeo heterólogo compreende ao menos um, ou qualquer combinação dos mesmos, de Glyma18g2580, Glyma18g2590, Glyma18g2600, Glyma18g2610; e Glyma18g2570 ou uma variante ativa ou fragmento dos mesmos. A expressão do polinucleotídeo heterólogo melhora a resistência da planta ao nematoide do cisto.

Description

Campo da invenção

[0001] A presente revelação refere-se a composições e métodos úteis na criação ou acentuação de resistência a nematoide de cisto em plantas.

Antecedentes da invenção

[0002] O Nematoide de Cisto do Feijão Soja (SCN) é uma praga parasitária que tem ameaçado a produção de feijão soja nos EUA por mais de 50 anos. A resistência ao SCN é um atributo economicamente importante dado que a infecção pode reduzir substancialmente os rendimentos. Apesar disso, duas fontes primárias de resistência contribuem para o germoplasma de alto nível da Pioneer: Peking e PI88788. Relata-se que vários loci conferem resistência ao SCN, sendo que, possivelmente, o mais importante dentre esses é o rhg1, que mapeia o grupo de ligação G e compreende pelo menos dois alelos: rhg1 derivado de Peking e rhg1-b derivado de PI88788.

[0003] A clonagem do alelo rhg1 foi relatada previamente, e um gene de quinase candidato do tipo receptor é o assunto de pedidos de patente de um concorrente. Apesar disso, não há evidências genéticas fornecidas para sustentar essas afirmações. Ademais, um estudo recente mapeou detalhadamente o alelo rhg1-b em uma região 67-kb que não inclui o gene candidato rhg1. À luz desses relatórios, a verdadeira natureza molecular dos alelos rhg1 e rhg1-b resistentes ao SCN permanece desconhecida com relação ao mesmo gene e é desconhecido se rhg1 e rhg1-b são alelos do mesmo gene resistente ou se representa dois loci genéticos distintos, apesar de ligados em proximidade.

[0004] A caracterização molecular desses alelos teria consequência importantes para o aprimoramento do cultivo do feijão soja.

Sumário

[0005] São fornecidas composições e métodos para identificar e selecionar plantas com uma resistência acentuada ao nematoide de cisto do feijão soja (SCN).

[0006] São fornecidas métodos para identificar e/ou selecionar a planta do feijão soja ou o germoplasma do feijão soja com uma resistência acentuada ao nematoide de cisto do feijão soja. Nesse métodos, a presença de pelo menos um alelo marcador é detectada no genoma da planta do feijão soja ou do germoplasma do feijão soja; e a planta do feijão soja ou o germoplasma do feijão soja com resistência acentuada ao nematoide de cisto é, desse modo, identificado e/ou selecionado. O alelo marcador pode incluir qualquer alelo marcador que esteja associado à duplicação de uma região dentro do locus rhg1, que confere uma tolerância acentuada aos nematódios do cisto do feijão soja.

[0007] São fornecidas adicionalmente métodos para identificar e/ou selecionar a planta do feijão soja ou o germoplasma do feijão soja com resistência acentuada ao nematoide de cisto do feijão soja empregando-se o PCR quantitativo ou outra técnica quantitativa de qualquer sequência dentro da região duplicada do locus rhg1.

[0008] São fornecidas também métodos para identificar e/ou selecionar a planta do feijão soja ou o germoplasma do feijão soja com uma resistência acentuada ao nematoide de cisto detectando-se uma quantidade aumentada de cópias de pelo menos um dentre ou qualquer combinação dentre, Glyma18g2580 (SEQ ID NO: 3), Glyma18g2590 (SEQ ID NO: 2), Glyma18g2600 (SEQ ID NO:4), Glyma18g2610 (SEQ ID NO:5); e Glyma18g2570 (SEQ ID NO:1) ou uma variante ativa ou fragmento da mesma.

[0009] São apresentados também métodos para identificar e/ou selecionar a planta do feijão soja ou o germoplasma do feijão soja com resistência acentuada ao nematoide de cisto do feijão soja, que compreendem detectar a junção de DNA formada no ponto de divisão da duplicação de sequências de nucleotídeos dentro do locus rhg1.

[0010] São fornecidas também kits para os vários métodos para identificar as plantas de feijão soja ou o germoplasma do feijão soja que têm uma resistência acentuada ao SCN.

[0011] São também fornecidos plantas transgênicas, partes de planta, sementes que compreendem um polinucleotídeo heterólogo ligado funcionalmente a um promotor ativo na planta, bem como métodos para produzir tais plantas e métodos para uso, sendo que o dito polinucleotídeo heterólogo compreende ao menos um ou qualquer combinação dos mesmos, dentre Glyma18g2580 (SEQ ID NO: 3), Glyma18g2590 (SEQ ID NO: 2), Glyma18g2600 (SEQ ID NO:4), Glyma18g2610 (SEQ ID NO:5); e Glyma18g2570 (SEQ ID NO:1) ou uma variante ativa ou fragmento da mesma. Expressão do polinucleotídeo heterólogo melhora a resistência da planta ao nematoide do cisto.

Descrição detalhada de desenhos

[0012] A Figura 1 mostra a heterozigosidade dentro de PI88788 derivado do locus rhg1. Haplótipos foram construídos com SNPs (Polimorfismos de Nucleotídeo Único) encontrados durante o ressequênciamento profundo de acestrais da Soja. Observou-se uma heterozigosidade persistente herdada através das gerações no locus rhg1 dentro de linhas resistentes derivadas de PI88788.

[0013] A Figura 2 mostra os alinhamentos de sequenciamento da próxima geração que indicam uma duplicação em consecutividade. Alinhamentos de leitura são visualizados como caixas cinzas em faixas com pares de leitura conectados por linhas cinzentas. A cobertura de sequenciamento total é visualizada na faixa acima com sítios polimórficos. Alterações significativas na cobertura são observadas nos pontos de divisão putativos de duplicação (setas). Leituras de mapeamento discordante de extremidades pareadas (círculos) sugerem uma duplicação em consecutividade do intervalo Gm18:1.632 a 1.663 (Mb).

[0014] A Figura 3 mostra uma análise de quantidade de cópias e indica um aumento substancial na quantidade de cópias. Análise de quantidade de cópias foi efetivada calculando-se a cobertura de sequenciamento em uma janela em movimento no decorrer da região mapeada detalhadamente de rhg1. Cobertura de Peking indicou uma taxa de cobertura normalizada aumentada na região de Gm18:1.632 a 1.663(Mb) de aproximadamente três vezes além do suscetível. Cobertura de PI88788 indicou uma taxa de cobertura normalizada aumentada de nove vezes na mesma região.

[0015] A Figura 4 mostra os resultados da análise de qPCR que indica uma quantidade aumentada de cópias em Peking e PI88788. Iniciadores de PCR foram projetados contra as regiões de cópia única e cópias variáveis do locus de mapeamento detalhado de rhg1. Duas fontes de resistência de Peking e PI88788 e três linhas suscetíveis foram ensaiadas em duas réplicas para todos os pares de iniciadores. Réplicas foram ponderadas e uma análise ΔΔCt foi efetivada com relação a pares e ponderadas entre cada combinações de cópias variáveis e cópia única. Os resultados são consistentes com uma quantidade de cópias aumentada em 4 e 9 vezes em Peking e PI88788 em relação às linhas suscetíveis.

[0016] A Figura 5 mostra os resultados de Blast de um conjunto de sequências em todo o decorrer dos pontos de divisão de duplicação. As leituras de mapeamento discordante de extremidades pareadas a partir dos limiares da duplicação em consecutividade foram juntados em conjuntos de sequência. Os conjuntos de sequência foram comparados por Blast contra o Conjunto Genômico Feijão Soja Glyma1.01 (JGI). O alinhamento desse conjunto de sequências à referência é consistente com o evento de duplicação em consecutividade com pontos de divisão em Gm18:1663448 e Gm18:1632228. A requisição A é apresentada na SEQ ID NO: 18; A unidade A é apresentada na SEQ ID NO: 19; A requisição B é apresentada na SEQ ID NO: 20; e a unidade B é apresentada na SEQ ID NO:21.

[0017] A Figura 6 mostra que os amplicons de PCR em Peking e PI88788 sustentam os pontos de divisão putativos. Pares de iniciadores de PCR foram projetados para amplificar as extremidades das regiões de variação de cópias (par escuro (ou preto), par claro (ou cinza)) e no decorrer dos pontos de divisão putativos (par misto). Pares de iniciadores projetados para amplificar as extremidades da região de variação de cópias produzem amplicons em todas as linhas. Pares de iniciadores projetados para uma amplificação no decorrer dos pontos de divisão putativos produzem amplicons em Peking e PI88788, mas não em suscetível.

[0018] A Figura 7 mostra que o sequenciamento e o alinhamento de amplicons de PCR confirmam os pontos de divisão. Um par de iniciadores pelo decorrer da junção do ponto de divisão foi ordenato com etiquetas de sequenciamento M13, testado e enviado para Sanger Sequencing. Os amplicons resultantes de Peking e PI88788 foram alinhados ao Conjunto Genômico do Feijão Soja Glyma1.01 (JGI) através de Blast. O alinhamento desses amplicons à referência é consistente com o evento de duplicação em consecutividade com pontos de divisão em Gm18:1663448 e em Gm18:1632228, do qual um exemplo é mostrado. A requisição A é apresentada na SEQ ID NO: 22; a unidade A é apresentada na SEQ ID NO: 23; a requisição B é apresentada na SEQ ID NO:24; e a unidade B é apresentada na SEQ ID NO: 25.

[0019] A Figura 8 fornece várias sequências iniciadoras.

Descrição detalhada I. Definições

[0020] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve-se compreender que essa invenção não é limitada a modalidades particulares, as quais podem, obviamente, variar. Deve-se compreender também que a terminologia usada no presente documento é para o propósito de somente descrever as modalidades específicas e não se destina a ser limitadora.

[0021] Determinadas definições usadas no relatório descritivo e reivindicações são fornecidas abaixo. A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, fornecem-se as definições a seguir.

[0022] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, os termos no singular e as formas “um”, “uma”, “o” e “a”, por exemplo, incluem referências no plural, exceto onde o conteúdo determinar de outro modo. Portanto, por exemplo, as referências “planta”, “à planta” ou “uma planta” também incluem uma pluralidade de plantas; também, dependendo do contexto, o uso do termo “planta” pode também incluir a progênie geneticamente similar ou idêntica daquela planta; o uso do termo “um ácido nucleico” inclui, opcionalmente, como uma questão prática, muitas cópias dessa molécula de ácido nucleico; de modo similar, o termo “sonda” abrange, opcionalmente, (e tipicamente) muitas moléculas de sonda similares ou idênticas.

[0023] Adicionalmente, para uso na presente invenção, “que compreende” ou “compreendendo” deve ser interpretado como especificamente na presença de características, números inteiros, etapas ou componentes declarados ou grupos dos mesmos. Portanto, por exemplo, um kit que compreende um par de iniciadores de oligonucleotídeo pode ter dois ou mais pares de iniciadores de oligonucleotídeo. Adicionalmente, o termo “que compreende” destina-se a incluir exemplos abrangidos pelos termos “consistindo essencialmente em”, e “consistindo em”. De Modo similar, o termo “consistindo essencialmente em” destina- se a incluir exemplos abrangidos pelo termo “consistindo em”.

[0024] “Alelo” se refere a qualquer um dentre um ou mais formas alternativas de uma sequência genética. Em um organismo ou célula diploide, os dois alelos de uma determinada sequência ocupam tipicamente loci correspondentes em um par de cromossomos homólogos. Em relação a um marcador de SNP, alelo se refere à base de nucleotídeo específico presente naquele locus de SNP naquela planta individual.

[0025] O termo “amplificar”, no contexto de amplificação de ácido nucleico, é qualquer processo pelo qual cópias adicionais de um ácido nucleico selecionado (ou uma forma transcrita do mesmo) são produzidas. Um “amplicon” é um ácido nucleico amplificado, por exemplo, um ácido nucleico que é produzido pela amplificação de ácido nucleico de modelo por meio de qualquer método de amplificação disponível.

[0026] O “retrocruzamento” é melhorista cruza uma variedade de dos genótipos parentais uma ou mais

[0027] O termo “segmento de cromossomo” designa uma amplitude linear contígua de DNA genômico que resideem planta em um único cromossomo. “Intervalo de cromossomo” se refere a um segmento de cromossomo definido pelo flanqueamento específico de marcadores de loci.

[0028] “Cultivar” e “variedade” são usados de maneira sinônima e se refere a um grupo de plantas dentro de uma espécie (por exemplo, Glycine max) que compartilham determinadas características genéticas que separam as mesmas de outras possíveis variedades dentro dessa espécie. Os cultivares de feijão soja são linhagens endogâmicas produzidas após várias gerações de autopolinizações. As partes individuais dentro de um cultivar de feijão soja são homogêneas, quase geneticamente idênticas, com a maioria dos loci no estado de homozigoto.

[0029] Uma “linhagem de elite” é uma linhagem agronomicamente superior que tem resultado de muitos ciclos de melhoramento genético e seleção para desempenho agronômico superior. Inúmeras linhagens de elite estão disponíveis e são conhecidas por aqueles versados na técnica de melhoramento genético de feijão soja.

[0030] Uma “população de elite” é uma variedade de linhagens ou indivíduos de elite que podem ser usados para representar o estado da técnica em termos de genótipos agronomicamente superiores de uma determinada espécie de cultura, tal como feijão soja.

[0031] Uma “cepa de feijão soja exótica” ou um “germoplasma de feijão soja exótico” é uma cepa ou germoplasma derivado a partir de feijão soja que não pertence a uma cepa ou linhagem de feijão soja de elite disponível de germoplasma. No contexto de um cruzamento entre duas cepas ou plantas de feijão soja de germoplasma, um germoplasma exótico não está intimamente relacionado por descendência ao germoplasma de elite com o qual o mesmo é cruzado. Mais comumente, o germoplasma exótico não é derivado de qualquer linhagem de elite de feijão soja, mas é, de preferência, selecionado para introduzir elementos genéticos inovadores (tipicamente alelos inovadores) em um programa de melhoramento genético.

[0032] Um “mapa genético” é uma descrição de relações de ligação genética entre loci em um ou mais cromossomos (ou grupos de ligação) dentro de uma determinada espécie, em geral mostrada em uma forma esquemática ou tabular.

[0033] “Genótipo” se refere à constituição genética de uma célula ou organismo.

[0034] “Germoplasma” se refere ao material genético que compreende a base física das qualidades hereditárias de um organismo. Para uso na presente invenção, o germoplasma inclui grãos e tecido vivo a partir dos quais novas plantas podem crescer; ou, outra parte de planta, tal como folha, caule, pólen ou células, que podem ser cultivados em uma planta inteira. Os recursos de germoplasma fornecem fontes de características genéticas usadas por melhoristas de plantas para aprimorar os cultivares comerciais.

[0035] Um indivíduo é “homozigoto” se o indivíduo tiver somente um tipo de alelo em um determinado locus (por exemplo, um indivíduo diploide tem uma cópia do mesmo alelo em um locus para cada um dos dois cromossomos homólogos). Um indivíduo é “heterozigoto” se mais do que um tipo de alelo estiver presente em um determinado locus (por exemplo, um indivíduo diploide com uma cópia cada de dois alelos diferentes). O termo “homogeneidade” indica que os membros de um grupo têm o mesmo genótipo em um ou mais loci específicos. Ao contrário, O termo “heterogeneidade” é usado para indicar que os indivíduos dentro do grupo se diferem em genótipo em um ou mais loci específicos.

[0036] “Introgressão” significa a entrada ou a introdução de um gene, QTL, marcador, haplótipo, perfil de marcador, traço ou locus do traço do genoma de uma planta no genoma de uma outra planta.

[0037] Os termos “marcação” e “marcação detectável” se referem a uma molécula com capacidade para detecção. Um marcador detectável pode também incluir uma combinação de um repórter e um extintor (quencher), tal como são empregados em sondas FRET ou sondas TaqMan™. O termo “repórter” se refere a uma substância ou uma parte da mesma que é capaz de exibir um sinal detectável, tal sinal pode ser suprimido por um silenciador. O sinal detectável do repórter é, por exemplo., fluorescente na faixa detectável. O termo “arrefecimento brusco” se refere a uma substância ou parte da mesma que é capaz de suprimir, reduzir, inibir, etc., o sinal detectável produzido pelo repórter. Para uso na presente invenção, os termos “suprimindo” e “transferência de energia de fluorescência” refere-se ao processo por meio do qual, quando um repórter e um supressor estão em estreita proximidade, e o repórter está excitado por uma fonte de energia, uma porção substancial da energia do estado excitado transfere-se não radioativamente para o supressor onde ela é dissipada não radioativamente ou é emitida em um comprimento de onda de emissão diferente que aquele do repórter.

[0038] Uma “linhagem” ou “cepa” é um grupo de indivíduos de descendência idêntica que são geralmente endogâmicos até certo ponto e que são geralmente homozigotos e homogêneos na maioria dos loci (isogênicos ou quase isogênicos). Uma “sublinhagem” se refere a um subconjunto endogâmico de descendentes que são geneticamente distintos de outros subconjuntos semelhantemente endogâmicos descendentes do mesmo progenitor. Tradicionalmente, uma sublinhagem foi derivada por endocruzamento da semente a partir de uma planta de feijão feijão soja individual selecionada na geração F3 a F5 até os loci segregantes residuais serem “fixados” ou homozigotos através da maioria ou todos os loci. Variedades (ou linhagens) de feijão feijão soja comerciais são tipicamente produzidas por agregação (“formação de volume”) da progênie autopolinizada de uma planta F3 a F5 única a partir de um cruzamento controlado entre 2 pais geneticamente diferentes. Embora a variedade pareça tipicamente uniforme, a variedade de autopolinização derivada a partir da planta selecionada eventualmente (por exemplo, F8) se torna uma mistura de plantas homozigotas que podem variar em genótipo em qualquer locus que era heterozigoto na planta F3 a F5 originalmente selecionada. As sublinhagens à base de marcador que se diferem uma da outra, com base no polimorfismo qualitativo no nível de DNA em um ou mais marcadores de loci específicos, são derivadas pela genotipagem de uma amostra de grão derivada a partir de progênie autopolinizada individual derivada a partir de uma planta F3 a F5 selecionada. A amostra de grão pode ser genotipada diretamente como grão ou como tecido de planta cultivado a partir de tal amostra de grão. Opcionalmente, as sementes que compartilham um genótipo comum no locus (ou loci) específico(s) são (aumentadas em volume) fornecendo uma sublinhagem que é geneticamente homogênea em loci identificados importantes para um traço de interesse (por exemplo, produtividade, tolerância, etc.).

[0039] “Ligação” se refere a um fenômeno em que os alelos no mesmo cromossomo tendem a segregar em conjunto com mais frequência do que o esperado pelo acaso se sua transmissão fosse independente. A recombinação genética ocorre com uma frequência aleatória presumida em relação a todo o genoma. Os mapas genéticos são construídos medindo-se a frequência de recombinação entre pares de características ou marcadores. Quanto mais próximos estão as características ou marcadores um do outro no cromossomo, menor a frequência de recombinação, e maior o grau de ligação. As características ou marcadores são considerados no presente documento como ligados se os mesmos geralmente cossegregarem. Uma probabilidade de 1/100 de recombinação por geração é definida como uma distância de mapa de 1,0 centiMorgan (1,0 cM). Os elementos genéticos ou genes localizados em um segmento de cromossomo único são acoplados fisicamente. Dois loci podem estar localizados em estreita proximidade de modo que a recombinação entre pares de cromossomos homólogos não ocorra entre os dois loci durante a meiose com alta frequência, por exemplo, de modo que os loci acoplados segreguem conjuntamente pelo menos cerca de 90% do tempo, por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,75% ou mais do tempo. Os elementos genéticos localizados dentro de um segmento de cromossomo também são geneticamente ligados, tipicamente dentro de uma distância de recombinação genética menor ou igual a 50 centimorgans (cM), por exemplo., cerca de 49, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25 cM ou menos. Isto é, dois elementos genéticos dentro de um segmento de cromossomo único se submetem à recombinação durante a meiose, um com o outro, a uma frequência menor que ou igual a cerca de 50%, por exemplo, cerca de 49%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5% ou 0,25% ou menos. Os marcadores intimamente ligados exibem uma frequência de cruzamento com um determinado marcador de cerca de 10% ou menos (o determinado marcador está dentro de cerca de 10 cM de um marcador intimamente ligado). Em outros termos, os loci intimamente ligados cossegregam pelo menos cerca de 90% do tempo. No que diz respeito à posição física em um cromossomo, os marcadores intimamente ligados podem ser separados, por exemplo, por cerca de 1 megabase (Mb; 1 milhão de nucleotídeos), cerca de 500 quilobases (Kb; 1.000 nucleotídeos), cerca de 400 kb, cerca de 300 kb, cerca de 200 kb, cerca de 100 kb, cerca de 50 kb, cerca de 25 kb, cerca de 10 kb, cerca de 5 kb, cerca de 4 kb, cerca de 3 kb, cerca de 2 kb, cerca de 1 kb, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos ou menos.

[0040] Quando se refere à relação entre dois elementos genéticos, tais como um elemento genético que contribui para a tolerância e uma ligação de fase de “acoplamento” de marcador proximal indica o estado em que o alelo “favorável” no locus de tolerância é fisicamente associada no mesmo filamento de cromossomo como o alelo “favorável” do respectivo marcador de locus ligado. Na fase de acoplamento, ambos os alelos favoráveis são herdados em conjunto pela progênie que herdou aquele filamento de cromossomo. Na ligação de fase de “repulsão”, o alelo “favorável” no locus de interesse (por exemplo., um QTL para tolerância) é fisicamente ligado a um alelo “desfavorável” no marcador de locus proximal, e os dois alelos “favoráveis” alelos não são herdados em conjunto (isto é, os dois loci são “fora de fase” um em relação ao outro).

[0041] “Desequilíbrio de ligação” se refere a um fenômeno em que os alelos tendem a permanecer em conjunto em grupos de ligação, quando segregam a partir de progenitores ao descendentes, com uma frequência maior do que esperado a partir de suas frequências individuais.

[0042] “Grupo de ligação” se refere a características ou marcadores que geralmente co-segregam. Um grupo de ligação corresponde geralmente a uma região cromossômica que contém material genético que codifica as características ou marcadores.

[0043] “Locus” é um segmento definido de DNA.

[0044] Um “local de mapa” ou uma “posição de mapa” ou uma “posição de mapa relativa” é um local designado em um mapa genético em relação a marcadores genéticos ligados onde um marcador especificado pode ser encontrado dentro de uma determinada espécie. As posições de mapa são geralmente fornecidas em centimorgans. Uma “posição física” ou “localização física” ou “localização física em mapa” é a posição, tipicamente em bases de nucleotídeo, de um nucleotídeo particular, tal como um nucleotídeo de SNP, no cromossomo.

[0045] “Mapeamento” é o processo de definir as relações de ligação de loci através do uso de marcadores genéticos, populações que segregação para os marcadores e princípios genéticos padrão de frequência de recombinação.

[0046] “Marcador” ou “marcador molecular” é um termo usado para denotar um ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que é suficientemente única para caracterizar um locus específico no genoma. Qualquer característica polimórfica detectável pode ser usada como um marcador, contanto que seja herdada de maneira diferencial e exiba desequilíbrio de ligação com uma característica fenotípica de interesse. Inúmeros marcadores de feijão soja foram mapeados e grupos de ligação criados, como descrito em Cregan, P.B., et al., “An Integrated Genetic Linkage Map of the Soybean Genome” (1999) Crop Science 39:1.464 a 1.490, e mais recentemente em Choi, et al., “A Soybean Transcript Map: Gene Distribution, Haplotype and Single-nucleotídeo Polymorphism Analysis” (2007) Genetics 176:685 a 696. Muitos marcadores de feijão soja estão publicamente disponíveis no site web de feijão soja afiliado a USDA (www.soybase.org). Todos os marcadores são usados para definir um locus específico no genoma do feijão soja. Grandes números desses marcadores têm sido mapeados. Cada marcador é, portanto, um indicador de um segmento específico de DNA, que tem uma sequência de nucleotídeos exclusiva. As posições do mapa fornecem uma medida das posições relativas de marcadores particulares em relação a outros. Quando uma característica é estipulada como ligada a um determinado marcador, deve-se compreender que o segmento de DNA real, cuja sequência afeta a característica, geralmente co-segrega com o marcador. A localização definitiva e mais precisa de uma característica pode ser obtida se os marcadores forem definidos em ambos os lados da característica. Mediante a medição da aparência do(s) marcador(es) e progênie de cruzamentos, a existência da característica pode ser detectada por testes moleculares relativamente simples sem avaliar realmente a aparência da própria característica, o qual pode ser difícil e demorado devido ao fato de que a avaliação real da característica exige o crescimento de plantas a um estágio e/ou sob condições ambientais em que a característica pode ser expressa. Os marcadores moleculares têm sido amplamente usados para determinar a composição genética em feijão soja. “Seleção assistida por marcador” se refere ao processo de selecionar uma característica ou características desejadas em uma planta ou plantas detectando-se um ou mais ácidos nucleicos a partir da planta, em que o ácido nucleico é ligado à característica desejada e, então, selecionando-se a planta ou germoplasma que possui aqueles um ou mais ácidos nucleicos.

[0047] “Haplótipo” se refere a uma combinação de alelos particulares presentes dentro de um genoma da planta particular em dois ou mais marcadores de loci ligados, por exemplo, em dois ou mais loci em um grupo de ligação particular. Por exemplo, em um exemplo, dois loci marcadores específicos em LG-O são usados para definir um haplótipo para uma planta particular. Em ainda outros exemplos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais loci marcadores ligados são usados para definir um haplótipo para uma planta particular.

[0048] O termo “planta” inclui a referência a uma planta total imatura ou madura, que inclui uma planta a partir da qual o grão, grão ou anteras têm sido removidas. A semente ou embrião que produzirá a planta também é considerada como planta.

[0049] “Partes de planta” se refere a qualquer parte ou pedaço de uma planta, que inclui folhas, caules, brotos, raízes, pontas da raiz, anteras, grão, grão, embrião, pólen, óvulos, flores, cotilédones, hipocótilos, vagens, flores, galhos, talos, tecidos, culturas de tecido, células, e similares. Grão pretende significar a semente madura produzida por produtores comerciais para propósitos exceto cultivo ou reprodução de espécies.

[0050] “Polimorfismo” se refere a uma mudança ou diferença entre dois ácidos nucleicos relacionados. Um “polimorfismo de nucleotídeo” se refere a um nucleotídeo que é diferente em uma sequência quando comparada a uma sequência relacionada, quando os dois ácidos nucleicos são alinhados para correspondência máxima.

[0051] “Polinucleotídeo”, “sequência de polinucleotídeos”, “sequência da ácidos nucleicos”, “fragmento de ácido nucleico” e “oligonucleotídeo” são usados de forma intercambiável no presente documento. Esses termos abrangem sequências de nucleotídeo e similares. Um polinucleotídeo é um polímero de nucleotídeos que tem filamentos únicos ou múltiplos, que contém opcionalmente bases de nucleotídeo de DNA ou RNA sintéticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleotídeo DNA pode compreender um ou mais filamentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou misturas dos mesmos.

[0052] “Iniciador” refere-se a um oligonucleotídeo (sintético ou de ocorrência natural), que é capaz de agir como um ponto de iniciação de síntese de ácido nucleico ou replicação ao longo de um filamento complementar quando colocado sob condições em que a síntese de um filamento complementar é catalisada por uma polimerase. Tipicamente, os iniciadores têm cerca de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, mas as sequências mais longas ou mais curtas podem ser empregadas. Os iniciadores podem ser fornecidos na forma de filamento duplo, apesar da forma de filamento único ser tipicamente mais usada. Um iniciador contém, ainda, uma marcação detectável, por exemplo, uma marcação de extremidade 5’.

[0053] “Sonda” refere-se a um oligonucleotídeo (sintético ou de ocorrência natural) que é complementar (embora não necessariamente completamente complementar) a um polinucleotídeo de interesse e forma uma estrutura duplexada por hibridização com pelo menos um filamento do polinucleotídeo de interesse. Tipicamente, as sondas são oligonucleotídeos com a partir de 10 a 50 nucleotídeos de comprimento, mas as sequências mais longas ou mais curtas podem ser empregadas. Uma sonda pode conter, adicionalmente, uma marcação detectável.

[0054] “Loci de traço quantitativo” ou “QTL” referem-se aos elementos genéticos que controlam um traço quantitativo.

[0055] “Frequência de recombinação” é a frequência de um cruzamento em relação ao evento (recombinação) entre dois loci genéticos. A frequência de recombinação pode ser observada seguindo-se a segregação de marcadores e/ou características durante a meiose.

[0056] “Tolerância” e “tolerância aprimorada” são usados de forma intercambiável aqui e referem-se a qualquer tipo de aumento da resistência ou tolerância a ou qualquer tipo de diminuição na suscetibilidade. Uma “planta tolerante” ou “variedade de planta tolerante” não precisa possuir tolerância absoluta ou completa. Em vez disso, uma “planta tolerante”, “variedade de planta tolerante” ou uma variedade de planta ou planta com “tolerância aprimorada” terá um nível de resistência ou tolerância que é mais alto que o de uma planta ou variedade suscetível comparável.

[0057] “Autocruzamento”, “autopolinização” ou “autofecundação” é um processo através do qual um melhorista cruza uma planta com si mesma; por exemplo, um híbrido de segunda geração F2 com si mesmo para render a progênie designada F2:3.

[0058] “SNP” ou “polimorfismo de nucleotídeo único” se refere a uma variação de sequência que ocorrer quando um único nucleotídeo (A, T, C ou G) na sequência do genoma é alterado ou variável. Os “marcadores de SNP” existem quando os SNPs são equiparados aos sítios no genoma do feijão soja.

[0059] O termo “produtividade” se refere à produtividade por unidade de área de um produto de planta particular de valor comercial. Por exemplo, o produtividade de feijão soja é comumente medido em bushels de grão por acre ou toneladas métricas de grão por hectare por período. A produtividade é afetada tanto por fatores genéticos como ambientais. A produtividade é o resultado final de todas as características agronômicas.

[0060] Uma “planta em questão ou célula de planta” é uma na qual a alteração genética, como transformação, foi afetada quanto a um gene de interesse ou é uma planta ou célula de planta que descende de uma planta ou célula alterada dessa forma e que compreende a alteração. Um “controle” ou “planta de controle” ou “célula de planta de controle” fornece um ponto de referência para medir alterações no fenótipo da planta ou célula de planta em estudo.

[0061] Uma planta ou célula de planta de controle pode compreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula de ocorrência natural, isto é, do mesmo genótipo que o material de partida para a alteração genética que resultou na planta ou célula em estudo; (b) uma planta ou célula de planta do mesmo genótipo como o material de partida, mas que foi transformada com um construto nulo (isto é, com um construto que não tem efeito conhecido sobre o traço de interesse, como um construto que compreende um gene marcador); (c) uma planta ou célula de planta que é uma segregante não-transformada entre a progênie de um indivíduo de planta ou célula de planta; (d) uma planta ou célula de planta geneticamente idêntica à planta ou célula de planta em estudo, mas que não é exposta a condições ou estímulos que poderiam induzir a expressão do gene de interesse; ou (e) a própria planta ou célula de planta em estudo, sob condições nas quais o gene de interesse não é expresso.

[0062] Como usado aqui, um polinucleotídeo ou polipeptídeo “isolado” ou “purificado” ou uma porção biologicamente ativa do mesmo, são substancialmente ou essencialmente isentos de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou polipeptídeo, como encontrado no seu ambiente de ocorrência natural. Dessa forma, um polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado ou purificado é substancialmente isento de outro material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes ou substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. Otimamente, um polinucleotídeo “isolado” é isento de sequências (otimamente, sequências que codificam proteínas) que flanqueiam naturalmente o polinucleotídeo (isto é, as sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinucleotídeo é derivado. Por exemplo, em várias modalidades, o polinucleotídeo isolado pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequência de nucleotídeos que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo no DNA genômico da célula a partir do qual o polinucleotídeo é derivado. Um polipeptídeo que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de polipeptídeos que têm menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante. Quando o polipeptídeo da invenção ou porção biologicamente ativa do mesmo é recombinantemente produzido, o meio de cultura ideal representa menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou produtos químicos de proteína de não interesse.

[0063] Os procedimentos de clonagem molecular e de DNA recombinante padrão usadas no presente documento são bem conhecidas na técnica e são descritas mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (deste ponto em diante no presente documento “Sambrook”).

II. Visão geral

[0064] As plantas que têm uma resistência acentuada ao nematoide de cisto do feijão soja (SCN) são conhecidas, entretanto, o motivo de sua resistência era desconhecido até agora. A presente invenção mostra que as duplicações dentro do locus rhg1, e um aumento subsequente na expressão dos genes duplicados dentro do segmento duplicado, causam a resistência no feijão soja a essa doença economicamente importante do feijão soja. Mais especificamente, a duplicação em consecutividade dentro da região mapeada detalhadamente de rhg1 foi identificada, e fornecem-se evidências que sugerem que rhg1 e rhg1-b portam alelos de quantidades variáveis de cópias desse variante estrutural. Essa variabilidade de cópias é a base do fenótipo da resistência ao SCN atribuída ao locus rhg1. Esses resultados apresentam consequências importantes para o desenvolvimento de produtos de feijão soja e apontam para estratégias em potencial para melhorias no cultivo. Os vários métodos e composições aqui fornecidos aplicam essa nova compreensão dos alelos rhg1- e rhg1-b.

[0065] Por “resistência acentuada”, entende-se que as plantas mostrem uma diminuição nos sintomas da doença resultantes das interações do nematoide de cisto com a planta. Isto é, o dano causado pelo nematoide de cisto é evitado ou, alternativamente, os sintomas da doença causados pelo nematoide de cisto são minimizados ou amenizados. Dessa forma, a resistência acentuada ao nematoide de cisto pode resultar na supressão, no controle e/ou na eliminação do nematoide de cisto invasor. Em modalidades específicas, a resistência acentuada pode reduzir os sintomas da doença resultantes do desafio patógeno em ao menos cerca de 2% to ao menos cerca de 6%, ao menos cerca de 5% a cerca de 50%, ao menos cerca de 10% a cerca de 60%, ao menos cerca de 30% a cerca de 70%, ao menos cerca de 40% a cerca de 80% ou ao menos cerca de 50% a cerca de 90% ou mais. Portanto, os métodos aqui fornecidos podem ser utilizados para proteger as plantas de doenças, particularmente doenças causadas pelos nematoides de cisto. Ensaios que mensuram o controle de uma praga são conhecidos e incluem a medição de tempo, do diâmetro médio de lesões, da biomassa do patógeno e da porcentagem geral de tecidos de planta danificados. Consulte, por exemplo, Thomma et al. (1998) planta Biology 95:15.107 a 15.111 e patente US n° 5.614.395, ambas as quais estão aqui incorporadas a título de referência.

[0066] Vários nematoides de cisto são conhecidos. Membros particulares dos nematoides de cisto incluem, mas não se limitam a, Heterodera glycines (nematoide de cisto do feijão soja); Heterodera schachtii (nematoide de cisto da beterraba); Heterodera avenae (nematoide de cisto de cereais); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematoide de cisto da batata). Em modalidades específicas, os métodos e composições revelados na presente invenção são empregados para acentuar a resistência à Heterodera glycines (nematoide de cisto do feijão soja).

III. Região de conferimento de resistência acentuada a nematoides de cisto

[0067] Para uso na presente invenção, o locus rhg1 compreende uma região do genoma do feijão soja que mapeia ao grupo de ligação G. Consulte, por exemplo, Kim et al. (2010) The Plant Genoma Journal 32:81 a 89, o qual é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Dois alelos rhg1 que conferem a resistência a um nematoide de cisto são conhecidos e incluem o alelo rhg1 derivado de Peking e o alelo rhg1-b derivado de PI88788. Conforme descrito em outras partes da presente invenção, a caracterização dos alelos rhg1 que conferem a resistência ao nematoide de cisto compreendem um aumento na quantidade de cópias de pelo menos uma região do locus rhg1.

[0068] Em modalidades específicas, um aumento na quantidade de cópias compreende uma duplicação de pelo menos uma região dentro do locus rhg1. Uma “duplicação” de pelo menos uma região dentro do locus rhg1 pode compreender qualquer aumento na quantidade de cópias dessa região, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais cópias. Uma região dentro do locus rhg1 pode ser de qualquer comprimento, incluindo de 20, 100, 200, 300, 400 nucleotídeos, de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 KB ou mais longas.

[0069] Em modalidades específicas, a região duplicada do locus rhg1 é entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228 do genoma do feijão soja. Em modalidades ainda adicionais, a duplicação da pelo menos uma região do locus rhg1 compreende uma duplicação em consecutividade da região. Para uso na presente invenção, o termo “em consecutividade” se refere ao fato de as sequências estarem imediatamente adjacentes umas às outras.

[0070] Em uma modalidade, a duplicação da região no locus rhg1 compreende uma duplicação em consecutividade do genoma de feijão soja entre, aproximadamente, a posição GM18:1663448, e, aproximadamente a posição GM18:1632228. Em modalidades adicionais, as duplicações em consecutividade são encontradas na mesma orientação em relação umas às outras.

[0071] Em outras modalidades, a duplicação da região dentro do locus rhg1 compreende uma duplicação de pelo menos um gene ou região regulatória dentro do locus ou pode compreender a duplicação de pelo menos um gene ou região regulatória localizados entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e em consecutividade a posição GM18:1632228 do genoma do feijão soja. Os genes dentro dessas regiões podem codificar polipeptídeos ou elementos regulatórios de RNA. Em modalidades específicas, a duplicação da região dentro do locus rhg1 compreende um aumento na quantidade de cópias de qualquer um ou qualquer combinação dentre os seguintes polinucleotídeos: Glyma18g2580 (SEQ ID NO: 3), Glyma18g2590 (SEQ ID NO: 2), Glyma18g2600 (SEQ ID NO:4), Glyma18g2610 (SEQ ID NO:5); e/ou Glyma18g2570 (SEQ ID NO:1) ou uma variante ativa ou fragmento da mesma.

IV. Métodos para identificar e gerar plantas com uma resistência acentuada aos nematoides de cisto

[0072] Vários métodos são fornecidos para identificar as plantas de feijão soja com uma resistência acentuada aos nematoides de cisto. Em uma modalidade, o método de identificação compreende detectar pelo menos um alelo marcador associado à duplicação de pelo menos uma região dentro do locus rhg1. O termo “associada(o) a” em conexão com uma relação entre um locus marcador e um fenótipo se refere a uma dependência estatisticamente significativa da frequência do marcador com relação à escala quantitativa ou com a gradação qualitativa do fenótipo. Dessa forma, um alelo de um marcador está mais comumente associado a um atributo pertinente quando o alelo do locus marcador e os fenótipos do atributo são encontrados juntos na progênie de um organismo, do que se os genótipos do marcador e os fenótipos do atributo tiverem segregado de forma separada.

[0073] Em uma modalidade, o alelo marcador que é detectado está associado com (1) uma duplicação ou uma duplicação em consecutividade do genoma do feijão soja entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228; (2) uma região duplicada encontrada entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228; ou (4) a duplicação de um gene encotnrado entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228; em que cada uma das duplicações está associada a uma resistência acentuada ao nematoide de cisto.

[0074] Em um exemplo não limitador, o alelo marcador associado à duplicação de pelo menos uma região dentro do locus rhg1 compreende a junção de DNA formada no ponto de divisão da duplicação em consecutividade da região dentro do locus rhg1. Tais regiões de junção de DNA são descritas em maiores detalhes em outra parte da presente invenção.

[0075] Os alelos marcadores adicionais que podem ser usados são apresentados nas Tabelas 1 e 2. A Tabela 1 fornece uma lista de sítios polimórficos encontrados no locus rhg1. A posição cromossomial é indicada nas primeiras duas colunas. “Ref” indica o nucleotídeo que ocorre na amostra de referência do feijão soja, e “ALT” indica o nucleotídeo encontrado nas linhas de resistência acentuada a SCN do feijão soja. A presença da alteração de nucleotídeo nas linhas Peking e P188788 é indicada nas duas últimas colunas. A Tabela 2 fornece uma lista de sítios polimórficos encontrados dentro das regiões de codificação do locus rhg1, especificamente polimorfismos em Glyma18g2580 (SEQ ID NO: 3), Glyma18g2590 (SEQ ID NO: 2), Glyma18g2600 (SEQ ID NO:4), Glyma18g2610 (SEQ ID NO:5); e Glyma18g2570 (SEQ ID NO:1) são fornecidos. Dessa forma, qualquer um marcador ou qualquer combinação de polimorfismos apresentados nas Tabelas 1 e 2 pode ser usado para auxiliar na identificação e seleção de plantas de feijão soja com resistência acentuada ao SCN.

[0076] São fornecidas adicionalmente métodos para identificar a planta do feijão soja ou o germoplasma do feijão soja com resistência acentuada ao nematoide de cisto. O método compreende detectar uma duplicação de uma região dentro do locus rhg1 dentro do genoma da planta ou do germoplasma do feijão soja ou. Em tal método, a duplicação de uma região dentro do locus rhg1 pode compreender a duplicação em consecutividade da região do genoma do feijão soja entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228. Em outras modalidades, a duplicação da região dentro do locus rhg1 compreende a duplicação de qualquer região entre as posições GM18:1663448 e GM18:1632228, incluindo, por exemplo, pelo menos um ou qualquer combinação dentre Glyma18g2580 (SEQ ID NO: 3), Glyma18g2590 (SEQ ID NO: 2), Glyma18g2600 (SEQ ID NO:4), Glyma18g2610 (SEQ ID NO:5); e Glyma18g2570 (SEQ ID NO:1) ou variantes ativas e fragmentos das mesmas. Tais métodos para detecção incluem o PCR quantitativo ou outras técnicas quantitativas, as quais estão descritas em maiores detalhes em outro lugar da presente invenção.

[0077] Os métodos adicionais para identificar a planta do feijão soja ou o germoplasma do feijão soja com resistência acentuada ao nematoide de cisto incluem detectar uma quantidade de cópias aumentada de qualquer região duplicada dentro do locus rhg1 ou entre as posições genômicas GM18:1663448 e GM18:1632228 ou detectar uma quantidade de cópias aumentada de qualquer um ou qualquer combinação dentre os seguintes polinucleotídeos Glyma18g2580 (SEQ ID NO: 3), Glyma18g2590 (SEQ ID NO: 2), Glyma18g2600 (SEQ ID NO:4), Glyma18g2610 (SEQ ID NO:5); e Glyma18g2570 (SEQ ID NO:1) ou uma variante ativa ou fragmento dos mesmos. Os métodos pelos quais a quantidade de cópias pode ser examinada são descritos em outros lugares na presente invenção e incluem, por exemplo, a amplificação de PCR e sequenciamento de DNA ou a análise da quantidade de cópias conforme mostrado nos exemplos da presente invenção. Um aumento na quantidade de cópias inclui pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais cópias de uma dada região.

[0078] São fornecidas adicionalmente métodos para identificar a planta do feijão soja ou o germoplasma do feijão soja com resistência acentuada aos nematoides de cisto detectando-se a junção de DNA formada no ponto de divisão de uma duplicação de uma região dentro do locus rhg1. Uma “junção” é um ponto no qual dois fragmentos de DNA de específicos se juntam. Para uso na presente invenção, a “junção de DNA” se refere a um DNA que compreende um ponto de junção. Por exemplo, existe uma junção onde a região duplicada do locus rhg1 o DNA genômico flanqueador. Dessa forma, para uso na presente invenção, uma “junção de DNA formada no ponto de divisão de uma duplicação de uma região” compreende a sequência de nucleotídeo que aparece na junção em que as duas regiões de DNA são repetidas. Em modalidades específicas, as duplicações são repetidas em consecutividade. Em uma modalidade, a junção de DNA compreende uma sequência de DNA que surge quando as regiões do genoma do feijão soja entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228 são colocadas em consecutividade e na mesma orientação com a mesma. A junção de DNA pode ser de qualquer comprimento incluindo, mas não se limitando a, 10 nt, 20 nt, 30 nt, 40 nt, 50 nt, 75 nt, 100 nt, 150 nt, 200 nt, 250 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt, 600 nt, 700 nt ou mais. O comprimento da junção de DNA deve ser um comprimento suficiente para possibilitar a detecção da junção e, dependendo da necessidade e da técnica de detecção empregada, para possibilitar um nível suficiente de especificidade na deteção.

[0079] Em modalidades específicas, a junção de DNA formada no ponto de divisão da duplicação em consecutividade de uma região dentro do locus rhg1 compreende a sequência apresentada em qualquer um dos SEQ ID NOS: 6, 7, 8 ou 9 ou um fragmento das mesmas. Em modalidades específicas, a junção de DNA sendo detectada compreende um fragmento de qualquer um dos SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 9 que tenha pelo menos 10 nt, 20 nt, 30 nt, 40 nt, 50 nt, 75 nt, 100 nt, 150 nt, 200 nt, 250 nt, 300 nt ou mais de nucleotídeos consecutivos de comprimento.

[0080] Vários métodos podem ser usados para detectar a junção de DNA inovadora, incluindo, mas não se limitando a, amplificação por PCR, métodos de hibridização ou sequenciamento de DNA. Tais métodos são discutidos em outro lugar na presente invenção.

[0081] Em uma modalidade, detectar a junção de DNA compreende contatar um material de origem vegetal com um primeiro e um segundo inciadores; e, amplificar um polinucleotídeo que compreende uma junção de DNA formada no ponto de divisão de uma duplicação de uma região do locus rhg1. Em mais modalidades específicas, o primeiro e o segundo iniciadores amplificam um polinucleotídeo que compreende uma junção de DNA, que compreende uma sequência de DNA que surge quando a região do genoma do feijão soja entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228 é colocada em consecutividade e na mesma orientação com o mesmo. Em modalidades específicas, o par de iniciadores amplifica uma junção de DNA apresentada em qualquer um dos SEQ ID NOS: 6, 7, 8 ou 9 ou um fragmento dos mesmos.

[0082] Para uso na presente invenção, “material de origem vegetal” se refere ao material que é obtido ou derivado de uma planta ou de uma parte de planta. Em modalidades específicas, a amostra biológica compreende o tecido de feijão soja.

[0083] As sondas e os iniciadores de polinucleotídeo empregados nos vários métodos e kits revelados na presente invenção especificamente detectam uma sequência de DNA alvo. Qualquer método concencional de hibridização ou ampliação de ácido nucleioco pode ser usado para identificar a presença da junção DNA desejada. Por “detecta especificamente”, entende-se que o polinucleotídeo pode ser usando tanto como um iniciador para amplificar a sequência de DNA desejada quanto o polinucleotídeo pode ser usado como uma sonda que se hibridiza mediante condições estringentes em um polinucleotídeo que tem a sequência de DNA desejada. O nível ou grau de hibridização que possibilita a detecção específica da sequência de DNA desejada é suficiente para distinguir o polinucleotídeo com a sequência de DNA desejada de um polinucleotídeo sem essa região e, por meio disso, possibilita-se uma identificação descriminada de uma planta que tenha a sequência de DNA desejada.

[0084] Por “compartilha(m) uma identidade ou complementaridade de sequência suficiente para possibilitar a amplificação de uma sequência de DNA desejada” entende-se que a sequência compartilhe pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade ou complementaridade com um fragmento ou com o decorrer completo do comprimento do polinucleotídeo que tem a sequência de DNA desejada.

[0085] A respeito da amplificação de um polinucleotídeo alvo (por exemplo, por PCR) com o uso de uma par de iniciadores de amplificação particular, as “condições estringentes” são condições que possibilitam que o par de iniciadores se hibridize no polinucleotídeo alvo ao qual um iniciador com a sequência correspondente de ocorrência natural (ou seu complemento) se ligaria e, preferencialmente, para produzir um produto identificável de amplificação (o amplicon) com uma (1) junção de DNA que compreende o ponto de divisão de uma duplicação de uma região dentro do locus rhg1; (2) junção de que compreende uma sequência de DNA que surge quando as regiões do genoma do feijão soja entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228 são colocadas em consecutividade e na mesma orientação com a mesma (3) junção de DNA apresentada em qualquer um dentre os SEQ ID NOS: 6, 7, 8 ou 9 ou um fragmento dos mesmos; ou (4) qualquer sequência de DNA que esteja associada com a duplicação dentro do locus rhg1. Em uma abordagem com PCR, os designs de iniciadores de oligonucleeotídeos podem ser feitos para uso em reações de PCR para amplificar a junção de DNA desejada. Os métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem por PCR são de conhecimento geral na técnica e apresentados em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, EUA). Consulte também Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods e Applications (Academic Press, New York, EUA); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York, EUA); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR métodos Manual (Academic Press, New York, EUA). Os métodos para amplificação são descritos adicionalmente nas patentes US n° 4.683.195, 4.683.202 e em Chen et al. (1994) PNAS 91:5.695 a 5.699. Esses métodos, bem como outros métodos conhecidos na técnica da amplificação do DNA podem ser usados na prática das modalidades da presente invenção. É compreendido que uma variedade de parâmetros em um protocolo de PCR específico pode precisar ser ajustada às condições de laboratório específicas e podem ser levemente modificados e ainda permitir a coleta de resultados similares.

[0086] O polinucleotídeo amplificado (amplicon) pode ser de qualquer comprimento. Por exemplo, o amplicon pode ser de aproximadamente 10, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 100, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000 nucleotídeos de comprimento ou mais longo.

[0087] Qualquer iniciador pode ser empregado nos métodos para a invenção que possibilite que (1) uma junção de DNA que compreende o ponto de divisão de uma duplicação de uma região dentro do locus rhg1; (2) a junção de DNA que compreende a sequência de DNA que surge quando a região do genoma do feijão soja entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228 é colocada em consecutividade e na mesma orientação com a mesma; (3) junção de DNA apresentada em qualquer um dentre os SEQ ID NOS: 6, 7, 8 ou 9 ou um fragmento dos mesmos; ou (4) qualquer sequência de DNA que esteja associada a uma duplicação do locus rhg1 a ser amplificado e/ou detectado. Por exemplo, em modalidades específicas, o primeiro iniciador compreende um fragmento de uma sequência de polinucleotídeo que flanqueia a extremidade 3’ de uma junção de DNA e o segundo iniciador compreende um fragmento de uma sequência de polinucleotídeo que flanqueia a extremidade 5’ de uma junção de DNA, em que o primeiro ou o segundo iniciador compartilha uma identidade ou complementaridade suficiente de sequência com um polinucleotídeo para amplificar a região de junção de DNA desejada. Os iniciadores podem ser de qualquer comprimento suficiente para amplificar a região desejada incluindo, por exemplo, pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 15 ou 30 ou aproximadamente de 7 a 10, de 10 a 15, de 15 a 20, de 20 a 25, de 25 a 30, de 30 a 35, de 35 a 40, de 40 a 45 nucleotídeos ou maior. Em uma modalidade, o par de iniciadores empregado para amplificar a junção compreende os SEQ ID NO: 14 e 15. São fornecidas, adicionalmente, kits que tenham o par de iniciadores para possibilitar a amplificação da junção desejada.

[0088] Dessa forma, em modalidades específicas, um método de identificar uma planta com resistência acentuada ao nematoide de cisto que compreende detectar uma junção de DNA formada no ponto de divisão de uma região duplicada dentro do locus rhg1 locus é fornecido. O método compreende (a) extrair uma amostra de DNA da planta do feijão soja; (b) fornecer um par de moléculas iniciadoras de DNA que possam especificamente amplificar a junção de DNA desejada, (c) fornecer condições de reação de amplificação de DNA; (d) efetivar a reação de amplificação de DNA, o que desse modo produz uma molécula amplicon de DNA; e (e) detectar a molécula amplicon de DNA, em que a deteção da dita molécula amplicon de DNA na reação de amplificação de DNA indica a presença de uma planta do feijão soja com uma resistência acentuada a nematoides de cisto. A fim de uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou sonda, ela precisa apenas ser suficientemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla estável sob as concentrações de solvente e sal particulares utilizadas.

[0089] Em técnicas de hibridização, o todo ou parte de um polinucleotídeo que se hibridiza seletivamente em um polinucleotídeo alvo que tem a junção de DNA desejada é empregado. O termo “condições estringentes” ou “condições de hibridização estringentes” refere-se às condições sob as quais uma sonda hibridizará com sua sequência alvo em um grau detectavelmente maior do que as outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes mais que o nível de fundo). Condições estringentes dependem da sequência e serão diferentes sob circunstâncias diferentes. Pelo controle da estringência das condições de hibridização e/ou lavagem, as sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma correspondência errada nas sequências para que graus menores de identidade sejam detectados (sondagem heteróloga). Em geral, uma sonda tem menos que cerca de 1.000 nucleotídeos de comprimento ou menos de 500 nucleotídeos de comprimento.

[0090] Para uso na presente invenção, uma sequência idêntica ou complementar é um polinuclotídeo irá especificamente hibridizar com o complemento da molécula de ácido nucleico ao qual ela está sendo comparada sob condições de alta estringência. As condições de estringência apropriadas que promovem a hibridização de DNA, por exemplo, 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguida por uma lavagem 2X SSC a 50°C, são conhecidas pelos versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 a 6.3.6. Tipicamente, as condições para estringentes para hibridização e detecção serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íons de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M da concentração de íons de Na (para outros sais) a um valor de pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, mais de 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores, como formamida. Condições de baixa estringência exemplificadoras incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a 50 a 55°C. Condições de estringência moderada exemplificadoras incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC a uma temperatura de 55 a 60°C. As condições de estringência elevadas exemplificadoras incluem hibridização em 50% de formamida, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em SSC 0,1X a 60 a 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, geralmente, de cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos um período de tempo suficiente para atingir o equilíbrio.

[0091] Nas reações de hibridização, a especificidade é tipicamente a função de lavagens de pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximadamente da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267 a 284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% form) - 500/l; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % GC é a porcentagem dos nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de bases A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza a uma sonda perfeitamente pareada. Tm é reduzida por cerca de 1°C para cada 1% de mau emparelhamento; dessa forma, Tm, as condições de hibridização e/ou de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com sequências da identidade desejada. Por exemplo, caso sequências com >90% de identidade sejam desejadas, a Tm pode ser reduzida em 10°C. Em geral, as condições estringentes são selecionadas para ser cerca de 5°C menores que o ponto de fusão térmico (Tm) para uma sequência específica e seu complemento em uma força iônica e um pH definidos. Entretanto, condições extremamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C abaixo do ponto térmico de fusão (Tm); Condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C a menos que o ponto de fusão térmica (Tm); condições de baixa estringência podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C abaixo do ponto térmico de fusão (Tm). Com o uso da equação, da hibridização e das composições de lavagem, e da Tmdesejada, os versados na técnica entenderão que variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de pareamento incorreto resultar em uma Tm menor que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é considerado ótimo aumentar a concentração de SSC para que uma temperatura mais elevada possa ser usada. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte 1 , Capítulo 2 (Elsevier, New York, EUA); e Ausubel et al., eds. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 Greene Publishing e Wiley-Interscience, New York, EUA. Consulte Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, EUA) e Haymes et al. (1985) Em: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C., EUA.

[0092] Diz-se que um polinucleotídeo é o “complemento” de outro polinucleotídeo se esses exibirem complementaridade. Para uso na presente invenção, as moléculas são consideradas como exibindo “complementaridade completa” quando cada nucleotídeo de uma das moléculas polinucleotídicas for complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são consideradas como sendo “minimamente complementares” se elas podem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma com a outra sob condições ao menos de “baixa-estringência” convencionais. De modo similar, as moléculas são consideradas como sendo “complementares” se elas podem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma com a outra sob condições de “alta estringência” convencionais.

[0093] Vários métodos para detecção incluem, mas não se limitam a, Genetic Bit Analysis (Nikiforov et al. (1994) Nucleic Acid Res. 22: 4.167 a 4.175) em que projeta-se de um oligonucleotídeo de DNA que sobrepõe tanto a sequência de DNA adjacente flanqueadora quanto a sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em poços de uma placa de microtitulação. Após a PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e um na sequência flanqueadora em posição adjacente) um produto de PCR de filamento único pode ser hibridizado ao oligonucleotídeo imobilizado e serve como um molde para uma reação de extensão de base única usando uma DNA polimerase e ddNTPs identificados específicos para a base seguinte esperada. A leitura pode ser baseada em ELISA ou fluorescente. Um sinal indica a presença da sequência de inserção/flanqueadora devido à amplificação, hibridização e extensão de base única bem sucedida.

[0094] Outro método de detecção é a Técnica de Pirossequenciamento conforme descrito por Winge ((2000) Innov. Pharma. Tech. 00: 18 a 24). Neste método, projeta-se um oligonucleotídeo que sobrepõe o DNA em posição adjacente e a junção de DNA da inserção. O oligonucleotídeo é hibridizado para um produto de PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência flanqueadora) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5‘ fosfossulfato e luciferina. Os dNTPs são acrescentados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença de uma sequência de inserção de transgene/flanqueadora devido à amplificação, hibridização e extensão de base simples ou múltipla bem sucedida.

[0095] A polarização de fluorescência, conforme descrito por Chen et al. ((1999) Genome Res. 9: 492 a 498, 1999), também é um método que pode ser usado para detectar um amplicon da invenção. Usando este método, projeta-se um oligonucleotídeo que sobrepõe a junção do DNA inserido e flanqueador. O oligonucleotídeo é hibridizado a um produto de PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência de DNA flanqueador) e incubado na presença de uma DNA polimerase e de um ddNTP marcado fluorescente. A extensão de base única resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma alteração na polarização usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença de uma sequência de inserção de transgene/flanqueadora devido à amplificação, hibridização e extensão de base simples bem sucedida.

[0096] Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é descrito como um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA e é totalmente compreendido nas instruções fornecidas pelo fabricante. Em suma, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada que sobrepõe a junção do DNA flanqueador e de inserção. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência do DNA de inserção e um na sequência genômica flanqueadora) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem e liberação da porção fluorescente da porção de supressão na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção flanqueadora/do transgene devido à amplificação e hibridização bem sucedida.

[0097] Sinais moleculares foram descritos para uso na detecção de sequências conforme descrito em Tyangi et al. ((1996) Nature Biotech. 14: 303 a 308). Em suma, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada que sobrepõe a junção do DNA flanqueador e de inserção. A estrutura única da sonda FRET resulta no contato da estrutura secundária que mantém as porções fluorescente e de supressão muito próximas. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência do DNA de inserção e um na sequência flanqueadora) sao ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação do PCR bem sucedida, a hibridização da sonda FRET à sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial das porções fluorescente e de supressão. Um sinal fluorescente é produzido. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção flanqueadora/do transgene devido à amplificação e hibridização bem sucedida.

[0098] Uma reação de hibridização usando uma sonda específica para uma sequência encontrada no amplicon é ainda outro método usado para detectar o amplicon produzido por uma reação de PCR.

[0099] Para uso na presente invenção, “kit” se refere a um conjunto de reagentes para o propósito de efetivar os vários métodos de detecção ou identificação aqui fornecidos, mais particularmente, de identificação e/ou deteção de uma planta do feijão soja que tenha uma resistência acentuada ao nematoide de cisto.

[0100] Uma vez que a planta do feijão soja com uma duplicação de uma região dentro do locus rhg1 que confere a resistência ao nematoide de cisto tenha sido identificada, a planta ou qualquer uma de suas prógenes que tenha essa região pode ser selecionada e cruzada com uma segunda planta do feijão soja. Em modalidades específicas, a duplicação de uma região dentro do locus rhg1 que confere uma resistência ao nematoide de cisto pode ser introgressada à segunda planta do feijão soja para produzir um germoplasma introgressado do feijão soja.

V. Plantas transgênicas que têm uma resistência acentuada ao nematoide do cisto

[0101] Uma abordagem transgênica pode ser usada para gerar materiais adicionais resistentes ao nematoide de cisto. Especificamente, a integração transgênica de um ou mais dos genes contidos dentro da região duplicada do locus rhg1 (por exemplo, um ou mais dos genes contidos entre aproximadamente a posição genômica GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228) pode ser introduzida em uma planta ou célula de planta e, por meio disso, conferir uma resistência acentuada aos nematoides de cisto. Dessa forma, fornecem-se plantas, células de plantas e partes de plantas que tenham um nível aumentado de expressão de um ou mais genes encontrados entre aproximadamente a posição genômica GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228.

[0102] Em modalidades específicas, fornece-se uma planta, célula de planta, semente, grão ou parte de planta (particularmente uma planta, célula de planta, semente ou grão do feijão soja) que compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo incorporado de maneira estável no genoma que compreende pelo menos um gene encontrado entre aproximadamente a posição genômica GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228. Em modalidades específicas, o polinucleotídeo heterólogo compreende pelo menos uma das sequências dentre Glyma18g2580 (SEQ ID NO: 3), Glyma18g2590 (SEQ ID NO:2), Glyma18g2600 (SEQ ID NO:4), Glyma18g2610 (SEQ ID NO:5) ou Glyma18g2570 (SEQ ID NO:1) ou uma variante ativa ou fragmento das mesmas. A variante ativa ou fragmento do gene continuará a conferir uma resistência acentuada a nematoides de cisto.

[0103] Além disso, embora qualquer combinação dos SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou de variantes ativos ou fragmentos dos mesmos possa ser introduzido na planta ou parte de planta, a planta ou parte de planta pode compreender, ainda, múltiplas cópias do mesmo polinucleotídeo heterólogo. Por exemplo, a planta pode compreender pelo menos 2, 3, 4, 5 ou mais cópias de qualquer um ou qualquer combination, dentre Glyma18g2580 (SEQ ID NO: 3), Glyma18g2590 (SEQ ID NO:2), Glyma18g2600 (SEQ ID NO:4), Glyma18g2610 (SEQ ID NO:5) ou Glyma18g2570 (SEQ ID NO:1) ou uma variante ativa ou fragmento das mesmas.

[0104] Em modalidades específicas, o polinucleotídeo heterólogo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou o variante ativa ou fragmento do mesmo está ligado de maneira funcional a um promotor constitutivo, tecido-preferencial ou outro promotor para uma expressão em plantas. Em modalidades específicas, o promotor é heterólogo ao polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0105] Em modalidades específicas, a planta ou célula de planta que tem o polinucleotídeo heterólogo é uma planta do feijão soja. Entretanto, a sequência pode ser introduzida em qualquer planta pertinente, incluindo, mas não se limitando a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de espécies das plantas de interesse incluem, mas não se limitam a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto (por exemplo, milheto pérola (Pennisetum glaucum), milheto proso (Panicum miliaceum), milheto rabo de raposa (Setaria italica), milheto de dedo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), feijão feijão soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), citrus trees (Citrus spp.), cocoa (Theobroma cacao), tea (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), noz de macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coníferas.

[0106] Os vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), vagem (Phaseolus vulgaris), feijão-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e membros do gênero Cucumis como o pepino (C. sativus), melão de polpa amarela (C. cantalupensis), e melão (C. melo). As plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortência (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narciso silvestre (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus poinsetia (Euphorbia pulcherrima), crisântemo.

[0107] Coníferas que podem ser empregadas na prática da presente invenção incluem, por exemplo, pinheiros como pinheiro loblolly (Pinus taeda), pinheiro americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro lodgepole (Pinus contorta) e pinheiro Monterey (Pinus radiata); Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); Western hemlock (Tsuga canadensis); Sitka spruce (Picea glauca); redwood (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros como abeto prata (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros como o cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do AlascaChamaecyparis (nootkatensis) e álamo e eucalipto. Em modalidades específicas, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, feijão soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, painço, tabaco, etc.). Em outras modalidades, plantas de milho e feijão soja são ótimas e, ainda em outras modalidades, as plantas de milho são ótimas.

[0108] Outras plantas de interesse incluem plantas de cereais que fornecem sementes de interesse, plantas de sementes oleaginosas e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de cereais, como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. Plantas de sementes oleaginosas incluem algodão, feijão soja, cártamo, girassol, Brassica, milho, alfafa, palma, coco, etc. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, alfarrobeira, feno-grego, feijão soja, feijões de jardim, feijão-caupi, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.

A. Variantes e fragmentos de Glyma18g2580, Glyma18g2590, Glyma18g2600, Glyma18g2610, e Glyma18g2570

[0109] O termo “variantes” se destina a significar sequências substancialmente similares. Para os polinucleotídeos, uma variante compreende um polinucleotídeo que tem um deleção (isto é, truncamentos) na extremidade 5‘ e/ou 3' e/ou uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios internos dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Para uso na presente invenção, um polinucleotídeo ou polipeptídeo “nativo” compreende uma sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácidos de ocorrência natural, respectivamente. Para polinucleotídeos, as variantes conservadoras incluem aquelas sequências que, devido à degenerecência do código genético, codificam a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos encontrados entre aproximadamente a posição genômica a posição genômica GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228, particularmente, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Os polinucleotídeos variantes também incluem polinucleotídeos de derivação sintética, como aqueles gerados, por exemplo, utilizando-se mutagênese sítio-dirigida ou síntese de gene, mas que ainda retenham a capacidade de acentuar a resistência a nematoides de cisto.

[0110] Uma variante ativa de qualquer um dos SEQ ID NO: 1, 2 , 3, 4 ou 5 pode compreender um polinucleotídeo que tem menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, conforme determinado por programas e parâmetros de alinhamento de sequência descritos em outro lugar na presente invenção e, quando expressada, a sequência continua a conferir uma resistência acentuada a nematoides de cisto. Alguns exemplos não limitadores de variantes de SEQ ID NO: 1, 2, 3, e 5 são apresentados na Tabela 2.

[0111] Obviamente, as mutações que serão feitas no DNA que codifica a variante não podem colocar a sequência fora do quadro de leitura e, de maneira ótima, não criarão regiões complementares que poderiam produzir estrutura de mRNA secundária. Consulte a publicação de pedido de patente EP n° 75.444. Os polinucleotídeos e proteínas variantes também abrangem sequências e proteínas derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico, como embaralhamento de DNA. As estratégias para embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389 391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336 a 347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288 a 291; e patentes US n°s 5.605.793 e 5.837.458.

[0112] O termo “fragmento” se destina a definir uma porção do polinucleotídeo ou uma porção da sequência de aminoácidos e, portanto, a proteína codificada pelo mesmo. Os fragmentos de um polinucleotídeo podem codificar fragmentos de proteína que retêm a capacidade de acentuar uma resistência a nematoides. Os fragmentos de uma sequência de nucleotídeo podem ter na faixa de ao menos cerca de 20 nucleotídeos, aproximadamente 50 nucleotídeos, aproximadamente 100 nucleotídeos e até polinucleotídeos de comprimento completo que codificam os polipeptídeos que conferem uma resistência acentuada a nematoides de cisto. Um fragmento de um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 que codifica uma porção biologicamente ativa e, por meio disso, acentua uma resistência a nematoides de cisto, irá compreender pelo menos 50, 75, 100, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 410, 415, 420, 425, 430, 435 ou 440 nucleotídeos contíguos ou até a quantidade total de nucleotídeos presentes em uma sequências de comprimento completo.

B. Construtos de polinucleotídeo

[0113] Os polinucleotídeos aqui revelados que conferem uma resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas) podem ser fornecidos em cassetes de expressão para a expressão na planta pertinente. O cassete pode incluir sequências regulatórias de 5' e 3' ligadas de maneira funcional ao polinucleotídeo ou variante ativa ou fragmento do mesmo, o que confere uma resistência acentuada aos nematoides de cisto. “Operacionalmente ligado” se destina a significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operacional entre um polinucleotídeo de interesse e uma sequência regulatória (isto é, um promotor) é uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Os elementos operacionalmente ligados podem ser contíguos ou não-contíguos. Quando usado com relação à união de duas regiões codificantes de proteína, o termo operacionalmente ligado significa que as regiões codificantes estão na mesma fase de leitura. O cassete pode conter, adicionalmente, pelo menos um gene adicional a ser co- transformado no organismo. Alternativamente, os genes adicionais podem ser fornecidos em cassetes de expressão múltiplos. Tal cassete de expressão é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para a inserção do polinucleotídeo ou variante ativa ou fragmento do mesmo para estar sob a regulação transcricional das regiões regulatórias. O cassete de expressão pode conter ainda genes marcadores selecionáveis.

[0114] O cassete de expressão pode incluir, na direção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação transcricional e translacional (isto é, um promotor), um polinucleotídeo ou variante ativa ou fragmento do mesmo, que confere uma resistência acentuada ao nematoide de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5), e uma região de terminação transcricional e translacional (isto é, uma região de terminação) functional em plantas. As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras transcricionais e regiões de terminação traducional) e/ou o polinucleotídeo ou variante ativa ou fragmento da mesma das modalidades podem ser nativas/análogas à célula hospedeira ou uma à outra. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou as sequências que conferem uma resistência acentuada ao nematoide de cisto ou variante ativa ou fragmento das mesmas, podem ser heterólogas à célula hospedeira ou umas às outras.

[0115] Para uso na presente invenção, “heterólogo”, com relação a uma sequência, é uma sequência que se origina de uma espécie estranha, ou, caso seja da mesma espécie, é substancialmente modificada com relação a sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por intervenção humana intencional. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie a partir da qual o polinucleotídeo se originou, ou, caso seja de espécie igual /análoga, um ou ambos são substancialmente modificados com relação a sua forma original e/ou locus genômico ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado.

[0116] Conforme usado aqui, um polinucleotídeo ou polipeptídeo é “recombinante” quando é artificial ou manipulado ou derivado de uma proteína ou ácido nucleico artificial ou manipulado. Por exemplo, um polinucleotídeo que é inserido em um vetor ou qualquer local heterólogo, por exemplo, em um genoma de um organismo recombinante, de modo que não seja associado a sequências de nucleotídeo que normalmente flanqueiam o polinucleotídeo conforme é encontrado na natureza é um polinucleotídeo recombinante. Um polipeptídeo expressado in vitro ou in vivo a partir de um polinucleotídeo recombinante é um exemplo de um polipeptídeo recombinante. De modo semelhante, uma sequência de polinucleotídeo que não aparece na natureza, por exemplo, uma variante de um gene de ocorrência natural é recombinante.

[0117] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional ou variante ativa ou fragmento da mesma, pode ser nativa com a planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estrangeira ou heteróloga) ao promotor, sendo que o polinucleotídeo ou fragmento ativa ou variante do mesmo que codifica o polipeptídeo que acentua uma resistência ao nematoide de cisto, à planta hospedeira ou a qualquer combinação dos mesmos. Regiões de terminação adequadas estão disponíveis a partir do plasmídeo de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consulte também Guerineau et al.(1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 a 144; Proudfoot (1991) Cell volume 64, páginas 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell2:1261 a 1272; Munroe et al. (1990) Gene, volume 91, páginas 151 a 158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 a 7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9.627 a 9.639.

[0118] Onde adequado, os polinucleotídeos podem ser otimizados para expressão aumentada na planta transformada. Isto é, os polinucleotídeos podem ser sintetizados com o uso de códons preferenciais de planta para expressão aprimorada. Consulte, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol.volume 92, páginas 1 a 11 para uma discussão quanto ao uso de códon preferencial para hospedeiro. Métodos para sintetizar genes preferenciais de plantas estão disponíveis na técnica. Consulte, por exemplo, as patentes US n° 5.380.831, e 5.436.391 e Murray et al.(1989) Nucleic Acids Res. volume 17, páginas 477 a 498, aqui incorporados a título de referência.

[0119] Modificações de sequência adicionais para melhorar a expressão gênica em um hospedeiro celular são conhecidas. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais espúrios de poliadenilação, sinais de sítio de emenda éxon- íntron, repetições similares a transpóson e outras sequências bem caracterizadas como essas, que podem ser prejudiciais à expressão gênica. O conteúdo de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis medidos para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas secundárias de mRNA em forma de grampo previstas.

[0120] Os cassetes de expressão podem conter ainda sequências líder 5'. Estas sequências líder podem atuar acentuando a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes picornavirus, por exemplo, o líder EMCV (região não codificadora de Encefalomiocardite 5') (Elroy- Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6126 a 6130); líderes de potivírus, por exemplo, líder TEV (Tobacco Etch Virus) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (vírus do mosaico do anão de milho) (Virology 154:9-20), e proteína de ligação à cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature volume 353, páginas 90-94); líder não traduzido da proteína de revestimento mRNA do vírus de mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature volume 325, páginas 622-625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) em Molecular Biology of RNA, Editor Cech (Liss, New York, EUA), páginas 237 a 256); e líder de vírus mosqueado clorótico do milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385. Consulte também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol., volume 84, páginas 965 a 968.

[0121] No preparo do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a fornecer às sequências de DNA a orientação adequada e, conforme para adequado, a fase de leitura adequada. Para isso, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Para este propósito, a mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, anelamento, resubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.

[0122] Vários promotores podem ser usados para expressar as várias sequências apresentadas nos SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 ou 5 ou a variante ativa ou fragmentos da mesma, incluindo o promotor nativo da sequência de polinucleotídeo pertinente. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Tais promotores incluem, por exemplo, promotores constitutivos, induzíveis, tecido-preferenciais ou outros promotores para a expressão em plantas ou em qualquer organismo pertinente. Em modalidades específicas, os promotores são heterólogos às sequências sendo expressadas.

[0123] Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados no WO 99/43838 e patente U.S. n° 6.072.050; o promotor CaMV 35S núcleo (Odell et al. (1985) Nature volume 313, páginas 810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell volume 2, páginas 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. volume 12, páginas 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. volume 18, páginas 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. volume 81, páginas 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723 a 2730); promotor ALS (patente U.S. n° 5.659.026) e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, os das patentes US n° 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611.

[0124] Promotores tecido-preferenciais podem ser usados para se obter uma expressão em um tecido de planta específico. Os promotores tecido-preferenciais incluem aqueles descritos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. volume 12, número 2, páginas 255 a 265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. volume 38, número 7, páginas 792 a 803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. volume 6, número 2, páginas 157 a 168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. volume 112, número 2, páginas 525 a 535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) resultados Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol.Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Esses promotores podem ser modificados, se necessário, para uma expressão fraca. Um promotor exemplificador é o promotor específico da antera 5126 (patentes US n°s 5.689.049 e 5.689.051). Exemplos dos promotores específicos de semente incluem, mas não se limitam a, o promotor da gama-zeína de 27 KD e o promotor waxy, Boronat et al. Plant Sci. 47, 95-102 (1986); Reina et al., (21) Nucleic Acids Res. 18 (21), 6426 (1990); e Kloesgen et al., Mol. Gen. Genet. 203, 237-244 (1986). Os promotores que expressam no embrião, no pericarpo e no endosperma são revelados nos pedidos de patente US n° de Série 60/097.233, depositado em 20 de agosto de 1998, e 60/098.230, depositado em 28 de agosto de 1998. As descrições para cada um destes estão aqui incorporadas a título de referência em suas totalidades.

[0125] Promotores preferenciais de folha são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. volume 12, número 2, páginas 255 a 265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. volume 35, número 5, páginas 773 a 778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 90, número 20, páginas 9586 a 9590.

[0126] Os promotores sintéticos podem ser usados para expressar as várias sequências que conferem tolerância a nematoides de cisto ou variantes biologicamente ativas e fragmentos das mesmas.

[0127] Promotores reguláveis quimicamente podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível quimicamente, em que a aplicação da substância química induz a expressão gênica ou um promotor reprimível quimicamente, em que a aplicação da substância química reprime a expressão gênica. Os promotores quimicamente induzíveis são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, o promotor In2-2 de milho, o qual é ativado por safeners herbicidas de benzenossulfonamida; o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergência; e o promotor PR-1a de tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores regulados quimicamente pertinentes incluem promotores responsivos a esteróides. Consulte, por exemplo, o promotor induzível por glucocortidóides em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 88, páginas 10421 a 10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257 e os promotores induzíveis por tetraciclina e reprimíveis por tetraciclina, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. volume 227, páginas 229 a 237, e patentes US n° 5.814.618 e 5.789.156, aqui incorporados a título de referência.

[0128] O cassete de expressão também pode compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Genes marcadores incluem genes que codificam resistência a antibióticos, como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, como glifosato, glufosinato amônio, bromoxinila, sulfonilureias, dicamba e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Os marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos como β-galactosidase e proteínas fluorescentes como proteína verde fluorescente (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng, volume 85, páginas 610 a 619 e Fetter et al. (2004) célula de planta, volume 16, páginas 215 a 228), proteína ciano fluorescente (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science, volume 117, páginas 943 a 954 e Kato et al. (2002) Plant Physiol. volume 129, páginas 913 a 942), e proteína amarela fluorescente (PhiYFP™ disponível junto à Evrogen, consulte Bolte et al. (2004) J. Cell Science, volume 117, páginas 943 a 954). Para conhecer marcadores selecionáveis adicionais, consulte, em geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 89, páginas 6314 a 6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) no The Operon, páginas 177 a 220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713 a 722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA, volume 86, páginas 5400 a 5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, páginas 2549 a 2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480 a 483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University de Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. volume 89, páginas 3952 a 3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,volume 88, páginas 5072 a 5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University de Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 89, páginas 5547 a 5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook de Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim, Alemanha); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Essas descrições estão aqui incorporadas a título de referência. A lista de genes marcadores selecionáveis acima não se destina a ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado na presente invenção, incluindo, por exemplo, DsRed.

C. Empilhamento de outros traços pertinentes

[0129] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que conferem uma tolerância acentuada a nematoides de cisto ou variantes ativas e fragmentos das mesmas, são engendradas em uma pilha molecular. Deste modo, as várias plantas, células vegetais e sementes reveladas na presente invenção podem compreender adicionalmente uma ou mais características de interesse, e em modalidades mais específicas, a célula hospedeira, a planta, parte da planta ou célula vegetal é empilhada com qualquer combinação de sequências de polinucleotídeo de interesse para criar plantas com uma combinação desejada de traços. Para uso na presente invenção, o termo “empilhado” inclui ter múltiplos traços presentes na mesma planta ou no no mesmo organismo pertinente. Em um exemplo não limitador, “traços empilhados” compreendem uma pilha molecular em que as sequências são fisicamente adjacentes umas às outras. Um traço, conforme usado na presente invenção, refere-se ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências.

[0130] A planta ou célula de planta ou parte de planta que tem a sequência que confere uma tolerância acentuada a nematoides de cisto ou variantes ativas ou fragmentos das mesmas, podem também ser combinadas com pelo menos um outro traço para produzir plantas que compreendem, ainda, várias combinações de traços desejados incluindo, mas não se limitando a, traços desejáveis para alimentação animal como um alto conteúdo de óleo (por exemplo, patente US n° 6.232.529); um conteúdo equilibrado de aminoácidos (por exemplo, hordotioninas (patentes US n°s 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; e 5.703.409; patente US n° 5.850.016); cevada de alto teor de lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; e WO 98/20122) e proteínas com alto teor de metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359; e Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada (por exemplo, proteínas de armazenagem modificadas (Pedido US N° de série 10/053.410, depositado em 7 de novembro de 2001); e tioredoxinas (Pedido US N° de série 10/005.429, depositado em 3 de dezembro de 2001)); cujas revelações estão aqui incorporadas, a título de referência. As combinações de traços desejados incluem também LLNC (baixo conteúdo de ácido linolênico; consulte, por exemplo, Dyer et al. (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 224-230) e OLCH (alto teor de ácido oléico; consulte, por exemplo., Fernandez-Moya et al. (2005) J. Agric. Food Chem. 53: 5326-5330).

[0131] A planta ou célula de planta ou parte de planta que tem a sequência ou uma variante ativa ou fragmento da mesma, que confira uma resistência acentuada a nematoides de cisto, pode também ser combinada com outros traços desejáveis como, por exemplo, genes de desintoxicação de fumonisinas (patente US n° 5.792.931), de avirulência e genes de resistência à doenças (Jones et al. (1994) Science 266: 789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78: 1089), e traços desejáveis para processamentos ou para produtos processados, como óleos modificados (por exemplo, genes de dessaturase de ácidos graxos (patente US n° 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (por exemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase), amido sintases (SS), enzimas ramificadoras de amido (SBE), e enzimas desramificadoras de amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (por exemplo, patente U.S. n° 5.602.321; beta-cetotiolase, polidroxibutirato sintase, e acetoacetil-CoA redutase (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão de polidroxialcanoatos (PHAs)); cujas revelações estão aqui incorporadas, a título de referência. Pode-se também combinar os polinucleotídeos tolerantes a herbicidas das modalidades com polinucleotídeos que fornecem traços agronômicos como a esterilidade masculina (por exemplo, consulte a patente n° 5.583.210), resistência de talo, tempo de floração ou traços de tecnologia de transformação, como regulação do ciclo celular ou alvejamento de genes (por exemplo, WO 99/61619, WO 00/17364 e WO 99/25821); cujas revelações estão aqui incorporadas, a título de referência.

[0132] Em outras modalidades, a planta ou célula de planta ou parte de planta que tem a sequência que confere uma resistência acentuada ao nematoide de cisto ou uma variante ativa ou fragmento da mesma, pode ser empilhada com quaisquer outros polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que tem atividade pesticida e/ou insecticida, como as proteínas tóxicas do Bacillus thuringiensis (descrito em patentes US n°s 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; Geiser et al. (1986) Gene 48: 109; Lee et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69: 4648-4657 (Vip3A); Galitzky et al. (2001) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57: 1101-1109 (Cry3Bb1); e Herman et al. (2004) J. Agric. Food Chem. 52: 2726-2734 (Cry1F)), as lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24: 825, as pentinas (descritas na patente US n° 5.981.722) e similares. As combinações geradas também podem incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse.

[0133] Em uma outra modalidade, a planta ou célula de planta ou parte de planta que tem a sequência que confere uma resistência acentuada ao nematoide de cisto ou uma variante ativa ou fragmento da mesma, pode também ser combinada com a sequência Rcg1 ou uma variante biologicamente ativa ou fragmento da mesma. A sequência Rcg1 é um gene de resistência à podridão de antracnose do caule em milho. Consulte, por exemplo, os pedidos de patente US n°s 11/397.153, 11/397.275, 11/397.247, cada um dos quais está aqui incorporado a título de referência.

[0134] Essas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo, mas não se limitando a, o melhoramento de plantas por qualquer metodologia convencional ou transformação genética. Caso as sequências sejam piramidizadas por transformação genética das plantas, as sequências de polinucleotídeos de interesse podem ser combinadas a qualquer momento e em qualquer ordem. As características podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação ou cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidos no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprimirá a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado por qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de expressão excessiva para gerar as combinações de traços desejadas na planta. É reconhecido ainda que as sequências de polinucleotídeo podem ser piramidizadas em um local genômico desejado com o uso de um sistema de recombinação sítio- específico. Vide, por exemplo, os documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, que estão aqui incorporados, a título de referência.

[0135] Qualquer planta que tem a sequência que confere resistência acentuada ao nematoide de cisto revelada aqui ou uma variante ativa ou fragmento da mesma, pode ser usada para fazer um alimento ou um produto alimentício. Tais métodos compreendem obter uma planta, explante, semente, célula de planta ou célula que compreende a sequência que confere resistência acentuada ao nematoide de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5), ou variante ativa ou fragmento da mesma, e processar a planta, explante, semente, célula de planta ou célula para produzir um alimento ou produto alimentício.

D. Métodos para introdução

[0136] Vários métodos podem ser usados para introduzir uma sequência pertinente em uma planta ou parte de planta. “Introduzir” entende-se apresentar, à célula hospedeira, planta, célula de planta ou parte de planta, o polinucleotídeo ou polipeptídeo de maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta ou do organismo. Os métodos para a invenção não dependem de um método particular para introduzir uma sequência em um organismo ou uma planta ou parte de planta, somente do fato de que o polinucleotídeo ou polipeptídeos ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula do organismo ou da planta. Os métodos para introduzir polinucleotídeos ou polipeptídeos em vários organismos, incluindo plantas, são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, métodos de transformação estável, métodos de transformação temporária e métodos mediados por vírus.

[0137] “Transformação estável” significa que um construto de nucleotídeo introduzido em uma planta se integra ao genoma da planta ou organismo pertinente e tem capacidade de ser herdado pela sua progênie. “Transformação transiente” tenciona significar que um polinucleotídeo é introduzido na planta ou organismo pertinente e não se integra ao genoma da planta ou organismo ou que um polipeptídeo é introduzido em uma planta ou um organismo.

[0138] Os protocolos de transformação e os protocolos para introduzir sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionada para a transformação. Os métodos adequados para introduzir polipeptídeos e polinucleotídeos em células de planta incluem a microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques volume 4, páginas 320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium(patente US n° 5.563.055 e patente US n° 5.981.840), transferência direta de gene (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração de partícula balística (consulte, por exemplo, patentes US n°s 4.945.050; patente US n° 5.879.918; patente US n° 5.886.244; e 5.932.782; Tomes et al. (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim, Alemanha); McCabe et al. (1988) Biotechnology volume 6, páginas 923-926); e transformação por Lec1 (WO 00/28058). Consulte também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology volume 5, páginas 27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. volume 87, páginas 671 a 674 (feijão soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology volume 6, páginas 923-926 (feijão soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (feijão soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319 a 324 (feijão soja); Datta et al. (1990) Biotechnology volume 8, páginas 736 a 740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305 a 4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology volume 6, páginas 559-563 (milho); patentes US n°s 5.240.855, 5.322.783; e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. volume 91, páginas 440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology volume 8, páginas 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) volume 311, páginas 763764; patentes US n° 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345 a 5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York, EUA), páginas 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports volume 9, páginas 415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por whisker (nanocristais)); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell volume 4, páginas 1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports volume 12, páginas 250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany volume 75, páginas 407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology volume 14, páginas 745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência.

[0139] Em modalidades específicas, as sequências que conferem uma resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, qualquer uma ou qualquer combinação dentre os SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5) ou variantes ativas ou fragmentos das mesmas podem ser introduzidas em plantas contatando-se as plantas com um vírus ou com ácidos nucleicos virais. Em geral, estes métodos envolvem a incorporação de um construto de nucleotídeo da invenção em uma molécula de DNA ou RNA. É reconhecido que a sequência que confere resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, qualquer uma ou qualquer combinação dentre os SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5), pode ser inicialmente sintetizada como parte de uma poliproteína viral, que posteriormente pode ser processada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Adicionalmente, é reconhecido que os promotores da invenção também incluem promotores utilizados para transcrição por RNA polimerases virais. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada por eles envolvendo moléculas de DNA ou RNA virais são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, as patentes US n°s 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 e Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology volume 5:209 a 221; aqui incorporados a título de referência.

[0140] Métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em um local específico no genoma da planta são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é obtida usando um sistema de recombinação sítio-específico. Vide, por exemplo, os documentos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, que estão aqui incorporados, a título de referência. Resumidamente, o polinucleotídeo da invenção pode estar contido em um cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não-recombinogênicos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que tem um sítio alvo incorporado de maneira estável no seu genoma que é flanqueado por dois sítios de recombinação não-recombinogênicos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase adequada é fornecida e o cassete de transferência é integrado ao sítio alvo. O polinucleotídeo de interesse é, portanto, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta. Outros métodos para alvejar polinucleotídeos são apresentados em WO 2009/114321 (aqui incorporada a título de referência), que descreve meganucleases “personalizadas” produzidas para modificar genomes de planta, em particular o genoma de milho. Consulte, também, Gao et al. (2010) Planta Journal 1:176-187.

[0141] As células que foram transformadas podem ser cultivadas para se tornar plantas de acordo com maneiras convencionais. Consulte, por exemplo, McCormick et al. (1986) célula de planta Reports 5:81-84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas, sejam polinizadas com a mesma linhagem transformada ou com linhagens diferentes, e a progênie resultante que tem expressão constitutiva da característica fenotípica pode ser identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de maneira estável e herdada e, então, as sementes são coletadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Desta forma, a presente invenção fornece sementes transformadas (também chamadas de “sementes transgênicas”) que têm um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de maneira estável no seu genoma.

[0142] As células de planta transformadas que são derivadas por técnicas de transformação de planta, incluindo aquelas discutidas acima, podem ser cultivadas para regenerar uma planta completa que possua o genótipo transformado (isto é, que confere uma resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, qualquer uma ou qualquer combinação dentre os SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5)) e, dessa forma, o fenótipo desejado, como uma resistência acentuada a nematoides de cisto. Para a transformação e regeneração de milho, consulte Gordon-Kamm, et al., The Plant Cell 2:603-618 (1990). A regeneração de planta a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans et al. (1983) Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, Macmillan Publishing Company, New York; e Binding (1985) Regeneration of Plants, Planta Protoplasts, páginas 21 a 73, CRC Press, Boca Raton. A regeneração pode ser também obtida a partir de calos de, planta, explantes, órgãos ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração são descritas, de forma geral, em Klee et al. (1987) Ann Rev of Plant Phys 38:467. Consulte também, por exemplo, Payne e Gamborg.

[0143] O versado na técnica r econhecerá que após o cassete de expressão que contém a sequência que confere uma resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, qualquer uma ou qualquer combinação dentre os SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5) ser incorporado de maneira estável em plantas transgênicas e ter sua operabilidade confirmada, o mesmo pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer uma de inúmeras técnicas de reprodução convencionais podem ser usadas, dependendo das espécies a serem cruzadas.

[0144] Em safras propagadas de modo vegetativo, plantas transgênicas maduras podem ser propagadas adotando técnicas de cultura de tecido ou cortes para produzir múltiplas plantas idênticas. A seleção de transgênicos desejáveis é feita e novas variedades são obtidas e propagadas de modo vegetativo para o uso comercial. Em plantações propagadas por sementes, as plantas transgênicas maduras podem ser autocruzadas para produzir uma planta endocruzada homozigota. A planta endocruzada produz semente que contém o ácido nucleico heterólogo recentemente introduzido. Essas sementes podem ser cultivadas para produzir plantas que produziriam o fenótipo selecionado.

[0145] As partes obtidas a partir da planta regenerada, como flores, sementes, folhas, ramificações, frutas e similares, estão incluídos na invenção, desde que essas partes compreendam células que compreendam a sequência que confere uma resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, qualquer uma ou qualquer combinação dentre os SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5). A progênie e variantes, e mutantes das plantas regeneradas, também estão incluídos dentro do escopo da invenção, desde que essas partes compreendam as sequências de ácido nucleico introduzidas.

[0146] Em uma modalidade, uma planta transgênica homozigota pode ser obtida através de cópula sexual (autofecundação) de uma planta transgênica heterozigota que contém um único ácido nucleico heterólogo adicionado, germinando algumas das sementes produzidas e analisando as plantas resultantes produzidas para divisão celular alterada em relação a uma planta de controle (isto é, não transgênica, nativa). O retrocruzamento com uma planta parental e o cruzamento com uma planta não-transgênica também é contemplado.

E. Métodos para aumentar a expressão e/ou a concentração de pelo menos uma sequência que confere resistência acentuada a nematoides de cisto em uma planta ou parte de planta

[0147] Um método para aumentar a atividade e/ou concentração de pelo menos uma sequência que confere uma resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma variante ativa ou fragmento da mesma) em uma planta, célula de planta, parte de planta, explante e/ou semente é fornecido. Em modalidades adicionais, a concentração/nível da pelo menos uma sequência que confere resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma variante ativa ou fragmento da mesma) é aumentada na planta ou parte de planta em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 500%, 1.000%, 5.000% ou 10.000% em relação a uma planta, parte de planta ou célula de controle apropriada que não tinha a sequência. Em ainda outras modalidades, o nível da pelo menos uma sequência que confere resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma variante ativa ou fragmento da mesma) na planta ou parte de planta é aumentada em 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 vezes ou mais em relação a uma planta, parte de planta ou célula de controle apropriada que não tinha a sequência. Tal aumento no nível da pelo menos uma sequência que confere resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma variante ativa ou fragmento da mesma) pode ser alcançada de várias maneiras, incluindo, por exemplo, pela expressão de multiplas cópias de uma ou mais dentre pelo menos uma sequência que confere resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma variante ativa ou fragmento da mesma) e/ou empregando-se um promotor para acionar níveis mais altos de expressão de uma ou mais das sequências.

[0148] Em modalidades específicas, pelo menos um polinucleotídeo que confere resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma variante ativa ou fragmento da mesma ou qualquer combinação das mesmas) é introduzido na planta, célula de planta, explante ou parte de planta. Subsequentemente, uma célula de planta ou planta que tem a sequência introduzida é selecionada com o uso de métodos conhecidos aos versados na técnica, como, mas não se limitando a, análise por Southern blot, sequenciamento de DNA, análise por PCR ou análise fenotípica. A planta ou parte de planta alterada ou modificada pelas modalidades anteriormente mencionadas é desenvolvida sob condições de formação de planta por um tempo suficiente para modular a concentração e/ou atividade de pelo menos uma sequência que confere resistência acentuada a nematoides de cisto (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma variante ativa ou fragmento da mesma) na planta.

VI. Comparações de sequências

[0149] Os seguintes termos são usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos: “sequência de referência”, “janela de comparação”, “identidade de sequência” e “percentual de identidade de sequência.”

[0150] Para uso na presente invenção, “sequência de referência” é uma sequência definida usada como uma base para a comparação de sequências. Um sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, como um segmento de uma sequência gênica ou de cDNA de comprimento total ou a sequência gênica ou de cDNA ou a sequência proteica.

[0151] Para uso na presente invenção, “janela de comparação” faz referência a um segmento contíguo e específico de uma sequência de polipeptídeo, sendo que a sequência de polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções, (isto é, lacunas) em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para um alinhamento ótimo dos dois polipeptídeos. Em geral, a janela de comparação tem pelo menos 5, 10, 15 ou 20 aminoácidos contíguos de comprimento ou ela pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais. Os versados na técnica compreendem que para evitar uma alta similaridade a uma sequência de referência devido à inclusão de lacunas na sequência de polipeptídeos, uma penalidade por lacuna é tipicamente introduzida e é subtraída do número de igualdades.

[0152] Os métodos para alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Desta forma, a determinação do percentual de identidade de sequência entre quaisquer duas sequências pode ser feito com o uso de um algoritmo matemático. Alguns exemplos não limitadores destes algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller, (1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 a 453; o método de alinhamento “procura por local” de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 a 2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modificado conforme em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 a 5877.

[0153] Implantações computacionais desses algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação entre sequências para determinar a identidade de sequência. Tais implementações incluem, mas não se limitam a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível junto à Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA); o programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Genetics Software Package de GCG Wisconsin, Versão 10 (disponível junto à Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, EUA). Alinhamentos usando estes programas podem ser feitos com os parâmetros padrão. O programa CLUSTAL é adequadamente descrito em Higgins et al. (1988) Gene 73:237 a 244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 a 153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10.881 a 10.890; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 a 331. O programa ALIGN tem por base o algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade por comprimento de lacuna de 12, e uma penalidade por lacuna de 4 podem ser usadas com o programa ALIGN ao comparar sequências de aminoácido. Os programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra As buscas de nucleotídeo por BLAST podem ser feitas com o programa BLASTN, pontuação = 100, tamanho de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeo homólogas a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína da invenção. As buscas de proteína por BLAST podem ser feitas com o programa BLASTX, pontuação = 50, tamanho de palavra = 3, para obter sequências de aminoácido homólogas a uma proteína ou polipeptídeo da invenção. Buscas de proteína BLASTP podem ser realizadas usando os parâmetros padrão. Consulte blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

[0154] Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST (no BLAST 2.0) pode ser usado, conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para executar uma busca repetida que detecta relações distantes entre moléculas. Consulte, Altschul et al. (1997) supra. Quando se usa os programas BLAST, Gapped BLAST ou PSI- BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeos, BLASTP para proteínas) podem ser usados. Consulte www.ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento também pode ser feito manualmente por inspeção.

[0155] Exceto onde especificado em contrário, os valores de identidade/similaridade de sequência fornecidos no presente documento referem-se ao valor obtido com o uso GAP versão 10 com o uso dos seguintes parâmetros: porcentagem de identidade e porcentagem de similaridade para uma sequência de nucleotídeos usando Peso GAP de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; porcentagem de identidade e porcentagem de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando Peso GAP de 8 e Peso de comprimento de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente ao mesmo. O termo “programa equivalente” refere-se a qualquer programa para comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem pareamentos de resíduos de nucleotídeo ou aminoácido idênticos e um percentual de identidade de sequência idêntico em comparação ao alinhamento correspondente gerado pelo programa GAP Version 10.

[0156] O GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 a 453: para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de igualdades e minimiza o número de lacunas. O programa GAP considera todos os alinhamentos e posições de lacuna possíveis e cria o alinhamento com o maior número de bases pareadas e o menor número de lacunas. Ele permite que se forneça uma penalidade por criação de lacuna e uma penalidade por extensão da lacuna em unidades de bases pareadas. O programa GAP deve obter vantagem pelo número de penalidades por criação de lacuna dos pareamentos para cada lacuna que ele insere. Se uma penalidade por extensão da lacuna maior que zero para escolhida, o GAP deve ainda obter uma vantagem para cada lacuna inserida com o comprimento da lacuna vezes a penalidade por extensão da lacuna. Os valores padrão de penalidade por criação de lacuna e os valores de penalidade por extensão da lacuna na versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package para sequências de proteína são 8 e 2, respectivamente. Para sequências de nucleotídeo, a penalidade por criação de lacuna padrão é de 50 e a penalidade por extensão da lacuna padrão é de 3. As penalidades por criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser expressas como um número inteiro selecionado a partir do grupo de números inteiros que consiste em 0 a 200. Desta forma, por exemplo, as penalidades por criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou mais.

[0157] O programa GAP apresenta um membro da família dos melhores alinhamentos. Pode haver muitos membros desta família, mas nenhum outro membro tem uma qualidade melhor. GAP exibe quatro coeficientes de mérito para alinhamentos: Qualidade, Razão, Identidade e Similaridade. A qualidade é a métrica maximizada de modo a alinhar as sequências. A razão é a qualidade dividida pelo número de bases no segmento mais curto. O percentual de identidade é o percentual dos símbolos que de fato pareiam. O percentual de similaridade é o percentual dos símbolos que são similares. Os símbolos que estão através das lacunas são ignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é maior que ou igual a 0,50, o limiar de similaridade. A matriz de pontuação usada na versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62 consulte Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

[0158] Para uso na presente invenção, “identidade de sequência” ou “identidade”, no contexto de dois polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeo, faz referência aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para máxima correspondência com uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada com relação a proteínas, reconhece-se que posições de resíduo que não são idênticas frequentemente diferem em substituições de aminoácido conservativas, quando os resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou capacidade hidrofóbica). Quando as sequências diferem em substituições conservativas, o percentual de identidade de sequência pode ser ajustado para cima para compensar a natureza conservativa da substituição. Diz-se que as sequências que diferem em tais substituições conservativas são têm “similaridade de sequência” ou “similaridade”. Os meios para fazer esse ajuste são bem conhecidas aos versados na técnica. Isto envolve tipicamente pontuar uma substituição conservativa como um pareamento parcial ao invés de total, assim aumentando a porcentagem de identidade de sequência. Desta forma, por exemplo, quando uma pontuação de 1 é dada a um aminoácido idêntico e uma pontuação zero é dada a uma substituição não- conservativa, uma pontuação entre zero e 1 será dada a uma substituição conservativa. A pontuação das substituições conservativas é calculada, por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA).

[0159] Para uso na presente invenção, “porcentagem de identidade de sequência” significa o valor determinado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas em uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas), em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais a base de ácido nucleico ou o resíduo de aminoácido idênticos ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições igualadas, dividindo-se o número de posições igualadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.

[0160] Duas sequências estão “idealmente alinhadas” quando elas estão alinhadas para a pontuação de similaridade com o uso de uma matriz de substituição de aminoácido (por exemplo, BLOSUM62), penalidade por existência de lacuna e penalidade por extensão de lacuna definidos, de modo a atingir a pontuação mais alta possível para aquele par de sequências. As matrizes de substituição de aminoácidos e seus usos na quantificação da similaridade entre duas sequências são bem conhecidas na técnica e estão descritas, por exemplo, em Dayhoff et al. (1978) ”A model of evolutionary change in proteins”. Em “Atlas of Protein Sequence and Structure,” Volume 5, Suppl. 3 (ed. M.O. Dayhoff), pp. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC e Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919. A matriz BLOSUM62 (Figura10) é usada com frequência como uma matriz de substituição de pontuação padrão em protocolos de alinhamento de sequências, como Gapped BLAST 2.0. A penalidade por existência de lacuna é imposta para a introdução de uma única lacuna de aminoácido em uma das sequências alinhadas, e a penalidade por extensão de lacuna é imposta para cada posição de aminoácido vazia adicional inserida em uma lacuna já aberta. A penalidade por existência de lacuna é imposta para a introdução de uma única lacuna de aminoácido em uma das sequências alinhadas, e a penalidade por extensão de lacuna é imposta para cada posição de aminoácido vazia adicional inserida em uma lacuna já aberta. O alinhamento é definido pelas posições de aminoácidos de cada sequência na qual o alinhamento começa e termina, e opcionalmente pela inserção de uma lacuna ou de múltiplas lacunas em uma ou em ambas as sequências, de modo a atingir a maior pontuação possível. Embora o alinhamento e a pontuação ideal possam ser conseguidos manualmente, o processo é facilitado pelo uso de um algoritmo de alinhamento implementado por computador, por exemplo, gapped BLAST 2.0, descrito em Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3.389 a 3.402, e disponibilizado ao público no Sítio do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Alinhamentos ideais, incluindo múltiplos alinhamentos, podem ser preparados usando, por exemplo, PSI-BLAST, disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov e descritos por Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3.389 a 3.402.

[0161] Modalidades não limitadoras incluem:

[0162] 1. Um método de identificar uma primeira planta do feijão soja ou um primeiro germoplasma do feijão soja com resistência acentuada ao nematoide de cisto, caracterizado pelo fato de que compreende detectar no genoma da dita primeira planta do feijão soja ou no genoma do dito primeiro germoplasma do feijão soja pelo menos um alelo marcador associado à duplicação de uma região dentro do locus rhg1.

[0163] 2. O método da modalidade 1 em que a duplicação da região dentro do locus rhg1 compreende uma duplicação em consecutividade do genoma do feijão soja entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228.

[0164] 3. O método da modalidade 1 em que que a duplicação da região dentro do locus rhg1 compreende a região conforme apresentado em pelo menos um dentre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0165] 4. O método da modalidade 1 em que o alelo marcador compreende pelo menos um polimorfismo apresentado na Tabela 1 ou na Tabela 2.

[0166] 5. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 4 em que o método compreende adicionalmente selecionar a primeira planta do feijão soja ou o primeiro germoplasma do feijão soja ou uma progênie dos mesmos que tem o pelo menos um alelo marcador.

[0167] 6. O método da modalidade 5 que compreende adicionalmente cruzar a primeira planta do feijão soja selecionada com uma segunda planta do feijão soja.

[0168] 7. Um método para identificar uma primeira planta do feijão soja ou um primeiro germoplasma do feijão soja com resistência acentuada ao nematoide de cisto que compreende detectar, no genoma da primeira dita planta do feijão soja ou do primeiro dito germoplasma do feijão soja, uma duplicação de uma região dentro do locus rhg1.

[0169] 8. O método da modalidade 7 em que a duplicação da região dentro do locus rhg1 compreende uma duplicação em consecutividade da região do genoma do feijão soja entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228.

[0170] 9. O método da modalidade 7 em que a duplicação da região dentro do locus rhg1 compreende a região conforme apresentado em pelo menos uma dentre a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0171] 10. O método da modalidade 7 em que a duplicação da região dentro do locus rhg1 compreende cada uma das regiões conforme apresentado na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 e 5.

[0172] 11. O método da modalidade 7, 8, 9 ou 10, em que a dita deteção compreende um PCR quantitativo ou outra técnica quantitativa.

[0173] 12. O método de qualquer uma das modalidades 7 a 11 em que o método compreende adicionalmente selecionar a primeira planta do feijão soja, o primeiro germoplasma do feijão soja ou uma progênie dos mesmos que tem a duplicação na região do locus rhg1.

[0174] 13. O método da modalidade 12 que compreende adicionalmente cruzar a primeira planta do feijão soja selecionada com uma segunda planta do feijão soja.

[0175] 14. Um método de identificar uma primeira planta do feijão soja ou um primeiro germoplasma do feijão soja com resistência acentuada ao nematoide de cisto que compreende detectar, na dita primeira planta do feijão soja ou no primeiro dito germoplasma do feijão soja, uma quantidade de cópias aumentada de pelo menos um dentre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma variante ativa ou fragmento da mesma.

[0176] 15. O método da modalidade 14 em que o dito método compreende detectar uma quantidade de cópias aumentada de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 e 5 ou uma variante ativa ou fragmento das mesmas.

[0177] 16. O método de qualquer uma das modalidades 14 a 15, em que o método compreende adicionalmente selecionar a primeira planta do feijão soja, o primeiro germoplasma do feijão soja ou uma progênie dos mesmos que tem a quantidade de cópias aumentada de pelo menos um dentre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0178] 17. O método da modalidade 16 que compreende adicionalmente cruzar a primeira planta do feijão soja selecionada com uma segunda planta do feijão soja.

[0179] 18. Um método para identificar uma primeira planta do feijão soja ou um primeiro germoplasma do feijão soja com resistência acentuada ao nematoide de cisto que compreende detectar, no genoma da primeira dita planta do feijão soja ou do primeiro dito germoplasma do feijão soja, a junção de DNA formada no ponto de divisão de uma região duplicada dentro do locus rhg1.

[0180] 19. O método da modalidade 18 em que a região duplicada dentro do locus rhg1 compreende uma duplicação em consecutividade da região do genoma do feijão soja entre aproximadamente a posição GM18:1663448 e aproximadamente a posição GM18:1632228.

[0181] 20. O método da modalidade 18 em que a junção de DNA compreende a sequência apresentada em qualquer um dentre SEQ ID NOS: 6, 7, 8 ou 9 ou um fragmento das mesmas.

[0182] 21. O método da modalidade 18 em que detectar a junção de DNA inovadora compreende uma amplificação por PCR de uma junção de DNA formada no ponto de divisão da região duplicada dentro do locus rhg1.

[0183] 22. O método da modalidade 21 em que a dita amplificação por PCR emprega o par de iniciadores apresentado na SEQ ID NO: 14 e 15.

[0184] 23. O método da modalidade 18 em que detectar uma junção de DNA compreende o sequenciamento de DNA.

[0185] 24. O método de qualquer uma das modalidades 18 a 23 em que o método compreende adicionalmente selecionar a primeira planta do feijão soja, o primeiro germoplasma do feijão soja ou uma progênie dos mesmos que tem uma junção de DNA formada no ponto de divisão da região duplicada dentro do locus rhg1.

[0186] 25. O método da modalidade 24 que compreende adicionalmente cruzar a primeira planta do feijão soja selecionada com uma segunda planta do feijão soja.

[0187] 26. Uma planta ou célula de planta que compreende um polinucleotídeo heterólogo ligado de maneira funcional a um promotor ativo na planta ou célula de planta, em que o dito polinucleotídeo heterólogo compreende:

[0188] a) a sequência de nucleotídeo conforme apresentado em qualquer um dentre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou qualquer combinação das mesmas; ou

[0189] b) a sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer um dentre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou qualquer combinação das mesmas; sendo que a expressão do dito polinucleotídeo heterólogo acentuar a resistência das ditas plantas ao nematoide de cisto.

[0190] 27. A planta ou célula de planta de modalidade 26 em que a dita planta ou célula de planta é a partir de uma monocotiledónea.

[0191] 28. A planta ou célula de planta de modalidade 27 em que a dita monocotiledónea é milho, trigo, arroz, cevada, cana de açúcar, sorgo ou centeio.

[0192] 29. A planta ou célula de planta de modalidade 26 em que a dita planta ou célula de planta é a partir de uma dicotiledónea.

[0193] 30. A planta ou célula de planta de modalidade 29 em que a dicotiledónea é Brassica, girassol, algodão ou alfalfa.

[0194] 31. A planta ou célula de planta de modalidade 29 em que a dicotiledónea é o feijão soja.

[0195] 32. Uma semente transgênica a partir da planta, de qualquer uma das reivindicações dentre 26 a 31, em que a dita semente transgênica compreender o polinucleotídeo heterólogo.

[0196] 33. Um método para acentuar uma resistência ao nematoide de cisto em uma planta que compreende introduzir, dentro de uma célula de planta, um polinucleotídeo heterólogo ligado de maneira funcional a um promotor ativo na planta, em que o dito polinucleotídeo heterólogo compreende:

[0197] a) uma sequência de nucleotídeo conforme apresentado em qualquer um dentre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou qualquer combinação das mesmas; ou

[0198] b) uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer um dentre SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou qualquer combinação das mesmas;

[0199] sendo que a expressão do dito polinucleotídeo heterólogo acentuar a resistência das ditas plantas ao nematoide de cisto.

[0200] 34. O método da modalidade 33 em que a dita planta é uma monoticodiledónea.

[0201] 35. O método da modalidade 34 em que a dita monoticodiledónea é milho, trigo, arroz, cevada, cana de açúcar, sorgo ou centeio.

[0202] 36. O método da modalidade 33 em que a dita planta é uma diticotiledónea.

[0203] 37. O método da modalidade 36 em que a diticotiledónea é Brassica, girassol, algodão ou alfalfa.

[0204] 38. O método da modalidade 36 em que a diticotiledónea é o feijão soja.

Experimental

[0205] O seguinte exemplo é oferecido para ilustrar, mas não para limitar, a invenção reivindicada. Entende-se que os exemplos e as modalidades aqui descritos são para propósitos ilustrativos apenas e as pessoas versadas na técnica reconhecerão vários reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem se afastar do espírito da invenção ou do escopo das reivindicações em anexo.

Exemplo 1

[0206] Observou-se um padrão previamente não explicado de heterozigosidade herdada no locus rhg1 dentro de linhar que postam o alelo rhg1-b derivado de PI88788. Vários variantes SNP dentro da região mapeada detalhadamente do locus de rhg1-b são heterozigosos no decorrer das linhas resistentes derivadas de PI88788 (Figura 1). Essa observação levou à hipotetização de que a duplicação em consecutividade e a subsequente degeneração da sequência paráloga poderiam ser responsáveis pela heterozigosidade observada nesse locus.

[0207] A fim de investigar a contagem de cópia paráloga, analizou-se os dados de ressequenciamento profundo de Peking, PI88788 e Lincoln. A visualização da cobertura de sequenciamento no locus rhg1 sugeriu um aumento substancial na quantidade de cópias para Peking e PI88788 em relação ao Lincoln consistente com a duplicação de sequências de nucleotídeos dentro desse locus (Figura 2). Ademais, as leituras de sequenciamento de extremidades pareadas nos extremos externos da região duplicada exibiu alinhamentos discordantes consistentes com a duplicação em consecutividade no locus. Considerados conjuntamente, esses resultados sugerem a duplicação em consecutividade de sequências de nucleotídeos dentro do locus rhg1.

[0208] A comparação quantitativa da profundidade de sequenciamento dentro, em profundidade, e adjacente à duplicação putativa, foi efetivada normalizando-se a cobertura PI88788 e Peking com Lincoln em uma janela em movimento no decorrer do locus Rhg1. Consistente com a visualização, a análise de quantidade de cópias indicou um aumento de 3 vezes e 9 vezes em Peking e PI88788, respectivamente, em relação ao Lincoln dentro da duplicação em consecutividade mas não nas regiões imediatamente adjacentes (Figura 3). Esses resultados sugerem que rhg1 e rhg1-b representam dois alelos distintos de variação de cópias de uma variante estrutural idêntica consistente com diferentes níveis de resistência fenotípica.

[0209] Para validar a quantidade de cópias observada, projetou-se ensaios qPCR contra as regiões de cópia única e de cópias variáveis do locus rhg1. Os resultados desses ensaios são consistentes com dados de sequenciamento que sugerem um aumento de aproximadamente 4 vezes e 9 vezes na quantidade de cópias em Peking e PI88788, respectivamente, em relação a linhas suscetíveis (Figura 4).

[0210] A fim de definir mais precisamente os pontos de divisão da duplicação, leituras de sequenciamento de extremidades pareadas com alinhamentos discordantes nos limiares do evento foram montadas, a partir das quais um conjunto de sequências de 158 bp foi recuperado. O alinhamento desse conjunto de sequências à referência é consistente com o evento de duplicação em consecutividade com pontos de divisão em Gm18:1632228 (Figura 5). De interesse, há uma micromologia de 3- bp compartilhada entre os pontos de divisão. Para avaliar a validade dos pontos de divisão putativos, uma série de iniciadores PCR foram projetados para amplificar os fragmentos no decorrer de uma junção da duplicação em consecutividade.

[0211] As linhas suscetíveis, mas não os genótipos suscetíveis, derivados da amplificação de produtos de PCR no decorrer dos pontos de divisão em Peking e PI88788, são consistentes com a duplicação descrita em consecutividade (Figura 6). Ademais, o tamanho de amplificações é consistente com as expectativas, dadas as posições físicas do9s pontos de divisão putativos. A fim de validar os produtos de PCR alvo, de fato, observados nessas linhas, efetivou-se o sequenciamento Sanger para amplicos de Peking e PI88788 (Figura 7).

[0212] Tomados juntos, os resultados concordantes fornecem evidências de que o locus rhg1 de Peking e PI88788 porta uma duplicação em consecutividade idêntica com dois alelos distintos de variação de cópias. O aumento observado na quantidade de cópias de Peking a PI88788 pode ser explicado pela recombinação homóloga entre as cópias parálogas e o cruzamento desigual. Presumindo-se que a pressão seletiva positiva age na expansão da contagem de cópias no locus Rhg1, segue-se que essa duplicação em consecutividade pode portar um gene ou genes dos quais a dosagem contribui favoravelmente ao fenótipo de resistência ao SCN que foi mapeado detalhadamente para essa região.

[0213] Essa região contém quatro genes que são completamente duplicados: Glyma18g2580, Glyma18g2590, Glyma18g2600, Glyma18g2610; e um gene que é parcialmente duplicado: Glyma18g2570. Evidências anedóticas de impacto confirmam o envolvimento de um ou mais desses genes na resistência ao SCN: As sequências codificantes de dois genes (Glyma18g2600 e Glyma18g2610) não são afetadas pelo polimorfismo nas duas fontes. De interesse, prevê-se que o Glyma18g2600 é a uma proteína de andaime mediadora de sinais e anotada como um ‘gene relacionado à defesa por previsão’.

[0214] Um subproduto útil de nossa análise tem sido o desenvolvimento de um ensaio de qPCR que pode ser usado para triar materiais candidatos adicionais. Esse ensaios seria útil para identificar ou o(s) alelo(s) de variação de cópias o rhg1 e rhg1-b descritos ou os alelos adicionais que não foram descritos.

Materiais e métodos Sequenciamento shotgun de genoma completo

[0215] Prepararam-se bibliotecas de sequenciamento shotgun de genoma completo para Peking, PI88788 e Lincoln pelo Mary Beatty Lab de acordo com protocolos-padrão de sequenciamento. As bibliotecas foram sequenciadas no instrumento Illumina HiSeq a uma profundidade média de cobertura de sequenciamento de 17x. Alinharam-se leituras sequenciadas ao Conjunto Genômico do Feijão Soja Glyma 1.01 (JGI) por bowtie2 e geraram-se arquivos comprimidos de alinhamento/mapa por SAMtools.

Conjunto de ponto de divisão a partir de leituras de sequenciamento

[0216] As leituras de sequenciamento de extremidades pareadas que se alinharam aos limiares da duplicação putativa foram extraídos do arquivo BAM por SAMtools e montados com o uso. Os conjuntos de sequência resultantes foram comparados por Blast ao o Conjunto Genômico do Feijão Soja Glyma1.01 (JGI) através da página da Pioneer de Apresentação e Recuperação de BLAST com as configurações Expect=0,01.

Análise de quantidade de cópias

[0217] A análise de quantidade de cópias foi efetivada calculando-se a cobertura de sequenciamento em uma janela em movimento no decorrer da região mapeada detalhadamente de rhg1. As janelas de cobertura dentro de cada amostra foram normalizadas à profundidade mediana de sequenciamento e então comparadas como uma razão de fontes resistentes a suscetíveis (Taxa de cobertura normalizada). Essa taxa aproxima a diferença em vezes entre as duas linhas sendo comparadas.

Ensaios de qPCR

[0218] Os iniciadores PCR tiveram seu design feito contra as regiões de cópia única e cópias variáveis do locus mapeado detalhadamente de rhg1, sendo que seis pares de iniciadores de variação de cópias e seis de cópia única renderam informações úteis. As duas fontes de resistência de Peking (Peking e 91Y90) e PI88788 (PI88788 e 93Y13) as três linhas suscetíveis (Lincoln, Dunfield e CNS) foram examinadas em quatro réplicas para todos os pares de iniciadores. O qPCR foi completado com o uso do ensaio SYBR-Green. As réplicas foram ponderadas e uma análise ΔΔCt foi efetivada com relação a pares e ponderadas entre cada combinações de cópias variáveis e cópia única. A distribuição desses resultados foi plotada para cada comparação a respeito de pares entre Peking, PI88788 e suscetível.

[0219] Os resultados confirmaram que a porção duplicada do genoma é de fato duplicada. Exemplo 2. Condições para amplificação de PCR de sequências de ponto de divisão 94 C/4 min 35 Ciclos: 94 C/30 s 60 C/45 s 72 C/2 min

[0220] Estágio de Dissociação Opcional: 72 C/5 min

[0221] Os iniciadores foram projetados com o uso de Primer3 (biocomplx.phibred.com/hu/primer3.html) e verificados a respeito da unicidade com o uso de GPS (bioprodlx.phibred.com/Primer_search/cgi- bin/primer_hit_form.cgi).

[0222] Faixa de Tamanho de Produto: 550 a 650 bps

[0223] Configurações Padrão

[0224] Condições para ensaios de cópias de qPCR 95 C/5 min 40 Ciclos: 95 C/20 s 60 C/45 s

[0225] Estágio de Dissociação Opcional:

[0226] 95 C/15 s

[0227] 60 C/20 s

[0228] 95 C/15 s

[0229] Os iniciadores foram projetados com o uso de Primer3 (biocomplx.phibred.com/hu/primer3.html) e verificados a respeito de unicidade com o uso de GPS (bioprodlx.phibred.com/Primer_search/cgi- bin/primer_hit_form.cgi).

[0230] Faixa de Tamanho de Produto: 50-200 bps

[0231] Tamanho de iniciador: 18-24 opt 20

[0232] Tm: 59-62°C (pares de iniciador dentro de 1°C uns dos outros)

[0233] Configurações Padrão

Protocolo de extração de DNA nuclear

[0234] Adaptado de Meizhong Luo e Rod Wing. Um método melhorado para a construção de biblioteca de BAC de planta. Methods in Molecular Biology, vol. 236: Plant Functional Genomics: Methods and Protocols

[0235] Materiais por extração: 5 - Folhas Miracloth 6”x6” 3 — Tubos de 50 ml 1 - funil Agitador orbital Soluções: Tampão de isolamento nuclear 2X (NIB) (2 L) Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0 (40 ml) EDTA a 20 mM, pH 8,0 (80 ml) KCl a 200 mM (29,82 g) Sacarose a 1 M (684,6 g) Espermidina a 8 mM (4,1 g) Espermina a 2 mM (1,4 g) Esterilização por filtragem. Armazenamento a 4°C

[0236] Observação: Diluir com água estéril para preparar NIB, NIBT e NIBM 1X NIBT 1X: NIB 1X com Triton X-100 a 10% (fazer 3 ml por extração) NIBM 1X: NIB 1X com β-mercaptoethanol a 0,1% (fazer 65 ml por extração)

[0237] Protocolo:

[0238] 1. Triturar 1,5 g de tecido liofilizado em agitador de pintura

[0239] 2. Transferir o tecido triturado em um tubo de 50 ml contendo 45 ml de NIBM gelado

[0240] 3. Manter tubo em gelo por 15 min, enquanto agita-se gentilmente no agitador orbital

[0241] 4. Filtrar o homogenato através de 3 camadas de Miracloth em um tubo limpo de 50 ml. Espremer o pékete para possibilitar a máxima recuperação da solução que contém núcleos. Usar 10 ml de NIBM adicionais para lavar o pélete e espremer novamente.

[0242] 5. Filtrar a solução que contém núcleos através de 2 camadas adicionais de Miracloth em um tubo limpo de 50 ml.

[0243] 6. Adicionar 1:20 de NIBT (2,75 ml) à solução que contém núcleos e manter o tubo no gelo por 15 min, enquanto agita-se gentilmente no agitador orbital

[0244] 7. Centrifugar os tubos a 4000 rpm a 4°C por 20 min

[0245] 8. Decantar o sobrenadante e adicionar 5 ml de NIBM ao primeiro tubo. Ressuspender através de vórtice.

[0246] 9. Centrifugar a mistura a 4000 rpm a 4°C por 15 min

[0247] 10. Decantar o sobrenadante e proceder à Extração Ureia

[0248] 11. Adicionar 5 ml de Tampão Ureia a 7M - Ressuspender

[0249] 12. Adicional 10 ul de RNAse - Incubar a 37°C por 30 min

[0250] 13. Adicionar 5 ml de Clorofórmio-Fenol-Octanol a 25:24:1 - Rock por 10 min - Centrifugar por 20 min a 4.000 rpm

[0251] 14. Transferir o sobrenadante, adicionar 450 ul de NaOAc e 5 ml de Isopropanol ao novo tubo

[0252] 15. Girar por 15 min a 4000 rpm. Decantar o sobrenadante. Limpar com etanol a 70%.

[0253] 16. Resuspender em 500 ul de Tris a 10 mM.

Exemplo 3.

[0254] A Tabela 1 fornece uma lista de sítios polimórficos encontrados dentro do locus rhg1. A posição cromossomial é indicada nas primeiras duas colunas. “Ref” indica o nucleotídeo que ocorre na amostra de referência do feijão soja, e “ALT” indica o nucleotídeo encontrado nas linhas de resistência acentuada a SCN do feijão soja. A presença da alteração de nucleotídeo nas linhas Peking e P188788 é indicada nas duas últimas colunas. A Tabela 2 fornece uma lista de sítios polimórficos encontrados dentro das regiões de codificação do locus rhg1, especificamente polimorfismos em Glyma18g2580 (SEQ ID NO: 3), Glyma18g2590 (SEQ ID NO: 2), Glyma18g2600 (SEQ ID NO:4), Glyma18g2610 (SEQ ID NO:5); e Glyma18g2570 (SEQ ID NO:1) são fornecidos. Dessa forma, qualquer um marcador ou qualquer combinação de polimorfismos apresentados nas Tabelas 1 e 2 pode ser usado para auxiliar na identificação e seleção de plantas de feijão soja com resistência acentuada ao SCN. Tabela 1

Tabela 2

Tabela 3. Sumário das SEQ ID NOS

[0255] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível dos versados na técnica à qual pertence a invenção. Todas as publicações e pedidos de patentes estão aqui incorporados, a título de referência, na mesma extensão, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

[0256] Embora a invenção anteriormente mencionada tenha sido descrita em detalhes consideráveis por meio de ilustração e exemplos para os propósitos de clareza de entendimento, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (11)

1. Método de identificação de uma planta de soja ou um germoplasma de soja com resistência acentuada a nematoide de cisto, CARACTERIZADO por compreender: (i) detectar, usando PCR quantitativo ou outra técnica quantitativa, no genoma da dita planta de soja ou no genoma do dito germoplasma de soja: (a) uma duplicação em consecutividade de uma região do locus rhg1 compreendendo uma sequência de nucleotídeos amplificada pelos iniciadores apresentados nas SEQ ID NO: 10, 11, 12 e 13; (b) um aumento no número de cópias de pelo menos uma dentre as SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5, em que o número de cópias é aumentado por 2 ou mais cópias; (c) uma junção de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos amplificada pelo par de iniciadores compreendendo as SEQ ID NO: 14 e 15; ou (d) uma sequência de ponto de divisão compreendendo a SEQ ID NO: 23 ou 24 dentro de uma sequência de nucleotídeos amplificada pelo par de iniciadores compreendendo as SEQ ID NO: 14 e 15; (ii) identificar a planta de soja ou o germoplasma de soja tendo a duplicação, número aumentado de cópias ou junção de DNA como uma planta de soja ou germoplasma de soja tendo resistência acentuada a nematoide de cisto.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a duplicação em consecutividade é uma duplicação em consecutividade do genoma de soja entre, aproximadamente, a posição GM18:1663448, e, aproximadamente a posição GM18:1632228.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a duplicação em consecutividade da região no locus rhg1 compreende a região conforme apresentada em pelo menos uma dentre as SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a duplicação em consecutividade da região no locus rhg1 compreende cada uma das regiões conforme apresentadas nas SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, e 5.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o método é CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente selecionar a planta de soja, o germoplasma de soja ou uma progênie dos mesmos, tendo a duplicação na região do locus rhg1.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de compreender detectar um aumento no número de cópias das SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 e 5.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o método é CARACTERIZADO por compreender adicionalmente selecionar a planta de soja, o germoplasma de soja, ou uma progênie dos mesmos tendo o número de cópias aumentado de pelo menos uma dentre a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que detectar a junção de DNA compreende amplificação por PCR da junção de DNA formada no ponto de divisão da região duplicada no locus rhg1.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a detecção da junção de DNA compreende o sequenciamento de DNA.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a detecção da sequência de ponto de divisão compreende o sequenciamento de DNA.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a detecção da sequência de ponto de divisão compreende amplificação por PCR.

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