BR112020024837A2 - métodos de identificação, seleção e produção de safras resistentes à ferrugem polissora - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO, SELEÇÃO E PRODUÇÃO DE SAFRAS RESISTENTES À FERRUGEM POLISSORA. O campo é relacionado à reprodução de planta e métodos para identificar e selecionar plantas com resistência à ferrugem polissora. São fornecidos métodos para identificar genes inovadores que codificam proteínas proporcionando resistência de plantas à ferrugem polissora e usos dos mesmos. Estes genes resistentes a doenças são úteis na produção de plantas resistentes através de melhoramento, modificação transgênica, ou edição do genoma.

Description

MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO, SELEÇÃO E PRODUÇÃO DE SAFRAS RESISTENTES À FERRUGEM POLISSORA REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCISS APRESENTADA ELETRONICAMENTE

[0001] Uma listagem de sequências que tem o nome de arquivo "RTS22658 SeqList.txt", criada em 30 de abril de 2019 e que tem um tamanho de 91 quilobytes é depositada na forma legível por computador concomitantemente com o relatório descritivo. A listagem de sequências faz parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0002] Este pedido reivindica a prioridade para o Pedido de Patente Internacional sob nº PCT/CN2018/090067 depositado em 6 de junho de 2018.

CAMPO

[0003] O campo é relacionado à reprodução de planta e métodos para identificar e selecionar plantas com resistência à ferrugem polissora. São fornecidos métodos para identificar novos genes que codificam proteínas proporcionando resistência de plantas à ferrugem polissora e usos dos mesmos. Estes genes resistentes a doenças são úteis na produção de plantas resistentes através de melhoramento, modificação transgênica, ou edição do genoma.

ANTECEDENTES

[0004] A ferrugem polissora (SCR), uma doença fúngica causada por Puccinia polysora Underw , é uma doença importante nas regiões tropicais e no sul dos Estados Unidos e da China. Se a SCR atingir as regiões temperadas (por exemplo, meio-oeste dos EUA) em pontos críticos da estação de cultivo e se as condições forem favoráveis para o desenvolvimento da ferrugem, a intensidade da doença pode atingir níveis epidêmicos muito rapidamente, resultando em graves perdas de rendimento.

O germoplasma de milho temperado é geralmente suscetível a SCR.

A identificação e utilização de linhas de resistência e QTL em programas de melhoramento para desenvolver resistências de variedades a SCR representam uma forma econômica no controle de SCR.

Alternativamente, variedades portadoras de genes responsáveis pela resistência a SCR podem ser desenvolvidas por tecnologias de edição de genoma ou transgênicas.

A identificação de QTL e genes de resistência aceleraria o desenvolvimento da resistência de produto a SCR.

As linhas de resistência (por exemplo, Brewbaker, J.L., et al. "General resistance in maize to southern rust (Puccinia polysora Underw.)." Crop science 51, no. 4 (2011): 1393 a 1409) ou QTL (por exemplo, Jines, M.

P., et al. "Mapping resistance to Southern rust in a tropical by temperate maize recombinant inbred topcross population." Theoretical and Applied Genetics 114, no. 4 (2007): 659 a 667. Zhang, Y., et al. "Mapping of southern corn rust-resistant genes in the W2D inbred line of maize (Zea mays L.)." Molecular breeding 25, no. 3 (2010): 433 a 439. Zhou CJ, et al. (2007) Characterization and fine mapping of RppQ, a resistance gene to southern corn rust in maize.

Mol Genet Genomics 278:723 a 728. Holland, J.

B., et al. "Inheritance of resistance to southern corn rust in tropical-by-corn-belt maize populations." Theoretical and Applied Genetics 96, no. 2

(1998) : 232 a 241.) foram identificados. Entretanto, nenhum dos genes causais responsáveis pela resistência a SCR foi identificado e caracterizado. Há uma necessidade contínua de plantas resistentes a doenças e métodos para encontrar genes resistentes a doenças.

SUMÁRIO

[0005] Composições e métodos úteis na identificação e seleção de genes de resistência a doenças de plantas, ou "genes R," são proporcionados aqui. As composições e métodos são úteis na seleção de plantas resistentes a doenças, criando plantas resistentes transgênicas, e/ou criando plantas com genoma editado resistentes. Plantas que têm resistência recém-conferida ou aprimorada a várias doenças de plantas em comparação com plantas de controle também são fornecidas no presente documento. Em algumas concretizaçõesconcretizações, as composições e métodos são úteis na seleção de plantas resistentes a doenças da ferrugem do sul do milho (SCR), criando plantas resistentes a SCR transgênicas e/ou criando plantas editadas de genoma resistentes a SCR.

[0006] Uma planta resistente a SCR pode ser cruzada com uma segunda planta para obter uma planta da progênie que tem o alelo do gene resistente. A resistência a doenças pode ser recém-conferida ou aprimorada em relação a uma planta de controle que não tem o alelo favorável. O alelo do gene R de SCR pode ser adicionalmente refinado para um intervalo cromossômico definido por e incluindo marcadores definidos. Em algumas concretizaçõesconcretizações, os métodos para identificar e/ou selecionar plantas que têm resistência a

SCR são apresentados.

Nesses método, DNA de uma planta é analisado pela presença de um alelo gênico resistente no cromossomo 10 que está associado à resistência de SCR, em que o dito alelo gênico resistente compreende: um "A" em SNPOO01 (posição 201 da sequência de referência SEQ ID NO: 6), um "A" em SNPOO02 (posição 127 da sequência de referência SEQ ID NO: 7), um "C" em SNPOO03 (posição 143 da sequência de referência SEQ ID NO: 8), um "G" em S26 (posição 43 da sequência de referência SEQ ID NO: 1), um "A" em S27 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 2), um "C" em S-24- 1 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S24-2 (posição 19 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "G" em S24-3 (posição 20 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S20-1 (posição 17 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-2 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-3 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "C" em S28-1 (posição 48 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-2 (posição 49 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "T" em S28-3 (posição 63 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "C" em S28-4 (posição 64 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-5 (posição 65 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-6 (posição 66 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "G" em SNPOO04 (posição 51 da sequência de referência SEQ ID NO: 9), um "A" em SNPOOS5S (posição 39 da sequência de referência SEQ ID NO: 10), e um "A" em SNPOO6 (posição 23 da sequência de referência SEQ ID NO: 11); e uma planta é identificada e/ou selecionada como tendo resistência a SCR se o dito alelo de gene resistente for detectado. Em algumas concretizaçõesconcretizações, os métodos para identificar e/ou selecionar plantas com resistência a SCR compreendem detectar ou selecionar uma região genômica que compreende SEQ ID NO: 12. A resistência a SCR pode ser recém-conferida ou aprimorada em relação a uma planta de controle que não tem o alelo favorável. Em uma concretização adicional, a região resistente a SCR compreende um gene que codifica um polipeptídeo de RppK que confere ou aumenta a resistência a SCR (o "gene RppK"). Em algumas concretizaçõesconcretizações, o polipeptídeo de RppK compreende a sequência de aminoácidos como apresentado no SEQ ID NO: 14.

[0007] Em outra modalidade, métodos para identificar e/ou selecionar plantas com resistência a SCR por antracnose são fornecidos, nos quais um ou mais alelos marcadores ligados a e associados a qualquer um dentre: um "A" em SNPOO01l (posição 201 da sequência de referência SEQ ID NO: 6), um "A" em SNPOO2 (posição 127 da sequência de referência SEQ ID NO: 7), um "C" em SNPOO03 (posição 143 da sequência de referência SEQ ID NO: 8), um "G" em S26 (posição 43 da sequência de referência SEQ ID NO: 1), um "A" em S27 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 2), um "C" em S-24- 1 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S24-2 (posição 19 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "G" em S24-3 (posição 20 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S20-1 (posição 17 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-2 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T"

em S20-3 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "C" em S28-1 (posição 48 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-2 (posição 49 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "T" em S28-3 (posição 63 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "C" em S28-4 (posição 64 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-5 (posição 65 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-6 (posição 66 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "G" em SNPOO04 (posição 51 da sequência de referência SEQ ID NO: 9), um "A" em SNPOOS5 (posição 39 da sequência de referência SEQ ID NO: 10), e um "A" em SNPOO6 (posição 23 da sequência de referência SEQ ID NO: 11), são detectados em uma planta, e uma planta com um ou mais alelos marcadores é selecionada.

O um ou mais alelos marcadores podem ser ligados por 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,9 cM, 0,8 cM, 0,7 cM, 0,6 cM, 0,5 cM, 0,4 cM, 0,3 cM, 0,2 cM, ou 0,1 cM ou menos em um mapa genético com base em meiose única.

A planta de selecionada pode ser cruzada com uma segunda planta para obter uma planta de progênie que tem um ou mais alelos marcadores ligados a e associados a qualquer um dentre: um "A" em SNPOOl (posição 201 da sequência de referência SEQ ID NO: 6), um "A" em SNPOO02 (posição 127 da sequência de referência SEQ ID NO: 7), um "C" em SNPO003 (posição 143 da sequência de referência SEQ ID NO: 8), um "G" em S26 (posição 43 da sequência de referência SEQ ID NO: 1), um "A" em S27 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 2), um "C" em S-24-1 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S24-2 (posição 19 da sequência de referência SEQ ID NO:

3), um "G" em S24-3 (posição 20 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S20-1 (posição 17 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-2 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-3 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "C" em S28-1 (posição 48 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-2 (posição 49 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "T" em S28-3 (posição 63 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "C" em S28-4 (posição 64 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-5 (posição 65 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-6 (posição 66 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "G" em SNPO04 (posição 51 da sequência de referência SEQ ID NO: 9), um "A" em SNPOOS (posição 39 da sequência de referência SEQ ID NO: 10), e um "A" em SNPOO06 (posição 23 da sequência de referência SEQ ID NO: 11).

[0008] Em outra modalidade, os métodos para introgressar um alelo de gene associado à resistência à SCR são apresentados no presente documento. Nestes métodos, uma população de plantas é testada com um ou mais marcadores para determinar se quaisquer das plantas têm um alelo de gene associado a resistência a SCR, e pelo menos uma planta que tem o alelo de gene associado à resistência a SCR é selecionada da população. O alelo do gene compreende um "A" em SNPOO01l (posição 201 da sequência de referência SEQ ID NO: 6), um "A" em SNP0O02 (posição 127 da sequência de referência SEQ ID NO: 7), um "C" em SNPO0O03 (posição 143 da sequência de referência SEQ ID NO: 8), um "G" em S26 (posição 43 da sequência de referência SEQ ID NO: 1), um "A" em S27 (posição

21 da sequência de referência SEQ ID NO: 2), um "C" em S-24- 1 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S24-2 (posição 19 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "G" em S24-3 (posição 20 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S20-1 (posição 17 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-2 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-3 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "C" em S28-1 (posição 48 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-2 (posição 49 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "T" em S28-3 (posição 63 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "C" em S28-4 (posição 64 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-5 (posição 65 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-6 (posição 66 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "G" em SNPOO04 (posição 51 da sequência de referência SEQ ID NO: 9), um "A" em SNPOO5 (posição 39 da sequência de referência SEQ ID NO: 10), e um "A" em SNPOO06 (posição 23 da sequência de referência SEQ ID NO: 11).

[0009] Em algumas concretizações, a introgressão de genes resistentes a SCR a partir de linhagens resistentes até suscetíveis pode ser alcançada por abordagens de introgressão de traços auxiliada por marcadores, transgênicas, ou de edição do genoma.

[0010] As concretizações incluem um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo de RppK com capacidade para conferir resistência a SCR, em que o polipeptídeo de RppK tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96% de identidade, pelo menos 97% de identidade, pelo menos 98% de identidade, ou pelo menos 99% de identidade em comparação ao SEQ ID NO:

14. Em outra modalidade, um polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de RppK com capacidade para conferir resistência a SCR, em que o polipeptídeo de RppK tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, e pelo menos 95% de identidade, em comparação ao SEQ ID NO: 14.

[0011] Concretizações adicionais da presente revelação incluem um vetor compreendendo um polinucleotídeo da revelação, tal como a SEQ ID NO: 13, ou um construto de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo revelado aqui operativamente ligado a pelo menos uma sequência reguladora. Também são incorporadas uma célula vegetal, bem como uma planta, cada uma compreendendo o construto de DNA recombinante de uma concretização revelada aqui, e uma semente compreendendo o construto de DNA recombinante.

[0012] Em algumas concretizações, as composições e métodos se relacionam a uma planta modificada que tem maior resistência a uma doença, em que o alelo causador da maior resistência a doenças compreende uma sequência de nucleotídeos que codificam um gene de resistência RppK, em que o gene de resistência RppK tem pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, e pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96% de identidade, pelo menos 97% de identidade, pelo menos 98% de identidade, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 13.

[0013] os métodos incorporados pela presente revelação se relacionam a um método para transformar uma célula hospedeira, incluindo uma célula vegetal, compreendendo “transformar a célula hospedeira com o polinucleotídeo de uma concretização da presente revelação, um método para produzir uma planta que compreende transformar uma célula vegetal com o construto de DNA recombinante de uma concretização da presente revelação e regenerar uma planta a partir da célula vegetal transformada, e métodos para conferir ou intensificar a resistência a doenças, compreendendo transformar uma planta com o construto de DNA recombinante revelado no presente documento.

[0014] Também são incorporados métodos para alterar o nível de expressão de uma proteína com capacidade para conferir resistência a doenças em uma planta ou célula vegetal, compreendendo (a) transformar uma célula vegetal com um construto de DNA recombinante revelado aqui e (b) cultivar a célula vegetal transformada sob condições que são adequadas para a expressão do construto de DNA recombinante, em que a expressão do construto de DNA recombinante resulta na produção de níveis alterados de uma proteína com capacidade para conferir resistência a doenças no hospedeiro transformado.

[0015] Plantas identificadas e/ou selecionadas com o uso de qualquer um dos métodos apresentados acima também são fornecidas.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] A Figura 1 mostra uma análise de ligação de RppK. Números entre dois marcadores indicam a distância genética (superior) ou o número de recombinantes (meio) de cada intervalo. Os pontos de interrupção de recombinação de genes recombinantes e anotados chave dentro do intervalo de RppK final são mostrados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0017] Conforme usado no presente documento, as formas singulares “um”, “uma”, "o" e “a” incluem referentes no plural, a menos que o contexto determine claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células e referência "à proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes das mesmas e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta divulgação pertence, a menos que claramente indicado de outro modo.

[0018] O grupo NBS-LRR ("NLR") de genes R é a maior classe de genes R descoberta até à data. Em Arabidopsis thaliana, é previsto que mais de 150 estejam presentes no genoma (Meyers, et al., (2003), Plant Cell, 15:809-834; Monosi, et al., (2004), Theoretical and Applied Genetics, 109:1.434 a 1.447), ao passo que em arroz foram previstos aproximadamente 500 genes NLR (Monosi, (2004) supra). A classe NBS-LRR de genes R é compreendida por duas subclasses. Os genes NLR da classe 1 contêm um domínio do tipo TIR- Toll/Interleucina-l no seu terminal N'; que até à data só havia sido encontrado em dicotiledôneas (Meyers, (2003)

supra; Monosi, (2004) supra). A segunda classe de NBS-LRR contém um domínio em super-hélice ou um domínio (nt) no seu terminal N (Bai, et al. (2002) Genome Research, 12:1.871 a

1.884; Monosi, (2004) supra; Pan, et al., (2000), Journal of Molecular Evolution, 50:203 a 213). NBS-LRR da classe 2 foram encontrados em espécies dicotiledôneas e monocotiledôneas (Bai, (2002) supra; Meyers, (2003) supra; Monosi, (2004) supra; Pan, (2000) supra).

[0019] O domínio NBS do gene aparenta desempenhar um papel na sinalização em mecanismos de defesa das plantas (van der Biezen, et al., (1998), Current Biology: CB, 8:R226-R227). A região LRR aparenta ser a região que interage com os produtos AVR patogênicos (Michelmore, et al., (1998), Genome Res., 8:1.113 a 1.130; Meyers, (2003) supra). Esta região LRR, em comparação com o domínio NB-ARC (NBS), está sob uma pressão de seleção muito maior para diversificar (Michelmore, (1998) supra; Meyers, (2003) supra; Palomino, et al., (2002), Genome Research, 12:1.305 a 1.315). Os domínios LRR também estão presentes em outros contextos; estes motivos com 20-29 resíduos estão presentes em séries em tandem em algumas proteínas com funções diversificadas, tais como interações hormônio - receptor, inibição enzimática, adesão celular e tráfego celular. Alguns estudos recentes revelaram o envolvimento de proteínas LRR no desenvolvimento inicial de mamíferos, desenvolvimento neural, polarização celular, regulação da expressão genética e sinalização da apoptose.

[0020] Um alelo está “associado a” uma característica quando faz parte de ou está ligado a uma sequência de DNA ou alelo que afete a expressão da característica. A presença do alelo é um indicador de como o traço será expresso.

[0021] Como usado aqui, "resistente a doença" ou "ter resistência a uma doença" se relaciona com uma planta exibindo aumento de resistência a uma doença em comparação com uma planta de controle. A resistência a doença pode se manifestar em lesões em menor quantidade e/ou menores, saúde intensificada da planta, rendimento acrescido, massa radicular aumentada, vigor aumentado da planta, menos ou nenhuma descoloração, crescimento aumentado, área necrótica reduzida, ou definhamento reduzido. Em algumas concretizações, um alelo pode apresentar resistência a uma ou mais doenças.

[0022] Doenças afetando plantas de milho plantas incluem, mas sem limitação, crestamento e podridão do caule bacterianos; mancha foliar bacteriana; listra bacteriana; mancha de chocolate; murcha e queima bacterianas de Goss; mancha de Holcus; bainha foliar púrpura; podridão da semente- queima de plântulas; murcha bacteriana; enfezamento do milho; crestamento de antracnose; podridão do caule de antracnose; podridão da espiga e do grão por Aspergillus; mancha foliar e da bainha em bandas; murcha do milho; podridão negra do grão; borde blanco; mancha marrom; mancha negra; podridão do caule; podridão do grão por Cephalosporium; podridão de carvão; podridão da espiga por Corticium; mancha foliar por Curvularia; mancha foliar por Didymella; podridão da espiga e podridão do caule por Diplodia; podridão da espiga por Diplodia; podridão da semente; queima da plântula do milho; mancha foliar ou estria foliar por Diplodia; míldios penugentos; míldio penugento de listra marrom; míldio penugento de pendão louco; míldio penugento da espiga verde; míldio penugento por Graminicola; míldio penugento de Java; míldio penugento Filipino; míldio penugento do sorgo; míldio penugento espontâneo; míldio penugento da cana-de-açúcar; podridão seca da espiga; cravagem-do-centeio; dente-de-cavalo; acama do milho; podridão da espiga e do caule por Fusarium; queima por Fusarium; podridão da raiz das plântulas; podridão da espiga e do caule por Gibberella; podridão cinzenta da espiga; mancha foliar cinzenta; mancha foliar por Cercospora; podridão da raiz por Helminthosporium; podridão da espiga por Hormodendrum; podridão por Cladosporium; mancha foliar por Hyalothyridium; murcha tardia; helmintosporiose; brusone branca; podridão coroa do caule; listra do milho; helmintosporiose; podridão da espiga por Helminthosporium; podridão da espiga por Penicillium; olho azul do milho; bolor azul; podridão do caule e podridão da raiz por Phaeocytostroma; mancha foliar por Phaeosphaeria; podridão da espiga por Physalospora; podridão da espiga por Botryosphaeria; podridão do caule e podridão da raiz por Pyrenochaeta; podridão da raiz por Pythium; podridão do caule por Pythium; mancha avermelhada do grão; podridão da espiga por Rhizoctonia; podridão do esclerócio; podridão da raiz e podridão do caule por Rhizoctonia; mancha foliar por Rostratum; ferrugem do milho comum; ferrugem polissora do sul; ferrugem do milho tropical; podridão da espiga por Sclerotium; queima do sul; mancha foliar por Selenophoma;

podridão da bainha; podridão-do-colo; bolor da silagem; fuligem comum; fuligem falsa; carvão do pendão; crestamento e podridão do caule do milho do sul; mancha foliar do sul; mancha de piche; podridão da espiga e podridão da raiz por Trichoderma; podridão branca da espiga, podridão da raiz e do caule; crestamento amarelo; mancha foliar zonada; estriado do trigo americano (mosaico estriado do trigo); mosaico listrado da cevada; nanismo amarelo da cevada; mosaico Brome; mosqueado clorótico de cereais; necrose letal (doença da necrose letal do milho); mosaico do pepino; mosaico do sorgo-bravo; enfezamento vermelho do milho; nanismo clorótico do milho; mosqueado clorótico do milho; mosaico do nanismo do milho; pinta foliar do milho; mancha anelar pelúcida do milho; raiado fino do milho; folha vermelha e listra vermelha do milho; listra vermelha do milho; mosqueado anelar do milho; nanismo rugoso do milho; enfezamento estéril do milho; estria do milho; listra do milho; aborto do pendão do milho; enação das nervuras do milho; orelha do wallaby do milho; folha branca do milho; mosaico das linhas brancas do milho; folha vermelha de milhete; e mosaico de cereais do norte.

[0023] Doenças afetando plantas de arroz incluem, mas sem limitação, queima bacteriana; estria bacteriana da folha do milho; podridão do pé; podridão do grão; podridão marrom da bainha; brusone; mancha marrom; podridão coroa da bainha; míldio penugento; acama; fuligem falsa; fuligem do grão; fuligem da folha; escaldadura foliar; mancha foliar marrom estreita; podridão da raiz; queima da plântula; queima da bainha; podridão da bainha; mancha da bainha; mancha foliar por Alternaria; e podridão da haste.

[0024] Doenças afetando plantas de soja incluem, mas sem limitação, mancha foliar por Alternaria; antracnose; crestamento negro; podridão negra da raiz; mancha marrom; podridão marrom da haste; podridão de carvão; crestamento por Choanephora; míldio penugento; queima por Drechslera; cercosporiose; mancha foliar por Leptosphaerulina; podridão da raiz por Mycoleptodiscus; podridão da haste por Neocosmospora; podridão da semente por Phomopsis; podridão da raiz e da haste por Phytophthora; mancha foliar por Phyllosticta; podridão da raiz por Phymatotrichum; queima da vagem e haste; oídio; mancha púrpura da semente; mancha foliar por Pyrenochaeta; podridão por Pythium; podridão coroa vermelha; mancha foliar por Dactuliophora; queima das partes aéreas por Rhizoctonia; podridão da raiz e da haste por Rhizoctonia; ferrugem; sarna; podridão da haste por Sclerotinia; queima por Sclerotium; cancro da haste; crestamento por Stemphylium; síndrome de morte súbita; mancha alvo; mancha de levedura; nematódeo lanceolado; nematódeo formador de lesões; nematódeo em forma de alfinete; nematódeo reniforme; nematódeo anelado; nematódeo das galhas radiculares; nematódeo de bainha; nematódeo formador de cistos; nematódeo espiralado; nematódeo de estilete das raízes; nematódeo de encurtamento e engrossamento da raiz; nematódeo do enfezamento; mosaico da alfafa; mosqueado do feijoeiro; mosaico amarelo do feijoeiro; queima do broto brasileira; mosqueado clorótico; mosaico amarelo; mosqueado do amendoim; listra do amendoim; enfezamento do amendoim;

mosqueado clorótico; encarquilhamento foliar; nanismo; enfezamento grave; e mancha anelar do tabaco ou queima do broto.

[0025] Doenças afetando plantas de canola incluem, mas sem limitação, podridão negra bacteriana; mancha foliar bacteriana; podridão da vagem bacteriana; podridão mole bacteriana; sarna; galha da coroa; mancha negra por Alternaria; antracnose; canela-negra; podridão-mole negra; podridão negra da raiz; podridão da raiz de anelamento marrom ("brown girdling root rot"); mancha foliar por Cercospora; hérnia das crucíferas; míldio penugento; murcha por Fusarium; bolor cinzento; podridão da cabeça; mancha foliar; mancha foliar clara; podridão da vagem; oídio; mancha anelar; podridão da raiz; podridão da haste por Sclerotinia; podridão da semente, tombamento de mudas; fuligem das galhas radiculares; queima do sul; murcha por Verticillium; queima branca; mancha foliar branca; blister branco; amarelos; vírus do encarquilhamento; vírus do mosaico; vírus de amarelos.

[0026] Doenças afetando plantas de girassol incluem, mas sem limitação, clorose apical; mancha foliar bacteriana; murcha bacteriana; galha da coroa; podridão do caule e podridão da cabeça por Erwinia; crestamento por Alternaria, mancha da haste e podridão da cabeça; podridão da cabeça por Botrytis; podridão de carvão; míldio penugento; podridão do caule por Fusarium; murcha por Fusarium; mancha foliar e da haste por Myrothecium; amarelos por Phialophora; haste negra por Phoma; cancro marrom da haste por Phomopsis; podridão da raiz por Phymatotrichum; podridão da haste por Phytophthora;

oídio; queima de plântula e podridão da raiz por Pythium; queima de plântula por Rhizoctonia; podridão da cabeça por Rhizopus; ferrugem do girassol; pecíolo basal e podridão da raiz por Sclerotium; mancha foliar por Septoria; murcha por Verticillium; ferrugem branca; ferrugem amarela; nematódeo em forma de adaga; em forma de alfinete; formador de lesões; reniforme; das galhas radiculares; e mosqueado clorótico.

[0027] Doenças afetando plantas de sorgo incluem, mas sem limitação, mancha foliar bacteriana; estria bacteriana da folha do milho; listra foliar bacteriana; murcha por Acremonium; antracnose; podridão de carvão; míldio penugento de pendão louco; tombamento de mudas e podridão da semente; cravagem-do-centeio; queima da cabeça por Fusariumy podridão da raiz e do caule; bolor de armazenamento de grãos; Mancha foliar cinzenta; mancha foliar tardia; crestamento; doença de milo; mancha foliar oval; Pokkah boeng; podridão da raiz por Pythium; mancha foliar rugosa; ferrugem; queima de plântula e podridão da semente; fuligem, núcleo coberto; fuligem, cabeça; fuligem, grão solto; listra fuliginosa; míldio penugento; mancha de piche; mancha alvo foliar; e mancha foliar zonada e queima da bainha.

[0028] Uma planta com resistência a doenças pode ter resistência 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 % maior a uma doença em comparação a uma planta de controle. Em algumas concretizações, uma planta pode ter saúde de planta 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,

90, 95, ou 100%% maior na presença de uma doença em comparação a uma planta de controle.

[0029] Conforme usado no presente documento, o termo "intervalo cromossômico" designa uma amplitude linear contígua de DNA genômico que reside in planta em um cromossomo —único. Os elementos genéticos ou genes localizados em um intervalo cromossômico único são fisicamente ligados. O tamanho de um intervalo cromossômico não é particularmente limitado. Em alguns aspectos, os elementos genéticos localizados dentro de um intervalo cromossômico único são geneticamente ligados, tipicamente com uma distância de recombinação genética, por exemplo, menor ou igual a 20 cM ou, alternativamente, menor ou igual a 10 cM. Isto é, dois elementos genéticos dentro de um intervalo cromossômico único sofrem recombinação a uma frequência inferior ou igual a 20% ou 10%.

[0030] A expressão "estreitamente ligado", no presente pedido, significa que a recombinação entre dois loci ligados ocorre com uma frequência igual ou menor que cerca de 10% (isto é, são separados em um mapa genético por não mais do que 10 cM). De outro modo, os loci estreitamente ligados cossegregam pelo menos 90% do tempo. Os loci marcadores são especificamente úteis com relação à matéria da revelação atual quando os mesmos demonstram uma probabilidade significativa de cossegregação (ligação) com uma característica desejada (por exemplo, resistência à ferrugem polissora). Os loci estreitamente ligados, como um locus marcador e a segundo locus podem exibir uma frequência de recombinação interlocus de 10% ou menos,

preferencialmente cerca de 9% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 8% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 1% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 6% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 5% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 4% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 3% ou menos e ainda mais preferencialmente cerca de 2% ou menos. Em concretizações altamente preferenciais, os loci relevantes exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferencialmente cerca de 0,5% ou menos, ou ainda mais preferencialmente cerca de 0,25% ou menos. Dois loci que são localizados no mesmo cromossomo, e a tal distância que a recombinação entre os dois loci ocorra em uma frequência menor que 10% (por exemplo, cerca de 9 %, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%,, ou menos) são considerados como "proximais" entre si. Em alguns casos, dois marcadores diferentes podem ter as mesmas coordenadas de mapa genético. Nesse caso, os dois marcadores apresentam uma proximidade tão estreita entre si que a recombinação ocorre entre os mesmos com uma frequência tão baixa a ponto de ser indetectável.

[0031] O termo "cruzado" ou "cruzar" se refere a um cruzamento sexual e que envolveu a fusão de duas gametas haploides por meio de polinização para produzir progênie diploide (por exemplo, células, sementes ou plantas). O termo abrange tanto a polinização de uma planta por outra quanto o autocruzamento (ou autopolinização, por exemplo, quando o pólen e o óvulo são da mesma planta).

[0032] Uma “linhagem de elite" é qualquer linhagem resultante de melhoramento e seleção quanto a desempenho agronômico superior.

[0033] Uma "cepa exótica", uma "linhagem tropical" ou um “germoplasma exótico" é uma cepa derivada de uma planta que não pertence a uma linhagem ou cepa de elite disponível de germoplasma. No contexto de um cruzamento entre duas plantas ou estirpes de germoplasma, um germoplasma exótico não está intimamente relacionado por descendência com o germoplasma de elite com o qual é cruzado. Muito vulgarmente, o germoplasma exótico não é derivado de qualquer linhagem de elite conhecida, mas em vez disso é selecionado para introduzir novos elementos genéticos (tipicamente novos alelos) em um programa de melhoramento.

[0034] Um "alelo favorável” é o alelo em um locus particular (um marcador, um QTL, um gene, etc.) que confere, ou contribui para, um fenótipo agronomicamente desejável, por exemplo, resistência a doenças, e que permite a identificação de plantas com tal fenótipo agronomicamente desejável. Um alelo favorável de um marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo favorável.

[0035] "Marcadores genéticos" são ácidos nucleicos que são polimórficos em uma população e cujos alelos podem ser detectados e distinguidos por um ou mais métodos analíticos, por exemplo, RFLP, AFLP, isozima, SNP, SSR e semelhantes. O termo também se refere a sequências de ácidos nucleicos complementares às sequências genômicas, como ácidos —nucleicos usados como sondas. Os marcadores correspondentes a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados por métodos bem estabelecidos na técnica. Os mesmos incluem, por exemplo, métodos de amplificação específicos para sequências com base em PCR, detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozimas, detecção de polimorfismos de polinucleotídeos por hibridação específica para alelos (ASH), detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma da planta, detecção de replicação de sequências autossustentada, detecção de repetições de sequências simples (SSRs), detecção de polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs) ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLPs). Também são conhecidos métodos bem estabelecidos para a detecção de caudas de sequências expressas (ESTs) e marcadores SSR derivados de sequências EST e DNA polimórfico amplificado ao acaso (RAPD).

[0036] "Germoplasma" se refere ao material genético de ou proveniente de um indivíduo (por exemplo, uma planta), um grupo de indivíduos (por exemplo, uma linhagem, variedade ou família de planta) ou um clone derivado de uma linhagem, variedade, espécie ou cultura, ou mais geralmente, todos os indivíduos dentro de uma espécie ou para diversas espécies (por exemplo, coleção de germoplasma de milho ou coleção de germoplasma andino). O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula, ou pode ser separado do organismo ou célula. Em geral, o germoplasma fornece material genético com uma constituição molecular específica que fornece uma base física para algumas ou todas as qualidades hereditárias de um organismo ou cultura celular. Conforme usado no presente documento, germoplasma inclui células, semente ou tecidos a partir dos quais as plantas novas podem ser cultivadas, ou partes de planta, como folhas, hastes, pólen ou células, que podem ser cultivados em uma planta total.

[0037] Um “haplótipo” é o genótipo de um indivíduo em uma pluralidade de loci genéticos, ou seja, uma combinação de alelos. Tipicamente, os loci genéticos descritos por um haplótipo estão ligados física e geneticamente, ou seja, no mesmo segmento cromossômico.

[0038] O termo “heterogeneidade” é usado para indicar que indivíduos dentro do grupo diferem no genótipo em um ou mais loci específicos.

[0039] A resposta heterótica de material, ou "heterose", pode ser definida por desempenho que excede a média dos parentes (ou parente superior) quando cruzado com outros grupos dissimilares ou não relacionados.

[0040] Um "grupo heterótico" compreende um conjunto de genótipos que têm desempenho satisfatório quando cruzados com genótipos de um grupo heterótico diferente (Hallauer et al. (1998) Corn breeding, páginas 463 a 564. Em G.F. Sprague e J.W. Dudley (ed.) Corn and corn improvement). As linhagens congênitas são classificadas em grupos heteróticos e são adicionalmente subdivididas em famílias dentro de um grupo heterótico, com base em diversos critérios como descendência, associações com base em marcador molecular e desempenho em combinações híbridas (Smith et al. (1990) Theor. Appl. Gen. 80:833 a 840). Os dois grupos heteróticos mais amplamente usados nos Estados Unidos são denominados "ITowa Stiff Stalk Synthetic" (também denominado no presente documento como "colmo rígido") e "Lancaster" ou "Lancaster Sure Crop" (algumas vezes denominado como NSS, ou Colmo não Rígido).

[0041] Alguns grupos heteróticos possuem os traços necessários para ser um parente feminino, e outros, traços para um parente masculino. Por exemplo, em milho, os resultados de rendimento de congênitos públicos liberados a partir de uma população chamada BSSS (população Iowa Stiff Stalk Synthetic) resultou nesses congênitos e seus derivados se tornando o grupamento feminino no Cinturão do Milho central. Os congênitos BSSS foram cruzados com outros congênitos, por exemplo, SD 105 e Maiz Amargo, e esse grupo geral de materiais se tornou conhecido como Stiff Stalk Synthetics (SSS) mesmo que nem todos os congênitos sejam derivados da população BSSS original (Mikel e Dudley (2006) Crop Sci: 46:1193 a 1205). Por padrão, todos os outros congênitos que se combinam bem com os congênitos SSS foram atribuídos ao grupamento masculino, o qual pela ausência de um nome mais satisfatório foi designado NSS, isto é, Colmo Não Rígido. Esse grupo inclui diversos grupos heteróticos principais como Lancaster Surecrop, Iodent e Leaming Corn.

[0042] O termo "homogeneidade" indica que membros de um grupo têm o mesmo genótipo em um ou mais loci específicos.

[0043] O termo “híbrido” refere-se à progênie obtida entre o cruzamento de pelo menos dois genitores geneticamente dissimilares.

[0044] O termo “consanguíneo” refere-se a uma linhagem que foi gerada para homogeneidade genética.

[0045] O termo “indel” refere-se a uma inserção ou deleção, em que uma linhagem pode ser dita como tendo um nucleotídeo ou fragmento de DNA inserido em relação a uma segunda linhagem, ou a segunda linhagem pode ser dita como tendo um nucleotídeo ou fragmento de DNA deletado em relação à primeira linhagem.

[0046] o termo “introgressão” refere-se à transmissão de um alelo desejado de um locus genético de um fundo genético para outro. Por exemplo, a introgressão de um alelo desejado em um locus específico pode ser transmitida a pelo menos uma progênie por meio de um cruzamento sexuado entre dois genitores da mesma espécie, em que pelo menos um dos genitores tem o alelo desejado no seu genoma. Alternativamente, por exemplo, a transmissão de um alelo pode ocorrer por meio de recombinação entre dois genomas doadores, por exemplo, em um protoplasto fundido, em que pelo menos um dos protoplastos doadores tem o alelo desejado no seu genoma. O alelo desejado pode ser, por exemplo, detectado por um marcador que está associado a um fenótipo, em um OTL, um transgene ou similar. Em todo caso, a prole compreendendo o alelo desejado pode ser submetida a retrocruzamento repetido com uma linhagem que tem um fundo genético desejado e selecionada em termos do alelo desejado, de modo que o alelo se torne fixo em um fundo genético selecionado.

[0047] O processo de “introgressão” é frequentemente chamado de “retrocruzamento” quando o processo é repetido duas ou mais vezes.

[0048] Uma “linhagem” ou “estirpe” é um grupo de indivíduos de ascendência idêntica que são geralmente consanguíneos, até certo grau, e que geralmente são homozigotos e homogêneos na maioria dos loci (isogênicos ou quase isogênicos). Uma —“sublinhagem” refere-se a um subconjunto consanguíneo de descendentes que são geneticamente distintos de outros subconjuntos similarmente consanguíneos descendentes do mesmo genitor.

[0049] Como usado no presente documento, o termo “ligação” é usado para descrever o grau em que um locus marcador está associado a outro locus marcador ou algum outro locus. A relação de ligação entre um marcador molecular e um locus que afeta um fenótipo é dada como uma “probabilidade” ou “probabilidade ajustada”. A ligação pode ser expressa como uma faixa ou limite desejado. Por exemplo, em algumas concretizações, qualquer marcador é ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador quando os marcadores são separados por menos de 50, 40, 30, 25, 20 ou 15 unidades de mapa (ou cM) de um mapa de meiose único (um mapa genético com base em uma população que foi submetida a um ciclo de meiose, como, por exemplo, um F;; os mapas IBM2 consistem em múltiplas meioses). Em alguns aspectos, é vantajoso definir uma faixa limitada de ligação, por exemplo, entre 10 e 20 cM, entre 10 e 30 cM, ou entre 10 e 40 cM. Quanto mais estritamente o marcador é ligado a um segundo locus, um melhor indicador para o segundo locus aquele marcador se torna. Desse modo, “loci estreitamente ligados”, como um locus marcador e um segundo locus, exibem uma frequência de recombinação interlocus de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 8% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 7% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 6% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 5% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 4% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 3% ou menos, e ainda mais preferencialmente cerca de 2% ou menos. Em concretizações altamente preferidas, os loci relevantes exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferencialmente cerca de 0,5% ou menos, ou ainda mais preferencialmente cerca de 0,25% ou menos. De outra forma, dois loci que são localizados no mesmo cromossomo, e aàa tal distância que a recombinação entre os dois loci ocorra em uma frequência menor que 10% (por exemplo, cerca de 9 %, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%,, ou menos) são considerados como "em proximidade" entre si. Visto que um cM é a distância entre dois marcadores que mostram uma frequência de recombinação de 1%, qualquer marcador estará estreitamente ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador que estiver em estreita proximidade, por exemplo, a uma distância de ou menor que 10 cM. Dois marcadores estreitamente ligados no mesmo cromossomo podem ser posicionados a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25 cM ou menos entre si.

[0050] O termo "desequilíbrio de ligação" se refere a uma segregação não aleatória de traços ou loci genéticos (ou ambos). Em qualquer caso, o desequilíbrio de ligação implica que os loci relevantes estão dentro de proximidade física suficiente ao longo de um comprimento de um cromossomo para que segreguem juntos com uma frequência maior do que aleatória (isto é, não aleatória). Os marcadores que mostram o desequilíbrio de ligação são considerados ligados. Os loci ligados cossegregam mais do que 50% do tempo, por exemplo, a partir de cerca de 51% a cerca de 100% do tempo. Em outras palavras, dois marcadores que cossegregam têm uma frequência de recombinação menor que 50% (e por definição, são separados por menos de 50 cM no mesmo grupo de ligação). Conforme usado no presente documento, a ligação pode ser entre dois marcadores, ou alternativamente entre um marcador e um locus que afeta um fenótipo. Um locus marcador pode estar “associado a” (ligado a) uma característica. O grau de ligação de um locus marcador e um locus que afeta um característica fenotípica é medido, por exemplo, como uma probabilidade estatística de cossegregação daquele marcador molecular com o fenótipo (por exemplo, uma estatística F ou escore LOD).

[0051] O desequilíbrio de ligação é mais comumente avaliado com o uso da medida r?º?, a qual é calculada com o uso da fórmula descrita por Hill, W.G. e Robertson, A, Theor. Appl. Genet. 38:226 a 231(1968). Quando r? = 1, LD completo existe entre os dois loci marcadores, o que significa que os marcadores não foram separados por recombinação e têm a mesma frequência de alelos. O valor de r? será dependente da população usada. Os valores para r? acima de 1/3 indicam LD suficientemente forte para ser útil para mapeamento (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299 a 309 (2002)). Então, os alelos estão em desequilíbrio de ligação quando valores de r? entre loci marcadores em par são maiores ou iguais a 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou 1,0.

[0052] Conforme usado no presente documento, “equilíbrio de ligação" descreve uma situação em que dois marcadores segregam independentemente, isto é, selecionam entre progênie aleatoriamente. Os marcadores que mostram equilíbrio de ligação são considerados não ligados (quer residam ou não no mesmo cromossomo) .

[0053] Um "locus" é uma posição em um cromossomo, por exemplo, onde um nucleotídeo, gene, sequência, Ou marcador está localizado.

[0054] O "logaritmo de valor de chances (LOD)" ou "escore de LOD" (Risch, Science 255:803 a 804 (1992)) é usado em mapeamento de intervalo genético para descrever o grau de ligação entre dois loci marcadores. Um escore de LOD de três entre dois marcadores indica que a ligação é 1,000 vezes mais provável do que nenhuma ligação, enquanto um escore de LOD de dois indica que a ligação é 100 vezes mais provável que nenhuma ligação. Os escores de LOD maiores ou iguais a dois podem ser usados para detectar a ligação. Os escores de LOD também podem ser usados para mostrar a força de associação entre loci marcadores e traços quantitativos no mapeamento de “loci de traços quantitativos”. Nesse caso, O tamanho do escore de LOD é dependente da proximidade do locus marcador com o locus que afeta o traço quantitativa, assim como o tamanho do efeito da característica quantitativa.

[0055] O termo “planta” inclui plantas inteiras, células de planta, protoplasto de planta, cultura de células ou tecidos de planta a partir da qual plantas podem ser regeneradas, calos de planta, touceiras de planta e células de planta que estão intactas em plantas ou partes de plantas, tais como sementes, flores, cotilédones, folhas, hastes, brotos, raízes, pontas de raízes e similares. Como usado aqui, uma "planta modificada" significa qualquer planta que tem uma alteração genética devido a intervenção humana. Uma planta modificada pode ter alterações genéticas introduzidas através de transformação da planta, edição do genoma, Ou melhoramento convencional de plantas.

[0056] Um “marcador” é um meio para encontrar uma posição em um mapa genético ou físico, ou então ligações entre marcadores e loci de traços (loci que afetam traços). A posição que o marcador detecta pode ser conhecida por meio de detecção de alelos polimórficos e seu mapeamento genético, ou então por hibridização, correspondência de sequências ou amplificação de uma sequência que foi fisicamente mapeada. Um marcador pode ser um marcador de DNA (detecta polimorfismos de DNA), uma proteína (detecta variação em um polipeptídeo codificado), ou um fenótipo simplesmente herdado (como o fenótipo 'ceroso'). Um marcador de DNA pode ser desenvolvido a partir da sequência de nucleotídeos genômico ou a partir de sequências de nucleotídeos expressas (por exemplo, a partir de um RNA emendado ou um cDNA). Dependendo da tecnologia de marcador de DNA, o marcador consistirá em iniciadores complementares que flanqueiam o locus e/ou sondas complementares que hibridizam para alelos polimórficos no locus. Um marcador de DNA, ou um marcador genético, também pode ser usado para descrever o gene, sequência de DNA ou nucleotídeo no cromossomo em si (em vez dos componentes usados para detectar o gene ou a sequência de DNA) e é frequentemente usado quando o marcador de DNA é associado a um traço particular em genética humana (por exemplo, um marcador para câncer de mama). O termo locus marcador é o locus (gene, sequência ou nucleotídeo) que o marcador detecta.

[0057] Os marcadores que detectam polimorfismos genéticos entre membros de uma População são bem estabelecidos na técnica. Os marcadores podem ser definidos pelo tipo de polimorfismo que detectam e também pela tecnologia de marcador usada para detectar o polimorfismo. Os tipos de marcador incluem, mas sem limitação, por exemplo, a detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozimas, DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPD), polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLPs), detecção de repetições de sequências simples (SSRs), detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma vegetal, detecção de replicação de sequência autossustentada Ou detecção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). SNPs podem ser detectados, por exemplo, por meio de sequenciamento de DNA, métodos de amplificação específicos para sequências com base em PCR, detecção de polimorfismos polinucleotídicos por hibridação alelo-específica (ASH), hibridação alelo- específica dinâmica (DASH, do inglês “dynamic allele- specific hybridization”), sinalizadores moleculares (molecular beacons), hibridação de microarranjo, ensaios de oligonucleotídeo ligase, endonucleases Flap, endonucleases 5', extensão de iniciador, polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP, do inglês “single strand conformation polymorphism”) ou eletroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE, do inglês “temperature gradient gel electrophoresis”). O sequenciamento de DNA, como à tecnologia de pirossequenciamento, tem a vantagem de poder detectar uma série de alelos de SNP ligados que constituem um haplótipo. Os haplótipos tendem a ser mais informativos (detectam um nível mais alto de polimorfismo) do que SNPs.

[0058] Um “alelo marcador”, alternativamente um “alelo de um locus marcador”, pode se referir a uma dentre uma pluralidade de sequências de nucleotídeos polimórficas encontradas em um locus marcador em uma população.

[0059] "Seleção auxiliada por marcador" (de MAS) é um processo pelo qual plantas individuais são selecionadas com base em genótipos marcadores.

[0060] "Contrasseleção auxiliada por marcador" é um processo pelo qual os genótipos marcadores são usados para identificar plantas que não serão selecionadas, o que permite que as mesmas sejam removidas de um programa de reprodução ou plantação.

[0061] Um "haplótipo marcador" se refere a uma combinação de alelos em um locus marcador.

[0062] Um "locus marcador" é uma localização cromossômica específica no genoma de uma espécie onde um marcador específico pode ser encontrado. Um locus marcador pode ser usado para rastrear a presença de um segundo locus ligado, por exemplo, um que afeta a expressão de um traço fenotípico. Por exemplo, um locus marcador pode ser usado para monitorar a segregação de alelos em um locus geneticamente ou fisicamente ligado.

[0063] O termo “marcador molecular” pode ser usado para se referir a um marcador genético, como definido acima, ou um produto codificado do mesmo (por exemplo, uma proteína) usado como um ponto de referência durante a identificação de um locus ligado. Um marcador pode ser derivado de sequências nucleotídicas genômicas ou de sequências nucleotídicas expressas (por exemplo, a partir de um RNA que sofreu splicing, um cDNA, etc.), ou a partir de um polipeptídeo codificado. O termo também se refere a sequências de ácidos nucleicos complementares ou que flanqueiam as sequências de marcador, como ácidos nucleicos usados como sondas ou pares de iniciadores com capacidade para amplificar a sequência de marcador. Uma "sonda de marcador molecular" é uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula que pode ser usada para identificar a presença de um locus marcador, por exemplo, uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de locus marcador. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda de marcador se refere a uma sonda de qualquer tipo que pode distinguir (isto é, genótipo) o alelo particular que está presente em um locus marcador. Ácidos nucleicos são "complementares" quando hibridam especificamente em solução. Alguns dos marcadores descritos no presente documento também são chamados de marcadores de hibridação quando localizados em uma região indel, tal como a região não colinear descrita no presente documento. Isso é devido ao fato de que a região de inserção é, por definição, um polimorfismo vis a vis uma planta sem a inserção. Desse modo, o marcador precisa indicar apenas se a região indel está presente ou ausente. Qualquer tecnologia de detecção de marcadores adequada pode ser usada para identificar tal marcador de hibridação, por exemplo, tecnologia SNP é usada nos exemplos proporcionados aqui.

[0064] Um alelo se correlaciona “negativamente” com uma característica quando está ligado à mesma e quando a presença do alelo é um indicador de que uma característica ou forma de característica desejada não ocorrerá em uma planta compreendendo o alelo.

[0065] o termo “fenótipo”, “característica fenotípica” ou “característica” pode se referir à expressão observável de um gene ou série de genes. O fenótipo pode ser observável ao olho nu, ou por quaisquer outros meios de avaliação conhecidos na técnica, por exemplo, pesagem, contagem, medição (comprimento, largura, ângulos, etc.), microscopia, análise bioquímica, ou um ensaio eletromecânico. Em alguns casos, um fenótipo é diretamente controlado por um único gene ou locus genético, isto é, um “traço de gene único” ou um “traço simplesmente herdado”. Na ausência de níveis grandes de variação ambiental, os traços de gene único podem segregar em uma população para gerar uma distribuição “qualitativa” ou “discreta”, isto é, o fenótipo se enquadra em classes distintas. Em outros casos, um fenótipo é o resultado de vários genes e pode ser considerado um “traço multigênico” ou um “traço complexo”. Os traços multigênicos segregam em uma população para gerar uma distribuição “quantitativa” ou “contínua”, isto é, o fenótipo não pode ser separado em classes discretas. Tanto os traços de gene simples quanto os traços multigênicos podem ser afetadas pelo ambiente no qual estão sendo expressas, mas os traços multigênicos tendem a ter um maior componente ambiental.

[0066] Um “mapa físico” do genoma é um mapa que mostra a ordem linear de marcos identificáveis (incluindo genes, marcadores, etc.) no DNA cromossômico. Entretanto, em contraste com os mapas genéticos, as distâncias entre os marcos são absolutas (por exemplo, medidas em pares de bases ou fragmentos genéticos contíguos isolados e sobrepostos) e não com base na recombinação genética (que pode variar em populações diferentes).

[0067] Um “polimorfismo” é uma variação no DNA entre dois ou mais indivíduos dentro de uma população. Um polimorfismo tem preferencialmente uma frequência de pelo menos 1% em uma população. Um polimorfismo útil pode incluir um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), uma repetição de sequência simples (SSR), ou um polimorfismo de inserção/deleção, também chamado no presente documento de “indel”.

[0068] Um “marcador de produção” ou “marcador SNP de produção” é um marcador que foi desenvolvido com propósitos de produtividade alta. Os marcadores SNP de produção são desenvolvidos para detectar polimorfismos específicos e são projetados para uso com uma variedade de químicas e plataformas.

[0069] O termo "locus de traços quantitativos" ou "QOTL" se refere a uma região de DNA que está associada à expressão diferencial de um traço fenotípico quantitativo em pelo menos um fundo genético, por exemplo, em pelo menos uma população de melhoramento. A região do OTL abrange ou está estreitamente ligada ao gene ou genes que afetam o traço em questão.

[0070] Uma “sequência de referência" ou uma “sequência de consenso" é uma sequência definida usada como base para comparação de sequências. A sequência de referência para um marcador é obtida por sequenciamento de algumas linhagens no locus, alinhando as sequências de nucleotídeos em um programa de alinhamento de sequências (por exemplo, Sequencher), e obtendo, então, a sequência de nucleotídeos mais comum do alinhamento. Os polimorfismos encontrados dentre as sequências individuais são anotados dentro da sequência de consenso. Uma sequência de referência não é normalmente uma cópia exata de qualquer sequência de DNA individual, mas representa uma amálgama de sequências disponíveis e é útil para projetar iniciadores e sondas para polimorfismos dentro da sequência.

[0071] Um “alelo desfavorável” de um marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo de planta desfavorável, fornecendo, portanto, o benefício de identificar plantas que podem ser removidas de um programa de melhoramento ou plantio.

[0072] o termo "rendimento" se refere à produtividade por área unitária de um produto de planta particular de valor comercial. O rendimento é afetado tanto por fatores genéticos quanto ambientais. "Agronômicos", “traços agronômicos", e "desempenho agronômico" se referem aos traços (e elementos genéticos subjacentes) de uma dada variedade de planta que contribuem para o rendimento ao longo da temporada de cultivo. Os traços agronômicos individuais incluem vigor da emergência, vigor vegetativo, tolerância ao estresse, resistência ou tolerância a doenças, resistência a herbicidas, ramificação, florescimento, conjunto de sementes, tamanho das sementes, densidade das sementes, resistência, capacidade para ser debulhado e semelhantes. O rendimento é, portanto, a culminação final de todos os traços agronômicos.

[0073] Loci marcadores que demonstram cossegregação estatisticamente significativa com um traço de resistência a doenças que confere resistência ampla contra uma doença ou doenças especificadas são proporcionados aqui. A detecção desses Jloci ou loci adicionais ligados e o gene de resistência podem ser usados em seleção auxiliada por marcador como parte de um programa de melhoramento para produzir plantas que têm resistência a uma doença ou doenças.

Mapeamento genético

[0074] Foi reconhecido desde há algum tempo que os loci genéticos específicos que se correlacionam com fenótipos particulares, como resistência a doenças, podem ser mapeados no genoma de um organismo. O reprodutor de plantas pode usar vantajosamente marcadores moleculares para identificar indivíduos desejados detectando-se alelos marcadores que mostram uma probabilidade estatisticamente significativa de cossegregação com um fenótipo desejado, manifestado como desequilíbrio de ligação. Identificando-se um marcador molecular ou agrupamentos de marcadores moleculares que cossegregam com um traço de interesse, o reprodutor pode selecionar rapidamente um fenótipo desejado selecionando-se o alelo marcador molecular apropriado (um processo chamado seleção auxiliada por marcador ou MAS).

[0075] Uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica são disponibilizados para detectar marcadores moleculares ou agrupamentos de marcadores moleculares que se cossegregam com um traço de interesse, tal como um traço de resistência a doenças. A ideia básica subjacente a estes métodos é a detecção de marcadores, para os quais genótipos (ou alelos) alternativos têm fenótipos médios significativamente diferentes. Desse modo, uma pessoa faz uma comparação entre loci marcadores da magnitude de diferença entre genótipos (ou alelos) alternativos ou do nível de significância dessa diferença. Infere-se que os genes de traços estão localizados mais próximos do(s) marcador (es) que têm a maior diferença genotípica associada. Dois métodos do tipo utilizados para detectar loci de traços de interesse são: 1) Análise de associação com base em população (isto é, mapeamento de associação) e 2) Análise de ligação tradicional.

Mapeamento de Associação

[0076] Entender a extensão e os padrões de desequilíbrio de ligação (LD) no genoma é um pré-requisito para desenvolver abordagens de associação eficientes para identificar e mapear loci de traços quantitativos (OTL). O desequilíbrio de ligação (LD) se refere à associação não aleatória de alelos em uma coleção de indivíduos. Quando LD é observado dentre alelos em loci ligados, o mesmo é medido como decaimento de LD através de uma região específica de um cromossomo. A extensão do LD é um reflexo do histórico recombinatório daquela região. A taxa média de decaimento de LD em um genoma pode ajudar a prever o número e a densidade de marcadores que são necessários para empreender um estudo de associação em todo o genoma e fornece uma estimativa da resolução que pode ser esperada.

[0077] Mapeamento de associação ou LD tem como objetivo identificar associações genótipo-fenótipo significativas. O mesmo foi explorado como uma ferramenta poderosa para mapeamento fino em cruzamento exogâmico de espécies como humanos (Corder et al. (1994) "Protective effect of apolipoprotein-E type-2 allele for late-onset Alzheimer-disease", Nat Genet 7:180 a 184; Hastbacka et al. (1992) "Linkage disequilibrium mapping in isolated founder populations: diastrophic dysplasia in Finland" Nat Genet 2:204 a 211; Kerem et al. (1989) "Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis", Science 245:1073 a 1080) e milho (Remington et al., (2001) "Structure of linkage disequilibrium and phenotype associations in the maize genome", Proc Natl Acad Sci USA 98:11479 a 11484; Thornsberry et al. (2001) "Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time", Nat Genet 28:286 a 289; revisado por Flint-Garcia et al. (2003) "Structure of linkage disequilibrium in plants", Annu Rev Plant Biol. 54:357 a 374), em que a recombinação entre heterozigotos é frequente e resulta em um decaimento rápido de LD. Em cruzamentos cossanguíneos de espécies em que a recombinação entre genótipos homozigóticos não é geneticamente detectável, a extensão de LD é maior (isto é, blocos maiores de marcadores ligados são herdados juntos) e isso intensifica dramaticamente o poder de detecção do mapeamento de associação (Wall e Pritchard (2003) "Haplotype blocks and linkage disequilibrium in the human genome", Nat Rev Genet 4:587 a 597).

[0078] O histórico recombinatório e de mutação de uma população é uma função do hábito de acasalamento, assim como do tamanho efetivo e a idade de uma população. Os tamanhos de população grandes oferecem possibilidades aprimoradas para detectar recombinação, enquanto as populações mais velhas são geralmente associadas a níveis mais altos de polimorfismo, ambos os quais contribuem para taxas aceleradas de modo observável de decaimento de LD. Por outro lado, os tamanhos de população efetivos menores, por exemplo, aqueles que experimentaram um efeito de gargalo genético recente, tendem a mostrar uma taxa mais lenta de decaimento de LD, o que resulta em conservação de haplótipos mais extensa (Flint-Garcia et al. (2003) "Structure of linkage disequilibrium in plants", Annu Rev Plant Biol. 54:357 a 374).

[0079] As linhagens de reprodução de elite fornecem um ponto de partida valioso para análises de associação. As análises de associação usam escores fenotípicos quantitativos (por exemplo, tolerância a doenças classificada de um a nove para cada linhagem) na análise (em oposição a olhar apenas para distribuições de frequência de alelos tolerantes versus resistentes em tipos de análise de distribuição de alelos intergrupos). A disponibilidade de dados de desempenho fenotípico detalhados coletados por programas de reprodução ao longo de múltiplos anos e ambientes para um número grande de linhagens de elite fornece um conjunto de dados valioso para análises de mapeamento de associação de marcadores genéticos. Isso cria o caminho para integração contínua entre pesquisa e aplicação e toma vantagem dos conjuntos de dados historicamente acumulados. Entretanto, um entendimento da relação entre polimorfismo e recombinação é útil no desenvolvimento de estratégias apropriadas para extrair de modo eficaz o máximo de informações desses recursos.

Esse tipo de análise de associação não gera nem necessita de quaisquer dados de mapa, mas é independente de posição de mapa. Essa análise compara o escore fenotípico das — plantas com os genótipos nos vários loci. Subsequentemente, qualquer mapa adequado (por exemplo, um mapa compósito) pode ser opcionalmente usado para ajudar a observar a distribuição dos marcadores QTL e/ou agrupamento de marcadores QTL identificados com o uso de localizações de mapa anteriormente determinadas dos marcadores.

Análise de ligação tradicional

[0080] Os mesmos princípios são subjacentes à análise de ligação tradicional; entretanto, LD é gerado criando-se uma população a partir de um número pequeno de fundadores. Os fundadores são selecionados para maximizar o nível de polimorfismo dentro da população construída, e sítios polimórficos são avaliados por seu nível de cossegregação com um dado fenótipo. Alguns métodos estatísticos foram usados para identificar associações marcador-traço significativas. Um tal método é uma abordagem de mapeamento de intervalo (Lander e Botstein, Genetics 121:185 a 199 (1989)), no qual cada uma das muitas posições ao longo de um mapa genético (dizer em intervalos de 1 cM) é testada quanto à probabilidade de um gene controlando um traço de interesse estar localizado naquela posição. Os dados genotípicos/fenotípicos são usados para calcular, para cada posição de teste, um escore de LOD (log da razão de probabilidade). Quando o escore de LOD excede um valor de limiar, há evidência significativa da localização de um gene que controla o traço de interesse naquela posição no mapa genético (que estará entre dois loci — marcadores particulares).

[0081] os loci marcadores que demonstram cossegregação estatisticamente significativa com um traço de resistência a doenças, conforme determinado pela análise de ligação tradicional e pela análise de associação em todo o genoma, são fornecidos no presente documento. A detecção desses loci ou loci ligados adicionais pode ser usada em programas de melhoramento assistido por marcadores para produzir plantas com resistência a doenças.

[0082] As atividades em programas de reprodução auxiliados por marcador podem incluir, mas sem limitação: selecionar dentre populações de reprodução novas para identificar qual população tem a frequência mais alta de sequências de ácidos nucleicos favoráveis com base no genótipo histórico e associações de traços agronômicos, selecionar sequências de ácidos nucleicos favoráveis dentre progênie em populações de reprodução, selecionar dentre linhagens parentais com base na previsão de desempenho da progênie, e avançar linhagens em atividades de melhora de germoplasma com base na presença de sequências de ácidos nucleicos favoráveis.

Intervalos cromossômicos

[0083] os intervalos cromossômicos que se correlacionam com o traço de resistência a doenças são fornecidos. Uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica está disponível para identificar intervalos cromossômicos. Os limites de tais intervalos cromossômicos são traçados de modo a abranger marcadores que estarão ligados ao(s) gene(s) que controla(m) o traço de interesse. Em outras palavras, o intervalo cromossômico é traçado de modo que qualquer marcador que se situe dentro desse intervalo (incluindo os marcadores terminais que definem os limites do intervalo) possa ser usado como um marcador para um traço de resistência a doença.

[0084] Inversamente, por exemplo, se dois marcadores em estreita proximidade mostrarem cossegregação com o traço fenotípico desejado, algumas vezes não é claro se cada um desses marcadores identifica o mesmo gene ou dois genes diferentes ou múltiplos genes. Independentemente, o conhecimento de quantos genes estão em um intervalo físico/genômico particular não é necessário para implementar ou praticar o que é apresentado na presente revelação.

[0085] O intervalo do cromossomo 10 pode abranger qualquer um dos marcadores identificados neste documento como estando associados ao traço de resistência a SCR, incluindo um "A" em SNPOOl (posição 201 da sequência de referência SEQ ID NO: 6), um "A" em SNPOO2 (posição 127 da sequência de referência SEQ ID NO: 7), um "C" em SNPOO3 (posição 143 da sequência de referência SEQ ID NO: 8), um "G" em S26 (posição 43 da sequência de referência SEQ ID NO: 1), um "A" em S27 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 2), um "C" no S-24-1 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S24-2 (posição 19 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "G" em S24-3 (posição 20 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S20-1 (posição 17 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-2 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-3 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "C" em S28-1 (posição 48 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-2 (posição 49 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "T" em S28-3 (posição 63 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "C" em S28-4 (posição 64 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-5 (posição 65 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-6 (posição 66 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "G" em SNPOO4 (posição 51 da sequência de referência SEQ ID NO: 9), um "A" em SNPOO5 (posição 39 da sequência de referência SEQ ID NO: 10), e um "A" em SNPOO6 (posição 23 da sequência de referência SEQ ID NO: 11). Qualquer marcador localizado nesses intervalos pode ser usado como um marcador para resistência à SCR e pode ser usado no contexto dos métodos apresentados no presente documento para identificar e/ou selecionar plantas que têm resistência a SCR, independentemente de ter sido recentemente conferida ou aprimorada em comparação a uma planta de controle.

Em determinadas concretizações, os marcadores localizados a montante e a jusante da posição do gene RppK estão fortemente ligados genética e fisicamente e, portanto, podem ser usados para selecionar o gene RppK para introgressão de traços e desenvolvimento de produtos.

[0086] Os intervalos cromossômicos também podem ser definidos por marcadores que estão ligados a (mostram desequilíbrio de ligação com) um gene resistente a doenças, e r? é uma medida comum do desequilíbrio de ligação (LD) no contexto de estudos de associação. Se o valor r? de LD entre um locus marcador de cromossomo 7 em um intervalo de interesse e outro locus marcador de cromossomo 7 em proximidade estreita for maior que 1/3 (Ardlie et al., Nature Reviews Genetics 3:299 a 309 (2002)), os loci estão em desequilíbrio de ligação entre si.

Marcadores e relações de ligação

[0087] Uma medida comum de ligação é a frequência com a qual os traços cossegregam. Isso pode ser expresso como uma porcentagem de cossegregação (frequência de recombinação) ou em centiMorgans (cM). O cM é uma unidade de medida de frequência de recombinação genética. Um cM é igual a uma chance de 1% de um traço em um locus genético ser separado de um traço em outro locus devido ao cruzamento ao longo de uma única geração (o que significa que os traços segregam juntos 99% do tempo). Devido ao fato de a distância cromossômica ser aproximadamente proporcional à frequência de cruzamento de eventos entre traços, há uma distância física aproximada que se correlaciona com a frequência de recombinação.

[0088] Os loci marcadores são traços em si e podem ser avaliados de acordo com a análise de ligação padrão rastreando os loci marcadores durante a segregação. Desse modo, um cM é igual a uma chance de 1% de um locus marcador ser separado de outro locus, devido ao cruzamento em uma única geração.

[0089] Quanto mais próximo um marcador estiver de um gene que controla um traço de interesse, mais eficaz e vantajoso esse marcador é como indicador para o traço desejado. Os loci estreitamente ligados exibem uma frequência de cruzamento interlocus de cerca de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 8% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 7% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 6% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 5% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 4% ou menos, ainda mais preferencialmente cerca de 3% ou menos, e ainda mais preferencialmente cerca de 2% ou menos. Em concretizações altamente preferidas, os loci relevantes (por exemplo, um locus marcador e um locus-alvo) exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferencialmente cerca de 0,5% ou menos, ou ainda mais preferencialmente cerca de 0,25% ou menos. Desse modo, os loci estão a cerca delO cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM ou menos separados. De outra forma, dois loci que são localizados no mesmo cromossomo, e a tal distância que a recombinação entre os dois loci ocorra em uma frequência menor que 10% (por exemplo, cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%,, ou menos) são considerados como "proximais" entre si.

[0090] Embora alelos marcadores particulares possam cossegregar com o traço de resistência a doenças, é importante observar que o locus marcador não é necessariamente responsável pela expressão do fenótipo de resistência a doenças. Por exemplo, não é uma necessidade que a sequência de polinucleotídeos marcadora faça parte de um gene que é responsável pelo fenótipo resistente a doenças (por exemplo, faça parte da fase de leitura aberta do gene). A associação entre um alelo marcador específico e o traço de resistência a doenças é devido à fase de ligação de "acoplamento" original entre o alelo marcador e o alelo na linhagem ancestral de onde é originário o alelo. No final, com recombinação repetida, os eventos de permutação entre o marcador e o locus genético podem alterar esta orientação. Por esse motivo, o alelo marcador favorável pode se alterar dependendo da fase de ligação que existe no progenitor que tem resistência à doença que é usado para criar populações de segregação. Isso não muda o fato de que o marcador pode ser usado para monitorar a segregação do fenótipo. Apenas muda qual alelo marcador é considerado favorável em uma dada população de segregação.

[0091] Os métodos apresentados no presente documento incluem detectar a presença de um ou mais alelos marcadores associados à resistência a doenças em uma planta e, então, identificar e/ou selecionar plantas que têm alelos favoráveis em tais loci marcadores. Foram identificados aqui marcadores como estando associados ao traço de resistência a doenças e, assim, podem ser usados para prever resistência a doenças em uma planta. Qualquer marcador dentro de 50 cM, 40 cM, 30 cM, 20 cM, 15 cM, 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM (com base em um mapa genético com base em meiose única) também poderia ser usado para prever resistência a doenças em uma planta.

Seleção assistida por marcadores

[0092] Os marcadores moleculares podem ser usados em uma variedade de aplicações de reprodução de planta (por exemplo, consultar Staub et al. (1996) Hortscience 31: 729 a 741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter. 1: 3-8). Uma das principais áreas de interesse é aumentar a eficiência do retrocruzamento e introgressão de genes com o uso de seleção auxiliada por marcadores (MAS). Um marcador molecular que demonstra ligação a um locus que afeta um traço fenotípico desejado fornece uma ferramenta útil para a seleção do traço em uma população de plantas. Isso é particularmente verdadeiro quando o fenótipo é difícil de ensaiar. Visto que os ensaios de marcador de DNA são menos trabalhosos e ocupam menos espaço físico do que a fenotipagem de campo, populações muito maiores podem ser ensaiadas, o que aumenta as chances de encontrar um recombinante com o segmento-alvo da linhagem doadora movido para a linhagem receptora. Quanto mais próxima a ligação, mais útil o marcador, visto que a recombinação é menos propensa a ocorrer entre o marcador e o gene que causa o traço, o que pode resultar em falsos positivos. Ter marcadores de flanqueamento diminui as chances de ocorrência de seleção de falsos positivos visto que um evento de recombinação dupla seria necessário. A situação ideal é ter um marcador no próprio gene, para que a recombinação não possa ocorrer entre o marcador e o gene. Em algumas concretizações, os métodos revelados no presente documento produzem um marcador em um gene de resistência a doenças, em que o gene foi identificado inferindo a localização genômica a partir do agrupamento de domínios conservados ou uma análise de agrupamento.

[0093] Quando um gene é introgressado por MAS, não apenas o gene é introduzido, como também as regiões de flanqueamento (Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780-1790). Isso é referido como "arraste de ligação". No caso em que a planta doadora é altamente não relacionada à planta recipiente, essas regiões de flanqueio portam genes adicionais que podem codificar traços agronomicamente indesejáveis. Este “arraste de ligação” também pode resultar em rendimento reduzido ou outras características agronômicas negativas até mesmo após múltiplos ciclos de retrocruzamento na linhagem de elite. Isso é também chamado às vezes de “arraste de rendimento”. O tamanho da região de flanqueamento pode ser diminuído por retrocruzamento adicional, embora isso não seja sempre bem- sucedido, visto que reprodutores não têm controle sobre o tamanho da região ou os pontos de interrupção de recombinação (Young et al. (1998) Genetics 120:579 a 585). Em reprodução clássica, é normalmente apenas por chance que são selecionadas recombinações que contribuem para uma redução do tamanho do segmento doador (Tanksley et al. (1989). Biotechnology 7: 257-264). Mesmo após 20 retrocruzamentos em retrocruzamentos desse tipo, uma pessoa pode esperar encontrar um pedaço razoavelmente grande do cromossomo doador ainda ligado ao gene selecionado. Com marcadores, no entanto, é possível selecionar aqueles indivíduos raros que experimentaram recombinação próxima ao gene de interesse. Em 150 plantas de retrocruzamento, há uma chance de 95% de que pelo menos uma planta tenha experimentado uma permutação dentro de 1 cM do gene, com base em uma distância de mapa de meiose única. Os marcadores permitirão a identificação não equivocada desses indivíduos. Com um retrocruzamento adicional de 300 plantas, haverá uma chance de 95% de um cruzamento em 1 cM de distância do mapa de meiose única do outro lado do gene, gerando um segmento em torno do gene- alvo menor do que 2 cM com base em uma distância do mapa de meiose única. Isso pode ser cumprido em duas gerações com marcadores, enquanto teriam sido necessárias em média 100 gerações sem marcadores (Consulte Tanksley et al., supra). Quando a localização exata de um gene é conhecida, os marcadores de flanqueamento que circundam o gene podem ser utilizados para selecionar as recombinações em tamanhos de população diferentes. Por exemplo, em tamanhos populacionais menores, as recombinações podem ser esperadas distantes do gene e, portanto, marcadores de flanqueamento mais distais serão necessários para detectar a recombinação.

[0094] Os componentes-chave para a implantação de MAS são: (i) Definir a população dentro da qual a associação marcador-traço será determinada, a qual pode ser uma população de segregação, ou uma população aleatória ou estruturada; (ii) monitorar a segregação ou associação de marcadores polimórficos em relação ao traço, e determinar a ligação ou associação com o uso de métodos estatísticos; (iii) definir um conjunto de marcadores desejáveis com base nos resultados da análise estatística, e (iv) o uso e/ou extrapolação dessas informações para o conjunto atual de germoplasma de reprodução para possibilitar que sejam tomadas decisões de seleção com base em marcador. Os marcadores descritos nessa revelação, assim como outros tipos de marcador, como SSRs e FLPs, podem ser usados em protocolos de seleção auxiliados por marcador.

[0095] SSRs podem ser definidos como rondas relativamente curtas de DNA repetido em tandem com comprimentos de 6 pb ou menos (Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463 a 6471; Wang et al. (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1 a 6). Polimorfismos surgem devido à variação do número de unidades de repetição, provavelmente causados por deslize durante a replicação de DNA (Levinson e Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203 a 221). A variação do comprimento das repetições pode ser detectada projetando-se iniciadores de PCR para as regiões de flanqueamento não repetitivas conservadas (Weber e May (1989) Am J Hum Genet. 44:388 a 396). SSRs são altamente adequados para mapeamento e MAS visto que são multialélicos, codominantes, reproduzíveis e propensos a automatização de produtividade alta (Rafalski et al. (1996) "Generating and using DNA markers in plants". Em: Non-mammalian genomic analysis: a practical guide. Academic press. páginas 75 a 135).

[0096] Vários tipos de marcadores SSR podem ser gerados, e perfis de SSR podem ser obtidos por eletroforese em gel dos produtos de amplificação. O escore de genótipo de marcador tem base no tamanho do fragmento amplificado.

[0097] Vários tipos de marcadores FLP também podem ser gerados. Muito comumente, iniciadores de amplificação são usados para gerar polimorfismos de comprimento de fragmento. Tais marcadores FLP são de muitas maneiras similares aos marcadores SSR, exceto pela região amplificada pelos iniciadores não ser tipicamente uma região altamente repetitiva. Adicionalmente, a região amplificada, Ou amplicon, terá variabilidade suficiente entre germoplasma, frequentemente devido a inserções ou deleções, de modo que os fragmentos gerados pelos iniciadores de amplificação podem ser distinguidos entre indivíduos polimórficos, e tais indels são conhecidos por ocorrerem frequentemente em milho (Bhattramakki et al. (2002). Plant Mol Biol 48, 539 a 547; Rafalski (2002b), supra).

[0098] Os marcadores SNP detectam substituições de nucleotídeos de pares de bases únicos. Dentre todos os tipos de marcador molecular, SNPs são os mais abundantes, tendo, desse modo, o potencial para fornecer a resolução de mapa genético mais alta (Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48:539 a 547). Os SNPs podem ser avaliados em um nível ainda mais alto de produtividade do que SSRs, de uma maneira chamada de “produtividade ultra-alta”, visto que SNPs não necessitam de quantidades grandes de DNA e a automatização do ensaio pode ser simples. Os SNPs também prometem ser sistemas de custo relativamente baixo. Esses três fatores juntos tornam SNPs altamente atrativos para uso em MAS. Estão disponíveis vários métodos para a genotipagem de SNPs, incluindo mas não se limitando a, hibridação, extensão de iniciadores, ligação de oligonucleotídeos, clivagen por nucleases, minissequenciamento e esferas codificadas. Tais métodos foram revistos em: Gut (2001) Hum Mutat 17 pp. 475 a 492; Shi (2001) Clin Chem 47, pp. 164 a 172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, pp. 95 a 100; e Bhattramakki e Rafalski (2001) "Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants". Em: R. J. Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford. Uma faixa ampla de tecnologias comercialmente disponíveis utiliza esses e outros métodos para interrogar SNPs incluindo Masscode.TM. (Qiagen), INVADERO. (Third Wave Technologies) e Invader PLUSO, SNAPSHOTO. (Applied Biosystems), TAQMANO. (Applied Biosystems) e BEADARRAYSEO. (Illumina).

[0099] Alguns SNPs juntos dentro de uma sequência, ou através de sequências ligadas, podem ser usados para descrever um haplótipo para qualquer genótipo particular (Ching et al. (2002), BMC Genet. 3:19 páginas Gupta et al. 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:329 a 333). Os haplótipos podem ser mais informativos do que SNPs únicos e podem ser mais descritivos de qualquer genótipo particular. Por exemplo, um SNP único pode ser o alelo “T” para uma linhagem ou variedade específica com resistência a doenças, mas o alelo “TI” também pode ocorrer na população de melhoramento sendo utilizada para progenitores recorrentes. Nesse caso, um haplótipo, por exemplo, uma combinação de alelos em marcadores SNP ligados, pode ser mais informativo. Depois de um haplótipo único ter sido atribuído a uma região cromossômica doadora, esse haplótipo pode ser usado nessa população ou qualquer seu subconjunto para determinar se um indivíduo tem um gene particular. Consulte, por exemplo, o documento WO2003054229. O uso de plataformas de detecção de marcadores de produtividade alta automatizadas conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica torna esse processo altamente eficiente e eficaz.

[0100] Muitos dos marcadores apresentados aqui podem ser prontamente usados como marcadores de polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) para selecionar o gene RppK. Com o uso de PCR, os iniciadores são usados para amplificar segmentos de DNA a partir de indivíduos (preferencialmente congênitos) que representam a diversidade da população de interesse. Os produtos de PCR são sequenciados diretamente em uma ou ambas as direções. As sequências resultantes são alinhadas e polimorfismos são identificados. os polimorfismos não são limitados a polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mas também incluem indels, CAPS, SSRs e VNTRs (número variável de repetições em tandem). Especificamente em relação às informações de mapa fino descritas no presente documento, uma pessoa pode usar prontamente as informações fornecidas no presente documento para obter SNPs —polimórficos adicionais (e outros marcadores) dentro da região amplificada pelos iniciadores aqui revelados. Os marcadores dentro da região de mapa descrita podem ser hibridados com BACs ou outras bibliotecas genômicas, ou eletronicamente alinhados com sequências de genoma, para encontrar sequências novas na mesma localização aproximada da dos marcadores descritos.

[0101] Além de SSRs, FLPs e SNPs, conforme descrito acima, outros tipos de marcadores moleculares também são amplamente usados, incluindo, mas sem limitação, marcadores de sequência expressas (ESTs), marcadores SSR derivados de sequências EST, DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPD), e outros marcadores à base de ácidos nucleicos.

[0102] Os perfis de isozima e características morfológicas ligadas também podem ser, em alguns casos, indiretamente usados como marcadores. Mesmo apesar de não detectarem diretamente diferenças de DNA, os mesmos são frequentemente — influenciados por diferenças genéticas específicas. Entretanto, os marcadores que detectam a variação de DNA são muito mais numerosos e polimórficos do que os marcadores de isozima ou morfológicos (Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1:3 a 8).

[0103] Os alinhamentos de sequência ou contigs também podem ser usados para encontrar sequências a montante ou a jusante dos marcadores específicos listados no presente documento. Essas sequências novas, próximas dos marcadores descritos no presente documento, são, então, usadas para descobrir e desenvolver marcadores funcionalmente equivalentes. Por exemplo, os mapas físicos e/ou genéticos diferentes são alinhados para localizar marcadores equivalentes não descritos nessa revelação, mas que estão dentro de regiões similares. Esses mapas podem estar dentro da espécie, ou até mesmo através de outras espécies que foram genética ou fisicamente alinhadas.

[0104] De modo geral, MAS usa marcadores polimórficos que foram identificados como tendo —“uma probabilidade significativa de cossegregação com um traço, tal como o traço de resistência a doenças. Se presume que tais marcadores mapeiam próximo de um gene ou genes que fornecem à planta seu fenótipo resistente a doenças, e são considerados como indicadores para o traço desejado, ou marcadores. As plantas são testadas quanto à presença de um alelo desejado no marcador, e se espera que as plantas contendo um genótipo desejado em um ou mais loci transfiram o genótipo desejado, juntamente com um fenótipo desejado, à sua progênie. Desse modo, as plantas com resistência a doença de SCR podem ser selecionadas detectando um ou mais alelos marcadores e, além disso, plantas da progênie derivadas de tais plantas também podem ser selecionadas. Desse modo, uma planta que contém um genótipo desejado em uma determinada região cromossômica (isto é, um genótipo associado a resistência a doenças) é obtida e, então, cruzada com outra planta. A progênie de tal cruzamento será, então, avaliada genotipicamente com o uso de um ou mais marcadores e as plantas da progênie com o mesmo genótipo em uma determinada região cromossômica serão, então, selecionadas como tendo resistência a doenças.

[0105] Os SNPs podem ser usados isoladamente ou em combinação (isto é, um haplótipo de SNP) para selecionar um alelo de gene resistente favorável associado a resistência à doença de SCR. Por exemplo, um haplótipo SNP no cromossomo QTL revelado no presente documento pode compreender: um "A" em SNPOOl (posição 201 da sequência de referência SEQ ID NO: 6), um "A" em SNPOO2 (posição 127 da sequência de referência SEQ ID NO: 7), um "C" em SNPOO3 (posição 143 da sequência de referência SEQ ID NO: 8), um "G" em S26 (posição 43 da sequência de referência SEQ ID NO: 1), um "A" em S27 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 2), um "C" em S-24-1 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S24-2 (posição 19 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "G" em S24-3 (posição 20 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S20-1 (posição 17 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-2 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-3 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "C" em S28-1 (posição 48 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-2 (posição 49 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "T" em S28-3 (posição 63 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "C" em S28-4 (posição 64 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-5 (posição 65 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-6 (posição 66 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "G" em SNPOO04 (posição 51 da sequência de referência SEQ ID NO: 9), um "A" em SNPOO5S (posição 39 da sequência de referência SEQ ID NO: 10), e um "A" em SNPOO6 (posição 23 da sequência de referência SEQ ID NO: 11) ou uma combinação dos mesmos.

[0106] O técnico versado na técnica esperará que possa haver sítios —“polimórficos adicionais em loci marcadores em e em torno de um marcador cromossômico identificado pelos métodos revelados no presente documento, em que um ou mais sítios polimórficos estão em desequilíbrio de ligação (LD) com um alelo em um ou mais dos sítios polimórficos no haplótipo e podem ser usados, desse modo, em um programa de seleção auxiliada por marcadores para introgressar um alelo de gene ou fragmento genômico de interesse. Dois alelos particulares em sítios polimórficos diferentes são ditos como estando em LD se a presença do alelo em um dos sítios tender a prever a presença do alelo no outro sítio no mesmo cromossomo (Stevens, Mol. Diag. 4:309 a 317 (1999)). Os loci marcadores podem ser localizados em cM, 2 cM ou 1 cM (em um mapa genético à base de meiose única) do traço de QTL de resistência a doenças.

[0107] O artesão versado entenderá que a frequência alélica (e, portanto, a frequência de haplótipo) pode diferir de uma reunião de germoplasma para outra. As reuniões de germoplasma variam devido a diferenças de maturidade, agrupamentos heteróticos, distribuição geográfica, etc. Como resultado, os SNPs e outros polimorfismos podem não ser informativos em algumas reuniões de germoplasma.

Composições de planta

[0108] As plantas identificadas, modificadas e/ou selecionadas por qualquer um dos métodos descritos acima também são de interesse.

Proteínas e Variantes e Fragmentos Das Mesmas

[0109] Os polipeptídeos Rppk são abrangidos pela revelação. "Polipeptídeo RppK " e "proteína RppK ", tal como aqui utilizado, refere-se indistintamente a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) com atividade de resistência a SCR e é suficientemente idêntico ao polipeptídeo RppK de SEQ ID NO:

14. Uma variedade de polipeptídeos RppK é contemplada.

[0110] “Suficientemente idêntico” é usado no presente documento para referência a uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 14%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência. Em algumas concretizações, a identidade de sequência é contra a sequência completa de um polipeptídeo. O termo "cerca de" quando usado no presente documento em contexto com identidade de sequência em porcentagem significa +/- 1,0%.

[0111] Uma "proteína recombinante" é usado aqui para referir uma proteína que já não está no seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira recombinante bacteriana ou de planta; uma proteína que é expressa a partir de um polinucleotídeo que foi editado relativamente à sua versão nativa; ou uma proteína que é expressa a partir de um polinucleotídeo em uma posição genômica diferente relativamente à sequência nativa.

[0112] “Substancialmente isento de material celular”, conforme usado no presente documento, refere-se a um polipeptídeo que inclui preparações de proteína que têm menos de cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não alvo (também denominada no presente documento como “proteína contaminante”).

[0113] "Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos de polipeptídeos ou polinucleotídeos compreendendo sequências suficientemente idênticas a um polipeptídeo ou polinucleotídeo de gene RppK, respectivamente, e que exibem resistência a doenças quando expressos em uma planta.

[0114] "Variantes", conforme usado no presente documento, se referem a proteínas ou polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos parental.

[0115] Em algumas concretizações, um polipeptídeo RppK compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com o comprimento completo ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, em que o polipeptídeo RppK tem resistência a SCR quando expresso em uma planta.

[0116] Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo RppK podem ser preparadas por meio de mutações no DNA. Isso pode ser também realizado por uma dentre diversas formas de mutagênese, tal como, por exemplo, tecnologia de quebra de fita dupla específica para sítio e/ou em evolução dirigida. Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes terão a atividade desejada. No entanto, é entendido que a capacidade de um polipeptídeo RppK para conferir resistência a doenças pode ser aprimorada pelo uso de tais técnicas nas composições desta revelação.

Moléculas de Ácidos Nucleicos e Variantes e Fragmentos das Mesmas

[0117] As moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes que compreendem sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos RppK ou porções biologicamente ativas dos mesmos, assim como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridação para identificar moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas com regiões de homologia de sequência são fornecidas. Conforme usado no presente documento, o termo "molécula de ácido nucleico" se refere a moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA, DNA genômico, DNA de plastídio, DNA mitocondrial) e moléculas de RNA (por exemplo, mMRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados com o uso de análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla, mas preferencialmente é DNA de fita dupla.

[0118] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" (ou DNA) é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro. Uma molécula de ácido nucleico (ou DNA) “recombinante” é usada no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico (ou DNA) que está em uma célula hospedeira bacteriana ou de planta recombinante; foi editada relativamente à sua sequência nativa; ou está localizada em uma localização diferente relativamente à sequência nativa. Em algumas concretizações, um ácido nucleico "isolado" ou "recombinante" está livre de sequências (preferentemente sequências que codificam proteínas) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (ou seja, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado. Para os propósitos da revelação, "isolado" ou "recombinante" quando usado para referir moléculas de ácido nucleico, exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias concretizações, as moléculas de ácido nucleico recombinante que codificam polipeptídeos de gene RppK podem conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de ácido nucleico que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula da qual o ácido nucleico é derivado.

[0119] Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica polipeptídeos RppK tem uma ou mais alterações na sequência de ácido nucleico em comparação com a sequência de ácido nucleico nativa ou genômica. Em algumas concretizações, a alteração na sequência de ácidos nucleicos nativa ou genômica inclui, mas sem limitação: alterações na sequência de ácidos nucleicos devido à degeneração do código genético; alterações na sequência de ácidos nucleicos devido à substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácido em comparação à sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais íntrons; deleção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante; e deleção da região não traduzida 5' e/ou 3' associada à sequência de ácido nucleico genômico. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo RppK é uma sequência não genômica.

[0120] Uma variedade de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos RppK ou proteínas relacionadas é contemplada. Esses polinucleotídeos são úteis para a produção de polipeptídeos RppK em células hospedeiras quando operacionalmente ligados a uma sequência promotora, de terminação de transcrição e/ou de poliadenilação adequada. Esses polinucleotídeos também são úteis como sondas para isolar polinucleotídeos homólogos ou substancialmente homólogos que codificam polipeptídeos RPppK ou proteínas relacionadas.

[0121] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo RppK é um polinucleotídeo que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 13; e variantes, fragmentos e complementos das mesmas. “Complemento" é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico que é suficientemente complementar a uma dada sequência de ácido nucleico para poder hibridar com a dada sequência de ácido nucleico para desse modo formar um dúplex estável. “Variantes de sequência de polinucleotídeo" é usado no presente documento para se referir a uma sequência de ácido nucleico que, exceto pela degenerescência do código genético, codifica o mesmo polipeptídeo.

[0122] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico codificadora do polipeptídeo RppK é uma sequência de ácido nucleico não genômico. Conforme usado no presente documento, uma "sequência de ácidos nucleicos não genômica" ou "molécula de ácido nucleico não genômica" ou "polinucleotídeo não genômico" se refere à uma molécula de ácido nucleico que tem uma ou mais alterações na sequência de ácidos nucleicos em comparação a uma sequência de ácidos nucleicos nativa ou genômica. Em algumas concretizações, a alteração para uma molécula de ácido nucleico nativa ou genômica inclui, porém sem limitação: alterações na sequência de ácidos nucleicos devido à degeneração do código genético; otimização da sequência de ácidos nucleicos para expressão em plantas; alterações na sequência de ácidos nucleicos para introduzir pelo menos uma substituição, inserção, deleção e/ou adição de aminoácido em comparação à sequência nativa ou genômica; remoção de um ou mais íntrons associados à sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de um ou mais íntrons heterólogos; deleção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante associadas à sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de uma ou mais regiões regulatórias a montante ou a jusante heterólogas; deleção da região não traduzida 5º e/ou 3' associada à sequência de ácidos nucleicos genômica; inserção de uma região não traduzida 5' e/ou 3' heteróloga; e modificação de um sítio de poliadenilação. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico não genômico é uma sequência de ácido nucleico sintético.

[0123] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo RppK revelado no presente documento é um polinucleotídeo não genômico que tem uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 713%, 74%, 75%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,

88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 13, em que o polipeptídeo RppK tem atividade de resistência a SCR quando expresso em uma planta.

[0124] Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico codifica uma variante do polipeptídeo RppK que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

[0125] Moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos dessas sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos RppK também são abrangidas pelas concretizações. “Fragmento", conforme usado no presente documento, se refere a uma porção da sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo RppK. Um fragmento de uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo RppK ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR com o uso dos métodos revelados abaixo. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo RppK compreendem pelo menos cerca de 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 400, 450, ou 500 nucleotídeos contíguos ou até ao número de nucleotídeos presentes em uma sequência de ácido nucleico de comprimento completo codificando um polipeptídeo RppK identificado pelos métodos revelados no presente documento, dependendo do uso destinado. “Nucleotídeos contíguos" é usado no presente documento para se referir a resíduos de nucleotídeo que são imediatamente adjacentes entre si. Os fragmentos das sequências de ácidos nucleicos das concretizações codificarão fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica do polipeptídeo de gene RppK e, por isso, retêm resistência a doenças. “Retêm resistência a doenças" é usado aqui para referir um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da resistência a doenças do polipeptídeo de polipeptídeo RppK completo como apresentado no SEQ ID NO:. 14.

[0126] “A porcentagem (%) de identidade de sequência” em relação a uma sequência de referência (sujeito) é determinada como a porcentagem de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em uma sequência candidata (consulta) que é idêntica aos resíduos de aminoácido respectivos ou nucleotídeos na sequência de referência, depois do alinhamento das sequências e da introdução de intervalos, se necessário, para se alcançar a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas de aminoácido como parte da identidade de sequência. O alinhamento com propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência pode ser alcançado de vários modos que estão dentro da habilidade da técnica, por exemplo, com o suo de software de computador publicamente disponível, tal como BLAST, BLAST-2. os indivíduos versados na técnica podem determinar parâmetros adequados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento das sequências que estão a ser comparadas. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (por exemplo, identidade percentual de sequência de busca = número de posições idênticas/número total de posições de sequência de busca x100).

[0127] Em algumas concretizações, um polinucleotídeo RppK codifica um polipeptídeo RppK que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ao longo do comprimento inteiro da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.

[0128] As concretizações também abrangem moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes de polipeptídeo RppK. “Variantes" das sequências de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos RppK incluem aquelas sequências que codificam os polipeptídeos de gene R identificados pelos métodos revelados no presente documento, mas que diferem conservativamente devido à degenerescência do código genético assim como aquelas que são suficientemente idênticas conforme discutido acima. Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com a utilização de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridação conforme descrito abaixo. As sequências de ácidos nucleicos variantes também incluem sequências de ácidos nucleicos sinteticamente derivadas que foram geradas, por exemplo, com o uso de mutagênese sítio-dirigida, mas que ainda codificam os polipeptídeos RppK revelados no presente documento.

[0129] O versado na técnica compreenderá ainda que podem ser introduzidas alterações por mutação das sequências de ácidos nucleicos, levando, assim, a alterações na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos RppK codificados, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Portanto, as moléculas de ácidos nucleicos variantes podem ser criadas introduzindo uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de nucleotídeos nas sequências de ácidos nucleicos correspondentes reveladas no presente documento, de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, como mutagênese dirigida a sítios e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de ácidos nucleicos variantes são também englobadas pela presente divulgação.

[0130] Alternativamente, as sequências de ácidos nucleicos variantes podem ser preparadas introduzindo mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados quanto à capacidade para conferir atividade com o propósito de identificar mutantes que retêm a atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de modo recombinante e a atividade da proteína pode ser determinada com o uso de técnicas de ensaio padrão.

[0131] os polinucleotídeos da divulgação e fragmentos dos mesmos são opcionalmente usados como substratos para uma variedade de reações de recombinação e recombinação recursiva, além de métodos de clonagem padrão,

conforme estabelecido, por exemplo, em Ausubel, Berger e Sambrook, isto é, para produzir homólogos de polipeptídeos adicionais e fragmentos dos mesmos com propriedades desejadas. Uma variedade de tais reações é conhecida. Métodos para produzir uma variante de qualquer ácido nucleico listado no presente documento compreendendo recombinar recursivamente tal polinucleotídeo com um segundo polinucleotídeo (ou mais), formando, assim, uma biblioteca de polinucleotídeos variantes, são também concretizações da divulgação, assim como as bibliotecas produzidas, as células que compreendem as bibliotecas e qualquer polinucleotídeo recombinante produzido por tais métodos. Adicionalmente, tais métodos compreendem opcionalmente selecionar um polinucleotídeo variante de tais bibliotecas com base na atividade, em que tal combinação recursiva é feita in vitro ou in vivo.

[0132] Uma variedade de protocolos geradores de diversidade, incluindo protocolos de recombinação recursiva de ácido nucleico, está disponível e completamente descrita na técnica. Os procedimentos podem ser usados separadamente e/ou em combinação para produzir uma ou mais variantes de um ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, assim como variantes de proteínas codificadas. Individual e coletivamente, esses procedimentos fornecem maneiras amplamente aplicáveis e robustas para gerar ácidos nucleicos diversificados e conjuntos de ácidos nucleicos (incluindo, por exemplo, bibliotecas de ácido nucleico) úteis, por exemplo, para a projeção ou evolução rápida de ácidos nucleicos, proteínas, vias, células e/ou organismos com características novas e/ou melhoradas.

Embora distinções e classificações sejam feitas no decorrer da discussão por motivos de clareza, será notado que as técnicas normalmente não são mutuamente exclusivas. De fato, os vários métodos podem ser usados isoladamente ou em combinação, em paralelo ou em série, para acessar diversas variantes de sequência.

[0133] O resultado de qualquer um dos procedimentos de geração de diversidade descritos no presente documento pode ser a geração de um ou mais ácidos nucleicos, os quais podem ser selecionados ou triados quanto a ácidos nucleicos com ou que conferem propriedades desejáveis ou que codificam proteínas com ou que conferem propriedades desejáveis. Após a diversificação por um ou mais dos métodos no presente documento ou disponíveis de outro modo para uma pessoa versada na técnica, quaisquer ácidos nucleicos que sejam produzidos podem ser selecionados quanto a uma atividade ou propriedade desejada, por exemplo, tal atividade a um pH desejado, etc. Isso pode incluir identificar qualquer atividade que possa ser detectada, por exemplo, em um formato automatizado ou automatizável, por qualquer um dentre os ensaios da técnica. Uma variedade de propriedades relacionadas (ou até mesmo não relacionadas) pode ser avaliada, em série ou em paralelo, a critério do praticante.

[0134] As sequências de nucleotídeos das concretizações “podem ser tambén “usadas para isolar sequências correspondentes de uma fonte diferente. Dessa maneira, métodos como PCR, hibridação e similares podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua homologia de sequência com as sequências identificadas pelos métodos revelados no presente documento. As sequências que são selecionadas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras apresentadas no presente documento ou com os fragmentos das mesmas são abrangidas pelas concretizações. Tais sequências incluem sequências que são ortólogos das sequências. O termo "ortólogos" se refere a genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como resultado da especiação. Os genes encontrados em espécies diferentes são considerados ortólogos quando suas sequências de nucleotídeo e/ou suas sequências de proteínas codificadas compartilham identidade substancial, conforme definido em outra parte no presente documento.

[0135] Em uma abordagem de PCR, os iniciadores oligonucleotídicos podem ser projetados para o uso em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem por PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2º edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), daqui em diante no presente documento, "Sambrook". Consultar também Innis, et al., editores (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, editores (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, editores (1999) PCR Methods

Manual (Academic Press, Nova Iorque). Métodos conhecidos de PCR incluem, porém não se limitam, aos métodos que usam iniciadores pareados, iniciadores aninhados, iniciadores únicos específicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de gene, iniciadores específicos de vetor, iniciadores parcialmente não correspondidos e semelhantes.

[0136] Em métodos de hibridação, toda ou parte da sequência de ácido nucleico pode ser usada para triar bibliotecas de cDNA ou genômicas. Métodos para construção de tais bibliotecas de cDNA e genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser identificadas com um grupo detectável, como 32P ou qualquer outro marcador detectável, como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático. As sondas para hibridação podem ser produzidas marcando-se oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências de ácidos nucleicos codificadoras de polipeptídeos conhecidas reveladas no presente documento. Iniciadores degenerados projetados com base em nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos conservados na sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos codificada podem adicionalmente ser usados. A sonda compreende tipicamente uma região de sequência de ácido nucleico que hibrida sob condições estringentes com pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos de sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ou um fragmento ou variante dos mesmos. Os métodos para a preparação de sondas para condições de hibridação e estringência são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e Russell, (2001), supra.

Construtos de Nucleotídeos, Cassetes de Expressão e Vetores

[0137] O uso do termo "construtos de nucleotídeos" no presente documento não é destinado a limitar as concretizações aos construtos de nucleotídeos que compreendem DNA. Os habitualmente peritos na técnica reconhecerão que construtos de nucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos compostos por ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, podem também ser empregues nos métodos aqui revelados. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das concretizações abrangem adicionalmente todas as formas complementares de tais construtos, moléculas e sequências. Adicionalmente, os construtos de nucleotídeos, moléculas de nucleotídeos e sequências de nucleotídeos das concretizações abrangem todos os construtos, moléculas e sequências de nucleotídeos que podem ser empregues nos métodos das concretizações para transformação de plantas incluindo, mas não se limitando a, aqueles compreendidos por desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e combinações dos mesmos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas de ocorrência natural como análogos sintéticos. Os construtos de nucleotídeos, ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeos das concretizações também abrangem todas as formas de construtos de nucleotídeos incluindo, mas sem limitação, formas de fita única, formas de fita dupla, grampos, estruturas de haste e alça e semelhantes.

[0138] Uma concretização adicional se refere a um organismo transformado, como um organismo selecionado dentre células de plantas, bactérias, levedura, baculovírus, protozoários, nematódeos e algas. O organismo transformado compreende uma molécula de DNA das concretizações, um cassete de expressão que compreende a molécula de DNA ou um vetor que compreende o cassete de expressão, o qual pode ser incorporado de modo estável no genoma do organismo transformado.

[0139] As sequências das concretizações são fornecidas em construtos de DNA para expressão no organismo de interesse. O construto incluirá sequências regulatórias 5' e 3' ligadas de maneira funcional a uma sequência das concretizações. O termo “ligado de maneira funcional”, conforme usado no presente documento, se refere a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. De modo geral, ligado de maneira funcional significa que as sequências de ácidos nucleicos que estão ligadas são contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões de codificação de proteína no mesmo quadro de leitura. O construto pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo.

Alternativamente, o gene ou (genes) adicional pode ser proporcionado em múltiplos construtos de DNA.

[0140] Tal construto de DNA é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição para que a inserção da sequência genética do polipeptídeo da revelação fique sob regulação de transcrição das regiões reguladoras. [) construto de DNA pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis.

[0141] O construto de DNA incluirá geralmente, na direção de 5' para 3' de transcrição: uma região de iniciação de transcrição e tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA das concretizações, e uma região de terminação de transcrição e de tradução (isto é, região de terminação) funcional no organismo que serve como um hospedeiro. A região de iniciação de transcrição (isto é, o promotor) pode ser nativa, análoga, estranha ou heteróloga ao organismo hospedeiro e/ou à sequência das concretizações. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. o termo "estranho(a)", conforme usado no presente documento, indica que o promotor não é encontrado no organismo nativo no qual o promotor é introduzido. Quando o promotor for "estranho" ou "heterólogo" à sequência das concretizações, se pretende que o promotor não seja o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência ligada de maneira funcional das concretizações. Tal como aqui utilizado, um gene quimérico compreende uma sequência de codificação ligada de maneira funcional a uma região de iniciação da transcrição que é heteróloga à sequência de codificação. Quando o promotor é uma sequência nativa ou natural, a expressão da sequência ligada de maneira funcional é alterada a partir da expressão de tipo selvagem, o que resulta em uma alteração do fenótipo.

[0142] Em algumas concretizações, o construto de DNA compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo RppK das concretizações. Em algumas concretizações, O construto de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão que compreende um polipeptídeo RppK das concretizações.

[0143] Em algumas concretizações, o construto de DNA também pode incluir uma sequência intensificadora da transcrição. Conforme usado no presente documento, o termo um "intensificador" se refere a uma sequência de DNA que pode estimular a atividade promotora e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para acentuar o nível ou a especificidade para tecidos de um promotor. Vários intensificadores são conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, íntrons com propriedades de intensificação de expressão de gene em plantas (Publicação de Pedido de Patente Número US 2009/0144863, o íntron de ubiquitina (isto é, o íntron de ubiquitina de milho 1 (consulte, por exemplo, sequência de NCBI S94464)), o intensificador ômega ou o intensificador de iniciador ômega (Gallie, et al., (1989) "Molecular Biology of RNA" editora Cech (Liss, Nova York) 237 a 256 e Gallie, et al., (1987) Gene 60:217 a 225), o intensificador de CaMV 35S (consulte, por exemplo, Benfey, et al., (1990) EMBO J. 9:1.685 a 1.696) e os intensificadores de Patente número US 7.803.992 também podem ser usados. A lista acima de intensificadores de transcrição não é destinada a ser limitante. Qualquer intensificador de transcrição apropriado pode ser usado nas concretizações.

[0144] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse operacionalmente ligada, pode ser nativa com o hospedeiro vegetal ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, a sequência de interesse, hospedeiro vegetal, ou qualquer combinação destes).

[0145] As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consultar também, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 a 144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671 a 674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1.261 a 1.272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151 a 158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7.891 a 7.903 e Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9.627 a 9.639.

[0146] Quando adequado, um ácido nucleico pode ser otimizado para aumentar a expressão no organismo hospedeiro. Portanto, quando o organismo hospedeiro for uma planta, os ácidos nucleicos sintéticos podem ser sintetizados utilizando códons preferenciais para plantas para uma expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11 quanto a uma discussão sobre o uso preferido de hospedeiros. Por exemplo, embora as sequências de ácidos nucleicos das concretizações possam ser expressas em espécies de planta tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, as sequências podem ser modificadas de modo a representar as preferências específicas e as preferências de teor de GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, uma vez que se demonstrou que essas preferências diferem (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a 498). Assim, a planta preferencial para um aminoácido particular pode ser derivada de sequências de genes conhecidas de plantas.

[0147] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por acentuarem a expressão de genes em um hospedeiro celular. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítio de encadeamento éxon-íntron, repetições semelhantes a transposons e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão de genes. O teor de GC da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado em referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. O termo "célula hospedeira", conforme usado aqui, se refere a uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão pretendida. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como E. coli, ou células eucarióticas, como células de levedura, inseto, anfíbio ou mamífero ou células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Um exemplo de uma célula hospedeira monocotiledônea é uma célula hospedeira de milho. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mMRNA secundárias em forma de grampo previstas.

[0148] Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Com essa finalidade, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Para esse propósito, mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, anelamento, ressubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.

[0149] Alguns promotores podem ser usados na prática das concretizações. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferenciais para tecidos, induzíveis ou outros para expressão no organismo hospedeiro.

Transformação de Planta

[0150] os métodos das concretizações envolvem introduzir um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. "Introduzir" significa, conforme usado no presente documento, apresentar à planta o polinucleotídeo ou polipeptídeo de tal maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos das concretizações não dependem de um método específico para introduzir um polinucleotídeo ou polipeptídeo em uma planta, apenas que o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) ou o polipeptídeo (ou polipeptídeos) ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) ou polipeptídeo (ou polipeptídeos) em plantas são conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente e métodos mediados por vírus.

[0151] “Transformação estável”, conforme usado no presente “documento, significa que o construto de nucleotídeos introduzido em uma planta integra o genoma da planta e tem capacidade para ser herdado pela progênie da mesma. "Transformação transiente" significa, conforme usado no presente documento, que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta. "Planta" se refere, conforme usado no presente documento, a plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de plantas, propágulos, embriões e progênie dos mesmos. As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura em suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floema e pólen).

[0152] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, alvejada para transformação. Métodos adequados para introduzir sequências de nucleotídeos em células de plantas e inserção subsequente no genoma de plantas incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320 a 334),

eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602 a 5606), transformação mediada por Agrobacterium (Patentes nºº U.S. 5.563.055 e 5.981.840), transferência de genes direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO JJ. 3:2717 a 2722) e aceleração balística de partículas (consultar, por exemplo, Patentes nº*º U.S. 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244 e

5.932.782; Tomes, et al., (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips, (Springer-Verlag, Berlin) e McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923 a 926) e transformação Lecl (WO 00/28058). Para transformação de batata, consultar Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829 a 838 e Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71 a 78. Os procedimentos de transformação adicionais podem ser encontrados em Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer e McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319 a 324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305 a 4309 (milho); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (milho); Patentes US números 5.240.855; 5,322,783 e 5,324,646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (milho); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; Patente US número 5.736.369 (cereais); Bytebier, et al.,

(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345 a 5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, Nova Iorque), páginas 197 a 209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por fibras); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495 a 1505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (milho por meio de Agrobacterium tumefaciens).

Métodos para Introduzir Tecnologias de Edição de Genoma em Plantas

[0153] Em algumas concretizações, as composições de polinucleotídeos podem ser introduzidas no genoma de uma planta com o uso de tecnologias de edição de genoma, ou polinucleotídeos anteriormente introduzidos no genoma de uma planta podem ser editados com o uso de tecnologias de edição de genoma. Por exemplo, os polinucleotídeos identificados podem ser introduzidos em uma localização desejada no genoma de uma planta através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, tais como TALENs, meganucleases, nucleases dedos de zinco, CRISPR-Cas e similares. Por exemplo, os polinucleotídeos identificados podem ser introduzidos em uma localização desejada em um genoma com o uso de um sistema CRISPR-Cas, para o propósito de inserção específica para sítios. A localização desejada em um genoma de planta pode ser qualquer local-alvo desejado para inserção, tal como uma região genômica favorável para melhoramento, ou pode ser um local-alvo localizado em uma janela genômica com um traço de interesse existente. Os traços de interesse existentes podem ser um traço endógeno ou um traço anteriormente introduzido.

[0154] Em algumas concretizações, quando um alelo de gene RppK de resistência a RppK tiver sido identificado em um genoma, tecnologias de edição do genoma podem ser usadas para alterar ou modificar a sequência de polinucleotídeos. As modificações específicas para sítios que podem ser introduzidas no polinucleotídeo de alelo de gene RppK reveladas incluem aqueles produzidas com o uso de qualquer método para introduzir a modificação específica para sítios, incluindo, mas sem limitação, através do uso de oligonucleotídeos de reparo de genes (por exemplo, Publicação nº US 2013/0019349), ou através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, como TALENs, meganucleases, nucleases dedos de zinco, CRISPR-Cas e semelhantes. Tais tecnologias podem ser usadas para modificar o polinucleotídeo anteriormente introduzido através de inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos dentro do polinucleotídeo introduzido. Alternativamente, tecnologias de quebra de fita dupla podem ser usadas para adicionar sequências de nucleotídeos adicionais ao polinucleotídeo introduzido. As sequências adicionais que podem ser adicionadas incluem elementos de expressão adicionais, tal como sequências intensificadoras e promotoras. Em outra modalidade, tecnologias de edição do genoma podem ser usadas para posicionar proteínas resistentes a doenças adicionais de modo próximo das composições de polinucleotídeos de gene RppK dentro do genoma de uma planta, a fim de gerar empilhamentos moleculares de proteínas resistentes a doenças.

[0155] Um “sítio-alvo alterado”, “sequência-alvo alterada”, “sítio-alvo modificado” e “sequência-alvo modificada” são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo conforme revelado no presente documento que compreende pelo menos uma alteração em comparação com a sequência-alvo não alterada. Tais “alterações” incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).

EXEMPLOS

[0156] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, a matéria reivindicada. É entendido que os exemplos e concretizações descritos no presente documento têm apenas propósitos ilustrativos, e pessoas versadas na técnica reconhecerão vários reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem se afastar do espírito da revelação ou do escopo das reivindicações anexas.

Exemplo 1. Identificação de um QTL de resistência principal a SCR do K22 e Mapeamento Fino de RppK

[0157] A ferrugem polissora (SCR), causada pelo patógeno biotrófico Puccinia polysora , é uma doença importante em muitas regiões de cultivo de milho. Condições de alta temperatura e umidade geralmente favorecem o desenvolvimento de SCR. A gravidade da SCR em experimentos de campo é avaliada por inspeção visual 3-4 semanas após a polinização, usando a escala de nove pontos, sendo 1 o mais

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para identificar uma planta com maior resistência à ferrugem polissora caracterizado pelo fato de que compreende: a. detectar na planta um alelo de gene resistente associado à maior resistência à ferrugem polissora, em que o dito alelo de gene resistente compreende um "A" em SNPOOl (posição 201 da sequência de referência SEQ ID NO: 6), um "A" em SNPOO02 (posição 127 da sequência de referência SEQ ID NO: 7), um "C" em SNPOO03 (posição 143 da sequência de referência SEQ ID NO: 8), um "G" em S26 (posição 43 da sequência de referência SEQ ID NO: 1), um "A" em S27 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 2), um "C" em S-24-1 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S24-2 (posição 19 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "G" em S24-3 (posição 20 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S20-1 (posição 17 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-2 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-3 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "C" em S28-1 (posição 48 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-2 (posição 49 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "T" em S28-3 (posição 63 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "C" em S28-4 (posição 64 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-5 (posição 65 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-6 (posição 66 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "G" em SNPOO04 (posição 51 da sequência de referência SEQ ID NO: 9), um "A" em SNPOO5S (posição 39 da sequência de referência SEQ ID NO: 10), ou um "A" em SNPO06 (posição 23 da sequência de referência SEQ ID NO: 11); e b. identificar a planta como tendo o alelo QOTL, em que a dita planta tem maior resistência à ferrugem polissora.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a contrasseleção da planta a partir de um programa de melhoramento.

3. Método para identificar uma planta com maior resistência a ferrugem polissora caracterizado pelo fato de que compreende: a. detectar no genoma de uma planta qualquer um dos seguintes: i. um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14; ii. um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:14; iii. um polinucleotídeo que compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:13; iv. um polinucleotídeo que compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO: 12; ou v. um ou mais alelos marcadores dentro de 5 cM de (i) ou (ii) que estão ligados e associados a (i) ou (ii); e b. identificar uma planta como tendo maior resistência à ferrugem polissora, se qualquer um dentre (i), (ii) ou (iii) for detectado.

4. Método para aumentar a resistência à ferrugem polissora em uma planta caracterizado pelo fato de que compreende expressar em uma planta um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14; em que a planta que expressa o polipeptídeo recombinante tem maior resistência à ferrugem polissora na planta quando comparada a uma planta de controle que não compreende o polinucleotídeo recombinante.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo recombinante compreende adicionalmente um promotor heterólogo.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente obter uma planta de progênie derivada da planta que expressa o polinucleotídeo recombinante, em que a dita planta de progênie compreende em seu genoma o polinucleotídeo recombinante e exibe maior resistência à ferrugem polissora em comparação a uma planta de controle que não compreende o polinucleotídeo recombinante.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita planta é selecionada a partir do grupo que consiste em: Arabidopsis, milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, milheto, cana-de-açúcar e switchgrass.

8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma monocotiledônea.

9. Método para identificar uma variante do gene RppK que proporciona às plantas maior resistência à ferrugem polissora caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a. combinar por meio de embaralhamento de genes uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um ou mais fragmentos de SEQ ID NO: 14, uma proteína que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14, ou um fragmento deste, para gerar variantes do gene RppK; e b. identificar uma variante que exibe a maior resistência à ferrugem polissora.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente as etapas de: a. introduzir em uma célula vegetal regenerável um construto recombinante que compreende a variante do gene RppK identificado pelo método conforme definido na reivindicação 9; b. regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal regenerável após a etapa (a), em que a planta transgênica compreende em seu genoma o construto de DNA recombinante; e ce. selecionar uma planta transgênica de (b), em que a planta transgênica compreende o construto de DNA recombinante e exibe maior resistência à ferrugem polissora, quando comparada a uma planta de controle que não compreende o construto de DNA recombinante.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a dita planta é selecionada a partir do grupo que consiste em: Arabidopsis, milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, milheto, cana-de-açúcar e switchgrass.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma monocotiledônea.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a dita monocotiledônea é milho.

14. Método para identificar uma variante alélica do gene RppK, em que a dita variante alélica está associada a uma maior tolerância à ferrugem polissora caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: a. obter uma população de plantas, em que as ditas plantas exibem níveis diferentes de resistência à ferrugem polissora; b. avaliar variações alélicas em relação à sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína compreendendo SEQ ID NO: 14, ou na região genômica que regula a expressão do polinucleotídeo que codifica a proteína; ce. associar as variações alélicas com maior resistência à ferrugem polissora; e d. identificar uma variante alélica que está associada à maior resistência à ferrugem polissora.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente detectar a dita variante alélica associada à maior resistência à ferrugem polissora e selecionar uma planta se a dita variante alélica for detectada.

16. Método para introduzir uma variante alélica de um gene RppK em que a dita variante alélica está associada à maior resistência à ferrugem polissora caracterizado pelo fato de que o método compreende introduzir uma mutação no gene RppK endógeno de modo que a variante alélica compreenda uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14, usando nuclease dedo de zinco, Nuclease Efetora similar a Ativador da Transcrição (TALEN), o sistema CRISPR/Cas ou meganuclease.

17. Construto de DNA recombinante caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência, em comparação à SEQ ID NO: 14.

18. Construto de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita pelo menos uma sequência reguladora é um promotor funcional em uma célula vegetal.

19. Construto de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13.

20. Célula de planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende o construto de DNA recombinante conforme definido na reivindicação 17.

21. Planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende a célula vegetal transgênica conforme definida na reivindicação 20.

22. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a dita planta transgênica é selecionada a partir do grupo que consiste em: Arabidopsis, milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, milheto, cana-de-açúcar e switchgrass.

23. Semente transgênica caracterizada pelo fato de que é produzida a partir da planta transgênica conforme definida na reivindicação 21.

24, Método para identificar e/ou selecionar uma planta que tem maior resistência à ferrugem polissora caracterizado pelo fato de que compreende: a. realizar uma triagem de uma população com um marcador localizado dentro de um intervalo no cromossomo 10 que compreende e é flanqueado por RRD40 e RRD26 para determinar se uma ou mais plantas da população compreende um alelo gênico que compreende "A" em SNPOO0l (posição 201 da sequência de referência SEQ ID NO: 6), um "A" em SNPOO2 (posição 127 da sequência de referência SEQ ID NO: 7), um "C" em SNPOO3 (posição 143 da sequência de referência SEQ ID NO: 8), um "G" em S26 (posição 43 da sequência de referência SEQ ID NO: 1), um "A" em S27 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 2), um "C" em S-24-1 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S24-2 (posição 19 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "G" em S24-3 (posição 20 da sequência de referência SEQ ID NO: 3), um "C" em S20-1 (posição 17 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-2 (posição 18 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "T" em S20-3 (posição 21 da sequência de referência SEQ ID NO: 4), um "C" em S28-1 (posição 48 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-2 (posição 49 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "T" em S28-3 (posição 63 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "C" em S28-4 (posição 64 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-5 (posição 65 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "A" em S28-6 (posição 66 da sequência de referência SEQ ID NO: 5), um "G"

em SNPO04 (posição 51 da sequência de referência SEQ ID NO: 9), um "A" em SNPOO5 (posição 39 da sequência de referência SEQ ID NO: 10), ou um "A" em SNPOO06 (posição 23 da sequência de referência SEQ ID NO: 11); e a. selecionar a partir da dita população pelo menos uma planta que compreende o alelo gênico.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende: b. cruzar a planta de (b) a uma segunda planta; e ce. obter uma planta de progênie que tem o alelo gênico.

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