DE69233118T2

DE69233118T2 - Fettsäure-desaturase gene aus pflanzen

Info

Publication number: DE69233118T2
Application number: DE69233118T
Authority: DE
Inventors: John Browse; Perez Luis GRAU; J. Anthony KINNEY; W. John PIERCE; M. Anna WIERZBICKI; S. Narendra YADAV
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1991-12-04
Filing date: 1992-12-03
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2012-12-04
Also published as: DK0616644T3; AU675923B2; AU3228893A; JPH07501701A; EP0616644A1; CA2124673A1; WO1993011245A1; EP0616644B1; CA2124673C; US20090205066A1; DE69233118D1; US5952544A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von Nucleinsäwefragmenten, kodierend Fettsäure-Desaturase-Enzyme, um die Lipidzusammensetzung von Pflanzen zu modifizieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Pflanzenlipide haben eine Vielfalt von industriellen und ernährungsmäßigen Anwendungen und sind zentral für Pflanzenmembranfunktion und klimatische Anpassung. Diese Lipide stellen eine umfangreiche Gruppe chemischer Strukturen dar, und diese Strukturen bestimmen die physiologischen und industriellen Eigenschaften des Lipids. Viele von diesen Struktwen ergeben sich entweder direkt oder indirekt aus Stoffwechselvorgängen, die den Grad von Ungesättigtheit des Lipids verändern. Unterschiedliche Stoffwechselregimes in unterschiedlichen Pflanzen erzeugen diese veränderten Lipide, und gewöhnlich ist entweder Domestizierung exotischer Pflanzenspezies oder Modifizierung agronomisch angepaßter Spezies erforderlich, um ökonomisch große Mengen des gewünschten Lipids zu erzeugen.
Pflanzenlipide finden ihre Hauptverwendung als Speiseöle in der Form von Triacylglycerolen. Die speziellen Leistungs- und Gesundheitsmerkmale von Speiseölen werden in großem Maße durch ihre Fettsäwezusammensetzung bestimmt. Die meisten aus kommerziellen Pflanzenvarietäten erhaltenen Pflanzenöle bestehen in erster Linie aus Palmitin- (16 : 0), Stearin- (18 : 0), Olein- (18 : 1), Linolein- (18 : 2) und Linolen-(18 : 3)-säure. Palmitin- und Stearinsäure sind jeweils 16 und 18 Kohlenstoffatome lange, gesättigte Fettsäuren. Olein-, Linolein- und Linolensäwe sind 18 Kohlenstoffatome lange, ungesättigte Fettsäwen, die eine, zwei bzw. drei Doppelbindungen enthalten. Oleinsäure wird als einfach ungesättigte Fettsäure bezeichnet, während Linolein- und Linolensäure als mehrfach ungesättigte Fettsäuren bezeichnet werden. Die relativen Mengen von gesättigten und ungesättigten Fettsäwen in gewöhnlich verwendeten, pflanzlichen Speiseölen sind nachstehend zusammengefaßt (Tabelle 1):
Prozentsätze von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren in den Ölen von ausgewählten Ölfrüchten TABELLE 1
Viele neuere Forschungsarbeiten haben die Rolle untersucht, die gesättigte und ungesättigte Fettsäwen bei der Veningerung des Risikos koronarer Herzkrankheit spielen. In der Vergangenheit wurde angenommen, daß einfach ungesättigte Verbindungen, im Gegensatz zu gesättigten Verbindungen und mehrfach ungesättigten Verbindungen, keine Wirkung auf Serumcholesterin und das Risiko koronarer Herzkrankheit hatten. Verschiedene neuere klinische Untersuchungen an Menschen lassen vermuten, daß Diäten, die hoch an einfach ungesättigtem Fett und niedrig an gesättigtem Fett sind, das "schlechte" (Lipoprotein niedriger Dichte) Cholesterin verringern können, während das "gute" (Lipoprotein hoher Dichte) Cholesterin aufrechterhalten wird (Mattson et al., Journal of Lipid Research (1985) 26: 194–202) Ein Pflanzenöl, das insgesamt gering an gesättigten Verbindungen und hoch an einfach ungesättigten Verbindungen ist, würde signifikante Gesundheitsvorteile für Verbraucher ebenso wie ökonomische Vorteile für Ölhersteller bereitstellen. Beispielsweise wird Canolaöl als sehr gesundes Öl angesehen. Jedoch macht beim Gebrauch das hohe Niveau von mehrfach ungesättigten Fettsäwen in Canolaöl das Öl unstabil, leicht oxidiert und anfällig für die Entwicklung von unangenehmem Geruch und Geschmack (Gailliard, 1980, Bd. 4, S. 85–116 in: Stumpf, P. K., Hrsg., The Biochemistry of Plants (Die Biochemie von Pflanzen), Academic Press, New York). Die Niveaus von mehrfach ungesättigten Verbindungen können durch Hydrierung verringert werden, aber die Kosten dieses Verfahrens und die begleitende Erzeugung ernährungsmäßig fragwürdiger trans-Isomere der verbliebenen ungesättigten Fettsäuren verringern insgesamt die Erwünschtheit des hydrierten Öls (Mensink et al., New England J. Medicine (1990) N323: 439–445). Ähnliche Probleme existieren mit Sojabohnen- und Maisölen.
Für spezialisierte Anwendungen können hohe Niveaus von mehrfach ungesättigten Verbindungen wünschenswert sein. Linoleat und Linolenat sind essentielle Fettsäuren in menschlichen Nahrungsmitteln, und ein Speiseöl, das eine hohe Konzentration an diesen Fettsäwen hat, kann für Nahrungsmittelergänzungen, zum Beispiel in Babynahrung, verwendet werden. Leinsamenöl, erhalten aus der Flachspflanze (Linum usitatissimum), enthält mehr als 50% Linolensäure und hat weitverbreitete Anwendung in häuslichen und industriellen Beschichtungen, da die Doppelbindungen der Fettsäuren schnell mit Sauerstoff reagieren, wobei sie zu einem weichen und biegsamen Film polymerisieren. Obwohl der Ölgehalt von Flachs mit Canola vergleichbar ist (um 40% des Trockengewichts des Samens), werden hohe Erträge nur bei warmen Temperaturen oder in subtropischen Klimagebieten erhalten. In den USA ist Flachs in hohem Maße für Rostinfektion anfällig. Es wird kommerziell nützlich sein, wenn eine Feldflucht wie beispielsweise Sojabohne oder Canola durch das (die) passende(n) Desaturase-Gene) genetisch umgewandelt werden könnte, um Öle mit einem hohen Linolensäuregehalt zu synthetisieren.
Programme zur Mutationszüchtung haben einigen Erfolg dabei gehabt, die Niveaus von mehrfach ungesättigter Fettsäure, die in den Speiseölen agronomischer Spezies gefunden werden, zu verändern. Beispiele von kommerziell gezüchteten Varietäten sind Sonnenblume mit hohem (85%) Oleingehalt und Flachs mit geringem (2%) Linolengehalt (Knowles, (1980) S. 35–38 In: Applewhite, T. H., Hrsg., World Conference on Biotechnology for the Fats and Oils Industry Proceedings, American Oil Chemists" Society). Ähnlicher kommerzieller Fortschritt mit den anderen in Tabelle 1 angegebenen Pflanzen ist in großem Maße schwer zu fassen gewesen, zurückzuführen auf die schwierige Natur der Verfahrensweise und die pleiotropen Wirkungen des Mutationsregimes auf Lebensfähigkeit und Ertragspotential der Pflanzen.
Die Biosynthese der hauptsächlichen Pflanzenlipide ist der Fokus vieler Forschungsarbeiten gewesen (Browse et al., Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. (1991) 42: 467–506). Diese Untersuchungen zeigen, daß, mit der beachtenswerten Ausnahme der löslichen Stearoylacyl-Trägerprotein-Desaturase, die kontrollierenden Schritte in der Erzeugung von ungesättigten Fettsäuren in großem Maße durch Membranassozüerte Fettsäure-Desaturasen katalysiert werden. Desaturationsreaktionen kommen in Plastiden und in dem endoplasmatischen Retikulum unter Verwendung einer Vielfalt von Substraten einschließlich Galactolipiden, Sulfolipiden und Phospholipiden vor. Genetische und physiologische Analysen nuclearer Mutanten von Arabidopsis thaliana, denen verschiedene Fettsäwedesaturationsreaktionen fehlen, zeigen an, daß die meisten von diesen Reaktionen von Enzymen, kodiert an einzelnen genetischen Loci in der Pflanze, katalysiert werden. Die Analysen zeigen weiterhin, daß die unterschiedlichen Defekte in der Fettsäuredesaturation profunde und unterschiedliche Wirkungen auf die ultrastruktwelle Morphologie, Kälteempfindlichkeit und photosynthetische Kapazität der Pflanzen haben können (Ohlrogge et al., Biochim. Biophys. Acta (1991) 1082: 1–26). Jedoch ist die biochemische Charakterisierung der Desaturase-Reaktionen dürftig gewesen. Die Instabilität der Enzyme und die Unlenksamkeit ihrer ordnungsgemäßen Prüfung hat Forscher in großem Maße auf Untersuchungen von Enzymaktivitäten in rohen Membranzubereitungen begrenzt. Diese Untersuchungen haben jedoch die Rolle von delta-l2-Desatwaseund delta-15-Desaturase-Aktivitäten bei der Erzeugung von Linoleat und Linolenat aus 2-Oleoylphosphatidylcholin bzw. 2-Linoleoylphosphatidylcholin demonstriert (Wang et al., Plant Physiol. Biochem. (1988) 26: 777–792). So stellt die Modifizierung der Aktivitäten dieser Enzyme ein attraktives Ziel für die Veränderung der Niveaus der Lipidungesättigtheit durch genetische Bearbeitung dar.
Gene aus Pflanzen für Stearoylacyl-Trägerprotein-Desatwase, die einzige bekannte lösliche Fettsäure-Desaturase, sind beschrieben worden (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 2578–2582; Shanklin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 2510–2514). Stearoyl-Coenzym-A-Desatwase-Gene von Hefe, Ratte und Maus sind ebenfalls beschrieben worden (Stukey et al., J. Biol. Chem. (1990) 265: 20144–20149; Thiede et al., J. Biol. Chem. (1986) 261: 13230–13235; Kaestner et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 14755–1476). Es existiert kein Anzeichen in der allgemein bekannten Technik, das die Isolation anderer Fettsäwe-Desaturasen als Stearoyl-ACP-Desatwasen aus höheren Pflanzen oder ihren entsprechenden Genen beschreibt. Ein Fettsäure-Desatwase-Gen aus dem Cyanobakterium, S- echocystis PCC 6803, ist ebenfalls beschrieben worden (Wada et al., Nature (1990) 347: 200–203). Dieses Gen kodiert eine Fettsäwe-Desaturase, bezeichnet als des A, die die Umwandlung von Oleinsäure an der l-Position von Galactolipiden zu Linoleinsäure katalysiert. Jedoch haben sich diese Gene für die Isolierung anderer Pflanzen-Fettsäwe-Desaturasen als Stearoyl-ACP-Desaturase über Sequenz-abhängige Protokolle nicht als nützlich erwiesen, und die gegenwärtige Technik zeigt nicht an, wie andere Pflanzen-Fettsäure-Desaturasen als Stearoyl-ACP-Desaturasen zu erhalten sind oder wie Fettsäure-Desatwase-verwandte Enzyme zu erhalten sind. So lehrt die gegenwärtige Technik nicht, wie Glycerolipid-Desatwasen aus Pflanzen zu erhalten sind. Weiterhin gibt es kein Anzeichen, daß ein Verfahren zur Kontrolle der Natur und der Niveaus von ungesättigten Fettsäwen in Pflanzen unter Verwendung von Nucleinsäuren, kodierend andere Fettsäure-Desaturasen als Stearoyl-ACP-Desatwase, auf dem Fachgebiet bekannt ist.
Die Biosynthese der untergeordneten Pflanzenlipide ist weniger gut untersucht worden. Wenn auch hunderte unterschiedliche Fettsäuren gefunden worden sind, viele aus dem Pflanzenreich, ist nur ein winziger Bruchteil aller Pflanzen auf ihren Lipidgehalt begutachtet worden (Gunstone et al., Hrsg., (1986) The Lipids Handbook (Handbuch der Lipide), Chapman und Hall Ltd., Cambridge). Dementsprechend ist wenig über die Biosynthese dieser ungewöhnlichen Fettsäuren und Fettsäwederivate bekannt. Zu in derartigen Fettsäuren gefundenen interessanten chemischen Merkmalen gehören, zum Beispiel, allenische und konjugierte Doppelbindungen, acetylenische Bindungen, trans-Doppelbindungen, multiple Doppelbindungen und einfache Doppelbindungen in einer breiten Anzahl von Positionen und Konfigurationen entlang der Fettsäurekette. Ähnlich werden viele von den strukturellen Modifizierungen, die in ungewöhnlichen Lipiden gefunden werden (z. B. Hydroxylierung, Epoxidierung, Cyclisierung usw.), wahrscheinlich über weiteren Metabolismus nach chemischer Aktivierung der Fettsäwe durch Desaturation erzeugt oder sie beinhalten eine chemische Reaktion, die mechanistisch der Desaturation ähnlich ist. Zum Beispiel ist ein Anzeichen für den Mechanismus der Hydroxylierung von Fettsäwen, der Teil eines allgemeinen Mechanismus von Enzym-katalysierter Desaturation in Eukaryoten ist, durch Substituieren eines Schwefelatoms an die Stelle von Kohlenstoff an der delta-9-Position von Stearinsäwe erhalten worden. Wenn das Thiostearat mit Hefezellenextrakten inkubiert wurde, wurde es in ein 9-Sulfoxid umgewandelt (Buist et al. (1987) Tetrahedron Letters 28: 857–860). Diese Sulfoxidation war spezifisch für Schwefel an der delta-9-Position und kam in einer Mutante, der Hefe-delta-9-Desatuase fehlte, nicht vor (Buist & Marecak (1991) Tetrahedron Letters 32: 891–894). Das 9-Sulfoxid ist das Schwefelanaloge von 9-Hydroxyoctadecastearat, dem vorgeschlagenen Zwischenprodukt der Stearat-Desatwation. So können Fettsäwedesaturase-cDNAs als verwendbare Sonden für cDNAs, kodierend Fettsäure-Hydroxylasen, und andere cDNAs, welche Enzyme mit Reaktionsmechanismen ähnlich der Fettsäuredesaturation kodieren, dienen. Viele von diesen Fettsäwen und Derivaten mit derartigen Merkmalen innerhalb ihrer Struktw könnten sich als kommerziell verwendbar erweisen, wenn eine agronomisch entwicklungsfähige Spezies durch Einführung eines Gens, kodierend die passende Desatwase, induziert werden könnte, sie zu synthetisieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben ein Mittel entdeckt, um die Natur und die Niveaus von ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen zu steuern. Nucleinsäurefragmente von Glycerolipid-Desaturase-cDNAs oder – Genen werden verwendet, um chimäre Gene zu erzeugen. Die chimären Gene können verwendet werden, um verschiedene Pflanzen zu transformieren, um die Fettsäurezusammensetzung der Pflanze oder des von der Pflanze erzeugten Öls zu modifizieren. Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäurefragment, umfassend eine Nucleinsäuesequenz, kodierend eine Fettsäure-Desaturase, welche zu der Nucleotidsequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 1, unter einer der folgenden Gruppen von Bedingungen hybridisieri: (a) Hybridisierung in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 5% Dextransulfat und 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma bei 50 C und Waschen zweimal bei Raumtemperatur mit 2X SSPE 0,1% SDS für 5 Minuten und 10 Minuten, nachfolgend Waschen für 5 Minuten bei 50 C in 0,5X SSPE 0,1% SDS; (b) Hybridisierung in 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCl, 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 5% Dextransulfat und 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma bei 50 C und Waschen zweimal bei Raumtemperatur mit 2X SSPE, 1% SDS für 5 Minuten, dann Waschen für 5 Minuten bei 50 C in 0,2X SSPE, 1% SDS; oder (e) Hybridisierung in 50 mM Tris, pH 7,6, 6X SSC, 5X Denhardt's, 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 μg DNA von denaturiertem Kalbsthymus bei 50°C und Waschen mit 6X SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatw für 15 Minuten, Wiederholen mit 2X SSC, 0,5% SDS bei 45°C für 30 Minuten, dann zweimal Wiederholen mit 0,2X SSC, 0,5% SDS bei 50°C für jeweils 30 Minuten. Genauer gesagt ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein isoliertes Nucleinsäurefragment, umfassend eine Nucleotidsequenz, kodierend eine Pflanzen-delta-lS-Fettsäure-Desaturase oder ein Fettsäwe-Desaturase-verwandtes Enzym mit einer Aminosäueidentität von 50%, 65%, 90% oder mehr zu dem Polypeptid, kodiert durch SEQ ID NOS: 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, oder 16. Das isolierte Fragment in diesen Ausführungsformen wird aus einer Pflanze, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sojabohne, Brassica-Spezies mit Ölsamen, Arabidopsis thaliana und Mais, isoliert.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung beinhaltet die Verwendung dieser Nucleinsäwefragmente in sequenzabhängigen Protokollen. Zu Beispielen gehört die Verwendung der Fragmente als Hybridisierungssonden, um andere Glycerolipid-Desaturase-cDNAs oder Gene zu isolieren. Eine verwandte Ausführungsform beinhaltet die Verwendung der offenbarten Sequenzen zu Amplifikation von DNA-Fragmenten, kodierend andere Glycerolipid-Desaturasen.
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung beinhaltet chimäre Gene, fähig, veränderte Niveaus der Linolensäwe in einer transformierten Pflanzenzelle zu bewirken, wobei das Gen Nucleinsäwefragmente unfaßt, kodierend eine Pflanzen-delta-15-Fettsäwe-Desatwase oder ein Fettsäure-Desatwase-verwandtes Enzym vorzugsweise mit einer Aminosäweidentität von 50%, 65%, 90% oder mehr zu dem Polypeptid, kodiert durch die SEQ ID NOS:1, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16, operabel verknüpft in geeigneter Orientierung mit geeigneten regulatorischen Sequenzen. Bevorzugt sind diejenigen chimären Gene, welche Nucleinsäwefragmente, kodierend delta-15-Fettsäure-Desaturase-cDNAs oder -Gene, einbringen. Pflanzen aus Samen von Pflanzen, enthaltend die beschriebenen chimären Gene, werden ebenfalls beansprucht.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Erzeugung von Samenöl, enthaltend veränderte Niveaus von Linolensäwe (18 : 3), umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem vorstehend beschriebenen chimären Gen; (b) Züchten fruchtbarer Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen von Schritt (a); (e) Screenen der Nachkommensamen von den fruchtbaren Pflanzen von Schritt (b) für die gewünschten Niveaus von Linolensäwe (18 : 3) und (d) Verarbeiten des Nachkommensamens von Schritt (e), um Samenöl, enthaltend veränderte Niveaus der ungesättigten Fettsäuren, zu erhalten. Bevorzugte Pflanzenzellen und Öle werden aus Sojabohne, Rapssamen, Sonnenblume, Baumwolle, Kakao, Erdnuß, Saflor, Kokosnuß, Flachs, Ölpalme und Mais erhalten. Zu bevorzugten Verfahren zum Transformieren derartiger Pflanzenzellen würden die Verwendung von Ti- und Ri-Plasmiden von Agrobacterium, Elektroporation und ballistische Bombardierung mit hoher Geschwindigkeit gehören.
Die Erfindung kann auch in einem Verfahren der Züchtung von Pflanzenspezies verwendet werden, um veränderte Niveaus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, speziell Linolensäue (18 : 3), im Samenöl von ölerzeugenden Pflanzen zu erhalten. Dieses Verfahren beinhaltet (a) Herstellen einer Kreuzung zwischen zwei Varietäten einer Pflanze mit Ölsamen, die sich in dem Linolensäwe-Merkmal unterscheiden; (b) Herstellen eines Southern Blot von Restriktionsenzym-digestierter genomischer DNA, isoliert aus verschiedenen Nachkommenpflanzen, entstehend aus der Kreuzung von Schritt (a); und (c) Hybridisieren des Southern Blot mit den radiomarkieΩen Nucleinsäwefragmenten, kodierend die beanspruchten Glycerolipid-Desaturasen.
Die Erfindung ist ebenfalls in einem Verfahren zum RFLP-Mapping verkörpert, das die hier beschriebenen isolierten delta-15-Desaturase-Sequenzen von Arabidopsis thaliana verwendet.
Die Erfindung ist ebenfalls in Pflanzen verkörpert, die auf Grund dessen, daß sie die hier beschriebenen chimären Gene enthalten, zur Erzeugung veränderter Niveaus von Glycerolipid-Desaturase fähig sind. Weiterhin kann die Erfindung verwendet werden, um Samenöl, erhalten aus derartigen Pflanzen, bereitzustellen.
Die Erfindung ist auch in einem Verfahren zum RFLP-Mapping in einem genomischen RFLP-Marker verkörpert, umfassend (a) Herstellen einer Kreuzung zwischen zwei Varietäten von Pflanzen; (b) Herstellen eines Southem Blot von Restriktionsenzym-digestierter genomischer DNA, isoliert aus verschiedenen Nachkommenpflanzen, entstehend aus der Kreuzung von Schritt (a); und (c) Hybridisieren des Southern Blot mit einem radiomarkierten Nucleinsäwefragment der beanspruchten Fragmente.
Die Erfindung kann ebenfalls in einem Verfahren verwendet werden, um Nucleinsäurefragmente, kodierend Fettsäwe-Desatwasen und Fettsäure-Desaturase-verwandte Enzyme zu isolieren, umfassend (a) Vergleichen der SEQ ID NOS: 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15 und 17 mit anderen Fettsäwe-Desaturase-Polypeptid-Sequenzen; (b) Identifizieren der konservierten Sequenzen) von 4 oder mehr Aminosäuen, erhalten in Schritt a; (c) Herstellen von Region-spezifischer(n) Nucleotidsonde(n) oder Oligomer(en), basierend auf den in Schritt b identifizierten konservierten Sequenzen; und d) Verwenden der Nucleotidsonde(n) oder des (der) Oligomers(en) von Schritt e, um Sequenzen, kodierend Fettsäwe-Desatwasen und Fettsäwe-Desatwase-verwandte Enzyme, dwch Sequenz-abhängige Protokolle zu isolieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER SEQUENZBESCHREIBUNGEN
Die Erfindung kann aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den Sequenzbeschreibungen, welche einen Teil dieser Anmeldung bilden, vollständiger verstanden werden. Die Sequenzbeschreibungen enthalten den ein-Buchstaben-Code für Nucleotidsequenzeigenschaften und den drei-Buchstaben-Code für Aminosäwen in Übereinstimnung mit dem IUPAC-IUB-Standard, beschrieben in Nucleic Acids Research 13: 3021–3030 (19085) und 37 C. F. R. 1,822, welche dwch Bezugnahme hier einbezogen sind.
SEQ ID NO:1 zeigt die vollständige 5'- bis 3'-Nucleotidsequenz von 1350 Basenpaaren der Arabidonsis-cDNA, welche delta-15-Desatwase in dem Plasmid pCF3 kodiert. Die Nucleotide 46 bis 48 sind das mutmaßliche Initiationscodon des offenen Leserahmens (Nucleotide 46 bis 1206). Die Nucleotide 1204 bis 1206 sind das Terminationscodon. Die Nucleotide 1 bis 45 und 1207 bis 1350 sind die 5'- bzw. 3'untranslatierten Nucleotide. Die 386-Aminosäwe-Proteinsequenz in SEQ ID NO:1 ist diejenige, die von dem offenen Leserahmen abgeleitet ist.
SEQ ID NO: 2 ist das abgeleitete Peptid des offenen Leserahmens von SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO: 3 ist eine teilweise Nucleotidsequenz des genomischen DNA-Inserts von Arabidopsis in dem Plasmid pF1, welche die genomische Sequenz in der Region des Arabidopsis-Genoms zeigt, die delta-15-Desaturase kodiert. Die Nucleotide 68–255 sind identisch mit den Nucleotiden 1–188 von SEQ ID NO:1. Die Nucleotide 47 bis 49 und 56 bis 58 sind Terminationscodons in dem gleichen Leserahmen wie der offene Leserahmen in SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO: 4 zeigt die 5'- bis 3'-Nucleotidsequenz des Inserts in dem Plasmid pACF2-2 mit 1525 Basenpaaren der Arabidonsis-thaliana-cDNA, die eine Plastid-delta-15 Fettsäwe-Desaturase kodiert. Die Nucleotide 10–12 bzw. die Nucleotide 1348 bis 1350 sind das mutmaßliche Initiationscodon und das Terminationscodon des offenen Leserahmens (Nucleotide 10 bis 1350). Die Nucleotide 1 bis 9 bzw. 1351 bis 1525 sind die 5'- und 3'-untranslatierten Nucleotide.
SEQ ID NO: 5 ist das abgeleitete Peptid des offenen Leserahmens von SEQ ID NO:4.
SEQ ID NO:6 zeigt die vollständige 5'- bis 3-Nucleotidsequenz von 1336 Basenpaaren der cDNA des Brassica-napus-Samens, gefunden in dem Plasmid pBNSF3-2, welche eine mikrosomale delta-l5-Glycerolipid-Desaturase kodiert. Die Nucleotide 79 bis 82 sind das mutmaßliche Initiationscodon des offenen Leserahmens (Nucleotide 79 bis 1212). Die Nucleotide 1210 bis 1212 sind das Terminationscodon. Die Nucleotide 1 bis 78 und 1213 bis 1336 sind entsprechend die 5'- und 3'-unstranslatierten Nucleotide.
SEQ ID NO:7 ist das abgeleitete Peptid des offenen Leserahmens von SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 8 ist die vollständige 5'- bis 3'-Nucleotidsequenz von 1416 Basenpaaren der cDNA des Brassica-napus-Samens, gefunden in dem Plasmid pBNSFd-2, welche eine Plastid-delta-l5-Glycerolipid-Desaturase kodiert. Die Nucleotide 1 bis 1215 entsprechen einem kontinuierlichen offenen Leserahmen von 404 Aminosäwen. Die Nucleotide 1213 bis 1215 sind das Terminationscodon. Die Nucleotide 1215 bis 1416 sind die 3'-untranslatierten Nucleotide.
SEQ ID NO:9 ist das abgeleitete Peptid des offenen Leserahmens von SEQ ID NO: 8.
SEQ ID NO:10 ist die vollständige Nucleotidsequenz der mikrosomalen delta-15-DesatwasecDNA der Sojabohne (Glycine max), gefunden in dem Plasmid pXF1, und die 2184 Nucleotide dieser Sequenz enthalten sowohl die Kodierungssequenz als auch die 5'- und 3'-nicht-translatierten Regionen der cDNA. Die Nucleotide 855 bis 857 sind das mutmaßliche Initiationscodon des offenen Leserahmens (Nucleotide 855 bis 2000). Die Nucleotide 1995 bis 1997 sind das Terminationscodon. Die Nucleotide 1 bis 854 bzw. 1998 bis 2184 sind die 5'- und 3'-unstranslatierten Nucleotide. Die 380-Aminosäwe-Proteinsequenz in SEQ ID NO: 7 ist diejenige, die von dem offenen Leserahmen abgeleitet ist.
SEQ ID NO:11 ist das abgeleitete Peptid des offenen Leserahmens in SEQ ID NO:10.
SEQ ID NO:12 ist die vollständige 5'- bis 3'-Nucleotidsequenz von 1676 Basenpaaren der SamencDNA der Sojabohne (Glycine max), gefunden in dem Plasmid pSFD-118bwp, welche eine Sojabohnen-Plastid-delta-lS-Desaturase kodiert. Die Nucleotide 169 bis 1530 entsprechen einem kontinuierlichen offenen Leserahmen von 453 Aminosäwen. Die Nucleotide 169 bis 171 sind das mutmaßliche Initiationscodon des offenen Leserahmens. Die Nucleotide 1528 bis 1530 sind das Terminationscodon. Die Nucleotide 1531 bis 1676 sind die 3'-untranslatierten Nucleotide. Die Nucleotide 169 bis 382 kodieren das mutmaßliche Plastid-Transitpeptid, basierend auf dem Vergleich des abgeleiteten Peptids mit dem mikrosomalen delta-15-Peptid der Sojabohne.
SEQ ID NO:13 ist das abgeleitete Peptid des offenen Leserahmens in SEQ ID NO:12.
SEQ ID NO:4 ist die vollständige Nucleotidsequenz eines 396-bp-Polymerase-Kettenreaktionsprodukts, erhalten aus Maissamen-mRNA, die in dem Insert des Plasmids pPCR20 gefunden wird. Die Nucleotide 1 bis 31 und 364 bis 396 entsprechen den Amplifikationsprimern, beschrieben in SEQ ID NO: 18 bzw. SEQ ID NO: 19. Die Nucleotide 31 bis 363 kodieren eine innere Region einer Maissamen-delta-15-Desaturase, die zu 61,9% identisch mit der Region zwischen den Aminosäuren 137 und 249 der delta-15-Desaturase-Peptidsequenz von Brassica napus, angegeben in SEQ ID NO:7, ist.
SEQ ID NO: 15 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14.
SEQ ID NO:16 zeigt die teilweise zusammengesetzte 5'- bis 3'-Nucleotidsequenz mit 472 bp, erhalten aus den Inserts in den Plasmiden pFadx-2 und pYacp7 für Arabidopsis-thaliana-cDNA, die eine Plastid-delta-lS-Fettsäure-Desaturase kodiert. Die Nucleotide 2-4 bzw. die Nucleotide 468 bis 470 sind der erste und der letzte Codon in dem offenen Leserahmen.
SEQ ID NO:17 ist die abgeleitete teilweise Peptidsequenz des offenen Leserahmens in SEQ ID NO:16.
SEQ ID NO: 18 Einhundertachtundzwanzig-fach degenerierter sense-3l-mer-PCR-Primer. Die Nucleotide 1 bis 8 entsprechen der Bam-H1-Restriktionsenzym-Erkennungssequenz. Die Nucleotide 9 bis 137 entsprechen den Aminosäureresten 130 bis 137 von SEQ ID NO:6 mit einer Desoxyinosin-Base an Nucleotid 11.
SEQ ID NO: 19 Zweitausendundachtundvierzig-fach degenerierter antisense-35-mer-PCR-Primer. Die Nucleotide 1 bis 8 entsprechen der Bam-Hl-Restriktionsenzym-Erkennungssequenz. Die Nucleotide 9 bis 35 entsprechen den Aminosäureresten 249 bis 256 von SEQ ID NO:6 mit einer Desoxyinosin-Base an Nucleotid 15.
SEQ ID NO: 20 Sechzehn-fach degeneriere sense-36-mers hergestellt für die Aminosäurereste 97-108 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 21 Sechzehn-fach degenerierte sense-36-mers hergestellt für die Aminosäurereste 97-108 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 22 Zweiundsiebzig-fach degeneriere sense-l8-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 100–105 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 23 Zweiundsiebzig-fach degenerierte sense-l8-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 100–105 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 24 Zweiundsiebzig-fach degenerierte antisense-l8-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 299–304 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 25 Zweiundsiebzig-fach degenerierte antisense-l8-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 299–304 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 26 Zweiundsiebzig-fach degenerierte antisense-l8-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 304–309 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 27 Zweiundsiebzig-fach degenerierte antisense-l8-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 304–309 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 28 Sechzehn-fach degenerierte sense-36-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 97-108 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 29 Sechzehn-fach degenerierte sense-36-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 97-108 in SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 30 Vierundsechzig-fach degenerierte antisense-38-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 299–311 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO: 31 Vierundsechzig-fach degenerierie antisense-38-mers, hergestellt für die Aminosäurereste 299–311 in SEQ ID NO:2.
SEQ ID NO:32 Ein 135-mer, hergestellt als antisense-Strang für die Aminosäurereste 97–141 in SEQ ID NO:2.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben Nucleinsäwefragmente isoliert, die Pflanzen-Fettsäwe-Desaturasen kodieren und die zw Modifizierung der Fettsäwezusammensetzung in ölerzeugenden Spezies dwch Transformation verwendbar sind.
So führt der Transfer der Nucleinsäwefragmente der Erfindung oder eines Teils davon, der ein funktionelles Enzym kodiert, zusammen mit geeigneten regulatorischen Sequenzen, die die Transkription ihrer mRNA richten, in eine lebende Zelle zu der Erzeugung oder Übererzeugung von Pflanzen-Fettsäwe-Desatwasen und führt zu vergrößerten Niveaus ungesättigter Fettsäuren in zellulären Lipiden einschließlich Triacylglycerolen.
Transfer der Nucleinsäwefragmente der Erfindung oder eines Teils davon, zusammen mit geeigneten regulatorischen Sequenzen, die die Transkription ihrer antisense-RNA richten, in Pflanzen führt zu der Hemmung der Expression der endogenen Fettsäwe-Desatwase, die im wesentlichen homolog mit dem transferierten Nucleinsäurefragment ist, und führt zu verminderten Niveaus von ungesättigten Fettsäuren in zellulären Lipiden einschließlich Triacylglycerolen.
Transfer der Nucleinsäwefragmente der Erfindung oder eines Teils davon zusammen mit geeigneten regulatorischen Sequenzen, die die Transkription ihrer mRNA richten, in Pflanzen kann zu Hemmung dwch Cosuppression der Expression des endogenen Fettsäwe-Desatwase-Gens, das im wesentlichen homolog mit dem transferierten Nucleinsäwefragment ist, führen und kann zu verminderten Niveaus von ungesättigten Fettsäwen in zellulären Lipiden einschließlich Triacylglycerolen führen.
Die Nucleinsäwefragmente der Erfindung können ebenfalls als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-(RFLP)-Marker bei genetischem Mapping von Arabidopsis und in Pflanzenzüchtungsprogrammen verwendet werden.
Die Nucleinsäurefragmente der Erfindung oder davon abgeleitete Oligomere können ebenfalls verwendet werden, um andere verwandte Glycerolipid-Desaturase-Gene zu isolieren, indem DNA, RNA oder eine Bibliothek von klonierten Nucleotidsequenzen aus den gleichen oder unterschiedlichen Spezies durch bekannte sequenzabhängige Protokolle einschließlich zum Beispiel Verfahren der Nucleinsäwehybridisierung und Amplifikation dwch die Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden.
DEFINITIONEN
In dem Zusammenhang dieser Offenbarung soll eine Anzahl von Begriffen verwendet werden. Der hier verwendete Begriff "Fettsäure-Desatwase" bezeichnet ein Enzym, welches das Aufbrechen einer Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung und die Einführung einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in ein Fettsäuremolekül katalysiert. Die Fettsäwe kann frei oder mit einem anderen Molekül einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Acyl-Trägerprotein, Coenzym A, Sterolen und der Glyceroleinheit von Glycerolipiden verestert sein. Der hier verwendete Begriff "Glycerolipid-Desaturasen" bezeichnet eine Untergruppe der Fettsäure-Desaturasen, die auf Fettsäweeinheiten wirkt, die mit einem Glycerolgrundgerüst verestert sind. "Delta-l2-Desaturase" bezeichnet eine Fettsäure-Desaturase, die die Bildung einer Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffpositionen 6 und 7 (gezählt von dem Methylende) katalysiert (d. h. denjenigen, die den Kohlenstoffpositionen 12 und 13 (gezählt von dem Carbonylkohlenstoff) einer 18 Kohlenstoffatome langen Fettsäurekette oder den Kohlenstoffpositionen 10 und 11 (gezählt von dem Carbonylkohlenstoff) einer 16 Kohlenstoffatome langen Fettsäwekette entsprechen). "Delta-15-Desatwase" bezeichnet eine Fettsäwe-Desatwase, die die Bildung einer Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffpositionen 3 und 4 (gezählt von dem Methylende) katalysiert (d. h. denjenigen, die den Kohlenstoffpositionen 15 und 16 (gezählt von dem Carbonylkohlenstoff) einer 18 Kohlenstoffatome langen Fettsäwekette und den Kohlenstoffpositionen 13 und 14 (gezählt von dem Carbonylkohlenstoff) einer 16 Kohlenstoffatome langen Fettsäurekette entsprechen). Zu Beispielen von Fettsäure-Desatwasen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, die mikrosomalen delta-12- und delta-15-Desatwasen, die auf Phosphatidylcholin-Lipid-Substrate wirken; die Chloroplast-delta-l2- und -delta-15-Desatwasen, die auf Phosphatidylglycerol und Galactolipide wirken; und andere Desaturasen, die auf derartige Fettsäuresubstrate wie beispielsweise Phospholipide, Galactolipide und Sulfolipide wirken. "Mikrosomale Desaturase" bezieht sich auf den zytoplasmatischen Standort des Enzyms, während "Chloroplast-Desaturase" und "Plastid-Desaturase" sich auf den Plastid-Standort des Enzyms beziehen. Diese Fettsäure-Desatwasen können in einer Vielfalt von Organismen einschließlich, ohne aber darauf begrenzt zu sein, höherer Pflanzen, Diatomeen und verschiedener eukaryotischer und prokaryotischer Mikroorganismen, wie beispielsweise Pilze und photosynthetische Bakterien und Algen, gefunden werden. Der Begriff "homologe Fettsäure-Desatwasen" bezeichnet Fettsäwe-Desatwasen, die die gleiche Desaturation an dem gleichen Lipidsubstrat katalysieren. So sind mikrosomale delta-15-Desaturasen, sogar von unterschiedlichen Pflanzenspezies, homologe Fettsäure-Desaturasen. Der Begriff "heterologe Fettsäure-Desaturasen" bezeichnet Fettsäwe-Desaturasen, die Desaturationen an verschiedenen Positionen und/oder an verschiedenen Lipidsubstraten katalysieren. So sind, zum Beispiel, mikrosomale delta-12- und delta-l5-Desaturasen, welche auf Phosphatidylcholin-Lipide wirken, heterologe Fettsäure-Desatwasen, sogar wenn sie von der gleichen Pflanze sind. Ähnlich sind mikrosomale delta-lS-Desaturase, welche auf Phosphatidylcholin-Lipide wirkt, und Chloroplast-delta-15-Desatwase, welche auf Galactolipide wirkt, heterologe Fettsäure-Desaturasen, sogar wenn sie von der gleichen Pflanze sind. Es sollte bemerkt werden, daß diese Fettsäwe-Desaturasen niemals isoliert und als Proteine charakterisiert worden sind. Dementsprechend werden die Begriffe wie beispielsweise "delta-l2-Desaturase" und "delta-lS-Desaturase" der Bequemlichkeit halber verwendet, um die dwch Nucleinsäurefragmente kodierten Proteine zu beschreiben, die basierend auf den dwch ihre Zeneißung verursachten phänotypischen Wvkungen isoliert worden sind. Der Begriff "Fettsäure-Desaturase-verwandtes Enzym" bezeichnet Enzyme, deren katalytisches Produkt nicht eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung sein kann, aber deren Wirkungsmechanismus ähnlich dem einer Fettsäure-Desaturase ist (das heißt Katalyse der Ersetzung einer Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung einer Fettsäurekette, wobei ein Hydroxyfettsäurezwischenprodukt oder – endprodukt gebildet wird). Dieser Begriff unterscheidet sich von "verwandten Fettsäure-Desaturasen", welche strukturelle Ähnlichkeiten zwischen Fettsäure-Desaturasen bezeichnen.
Der Begriff "Nucleinsäue" bezeichnet ein großes Molekül, welches einsträngig oder doppelsträngig sein kann und aus Monomeren (Nucleotide) zusammengesetzt ist, die einen Zucker, ein Phosphat und entweder ein Purin oder ein Pyrimidin enthalten. Ein "Nucleinsäurefragment" ist eine Fraktion eines gegebenen Nucleinsäwemoleküls. In höheren Pflanzen ist Desoxyribonucleinsäwe (DNA) das genetische Material, während Ribonucleinsäue (RNA) an dem Transfer der Information in DNA in Proteine beteiligt ist. Ein "Genom" ist die gesamte Masse von genetischem Material, die in jeder Zelle eines Organismus enthalten ist. Der Begriff "Nucleotidsequenz" bezeichnet die Sequenz von DNA- oder RNA- Polymeren, welche einzel- oder doppelsträngig sein können, die gegebenenfalls synthetische, nichtnatürliche oder veränderte Nucleotidbasen, fähig zw Einlagerung in DNA- oder RNA-Polymere, enthalten. Der Begriff "Oligomer" bezeichnet kurze Nucleotidsequenzen, gewöhnlich bis zu 150 Basen lang. "Regionspezifische Nucleotidsonden" bezeichnet isolierte Nucleinsäurefragmente, erhalten aus einer cDNA oder einem Gen unter Verwendung einer Kenntnis der Aminosäweregionen, konserviert zwischen verschiedenen Fettsäwe-Desaturasen, welche verwendet werden können, um unter Verwendung von Sequenz-abhängigen Protokollen cDNAs oder Gene für andere Fettsäwe-Desatwasen oder Fettsäwe-Desatwase-verwandten Enzyme zu isolieren. Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff "homolog zu" die Verwandtschaft zwischen der Nucleotidsequenz von zwei Nucleinsäwemolekülen oder zwischen den Aminosäuresequenzen von zwei Proteinmolekülen. Abschätzungen derartiger Homologie werden dwch entweder DNA-DNAoder DNA-RNA-Hybridisierung unter Bedingungen von Stringenz, wie für den Fachmann verständlich ist (Hames und Higgins, Hrsg. (1985) Nucleic Acid Hybridisation (Nucleinsäurehybridisierung), IRL Press, Oxford, UK); oder dwch den Vergleich von Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Nucleinsäwen oder Proteinen, wie beispielsweise durch das Verfahren von Needleman et al. (J. Mol. Biol. (1970) 48: 443–453) bereitgestellt. Wie hier verwendet bezeichnet "im wesentlichen homolog" Nucleotidsequenzen, die mehr als 90% Gesamtidentität an dem Nucleotidniveau mit der Kodierungsregion der beanspruchten Sequenz haben, wie beispielsweise Gene und Pseudogene entsprechend den kodierenden Regionen. Die hier beschriebenen Nucleinsäwefragmente schließen Moleküle ein, welche mögliche Variationen, sowohl künstliche als auch natürliche, umfassen, wie beispielsweise, ohne aber darauf begrenzt zu sein, (a) diejenigen, die Basenänderungen beinhalten, die nicht eine Änderung in einer kodierten Aminosäure verursachen, oder (b) welche Basenänderungen beinhalten, die eine Aminosäure verändern, aber nicht die funktionellen Eigenschaften des Proteins, kodiert dwch die DNA-Sequenz, beeinflussen, (c) diejenigen, erhalten aus Deletionen, Umlagerungen, Amplifikationen, statistischer oder gesteuerter Mutagenese des Nucleinsäwefiagments, und (d) sogar gelegentliche Nucleotidsequenzierungsirrtümer.
"Gen" bezeichnet eine Nucleinsäwefragment, das ein spezielles Protein, einschließlich regulatorischer Sequenzen, die der Kodierungsregion vorangehen (5'-nicht-kodierend) und folgen (3'-nichtkodierend), exprimiert. "Fettsäure-Desatwase-Gen" bezeichnet ein Nucleinsäwefragment, das ein Protein mit Fettsäwe-Desaturase-Aktivität exprimiert. "Natives" Gen bezeichnet ein isoliertes Gen mit seinen eigenen regulatorischen Sequenzen, wie es in der Natur gefunden wird. "Chimäres Gen" bezeichnet ein Gen, das heterogene regulatorische und kodierende Sequenzen umfaßt, das nicht in der Natur gefunden wird. "Endogenes" Gen bezeichnet das native Gen, das normalerweise an seinem natürlichen Standort in dem Genom gefunden wird, und wird nicht isoliert. Ein "fremdes" Gen bezeichnet ein Gen, das nonnalerweise nicht in dem Wirtsorganismus gefunden wird, aber das statt dessen durch Gentransfer eingeführt wird. "Pseudogen" bezeichnet eine genomische Nucleotidsequenz, die nicht ein funktionelles Enzym kodiert.
"Kodierende Sequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die für ein spezielles Protein kodiert, und schließt die nicht-kodierenden Sequenzen aus. Sie kann eine "ununterbrochene kodierende Sequenz" bilden, d. h. kein Intron haben, oder sie kann ein oder mehrere Introne, gebunden durch passende Spleißverbindungen, einschließen. Ein "Intron" ist eine Nucleotidsequenz, die in dem primären Transkript transkribiert wird, aber die durch Spaltung und erneute Ligierung der RNA innerhalb der Zelle entfernt wird, um die reife mRNA zu erzeugen, die in ein Protein translatiert werden kann.
"Initiationscodon" und "Terminationscodon" bezeichnen eine Einheit aus drei benachbarten Nucleotiden in einer kodierenden Sequenz, die Initiation bzw. Kettentermination von Proteinsynthese (mRNA-Translation) spezifiziert. "Offener Leserahmen" bezeichnet die kodierende Sequenz, ununterbrochen durch Introne, zwischen Initiations- und Terminationscodon, die eine Aminosäwesequenz kodiert.
"RNA-Transkript" bezeichnet das Produkt, das sich aus RNA-Polymerase-katalysierter Transkription einer DNA-Sequenz ergibt. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte komplementäre Kopie der DNA-Sequenz ist, wird es als primäres Transkript bezeichnet, oder es kann eine aus posttranskriptioneller Verarbeitung des primären Transkripts erhaltene RNA-Sequenz sein und wird als reife RNA bezeichnet. "Messenger-RNA (mRNA)" bezeichnet die RNA, die ohne Introne ist und die durch die Zelle in Protein translatiert werden kann. "cDNA" bezeichnet eine doppelsträngige DNA, die komplementär zu und erhalten aus mRNA ist. "Sense"-RNA bezeichnet RNA-Transkript, das die mRNA einschließt. "Antisense-RNA" bezeichnet ein RNA-Transkript, das komplementär zu allem oder einem Teil eines primären Transkripts oder einer mRNA als Ziel ist und das die Expression eines Zielgens blockiert, indem die Verarbeitung, der Transport und/oder die Translation seines primären Transkripts oder der mRNA gestört wird. Die Komplementarität einer antisense-RNA kann mit einem beliebigen Teil des speziellen Gentranskripts, d. h. an der 5'-nicht-kodierenden Sequenz, 3'-nicht-kodierenden Sequenz, den Intronen oder der kodierende Sequenz, sein. Außerdem kann, wie hier verwendet, antisense-RNA Regionen von Ribozymsequenzen enthalten, die die Wirksamkeit von antisense-RNA, die Genexpression zu blockieren, vergrößern. "Ribozym" bezeichnet eine katalytische RNA und schließt Sequenz-spezifische Endoribonucleasen ein.
Wie hier verwendet bezeichnen "geeignete regulatorische Sequenzen" Nucleotidsequenzen in nativen oder chimären Genen, die sich stromaufwärts (5'), innerhalb und/oder stromabwärts (3') zu den Nucleinsäwefragmenten der Erfindung befinden, welche die Expression der Nucleinsäurefragmente der Erfindung steuern. Der Begriff "Expression" bezeichnet, wie hier verwendet, die Transkription und stabile Akkumulation der sense- (mRNA) oder der antisense-RNA, erhalten aus dem (den) Nucleinsäwefragment(en) der Erfindung, die in Verbindung mit dem Proteinapparat der Zelle zu veränderten Niveaus der Fettsäwe-Desaturase(n) führt. Expression oder Überexpression des Gens beinhaltet Transkription des Gens und Translation der mRNA in Vorläufer- oder reife Fettsäwe-Desatwase-Proteine. "Antisense-Hemmung" bezeichnet die Erzeugung von antisense-RNA-Transkripten, fähig zur Verhinderung der Expression des Zielproteins. "Überexpression" bezeichnet die Erzeugung eines Genprodukts in transgenen Organismen, die Niveaus der Erzeugung in normalen oder nicht-transformierten Organismen überschreitet. "Cosuppression" bezeichnet die Expression eines fremden Gens, welches wesentliche Homologie zu einem endogenen Gen hat, was zu Suppression der Expression sowohl des fremden als auch des endogenen Gens führt. "Veränderte Niveaus" bezeichnet die Erzeugung von Genprodukten) in transgenen Organismen in Mengen oder Verhältnissen, die sich von denen normaler oder nichttransformierter Organismen unterscheiden.
"Promotor" bezeichnet eine DNA-Sequenz in einem Gen, gewöhnlich stromaufwärts (5') zu seiner kodierenden Sequenz, welche die Expression der kodierenden Sequenz steuert, indem die Erkennung für RNA-Polymerase und andere für richtige Transkription erforderliche Faktoren bereitgestellt werden. In künstlichen DNA-Konstrukten können Promotoren auch verwendet werden, um antisense-RNA zu transkribieren. Promotoren können auch DNA-Sequenzen enthalten, die an der Bindung von Proteinfaktoren beteiligt sind, welche die Effektivität der Initiation der Transkription in Antwort auf physiologische oder entwicklungsmäßige Bedingungen steuern. Er kann auch Enhancer-Elemente enthalten. Ein "Enhancer" ist eine DNA-Sequenz, welche die Promotoraktivität stimulieren kann. Er kann ein angeborenes Element des Promotors oder ein heterologes Element sein, das insertiert wird, um das Niveau und/oder die Gewebespezifität eines Promotors zu erhöhen. "Konstitutive Promotoren" bezeichnen diejenigen, die die Genexpression in allen Geweben und zu allen Zeiten lenken. "Gewebespezifische" oder "entwicklungsspezifische" Promotoren, wie sie hier bezeichnet werden, sind diejenigen, die Genexpression fast ausschließlich in speziellen Geweben, wie beispielsweise Blätter oder Samen, bzw. bei speziellen Entwicklungsstadien in einem Gewebe, wie beispielsweise in früher oder später Embryogenese, lenken.
Die " 3'-nicht-kodierenden Sequenzen" bezeichnen den DNA-Sequenzanteil eines Gens, der ein Polyadenylierungssignal und ein beliebiges anderes regulatorisches Signal, fähig, mRNA-Verarbeitung oder Genexpression zu beeinflussen, enthält. Das Polyadenylierungssignal ist gewöhnlich durch Beeinflussen der Zugabe von Polyadenylsäure-Tracts an das 3'-Ende des mRNA-Vorläufers gekennzeichnet.
Der Begriff "Transitpeptid" bezeichnet die N-terminale Extension eines Proteins, die als Signal für Aufnahme und Transport dieses Proteins in eine Organelle, wie beispielsweise ein Plastid oder Mitochondrion, dient.
"Transformation" bezeichnet hier den Transfer eines fremden Gens in das Genom eines Wirtsorganismus und seine genetisch stabile Vererbung. "Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus" bezeichnet Restriktionsfragment-Längen mit unterschiedlichen Größen aufgrund veränderter Nucleotidsequenzen in oder um variante Formen von Genen herum. "Fruchtbar" bezeichnet Pflanzen, die imstande sind, sich geschlechtlich zu vermehren.
"Ölerzeugende Spezies" bezeichnen hier Pflanzenspezies, welche Triacylglycerol in speziellen Organen, in erster Linie in Samen, erzeugen und lagern. Zu derartigen Spezies gehören Sojabohne (Glycine max), Rapssamen und Canola (einschließlich Brassica napus, B. campestris), Sonnenblume (Helianthus annus), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Mais (Zea mays), Kakao (Theobroma cacao), Saflor Carthamus tinctorius), Ölpalme (Elaeis guineensis), Kokosnußpalme (Cocos nucifera), Flachs (Linum usitatissimum), Castor (Ricinus communis) und Erdnuß (Arachis hypogaea). Zu der Gruppe gehören auch nichtagronomische Spezies, welche bei der Entwicklung passender Expressionsvektoren verwendbar sind, wie beispielsweise Tabak, schnell zyklisierende Brassica-Spezies und Arabidopsis thaliana sowie wilde Spezies, welche eine Quelle von einzigartigen Fettsäuren sein können.
"Sequenzabhängige Protokolle" bezeichnen Techniken, die sich wegen ihrer Verwendbarkeit auf eine Nucleotidsequenz stützen. Zu Beispielen von Sequenz-abhängigen Protokollen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, die Verfahren der Nucleinsäure- und Oligomer-Hybridisierung und Verfahren der DNA- und RNA-Amplifikation, wie sie beispielsweise in verschiedenen Anwendungen der Polymerase- Kettenreaktion als Beispiele veranschaulicht sind. "PCR-Produkt" bezeichnet das durch Polymerase-Kettenreaktion erhaltene DNA-Produkt.
Verschiedene in den experimentellen Manipulationen verwendete Lösungen sind mit ihren gewöhnlichen Namen bezeichnet, wie beispielsweise "SSC", "SSPE", "Denhardt-Lösung" usw. Die Zusammensetzung diese Lösungen kann durch Bezugnahme auf den Appendix B von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Molekulare Klonierung, ein Laborhandbuch), 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) gefunden werden.
T-DNA-MUTAGENESE UND IDENTffIZIERUNG EINER ARABIDOPSIS-MUTANTE, DER ES AN DELTA-15-DESATURATION MANGELT
Bei T-DNA-Mutagenese (Feldmann et al., Science (1989) 243: 1351–1354) kann die Integration von T-DNA in das Genom die nonnale Expression des Gens an oder in der Nähe der Stelle der Integration unterbrechen. Wenn der entstehende mutante Phänotyp nachgewiesen und genetisch gezeigt werden kann, daß er eng mit der T-DNA-Insertion verknüpft ist, dann können der "markierte" Locus und sein Wildtyp-Gegenstück leicht durch molekulares Klonen vom Fachmann isoliert werden.
Arabidopsis-thaliana-Samen wurden transformiert durch den C58Clrif-Stamm von Agrobacterium tumefaciens, beherbergend das avirulente Ti-Plasmid pGV3850::pAK1003, das die T-DNA-Region zwischen der linken und rechten T-DNA Grenze durch die Region des Ursprungs der Replikation ausgetauscht hat, und das Ampicillin-Resistenz-Gen von dem Plasmid pBR322, ein bakterielles Kanamycin-Resistenz-Gen und ein Pflanzen-Kanamycin-Resistenz-Gen (Feldmann et al., Mol. Gen. Genetics (1987) 208: 1–9). Pflanzen von den behandelten Samen waren selbstbefruchtend und die entstehenden Nachkommensamen, ausgekeimt in Anwesenheit von Kanamycin, waren selbstbefruchtend, wobei eine Population, bezeichnet als T3, hervorgerufen wurde, die für T-DNA-Inseriionen segregiert wurde. T3-Samen von ungefähr 6000 T2-Pflanzen wurden auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert. Eine Linie, bezeichnet als 3707, zeigte ein veningertes Niveau von Linolensäure (18 : 3). Eine weitere Runde von Selbstbefruchtung der mutanten Linie 3707 erzeugte T4-Nachkommensamen. Das Verhältnis von 18 : 2/18 : 3 in Samen der homozygoten Mutante in der 74-Population war ca. 14; dieses Verhältnis ist ca. 1,8 bzw. ca. 23 bei Wildtyp-Arabidopsis und Arabidopsis-fad-3-Mutante [Lemieux et al. (1990) Theor. App. Gen. 80: 234–240 ], erhalten über chemische Mutagenese. Diese Samen wurden gepflanzt, und 263 individuelle Pflanzen wurden auf die Anwesenheit von Nopalin in Blattextrakten analysiert. T5-Samen von diesen Pflanzen wurden weiterhin auf die Fettsäwezusammensetzung und die Fähigkeit, in Anwesenheit von Kanamycin zu keimen, analysiert. Es wurde gefunden, daß der mutante Fettsäwephänotyp sich in einem 1 : 2 : 1-Verhältnis, wie die Keimfähigkeit auf Kanamycin war, segregiert. Nopalin wurde in allen Pflanzen mit einem veränderten Fettsäwephänotyp, aber nicht in Wildtyp-Segreganten gefunden. Diese Ergebnisse stellten den Beweis bereit, daß die den Locus kontrollierende delta-15-Desaturation durch T-DNA in der mutanten Linie 3707 unterbrochen wurde.
ISOLATION GENOMISCHER DNA VON ARABIDOPSIS, ENTHALTEND DIE GEN-KONTROLLIERENDE DELTA-15-DESATURATION
Um das Gen, steuernd die delta-15-Desatwation von Wildtyp-Arabidopsis, zu isolieren, wurde ein T-DNA-Pflanzen-DNA"-Verbindungs"fragment, enthaltend eine T-DNA-Grenze, in die Wirtspflanzen-DNA, isoliert aus der Arabidopsis-Mutante 3707, integriert. Dafiir wurde genomische DNA aus der mutanten Pflanze isoliert und durch entweder Bam-HI- oder Sal-I-Restriktionsenzyme vollständig digestiert. In jedem Fall wurde erwartet, daß eines der entstehenden Fragmente den Ursprung der Replikation und das Ampicillin-Resistenz-Gen von pBR322 ebenso wie das linke T-DNA-Pflanzen-DNA-Verbindungsfragment enthält. Derartige Fragmente wurden als Plasmide gerettet, indem die digestierten genomischen DNA-Fragmente in einer verdünnten Konzentration, um Selbstligierung zu erleichtern, ligiert wurden und dann die ligierten Fragmente verwendet wurden, um E.-coli-Zellen zu transformieren. Ampicillin-resistente E.-coli-Transformanten wurden isoliert und durch Koloniehybridisierung zu Fragmenten gescreent, die entweder die linke oder die rechte T-DNA-Grenze enthielten. Von den 192 Kolonien, erhalten aus der Plasmid-Rettung von Sal-I-digestierter genomischer DNA, hybridisierten 31 mit dem Fragment der linken T-DNA-Grenze, hybridisierten 4 an das Fragment der rechten T-DNA-Grenze und hybridisierte keines an beide. Von den 85 Kolonien, erhalten aus der Plasmidrettung von Bam-HIdigestierter genomischer DNA, hybridisierten 63 an die linke Grenze und keines an die rechte Grenze. Restriktionsanalyse von sieben geretteten Plasmiden, die aus der Bam-HI-Digestion erhalten wurden und die an die linke T-DNA Grenze hybridisierten, zeigte, daß sie ununterscheidbar waren und 1,4 kb mutmaßliche, flankierende Pflanzen-DNA enthielten. Restriktionsanalyse eines anderen geretteten Plasmids, pS1, das aus der Sal-I-Digestion erhalten wurde und nur an die linke T-DNA-Grenze hybridisierte, zeigte, daß es 2,9 kb mutmaßliche, flankierende Pflanzen-DNA enthielt. Diese flankierende DNA hatte eine Bam-HI-Stelle und eine Hind-III-Stelle, 1,4 kb bzw. 2,2 kb von der linken T-DNA-Grenze entfernt, was vermuten läßt, daß die 1,4 kb mutmaßliche Pflanzen-DNA in Bam-HI-geretteten Plasmiden innerhalb der 2,9 kb mutmaßlicher Pflanzen-DNA in den Sal-I-geretteten Plasmiden enthalten war. Southern-Blot-Analyse genomischer DNA von Wildtyp- und 3707-mutanter Arabidopsis unter Verwendung des radiomarkierten 1,4-kb-DNA-Fragments als Hybridisierungssonde bestätigte, daß dieses Fragment Pflanzen-DNA enthielt und daß die T-DNA-Integrationsstelle in einem 2,8 kb Bam HI, einem 5,2 kb Hind III, einem 3,5 kb Sal I, einem 5,5 kb Eco RI und einem ungefähr 9 kb Cia I Fragment von Wildtyp-Arabidosis-DNA war. Nucleotidsequenzierung von Plasmid pS1 mit einem Primer, hergestellt für eine linke T-DNA-Grenzsequenz, offenbarte, daß pS1 colinear mit der Sequenz der linken T-DNA-Grenze (Yadav et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6322–6326) bis zu der Nucleotidposition 65 war, welche in den T-DNA-Grenzwiederholungen ist. Ungefähr 800 by zusätzliche Sequenz in pS1 jenseits der T-DNA-Pflanzen-DNA-Verbindung, das heißt, in der an die linke T-DNA-Grenze angrenzenden Pflanzen-DNA, zeigte keine signifikante Homologie ru der T-DNA von pGV3850::pAK1003 und keinen signifikanten offenen Leserahmen.
Das Nucleinsäurefragment von Wildtyp-Arabidopsis entsprechend der Pflanzen-DNA, flankierend T-DNA in der Linie 3707, wurde durch Screenen der genomischen Bibliothek einer lambda-Phagen-Arabidopsis-thaliana mit der 1,4-kb-Pflanzen-DNA, isoliert aus den geretteten Plasmiden, als Hybridisierungssonde isoliert. Sieben positiv hybridisierende genomische Klone wurden isoliert, die, basierend auf teilweisem Restriktions-Mapping, in eine von fünf Klassen fielen. Während ihre durchschnittliche Insertgröße ungefähr 15 kb war, überspannten sie zusammengenommen eine Gesamtmenge von ungefähr 40 kb genomischer DNA. Eine Kombination von Restriktions- und Southern-Analyse offenbarte, daß die fünf Klone die Stelle der Integration der linken Grenze der T-DNA überlappten und daß es keine nachweisbare Umlagerung von Pflanzen-DNA in den geretteten Plasmiden gab, verglichen mit der in der genomischen Pflanzen-DNA vom Wildtyp. Einer von diesen lambda-Phagen-Klonen, bezeichnet als 1111, war typisch für die gewonnenen Klone und enthielt ein genomisches DNA-Insert von ungefähr 20 kb, welches mehr oder weniger symmetrisch um die Stelle der Insertion der linken Grenze der 7-DNA herum angeordnet war. Dieser Klon wurde am 27. November 1991 bei der American Type Cultue Collection of Rockville, Maryland unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und trägt die Zugangsnummer ATCC 75167.
ISOLATION VON ARABIDOPSIS-DELTA-15-DESATURASE-CDNA
Ein 5,2-kb-Hind-III-Fragment, enthaltend Wildtyp-genomische DNA, welche mit der flankierenden 1,4-kb-Pflanzen-DNA, gewonnen aus Linie 3707, hybridisierte und welche nahe ihrer Mitte von der T-DNA-Insertion in Linie 3707 unterbrochen war, wurde aus dem lambda-Phagen-Klon 41Al isoliert und in die Hind-III-Stelle des pBluescript-SK-Vektors (Stratagene) durch Standardklonierungsverfahren, beschrieben bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, kloniert. Das entstehende Plasmid wurde als pF1 bezeichnet. Das isolierte 5,2-kb-Hind-III-Fragment wurde ebenfalls als radiomarkierte Hybridisierungssonde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek, hergestellt für poly A⁺ mRNA aus Sämlings-Hypocotylen 3 Tage alter etiolierter Arabidopsis thaliana (Ökotyp Columbia) in einem lambda-ZAP-II-Vektor (Stratagene), zu screenen. Von den verschiedenen positiv hybridisierenden Plaquen wurden vier stark hybridisierende der Plaquereinigung unterworfen. Sequenzen des pBluescript-(Stratagene)-Vektors, einschließlich der cDNA-Inserts, von jedem der gereinigten Phagenvorräte wurden in Anwesenheit eines Helferphagen exzidiert. Die entstehenden Phagemide wurden verwendet, um E.-coli-Zellen zu infizieren, welche doppelsträngige Plasmide, pCF1, pCF2, pCF3 und pCF4, ergaben. Es wurde gezeigt, daß alle vier mindestens ein ungefähr 1,3 bis 1,4 kb Not I Insert-Fragment enthielten (Not I/Eco RI-Adaptoren wurden bei der Herstellung der cDNA-Bibliothek verwendet), welches mit der gleichen Region genomischer DNA von Wildtyp-Pflanzen, vorhanden in den isolierten Phagen-Klonen, hybridisierte. Diese Region, welche nahe der Stelle der Integration der linken T-DNA-Grenze in Linie 3707 war, war auf der Seite der T-DNA-Insertion gegenüber der der Pflanzen-DNA, flankierend die linke T-DNA-Grenze, die früher über Plasmidrettung isoliert wurde. Teilweise Sequenzbestimmung der unterschiedlichen cDNAs offenbarte gemeinsame Identität. Da mehrfache Versionen von nur einem Typ von cDNA aus einer cDNA-Bibliothek erhalten wurden, die aus etioliertem Gewebe hergestellt ist, von welchem erwartet wird, daß es delta-l5-Desatwation exprimiert, und da diese cDNAs mit der genomischen DNA hybridisierten, die der Stelle der T-DNA-Integration in Linie 3707 entspricht, welche einen Phänotyp mit hohem Gehalt an Linoleinsäwe/geringem Gehalt an Linolensäure hatte, wwden die Anmelder zu der Schlußfolgerung geführt, daß die T-DNA in Linie 3707 die normale Expression des Gens, kodierend delta-lS-Desaturase unterbrach. Die vollständige Nucleotidsequenz einer cDNA, bezeichnet als pCF3, wurde bestimmt und wird als SEQ ID NO:1 angegeben. Sie offenbart einen offenen Leserahmen, der ein 386-Aminosäuren-Polypeptid kodiert. Einer der Sequenzierungsprimer, hergestellt für den pCF3-Insert, wurde ebenfalls verwendet, um 255 bp der Sequenz von pF1 zu erhalten, die als SEQ ID NO: 3 angegeben wird. Die Nucleotide 68 bis 255 der genomischen DNA in pF1 (SEQ ID NO: 3) sind identisch mit den Nucleotiden 1 bis 188 der cDNA (SEQ ID NO:1), was zeigt, daß sie colinear sind und daß die cDNA durch das Gen in der isolieren genomischen DNA kodiert wird. Die Nucleotide 113 bis 115 in SEQ ID NO: 3 sind das Initiationscodon des größten offenen Leserahmens entsprechend den Nucleotiden 46–48 in SEQ ID NO:1. Dies ist aus der Anwesenheit von Terminationscodons im Rahmen an den Nucleotiden 47 bis 49 und den Nucleotiden 56 bis 58 und der Abwesenheit von beobachtbaren Intron-Spleißverbindungen in SEQ ID NO: 3 offensichtlich. Die Identifikation des 386-Aminosäwen-Polypeptids als Desatwase wurde durch Vergleichen seiner Aminosäwesequenz mit allen Proteinsequenzen, gefunden in Release 19.0 der SWISSPROTEIN Datenbank unter Verwendung des FASTA-Algorithmus von Pearson und Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 2444–2448) und des BLAST-Programms (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215: 403–410), bestätigt. Das in beiden Durchsuchungen gefundene am meisten homologe Protein war die desA-Fettsäwe-Desatwase von dem Cyanobacterium Synechocystis PCC6803 (Wada et al., Nature (1990) 347: 200–203; Genbank ID : CSDESA; GenBank Accession No: X53508). Das 386-Aminosäuren-Peptid in SEQ ID NO:1 wurde nach dem Verfahren von Needleman et al. (J. Mol. Biol. (1970) 48: 443–453) auch mit der 351-Aminosäwen-Sequenz von desA verglichen. Über ihre gesamte Länge waren diese Proteine zu 26% identisch, wobei der Vergleich vier Hauptlücken in der desA-Proteinsequenz ausnutzt. Während diese gesamte Homologie schlecht ist, war Homologie in kürzeren Abschnitten besser. Zum Beispiel zeigten in einem Abschnitt von 78 Aminosäuren die Arabidonsis-delta-15-Desatwase (Aminosäwen 78 bis 155 in SEQ ID NO:1) und das desA-Protein (Aminosäwen 67 bis 144) 40% Identität und 66% Ähnlichkeit. Die Homologie in noch kürzeren Abschnitten war noch größer, wie in Tabelle 2 gezeigt wird.
TABELLE 2
Diese hohen prozentualen Identitäten in kurzen Abschnitten von Aminosäwen zwischen dem Polypeptid der cyanobakteriellen Desatwase und SEQ ID NO:2 lassen signifikante Verwandtschaft zwischen den beiden vermuten.
Um die entwicklungsmäßige Expression des Gens, kodierend mRNA entsprechend SEQ ID NO:1, zu analysieren, wurde das cDNA-Insert in dem Plasmid pCF3 als radiomarkierte Hybridisierungssonde auf mRNA-Proben von Blatt, Wurzel, keimendem Sämling und sich entwickelnden Schoten von sowohl Wildtyp- als auch Mutante-3707-Arabidopsis-Pflanzen verwendet, im wesentlichen wie bei Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben ist. Die Ergebnisse zeigten an, daß, wenn auch die mRNA entsprechend SEQ ID NO:1 in allen Geweben von der mutanten Pflanze nachgewiesen wird, ihre Niveaus niedriger als in Wildtyp-Geweben sind. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, daß die Fettsäuremutation in Linie 3707 relativ zu der über chemische Mutagenese erhaltenen, bekannten Mutante Arabidonsis fad 3 unzuverlässig ist. Diese Ergebnisse bestätigten, daß die T-DNA in Linie 3707 die normale Expression eines Fettsäwe-Desatwase-Gens unterbrochen hatte. Basierend auf dem Fettsäure-Phänotyp der homozygoten Mutantenlinie 3707 schlußfolgerten die Anmelder, daß das cDNA-Insert in pCF3 die delta-lS-Desaturase kodiert. Weiterhin schlußfolgerten die Anmelder, daß es die mikrosomale delta-15-Desatwase und nicht die Chloroplast-delta-15-Desatwase war, da: a) der mutante Phänotyp stark in dem Samen exprimiert wurde, aber schlecht, wenn überhaupt, in dem Blatt von Linie 3707 exprimiert wurde, und b) das delta-15-Desatwase-Polypeptid, im Vergleich mit dem desA-Polypeptid, keine N-terminale Extension eines Transitpeptids, erwartet für eine nuclear-kodierte Chloroplast-Desaturase, hatte.
Die Identität von SEQ ID NO:2 als mikrosomale delta-lS-Desaturase von Arabidonsis wurde durch ihre biologische Überexpression in Pflanzengeweben bestätigt. Dafür wurde das 1,4-kB-Not-I-Fragment von dem Plasmid pCF3, enthaltend die delta-15-Desaturase-cDNA, in der sense-Orientierung entweder hinter den CaMV-35S-Promotor, um konstitutive Expression bereitzustellen, oder hinter den Promotor für das Gen, kodierend die Sojabohnen-a'-Untereinheit des β-Conglycinin-(7S)-Samenspeicherproteins, um embryo-spezifische Expression bereitzustellen, plaziert. Die chimären Gene 35S Promotor/sense SEQ ID NO: 1/3'-Nopalinsynthase und β-Conglycinin/sense SEQ ID NO: 1/3'-Phaseolin wurden dann durch das binäre Ti-Plasmid-Vektorsystem von Agrobacterium tumefaciens in Pflanzenzellen transformiert [Hoekerna et al. (1983) Nature 303: 179–180; Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711–8720].
Um die Identität von SEQ ID NO:1 zu bestätigen und um die biologische Wirkung ihrer Überexpression in einer heterologen Pflanzenspezies zu testen, wurde das chimäre Gen 35S-Promotor/sense-SEQ ID NO:1/3'-Nopalinsynthase in einen binären Vektor transformiert, welcher dann in den Agrobacterium-tumefaciens-Stamm R1000 transferiert wurde, wobei er das Ri-Plasmid pRiA4b von Agrobacterium rhizopenes trägt [Moore et al. (1979) Plasmid 2: 617–626]. Zellen von Karotten Daucus carota L.) wurden durch Cokultivierung von Karottenwurzelscheiben mit dem Stamm R1000, tragend das chimäre Gen, nach dem Verfahren von Petit et al. (1986) [Mol. Gen. Genet. 202: 388–393] transformiert. Fettsäweanalysen transgener Karotten"haar"wurzeln zeigen, daß Überexpression von mikrosomaler Arabidopsis-delta-15-Desaturase zu mehr als 10-facher Zunahme von 18:3 auf die Kosten von 18 : 2 führen kann.
Um die delta-lS-Desaturationsmutation in der T-DNA-Mutantenlinie 3707 zu ergänzen und um die biologische Wirkung der Überexpression von SEQ ID NO:1 in Samen zu testen, wurde das chimäre Gen embryo-spezifischer Promotor/SEQ ID NO: 1/3'-Phaseolin in einen binären Vektor transformiert, welcher dann in den avirulenten Agrobacterium Stamm LBA4404/pAL4404 transformiert wurde [Hoekema et al. (1983) Nature 303: 179–180]. Wurzeln von Linie 3707 wurden durch das bearbeitete Agrobacterium transformiert, transformierte Pflanzen wurden ausgewählt und gezüchtet, um Samen hervorzubringen. Fettsäureanalyse der Samen von zwei Pflanzen zeigte, daß die eine von sechs Samen in jeder Pflanze den mutanten Fettsäurephänotyp zeigte, während die verbliebenen Samen eine mehr als 10-fache Zunahme von 18:3 auf ca. 55% zeigen. Wenn auch die Probengröße klein ist, läßt diese Segregation Mendelsche Vererbung des Fettsäurephänotyps vermuten. Wenn auch die meiste Zunahme auf Kosten von 18 : 2 erfolgt, erfolgt etwas davon auch auf Kosten von 18 : 1. So wird ebenfalls erwartet, daß Überexpression dieses Gens in Ölfrüchten, speziell Canola, welche eine nahe Verwandte von Arabidopsis ist, zu den hohen Niveaus von 18:3 führt, die in Spezialöl von Leinsamen gefunden werden.
Vergleiche der Sequenz des 386-Aminosäuren-Polypeptids nach dem Verfahren von Needleman et al. (J. Mol. Biol. (1970) 48: 443–453) mit denjenigen für die mikrosomalen Stearoyl-CoA-(delta-9)-Desatwasen von Ratte, Maus und Hefe offenbarten 21%, 19% bzw. 17% Identitäten. Während das Membran-assoziierte Arabidonsis-delta-15-Desaturase-Protein signifikante, aber begrenzte Homologie zu dem desA-Protein zeigte, zeigte es keine signifikante Homologie zu den löslichen Stearoyl-ACP-(delta-9)-Desaturasen von höheren Pflanzen, einschließlich einer von Arabidonsis.
Vergleich von teilweisen Nucleotidsequenzen der Plasmide pF1 und pS1 zeigte, daß die linke T-DNA-Grenze : Pflanzen-DNA-Verbindung ca. 700 bp von dem Initiatonscodon in SEQ ID NO:1 ist. Um die Position der anderen T-DNA:Pflanzen-DNA-Verbindung in bezug auf die pF1-Sequenz zu bestimmen, wurde das T-DNA:Pflanzen-DNA-Verbindungsfragment isoliert. Genomische DNA von der Mutantenlinie 3707, isoliert wie früher beschrieben, wurde durch das Restriktionsenzym Mbo I teilweise digestiert, wobei sich eine durchschnittliche Fragmentgröße von ca. 15 kB ergab. Die Fragmentenden wurden nach Klenow teilweise mit dGTP und gATP gefüllt und in Xho-I-Halbstellen von LambdaGEM®-11 (Promega Corporation) kloniert, indem dem Protokoll des Herstellers gefolgt wurde. Die Phagen-Bibliothek wurde titriert und im wesentlichen verwendet, wie bei Ausubel et al. beschrieben ist [Cunent Protocols in Molecular Biology (Gegenwärtige Protokolle in der Molekularbiologie) (1989) John Wiley & Sons]. Die genomische Phagen-Bibliothek wurde mit radiomarkiertem PCR-Produkt, ca. 0,6 kB, erhalten von dem 5'-Ende des Gens in pF1, gescreent. Dieses Produkt überspannt von 3 by nach rechts, von wo die 1inke-T-DNA-Grenze insertierte, zu 15 bp nach links von der Nucleotidposition 1 in SEQ ID NO:1. Southern-Blot-Analyse von DNA von einem der gereinigten, positiv hybridisierenden Phagen nach Eco-RI-Restriktionsdigestion und Elektrophorese zeigte, daß ein 4-kB-Eco-RI-Fragment mit dem 0,6-kB-PCR-Produkt hybridisierte. Das Eco-RI-Fragment wurde subkloniert und Sequenzanalysen unterworfen. Vergleich der aus diesem Fragment erhaltenen Sequenzen, pF1 und pS1, zeigte, daß die Insertion von T-DNA zu einer 56-bp-Deletion an der Stelle der Insertion führte und daß die T-DNA das Arabidonsis-Gen 711 bp 5' zu dem Initiatonscodon in SEQ ID NO:1 unterbrach. So insertiert die T-DNA 5' zu dem offenen Leserahmen, übereinstimmend mit der unzuverlässigen Expression des Gens, kodierend SEQ ID NO:1, und dem unzuverlässigen Fettsäure-Phänotyp in der Mutante 3707. Während die linke T-DNA:Pflanzen-DNA-Verbindung präzise ist, das heißt ohne irgendeine Sequenzumlagerung an entweder der linken T-DNA-Grenze oder der flankierenden Pflanzen-DNA ist, ist die andere T-DNA:Pflanzen-DNA-Verbindung komplex und nicht vollständig charakterisiert.
Das Plasmid pCF3 wurde am 3. Dezember 1991 bei der American Type Culture Collection of Rockville, Maryland unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt und trägt die Zugangsnummer ATCC 68875.
VERWENDUNG VON ARABIDOPSIS-DELTA-15-DESATURASE-cDNA ALS HYBRIDISIERUNGSSONDE, UM cDNAS, KODIEREND VERWANDTE DESATURASEN, AUS ARABIDOPSIS ZU ISOLIEREN
Das 1,4-kb-Not-I-Insert-Fragment, isoliert aus dem Plasmid pCF3, wurde gereinigt, radiomarkiert und verwendet, um ungefähr 80000 Klone aus der cDNA-Bibliothek, die für poly A+ mRNA aus 3 Tage alter etiolierter Arabidopsis thaliana hergestellt wurde, wie vorstehend beschrieben zu screenen, außer daß Hybridisierungen mit geringerer Stringenz (1 M NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1% SDS, 5% Dextransulfat, 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma und 50°C) und Waschungen (nacheinander mit 2x SSPE, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 5 min und dann wiederum mit frischer Lösung für 10 min und schließlich mit 0,5x SSPE, 0,1% SDS bei 50°C für 5 min) verwendet wurden. Ungefähr 17 stark hybridisierende und 17 schwach hybridisierende Plaquen wurden in dem primären Screen identifiziert, Vier von den schwach hybridisierenden Plaquen wurden ausgesucht und einer oder zwei weiteren Runden von Screenen mit der radiomarkierten Sonde wie vorstehend unterworfen, bis sie rein waren. Um sicherzustellen, daß diese nicht delta-15-Desaturase-Klone waren, wurden sie weiter analysiert, um zu bestimmen, ob sie mit einem 18-bp-Oligomer, spezifisch für die 3'-nicht-kodierende Region von delta-l5-Desaturase-cDNA (pCF3) hybridisierten. Nach Autoradiographie der Filter wurde gefunden, daß einer der Klone nicht mit dieser Sonde hybridisierte. Dieser Klon wurde ausgesucht und ein Plasmid-Klon, enthaltend den cDNA-Insert, wurde wie vorstehend beschrieben erhalten. Restriktionsanalyse dieses Plasmids, bezeichnet als pCM2, zeigte, daß es ein ungefähr 1,3-kb-cDNA-Insert hatte, welchem ein 0,7 kb Nco I – Bgl II Fragment, charakteristisch für die Arabidopsis-delta-15-Desaturase cDNA von pCF3, fehlte. (Dieses Fragment entspricht der DNA, die sich zwischen der Nco-I-Stelle an den Nucleotiden 474 bis 479 und der BgI-II-Stelle an den Nucleotiden 1164 bis 1169 in SEQ ID NO:1 befindet). Teilweise Nucleotidsequenzen von einfachen Strängen aus der 5'-Region und 3'-Region von pCM2 offenbarten, daß das cDNA-Insert unvollständig war und daß es ein Polypeptid kodierte, das ähnlich, aber unterschiedlich von dem ist, das von der cDNA in pCF3 kodiert wird. Um eine Version mit voller Länge der cDNA in dem Plasmid pCM2 zu isolieren, wurde das 1,3 kB-Not-I-Fragment von dem das cDNA-Insert enthaltenden Plasmid pCM2 isoliert und als radiomarkierie Hybridisierungssonde verwendet, um die gleiche Arabidopsis-cDNA-Bibliothek wie vorstehend erneut zu screenen. Drei stark hybridisierende Plaquen wurden gereinigt und die Plasmide wie beschrieben früher exzidiert. Die drei entstehenden Plasmide wurden durch Not-I-Restriktionsenzym digestiert und es wurde gezeigt, daß sie cDNA-Inserts enthalten, die im Größenbereich zwischen 1 kB und 1,5 kB liegen. Vollständige Nucleotidsequenzbestimmung des cDNA-Inserts in einem von diesen Plasmiden, bezeichnet als pACF2-2, ist in SEQ ID NO:4 angegeben. SEQ ID NO:4 zeigt die 5'- bis 3'-Nucleotidsequenz von Basenpaaren der Arabidopsis-thaliana-cDNA, welche eine Fettsäure-Desaturase kodiert. Die Nucleotide 10–12 bzw, die Nucleotide 1358 bis 1350 sind das mutmaßliche Initiationscodon und das Terminationscodon des offenen Leserahmens (Nucleotide 10 bis 1350). Der offene Leserahmen wurde durch Vergleich seiner abgeleiteten Aminosäwesequenzen mit denen der verwandten delta-15-Fettsäure-Desaturase von Sojabohne in dieser Anmeldung bestätigt. Die Nucleotide 1 bis 9 bzw. 1351 bis 1525 sind die 5'- und 3'-untranslatierten Nucleotide. Die Proteinsequenz mit 446 Aminosäuren in SEQ ID NO:5 ist die, die von dem offenen Leserahmen in SEQ ID NO:4 abgeleitet ist, und hat ein geschätztes Molekulargewicht von 51 kD. Die Ausrichtung der SEQ ID NOS:2 und 5 zeigt eine gesamte Homologie von ungefähr 80%, und die der ersteren hat eine ungefähr 55 Aminosäuren lange N-terminale Extension, aus welcher abgeleitet wird, daß sie ein Transitpeptid, gefunden in nuclearkodierten Plastid-Proteinen, ist.
Um die entwicklungsmäßige Expression des Gens entsprechend SEQ ID NO:4 zu analysieren, wurde diese Sequenz als radiomarkierte Hybridisierungssonde auf mRNA-Proben von Blatt, Wurzel, keimendem Sämling und sich entwickelnden Schoten von Arabidopsis-Pflanzen sowohl des Wildtyps als auch der mutanten Linie 3707 verwendet, im wesentlichen wie beschrieben bei Maniatis et al. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Die Ergebnisse zeigten an, daß im Gegensatz zu der konstitutiven Expression des SEQ ID NO: 1 kodierenden Gens die SEQ ID NO: 4 entsprechende mRNA in grünen Geweben reichlich vorhanden, in Wurzeln und Blättern rar ist und etwa dreimal reichlicher im Blatt vorhanden ist als die von SEQ ID NO: 1. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß die cDNA in dem Plasmid pCM2 polymorph zu genonvscher DNA von Arabidonsis thaliana (Ökotyp WassiIeskija und Marker-Linie W 100 Ökotyp Herkunft Landesberg), digestiert mit Eco RI, hybridisiert. Sie wurde als RFLP-Marker verwendet, um den genetischen Locus für das Gen, kodierend diese Fettsäwe-Desatwase in Arabidopsis, zu kartieren. Ein einfacher genetischer Locus wurde entsprechend dieser Desaturase-cDNA positioniert. Es wurde so bestimmt, daß sein Standort an Chromosom 3 zwischen den RFLP-Mackern lambda AT228 und Cosmid c3838 "nördlich" des kahlen Locus war (Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 : 6856-6860; Nam et al., Plant Cell (1989) 1: 699–705). Dies nähert sich der Region, für welche fad 2, fad D, und fad B Mutationen von Arabidopsis-Fettsäure-Desaturase kartieren [Somerville et al., (1992) im Druck]. Erfolglose Anstrengungen, die mikrosomale delta-l2-Fettsäwe-Desaturase unter Verwendung von cDNA-Inserts von pCF3 und pACF2-2 zu klonen, zusammen mit den vorstehenden Daten führten die Anmelder zu dem Schluß, daß die cDNA in pACF2-2 eine Plastid-delta-l5-Fettsäwe-Desatwase kodiert, die dem fad D Locus entspricht. Diese Schlußfolgerung wvd durch biologische Expression der cDNA in pACF2-2 bestätigt.
Das Plasmid pCM2 wurde am 27. November 1991 bei der American Type Culture Collection of Rockville, Maryland unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt und trägt die Zugangsnummer ATCC 68852.
Die 1,4-kb-, 1,3-kB- und 1,5-kB-Not-I-cDNA-Insert-Fragmente, isoliert aus den Plasmiden pCF3, pCM2 und pACF2-2 wurden gereinigt, radiomarkiert und verschiedene Male verwendet, um bei geringer Stringenz wie vorstehend beschrieben zwei verschiedene cDNA-Bibliotheken zu screenen: eine wurde für poly A+ mRNA aus 3 Tage alter etiolierter Arabidopsis thaliana wie vorstehend beschrieben hergestellt ("etiolierte" Bibliothek) und eine für polyA⁺ mRNA aus den vorstehend gemahlenen Teilen von Arabidopsis-thaliana-Pflanzen hergestellt, welche in der Größe von denjenigen, die ihre primären Blätter gerade geöffnet hatten, zu Pflanzen, welche geschossen waren und blühten, variierten [Elledge et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 1731–1735]. Die cDNA-Inserts in der Bibliothek wurden in eine Xho-I-Stelle, flankiert durch Eco-RI-Stellen, in lambda-Yes-Vektor gemacht [Elledge et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 1731–1735] ("Blatt"-Bibliothek). Verschiedene Plaquen aus beiden Bibliotheken, die schwach und in doppelten Lifts mit sowohl SEQ ID NOS:1 als auch 4 hybridisierten, wurden der Plaquereinigung unterworfen. Phagemide wurden aus den reinen Phagen aus der "etiolierten" Bibliothek wie vorstehend beschrieben exzidiert. Plasmide wurden aus den gereinigten Phagen der "Blatt"-Bibliothek durch Stellen-spezifische Rekombination unter Verwendung des cre-lox-Rekombinationssystems in dem E.-coli-Stamm BNN132 exzidiert [Elledge et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:1731-1735]. In allen Fällen offenbarte Nucleotidsequenzierung der klonierten DNA Klone, die entweder identisch zu SEQ ID NOS: 1 oder 4 oder unerkennbare Sequenzen waren.
In einer anderen Gruppe von Experimenten wurden ea. 400000 Phagen in der "Blatt"-Bibliothek mit den SEQ ID NOS:1 und 4 bei geringer Stringenz (26°C, 1 M Na⁺, 50% Formamid) und hoher Stringenz (42°C, 1 M Na+, 50% Formamid) gescreent. Von den verschiedenen positiven Signalen auf den Lifts der primären Plaque zeigten 11 Hybridisierung bei hoher Stringenz mit SEQ ID NO:1, zeigten 35 Hybridisierung hoher Stringenz mit SEQ ID NO:4 und hybridisierten 39 nur bei geringer Stringenz mit beiden. Siebenundzwanzig Plaquen der Signale bei geringer Stringenz kamen durch einen sekundären Screen bei geringer Stringenz, 17 von diesen wurden verwendet, um DNA aus exzidierten Plasmiden herzustellen. Von den 7 wurde die Plasmid-DNA sequenziert, 8 waren unerkennbare Sequenzen, 5 waren identisch mit SEQ ID NO:1, 2 waren identisch mit SEQ ID NO:2 und 2 waren identisch miteinander und verwandt, aber verschieden von den SEQ ID NOS:1 und 4. Die neue Desaturase-Sequenz, bezeichnet als pFad-x2, wurde ebenfalls unabhängig aus der Blatt" Bibliothek isoliert, indem als Hybridisierungssonde ein 0,6-kB-PCR-Produkt verwendet wurde, erhalten durch Polymerase-Kettenreaktion auf poly A+ RNA, hergestellt aus sowohl Canola-Samen wie auch Arabidopsis-Blättern, wie anderswo in dieser Anmeldung beschrieben ist, wobei degenerierte Oligomere, hergestellt für konservierte Sequenzen zwischen Pflanzendelta-15-Desaturasen und der cyanobakteriellen desA-Desaturase, verwendet werden. Das PCR-abgeleitete Plasmid, bezeichnet als pYacp7, wurde teilweise von beiden Enden sequenziert. Vergleich der Sequenzen von pFad-x2 und pYacp7 offenbarte, daß die zwei unabhängig klonierten cDNAs eine identische Sequenz enthielten, die mit den anderen delta-lS-Desaturasen verwandt war, und daß beide unvollständige cDNAs waren. Eine teilweise zusammengesetzte Sequenz, erhalten aus beiden Plasmiden, pFadx-2 und pYacp7, ist in SEQ ID NO:16 als 5'- bis 3'-Nucleotidsequenz von 472 by angegeben. Die Nucleotide 2–4 bzw. die Nucleotide 468 bis 470 sind das erste und das letzte Codon in dem offenen Leserahmen. Dieser offene Leserahmen ist in SEQ )D NO:17 angegeben. Vergleich von SEQ ID NO:17 mit den anderen delta-l5-Desaturase-Polypeptiden offenbarte in dieser Anmeldung nach dem Verfahren von Needleman et al. [J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453)] unter Verwendung von Lückengewicht und Lückenlängengewicht Werte van 3,0 bzw. 0,1. Die gesamten Identitäten sind zwischen 65% und 68% zwischen SEQ ID NO:17 und den mikrosomalen delta-lS-Desaturasen aus Arabidonsis, Canola und Sojabohne, und die gesamten Identitäten sind zwischen 77% und 87% zwischen SEQ ID NO:17 und den Plastid-delta-15-Desaturasen aus Arabidopsis, Canola und Sojabohne. Außerdem hat die SEQ ID NO:17 eine N-terminale Peptidextension, verglichen mit den mikrosomalen delta-lS-Desaturasen, die Homologie der Transitpeptidsequenz in Arabidopsis-Plastid-delta-lS-Desatwase zeigt. Auf der Basis dieser Vergleiche wird abgeleitet, daß SEQ ID NO:16 eine PIastid-delta-15-Desaturase kodiert. Es gibt genetische Daten in Arabidopsis, die das Vorhandensein von zwei Loci für Plastid-delta-15-Desaturase vermuten lassen. Die Version mit voller Länge von SEQ ID NO:16 kann leicht von einem Fachmann isoliert werden. Die biologische Wirkung der Einführung von SEQ ID NO:16 oder seiner Version mit voller Länge in Pflanzen wird verwendet, um seine Identität zu bestätigen.
Das Plasmid pYacp7 wurde am 20. November 1992 bei der American Type Culture Collection of Rockville, Maryland unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt und trägt die Zugangsnummer ATCC 69129.
VERWENDUNG VON ARABIDOPSIS-DELTA-IS-DESATURASE-cDNAS ALS HYBRIDISIERUNGSSONDEN, UM DELTA-15-DESATURASE-cDNAS AUS ANDEREN PFLANZENSPEZIES ZU ISOLIEREN
Für den Zweck der Klonierung der Brassica-napus-Samen-cDNAs, kodierend delta-15-Fettsäure-Desaturasen, wurden die cDNA-Inserts aus pCF3 und pCM2 durch Polymerase-Kettenreaktion aus den entsprechenden Plasmiden isoliert, radiomarkiert und als Hybridisierungssonden verwendet, um eine lambda-Phagen-cDNA-Bibliothek, hergestellt mit poly A+ mRNA aus sich entwickelnden Brassica-napus-Samen 20–21 Tage nach der Befruchtung, zu screenen. Diese cDNA-Bibliothek wurde mehrere Male mit geringer Stringenz gescreent, indem die vorstehend erwähnten Arabidopsis-cDNA-Sonden verwendet wurden. Eine der Brasssica-nanus-cDNAs, erhalten in den anfänglichen Screens, wurde als Sonde in einem nachfolgenden Screen hoher Stringenz verwendet.
Arabidopsis-pCM2-Insert wurde radiomarkiert und als Sonde verwendet, um unter Hybridisienmgsbedingungen geringer Stringenz ungefähr 300000 Plaquen zu screenen. Die Filterhybridisierungen wurden in 50 mM Tris pH 7,6, 6xSSC, 5x Denhardt's, 0,5% SDS, 100 μg DNA von denaturiertem Kalbsthymus bei 50°C über Nacht durchgeführt, und die Posthybridisierungswaschungen wurden in 6x SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatw für 15 min ausgeführt, dann mit 2x SSC, 0,5% SDS bei 45°C für 30 min wiederholt und dann zweimal mit 0,2x SSC, 0,5% SDS bei 50°C für 30 min wiederholt. Fünf stark hybridisierende Phagen wurden erhalten. Diese wurden Plaque-gereinigt und verwendet, um die Phagemide zu exzidieren, wie in dem Handbuch des pBluescriptII Phagemid Kit von Stratagene (Stratagene 1991, Katalog, Punkt 212205) beschrieben ist. Eines von diesen, bezeichnet als pBNSF3-2, enthielt ein 1,3-kb-Insert. pBNSF3-f2 wurde vollständig auf beiden Strängen sequenziert, und die Nucleotidsequenz ist in SEQ ID NO:6 angegeben. Das Plasmid pBNSF3-2 wurde am 27. November 1991 bei der American Type Culture Collection of Rockville Maryland, USA unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt und trägt die zugangsnummer 68854.
Ein zusätzlicher Screen bei geringer Stringent unter Verwendung einer pCM2-Sonde stellte acht stark hybridisierende Phagen bereit. Einer von diesen, bezeichnet als pBNSFd 8, enthielt ein 0,4-kb-Insert. pBNSFd-8 wurde vollständig auf einem Strang sequenziert, diese Nucleotidsequenz zeigte signifikante Divergenz von der Sequenz SEQ ID NO:6 in der homologen Region, welche vermuten ließ, daß sie einer neuen Brassica-napus-Samen-Desatwase, verschieden von der in SEQ ID NO:6 angegebenen, entsprach. Das pBNSFd-8-Insert wurde radiomarkiert und als Hybridisierungssonde in einem Screen bei hoher Stringent der Brassica-nanus-Samen-cDNA-Bibliothek verwendet. Die Hybridisierungsbedingungen waren identisch mit denjenigen des vorstehend beschriebenen Screens bei geringer Stringent, außer daß die Temperatur der finalen beiden 30-min-Posthybridisierungswaschungen in 0,2x SSC, 0,5% SDS auf 60°C erhöht wurden. Dieser Screen ergab drei stark hybridisierende Phagen, die gereinigt und exzidiert wurden. Eines von den exyidierten Plasmiden pBNSFd-3 enthielt ein 1,4-kb-Insert, das auf beiden Strängen vollständig sequenziert wurde. SEQ ID NO: 8 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz von pBNSFd-2.
VERWENDUNG VON ARABIDOPSIS-DELTA-I5-DESATURASE-cDNA ALS HYBRIDISIERUNGSSONDE, UM EINE GLYCEROLIPID-DESATURASE-cDNA AUS SOJABOHNE ZU ISOLIEREN
Eine cDNA-Bibliothek wurde für poly A⁺ mRNA, isoliert aus sich entwickelnden Sojabohnensamen, hergestellt und gescreent im wesentlichen wie vorstehend beschrieben, außer daß die Filter in 25 ml Hybridisierungspuffer, bestehend aus 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 M NaCl, 1% SDS, 5% Dextransulfat und 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma (Sigma Chemical Co.), bei 50°C für 2 h prähybridisiert wurden. Eine radiomarkierte Sonde, hergestellt aus pCF3 wie vorstehend beschrieben, wurde hinzugegeben und für 18 h bei 50°C hybridisieren gelassen. Die Sonden wurden zweimal bei Raumtemperatur mit 2x SSPE, 1% SDS für fünf min gewaschen, nachfolgend für 5 min bei 50°C in 0,2x SSPE, 1% SDS gewaschen. Autoradiographie der Filter zeigte an, daß es eine stark hybridisierende Plaque und ungefähr fünf schwach hybridisierende Plaquen gab. Die stärker hybridisierende Plaque wurde einer zweiten Runde von Screenen wie zuvor unterworfen, außer daß das finale Waschen für 5 min bei 60°C in 0,2X SSPE, 1% SDS erfolgte. Zahkeiche stark hybridisierende Plaquen wurden beobachtet, und ein Phage, gut isoliert von einem anderen, wurde für weitere Analyse ausgesucht.
Sequenzen des pBluescript-Vektors aus dem gereinigten Phagen, einschließlich des cDNA-Inserts, wurden in Anwesenheit eines Helferphagen exzidiert, und das entstehende Phagemid wurde verwendet, um Zellen von E. coli XL-1 Blue zu infizieren. DNA von dem Plasmid, bezeichnet als pXF1, wurde durch das Minipräparationsverfahren mit alkalischer Lyse, beschrieben bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), hergestellt. Die alkalidenaturierte doppelsträngige DNA aus pXF1 wurde auf beiden Strängen vollständig sequenziert. Das Insert von pXF1 enthielt einen Abschnitt von 1783 Nucleotiden, welche einen unbekannten offenen Leserahmen enthielten, und ebenfalls einen poly-A-Abschnitt von 16 Nucleotiden 3' zu dem offenen Leserahmen, aus den Nucleotiden 1767 bis 1783, nachfolgend eine Eco-RI-Restriktionsstelle enthielt. Die 2184 Basen, die dieser Eco-RI-Stelle folgten, enthielten einen offenen Leserahmen von 1145 bp, welcher ein Polypeptid mit etwa 68% Identität zu und colinear mit dem Arabidopsis-delta-15-Desaturase-Polypeptid, aufgeführt in SEQ ID No: 2, kodierte. Das mutmaßliche Start-Methionin des offenen Leserahmens von 1145 bp entsprach dem Start-Methionin des mikrosomalen delta-15-Peptids von Arabidopsis, und es gab keine Aminosäuren entsprechend einem Plastid-Transitpeptid 5' zu diesem Methionin. Wenn das Insert in pXF1 mit Eco RI digestiert wurde, wurden vier Fragmente beobachtet, Fragmente von ungefähr 370 bp und 1400-bp-Fragmente, erhalten aus den ersten 1783 bp des Inserts in pXF1, und Fragmente von ungefähr 600 bp und 1600 bp, erhalten aus den anderen 2184 Nucleotiden des Inserts in pXF1. Nur das 600-bp-und 1600-bp-Fragment hybridisierten auf Southern Blots mit der aus pCF3 erhaltenen Sonde. Es wurde abgeleitet, daß pXF1 zwei unterschiedliche cDNA-Inserts, getrennt durch eine Eco-RI-Stelle, enthielt, und das zweite von diesen Inserts war eine 2184-bp-cDNA, kodierend eine mikrosomale delta-lS-Desatwase der Sojabohne. Die vollständige Nucleotidsequenz der mikrosomalen 2184-bp-delta-15-cDNA der Sojabohne, enthalten in dem Plasmid pXF1, ist in SEQ ID No: 10 aufgeführt. Das Plasmid pXF1 wurde am 3. Dezember 1991 bei der American Type Culture Collection of Rockville, Maryland unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt und trägt die Zugangsnummer ATCC 68874.
VERWENDUNG VON MIKROSOMALER DELTA-15S-DESATURASE-cDNA DER SOJABOHNE ALS HYBRIDISIERUNGSSONDE, UM cDNAS, KODIEREND VERWANDTE DESATURASEN, AUS SOJABOHNE ZU ISOLIEREN
Ein 1,0-kb-Fragment von DNA, entsprechend einem Teil der Kodierungsregion der mikrosomalen delta-lS-Desaturase-cDNA der Sojabohne, enthalten in dem Plasmid pXF1, wurde mit dem Restriktionsenzym Hha I exzidiert und Gel-gereinigt. Das Fragment wurde wie vorstehend beschrieben mit ³²P markiert und verwendet, um eine Sojabohnen-cDNA-Bibliothek wie vorstehend beschrieben zu sondieren. Autoradiographie der Filter zeigte an, daß es acht hybridisierende Plaquen gab, und diese wurden einer zweiten Runde von Screening unterworfen. Sequenzen des pBluescript-Vektors von allen acht der gereinigten Phagen, einschließlich der cDNA-Inserts, wurden in Anwesenheit eines Helferphagen exzidiert, und die entstehenden Phagemide wurden verwendet, um Zellen von E. coli XL-1 Blue zu infizieren. DNA aus den Plasmiden wurde durch die Minipräparationsverfahrensweise mit alkalischer Lyse, beschrieben bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) hergestellt. Restriktionsanalyse zeigte, daß sie Inserts im Größenbereich von 1,0 kb bis 3,0 kb enthielten. Eines von diesen Inserts, bezeichnet als pSFD-118bwp, enthielt ein Insert von etwa 1700 bp. Die alkali-denaturierte doppelsträngige DNA von pSFD-118bwp wurde auf beiden Strängen vollständig sequenziert, angegeben in SEQ ID NO:12. Das Insert von pSFD-118bwp enthielt einen Abschnitt von 1675 Nucleotiden, welche einen offenen Leserahmen, kodierend ein Polypeptid, angegeben in SEQ ID NO:13, von etwa 80% Identität mit und colinear mit dem Arabidopsis-Plastid-delta-15-Desaturase-Polypeptid enthielten, aufgeführt in SEQ ID No: 5. Der offene Leserahmen kodierte ebenfalls Aminosäuren entsprechend einem Plastid-Transitpeptid an dem 5'-Ende des offenen Leserahmens. Das Transitpeptid war colinear mit und teilte einige Homologie mit dem Transitpeptid, beschrieben für die Arabidopsis-Plastiddelta-15-Glycerolipid-Desaturase. Die vollständige Nucleotidsequenz der 1675-bp-Sojabohnen-Plastiddelta-lS-Glycerolipid-Desaturase-cDNA ist in SEQ ID No: 12 aufgeführt.
Vergleich der verschiedenen in der Anmeldung offenbarten delta-15-Desaturase-Sequenzen durch das Verfahren von Needleman et al. (J. Mol. Biol. (1970) 48: 443–453) unter Verwendung von Werten von Lückengewicht und Lückenlängengewicht von 3,0 bzw. 0,1 offenbart die Verwandtschaft zwischen ihnen, wie in Tabelle 3 angegeben ist.
TABELLE 3
Prozent Identitäten zwischen unterschiedlichen delta-15-Fettsäure-Desaturasen an dem Aminosäureniveau
a3, aD, c3, cD, s3 bzw. sD beziehen sich auf SEQ ID NO:2 (mikrosomale delta-lS-Desaturase von Arabidopsis), SEQ ID NO:5 (Plastid-delta-lS-Desaturase von Arabidopsis), SEQ ID NO:7 (mikrosomale delta-lS-Desaturase von Canola), SEQ ID NO:9 (Plastid-delta-lS-Desaturase von Canola), SEQ ID NO:11 (mikrosomale delta-lS-Desaturase der Sojabohne) und SEQ ID NO:13 (Plastid-delta-lS-Desaturase der Sojabohne). Basierend auf diesen Vergleichen haben die delta-lS-Desaturasen sowohl von dem mikrosomalen als auch dem Plastid-Typ Gesamtidentitäten von 65% oder mehr an den Aminosäure-Niveaus, sogar wenn sie von unterschiedlichen Pflanzenspezies sind.
ISOLATION VON NUCLEOTIDSEQUENZEN, KODIEREND HOMOLOGE UND HETEROLOGE GLYCEROLIPID-DESATURASEN
Fragmente der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um cDNAs und Gene von homologen und heterologen Glycerolipid-Desatwasen aus den gleichen Spezies wie das Fragment der Erfindung oder aus unterschiedlichen Spezies zu isolieren. Isolation von homologen Genen unter Verwendung Sequenz-abhängiger Protokolle ist auf dem Fachgebiet bekannt. Southern-Blot-Analyse offenbarte, daß die mikrosomale delta-15-Desatwase-cDNA von Arabidopsis (SEQ ID NO:1) mit genomischen DNA-Fragmenten von Mais und Sojabohne hybridisierte. Außerdem haben die Anmelder demonstriert, daß sie verwendet werden kann, um cDNAs, kodierend mikrosomale delta-lS-Desaturasen von Samen von Brassica napus (SEQ ID NO:6) und Sojabohne (SEQ ID NO:10), zu isolieren. So kann man cDNAs und Gene für homologe Glycerolipid-Desaturasen aus den gleichen oder unterschiedlichen Spezies höherer Pflanzen, speziell aus den ölerzeugenden Spezies, isolieren.
Wichtiger ist, daß man die Fragmente der Erfindung verwenden kann, um cDNAs und Gene für heterologe Glycerolipid-Desaturasen, einschließlich derjenigen, die in Plastiden gefunden werden, zu isolieren. So wurde mikrosomale delta-lS-Desaturase-cDNA von Arabidopsis (SEQ ID NO:1) erfolgreich als Hybridisierungssonde verwendet, um cDNAs, kodierend die verwandten Plastid-delta-15S-Desaturasen aus Arabidopsis (SEQ ID NO:4) und Brassica napus (SEQ ID NO: 8) zu isolieren, und die mikrosomale delta-15-Sojabohne der Sojabohne (SEQ ID NO:10) wurde erfolgreich verwendet, um Sojabohnen-cDNA, kodierend Plastid-delta-lS-Desaturase (SEQ ID NO:12), zu isolieren.
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Regionen der Nucleinsäurefragmente der Erfindung, die zwischen unterschiedlichen Desaturasen konserviert sind, vom Fachmann verwendet werden, um ein Gemisch von degenerierten Oligomeren zur Verwendung in Sequenzabhängigen Protokollen mit dem Ziel der Isolierung von Nucleinsäurefragmenten, kodierend andere homologe oder heterologe Glycerolipid-Desaturase-cDNA's oder -Gene, zu gestalten. Zum Beispiel kann man durch Vergleichen aller Desaturase-Polypeptide Abschnitte von Aminosäuren, die zwischen ihnen konserviert sind, identifizieren und dann die konservierte Aminosäuresequenz verwenden, um Oligomere, sowohl kurze degenerierte oder lange, oder "Guessmers" wie dem Fachmann bekannt ist (siehe Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) zu gestalten. Derartige Oligomere und "Guessmers" können, wie dem Fachmann bekannt ist, als Hybridisierungssonden verwendet werden.
Zum Beispiel offenbarte der Vergleich von cyanobakteriellen desA- und Pflanzen-delta-15 Desaturasen einen besonders gut konservierten Abschnitt von Aminosäuren (Aminosäuren 97-108 in SEQ ID NO:1). Die SEQ ID NOS: 20 und 21 stellen zwei Gruppen von 36-mers, jeweils 16-fach degenerieri, hergestellt für diese Region, dar. Am Ende markierte Oligomere, dargestellt in den SEQ ID NOS:20 und 21, wurden gemischt und als Hybridisierungssonden verwendet, um Arabidopsis-cDNA-Bibliotheken zu screenen. Die meisten der positiv hybridisierenden Plaquen hybridisierten ebenfalls mit cDNAs, kodierend mikrosomale und Plastid-delta-lS-Desaturasen von Arabidopsis (SEQ ID NOS:1 und 4). Jedoch ergab die Verwendung der SEQ ID NOS:20 und 21 keine übereinstimmenden und reproduzierbaren Ergebnisse. Ein 135 Basen langes Oligomer (SEQ ID NO:32) wurde auch als antisense-Strang zu einem längeren Abschnitt der gleichen konservierten Region, den Aminosäuren 97 bis 141 in SEQ ID NO:1 (FVLGHDCGHGSFSDIPLLNSVVGHILHSFILVPYHGWRISHRTHH), hergestellt. In Positionen von Doppeldeutigkeit verwendete die Gestaltung entweder Desoxyinosine oder verwendete am häufigsten Codons, basierend auf der Codonverwendung in Arabidopsis-Genen. Wenn verwendet als Hybridisierungssonde, hybridisierte die 135-mer mit allen Plaquen, die ebenfalls mit cDNAs, kodierend mikrosomale und Plastid-delta-lS-Desaturasen von Arabidopsis (SEQ ID NOS:1 und 4), hybridisierten. Außerdem hybridisierte es ebenfalls mit Plaquen, die nicht mit den SEQ ID NOS:1 und 4 hybridisierten). Die letzteren wurden wie früher beschrieben gereinigt und exzidiert. Nucleotidsequenzierung der cDNA-Inserts in den entstehenden Plasmiden offenbarte DNA-Sequenzen, die keinerlei Verwandtschaft zu irgendeiner Desaturase zeigten.
Um ein anderes Beispiel zu geben, können in der Polymerase-Kettenreaktion (Innis et al., Hrsg., (1990) PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications (PCR-Protokolle: Eine Anleitung zu Methoden und Anwendungen), Academic Press, San Diego) zwei kurze Stücke des vorliegenden Fragments der Erfindung verwendet werden, um ein längeres Glycerolipid-Desatwase-DNA-Fragment von DNA oder RNA zu amplifizieren. Die Polymerase-Kettenreaktion kann ebenfalls an einer Bibliothek von klonierten Nucleotidsequenzen mit einem Primer, basierend auf dem Fragment der Erfindung, und dem anderen auf entweder dem poly A⁺ Schwanz oder einer Vektorsequenz durchgeführt werden. Diese Oligomere können einzigartige Sequenzen oder degenerierte Sequenzen, erhalten aus den Nucleinsäwefragmenten der Erfindung, sein. Das längere Stück von homologer Glycerolipid-Desaturase-DNA, das durch dieses Verfahren erzeugt wird, könnte dann als Sonde zw Isolierung verwandter Glycerolipid-Desatwase-Gene oder -cDNAs aus Arabidopsis oder anderen Spezies verwendet werden. Die Gestaltung von Oligomeren einschließlich langer Oligomere unter Verwendung von Desoxyinosin und "Guessmers" zur Hybridisierung oder für die Polymerase-Kettenreaktion ist dem Fachmann bekannt und bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) diskutiert. Abschnitte von konservierten Aminosäwen zwischen delta-lS-Desatwase und anderen Desaturasen, speziell desA, erlauben die Gestaltung derartiger Oligomere. Zum Beispiel sind konservierte Abschnitte von Aminosäwen zwischen desA- und delta-lS-Desatwase, diskutier vorstehend, bei der Gestaltung langer Oligomere zw Hybridisierung ebenso wie kürzerer zur Verwendung als Primer in der Polymerase-Kettenreaktion verwendbar. In dieser Beziehung ist der konservierte Aminosäweabschnitt der Aminosäuren 97 bis 108 von SEQ ID NO:2 besonders brauchbar. Andere konservierte Regionen in SEQ )D NO:2, die für diesen Zweck verwendbar sind, sind die Aminosäuren 299 bis 309, die Aminosäuren 115 bis 121 und die Aminosäwen 133 bis 141. Der Aminosäweabschnitt 133 bis 141 in SEQ ID NO:2 zeigt speziell gute Homologie mit verschiedenen Desatwasen. Zum Beispiel sind in diesem Abschnitt die Aminosäuren 133, 137, 138, 140 und 141 in delta-lS-Desaturasen von Pflanzen, cyanobakterieller desA, und mikrosomalen Stearoyl-CoA-Desatwasen von Hefe und Säugern konserviert. Der Vergleich von cyanobakterieller des-Aund Pflanzen-delta-15-Desatwase offenbarte zwei besonders gut konservierte Abschnitte von Aminosäwen (die Aminosäwen 97–108 und die Aminosäwen 299–311 in SEQ ID NO: 1), die für PCR verwendet werden können. Die folgenden Gruppen von PCR-Primern wurden für diese Regionen hergestellt:
In einem Experiment wurden PCRs unter Verwendung der SEQ ID NOS: 22 und 23 als sense-Primer und entweder der SEQ ID NOS: 24 und 25 oder der SEQ ID NOS: 26 und 27 als antisense-Primer auf poly A⁺ RNA, gereinigt aus sowohl Blatt von Arabidopsis als auch sich entwickelnden Samen von Canola, durchgeführt. Alle PCRs führten zu PCR-Produkten der konekten Größe (ca. 630 bp). Die PCR-Produkte aus Arabidopsis und Canola wurden gereinigt und als radiomarkierte Hybridisierungssonden verwendet, um die Lambda-Yes-Arabidopsis-cDNA-Bibliothek zu screenen, wie vorstehend beschrieben ist. Dies führte zu der Isolation eines reinen Phagen, welcher exzidiert wurde, wobei sich das Plasmid pYaep7 ergab. Das cDNA-Insert in pYaep7 wurde teilweise sequenziert. Seine Sequenz zeigte, daß es ein unvollständiges Desaturase-Polypeptid kodiert, das identisch mit einer anderen cDNA (in dem Plasmid pFadx-2) war, die durch Hybridisierung bei geringer Stringenz wie früher beschrieben isoliert wurde. Die zusammengesetzte Sequenz, erhalten aus den teilweisen Sequenzen von den cDNA-Inserts in pFadx-2 und pYaep7, ist in SEQ ID NO:16 angegeben und das durch sie kodierte Polypeptid in SEQ ID NO:17. Wie früher diskutiert ist SEQ ID NO:17 eine mutmaßliche Plastid-delta-lS-Desaturase. Dies wird durch Southern-Blot-Analyse unter Verwendung radiomarkierter cDNA-Inserts aus entweder pCF3, pACF2-2 oder pYacp7 auf genomischer DNA von Arabidopsis, digestiert mit einem von verschiedenen Enzymen, weiterhin unterstützt. Sie zeigt, daß die unterschiedlichen Inserts mit unterschiedlichen Restriktionsfragmenten hybridisieren und daß nur die Inserts von pACF2-2 und pYaep7 etwas Kreuzhybridisierung zeigen.
In einem anderen PCR-Experiment wurde PCR unter Verwendung von ea. 80 pmol jeweils der SEQ ID NOS: 28 und 29 als sense-Primer und ca. 94 pmol jeweils der SEQ ID NOS: 30 und 31 als antisense-Primer auf poly A+ RNA, gereinigt aus der Arabidopsis-Mutantenlinie 3707, durchgeführt. Dies wurde unter Verwendung des GeneAmp® RNA PCR Kit (Perkin Elmer Cetus) durchgeführt, indem dem Protokoll des Herstellers gefolgt wurde und das folgende Programm verwendet wurde: a) 1 Zyklus von 2 min bei 95°C, b) 35 Zyklen von 1 min bei 95°C (Denaturation), 1 min bei 50°C (Tempern) und 1 min bei 65°C (Extension) und e) 1 Zyklus von 7 min bei 65°C. Das so erhaltene PCR-Produkt mit der konekten Größe (ea. 630 bp) wurde gereinigt, radiomarkiert und als Hybridisierungssonde auf einem Southern Blot von genomischer DNA von Arabidopsis wie vorstehend beschrieben verwendet. Wenn es auch mit Restriktionsfragmenten hybridisierte, die ebenfalls mit den SEQ ID NOS:1 (mikrosomale delta-l5-Desaturase von Arabidopsis), 4 (Arabidopsis-Plastid-delta-15-Desaturase) und 16 (Arabidopsis-Plastiddelta-15-Desaturase) hybridisierten, hybridisierte es ebenfalls mit neuen Fragmenten, die nicht mit früher klonierten Desaturase-cDNAs hybridisierten. Jedoch hybridisierte, selbst nach verschiedenen Versuchen, das radiomarkierte PCR-Produkt nicht mit irgendeinem neuen cDNA-Klon, wenn es als Sonde auf unterschiedlichen Arabidopsis-cDNA-Bibliotheken verwendet wurde: in allen Fällen hybridisierte es nur mit Plaquen, die auch mit den bekannten Desaturase-cDNAs hybridisierten. Weiterhin wurde das PCR-Produkt in einem Plasmid-Vektor subkloniert und nach dem Screenen von etwa 100 von diesen rief keines einen Klon mit einer neuen Desaturase-Sequenz hervor.
Die Isolation anderer Glycerolipid-Desaturasen wird leichter, da unter Verwendung der Fragmente der Erfindung mehr Beispiele von Glycerolipid-Desaturasen isoliert werden. Kenntnis der konservierten Aminosäuresequenzen von diversen Desaturasen erlaubt ebenfalls, mehr und bessere Wechselwirkungssequenzen zu identifizieren. Derartige Sequenzen können verwendet werden, um Hybridisierungssonden oder Amplifikationsprimer herzustellen, welche die Isolation unterschiedlicher Glycerolipid-Desatwasen, einschließlich derjenigen aus nicht-Pflanzenquellen, wie beispielsweise Pilze, Algen und sogar Cyanobakterien, ebenso wie anderer Membran-assoziierter Desatwasen aus anderen Organismen weiterhin unterstützen.
Die Funktion der diversen Nucleotidfragmente, kodierend Glycerolipid-Desatwasen, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung isoliert werden können, kann durch Transformieren der Pflanzen mit den isolierten Desatwasesequenzen, verknüpft in sense- oder antisense-Orientierung mit geeigneten regulatorischen Sequenzen, erforderlich für Pflanzenexpression, und Beobachten des Fetisäue-Phänotyps der so erhaltenen transgenen Pflanzen identifiziert werden. Bevorzugte Zielpflanzen für die Transformation sind die gleichen wie das Ausgangmaterial der isolierten Nucleotidfragmente, wenn das Ziel ist, Hemmung des entsprechenden endogenen Gens durch antisense-Hemmung oder Cosuppression zu erhalten. Bevorzugte Zielpflanzen zw Verwendung in Expression oder Überexpression der isolierten Nucleinsäwefragmente sind Pflanzen mit bekannten Mutationen in Desaturationsreaktionen, wie beispielsweise die Arabidopsis-Desatwase-Mutanten, mutanter Flachs mit unzulänglicher delta-l5-Desaturation oder mutante Sonnenblume mit unzulänglicher delta-l2-Desatwation. Alternativ kann die Funktion der isolierten Nucleinsäwefragmente ähnlich durch Transformation anderer Organismen, wie beispielsweise Hefe oder Cyanobakterien, mit chimären Genen, enthaltend das Nucleinsäurefragment und geeignete regulatorische Sequenzen, mit nachfolgender Analyse von Fettsäurezusammensetzung und/oder Enzymaktivität bestimmt werden.
ÜBEREXPRESSION DER GLYCEROLIPID-DESATURASE-ENZYME IN TRANSGENEN SPEZIES
Das (die) Nucleinsäwefragment(e) der vorliegenden Erfindung, kodierend funktionelle Glycerolipid-Desaturase(n), kann (können) mit geeigneten regulatorischen Sequenzen verwendet werden, um das (die) Enzym(e) in transgenen Organismen zu überexprimieren. Derartige rekombinante DNA-Konstrukte können entweder das native Glycerolipid-Desatwase-Gen oder ein chimäres Glycerolipid-Desatwase-Gen, isoliert aus der gleichen oder einer unterschiedlichen Spezies als Wirtsorganismus, einschließen. Für Überexpression von Glycerolipid-Desaturase(n) ist es vorzuziehen, daß das eingeführte Gen von einer unterschiedlichen Spezies ist, um die Wahrscheinlichkeit von Cosuppression zu veningern. Zum Beispiel kann Überexpression von delta-lS-Desatwase in Sojabohne, Rapssamen oder anderen ölerzeugenden Spezies, um veränderte Niveaus von mehrfach ungesättigten Fettsäwen zu erzeugen, durch Exprimieren von RNA aus der gesamten cDNA, gefunden in pCF3, erreicht werden. Ähnlich können die isolierten Nucleinsäwefragmente, kodierend Glycerolipid-Desaturasen aus Arabidopsis, Rapssamen und Sojabohne, ebenfalls vom Fachmann verwendet werden, um im wesentlichen homologe cDNAs mit voller Länge, wenn nicht schon erhalten, ebenso wie die entsprechenden Gene als Fragmente der Erfindung zu erhalten. Diese können dann wieder verwendet werden, um die entsprechenden Desatwasen in Pflanzen zu überexprimieren. Ein Fachmann kann auch die kodierende(n) Sequenzen) aus dem(n) Fragmenten) der Erfindung durch Verwendung und/oder Erzeugung von Stellen für Restriktionsendonucteasen isolieren, wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben ist. Zum Beispiel ist das Fragment in SEQ ID NO:1 in dem Plasmid pCF3 durch Not-I-Stellen flankiert und kann als Not-I-Fragment isoliert werden, das in der sense-Orientierung relativ zu geeigneten regulatorischen Sequenzen der Pflanze eingeführt werden kann. Alternativ können Stellen für Neo I (5'-CCATGG-3') oder Sph I (5'-GCATGC-3'), die präzise Entfernung von kodierenden Sequenzen, beginnend mit dem initiierenden Codon "ATG", erlauben, zu dem(n) Fragmenten) der Erfindung verarbeitet werden. Zum Beispiel kann zur Nutzung der kodierenden Sequenz von delta-l5-Desaturase aus pCF3 eine Sph-I-Stelle durch Substituieren von Nucleotiden an den Positionen 44, 45 und 49 von SEQ ID NO:1 mit G, C bzw. C, verarbeitet werden.
HEMMUNG VON PFLANZEN-ZIELGENEN DURCH VERWENDUNG VON ANTISENSE-RNA
Antisense-RNA ist verwendet worden, um Pflanzen-Zielgene in einer gewebespezifischen Weise zu hemmen (siehe van der Krol et al., Biotechniques (1988) 6: 958–976). Es ist gezeigt worden, daß antisense-Hemmung die gesamte cDNA-Sequenz (Sheehy et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85: 8805–8809) ebenso wie eine teilweise cDNA-Sequenz (Cannon et al., Plant Molec. Biol. (1990) 15 : 39-47) verwendet. Es gibt ebenfalls einen Beweis, daß die 3'-nicht-kodierenden Sequenzen (Ch'ng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 10006–10010) und Fragmente der 5'-kodierenden Sequenz, die so wenige wie 41 Basenpaare einer 1,87-kb-cDNA enthalten (Cannon et al., Plant Molec. Biol. (1990) 15: 39–47), wichtige Rollen bei der antisense-Hemmung spielen können.
Die Verwendung von antisense-Hemmung der Glycerolipid-Desaturasen kann Isolation der transkribierten Sequenz für eine oder mehrere Ziel-Glycerolipid-Desaturase Gene, die in dem Zielgewebe der Zielpflanze exprimiert werden, erfordern. Die Gene, die im höchsten Maße exprimiert werden, sind die besten Ziele für antisense-Hemmung. Diese Gene können durch Bestimmen ihrer Niveaus der Transkription durch Techniken, wie beispielsweise quantitative Analyse von mRNA-Niveaus oder nucleare run-off-Transkription, die dem Fachmann bekannt sind, identifiziert werden.
Zum Beispiel kann antisense-Hemmung der delta-lS-Desaturase in Brassica napus, die zu veränderten Niveaus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren führt, durch Exprimieren von antisense-RNA aus der gesamten oder teilweisen cDNA, gefunden in pBNSF3-2, erreicht werden.
HEMMUNG VON PFLANZEN-ZIELGENEN DURCH COSUPPRESSION
Das Phänomen der Cosuppression ist ebenfalls verwendet worden, um Pflanzen-Zielgene in einer gewebespezifischen Weise zu hemmen. Cosuppression eines endogenen Gens unter Verwendung der gesamten cDNA-Sequenz (Napoli et al., The Plant Cell (1990) 2: 279–289; van der Krol et al., The Plant Cell (1990) 2: 291–299) ebenso wie einer teilweisen cDNA-Sequenz (730 bp einer 1770-bp-cDNA) (Smith et al., Mol. Gen. Genetics (1990) 224: 477–481) sind bekannt.
Die Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung, kodierend Glycerolipid-Desaturasen oder Teile davon mit geeigneten regulatorischen Sequenzen, können verwendet werden, um das Niveau von Glycerolipid-Desaturasen zu vemngern, wodurch die Fettsäurezusammensetzung in transgenen Pflanzen verändert wird, welche ein endogenes Gen, im wesentlichen homolog mit dem eingefiilvten Nucleinsäurefragment, enthalten. Die dafür notwendigen experimentellen Verfahrensweisen sind ähnlich denjenigen, die vorstehend für die Überexpression der Glycerolipid-Desaturase-Nucleinsäurefragmente beschrieben sind. Zum Beispiel kann Cosuppression von delta-lS-Desaturase in Brassica napus, die zu veränderten Niveaus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren führt, durch Exprimieren der gesamten oder teilweisen Samen-delta-15-Desaturase-cDNA, gefunden in pBNSF3-2, in der sense-Orientierung erreicht werden.
AUSWAHL VON WIRTEN, PROMOTOREN UND ENHANCERN
Eine bevorzugte Klasse von heterologen Wirten für die Expression der Nucleinsäurefragmente der Erfindung sind eukaryotische Wirte, besonders die Zellen von höheren Pflanzen. Besonders bevorzugt unter den höheren Pflanzen sind die ölerzeugenden Spezies, wie beispielsweise Sojabohne (Glycine max), Rapssamen (einschließlich Brassica napus, B. campestris , Sonnenblume (Helianthus annua), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Mais (Zea mays) , Kakao (Theobroma cacao), Saflor (Carthamus tinctorius), Ölpalme (Elaeis guineensis), Kokosnußpalme (Cocos nucifera), Flachs (Linum usitatissimum) und Erdnuß (Arachis hypogaea).
Expression in Pflanzen verwendet regulatorische Sequenzen, die funktionell in derartigen Pflanzen sind. Die Expression fremder Gene in Pflanzen ist fest eingeführt (De Blaere et al., Meth. Enzymol. (1987) 153: 277–291). Der Ausgangsstoff' des Promotors, ausgewählt, um die Expression der Fragmente der Erfindung zu lenken, ist nicht kritisch, mit der Maßgabe, daß er ausreichend transkriptionelle Aktivität hat, um die Erfindung durch Vergrößern bzw. Verkleinern des Niveaus von translatierbarer mRNA für die Glycerolipid-Desaturasen in dem gewünschten Wirtsgewebe zu bewerkstelligen. Zu bevorzugten Promotoren gehören (a) starke konstitutive Pflanzenpromotoren, wie beispielsweise diejenigen, die die 19Sund 35S-Transkripte in Blumenkohlmosaikvirus dirigieren (Odell et al., Nature (1985) 313: 810–812; Hull et al., Viology (1987) 86: 482–493), und (b) gewebe- oder entwicklungsspezifische Promotoren. Beispiele von gewebespezifischen Promotoren sind der lichtinduzierbare Promotor der kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-Bisphosphatcarboxylase (wenn Expression in photosynthetischen Geweben gewünscht wird), der Mais-Zein-Protein-Promotor (Matzke et al., EMBO J. (1984) 3: 1525–1532) und der Chlorophyll-aB-Bindungsprotein-Promotor (Lampa et al., Nature (1986) 316: 750–752).
Besonders bevorzugte Promotoren sind diejenigen, die samenspezifische Expression erlauben. Diese können speziell nützlich sein, da Samen die primäre Quelle von Pflanzenölen sind und ebenfalls, da samenspezifische Expression eine potentiell schädliche Wirkung in nicht-Samengeweben vermeidet. Zu Beispielen von samenspezifischen Promotoren gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, die Promotoren von Samenspeicherproteinen, welche in vielen Pflanzen bis zu 90% des gesamten Samenproteins darstellen können. Die Samenspeicherproteine sind streng reguliert, wobei sie fast ausschließlich in Samen in einer in hohem Maße gewebespezifischen und stadiumspezifischen Weise exprimiert werden (Higgins et al., Ann. Rev. Plant Physiol. (1984) 35: 191–221; Goldberg et al., Cell(1989) 56: 149–160). Darüber hinaus können in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung des Samens unterschiedliche Samenspeicherproteine exprimiert werden.
Die Expression von samenspezifischen Genen ist in großer Ausführlichkeit untersucht worden (siehe Übersichten von Goldberg et al., Cell (1989) 56: 149–160 und Higgins et al., Ann. Rev. Plant Physiol. (1984) 35: 191–221). Es gibt gegenwärtig zahlreiche Beispiele samenspezifischer Expression von Samenspeicherprotein-Genen in transgenen zweikeimblättrigen Pflanzen. Zu diesen gehören Gene von zweikeimblättrigen Pflanzen für Bohnen-b-Phaseolin (Sengupta-Gopalan et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1985) 82: 3320–3324; Hoffman et al., Plant Mol. Biol. (1988) 11: 717–729), Bohnen-Lectin (Voelker et al., EMBO J. (1987) 6: 3571–3577), Sojabohnen-Lectin (Okamuro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8240–8244), Sojabohnen-Kunitz-Trypsin-Inhibitor (Perez-Grau et al., Plant Cell (1989) 1: 095–1109), Sojabohnen-b-Conglycinin (Beachy et al., EMBO J. (1985) 4: 3047–3053; Erbsen-Vicilin (Higgins et al., Plant Mol. Biol. (1988) 11: 683–695), Erbsen-Convicilin (Newbigin et al., Planta (1990) 180: 461–470), Erbsen-Legumin (Shirsat et al., Mol. Gen. Genetics (1989) 215: 326–331); Rapssamen-Napin (Radke et al., Theor. Appl. Genet. (1988) 75: 685–694) ebenso wie Genen von einkeimblättrigen Pflanzen wie beispielsweise für Mais-15-kD-Zein (Hoffinan et al., EMBO J. (1987) 6: 3213–3221), Mais-l8-kD-Oleosin (Lee at al., Proc Natl. Acad. Sci. USA (1991) 888: 6181–6185), Gerste-b-Hordein (Marris et al., Plant Mol. Biol. (1988) 10: 359–366) und Weizen-Glutenin (Colot et al., EMBO J. (1987) 6: 3559–3564). Darüber hinaus bewahren Promotoren von samenspezifischen Genen, operabel verknüpft mit heterologen kodierenden Sequenzen in chimären Genkonstrukten, ebenfalls ihr zeitliches und räumliches Expressionsmuster in transgenen Pflanzen. Zu derartigen Beispielen gehören die Verwendung von Samenspeicherprotein-Gen-Promotor von Arabidopsis thaliana 2S, um Enkephalinpeptide in Samen von Arabidopsis und B. napus zu exprimieren (Vandekerckhove et al., Bio/Technology (1989) 7: 929–932), Bohnen-Lectin und Bohnen-β-Phaseolin-Promotoren, um Luciferase zu exprimeren (Riggs et al., Plant Sci. (1989) 63: 47–57), und Weizen-Glutenin-Promotoren, um Chloramphenicol-Acetyltransferase zu exprimieren (Colot et al., EMBO J. (1987) 6: 3559–3564).
Von besonderem Nutzen bei der Expression des Nucleinsäwefragments der Erfindung sind die heterologen Promotoren von verschiedenen Sojabohnen-Samenspeicherprotein-Genen wie beispielsweise diejenigen für den Kunitz-Trypsin-Inhibitor (Jofuku et al., Plant Cell (1989) 1: 1079–1093); Glycinin (Nielson et al., Plant Cell (1989) 1: 313–328) und β-Conglycinin (Harada et al., Plant Cell (1989) 1: 415-425). Promotoren von Genen für a- und b-Untereinheiten von Sojabohnen-β-Conglycinin-Speicherprotein sind beim Exprimieren der mRNA oder der antisense-RNA in den Kotyledonen im mittleren bis späten Stadium der Samenentwicklung (Beachy et al., EMBO J. (1985) 4: 3047–3053) in transgenen Pflanzen besonders brauchbar. Dies ist der Fall, weil es sehr wenig Positionswirkung auf ihre Expression in transgenen Samen gibt und die zwei Promotoren unterschiedliche zeitliche Regulation zeigen. Der Promotor für das a-Untereinheit-Gen wird einige Tage vor dem für das b-Untereinheit-Gen exprimiert. Dieses ist für die Transformierung von Rapssamen wichtig, wo die Öl-Biosynthese etwa eine Woche vor der Samenspeicherproteinsynthese beginnt (Murphy et al., J. Plant Physiol. (1989) 135: 63–69).
Ebenfalls von besonderem Nutzen sind Promotoren von Genen, die während früher Embryogenese und Ölbiosynthese exprimiert werden. Die nativen regulatorischen Sequenzen, einschließlich der nativen Promotoren, der Glycerolipid-Desatwase-Gene, die die Nucleinsäurefragmente der Erfindung exprimieren, können nach ihrer Isolation durch den Fachmann verwendet werden. Heterologe Promotoren von anderen Genen, beteiligt an der Samenölbiosynthese, wie beispielsweise diejenigen fiir B. napus Isocitratlyase und Malatsynthase (Comai et al., Plant Cell (1989) 1: 293–300), delta-9-Desaturase aus Saflor (Thompson et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1991) 88: 2578–2582) und Castor (Shanklin et al., Proc. NatL'Acad. Sci. USA (1991) 88: 2510–2514), Acyl-Trägerprotein (ACP) aus Arabidopsis (Post-Beittenmiller et al., Nucl. Acids Res. (1989) 17: 1777), B. napuus (Safford et al., Eur. J. Biochem. (1988) 174: 287–295) und B. camnestris (Rose et al., Nuel. Acids Res. (1987) 15: 7197), b-Ketoacyl-ACP-Synthetase aus Gerste (Sil;gaard-Andersen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 4114–4118) und Oleosin aus Zea mays (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 6181–6185), Sojabohne (Genbank Accession No: X60773) und B. napus (Lee et al., Plant Physiol. (1991) 96: 1395–1397) werden von Nutzen sein. Wenn die Sequenz der entsprechenden Gene nicht offenbart ist oder ihre Promotonegion nicht identifizieri ist, kann ein Fachmann die veröffentlichte Sequenz verwenden, um das entsprechende Gen und ein Fragment davon, enthaltend den Promotor, zu isolieren. Die teilweisen Proteinsequenzen für die relativ reichlich vorhandene Enoyl-ACP-Reduktase und Acetyl-CoA-Carboxylase sind ebenfalls veröffentlicht (Slabas et al., Biochim. Biophys. Acta (1987) 877: 271–280; Cottingham et al., Biochim. Biophys. Acta (1988) 954: 201–207), und ein Fachmann kann diese Sequenzen verwenden, um die entsprechenden Samengene mit ihren Promotoren zu isolieren. Ähnlich können die Fragmente der vorliegenden Erfindung, kodierend Glycerolipid-Desaturasen, verwendet werden, um Promotonegionen der entsprechenden Gene zur Verwendung beim Exprimieren chimärer Gene zu erhalten.
Eneichen des richtigen Niveaus der Expression der Nucleinsäwefragmente der Erfindung kann die Verwendung unterschiedlicher chimärer Gene unter Ausnutzung unterschiedlicher Promotoren erfordern. Derartige chimäre Gene können entweder zusammen in einem einzelnen Expressionsvektor oder nacheinander unter Verwendung von mehr als einem Vektor in Wirtspflanzen transferiert werden.
Man stellt sich vor, daß die Einführung von Enhancern oder Enhancer-ähnlichen Elementen in die Promotor-Regionen entweder der nativen oder der chiraären Nucleinsäurefragmente der Erfindung zu vergrößerter Expression führt, um die Erfindung ru bewerkstelligen. Zu diesen würden virale Enhancer, wie beispielsweise diejenigen, gefunden in dem 35S-Promotor (Odell et al., Plant Mol. Biol. (1988) 10: 263-272), Enhancer aus den Opin-Genen (Fromm et al., Plant Cell (1989) 1: 977–984) oder Enhancer aus irgendeiner anderen Quelle gehören, die, wenn in einen Promotor, operabel verknüpft mit dem Nucleinsäurefragment der Erfindung, plaziert, zu vergrößerter Transkription führen.
Von besonderer Bedeutung ist das DNA-Sequenzelement, isoliert aus dem Gen für die a-Untereinheit von β-Conglycinin, das 40-fache samenspezifische Verstärkung an einen konstitutiven Promotor übertragen kann (Chen et al., Dev. Genet. (1989) 10: 112–122). Ein Fachmann kann dieses Element leicht isolieren und es innerhalb der Promotorregion eines beliebigen Gens insertieren, um samenspezifische verstärkte Expression mit dem Promotor in transgenen Pflanzen zu erhalten. Insertion eines derartigen Elements in ein beliebiges samenspezifisches Gen, das zu anderen Zeiten als das β-Conglycinin-Gen exprimiert wird, führt für einen längeren Zeitraum während der Samenentwicklung zu Expression in transgenen Pflanzen.
Die Erfindung kann auch durch eine Vielfalt von anderen Verfahren, um das gewünschten Ziel zu erhalten, bewerkstelligt werden. In einer Form basiert die Erfindung auf der Modifizierung von Pflanzen, um auf Grund der Einführung mehr als einer Kopie des fremden Gens, enthaltend die Nucleinsäurefragmente der Erfindung, vergrößerte Niveaus von Glycerolipid-Desatwasen zu erzeugen. In einigen Fällen kann das gewünschte Niveau von mehrfach ungesättigten Fettsäuren die Einführung fremder Gene für mehr als eine Art von Glycerolipid-Desaturase erfordern.
Eine beliebige 3'-nicht-kodierende Region, fähig ein Polyadenylierungssignal und andere regulatorische Sequenzen bereitzustellen, die für die richtige Expression der Nucleinsäurefragmente der Erfmdung erforderlich sein können, kann verwendet werden, um die Erfindung zu bewerkstelligen. Diese würde 3'-Enden der nativen Glycerolipid-Desaturase(n), virale Gene wie beispielsweise aus den 35S- oder den 19S-Blumenkohlmosaikvirus-Translσipten, aus den Opinsynthese-Genen, Ribulose-l,5-Bisphosphatcarboxylase oder Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein einschließen. Es gibt zahlreiche Beispiele auf dem Fachgebiet, die die Brauchbarkeit unterschiedlicher 3'-nicht-kodierender Regionen lehren.
TRANSFORMATIONSMETHODEN
Verschiedene Methoden zum Transformieren von Zellen höherer Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann verfügbar (siehe EPO Pub. 0295959 A2 und 0318341 A1). Zu derartigen Methoden gehören diejenigen, die auf Transformationsvektoren unter Ausnutzung der Ti- und Ri-Plasmide von Agrobacterium spe. basieren. Es wird besonders bevorzugt, den binären Typ dieses Vektors zu verwenden. Ti-abgeleiteteVektoren transformieren eine weite Vielfalt höherer Pflanzen einschließlich einkeimblättriger und zweikeimblättrigen Pflanzen (Sukhapinda et al., Plant Mol. Biol. (1987) 8: 209–216; Potrykus, Mol. Gen. Genet. (1985) 199: 183). Andere Transformationsmethoden sind für den Fachmann verfügbar, wie beispielsweise direkte Aufnahme fremder DNA-Konstrukte (siehe EPO Pub. 0295959 A2), Techniken der Elektroporation (Fromm et al., Nature (1986) (London) 319: 791) oder ballistische Bombardierung mit hoher Geschwindigkeit mit Metallpartikeln, beschichtet mit den Nucleinsäurekonstrukten (Kline et al., Nature (1987) (London) 327: 70). Sobald transformiert können die Zellen durch den Fachmann regeneriert werden.
Von besonderer Relevanz sind die kürzlich beschrieben Methoden, um fremde Gene in kommerziell wichtige Feldfrüchte wie beispielsweise Rapssamen (De Block et al., Plant Physiol. (1989) 91: 694–701), Sonnenblume (Everett et al., Bio/Technology (1987) 5: 1201) und Sojabohne (Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1989) 86: 7500–7504) zu transformieren.
ANWENDUNG AUF RFLP-TECHNOLOGIE
Die Verwendung von Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-(RFLP)-Markern in der Pflanzenzüchtung wurde auf dem Fachgebiet gut dokumentiert (Tanksley et al., Bio/Technology (1989) 7: 257–264). Die Nucleinsäurefragmente der Erfindung können als RFLP-Marker für mit der Expression von Glycerolipid-Desaturasen verknüpfte Eigenschaften verwendet werden. Zu diesen Eigenschaften gehören veränderte Niveaus von ungesättigten Fettsäuren. Das Nucleinsäurefragment der Erfindung kann auch verwendet werden, um das Glycerolipid-Desatwase-Gen aus varianten (einschließlich mutanten) Pflanzen mit veränderten Niveaus von ungesättigten Fettsäuren zu isolieren. Sequenzierung dieser Gene offenbart Nucleotiddifferenzen von dem normalen Gen, die die Variation verursachen. Kurze Oligonucleotide, gestaltet um diese Differenzen herum, können als Hybridisierungssonden verwendet werden, um der Variation in mehrfach ungesättigten Verbindungen zu folgen. Oligonucleotide, basierend auf Differenzen, die mit der Variation verknüpft sind, können als molekulare Macker bei der Züchtung dieser varianten Öleigenschaften verwendet werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin in den folgenden Beispielen definiert, in welchen alle Teile und Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind und Grad Celsius sind, wenn es nicht anderweitig festgestellt ist. Es sollte selbstverständlich sein, daß diese Beispiele, wenn sie auch bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anzeigen, lediglich zur Veranschaulichung angegeben sind. Aus der vorstehenden Diskussian und diesen Beispielen kann ein Fachmann die wesentlichen charakteristischen Eigenschaften dieser Erfindung bestimmen und kann, ohne von dem Geist und Umfang davon abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifizierungen der Erfindung ausführen, um sie an verschiedene Nutzungen und Bedingungen anzupassen. Alle Veröffentlichungen, einschließlich Patenten und nicht-Patent-Literatur, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, sind hier durch Bezugnahme ausdrücklich einbezogen.
BEISPIEL 1
ISOLATION VON GENOMISCHER DNA, FLANKIEREND DIE T-DANN-STELLE DER INSERTION IN DER MUTANTENLINIE 3707 VON ARABIDOPSIS THALIANA
IDENTIFIKATION EINER ARABIDOPSIS-THALIANA-T-DNA-MUTANTE MIT GERINGEM LINOLENSÄUREGEHALT
Eine Population Transformanten von Arabidopsis thaliana (geographische Rasse Wassilewskija), die die T-DNA von Agrobacterium tumefaciens enthalten, wurde durch Samentransformation erzeugt, wie von Feldmann et al. beschrieben ist (Mol. Gen. Genetics (1987) 208: 1–9). In dieser Population enthalten die Transformanten DNA-Sequenzen, kodierend den bakteriellen Vektor pBR322, Nopalinsynthase, Neomycinphosphotransferase (NPTII, überträgt Kanamycin-Resistenz) und b-Lactamase (überträgt Ampicillin-Resistenz) innerhalb der T-DNA-Grenzsequenzen. Die Integration der T-DNA in unterschiedliche Bereiche der Chromosomen individueller Transformanten kann eine Zeneißung der Pflanzengenfunktion an oder nahe der Stelle der Insertion verursachen, und Phäriotypen, verbunden mit diesem Verlust von Genfunktion, können durch Screenen der Population für den Phänotyp analysiert werden.
T3-Samen wurde aus dem Wildtyp-Samen, behandelt mit Agrobacterium tumefaciens, durch zwei Runden von Selbstbefruchtung, erzeugt, wie von Feldmann et al. beschrieben ist (Science (1989) 243: 1351-1354). Diese Nachkommenschaft wurde für die T-DNA-Insertion, und so für eine Mutation, die sich aus der Insertion ergibt, segregiert. Ungefähr 100 Samen von jeder von 6000 Linien wurden vereinigt, und der Fettsäwegehalt von jeder der 6000 gepoolten Proben wurde durch Gaschromatographie der Fettsäuremethylester im wesentlichen wie von Browse et al. beschrieben bestimmt (Anal. Biochem. (1986) 152: 141–145), außer daß 2,5% H₂SO₄ in Methanol als Methylierungsreagenz verwendet wurden und Proben für 1,5 h auf 80°C erwärmt wurden, um die Methanolyse der Samentriglyceride zu bewirken. Eine Linie, bezeichnet als "3707", erzeugte Samen, die ein verändertes Fettsäweprofil, verglichen mit dem der Gesamtpopulation, ergaben. T3-Pflanzen wurden aus individuellen T3-Samen, erzeugt durch Linie 3707, gezüchtet und selbstbefruchtet, um T4-Samen auf individuellen Pflanzen, die entweder homorygoter Wildtyp, homorygote Mutante oder heterorygot waren, für die Mutation zu erzeugen. Die Prozent Fettsäurezusammensetzungen einer repräsentativen Unterprobe der gesamten Population, der gepoolten 3707-T3-Samen und eines homorygoten T4-Mutantensegregants sind in Tabelle 4 angegeben, TABELLE 4
Der Phänotyp des segregierenden T3-Pools von Linie 3707 (hoher Linoleinsäwegehalt, geringer Linolensäwegehalt) war Zwischenprodukt zwischen dem von der Populationsuntergruppe und den homorygoten T4-Mutante-Samen, was vermuten läßt, daß Linie 3707 eine Mutation an einem Locus beherbergte, welche die Umwandlung von Linolein- zu Linolensäwe in dem Samen steuert. Noch war es nicht offensichtlich, ob der mutante Phänotyp in Linie 3707 das Ergebnis einer T-DNA-Insertion war. Daher überprüften die Anmelder eine segregierende T4-Population, um zu bestimmen, ob der mutante Fettsäure-Phänotyp mit der Nopalinsynthase-Aktivität und Kanamycin-Resistenz, kodiert durch das T-DNA-Insert, cosegregierte. Eine Gesamtmenge von 263 T4-Pflanzen wurde gezüchtet und auf die Anwesenheit von Nopalin in Blattextrakten geprüft (Enampalli et al., The Plant Cell (1991) 3: 149–157).
Außerdem wurden T5-Samen von jeder der T4-Pflanzen gesammelt, und Proben von 10–50 Samen wurden genommen, um die Samenfettsäwezusammensetzung zu bestimmen und um ihre Fähigkeit zu bestimmen, in Anwesenheit von Kanamycin zu keimen (Feldmann et al., (1989) Science 243: 1351–1354). Die 263 Pflanzen fielen wie in Tabelle 5 in 3 Klassen.
TABELLE 5
Die Cosegregation des Fettsäwe-Phänotyps mit den durch T-DNA-Sequenzen übertragenen Phänotypen in einem ungefähr 1 : 2 : 1-Muster stellte starken Beweis bereit, daß die Mutation in Linie 3707 das Ergebnis einer T-DNA-Insertion war. Weitere Experimente wurden dann mit der Absicht durchgeführt, Sonden zu verwenden, die T-DNA-Sequenzen enthalten, um das T-DNA-Insert und flankierende genomische DNA aus Linie 3707 zu klonieren.
HERSTELLUNG VON GENOMISCHER DNA AUS HOMOZYGOTEN 3707-PFLANZEN
Samen von einer homorygoten Linie, erhalten aus Arabidopsis thaliana (geographische Rasse Wassilewskija (WS)), Linie 3707, wurden für 5 min bei Raumtemperatw in einer Lösung von 5,25% Natriumhypochlorit (Gew.Nol.)/0,15% Tween 20 (Vol.Nol.) oberflächensterilisiert, dann verschiedene Male in sterilem destillierten Wasser, mit einer finalen Spülung in 50% Ethanol, gewaschen. Unmittelbar nach der Ethanolwaschung wurden die Samen zum Trocknen auf steriles Filterpapier überführt. Einer von drei Samen wurde dann in 250-ml-Kolben, die 50 ml steriles Gamborgs-B5-Medium (Gibco, 500-1153EA), pH 6,0 enthielten, überführt. Die Kultwen wurden bei 22°C, 70 μE·/m^-2· s^-1 kontinuierlichem Licht für ungefähr drei Wochen inkubiert, nach welcher Zeit das Wwzelgewebe geerntet, zu 10-g-Aliquots (Feuchtgewicht) verarbeitet, lyophilisiert und bei –20°C aufbewahrt wurde.
Unter Verwendung einer Variation der Verfahrensweise von Shure et al. (Cell (1983) 35: 225–233) wurde genomische DNA aus dem Wurzelgewebe isoliert. Zwei Aliquots von lyophilisiertem Gewebe wurden unter Verwendung von einem Mörder und Pistill zu einem feinen Pulver gemahlen. Das gemahlene Gewebe wurde in einen Kolben, enthaltend 85 ml Lyse-Puffer (7 M Hamstoff 0,35 M NaCI, 0,05 M Tris-HCI, pH 8,0, 0,02 M EDTA, 1% Sarkosyl, 5% Phenol), gegeben und sanft mit einem Glasstab gemischt, um eine homogene Suspension zu erhalten. Zu dieser Suspension wurde ein gleiches Volumen von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) (ins Gleichgewicht gebracht mit 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA) hinzugegeben. Nach der Zugabe von 8,5 ml 10%igem SDS wurde das Gemisch auf einer rotierenden Plattform für 15 min bei Raumtemperatur verwirbelt. Nach Zentrifugation mit 2000xg für 15 min wurde die obere wässerige Phase in ein neues Röhrchen verbracht und zwei weitere Male wie vorstehend, aber ohne die Zugabe von SDS, extrahiert. Zu der finalen wässerigen Phase wurden I/120 des Volumens von 3 M Kaliumacetat, pH 5,5 und zwei Mal das Volumen von eiskaltem 100%igem Ethanol hinzugegeben. Die Ausfällung der DNA wurde durch Inkubation bei -20°C für eine Stunde und nachfolgende Zentrifugation mit 12,000xg für 10 min erleichtert. Das so erhaltene Pellet wurde in 3 ml von 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA, wozu 0,95 g Cäsiumchlorid (CsCI) und 21,4 μl von 10 mg/ml Ethidiumbromid (EtBr) pro ml Lösung hinzugegeben wurden, resuspendiert. Die DNA wurde dann durch Zentrifugation zum Gleichgewicht in einem CsCl/EtBr-Dichtegradienten für 16 h bei 15°C, 265000xg gereinigt. Nach Entfernung aus dem Gradienten wurde die DNA mit Isopropanol, gesättigt mit TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) und CsCI, extrahiert, um EtBr zu entfernen und dann über Nacht bei 4°C gegen 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA dialysiert, um CsCI zu entfernen. Die DNA wurde aus der Dialyse entfernt und die Konzentration wurde unter Verwendung des fluorimetrischen Assay von Hoechst bestimmt, bei welchem ein Aliquot von DNA zu 3 ml von 1,5 × 10^-6 M Bisbenzimid (Hoechst 33258, Siga) in 1 × SSC (0,15 M NaCI, 0,015 M Natriumcitrat), pH 7,0, hinzugegeben, bei Raumtemperatur für S min inkubiert und auf einem Fluorometer mit Anregung 360, Emission 450 gegen eine bekannte Gruppe von DNA-Standards abgelesen wird.
PLASMID-RETTUNG UND ANALYSE
Fünf Mikrogramm genomische DNA aus der homozygoten 3707-Mutante, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurden mit 20 Einheiten von entweder Bam-HI- oder SaI-I-Restriktionsenzym (Bethesda Research Laboratory) in einem 50-μl-Reaktionsvolumen gemäß den Beschreibungen des Herstellers digestiert. Nach der Digestion wurde die DNA mit puffer-gesättigtem Phenol extrahiert (Bethesda Research Laboratory) und nachfolgend in Ethanol ausgefällt. Das so erhaltene Pellet wurde in einem finalen Volumen von 10 μl von 10 mM Tris, pH 8, resuspendiert und die Konzentration der DNA wurde unter Verwendung des fluorimetrischen Assay von Hoechst wie vorstehend bestimmt.
Um die Zirkularisierung, im Gegensatz zu der End-zu-End-Verknüpfung, zu erleichtern, wurde eine verdünnte Ligationsreaktion in Gang gesetzt, enthaltend 250 ng von Bam-HI- oder Sal-I-digestierter genomischer DNA, 3 Weiss-Einheiten von T4-DNA-Ligase (Promega), 50 μl von 10 × Ligasepuffer (30 mM Tris-HCl, pH 7,8, 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 5 mM ATP) und 5 μl von 100 mM ATP in einem 500 μl Reaktionsvolumen. Die Reaktion wurde für 16 h bei 16°C inkubiert, für 10 min auf 70°C erwärmt und einmal mit Puffer-gesättigtem Phenol (Bethesda Research Laboratory) extrahiert. Die DNA wurde dann mit der Zugabe von zwei Volumina von 100%igem Ethanol und 1/10 Volumen von 7,5 M Ammoniumacetat ausgefällt. Das so erhaltene Pellet wurde in einem finalen Volumen von 10 μl von 10 mM Tris, pH 8, resuspendiert, und die Konzentration der DNA wurde unter Verwendung des fluorimetrischen Assay von Hoechst wie vorstehend bestimmt.
Kompetente DH10B-Zellen (Bethesda Research Laboratory) wurden mit 50 ng ligierter DNA mit einer Konzentration von 10 ng DNA pro 100 μl von Zellen gemäß den Beschreibungen des Herstellers transfektiert. Transformanten aus SaI-I- oder Bam-HI-Digestionen wurden auf LB-Platten (10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 5 g NaCl, 15 g Agar pro Liter, pH 7,4), enthaltend 100 μg/ml Ampicillin bzw. 25 μg/ml Kanamycinsulfat, ausgewählt. Ampicillin-resistente (Amp ; Ampicillin-Empfmdlichkeit, Amp^s) SaI-I-Tranformanten wurden auf das Vorhandensein des Kanamycin-Resistenz-Gens (Kan^r; Kanamycin-Empfindlichkeit, Kin^s) gescreent, indem primäre Tranformanten ausgesucht und sie zuerst auf LB-Platten, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, dann auf LB-Platten, enthaltend 25 μg/m1 Kanamycin, gestochen wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Platten auf Amp/Kan^s-Kolonien bewertet. Kanamycin-resistente Bam-HI-Transformanten wurden auf die Anwesenheit des Ampicillin-Resistenzgens gescreent, indem primäre Tranformanten ausgesucht und sie zuerst auf LB-Platten, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin, und dann auf LB-Platten, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, gestochen wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Platten auf Kan^`/Amp^`-Kolonien bewertet.
Kulturen wurden von 192 Amp/Kan^s-Sal-I-Transformanten und 85 Kan^`/Amp^`-Bam-HI-Transfonnanten direkt in Mikrotiterplatten mit tiefen Vertiefungen hergestellt, die 200 μl LB-Nährlösung (10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 5 g NaCI pro Liter) mit 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Unter Verwendung der Apparatur Minifold I von Schleicher und Schueil und Nytran-Membranen wurden Dot Blots, in doppelter Ausführung, unter Verwendung der folgenden Bedingungen aufgesetzt: 50 μl Kultur wurden in 150 μ1 von 5X SSC verdünnt, die Kultw wurde lysiert und die DNA durch die Zugabe von 150 μ1 Lösung von 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI für 3 min bei Raumtemperatur denaturiert, das Filter wurde aus der Apparatur entnommen und in 0,5 M Tris, pH 8, 1,5 M NaCI neutralisiert, die DNA wurde dann mit den Filtern unter Verwendung des Stratagene Stratalinker UV-vernetzt, und die Filter wurden fiir 2 h auf 80°C erwärmt und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Um zu bestimmen, ob T-DNA innerhalb eines der geretteten Plasmide enthalten war, wurden die Dot Blots mit Anteilen der rechten und linken Grenze der T-DNA sondiert. Die Sonde der rechten Grenze bestand aus einem 2,2 kb Hind III-Dra I Fragment von DNA, erhalten aus dem Plasmid H23pKC7 (bestehend aus dem 3,2 kb Hind III 23 Fragment von dem Ti-Plasmid pTiC58 (Lemmers et al., J. Mol. Biol. (1989) 144;353–376), kloniert in den Plasmid-Vektor pKC7 (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press)), und die Sonde der linken Grenze bestand aus einem 2,9 kb Hind III-Eco RI Fragment, erhalten aus dem Plasmid HIOpKC7 (bestehend aus dem 6,5 kb Hind III 10 Fragment aus dem Ti-Plasmid pTiC58 (Lemmers et al., J. Mol. Biol. (1989) 144: 353–376), kloniert in den Plasmid-Vektor pKC7 (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press)) unter Verwendung von Standarddigestions-, Elektrophorese- und Elektroelutionsbedingungen wie beschrieben bei Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Finale DNA-Reinigung wurde durch Passage der eluierten DNA über eine Elutip-D-Säule (Schleicher und Schuell) unter Verwendung der Beschreibungen des Herstellers erhalten. Die Konzentration der DNA wurde unter Verwendung des fluorimetrischen Assay von Hoechst wie vorstehend bestimmt. Ungefähr 100 ng von jeder Sonde wurden mit a[³²P]dCTP markiert, indem ein Random Priming Kit von den Bethesda Research Laboratories unter von dem Hersteller empfohlenen Bedingungen verwendet wurde. Die markierte Sonde wurde von uneingelagertem a[³²P]dCTP abgetrennt, indem die Reaktion unter Standardbedingungen wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben durch eine Schleudersäule Sephadex G-25 hindurchgeführt wurde.
Die Filter wurden in 150 ml Puffer, bestehend aus 6X SSC, 10X Denhardt's Lösung, 1% SDS und 100 μg/m1 DNA von denaturiertem Kalbsthymus, für 16 h bei 42°C prähybridisiert. Die denaturierte, gereinigte, markierte Sonde wurde nach der Überführung der Filter in 50 ml Hybridisierungspuffer, bestehend aus 6X SSC, 1% SDS, 10% Dextransulfat und 50 μg/ml DNA von denaturiertem Kalbsthymus, zu den prähybridisierten Filtern gegeben. Nach der Inkubation der Filter in Anwesenheit der Sonde für 16 h bei 65°C wurden die Filter zweimal in 150 ml von 6X SSC, 0,5% SDS, zweimal in 1X SSC, 1% SDS und einmal in 0,1X SSC, 1% SDS, alles bei 65°C, gewaschen. Die gewaschenen Filter wurden der Autoradiographie auf Kodak-XAR-2-Film bei 80°C über Nacht unterworfen.
Von den 85 Bam-HI-Kandidaten hybridisierten 63 mit der Sonde der linken Grenze und keiner hybridisierte mit der Sonde der rechten Grenze. Von den 192 SaI-I-Kandidaten hybridisierten 31 mit der Sonde der linken Grenze, hybridisierten 4 mit der Sonde der rechten Grenze und hybridisierte keiner mit beiden Sonden. Zwölf von den Bam-HI-Kandidaten, 7 positive und 5 negative für die Anwesenheit der linken Grenze der T-DNA, wurden durch Restriktionsdigestionen weiter analysiert.
DNA aus den Bam-HI-Kandidaten wurde durch die Minipräparationsverfahrensweise mit alkalischer Lyse von Birmbiom et al. hergestellt (Nuc. Säure Res. (1979) 7: 1513–1523), wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben ist. Die Plasmid-DNA wurde nüt Eco-RI-Restriktionsenzym (Bethesda Research Laboratories) in Übereinstimmung mit den Beschreibungen des Herstellers digestiert und der Elektrophorese durch ein 0,8%iges Agarosegel in 1X TBE-Puffer (0,089 M Tris-Borat, 0,089 M Borsäure, 0,002 M EDTA) unterworfen. Alle von den Bam-HI-Kandidaten, welche mit der Sonde der linken Grenze von T-DNA hybridisierten, hatten das gleiche Eco-RI-Restriktionsmuster, welches die Anwesenheit von 14,2 kb der T-DNA und 1,4 kb der mutmaßlichen genomischen DNA der Pflanze in diesen Klonen anzeigte.
DNA von SaI-I-Kandidaten wurde isoliert, unter Verwendung der Enzyme Eco RI, Bam HI und Sal I Restriktions-analysiert und der Elektrophorese durch ein 0,8%iges Agarosegel, wie vorstehend, unterworfen. Alle von den Sal-I-Kandidaten, welche mit der Sonde der linken Grenze der T-DNA hybridisierten, schlossen 2,9 kb der mutmaßlichen Pflanzen-DNA ein. Enthalten innerhalb dieses 2,9-kb-Fragments war ein 1,4 kb Bam HI-Eeo RI Fragment, wie gesehen mit den Bam-HI-geretteten Plasmiden, was vermuten läßt, daß das 1,4-kb-Fragment eine Untergruppe des 2,9-kb-Fragments war und daß es benachbart der linken Grenze der T-DNA an ihrer Stelle der Tnsertion in das Pflanzen-Genom war. Sequenzanalyse eines SaI-I-Kandidaten (pSl) unter Verwendung eines Primers homolog zu der Sequenz der linken Grenze der T-DNA offenbarte, daß die Sequenz von pSl mit der Sequenz der linken Grenze der T-DNA colinear war (Yadav et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6322–6326) bis zu Nucleotid 65, gefolgt von nicht-T-DANN-(mutmaßliche Pflanze)-Sequenzen.
SOUTHERN-ANALYSE MIT MUTMAßLICHER PFLANZEN-DNA AUS GERETTETEN PLASMIDEN
DNA von den sieben Bam-HI-Kandidaten, welche mit der linken Grenze der T-DNA hybridisierten, wurde gepoolt und ein Anteil wurde mit den Restriktionsendonucleasen Eco RI und Bam HI digestiert und elektrophoretisch auf einem 0,8%igen Agarosegel in 1X TBE-Puffer aufgetrennt. Nach Exzidieren eines 1,4 kb Eco RI-Bam HI Fragments aus dem Agarosegel wurde das 1,4-kb-Fragment durch Verwendung eines Gene Clean Kit von Bio 101 gereinigt. Fünfzig Nanogramm des so erhaltenen DNA-Fragments wurden mit a[³²P]dCTP unter Verwendung eines Random Priming Kit (Bethesda Research Laboratory) unter von dem Hersteller empfohlenen Bedingungen markieri.
Drei Mikrogramm der gesamten genomischen DNA aus homozygoter Wildtyp-Arabidopsis und homozygoten 3707-mutanten Arabidopsis-Pflanzen wurden bis zum Abschluß mit einem der folgenden Restriktionsenzyme: SaI I, Hind III, Eco RI, Cla I und Bam HI unter von dem Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen digestiert. Die digestierte DNA wurde Elektrophorese und Southern-Transfer auf Hybond-N-Membrane (Amersham) unterworfen, wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Approach, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben ist. Nach dem Southern-Transfer wurden die Membrane unter Verwendung des Stratalinker (Stratagene) laut den Instruktionen des Herstellers UV-Licht ausgesetzt, luftgetrocknet und für 2 h auf 68°C erwärmt.
Die Filter wurden in 1 M NaCI, 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1% Natriumdodecylsulfat, 5% Dextransulfat, 100 μg/m1 von DNA von denaturiertem Lachssperma bei 65°C über Nacht prähybridisiert. Fünfzig Nanogramm des vorstehend hergestellten radiomarkierten 1,4 kb Eco RI-Bam HI Pflanzen-DNA-Fragments wurden zu der das Southem Blot enthaltenden Prähybridisierungslösung hinzugegeben und bei 65°C über Nacht weiter inkubiert. Das Filter wurde für 10 min zweimal in 200 ml 2X SSPE, 0,1% Natriumdodecylsulfat bei 65°C und für 10 min in 200 ml 0,5% SSPE, 0,1% Natriumdodecylsulfat bei 65°C gewaschen. Hybridisierende Fragmente wurden durch Autoradiographie nachgewiesen. Die Analyse bestätigte, daß das Sondenfragment Pflanzen-DNA enthielt und daß die T-DNA-Integrationsstelle in einem 2,8 kb Bam HI, einem 5,2 kb Hind III, einem 3,5 kb Sal I, einem 5,5 kb Eco RI und einem ungefähr 9 kb Cla I Fragment von Wildtyp-Arabidonsis-DNA war.
ISOLATION VON LAMBDA-KLONEN, ENTHALTEND DAS WILDTYP-ARABIDOPSIS-DELTA-15-DESAT(JRASE-GEN Das 1,4 kb Eco RI-Bam HI Fragment (siehe vorstehend) wurde als Sonde verwendet, um eine 1Gem-1 1-Bibliothek, hergestellt aus genomischer DNA, isoliert aus Wildtyp-Arabidopsis-thaliana-Pflanzen, geographische Rasse WS, zu screenen. Um die Bibliothek aufzubauen, wurde genomische DNA teilweise mit Sau3A-Enzym digestiert und über einem Salzgradienten wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Approach, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben größenfraktioniert. Die größenfraktionierte DNA wurde dann in Bam-HI-digestierten 1Gem-1l-Phagen-DNA (Promega) kloniert, wobei dem von dem Hersteller entworfenen Protokoll gefolgt wurde. Etwa 25000 Plaque erzeugende Einheiten von jedem Phagen wurden auf fünf 150-mm-Petriplatten, enthaltend einen Rasen von KW251-Zellen auf NZY-Agarmedien (5 g NaCI, 2 g MgSO₄7H₂O, 5 g Hefeextrakt, 10 g NZ Amine (Caseinhydrolysat von ICN Pharmaceuticals), 15 g Agar pro Liter; pH 7,5) plattiert. Die Plaquen wurden auf Nylonmembranen (Colony/Plaque Screen, New England Nuclear), in doppelter Ausführung, adsorbiert und entsprechend den Instruktionen des Herstellers mit der Hinzufügung einer 2-h-Inkubation bei 80°C nach Lufttrocknen der Filter präpariert. Die Filter wurden bei 65°C in Hybridisierungspuffer (1% BSA, 0,5 M NaP_i;, pH 7,2,(NaHP₂O₄ und NaHP₂O₄), 10 mM EDTA und 7% SDS) für 4 h prähybridisiert, nach welcher Zeit sie in frischen Puffer, enthaltend die denaturierte radiomarkierte Sonde (siehe vorstehend), überführt und über Nacht bei 65°C inkubiert wurden. Die Filter wurden zweimal mit 0,1X SSC, 1% SDS bei 65°C für jeweils 30 min gespült und der Autoradiographie auf Kodak-XA-R-Film bei 80°C über Nacht unterworfen. Sieben positiv hybridisierende Plaquen wurden der Plaquereinigung wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben unterworfen.
Kleinformatige (5 ml) flüssige Lysate von jedem der 7 Klone wurden hergestellt und auf KW251-Bakterien wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben getitert. Phagen-DNA wurde unter Verwendung einer Variation des Verfahrens von Chisholm (Biotechniques (1989) 7: 21–23) isoliert, in welchem das anfängliche Lysat nach Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) hergestellt wurde, die Konzentration von DNase I und RNase I (Sigma) um die Hälfte veningert wurde und der Schritt der PEG-Ausfällung auf 16 h erhöht wurde. Basierend auf Restriktionsanalyse unter Verwendung der Enzyme Hind III, Sal I und Xho I fielen die ursprünglichen 7 positiven Phagen in 5 unterschiedliche Klassen. Während die durchschnittliche Insertgröße ungefähr 15 kb betrug, überspannten die Klone zusammengenommen eine 40-kb-Region der genomischen DNA. Durch Restriktions-Mapping unter Verwendung von 4 unterschiedlichen Enzymen (Hind III, Bam HI, Kpn I und Sal I) einzeln und in paarweisen Kombinationen, begleitet von Southern-Analyse nüt der 1,4 kb Eco RI-Bam HI Sonde (wie vorstehend) und anderen Sonden, erhalten aus den 1 Klonen selbst, wurde eine Teilkarte erhalten, in welcher gefunden wurde, daß alle 5 Klone (11111, 141A1, 14211, 14311 und 14411) eine ungefähr 3-kb-Region mit Homologie nahe der Stelle der T-DNA Insertion teilten. Über Restriktionsund Southern-Analyse stellten die Anmelder fest, daß ein 5,2-kb-Hind-III-Fragment, vorhanden in den Klonen 1111, 41A1, und 441 I, ebenfalls die Stelle der T-DANN-Insertion überspannte. Dieses Fragment wurde aus dem lambda-Klon 41A1 exzidiert, in die Hind-III-Ste11e des pBluescript-Vektors (Stratagene) insertiert und das so erhaltene Plasmid, bezeichnet als pFl, wurde hergestellt und unter Verwendung von Standardprotokollen isoliert. Dieses Hind-III-Fragment was nachfolgend verwendet, um eine ArabidopsiscDNA-Bibliothek (siehe nachstehend) zu sondieren.
BEISPIEL 2
KLONIEREN DER DELTA-IS-DESATURASE-cDNA VON ARABIDOPSIS THALIANA UNTER VERWENDUNG VON GENOMISCHER DNA, FLANKIEREND DIE T-DNA-STELLE DER INSERTION IN DER MUTANTEN LINIE 3707 VON ARABIDOPSIS THALIANA ALS HYBRIDISIERUNGSSONDE
Das 5,2-kb-Hind-III-Fragment aus dem Plasmid pFl wurde wie vorstehend beschrieben durch Elektrophorese in Agarose nach Digestion des Plasmids mit Hind III gereinigt und mit ³²P radiomarkiert. Für die Herstellung einer Arabidopsis-cDNA-Bibliothek wurde polyadenylierte mRNA aus Hypocotylen von einem 3 Tage alten etiolierten Sämling von Arabidopsis (Ökotyp Columbia) unter Verwendung von Standardprotokollen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) hergestellt. Fünf Mikrogramm von dieser mRNA wurden als Matrize mit einem Oligo-d(T)-Primer verwendet, und reverse Transkriptase des Moloney Murine Leukemia Virus (Pharmacia) wurde verwendet, um die cDNA-Synthese des ersten Strangs zu katalysieren. Die cDNA des zweiten Strangs wurde nach Gubler et al. (Gen (1983) 25: 263–272) hergestellt, außer daß die DNA-Ligase weggelassen wurde. Nach der Synthese des zweiten Strangs wurden die Enden der cDNA durch Reaktion mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase abgestumpft und mit Eco RI/Not I Adaptoren (Pharmacia) ligiert. Die cDNAs wurden durch Schleudersäulenchromatographie unter Verwendung von Sephacryl S-300 gereinigt und auf einem 1%igem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt größenfraktioniert. Größenausgewählte cDNAs (1–3 kb) wurden unter Verwendung von Agarase (New England Biolabs) aus dem Gel entnommen und durch Phenol:Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung gereinigt. Einhundert Nanogramm der cDNA wurden mit 1 μg von mit 1 ZAP II (Stratagene) Eco RI digestierten, dephosphorylierten Armen mitgefällt. Die DNAs wurden in einem Volumen von 4 μ1 über Nacht ligiert, und die Ligationsmischung wurde in vitro unter Verwendung des Verpackungsextrakts Gigapack II Gold (Stratagene) verpackt.
Ungefähr 80000 Phagen wurden auf positiv hybridisierende Plaquen gescreent, indem das radiomarkierte 5,2-kb-Hind-III-Fragment als Sonde im wesentlichen wie vorstehend und bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben verwendet wurde. Replica-Filter der Phagen-Plaquen wurden während des Prähybridisierungsschrittes (8 h bei 65°C) in 1 M NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1% SDS, 5% Dextransulfat, 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma eingeweicht, und dann wurde die Sonde hinzugegeben und die Hybridisierung über 16 h bei der gleichen Temperatur betrieben. Die Filter wurden nacheinander mit 2X SSPE, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 5 min und dann wiederum mit frischer Lösung für 10 min, und schließlich mit 0,5X SSPE, 0,1% SDS bei 65°C min 5 min gewaschen. Ungefähr 20 positiv hybridisierende Plaquen wurden in dem primären Screen identifiziert. Vier von diesen wurden ausgesucht und zwei weiteren Runden von Screenen und Reinigung unterworfen. Aus dem tertiären Screen wurden vier reine Phagen-Plaquen isoliert. Plasmid-Klone, die die cDNA-Inserts enthielten, wurden durch die Verwendung von einem Helferphagen entsprechend dem von Stratagene bereitgestellten in-vivo-Exzisionsprotokoll erhalten. Doppelsträngige DNA wurde unter Verwendung des alkalischen Lyseverfahrens wie früher beschrieben hergestellt, und die so erhaltenen Plasmide wurden durch Elektrophorese in Agarosegelen Größen-analysiert. Das größte von diesen, bezeichnet als pCF3, enthielt ein Insert von ungefähr 1,4 kb, welches sequenziert wurde, indem Sequenaee T7 DNA Polymerase (US Biochemical Corp.) und die Instruktionen des Herstellers verwendet wurden, beginnend mit Primern homolog zu Vektor-Sequenzen, die das cDNA-Insert flankieren, und fortsetzend nacheinander mit Primern, gestaltet aus den neu erworbenen Sequenzen, wenn das Sequenzierungexperiment voranschritt. Die Sequenz von diesem Insert ist in SEQ ID NO:1 angegeben.
BEISPIEL 3
KLONIERUNG EINER ARABIDOPSIS-CDNA, KODIEREND EINE PLASTID-DELTA-15-FETTSÄURE-DESATURASE
Eine verwandte Fettsäwe-Desaturase wurde in einer ähnlicher Weise kloniert, außer daß die verwendete Sonde nicht aus einer PCR-Reaktion auf pCF3 erhalten wurde, sondern vielmehr d_as tatsächliche 1,4-kb-Not-I-Fragment, isoliert aus pCF3, war, welches wie vorstehend beschrieben gereinigt und radiomarkiert wurde.
Ungefähr 80000 Phagen aus der vorstehend beschriebenen cDNA-Bibliothek etiolierter Hypocotyle von Arabidopsis wurden ausplattiert und gescreent im wesentlichen wie vorher, außer wie nachstehend angezeigt ist. Die Filter wurden während des Prähybridisierungsschrittes (8 h bei 50°C) in 1 M NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1% SDS, 5% Dextransulfat, 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma eingeweicht. Dann wurde die Sonde hinzugegeben und die Hybridisierung über 16 h bei der gleichen Temperatur betrieben. Die Filter wurden nacheinander mit 2X SSPE, 0,1% SDS bei Raumtemperatw für 5 min und dann wiederum mit frischer Lösung für 10 min und schließlich mit 0,5X SSPE, 0,1% SDS bei 50°C für 5 min gewaschen. Ungefähr 17 stark hybridisierende und 17 schwach hybridisierende Plaquen wurden in dem primären Screen identifiziert. Vier von den schwach hybridisierenden Plaquen wurden ausgesucht und ein bis zwei weiteren Runden von Screenen mit der radiomarkierten Sonde wie vorstehend unterworfen, bis sie rein waren. Um sicherzustellen, daß diese nicht delta-l5-Desaturase-Klone waren, wurden sie weiter analysiert, um zu bestimmen, ob sie mit einer für das delta-15-Desaturase-3'-Ende spezifischen Sonde hybridisierten. Die verwendete Sonde war ein 18-bp-OligonucIeotid, welches in der Sequenz (d. h. antisense) zu Nucleotid 1229–1246 von SEQ ID NO:1 komplementär ist. Die Sonde wurde unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase mit gamma-³²P-ATP radiomarkiert und mit Filtern, die DNA aus den isolierten Klonen enthielten, in 6X SSC, 5X Denhardt's, 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma, 1 mM EDTA, 1% SDS bei 44°C über Nacht hybridisiert. Die Filter wurden zweimal in 6X SSC, 0,1% SDS für 5 min bei Raumtemperatur, dann in 6X SSC, 0,1% SDS bei 44°C für 3–5 min gewaschen. Nach Autoradiographie der Filter mißlang es einem der Klone, Hybridisierung mit dieser Sonde zu zeigen. Dieser Klon wurde ausgesucht und ein Plasmid-K1on, enthaltend das cDNA-Insert, wurde durch die Verwendung eines Helferphagen entsprechend dem in-vivo-Exzisionspmtokoll, bereitgestellt von Stratagene, erhalten. Doppelsträngige DNA wurde unter Verwendung des alkalischen Lyseverfahrens wie früher beschrieben hergestellt, und das so erhaltene Plasmid wurde durch Elektrophorese in Agarosegelen nach entweder Not-I-Digestion oder Digestion mit sowohl Nco I als auch Bgl II Größen-analysiert. Die Ergebnisse waren übereinstimmend mit der Anwesenheit in diesem Plasmid, bezeichnet als pCM2, eines ungefähr 1,3-kb-cDNA-Inserts, welchem ein 0,7 kb Nco I – Bgl II Fragment, charakteristisch für die Arabidopsis-delta-l5-Desaturase-cDNA von pCF3, fehlte. (Dieses Fragment entspricht der DNA, die sich zwischen der Nco-I-Stelle an Nucleotid 474–479 und der BgI-II-Stelle an Nucleotid 1164–1169 in SEQ ID NO:1 befindet). Die vollständige Nucleotidsequenz von pCM2 ist in SEQ ID: 4 angegeben.
BEISPIEL 4
KLONIEREN DER PFLANZEN-FETTSÄURE-DESATURASE-cDNAs AUS ANDEREN SPEZIES DURCH HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN
Ein Fragment von ungefähr 1,4 kb, enthaltend die Arabidopsis-delta-lS-Desaturase kodierende Sequenz von SEQ ID NO:1, wurde aus dem Plasmid pCF3 durch die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erhalten. Primer (M13(-20) und T7-17mer-Primer, 1991-Stratagene-Katalognummern 300303 bzw. 300302), flankierend das pCF3-Insert, wurden in der PCR verwendet, welche im wesentlichen wie in den Instruktionen, bereitgestellt von dem Verkäufer in dem Perkin-Elmer/Cetus PCR Kit, beschrieben ausgeführt wurde. Dieses Fragment wurde mit Not I digestiert, um Vektor-Sequenzen zu entfernen, durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und wie früher beschrieben mit 32P radiomarkiert.
BEISPIEL 5
KLONIEREN VON BRASSICA-NAPUS-SAMEN-cDNAs, KODIEREND DELTA-IS-FETTSÄURE-DESATURASEN
Eine cDNA-Bibliothek aus sich entwickelnden Brassica-nanus-Samen wurde aufgebaut, indem die polyadenylierte mRNA-Fraktion, enthalten in einer polysomalen RNA-Herstellung aus sich entwickelnden Brassica-napus-Samen, verwendet wurde. Polysomale RNA wurde nach der Verfahrensweise von Kamalay et al. (Cell (1980) 19: 935–946) aus Samen 20–21 Tage nach der Befruchtung isoliert. Die polyadenylierte mRNA-Fraktion wurde durch Affinitätschromatographie auf oligo-dT-Cellulose (Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1972) 69: 1408–1411) erhalten. Vier Mikrogramm polyadenylierte mRNA wurden reversetranskribiert und verwendet, um eine cDNA-Bibliothek in lambda-Phagen (Uni-ZAP^TM XR Vektor) aufzubauen, indem das Protokoll, beschrieben in dem ZAP-cDNA^TM Synthese Kit (1991 Stratagene Catalog, Punkt # 200400) verwendet wurde.
Für den Zweck der Klonierung der Brassica-napus-Samen-cDNAs, kodierend delta-lS-Fettsäure-Desaturasen, wurde die Brassica-napus-Samen-cDNA-Bibliothek verschiedene Male gescreent, indem die Inserts aus den Arabidopsis-cDNAs pCF3 und pCM2 als radiomarkierte Hybridisierungssonden verwendet wurden. Eine von den in diesen Screens erhaltenen Brasssica-nanus-cDNAs wurde als Hybridisierungssonde in einem nachfolgenden Screen verwendet.
Für jedes Screening-Experiment wurden ungefähr 300000 Phagen unter Hybridisierungbedingungen mit geringer Stringenz gescreent. Die Filterhybridisierungen wurden in 50 mM Tris pH 7,6, 6X SSC, 5X Denhardt's, 0,5% SDS, 100 μg DNA von denaturtertem Kalbsthymus bei 50°C über Nacht ausgeführt, und die Posthybridisierungswaschungen wurden in 6X SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 min durchgeführt, dann mit 2X SSC, 0,5% SDS bei 45°C für 30 min wiederholt und dann zweimal mit 0,2X SSC, 0,5% SDS bei 50°C für 30 min wiederholt.
Unter Verwendung des Arabidoosis-cDNA-Inserts von pCM2 als Sonde in einem Screen mit geringer Stringenz wurden fünf stark hybridisierende Phagen identifiziert. Diese Phagen wurden gereinigt und nach den Protokollen, beschrieben in dem ZAP-cDNA^TM Synthesis Kit und dem pBluescript II Phagemid Kit (1991 Stratagene Catalog, Punkt # 200400 und 2I2205) exzidiert. Einer von diesen, bezeichnet als pBNSF3-f2, enthielt ein 1,3-kb-Insert. Das pBNSF3-f2-Insert wurde vollständig auf beiden Strängen sequenziert. Die pBNSF3-f2-Nucleotidsequenz ist in SEQ ID NO:6 angegeben. Ein Vergleich dieser Sequenz mit der von dem delta-15-Desaturase-Klon von Arabidonsis thaliana (SEQ ID NO:1) bestätigte, daß pBNSF3-f2 eine Brassica-nus-cDNA ist, die eine mikrosomale delta-lS-Desaturase des Samens kodiert.
Ein zusätzlicher Screen mit geringer Stringenz der Brassica-nanus-Samen-cDNA-Bibliothek unter Verwendung des cDNA-Inserts in pCM2 als Sonde identifizierte acht stark hybridisierende Phagen. Diese Phagen wurden Plaque-gereinigt und verwendet, um die Phagemide wie vorstehend beschrieben zu exzidieren. Eines von diesen, bezeichnet als pBNSFd-8, enthielt ein 0,3-kb-Insert. pBNSFd-8 wurde vollständig auf einem Strang sequenziert, diese Sequenz hatte signifikante Divergenz von der Sequenz von pBNSF3-fl. Das cDNA-Insert in pBNSFd-8 wurde als Hybridisierungssonde in einem Screen mit hoher Stringenz der Brassica-napus-Samen-cDNA-Bibliothek verwendet. Die Filterhybridisierimgen wurden in 50 mM Tris pH 7,6, 6X SSC, 5X Denhardt's, 0,5% SDS, 100 μg DNA von denaturiertem Kalbsthymus über Nacht bei 50°C ausgeführt und Posthybridisierungswaschungen erfolgten in 6X SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 min, dann mit 2X SSC, 0,5% SDS bei 45°C für 30 min und dann zweimal mit 0,2X SSC, 0,5% SDS bei 60°C für 30 min. Der Screen mit hoher Stringenz führte zu drei stark hybridisierenden Phagen, die wie vorstehend gereinigt und exzidiert wurden. Eines der exzidierten Plasmide, pBNSFd-3, enthielt ein 1,4-kb-Insert, das vollständig auf beiden Strängen sequenziert wurde. SEQ ID NO: 8 zeigt die Nucleotidsequenz von pBNSFd-3. Ein Vergleich dieser Sequenz mit der des delta-lS-Desaturase-Klons von Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 4) bestätigte, daß pBNSFd-3 eine Brassica-napus-cDNA ist, die eine Samen-Plastid-delta-l5-Desaturase kodiert.
KLONIERUNG EINER SOJABOHNEN-SAMEN-CDNA, KODIEREND EINE MIKROSOMALE DELTA-IS-GLYCEROLIPID-DESATLIRASE
Eine cDNA-Bibliothek wurde wie folgt hergestellt: Sojabohnenembryos (jeweils ca. 50 mg Frischgewicht) wurden aus den Samenhülsen entfernt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die eingefrorenen Embryos wurden in Anwesenheit von flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver gemahlen und dann durch Polytron-Homogenisierung extrahiert und fraktioniert, um nach dem Verfahren von Chirgwin et al. (Biochemistry (1979) 18: 5294–5299) die Gesamt-RNA anzureichern. Die Nucleinsäurefraktion wurde für poly A⁺RNA angereichert, indem die Gesamt-RNA durch eine oligo-dT-Cellulose-Säule hindurchgeführt und die poly A⁺RNA wie von Guteman et al. beschrieben (Meth. Enzymol. (1979) 68: 75–90) mit Salz eluiert wurde. cDNA wurde aus der gereinigten poly A⁺RNA synthetisiert, indem das cDNA Synthesis System (Bethesda Research Laboratory) und die Instruktionen des Herstellers verwendet wurden. Die entstehende doppelsträngige DNA wurde vor dem Füllen ihrer Enden mit T4-DNA-Polymerase (Bethesda Research Laboratory) und der Ligierung der stumpfen Enden mit phosphorylierten Eco-RI-Linkern unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Pharmacia) durch Eco RI DNA Methylase (Promega) methyliert. Die doppelsträngige DNA wurde mit Eco-RI-Enzym digestiert, von überschüssigen Linkem durch Passage durch eine Gelfiltrationssäule (Sepharose CL-4B) abgetrennt und mit lambda-ZAP-Vektor (Stratagene) nach Instruktionen des Herstellers ligiert. Ligierte DNA wurde unter Verwendung des Ligapack-Verpackungsextrakts (Stratagene) nach Instruktionen des Herstellers in den Phagen verpackt. Die entstehende cDNA-Bibliothek wurde laut Instruktionen von Stratagene amplifiziert und bei -80°C aufbewahrt.
Folgend den Instruktionen in dem Lambda ZAP Cloning ICit Manual (Stratagene) wurde die cDNA-Phagen-Bibliothek verwendet, um E.-coli-BB4-Zellen zu infizieren und ungefähr 80000 Plaqueerzeugende Einheiten wurden auf Petriplatten von 150 mm Durchmesser plattiert. In doppelter Ausführung wurden Lifts der Platten auf Nitrocellulosefiltern (Schleicher & Schuell) hergestellt. Die Filter wurden in 25 ml Hybridisierungspuffer, bestehend aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 1% SDS, 5% Dextransulfat und 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma (Sigma Chemical Co.), bei 50°C für 2 h prähybridisiert. Eine radiomarkierte Sonde, hergestellt aus pCF3 wie vorstehend beschrieben, wurde hinzugegeben und für 18 h bei 50°C hybridisieren gelassen. Die Sonden wurden zweimal bei Raumtemperatur mit 2X SSPE, 1 SDS für fünf Minuten gewaschen, nachfolgend für 5 min bei 50°C in 0,2X SSPE, 1% SDS gewaschen. Autoradiographie der Filter zeigte an, daß es eine stark hybridisierende Plaque und ungefähr fünf schwach hybridisierende Plaquen gab. Die stärker hybridisierende Plaque wurde einer zweiten Runde von Screenen wie zuvor unterworfen, ausgenommen, daß das finale Waschen für 5 min bei 60°C in 0,2X SSPE, 1% SDS erfolgte. Zahlreiche stark hybridisierende Plaquen wurden beobachtet, und eine, gut isoliert von einem anderen Phagen, wurde für weitere Analyse ausgesucht.
Folgend dem Lambda ZAP Cloning Kit Instruction Manual (Stratagene) wurden Sequenzen des pBluescript-Vektors, einschließlich der cDNA-Inserts, aus dem gereinigten Phagen in Anwesenheit eines Helferphagen exzidiert, und das entstehende Phagemid wurde verwendet, um Zellen von E, coli XL-1 Blue zu infizieren. DNA von dem Plasmid, bezeichnet als pXF1, wurde durch die Minipräparationsverfahrensweise mit alkalischer Lyse, beschrieben bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), hergestellt. Die alkali-denaturierte doppelsträngige DNA aus pXF1 wurde auf beiden Strängen vollständig sequenziert. Das Insert von pXF1 enthielt einen Abschnitt von 1783 Nucleotiden, welcher einen unbekannten offenen Leserahmen enthielt und ebenfalls einen poly-A-Abschnitt von 16 Nucleotiden 3' zu dem offenen Leserahmen, von den Nucleotiden 1767 bis 1783, nachfolgend eine Eco-RI-Restriktionsstelle enthielt. Die 2184 Basen, die dieser Eco-RI-Stelle folgten, enthielten einen offenen Leserahmen von 1145 bp, welcher ein Polypeptid von etwa 68% Identität zu und colinear mit dem Arabidopsis-delta-15-Desaturase-Polypeptid, aufgeführt in SEQ ID No: 2, kodierte. Das mutmaßliche Start-Methionin des offenen Leserahmens von 1145 bp entsprach dem Start-Methionin des mikrosomalen delta-lS-Peptids von Arabidopsis, und es gab keine Aminosäuren entsprechend einem Plastid-Transitpeptid 5' zu diesem Methionin. Wenn das Insert in pXF1 mit Eeo RI digestiert wurde, wurden vier Fragmente beobachtet, Fragmente von ungefähr 370 bp und 1400-bp-Fragmente, erhalten aus den ersten 1783 bp des Inserts in pXF 1, und Fragmente von ungefähr 600 bp und 1600 bp, erhalten aus den anderen 2184 Nucleotiden des Inserts in pXF 1. Nur die 600-bp- und 1600-bp-Fragmente hybridisierten mit der aus pCF3 erhaltenen Sonde auf Southern Blots. Es wurde abgeleitet, daß pXF1 zwei unterschiedliche cDNA-Inserts, getrennt durch eine Eco-RI-Stelle, enthielt, und das zweite von diesen Inserts war eine 2184-bp-cDNA, kodierend eine mikrosomale delta-lS-Desaturase der Sojabohne. Die vollständige Nucleotidsequenz der 2184 by der mikrosomalen delta-15-cDNA der Sojabohne, enthalten in dem Plasmid pXF1, ist in SEQ ID No: 10 aufgeführt.
KLONIERUNG EINER SOJABOHNEN-SAMEN-cDNA, KODIEREND EINE PLASTID-DELTA-15-GLYCEROLIPID-DESATURASE, UNTER VERWENDUNG VON MIKROSOMALER DELTA-15-DESATURASE-cDNA DER SOJABOHNE ALS HYBRIDISIERUNGSSONDE
Ein 1,0-kb-Fragment der Kodierungsregion der mikrosomalen delta-lS-Desaturase-cDNA der Sojabohne, enthalten in dem Plasmid pXFl, wurde durch Digestion mit dem Restriktionsenzym Hha I exzidiert. Dieses 1,0-kb-Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und wie früher beschrieben mit ³²P radiomarkiert. Das radiomarkierte Fragment wurde verwendet, um 100000 Plaque erzeugende Einheiten der Sojabohnen-cDNA-Bibliothek wie vorstehend beschrieben zu _Screenen. Autoradiographie der Filter zeigte an, daß es acht hybridisierende Plaquen gab, und diese wurden einer zweiten Runde von Screening unterworfen. Sequenzen des pBluescript-Vektors aus allen acht der gereinigten Phagen, einschließlich der cDNA-Inserts, wurden in Anwesenheit eines Helferphagen exzidiert, und die entstehende Phagemide wurden verwendet, um Zellen von E. coli XL-1 Blue zu infizieren. DNA aus den Plasmiden wurde durch die Minipräparationsverfahrensweise mit alkalischer Lyse, beschrieben bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) hergestellt. Restriktionsanalyse zeigte, daß sie Inserts im Größenbereich von 1,0 kb bis 3,0 kb enthielten. Eines von diesen Inserts, bezeichnet als pSFD-1l8bwp, enthielt ein Insert von etwa 1700 bp. Die alkali-denaturierte doppelsträngige DNA aus pSFD-118bwp wurde auf beiden Strängen vollständig sequenziert. Das Insert von pSFD-118bwp enthielt einen Abschnitt von 1675 Nucleotiden, welche einen offenen Leserahmen enthielten, kodierend ein Polypeptid von etwa 80% Identität mit und colinear mit dem Arabidopsis-Plastid-delta-15-Desaturase-Polypeptid, aufgeführt in SEQ ID No: 5. Der offene Leserahmen kodierte ebenfalls Aminosäwen entsprechend einem Plastid-Transitpeptid an dem 5'-Ende des offenen Leserahmens. Das Transitpeptid war colinear mit, und teilte einige Homologie zu, dem Transitpeptid, beschrieben für die Arabidopsis-Plastid-delta-15-Glycerolipid-Desaturase. Basierend auf der Homologie zu Arabidopsis-Plastid-delta-lS-Glycerolipid-Desaturase und wegen der Anwesenheit eines Plastid-Transitpeptids wurde abgeleitet, daß die cDNA, enthalten in dem Plasmid pSFD-118bwp, eine Sojabohnen-Plastid-delta-15-Glycerolipid-Desaturase ist. Die vollständige Nucleotidsequenz der 1675-bp-Sojabohnen-Plastid-delta-15-Glycerolipid-Desaturase-cDNA ist in SEQ ID NO:12 aufgeführt.
BEISPIEL 6
KLONIEREN DER cDNA-SEQUENZEN, KODIEREND FETTSÄURE-DESATURASEN, DURCH POLYMERASEKETTENREAKTION
Analyse der abgeleiteten Proteinsequenzen der Glycerolipid-Desatwasen von unterschiedlichen höheren Pflanzen, beschrieben in dieser Erfindung, offenbart dem Fachmann Regionen der Aminosäuresequenzen, die unter höheren Pflanzen und zwischen höheren Pflanzen und cyanobakterieller des A konserviert worden sind. Diese kurzen Abschnitte von Aminosäuren können verwendet werden, um Oligomere als Primer für Polymerase-Kettenreaktionen zu gestalten. Zwei Aminosäwesequenzen, die in hohem Maße zwischen den des-A- und Pflanzen-delta-15-Desatwasen-Polypeptiden konserviert sind, sind die Aminosäwesequenzen 97–108 und 299–311 (SEQ ID NO: 2). Polymerase-Kettenreaktionen (PCRs) wurden unter Verwendung des GeneAmp® RNA PCR Kit (Perkin Elmer Cetus) durchgeführt, wobei den Protokollen des Herstellers gefolgt wurde. In einem PCR-Experiment wurden die SEQ ID NOS:22 und 23 als sense-Primer und entweder die SEQ ID NOS: 24 und 25 oder die SEQ ID NOS: 26 und 27 als antisense-Primer auf poly A+ RNA, gereinigt aus sowohl Blatt von Arabidopsis als auch sich entwickelnden Samen von Canola, verwendet. Dafür wurden ca. 100 ng von polyA+ RNA wie früher beschrieben isoliert und unter Verwendung des Kit unter Verwendung statistischer Hexamere reverse-transkribiert. Dann wurde die cDNA in PCR unter Verwendung von 64 pmol jeweils der SEQ ID NOS:22 und 23 als sense-Primern und entweder einem Gemisch von 64 pmol von SEQ ID NO: 24 und 78 pmol von SEQ ID NO: 25 oder einem Gemisch von 35 pmol von SEQ ID NO: 26 und 50 pmol von SEQ ID NO: 27 nach dem folgenden Programm verwendet: a) 1 Zyklus von 2 min bei 95°C und 15 C bei 50°C, b) 30 Zyklen von 3 min bei 65°C (Extension), 1 min 20 s bei 95°C (Denaturation), 2 min bei 50°C (Tempern) und c) 1 Zyklus von 7 min bei 65°C. Die PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese analysiert. Alle PCRs führten zu PCR-Produkten der konekten Größe (ea. 630 bp). Die PCR-Produkte aus Arabidopsis und Canola wurden gereinigt und als radiomarkierte Hybridisierungssonden verwendet, um die Lambda-Yes-Arabidopsis-cDNA-Bibliothek bei geringer Stringenz wie vorstehend beschrieben zu screenen. Dies führte zu der Isolation eines reinen Phagen, welcher exzidiert wurde, um das Plasmid pYaep7 zu ergeben. Das cDNA-Insert in pYacp7 wurde teilweise sequenziert. Seine Sequenz zeigte, daß es ein unvollständiges Desatwase-Polypeptid kodierte, das mit einer anderen cDNA (in dem Plasmid pFadx-2) identisch war, die durch Hybridisierung bei geringer Stringenz wie früher beschrieben isoliert wurde. Die zusammengesetzte Sequenz, erhalten aus den teilweisen Sequenzen aus den cDNA-Inserts in pFadx-2 und pYacp7, ist in SEQ ID NO:16 und das durch sie kodierte Polypeptid in SEQ ID NO:17 angegeben. Wie früher diskutiert ist SEQ ID NO:17 eine mutmaßliche Piastid-delta-15-Desatwase. Eine Version mit voller Länge von pYacp7 kann leicht isoliert werden, indem sie als Hybridisierungssonde verwendet wird.
Zwei zusätzliche konservierte Regionen entsprechen den Aminosäweresten 130 bis 137 und 249 und 256 von SEQ ID NO: 7 (Brassica-napus-Glycerolipid-Desatwase-delta-15). Degenerierte Oligomere wurden für diese Regionen mit zusätzlichen Nucleotiden, die eine Restrtktionsstelle für Bam H1 enthielten, gestaltet, wurden zu den 5'-Enden von jedem Oligonucleotid hinzugegeben, um das Subklonieren der PCR-Produkte zu erleichtern. Die Nucleotidsequenzen dieser Oligonucleotide, genannt F2–3 und F2–3e, sind in SEQ ID NO: 18 bzw. SEQ ID NO: 19 angegeben.
Gemische der degenerterten Oligonucleotide F2-3 und F2-3c wurden verwendet, um Glycerolipid-Desatwase-Sequenzen, dargestellt in Maissamen-mRNA-Population, zu amplifizieren, zu isolieren und zu klonieren im wesentlichen wie in dem GeneAmp RNA PCR Kit, gekauft von Perkin Elmer Cetus, und bei Innis et al., Hrsg., (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods und Applications, Academic Press, San Diego, beschrieben ist.
Maissamen-RNA wurde aus sich entwickelnden Maissamen 15-20 Tage nach der Befruchtung durch das Verfahren von Chirgwin et al., (1979) Biochemistry 18: 5294 erhalten. Polyadenylierte mRNA von Maissamen wurde durch Affinitätschromatographie auf oligo-dT-Cellulose isoliert (Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1972) 69: 1408–1411). 20–50 ng von A⁺mRNA wurden in reverse-Transkrtptions-Reaktionen mit oligo-dT und Prtmern in Form von statistischen Hexameren unter Verwendung des Reaktionspuffers und der Bedingungen, empfohlen durch Perkin Elmer Cetus, verwendet. Die so erhaltene cDNA wurde dann als Matrtze für die Amplifikation von Maissamen-Glycerolipid-Sequenzen unter Verwendung der Gruppe von degenerterten Prtmern in SEQ ID NO: 18 und 19 verwendet. Die Reaktionsbedingungen waren wie von Perkin Elmer Cetus beschrteben, das Amplifikationsprotokoll bestand aus einer Folge von 95°C/1 min, 55°C/1 min, 72°C/2 min für 30–50 Zyklen. Die so erhaltenen Polymerase-Reaktionsprodukte wurden mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Bam HI digestiert und von uneingelagertem Primern durch Gelfiltrationchromatographie auf Linker-6-Schleudersäulen (Pharmacia Inc.) getrennt. Die so erhaltenen PCR-Produkte wurden in pBluescript SK an der Bam-H1-Stelle kloniert und in E.-coli-DHS-kompetente Zellen transformiert. Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA aus den erhaltenen transformierten Kolonien offenbarte eine Kolonie, PCR-20, die ein Insert in der Größe von etwa 0,5 kB an der pBluescrtpt-SK-BamH1-Stelle enthielt. Das PCR-20-Insert wurde auf beiden Strängen vollständig sequenziert. Die Nucleotidsequenz des PCR20-Inserts ist in SEQ ID NO: 14 angegeben, und die translatierte Aminosäwesequenz ist in SEQ ID NO: 15 angegeben. Diese Aminosäuresequenz zeigt eine Gesamtidentität von 61,9% zu der Aminosäwesequenz der mikrosomalen delta-lS-Desaturase von Brassica napus, angegeben in SEQ ID NO:7. Dieses Ergebnis identifiziert das PCR20-Insert als Polymerase-Reaktionsprodukt einer Maissamen-delta-15-Desaturase-cDNA. Das PCR20-Insert kann als Sonde verwendet werden, um leicht Maissamen-delta-15-Desatwase-cDNAs mit voller Länge zu isolieren oder ebenso für antisense oder um Maissamen-Glycerolipid-delta-15-Desatwase-Gen-Expression in transgenen Maispflanzen durch Klonierung in dem passenden Mais-Gen-Expressionsvektor zu cosuppressieren.
BEISPIEL 7
VERWENDUNG DER GENOMISCHEN KLONE VON ARABIDOPSIS-THALIANA-DELTA-15-DESATURASE ALS RESTRIKTIONSFRAGMENT-LÄNGENPOLYMORPHISMUS-(RFLP)-MARKER, UM DIE DELTA-1S-DESATURASE-LOCI IN ARABIDOPSIS ZU KARTIEREN
DNA, flankierend die T-DNA-Insertionsstelle in der mutanten Linie 3707, wurde verwendet, um den genetischen Locus, kodierend die delta-15-Desatwase von Arabidopsis-thaliana-Samen, zu kartieren. Ein genomisches DNA-Fragment von ungefähr 12 kB, enthaltend die Arabidopsis-delta-15-Desatwase kodierende Sequenz, wurde aus dem lambda-4211-Klon durch Digestion mit der Restriktionsendonuclease Xho It entfernt, von den Lambda-Armen durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt und unter Verwendung von Standardverfahrensweisen gereinigt. Die isolierte DNA wurde unter Verwendung eines statistischen Primer-Kits von Pharmacia unter von dem Hersteller empfohlenen Bedingungen mit ³²P markiert. Die radioaktive DNA wurde verwendet, um einen Southern Blot, enthaltend genomische DNA von Arabidopsis thaliana (Ökotyp Wassileskija und Marker-Linie W 100 Ökotyp Herkunft Landesberg), digestiert mit einer von verschiedenen Restriktionsendonucleasen, zu sondieren. Nach Hybridisierung und Waschungen unter Standardbedingungen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) wurden Autoradiogramme erhalten. Unterschiedliche Muster von Hybridisierung (Polymorphismen) wurden in Digestionen unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen Bgl II, Cla I, Hind III, Nsi I, und Xba I identifiziert. Das gleiche radiomarkierte DNA-Fragment wurde verwendet, um den Polymorphismus im wesentlichen wie von Helentjaris et al. (Theor. Appl. Genet. (1986) 72: 761–769) beschrieben zu karieren. Das radiomarkierte DNA-Fragment wurde wie vorstehend beschrieben auf Southern Blots von mit Xba I digestierter genomischer DNA aufgebracht, die aus 117 rekombinanten Inzucht-Nachkommen (erhalten aus Einzelsamenherkunftslinien zu der F6-Generation) isoliert wurden, die sich aus einer Kreuzung zwischen der Arabidousis-thaliana-Marker-Linie W100 und dem Ökotyp Wassileskija (Burr et al., Genetics (1988) 118: 519–526) ergaben. Die Banden auf den Autoradiogrammen wurden als Ergebnis der Vererbung von entweder dem Vater (Ökotyp Wassileskija) oder der Mutter (Marker-Linie W 100) DNA oder beiden (ein Heterozygot) interpretiert. Die so erhaltenen Segregationsdaten wurden genetischer Analyse unter Verwendung des Computerprogramms Mapmaker (Lander et al., Genomics (1987) 1: 174–181) unterworfen. In Verbindung mit früher erhaltenen Segregationsdaten für 63 anonyme RFLP-Marker und 9 morphologische Macker in Arabidopsis thaliana (Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 6856–6860; Nam et al., Plant Cell (1989) 1: 699–705), wurde ein einfacher genetischer Locus entsprechend der genomischer DNA, enthaltend die delta-l5-Desaturase kodierende Sequenz, positioniert. Es wurde so bestimmt, daß der Standort des delta-l5-Desatwase-Gens auf Chromosom 2 zwischen dem lambda-AT283- und dem Cosmid-c6842-RFLP-Macker nahe den morphologischen Markern py und erecta ist.
Es wurde ebenfalls gezeigt, daß die cDNA in dem Plasmid pCM2 polymorphisch mit genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana (Ökotyp Wassileskija und Marker-Linie W100 Ökotyp Herkunft Landesberg), digestiert mit Eeo RI, hybridisiert. Sie wurde als RFLP-Marker verwendet, um den genetischen Locus für das Gen, kodierend diese Fettsäwe-Desaturase in Arabidopsis, wie vorstehend beschrieben zu kartieren. Ein einzelner genetischer Locus wurde entsprechend dieser Desatwase-cDNA positioniert. Es wurde so bestimmt, daß sein Standort auf Chromosom 3 zwischen den RFLP-Markern lambda AT228 und Cosmid-c3838 "nördlich" des kahlen Locus war (Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85: 6856–6860; Nam et al., Plant Cell (1989) 1: 699–705).
BEISPIEL 8
VERWENDUNG MIKROSOMALER DELTA-15-GLYCEROLIPID-DESAT[TRASE-cDNA-SEQUENZ VON SOJABOHNENSAMEN IN PLASMID ALS RESTRIKTIONSFRAGMENT-LÄNGENPOLYMORPHISMUS-(RFLP)-MARKER
Ein 600-bp-Fragment des cDNA-Inserts aus dem Plasmid pXF1, welches etwa 300 bp der kodierenden Sequenz und 300 bp der 3'-untranslatierten Sequenz enthält, wurde durch Digestion mit dem Restriktionsenzym Eeo RI bei Standardbedingungen wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben exzidiert, durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt und unter Verwendung eines Random Priming Kit von Bethesda Research Laboratories unter von dem Hersteller empfohlenen Bedingungen mit ³²P markiert. Die so erhaltene radioaktive Sonde wurde verwendet, um einen Southern Blot (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), enthaltend genomische DNA aus Sojabohne Glycine max (cultivar Bonus) und Glycine soja (PI81762)], digestiert mit einem von mehreren Restriktionsenzymen, zu sondieren. Nach Hybridisierung und Waschungen unter Standardbedingungen (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) wurden Autoradiogramme erhalten und unterschiedliche Hybridisierungsmuster (Polymorphismen) wurden in Digestionen, durchgeführt mit den Restriktionsenzymen Bam HI, Eco RV und Eco RI, identifiziert. Die gleiche Sonde wurde dann verwendet, um den polymorphen pXF1-Locus auf dem Sojabohnen-Genom, im wesentlichen wie durch Helentjaris et al. (Theor. Appl. Genet. (1986) 72: 761–769) beschrieben, zu kartieren. Die Plasmid-pXF1/600-bp-Sonde wurde, wie vorstehend beschrieben, auf Southem Blots von mit EcoRI, PstI, EcoRV, BamHI, oder Hin DIII digestierten genomischen DNAs aufgebracht, die aus 68 F2-Nachkommen-Pflanzen isoliert wurden, die sich aus einer Kreuzung G. max Bonus x G. soja PI81762 ergaben. Die Banden auf den Autoradiogrammen wurden als Ergebnis aus der Vererbung von entweder dem Vater (Bonus) oder der Mutter (PI81762) Muster oder beiden (ein Heterozygot) interpretiert. Die so erhaltenen Daten wurden genetischer Analyse unter Verwendung des Computerprogramms Mapmaker (Lander et al., Genomics (1987) 1: 174–181) unterworfen. In Verbindung mit früher erhaltenen Daten füv 436 anonyme RFLP-Marker in der Sojabohne (Tingey et al., J. Zelle. Biochem., Supplement 14E (1990) S. 291, Abstract R153] waren die Anmelder imstande, eine einzelnen genetischen Locus entsprechend der pXF1/600-bp-Sonde auf der genetischen Karte der Sojabohne zu positionieren. Dies bestätigt, daß das Gen für mikrosomale delta-lS-Desatwase sich auf Chromosom 19 in dem Sojabohnen-Genom befindet. Diese Information wird in der Sojabohnenzüchtung mit dem Ziel in Richtung zu der Entwicklung von Linien mit veränderten Niveaus von mehrfach ungesättigten Verbindungen verwendbar sein.
BEISPIEL 9
ÜBEREXPRESSION VON MIKROSOMALER DELTA-IS-FETTSÄURE-DESATURASE IN PFLANZEN
Ausführlichen Verfahrensweisen für DNA-Manipulation, wie beispielsweise Verwendung von Restriktionsendonucleasen und anderen DNA-modifizierenden Enzymen, Agarosegel-Elektrophorese, Isolation von DNA aus Agarosegelen, Transformation von E.-coli-Zellen mit Plasmid-DNA sowie Isolation und Sequenzierung von Plasmid-DNA, sind bei Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press und Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons beschrieben. Alle Restriktionsenzyme und modifizierenden Enzyme wurden, wenn nicht anderweitig bemerkt, von Bethesda Research Laboratory erhalten.
Um die biologische Wirkung von Überexpression der mikrosomalen delta-lS-Desaturase zu testen, wurde SEQ ID NO: 1, d. h. die cDNA, kodierend die mikrosomale delta-lS-Desaturase von Arabidopsis thaliana, in der sense-Orientierung hinter entweder dem CaMV-35S-Promotor, um konstitutive Expression bereitzustellen, oder hinter dem Promotor für das Gen, kodierend die a'-Untereinheit des (3-Conglycinin(7S)-Samenspeicherproteins der Sojabohne, um embryo-spezifische Expression bereitzustellen, plaziert. Um die chimären Genkonstrukte zu erzeugen, wurden spezielle Expressionskassetten hergestellt, um leichte Manipulation der gewünschten Klone zu ermöglichen. Die _Chimären Gene wurden dann durch das binäre Ti-Plasmid-Vektorsystem des Agrobacterium tumefaciens in Pflanzenzellen transformiert [Hoekema et al. (1983) Nature 303: 179–180; Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711–8720].
ÜBEREXPRESSION VON ARABIDOPSIS-DELTA-15-FETTSÄURE-DESATURASE IN TRANSGENEN KAROTTENHAARWURZELN
Um die Identität von SEQ ID NO:1 (mikrosomale delta-15-Fettsäure-Desaturase von Arabidopsis) zu bestätigen und um die biologische Wirkung ihrer Überexpression in einer heterologen Pflanzenspezies zu testen, wurde das konstitutive chimäre Gen 35S : SEQ ID NO: 1 durch Agrobacterium in Karottengewebe eingeführt. Die Kassette für konstitutive Genexpression in dem Plasmid, pAW28, ging aus pK35K hervor, welches dann wieder aus pKNK erhalten wird. Das Plasmid pKNK ist ein auf pBR322 basierender Vektor, enthaltend ein chimäres Gen für Pflanzen-Kanamycin-Resistenz: Nopalin-Synthase (NOS) Promotor/Neomycinphosphotransferase (NPT) II kodierende Region/3' NOS chimäres Gen. Das Plasmid pKNK ist am 7. Januar 1987 bei der American Type Culture Collection von Rockville, Maryland, USA unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt worden und trägt die Hinterlegungs-Zugangsnummer 67284. Eine Karte dieses Plasmids wird bei Lin et al., Plant Physiol. (1987) 84: 856–861 gezeigt. Die NOS-Promotor-Region ist ein 296 bp Sau 3A-Pst I Fragment entsprechend den Nucleotiden – 263 bis +33, in Bezug auf die Transkriptionsstartstelle, des NOS-Gens, beschrieben von Depicker et al. (1982) J. Appl. Genet. 1: 561–574. Die Pst-I-Stelle an dem 3'-Ende wurde an dem Translations-Initiationscodon des NOS-Gens erzeugt. Die NptII kodierende Region ist ein 998 bp Hind III-Bam HI-Fragment, erhalten aus Transposon Tn5 (Beck et al., Gen (1982) 19: 327–336) durch die Erzeugung von Hind-III- und Bam-HI-Stellen an den Nucleotiden 1540 bzw. 2518. Die 3'-NOS ist ein 702 bp Bam HI-Cla I Fragment von den Nucleotiden 848 bis 1550 des 3'-Endes des NOS-Gens (Depicker et al., J. Appl. Genet. (1982) 1: 561–574) einschließlich seiner Polyadenylierungsregion. pKNK wurde in pK35K umgewandelt, indem sein Eco RI-Hind III Fragment, enthaltend den NOS-Promotor, mit einem Eco RI-Hind III Fragment, enthaltend den CaMV-35S-Promotor, ersetzt wurde. Das Eeo RI-Hind III 35S Promotor-Fragment ist das gleiche wie das in pUC35K enthaltene, das am 7. Januar 1987 bei der American Type Culture Collection unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt worden ist und die Hinterlegungs-Zugangsnummer 67285 trägt. Das 35S-Promotor-Fragment wurde wie folgt und wie bei Odell et al., Nature (1985) 313: 810–813 beschrieben hergestellt, außer daß das 3'-Ende des Fragments CaMV-Sequenzen bis +21 in Bezug auf die Transkriptionsstartstelle einschließt. Ein 1,15-kB-BgI-II-Segment des CaMV-Genoms, enthaltend die Region zwischen –941 und +208 relativ zu der 35S-Transkriptionsstartstelle, wurde in der Bam-HI-Stelle des Plasmids pUC13 kloniert. Dieses Plasmid wurde an der SaI-I-Stelle in dem Polylinker, die sich 3' zu dem CaMV-Fragment befindet, linearisiert und das 3'-Ende des Fragments wurde durch Digestion nüt der Nuclease Bal31 verkürzt. Nach der Zugabe von Hind-III-Linkem wurde die Plasmid-DNA rezirkularisiert. Aus der Nucleotidsequenzanalyse der isolierten Klone wurde ein 3'-Deletions-Fragment mit dem bei +21 positionierten Hind-III-Linker ausgewählt. Das 35S-Promotor-Fragment wurde als Eco RI-Hind III Fragment isoliert, wobei die Eeo RI Stelle von dem Polylinker von pUC13 kommt.
Die NPTII kodierende Region in dem Plasmid pK35K wurde aus dem Plasmid pK35K durch Digestion mit Hind-III- und Bam-HI-Restriktionsenzym entfernt. Nach der Digestion wurden die Enden der DNA-Moleküle unter Verwendung von Klenow-Enzym aufgefüllt. Not-I-Linker (New England Biolabs) wurden dann auf den Enden ligiert und das Plasmid wurde rezirkularisiert, wobei sich das Plasmid pK35Nt ergab. Ein 1,7-kB-Fragment, enthaltend die 35S-Promotor-Region – Not-I-Stelle – 3' untranslatierte Region aus Nopalinsynthase, wurde aus pK35Nt unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen Eeo RI und Cla I freigesetzt. Nach der Restriktionsdigestion wurden die Enden des DNA-Moleküls unter Verwendung von Klenow-Enzym aufgefüllt, wonach Xho-I-Linker (New England Biolabs) hinzugegeben wurden. Das 1,7-kB-Fragment, jetzt enthaltend Xho-I-Stellen an jedem Ende, wurde Gel-isoliert und an seiner einzigartigen Xho-I-Stelle in den Plasmid-Vektor pURA3 (Clonetech) kloniert. Der Vektor pURA3 wurde ausgewählt aufgrund der Abwesenheit einer Not-I-Restriktionsstelle, der Anwesenheit einer einzelnen Xho-I-Restriktionsstelle und weil die relativ große Größe des Vektors (pURA3) die Isolation der Genexpressionskassetten aus dem finalen Konstrukt relativ leicht machen würde.
Das 1,4-kB-Not-I-Fragment in dem Plasmid pCF3, enthaltend mikrosomale delta-lS-Desaturase von Arabidopsis (SEQ ID NO: 1), wurde isoliert und ligiert mit pAW28 (die konstitutive Expressionskassette), früher mit Not-I-Restriktionsenzym linearisiert und mit intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer Mannheim) behandelt, um zu den Plasmiden pAW29 und pAW30 zu führen, die SEQ ID NO: 1, kloniert in einer sense-Orientierung bzw. antisense-Orientatierung in Bezug auf den Promotor, aufwiesen. Die Orientierung der cDNA relativ zu den Promotoren wurde durch Digestion mit passenden Restriktionsendonucleasen oder durch Sequenzierung über die Promotor-cDNA-Verbindungen festgestellt.
Die Chimären Gene 35S-Promotor/sense-SEQ ID NO: 1/3NOS- und 35S-Promotor/antisense-SEQ ID NO: 1/3NOS wurden als 3-kB-Xho-I-Fragment aus den Plasmiden pAW29 bzw. pAW30 isoliert und in den binären Vektor pZS194b an seiner einzigartigen SaI-I-Stelle kloniert, um zu den Plasmiden pAW31 bzw. pAW32 zu führen. Die Orientierung des selektierbaren Pflanzen-Marker-Gens in pAW31 und pAW32 ist, wie durch Digestion mit passenden Restriktionsendonucleasen festgestellt, die gleiche wie die des 355-Promotors. Der binäre Vektor pZS 194 enthält den pBR322-Ursprung der Replikation, die Replikations und Stabilitätsregionen des Pseudomonas-aeruinosa-Plasmids pVSl [Itoh et al., (1984) Plasmid 11: 206-220], erforderlich für Replikation und Erhaltung des Plasmids in Agrobacterium, das bakterielle NPT-II-Gen (Kanamycin-Resistenz) aus Tn5 [Berg et al., (1975) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 72: 3628–3632] als selektierbaren Marker für transformierte Bakterien, linke und rechte Grenzen der T-DNA des Ti-Plasmids [Bevan et al., (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711m8720] und, zwischen der linken und rechten 7-DNA-Grenze sind das chimäre NOS : NPT-II-Gen für Pflanzen-Kanamycin-Resistenz, beschrieben vorstehend, als selektierbarer Marker für transformierte Pflanzenzellen und das E. coli lacZ a komplementierende Segment [Vieria und Messing (1982) Gene 19: 259–267] mit einzigartigen Restriktionsendonuclease-Stellen für Kpn I und Sal I.
Die binären Vektoren pAW31 und pAW32 wurden durch das Ausfrierverfahren [Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181–187] in den Agrobacterlum-tumefaciens-Stamm R1000, tragend das Ri-Plasmid pRiA4b aus Agrobacterium rhizogenes [Moore et al., (1979) Plasmid 2: 617–626], transformiert, um zu den Transformanten R1000/pAW31 bzw. RI000/pAW32 zu führen.
Zellen von Karotten (Daucus carota L.) wurden durch Cokultivierung von Karottenwurzelscheiben mit dem Stamm R1000, R1000/pAW31 oder R1000/pAW32 nach dem Verfahren von Petit et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 388–393 transformert. Um Explants zur Inokulation herzustellen, wurden aus dem örtlichen Supermarkt gekaufte Karotten zuerst sanft mit Wasser und Geschinspülmittel geschrubbt, dann sorgfältig mit Leitungswasser und destillierten Wasser gespült. Sie wurden in einer gerührten Lösung von 50% Clorox und destilliertem Wasser für 30 min oberflächensterilisiert und sorgfältig mit sterilem destillierten Wasser gespült. Die Karotten wurden unter Verwendung eines autoklavierten Gemüseschälers abgeschält und dann mit einem Skalpellmesser zu Scheiben von ungefähr 5–10 mm Dicke geschnitten. Die Scheiben wurden in Petrischalen auf ein Medium, bestehend aus destilliertem deionisierten Wasser, verfestigt mit 0,7% Agar, in einer invertierten Orientierung plaziert, so daß die geschnittene Oberfläche, die der Wurzelspitze der Karotte am nächsten war, der Inokulation ausgesetzt wurde.
Kulturen der Agrobacterium-Stämme R1000, R1000/pAW31 und RI000/pAW32 wurden von frisch gezüchteten Platten in LB-Nährlösung plus den passenden antibiotischen selektiven Mitteln (50 mg/l Chloramphenicol für das R1000 oder 50 mg/l jeweils von Chloramphenicol und Kanamycin für R1000/pAW31 und RI000/pAW32) initiiert und bei 28°C zu einer optischen Dichte um 1,0 herum bei 600 nm gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifügation pelletisiert, gespült und in LB-Nährlösung ohne Antibiotika resuspendiert. Frisch geschnittene Karottenscheiben wurden durch Aufbringen von 100 μl der Bakteriensuspension auf die geschnittene Oberfläche jeder Scheibe inokuliert. Als Kontrolle wurden einige Scheiben nur mit steriler LB-Nährlösung inokuliert, um das Ausmaß von Wurzelbildung in der Abwesenheit von Agrobacterium anzuzeigen.
Inokulierte Wurzelscheiben wurden bei 25°C im Dunklen in mit Parafilm verschlossenen Petrischalen inkubiert. Nach zwei Wochen Cokultivierung von Karottenscheiben mit Probacterium urden die Karottenscheiben in frisches agar-verfestigtes Wassermedium, enthaltend 500 mg/l Carbenicillin fiir die Gegenauswahl von Agrobacterium überführt. Zu dieser Zeit wurde Haarwurzelbildung an einigen Wwzelscheiben bemerkt. Die Überführung der Explants in frisches Gegenauswahlmedium wurde nach vier Wochen ausgeführt. Die Exzision individueller Wurzeln aus den Explants wurde nach sechs Wochen begonnen. Zehn Tage später wurden wie benötigt zusätzliche Wurzeln aus den Explants genommen.
Ungefähr 5–10 nun lange Haarwurzeln wurden herausgeschnitten und individuell auf MS Minimal Organics Medium mit 30 g/l Saccharose (Gibco, Grand Island, N. Y., Kat.-Nr. 510-1118EA) und 500 mg/l Carbenicillin subkultiviert. Ungefähr eine gleiche Anzahl von Wurzeln wurde in flüssigem Medium und in einem mit 0,6% Agarose verfestigten Medium subkultiviert. Kulturen auf festem Medium wurden in Petrischalen von 60 x 100 mm gezüchtet, flüssige Kulturen waren in Kulturschalen mit 6 Vertiefungen. Wenn die Wwzeln herausgeschnitten wurden, wurde eine Anstrengung gemacht, um einzelne Wwzeln aus verschiedenen schwielenartigen Auswüchsen auf der verwundeten Oberfläche auszuwählen. Diese Stellen von Exzision wurden auf dem Deckel der Petrischale markiert, um Wiederholungsprobenahme von Gewebe, entstehend aus dem gleichen Transformationsereignis, zu minimieren.
Zwei bis drei Wochen nach der Exzision aus den Explants wurden individuelle Haarwurzel-Kulturen, die nicht sichtbar mit Agrobacterium kontamiert waren, in frisches MS-Medium, ergänzt mit 500 mg/1 Carbenicillin, überführt. Die Wurzelmasse von jeder Kultur wurde in Segmente, einschließend eine oder mehrere Zweigwurzeln, geschnitten und diese Segmente wurden als Gruppe auf eine Platte oder Vertiefung mit frischem Medium überführt. Ungefähr 20 mg Frischgewicht von Gewebe von Wurzelkulturen, welche innerhalb der nächsten zwei bis drei Wochen zu adäquater Größe wuchsen, wurden als Probe für Fettsäwezusammensetzung durch Gaschromatographie der Fettsäwemethylester genommen, im wesentlichen wie von Browse et al. (Anal. Biochem. (1986) 152: 141–145) beschrieben ist, außer daß 2,5% H₂SO₄ in Methanol als Methylierungsreagenz verwendet wurden und die Proben für 1,5 h auf 80°C erwärmt wurden, um die Methanolyse der Samentriglyceride zu bewirken. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Eine zweite Probe von Gewebe, bestehend aus einer aktiv wachsenden Wwzelspitze von ungefähr 1 cm, wurde herausgeschnitten und auf MS-Medium, ergänzt mit 500 mg/l Carbenicillin und 25-50 mg/l Kanamycin, plaziert, um auf Kanamycin-Resistenz-Selektion für Haarwurzeln, cotransformiert mit dem binären Vektor, zu testen [Simpson et al. (1986) Plant Mol. Biol. 6: 403–415].
TABELLE6 Prozent 18:3 und Verhältnis 18:2/18:3 in Wurzeln von transgenen Karotten
Die Fähigkeit von mit R1000 transformierten "Haar"-Wurzeln, in der Abwesenheit von exogenen Phytohormonen zu wachsen, kann dem Ri-Plasmid, pRiA4b, zugeschrieben werden. Wenn die Stämme R1000/pAW31 oder R1000/pAW32 zw Transformierung verwendet werden, wird nur eine Fraktion (etwa die Hälfte) der "Haar"-Wurzeln auch mit dem experimentellen binären Vektor, pAW31 oder pAW32, transformert. So zeigen, wie erwartet, nicht alle Haarwurzeln, die sich aus der Transformation mit R1000/pAW31 ergeben, den Phänotyp mit hohem 18 : 3-Gehalt. Die Abwesenheit eines signifikanten Fettsäure-Phänotyps in mit R1000/pAW31 transformierten "Haarwurzeln" ist erwartet, da nicht erwartet wird, daß delta-15-Desatwase-Sequenzen von Karotten und Arabidopsis hinreichend verwandt sind. Diese Ergebnisse zeigen, daß Überexpression von mikrosomaler delta-lS-Desatwase von Arabidopsis zu mehr als 10-facher Zunahme an 18:3 auf Kosten von 18 : 2 in heterologem Pflanzengewebe führen kann.
ÜBEREXPRESSION DER DELTA-IS-FETTSÄURE-DESATURASE VON ARABIDOPSIS IN SAMEN UND KOMPLEMENTATION DER MUTATION DER DELTA-IS-DESATURATION IN DER MUTANTE 3707
Um die Mutation der delta-15-Desatwation in der 7-DNA-Mutante 3707 zu ergänzen und um die biologische Wirkung der Überexpression von SEQ ID NO:1 (mikrosomale delta-15 Fettsäure-Desatwase von Arabidopsis) in Samen zu testen, wurde das chimäre Gen embryospezifischer Promotor:SEQ ID NO: 1 in die mutante Pflanze transformiert. Diese embryo-spezifische Expressionskassette in pAW42 wurde zum Teil unter Verwendung einer modifizierten Version des Vektors pCW109 hergestellt. Der Vektor pCW109 selbst wurde hergestellt, indem in die Hind-III-Stelle des Klonierungsvektors pUC18 (Bethesda Research Laboratory) eine 5'-nicht-kodierende Region von 555 bp (enthaltend die Promotonegion) des β-Conclycinin-Gens und die nachfolgende mehrfache Klonierungsequenz, enthaltend die Restriktionsendonuclease-Stellen für Nco I, Sma I, Kpn I und Xba I, dann die 3'-untranslatierte Region von Phaseolin von 1174 bp der gewöhnlichen Bohne in die Hind-III-Stelle [Slightom et al., Proc. Nat'l Acad.Sci. USA(1983) 80: 1897–1901] insertiert wurden. Die verwendete β-Conclycinin-Promotonegion ist ein Allel des veröffentlichten β-Conglycinin-Gens (Doyle et al., J. Biol. Chem. (1986) 261: 9228–9238) aufgrund von Unterschieden an den 27-Nucleotid-Positionen. Weitere Sequenzbeschreibung kann bei Slightom (W091/13993) gefunden werden.
Die Modifizierungen für den Vektor pCW109 waren wie folgt: Die potentielle Translations-Startstelle wurde durch Digestion mit den Restriktionsenzymen Neo I und Xba I und nachfolgende Behandlung mit Mungbohnen-Nuclease (New England Biolabs) zerstört, um lineare DNA-Moleküle mit stumpfen Enden zu erzeugen. Nach Ligierung von Not-I-Linkem (New England Biolabs) und Digestion mit Not-I-Restriktionsenzym (New England Biolabs) wurde das Plasmid rezirkularisiert. Bestätigung der gewünschten Änderung wurde durch Dideoxy-Sequenzierung erhalten. Das so erhaltene Plasmid wurde als pAW35 bezeichnet. Das 1,8-kB-Hind-III-Fragment aus pAW35, enthaltend die modifizierte β-Conclycinin-Promotor/3'-Phaseolin-Region, wurde in die Hind-III-Stelle in dem Plasmid-Vektor pBluescript SK⁺ (Stratagene) subkloniert, wobei das Plasmid pAW36 erzeugt wurde. Das Plasmid pAW36 wurde an seiner einzigartigen Eco-RI-Stelle linearisiert und mit Eeo RI/Xho I Adaptoren (Stratagene) ligiert. Nach Digestion mit Xho I wurde das 1,7-kB-Xho-I-Fragment, enthaltend die untranslatierte β-Conclycinin-Promotor/Not-I-Stelle/3'-Phaseolin-Region, in die Xho-I-Stelle in dem pURA3-Vektor (Clonetech) kloniert. Das entstehende Plasmid, pAW42, enthält die samenspezifische Expressionskassette, begrenzt durch Xho-I- Stellen, um Klonierung in modifizierte binäre T-DNA-Vektoren zu erleichtern, und eine einzigartige Not-I-Stelle, um Klonierung von Ziel-cDNA-Sequenzen zu erleichtern. Der Vektor pURA3 wurde aufgrund der Abwesenheit einer Not-I-Restriktionsstelle, der Anwesenheit einer einfachen Xho-I-Restriktionsstelle ausgewählt, und die relativ große Größe des Vektors (pURA3) würde die Isolation der Genexpressionskassetten aus dem finalen Konstrukt relativ leicht machen.
Das 1,4-kB-Not-I-Fragment in dem Plasmid pCF3, enthaltend mikrosomale delta-lS-Desaturase von Arabidopsis (SEQ ID NO: 1), wurde isoliert und mit dem Plasmid pAW42 (die samenspezifische Expressionskassette) ligiert, das früher mit Not-I-Restrtktionsenzym lineartsiert und mit intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer Mannheim) behandelt worden war, um das Plasmid pAW45 zu ergeben, das SEQ ID NO: 1, kloniert in einer sense-Ortentierung in bezog auf den Promotor, aufwies. Die Orientierung der cDNA relativ zu den Promotoren wurde durch Digestion mit passenden Restrtktionsendonucleasen oder durch Sequenzierung über die Promotor-cDNA-Verbindungen festgestellt.
Das chimäre β-Conclycinin-Promotor/sense-SEQ ID NO: 1/Phaseolin-3' wurde als 3,2-kB-Xho-I-Fragment aus dem Plasmid pAW45 isoliert und in den binären Vektor pAW25 an seiner einzigartigen SaI-I-Stelle subkloniert. In dem so erhaltenen Vektor, pAW50, ist die Ortentierung des selektierbaren Markers der Pflanze die gleiche wie die des β-Conclycinin-Promotors, wie durch Digestion mit passenden Restrtktionsendonucleasen festgestellt wurde. Das Plasmid pAW25 wird aus den Plasmiden pZS94K und pML2 erhalten. Das Plasmid pZS94K enthält den pBR322-Ursprung der Replikation, die Replikations- und Stabilitätsregionen des Pseudomonas-aeruginosa-Plasmids pVSI [Itoh et al., (1984) Plasmid 11: 206–220], erforderlich für Replikation und Erhaltung des Plasmids in Agrobacterium, das baktertelle NPT-II-Gen (Kanamycin-Resistenz) aus Tn5 [Berg et al., (1975) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 72: 3628–3632] als selektierbaren Marker fi1r transformierte Bakterten, ein Fragment der linken T-DNA-Grenze des Octopin-Ti-Plasmids pTiA6 und ein Fragment der rechten Grenze, erhalten aus TiAch5, beschrieben von van den Elzen et al. (Plant Mol. Biol. (1985) 5: 149–154). Zwischen diesen Grenzen ist das E. coli lacZ a komplementierende Segment [Vierta und Messing (1982) Gene 19: 259–267] mit den Restriktionsendonucleasestellen Sal I und Asp 718, erhalten aus pUCl8. Ein 4,5 kB Asp 718-Sal I DNA Fragment, enthaltend das chimäre, gegenüber dem Herbizid Sulfonylharnstoff (SU) resistente Acetolactat(ALS)-Gen, wurde aus dem Plasmid pML2 erhalten und in die Asp 718-Sal I Stellen des Plasmds pZS94K kloniert. Dieses chimäre ALS-Gen enthielt das CaMV 35S Promotor/Cab22L Bgl II-Nco I Fragment, das von Harpster et al. [Mol. Gen. Genet. (1988) 212: 182–190] beschrteben ist, und die Arabidopsis-ALS kodierende und 3'-nicht-kodierende Sequenz [Mazur et al., (1987) Plant Physiol. 85: 1110–1117], die mutiert wurde, so daß sie eine SU-resistente Form von ALS kodiert. Die Mutationen, eingef[hrt durch Stellen-gerichtete Mutagenese, sind diejenigen, vorhanden in dem Tabak-SU-resistenten Hra-Gen, beschrteben von Lee et al., (1988) EMBO J. 5: 1241–1248. Das so erhaltene Plasmid wurde als pAW25 bezeichnet.
Der binäre Vektor pAW25, enthaltend das chimäre embryospezifische (3-Conglycinin-Promotoraense-SEQ ID NO: 1-Gen, wurde durch das Ausfrierverfahren [Holsters et al., (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181–187] in den avirulenten Agrobactertum-Stamm LBA4404/pAL4404 transformiert [Hoekema et al., (1983) Nature 303: I 79–180].
Arabidosis-Wwzelkulturen wurden durch Cokultivierung mit Agrobacterium unter Verwendung von standardmäßigen aseptischen Techniken für die Manipulation steriler Medien transformiert, und axenischen Pflanzen/Bakterien-Kulturen wurde gefolgt, einschließlich der Verwendung einer Haube für laminaren Fluß für alle Transfers. Zusammensetzungen der Kulturmedien sind in Tabelle 8 aufgeführt. Wenn nicht anderweitig angezeigt, wurden für Pflanzengewebekultwen Petriplatten von 25 × 100 nun verwendet. Die Inkubation von Pflanzengewebekulturen erfolgte, wenn nicht anderweitig bemerkt, bei 23°C unter konstanter Beleuchtung mit gemischten Fluorescenz- und "Gro und Sho"-Pflanzenleuchten (General Electric). Um in-vitro-Wurzelkultwen der T-DNA-homorygoten-Mutantenlinie 3707 (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, geographische Rasse Wassilewskija) zu initiieren, wurden Samen der mutanten Linie für 10 min in einer Lösung von 50% Chlorox mit 0,1 SDS sterilisiert, 3 bis 5 Male mit sterilem dH₂O gespült, sorgfältig auf sterilem Filterpapier getrocknet, und dann wurden 2-3 Samen in flüssiges B5-Medium in 250-ml-Belco-Kolben gesät. Die Kolben wurden mit Kappen versehen, auf einer Umlaufschüttelmaschine mit 70–80 U/min plaziert und für 3–4 Wochen inkubiert. Vor der Inokulation mit Agrobacterium wurden die Wurzelgewebe auf Callus-Induktionsmedium (MSKig) kultiviert. Die Wwzeln wurden geerntet, indem die Wwzelmasse aus dem Belco-Kolben entnommen wurde, sie in eine Petrischale plaziert und unter Verwendung einer Pinzette kleine Bündel von Wwzeln aus der Wwzelmasse gezogen und sie auf MSKig-Medium plaziert wurden. Die Petrischalen wurden mit Filterband verschlossen und für vier Tage inkubiert.
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, tragend die Plasmide pAL4404 und pAW50, wurde in 5 ml YEB-Nährlösung, enthaltend 25 mg/1 Kanamycin und 100 mg/1 Rifampicin, gezüchtet. Die Kultur wurde für ungefähr 17–20 h in Glaskulturröhrchen in einem New-Brunswick-Plattformschüttler (225 U/min), gehalten bei 28°C, gezüchtet. Präkultivierte Wurzeln wurden in 0,5-cm-Segmente geschnitten und in einem 100-μm-Filter plaziert, das aus einem Tri-Pow-Becherglas (VWR Scientific, San Francisco, CA USA) und Drahtgewebe hergestellt wird, welches in eine Petrischale gesetzt wird. Wurzelsegmente wurden für mehrere min in 30–50 ml einer 1 : 20-Verdünnung der über-Nacht-Agrobacterium-Kultur mit periodischem sanften Mischen inokuliert. Inokulierte Wurzeln wurden auf steriles Filterpapier überführt, um das meiste von der Flüssigkeit abzuziehen. Kleine Bündel von Wurzeln, bestehend aus verschiedenen Wwzelsegmenten, wurden auf MSKig-Medium, enthaltend 100 μM Acetosyringon (3',5'-Dimethoxy-4'hydroxyacetophenon, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA), plaziert. Die Petriplatten wurden mit Parafilm oder Filterband verschlossen und für 2 bis 3 Tage inkubiert.
Nach der Infektion wurden die Wurzelsegrnente gespült und in Sproßinduktionsmedium mit Antibiotika überführt. Die Wurzelbündel wurden in eine 100-μm-Filtereinheit (vorstehend beschrieben) plaziert und mit 30–50 ml flüssigem MSKig-Medium gespült. Das Filter wurde in der Lösung heftig geschüttelt, um die Entfernung des Agrobacterium zu unterstützen, in eine saubere Petrischate überführt und wiederum gespült. Die Wwzeln wurden auf sterilem Filterpapier abgetupft, und Bündel von Wurzeln wurden auf MSg-Medium, enthaltend 500 mg/1 Vancomycin und entweder 10 oder 20 ppb Chlorsulfuron, plaziert. Die Platten wurden mit Filterband verschlossen und für 12 bis 14 Tage inkubiert.
Grüne Knötchen und kleine Sproßprimordia waren nach etwa 2-3 Wochen sichtbar. Die Explants wurden entweder intakt gelassen oder wurden für weitere Sproßentwicklung in zahlreiche Stücke zerbrochen und auf GM-Medium, enthaltend 200–300 mg/1 Vancomycin und entweder 10 oder 20 ppb Chlorsulfuron, plaziert. Die Platten wurden entweder mit zwei Stücken Band oder mit Filterband verschlossen. Wenn sich individuelle Sprosse entwickelten, wurden sie von dem Callus isoliert und wurden auf MSRg-Medium, enthaltend 100 mg/l Vancomycin und entweder 10 oder 20 ppb Chlorsutfuron, plaziert. Die Schalen wurden wie vorstehend beschrteben verschlossen und für sieben bis 10 Tage inkubiert. Die Sprosse wurden dann in GM-Medium, enthaltend 100–200 mg/1 Vancomycin in 25 × 100 Petrischalen oder Magenta-G7-Gefäßen, überführt. Viele prtmäre Transformanten (T1), welche in individuelle Behälter überführt wurden, setzten Samen (T2).
T2-Samen wurde von ausgewählten mutmaßlichen Transformanten geerntet und auf GM-Medium, enthaltend 10 ppb Chlorsulfuron, gesät. Die Platten wurden mit Filterband verschlossen, für 2 oder mehr Tage bei 4°C mit Kälte behandelt und dann für 10 bis 20 Tage bei 23°C unter konstanter Beleuchtung wie vorstehend beschrieben inkubiert. Die Sämlinge wurden als resistent (grün, wirkliche Blätter entwickeln sich) und empfindlich (keine wahren Blätter entwickeln sich) bewertet.
Ausgewählte Chlorsulfuron-resistente T2-Sämlinge wurden in Erde verpflanzt und wurden bei 23°C am Tage (16 h), 18°C in der Nacht (8 h) bei 65–80% relativer Feuchtigkeit zur Reife gezüchtet. T2-Samen von zwei Pflanzen wurden bei Reife geerntet und individuell durch Gaschromatographie der Fettsäuremethylester auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert, im wesentlichen wie von Browse et al. (Anal. Biochem. (1986) 152 :141–145) beschrteben ist, außer daß 2,5% H₂SO₄ in Methanol als Methylierungsreagenz verwendet wurden und die Proben für 1,5 h auf 80°C erwärmt wurden, um die Methanolyse der Samentriglycertde zu bewirken. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben.
Prozent Fettsäure in Samen von transgenen Mutanten 3707 TABELLE 7
Die Fettsäurezusammensetzung der Wildtyp- und der Mutantenlinie 3707 stellt den Durchschnitt von jeweils 6 einzelnen Samen dar. Samen von Pflanze 1 werden als 1–1 bis 1–6 bezeichnet und diejenigen von Pflanze 2 werden als 2–1 bis 2–6 bezeichnet. Die 20 : 1- und 20 : 2-Mengen sind nicht angegeben. Die Daten zeigen, daß die eine von sechs Samen in jeder Pflanze den mutanten Fettsäwe-Phänotyp zeigt, während die verbliebenen Samen mehr als 10-fache Zunahme in 18:3 bis ea. 55% zeigen. Während das meiste der Zunahme auf Kosten von 18 : 2 erfolgt, erfolgt etwas davon auch auf Kosten von 18 : 1. Derartige hohe Niveaus von Linolensäwe in Pflanzenölen werden in speziellen Ölfrüchten wie beispielsweise Leinsamen beobachtet. So wvd ebenfalls erwartet, daß Überexpression von diesem Gen in anderen Ölfrüchten, speziell Canola, welche eine nahe Verwandte von Arabidopsis ist, zu derartigen hohen Niveaus von 18:3 führt.

Mediumzusammensetzung TABELLE 8

YEP-MEDIUM	GRUNDMEDIUM
Bacto-Rindfleischextrakt 5,0 g	1 Pkg. Murashige und Skoog
Bacto-Hefeextrakt 1,0 g	Minimal Organics Medium ohne Saccharose
Pepton 5,0 g	(Gibco Y510-3118 oder Sigma #Me899)
Saccharose 5,0 g	10 ml Vitamin-Ergänzung
MgSO₄7H₂0 0,5 g	0,05% MES 0,5 g/l
Agar (optional) 5,0 g	0,8 Agar 8 g/l
PH	pH
VITAMIN-ERGÄNZUNG	GM = Keimungsmedium
10 mg/1 Thiamin	Grundmedium
50 mg/1 Pyridoxin	1% Saccharose 10 g/l
50 mg/1 Nicotinsäure
MSKIg = Callus-Induktionsmedium	MSg – Sproß-Induktionsmedium
Grundmedium	Grundmedium
2% Glucose 20 g/1	2% Glucose 20 g/l
0,5 mg/12,4-D 2,3 μ1	0,15 mg/1 IAA 0,86 μM
0,3 mg/1 Kinetin 1,4 μM	5,0 mg/12iP 24,6 μM
5 mg/1 IAA 28,5 μM
MSRg = Sproß-Induktionsmedium
Grundmedium
2% Glucose 20 g/1
12 mg/1 IBA 58,8 μM
0,1 mg/1 Kinetin 0,46μM

BEISPIEL 10
KONSTRUKTION VON VEKTOREN FÜR TRANSFORMATION VON BRASSICA NAPUS FÜR
VERRINGERTE EXPRESSION VON DELTA-15-DESATURASEN IN SICH ENTWICKELNDEN SAMEN
Ausführliche Verfahrensweisen für die Manipulation von DNA-Fragmenten durch Restriktionsendonuclease-Digestion, Größentrennung durch Agarosegel-Elektrophorese, Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, Ligierung von DNA-Fragmenten, Modifizierung geschnittener Enden von DNA-Fragmenten und Transformation von E.-coli-Zellen mit kreisförmigen DNA-Plasmiden sind alle bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (1989) John Wiley & Sons) beschrieben.
Sequenzen der cDNA's, kodierend die zytoplasmatische delta-lS-Desaturase von B. nanus und die Plastid-delta-15-Desatwase von Brassica napus, wurden in der antisense-Orientierung hinter die Promotor-Region der a'-Untereinheit des Sojabohnen-Speicherproteins β-Conglycinin plaziert, um embryospezifische Expression und hohe Expressionsniveaus bereitzustellen.
Eine embryospezifsche Expressionskassette wurde aufgebaut, um als Basis für chimäre Genkonstrukte für anti-sense-Expression der Nucleotidsequenzen von delta-15-Desaturase-cDNAs zu dienen. Der Vektor pCW109 wurde durch die Insertion von 555 Basenpaaren des β-Conglycinin-(a'-Untereinheit des 7s-Sarnenspeicherproteins)-Promotors aus der Sojabohne (Glvcine max) erzeugt, wobei der 5'-untranslatierten Region des β-Conglycinins eine mehrfache Klonierungsequenz folgt, enthaltend die Restriktionsendonucleasestellen für Nco I, Sma I, Kpn I und Xba I, dann 1174 Basenpaare der Phaseolin-3'untranslatierten Region von gewöhnlichen Bohnen in der Hind-III-Stelle in dem Klonierungsvektor pUCl8 (BRL). Die β-Conglycinin-Promotorsequenz stellt ein Allel des veröffentlichten β-Conglycinin-Gens (Doyle et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228–9238) dar, zurückzuführen auf Differenzen an 27 Nucleotidpositionen. Weitere Sequenzbeschreibung kann bei Slightom (WO92/13993) gefunden werden. Die Sequenz der 3'-untranslatierten Region von Phaseolin ist bei (Slightom et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1897–1901) beschrieben.
Um die Verwendung in antisense-Konstruktionen zu erleichtern, wurden die Nco-I-Stelle und potentielle Translations-Start-Stelle in dem Plasmid pCW109 durch Digestion mit Nco I, Mungbohnen-Exonuclease-Digestion und erneute Ligierung der stumpfen Stelle zerstört, wobei sich das modifizierte Plasmid pCW109A ergab. pCW109A wurde zwischen der β-Conglycinin-Promotor-Sequenz und der Phaseolin-3'-Sequenz durch Digestion mit Sma I geöffnet, um Insertion von cDNA-Fragmenten mit stumpfen Enden, kodierend die delta-15-Desatwase-Sequenzen, durch Ligation zu erlauben. Das Fragment mit stumpfen Enden der zytoplasmatischen delta-lS-Desatwase wurde aus dem Plasmid pBNSF3 erhalten, welches die Nucleotide 208 bis 1336 des cDNA-Inserts, beschrieben in SEQ ID NO:6, enthält. pBNSF3 wurde modifiziert, um die Hind-III-Stelle an den Basen 682 bis 687 von SEQ ID 6 durch Digestieren mit Hind III, Abstumpfen mit Klenow und erneute Ligierung zu entfernen. Das so erhaltene Plasmid [pBNSF3(-H)] wurde mit Eeo RI und Xho I digestiert, um das delta-15-cDNA-Fragment freizusetzen, alle Enden wurden Klenow-abgestumpft, und die kodierende 1,2-kB-Region wurde durch Gelisolation gereinigt. Das 1,2-kB-Fragment wurde in das vorstehend beschriebene Sma-I-geschnittene pCW109A ligiert. Die antisense-Orientierung der insertierten cDNA relativ zu dem β-Conglycinin-Promotor wurde durch Digestion nüt Aat I festgestellt, welche in der delta-lS-Desaturase kodierenden Region und in dem Vektor 5' zu dem β-Conglycinin-Promotor schneidet, um ein 1,4-kb-Fragment freizusetzen, wenn die kodierende Region in der antisense-Orientierung ist. Der antisense-Konstruktion wurde der Name pCCFdRI gegeben.
Die Transkriptionseinheit [β-Conglycinin-Promotor:antisense-delta-15-Desatwase:Phaseolin-3'-Ende) wurde aus pCCFdR1 durch Hind-III-Digestion freigesetzt, isoliert und in pBluescript ligiert, welches ebenfalls Hind-III-digestiert worden war, um das Plasmid pCCFdR2 zu ergeben. Dieses Konstrukt hat einzigartige BamH-I- und SaI-I-Stellen, welche digestier wurden. Die transkriptionelle Einheit von 3 kB wurde isoliert und in die Bam-HI- und SaI-I-Stellen in nachstehend beschriebenem pZ199 kloniert, um den binären Vektor pZCC3FdR zu ergeben. Die durch diese gerichtete Klonierung gegebene Orientierung geschieht mit Transkription von sowohl dem selektierbaren Marker-Gen als auch dem delta-l5-antisense-Gen in der gleichen Richtung und hin zu der T-DNA-Sequenz der rechten Grenze.
Eine antisense-Konstruktion, basierend auf der Plastid-delta-lS-Desaturase, wurde mit den 425 meist 3'-Basen von SEQ ID NO:8, welche in dem Plasmid pBNSFD8 enthalten ist, hergestellt. pBNSFD-8 stellt eine cDNA der Plastid-delta-lS-Desaturase in pBluescript dar. Das cDNA-Insert wurde aus pBNSFD-8 durch Digestion mit Xho I und Sma I entfernt, die Fragmente wurden abgestumpft und das 425-Basen-Insert durch Gelreinigung isoliert. Das isolierte Fragment wurde in die Sma-I-Stelle von pCW 109A kloniert und die antisense-Orientierung des ausgewählten Klons durch Digestion des Plasmids mit Pst I bestätigt. Pst I schneidet in der Plastid-delta-15-Sequenz und in dem pCW 109A-Vektor 5' zu dem (3-Conglycinin-Promotor, wobei ein 1,2-kB-Fragment freigesetzt wird, das ein Anzeichen der antisense-Orientierung ist. Das diese Konstruktion enthaltende Plasmid wurde pCCdFdR1 genannt.
Digestion von pCCdFdR1 mit Hind III entfernt ein 2,3-kB-Fragment, enthaltend die transkriptionelle Einheit [β-Conglycinin-Promoter:Plastid-delta-15-antisense:3'-Phaseolin-Sequenz]. Das Fragment wurde gelisoliert und in Hind-III-digestiertes pBluescript kloniert. Die Orientierung des Fragments war relativ zu der Bam-HI-Stelle in der Klonierungsregion von pBluescript und wurde durch Digestion mit Pst I wie vorstehend beschrieben bestimmt. Ein Klon, orientiert mit dem Promotor zu dem Sal I enthaltendem Ende, wurde ausgewählt und ihm wurde der Name pCCdFdR2 gegeben.
pCCdFdR2 wurde nüt Bam HI und Sal I digestiert, das freigesetzte Fragment wurde gelisoliert und in pZ199 ligiert, welches mit Bam HI und Sal I digestiert worden war, um den binären Vektor pZCCdFdR zu ergeben.
Vektoren für Transformation der antisense-delta-15-Desatwase-Konstruktionen unter Kontrolle des [i-Conglycinin-Promotors in Pflanzen unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens wurden durch Aufbauen eines binären Ti-Plasmid-Vektorsystems (Bevan, (1984) Nuel. Acids Res. 12: 8711–8720) erzeugt. Der für diese Systeme verwendete Ausgangsvektor (pZS199) basiert auf einem Vektor, welcher enthält: (1) das chimäre Gen Nopalinsynthase/Neomycinphosphotransferase als selektierbaren Marker für transformierte Pflanzenzellen (Bevan et al., (1984) Nature 304: 184–186), (2) die linke und rechte Grenze der T-DNA des Ti-Plasmids (Bevan et al., (1984) Nuel. Acids Res. 12: 8711–8720), (3) das E. coli 1aeZ a komplementierende Segment (Vieria and Messing (1982) Gene 19: 259–267) mit einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen für Eeo RI, Kpn I, Bam HI, Hin DIII und Sal I, (4) den Bakterien-Replikationsursprung von dem Pseudomonas-Plasmid pVSI (Itoh et al., (1984) Plasmid 11: 206–220) und (5) das bakterielle Neomycinphosphotransferase-Gen aus Tn5 (Berg et al., (1975) Proc. Natnl. Acad. Sci. USA 72: 3628–3632) als selektierbaren Marker für transformierte A. tumefaciens. Der Nopalinsynthase-Promotor in dem selektierbaren Marker von Pflanzen wurde mit dem 35S-Promotor (Odell et al. (1985) Nature, 313: 810–813) durch eine standardmäßige Restriktionsendonuclease-Digestion und Ligierungsstrategie ausgetauscht. Der 35S-Promotor ist wie nachstehend beschrieben für wirksame Brassica-napus-Transformation erforderlich.
BEISPIEL 11
AGROBACTERIUM-VERMITTELTE TRANSFORMATION VON BRASSICA NAPUS
Die binären Vektoren pZCC3FdR und pZCCdFdR wurden durch ein Ausfrierverfahren (Holsters et al., (1978) Mol Gen Genet 163: 181–187) in den Agobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 (Hoekema et al., (1983), Nature 303:179-180) transfertert.
Die Brassica-napus-Sorte "Westar" wurde durch Cokultivierung von Stücken des Sämlings mit dem passivierten Agrobacterium-tumefaciens-Stamm LBA4404, tragend den passenden binären Vektor, transformiert.
B.-napus-Samen wurden durch Rühren in 10% Chlorox, 0,1% SDS für dreißig min stertlisiert und dann sorgfältig mit stertlem destillierten Wasser gespült. Die Samen wurden auf stertlem Medium, enthaltend 30 mM CaCl₂ und 1,5% Agar, ausgekeimt und fiir sechs Tage im Dunklen bei 24°C gezüchtet.
Flüssige Kulturen von Agobacterium für Pflanzentransformation wurden über Nacht bei 28°C in Minimal A Medium, enthaltend 100 mg/l Kanamycin, gezüchtet. Die Baktertenzellen werden durch Zentrtfugation pelletisiert und mit einer Konzentration von 10⁸ Zellen/ml in flüssigem Minimal Organic Medium von Murashige und Skoog, enthaltend 100 μM Acetosyringon, resuspendiert.
Hypocotyle von B.-napus-Sämling wurden in 5-mm-Segmente geschnitten, welche unmittelbar in die Baktertensuspension plaziert wurden. Nach 30 min wurden die Hypocotyl-Stücke aus der Baktertensuspension entfernt und auf BC-12-Callus-Medium, enthaltend 100 μM Acetosyringon, plaziert. Das Pflanzengewebe und die Agrobacteria wurden für drei Tage bei 24°C in Dämmerlicht cokultiviert.
Die Cokultivierung wurde durch Überführen der Hypocotyl-Stücke in BC-12-Callus-Medium, enthaltend 200 mg/l Carbenicillin, um die Agrobacteria zu töten, und 25 mg/1 Kanamycin, um das Wachstum für die transformierte Pflanzenzelle auszuwählen, beendet. Die Sämlingsstücke wurden auf diesem Medium für drei Wochen bei 24°C unter kontinuierlichem Licht inkubiert.
Nach drei Wochen wurden die Segmente in BS-48 Regenerationsmedium, enthaltend 200 mg/1 Carbenicillin und 25 mg/1 Kanamycin, überführt. Das Pflanzengewebe wurde alle zwei Wochen auf frischem selektiven Regenerationsmedium unter den gleichen Kultwbedingungen, die für das Callus-Medium beschrieben wurden, subkultiviert. Mutmaßlich transformierte Calli wachsen schnell auf Regenerationsmedium; wenn die Calli einen Durchmesser von etwa 2 mm eneichten, wurden sie von den Hypocotyl-Stücken entfernt und auf dem gleichen Medium, dem Kanamycin fehlte, plaziert.
Sprosse begannen innerhalb mehrerer Wochen nach Überführung auf B(-48-Regenerationsmedium zu erscheinen. Sobald die Sprosse unterscheidbare Stengel bildeten, wurden sie von den Calli herausgeschnitten, in MSV-1A-Elongationsmedium überführt und zu einer 16 : 8-h-Tag/Nacht-Photopertode bei 24°C bewegt.
Sobald die Sprosse mehrere Internodien verlängert hatten, wurden sie über der Agaroberfläche geschnitten, und die geschnittenen Enden wurden in Rootone eingetaucht. Behandelte Sprosse wurden direkt in feuchtes erdfreies Eintopfmedium Metro-Mix 350 gepflanzt. Die Töpfe wurden mit Plastikbeuteln bedeckt, welche entfernt wurden, wenn die Pflanzen offensichtlich wuchsen -- nach etwa 10 Tagen.
Die Pflanzen wurden unter einer 16 : 8-h-Tag/Nacht-Photopertode mit einer Tagestemperatur von 23°C und einer Nachttemperatur von 17°C gezüchtet. Wenn der primäre Blühstengel sich zu verlängem begann, wurde er mit einem Maschenbeutel als Pollenbehältnis bedeckt, um Auskreuzung zu verhindern.
Selbstbefruchtung wurde durch Schütteln der Pflanzen mehrere Male an jedem Tag erleichtert. Samen, die aus Selbstbefruchtungen erhalten wurden, wurden etwa drei Monate nach dem Pflanzen geerntet.

TABELLE 9

Minimal-A-Bakterienwachstumsmedium	Brassica-Callus-Medium BC-12
Lösen in destilliertem Wasser:	Pro Liter:
10,5 g Kaliumphosphat, dibasisch	Minimal Organic Medium von Murashige und
4,5 g Kaliumphosphat, monobasisch	Skoog (MS-Salze, 100 mg/l i-Inositol, 0,4
1,0 g Ammoniumsulfat	mg/1 Thiamin; GIBCO #510-3118)
0,5 g Natriumcitrat, Dihydrat	30 g Saccharose
Auffüllen bis zu 979 ml mit destilliertem Wasser	18 g Mannitol
Autoklavieren	1,0 mg/12,4-D
Hinzugeben von 20 ml Filter-sterilisierter 10	3,0 mg/l-Kinetin
%ige Saccharose	0,6% Agarose
Hinzugeben von 1 ml Filter-sterilisiertem 1 M	pH 5,8
MgSO₄
Brassica-Regenerationsmedium BS-48	Brassica-Sproß-Elongations-Medium MSV-1A
Minimal Organic Medium von Murashige und	Murashige und Skoog Minimal Organic
Skoog Gamborg-B5-Vitamine (SIGMA #1019)	Medium Gamborg-B5-Vitamine
10 g Glucose	10 g Saccharose
250 mg Xylose	0,6% Agarose
600 mg MES	pH 5,8
0,4% Agarose
pH 5,7
Filter-sterilisieren und nach dem Autoklavieren
hinzugeben:
2,0 mg/1 Zeatin
0,1 mg/1 IAA

BEISPIEL 12
ANALYSE VON TRANSGENEN BRASSICA-NAPUS-PFLANZEN
Die Insertion der intakten transkriptionellen antisense-Einheit wurde durch Southern-Analyse unter Verwendung von transgenem Pflanzenblattgewebe als Ausgangsstoff von DNA wie in Beispiel 5 beschrieben überprüft. Zehn Mikrogramm von Blatt-DNA wurden mit einem Gemisch der Restriktionsendonucleasen Bam HI und Sal I bis zum Abschluß digestiert und dann durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt. Die abgetrennte DNA wurde auf Hybond-H⁺-Membran transferiert und mit radiomarkiertem Insert von pBNSF3-2 hybridisiert. Eine Abschätzung der Anzahl von Kopien des insertierten Transgens wurde durch Kalibrieren jedes Southern Blot mit standardmäßigen Mengen von pBNSF3-2 entsprechend 1 und 5 Kopien pro Genom und Vergleichen der Intensitäten des autoradiographischen Signals von den Standards, den Signalen der endogenen delta-15-Desahirase und dem Signal des insertierten Gens hergestellt. Bisher sind 38 unabhängige Transformanten auf die Anwesenheit des Gens analysiert worden und es wurde gefunden, daß 36 positiv waren.
Die relative Gehalt der 5 am reichlichsten vorhandenen Fettsäwen in Canola-Samen wurde entweder durch direkte Umesterung individueller Samen in 0,5 ml methanolischer H₂SO₄ (2,5%) oder durch Hexan-Extraktion von zusammengesetzten Samenproben und nachfolgende Umesterung eines Aliquots in 0,8 ml von 1%igem Natriummethoxid in Methanol bestimmt. Fettsäuremethylester wurden aus den methanolischen Lösungen nach der Zugabe eines gleichen Volumens von Wasser in Hexan extrahiert.
Die relative Gehalt von 18 : 3-Fettsäwe variiert signifikant während der Samenentwicklung. In einem geringeren Ausmaß variiert das Verhältnis von 18 : 3 zu 18 : 2 ebenfalls. So können bedeutungsvolle Daten aus Samen nur nach Reifung und Trocknung erhalten werden. Zusätzlich variiert das Verhältnis von 18:3 zu dem Gesamtfettsäwegehalt und zu 18 : 0 signifikant aufgrund von Umweltfaktoren, in erster Linie der Temperatur. In diesem Fall sind die am meisten passenden Kontrollen die transformierten Pflanzen, welche nach Southern-Analyse das antisense-delta-15-Transgen nicht enthalten. Die Analyse von den ersten 5 Transformanten, um trockenen Samen zu erreichen, ist nachstehend in Tabelle 10 angegeben. Es wurden Samen geerntet, indem ein Handkescher verwendet wurde, aufgehäuft und eine Probe von 1,5 g (etwa 300 Samen) entnommen wurde. Der Samen von jedem Transformanten wurde mit einem Mörser und Pistill zerkleinert, 4 Mal mit 8 ml Hexan bei etwa 50°C extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden im Volumen auf 5 ml verringert und zwei 50-Mikroliter-Aliquots wurden wie vorstehend beschrieben für Veresterung genommen. Trennung der Fettsäwemethylester wurde durch Gas-Flüssig-Chromatographie unter Verwendung einer Säule Omegawax 320 (Supelco Inc., 0,32 mm ID X 30M) ausgeführt, die isotherm bei 220° gefahren und zwischen jeder Injektion zyklisch bis 260° gefahren wurde.
TABELLE 10
Die Unterschiede zwischen den 4 transformierten Linien und Linie 92 sind sehr gering, um jedoch die Signifikanz des Unterschieds in dem 18 : 3/18 : 2-Verhältnis zwischen Linie 81 und 91 zu testen, wurden 25 individuelle Samen aus jeder Linie umgeestert und ihre Fettsäwezusammensetzung bestimmt. Das durchschnittliche Verhältnis für Linie 81 war 0,345 mit einem Variationskoeffizienten von 11,6%, während der Durchschnitt für Linie 91 0,375 mit einem Variationskoeffizienten von 8,0% war. Die Probenmittel sind unter Verwendung des Student's t-Tests an dem 0,01%-Niveau signifikant verschieden.
BEISPIEL 13
AUFBAU VON VEKTOREN FÜR TRANSFORMATION VON GLYCINE MAX FÜR VERRINGERTE EXPRESSION VON DELTA-15-DESATURASEN IN SICH ENTWICKELNDEN SAMEN
Die antisense-delta-15-Desaturase-cDNA-Sequenz des G.-max-Plastids unter Kontrolle des β-Conglycinin-Promotors wurde unter Verwendung des vorstehend in Beispiel 10 beschriebenen Vektors pCW109A aufgebaut. Zur Verwendung in dem nachstehend beschrtebenen Sojabohnen-Transformationssystem wurde die transkrtptionelle Einheit zusammen mit einem passenden selektierbaren Marker-Expressionssystem in einem Vektor plaziert.Der Ausgangsvektor war pML45, welcher aus dem nichtgewebespezifischen und konstitutiven Promotor, bezeichnet als 5O8D und beschrieben bei Hershey (WO 9011361), besteht, der die Expression des Neomycinphosphotransferase-Gens, beschrieben bei (Beck et al. (1982) Gene 19: 327–336), gefolgt von dem 3'-Ende des Nopalinsynthase-Gens einschließlich der Nucleotide 848 bis 1550, beschrieben von (Depicker et al. (1982) J. Appl. Genet. 1: 561–574), lenkt. Diese transkriptionelle Einheit wurde in den kommerziellen Klonierungsvektor pGEM9Z (BRL) insertiert und ist an dem 5'-Ende des 508D-Promotors von den Restriktionsstellen Sal I, Xba I, Bam HI und Sma I in dieser Reihenfolge flankiert. Eine zusätzliche SaI-I-Stelle ist an dem 3'-Ende der NOS-3'-Sequenz vorhanden, und die Stellen Xba I, Bam HI und Sal I sind einzigartig.
Entfernung der Einheit [β-Conglycinin-Promotor:IKlonierungsregion:Phaseolin-3'-Ende) aus pCW109A durch Digestion mit Hind III, Abstumpfen der Enden und Isolieren des 1,8-kB-Fragments lieferten durch Ligieren des vorstehend isolierten Fragments in die Sma-I-Stelle von pML45 die Expressionskassette pCST. Ein Klon mit dem β-Conglycinin-Promotor in der gleichen Orientierung wie dem 508D-Promotor wurde durch Digestion mit Xba I ausgewählt. Die korrekte Orientierung setzt ein 700-bp-Fragment frei. Diese Vektorkassette wurde pCST genannt.
Das 2,2-kB-Insert, kodierend die Sojabohnen-Plastid-delta-lS-Desaturase, wurde aus dem Plasmid pXF 1 durch Digestion mit HinP I subkloniert, um etwa 1 kB nichtverwandte cDNA zu entfernen. HinP I schneidet innerhalb des cDNA-Inserts sehr nahe an dem 5'-Ende der cDNA für die delta-lS-Desatwase und etwa 300 bp von dem 3'-Ende dieser cDNA. Die mit Cla I compatiblen Enden wurden in mit Cla I digestiertes pBluescript kloniert, und ein Klon mit dem 5'-Ende der cDNA in Richtung zu der Eco-RV-Stelle in der pBluescript-Klonierungsregion wurde ausgewählt, basierend auf der Freisetzung eines 900-bp-Fragments durch Digestion mit Pst I. Das subklonierte Plasmid wurde pS3Fd1 genannt.
Die delta-15 kodierende Sequenz wurde aus pS3Fd1 durch Digestion mit HinC II und Eco RV entfernt, das 2,2-kB-Fragment wurde gelisoliert und in die geöffnete Sma-I-Stelle in pCST1 kloniert. Ein Klon mit der delta-15-Sequenz in der antisense-Orientierung zu dem (3-Conglycinin-Promotor wurde durch Digestion mit Xba I ausgewählt. Das antisense-Konstrukt setzt ein 400-bp-Stück frei und dieser Klon wurde als pCS3FdSTIR bezeichnet.
BEISPIEL 14
TRANSFORMATION VON SOMATISCHEN SOJABOHNEN-EMBRYOKULTUREN
Sojabohnen-embryogene Suspensionskulturen werden in 35 ml flüssigen Medien (SB55 oder SBP6) auf einem Rotationsschüttler, 150 U/min, bei 28°C mit gemischtem Fluoreszenz- und Glühlicht in einem 16: 8-h-Tag/Nacht-Schema gehalten. Die Kulturen wurden alle vier Wochen durch Inokulieren von ungefähr 35 mg Gewebe in 35 ml flüssiges Medium subkultiviert.
Sojabohnen-embryogene Suspensionskulturen wurden mit pCS3FdSTIR nach dem Verfahren der Bombardierung mit dem Partikelgewehr (siehe Kline et al. (1987) Natwe (London) 327:70) transformiert. Ein Instrument Du Pont Biolistic PDS1000/HE (Heliumretrofit) wurde für diese Transformationen verwendet.
Zu 50 ml einer Suspension mit 60 mg/ml 1-mm-Goldpartikeln wurden (der Reihe nach) hinzugegeben; 5 μ1 DNA (1 μg/μl), 20 μ1 Spermidin (0,1 M) und 50 μ1 CaCl₂ (2,5 M). Die Partikelzubereitung wurde für 3 min gerührt, in einer Mikrofuge für 10 s geschleudert und die überstehende Flüssigkeit entfernt. Die DNA-beschichteten Partikel wurden dann einmal in 400 μ1 70%igem Ethanol gewaschen und in 40 μl wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA/Partikel-Suspension wurde drei Mal für jeweils 1 s ultraschallbehandelt. Fünf μ1 der DNA-beschichteten Goldpartikel wurden dann auf jede Makroträgerscheibe aufgegeben.
Ungefähr 300-400 mg einer vier Wochen alten Suspensionskultur wurden in eine leere Petrischale von 60 × 15 mm gegeben, und die restliche Flüssigkeit wurde aus dem Gewebe mit einer Pipette entfernt. Für jedes Transformationsexperiment wurden normalerweise ungefähr 5–10 Platten von Gewebe bombardiert.
Der Membranberstdruck wurde auf 1000 psi eingestellt und die Kammer wurde zu einem Vakuum von 28 Zoll Quecksilber evakuiert. Das Gewebe wurde ungefähr 3,5 Zoll von dem verbliebenen Screen entfernt plaziert und drei Mal bombardiert. Nach der Bombardierung wurde das Gewebe zurück in die Flüssigkeit plaziert und wie vorstehend beschrieben kultiviert.
Elf Tage nach der Bombardierung wurden die flüssigen Medien mit frischem SB55, enthaltend 50 mg/ml Hygromycin, ausgetauscht. Die selektiven Medien wurden wöchentlich aufgefrischt. Sieben Wochen nach der Bombardierung wurde grünes, transformiertes Gewebe, wachsend aus urtransformierten, nekrotischen embryogenen Clustern, beobachtet. Isoliertes grünes Gewebe wurde entfernt und in individuelle Kolben inokuliert, um neue, klonal propagierte, transformierte embryogene Suspensionskulturen zu erzeugen. So wurde jede neue Linie als unabhängiges Transformationsereignis behandelt. Diese Suspensionen können dann als Suspensionen von Embryos, geclustert in einem unreifen Entwicklungsstadium, durch Subkultur gehalten oder durch Reifung und Keimung individueller somatischer Embryos in ganze Pflanzen regeneriert werden.
Transformierte embryogene Cluster wurden aus der flüssigen Kultur entfernt und auf einem festen Agannedium (SB103), enthaltend keine Hormone oder Antibiotika, plaziert. Embryos wurden für acht Wochenbei 26°C mit gemischtem Fluoreszenz- und Glühlicht in einem 16 : 8-h-Tag/Nacht-Schema kultiviert. Während dieses Zeitraums wurden individuelle Embryos aus den Clustern entfernt und in verschiedenen Stadien der Embryoentwicklung analysiert. Nach acht Wochen werden die Embryos geeignet zur Keimung.

TABELLE 11

Medien:	B5-Vitamin-Vorrat
SB55- und SBP6-Vonatslösungen (g/1):	10 g m-Inositol
MS Sulfat 100X Vorrat	100 mg Nicotinsäure
MgSO₄7H₂O 37,0	100 mg Pyridoxin-HCl
MnSO₄H₂O 1,69	1 g Thiamin
ZnSO₄·7H₂O 0,86	SB55 (pro Liter)
CuSO_4·5H₂0 0,0025	10 ml jedes MS-Vorrats
MS Halogenide 100X Vorrat	1 ml B5-Vitaimin-Vorrat

CaCl₂·2H₂O	44,0 "
0,8 g NH₄NO₃	Kl
0,083	3,033 g KNO₃
CoCl₂6H₂O	0,00125
1 ml 2,4-D (10 mg/ml Vorrat)	KH₂PO₄
17,0	60 g Saccharose
H₃BO₃	0,62
0,667 g Asparagin	Na₂MoO_4·2H₂O
0,025	pH 5,7
Für SBP6-Substitut 0,5 ml 2,4-D SB 103 (pro	MSFeEDTA 100X Vorrat
	Liter)
Na₂EDTA	3,724
MS Salze	FeSO_4·7H₂O
2,784	6% Maltose
750 mg MgCl₂
	Q2% Gelrite
pH 5,7

BEISPIEL 15
ANALYSE VON TRANSGENEN GLYCINE-MAX-PFLANZEN
Während somatische Sojabohnenembryos in dem globularen Embryozustand in flüssiger Kultur wie in Beispiel 14 beschrieben sind, enthalten sie sehr geringe Mengen von Triacylglycerol oder Speicherproteinen, die typisch für reifende, zygotische Sojabohnenembryos sind. In diesem Entwicklungsstadium ist das Verhältnis von Gesamttriacylglycerid zu gesamtem polaren Lipid (Phospholipide und Glycolipid) etwa 1 : 4, wie typisch für zygotische Sojabohnenembryos in dem Entwicklungsstadium ist, aus welchem die somatische Embryokultur initiiert wurde. In dem globularen Stadium sind ebenso die mRNAs für die prominenten Samenproteine (a'-Untereinheit von β-Conglycinin, Kunitz Trypsin Inhibitor III und Sojabohnensamen-Lectin) im wesentlichen abwesend. Bei Überführung in hormonfreies Medium, um Differenzierung zu dem reifenden somatischen Embryozustand, wie beschrieben in Beispiel 14, zu erlauben, wird Triacylglycerol die am reichlichsten vorhandene Lipidklasse. Ebenso werden mRNAs für die a'-Untereinheit von β-Conglycinin, Kunitz Trypsin Inhibitor III und Soybean Seed Lectin sehr reichlich vorhandene Botschaften in der Gesamt-mRNA-Population. In dieser Beziehung verhält sich das somatische Sojabohnenembryosystem sehr ähnlich reifenden zygotischen Sojabohnenembryos in vivo und ist daher ein gutes und schnelles Modellsystem zum Analysieren der phänotypischen Wirkungen der Modifizierung der Expression von Genen in dem Fettsäure-Biosyntheseweg. Ähnliche somatische Embryokultursysteme sind dokumentiert und in einer anderen Ölsamenfrucht, Rapssamen, verwendet worden (Taylor et . (1990) Planta 181: 18–26). Fettsäweanalyse wurde wie in Beispiel 12 beschrieben unter Verwendung von einfachen Embryos als Gewebeausgangsmaterial durchgeführt. Eine Anzahl von Embryos aus Linie 2872 (Kontrollgewebe, transformiert mit pCST) und den Linien 299, 303, 306 und 307 (Linie 2872, transformiert mit dem Plasmid pCS3FdSTIR) wurden auf den Fettsäwegehalt analysiert. Die relative Fettsäure-Zusammensetzung von Embryos, genommen aus Gewebe, transformiert mit pCS3FdSTIR, wurde mit Kontrollgewebe, transformiert mit pCST, verglichen. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 12 angegeben.
TABELLE 12
Der durchschnittliche 18 : 3-Gehalt von Kontrollembryos war 14,5% mit einem Bereich von 11,1% bis 18,0%. Der durchschnittliche 18 : 3-Gehalt von transformierten Embryos war 11,5% mit einem Bereich von 6,3% bis 19,9%. Fast 80% der transformierten Embryos (38/48) hatten eine 18 : 3-Gehalt unter dem des Kontrollmittels. Etwa 44% hatten einen 18 : 3-Gehalt, der geringer war als der niedrigste beobachtete Kontrollwert, und 12,5% hatten einen 18 : 3-Gehalt, der geringer war als die Hälfte des Kontrollmittelwertes (d. h., weniger als 7,5%). Die geringste in transformiertem Gewebe beobachtete 18 : 3-Gehalt waren 6,3% (299-1-3, 307-1-2 #1), verglichen mit Tiefstand der Kontrolle von 11,1%. In allen Fällen wurde in transformiertem Gewebe eine Abnahme im 18 : 3-Gehalt durch eine äquivalente Zunahme im 18 : 2-Gehalt wiedergespiegelt, was anzeigt, daß die Desaturation von 18 : 2 auf 18:3 veningert worden war. Der relative Gehalt der anderen Fettsäuren blieb unverändert.
Southern-Analyse auf die Anwesenheit der intakten, eingeführten antisense-Konstruktion wurde wie in Beispiel 12 beschrieben unter Verwendung von Bam-HI-geschnittener gDNA durchgeführt, wobei auf einer Anzahl der nachstehend aufgeführten transformierten Linien Gruppen von Embryos aus einem einzelnen Transformationsereignis verwendet wurden. Die ungefähre Anzahl der intakten antisense-Kopien wurde aus der Anzahl und Intensität von hybridisierenden Banden auf den Autoradiogrammen geschätzt und ist in Tabelle 13 angegeben.
TABELLE 13
Es gab eine vernünftige Korrelation zwischen der Anzahl der intakten antisense-Kopien und dem 18 : 3-Gehalt, wobei eine Zunahme in der Anzahl der Kopien nüt einem verminderten 18 : 3-Gehalt und einer daraus folgenden Zunahme in dem 18 : 2/18 : 3-Verhältnis korreliert. Das durchschnittliche 18 : 2/18 : 3-Verhältnis von Linie 307-1/4, welche mindestens 8 Kopien der antisense-cDNA aufwies, war mehr als das doppelte von dem der Kontrolle.

Claims

Isoliertes Nucleinsäwefragment, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, kodierend eine Fettsäwe-Desatwase, welche zu der Nucleotidsequenz, angegeben in SEQ ID NO: 1, unter einer der folgenden Gruppen von Bedingungen hybridisiert: (a) Hybridisierung in 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 5% Dextransulfat und 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma bei 50°C und zweimal Waschen bei Raumtemperatur mit 2X SSPE, 0,1% SDS für 5 Minuten und 10 Minuten, nachfolgend Waschen für 5 Minuten bei 50°C in 0,5X SSPE, 0,1% SDS; (b) Hybridisierung in 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 5% Dextransulfat und 0,1 mg/ml DNA von denaturiertem Lachssperma bei 50°C und zweimal Waschen bei Raumtemperatw mit 2X SSPE, 1% SDS für 5 Minuten, dann Waschen für 5 Minuten bei 50°C in 0,2X SSPE, 1% SDS; oder (e) Hybridisierung in 50 mM Tris, pH 7,6, 6X SSC, 5X Denhardt's, 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 μg DNA von denaturiertem Kalbsthymus bei 50°C und Waschen mit 6X SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 Minuten, Wiederholen mit 2X SSC, 0,5% SDS bei 45°C für 30 Minuten, dann zweimal Wiederholen mit 0,2X SSC, 0,5% SDS bei 50°C für jeweils 30 Minuten.
Isoliertes Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäweidentität zu 90% oder mehr den SEQ ID NOS: 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 entspricht.
Isoliertes Nucleinsäwefragment nach Anspruch 1, wobei die Aminosäweidentität zu 65% oder mehr dem Polypeptid, kodiert durch SEQ ID NO: 14, entspricht.
Isoliertes Nucleinsäwefragment nach Anspruch 1, umfassend eine Nucleinsäwesequenz mit einer von den SEQ ID NOS: 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16.
Isoliertes Nucleinsäwefragment nach Anspruch 1, umfassend eine Nucleinsäwesequenz, kodierend eine Fettsäure-Desaturase-Säuresequenz mit einer Aminosäwesequenz, kodiert durch SEQ ID NOS: 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16.
Isoliertes Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Fragment aus einer Pflanze, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sojabohne, Brassica-Spezies mit Ölsamen, Arabidonsis thaliana und Mais, isoliert wird.
Chimäres Gen, welches heterogene regulatorische und kodierende Sequenzen umfaßt, die nicht in der Natur gefunden werden, umfassend ein Nucleinsäwefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Fragment operabel mit geeigneten regulatorischen Sequenzen verknüpft ist.
Pflanzen, enthaltend die chimären Gene nach Anspruch 7.
Verfahren zw Erzeugung von Samenöl, enthaltend veränderte Gehalte von Linolensäwe (18 : 3), umfassend: (a) Tranformieren einer Pflanzenzelle einer ölerzeugenden Spezies mit einem chimären Gen nach Anspruch 7; (b) Züchten fruchtbarer Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen von Schritt (a); (c) Screenen der Nachkommensamen von den fruchtbaren Pflanzen von Schritt (b) auf die gewünschten Gehalte von Linolensäuren (18 : 3); und (d) Verarbeiten des Nachkommensamens von Schritt (c), um Samenöl, enthaltend veränderte Gehalte von Linolensäure (18 : 3), zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Pflanzenzelle einer ölerzeugenden Spezies aus der Gruppe, bestehend aus Arabidopsis thaliana, Sojabohne, Brassica-Spezies mit Ölsamen, Sonnenblume, Baumwolle, Kakao, Erdnuß, Saflor und Mais, ausgewählt ist.
Verfahren zum RFLP-Mapping mit einem genomischen RFLP-Marker, umfassend: (a) Herstellen einer Kreuzung zwischen zwei Varietäten von Pflanzen; (b) Herstellen eines Southern Blot von Restriktionsenzym-digestierter genomischer DNA, isoliert aus verschiedenen Nachkommenpflanzen, entstehend aus der Kreuzung von Schritt (a); und (e) Hybridisieren des Southern Blot mit einem radiomarkierten Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1.
Isolierte genomische DNA von Arabidopsis thaliana, gekennzeichnet durch die Zugangsnummer ATCC 75167.
Isoliertes cDNA-Klon, welches für Sojabohnen-delta-15-Desaturase kodiert, umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 10 und gekennzeichnet durch die Zugangsnummer ATCC 68874.
Isoliertes cDNA-Klon, welches für delta-lS-Desaturase von Brassica-Spezies mit Ölsamen kodiert, umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 6 und gekennzeichnet durch die Zugangsnummer ATCC 68854.