EA037817B1 - Экстрагированный растительный липид, содержащий длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты - Google Patents

Экстрагированный растительный липид, содержащий длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты Download PDF

Info

Publication number
EA037817B1
EA037817B1 EA201600471A EA201600471A EA037817B1 EA 037817 B1 EA037817 B1 EA 037817B1 EA 201600471 A EA201600471 A EA 201600471A EA 201600471 A EA201600471 A EA 201600471A EA 037817 B1 EA037817 B1 EA 037817B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
desaturase
lipid
elongase
plant
acid
Prior art date
Application number
EA201600471A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201600471A1 (ru
Inventor
Джеймс Робертсон Петри
Суриндер Пал Сингх
Пушкар Шреста
Джейсон Тимоти Макаллистер
Малколм Дэвид Дивайн
Роберт Чарльз Де Фейтер
Original Assignee
Коммонвелт Сайнтифик Энд Индастриэл Рисерч Организэйшн
Нусид Пти Лтд
Грейнз Рисерч Энд Дивелопмент Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53367674&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA037817(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from AU2013905033A external-priority patent/AU2013905033A0/en
Application filed by Коммонвелт Сайнтифик Энд Индастриэл Рисерч Организэйшн, Нусид Пти Лтд, Грейнз Рисерч Энд Дивелопмент Корпорейшн filed Critical Коммонвелт Сайнтифик Энд Индастриэл Рисерч Организэйшн
Publication of EA201600471A1 publication Critical patent/EA201600471A1/ru
Publication of EA037817B1 publication Critical patent/EA037817B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/02—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fatty acids with glycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/52—Esters of acyclic unsaturated carboxylic acids having the esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C07C69/587—Monocarboxylic acid esters having at least two carbon-to-carbon double bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/201—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having one or two double bonds, e.g. oleic, linoleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/232—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having three or more double bonds, e.g. etretinate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/31—Brassicaceae or Cruciferae (Mustard family), e.g. broccoli, cabbage or kohlrabi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01051—1-Acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase (2.3.1.51)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)

Abstract

Изобретение относится к экстрагированному растительному липиду, содержащему докозагексаеновую кислоту (ДГК), причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%. Кроме того, настоящее изобретение относится к растительному и/или микробному липиду, содержащему докозапентаеновую кислоту (ДПК), причем уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 7 до 35%, и способам получения экстрагированного липида.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к липиду, содержащему докозагексаеновую кислоту и/или докозапентаеновую кислоту, полученные из растительных клеток или микробных клеток, и способам получения и применения липида.
Уровень техники
Длинноцепочечные омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ДЦ-ПНЖК) на сегодняшний день широко признаны как значимые соединения для здоровья человека и животных. Указанные жирные кислоты могут быть получены из пищевых источником или путем превращения линолевой (ЛК, 18:2ω6) или α-линоленовой (АЛК, 18:3 ω3) жирных кислот, обе из которых рассматриваются как незаменимые жирных кислот в рационе человека. Хотя человек и многие другие позвоночные животные могут превращать ЛК или АЛК, полученные из растительных источников, в C22, они осуществляют такое превращение с очень низкой скоростью. Кроме того, большинству современных обществ присуще несбалансированное питание, в котором по меньшей мере 90% полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) составляют ω6 жирные кислоты, вместо соотношения 4:1 или менее для ω6:ω3 жирных кислот, которое считается идеальным (Trautwein, 2001). Непосредственным пищевым источником ДЦ-ПНЖК, например, эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК, 20:5ω3) и докозагексаеновой кислоты (ДГК, 22:6ω3), для человека в основном является рыба или рыбий жир. Таким образом, медицинские работники рекомендуют регулярно включать рыбу, содержащую значительные уровни ДЦ-ПНЖК в рацион человека. Все чаще полученные из рыбьего жира ДЦ-ПНЖК вводят, например, в пищевые продукты и детское питание. Однако за счет уменьшения глобальной и национальной ловли рыбы необходимы альтернативные источники указанных благоприятно влияющих на здоровье масел.
Цветковые растения, в противоположность животным, не обладают способностью синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты с длиной цепи более 18 атомов углерода. В частности, культивируемые и садовые растения, наряду с другими покрытосеменными, не содержат ферментов, необходимых для синтеза ω3 жирных кислот с более длинной цепью, например ЭПК, докозапентаеновой кислоты (ДГЖ, 22:5ω3) и ДГК, полученных из АЛК. Важной целью в биотехнологии растений, таким образом, является создание культивируемых растений, которые вырабатывают существенные количества ДЦ-ПНЖК, таким образом обеспечивая альтернативный источник этих соединений.
Пути биосинтеза ДЦ-ПНЖК.
Биосинтез ДЦ-ПНЖК в организмах, таких как микроводоросли, мхи и грибы, обычно происходит как серия реакций кислород-зависимой десатурации и элонгации (фиг. 1). Самый распространенный путь получения ЭПК в указанных организмах включает Δ6-десаmурацию, Δ6-элонгацию и Δ5-десатурацию (называется путем Δ6-десатурации), тогда как в менее распространенном пути используется Δ9-элонгацuя, Δ8-десаmурация и Δ5-десатурацuя (носит название пути Δ9-десатурации). Указанные последовательные реакции десатурации и элонгации могут начинаться с субстрата ω6 жирной кислоты ЛК, схематически проиллюстрированного в верхней левой части фиг. 1 (ω6) или субстрата ω 3 АЛК до ЭПК, проиллюстрированного на нижней правой части фиг. 1 (ω3). Если начальная Δ6-десаmурацuя осуществляется на субстрате ω6 ЛК, продукт серии из трех ферментов ДЦ-ПНЖК будет представлять собой ω6 жирную арахидоновую кислоту (АРК). Организмы, синтезирующие ДЦ-ПНЖК, могут превращать ω6 жирных кислот в ω3 жирные кислоты с использованием ω3-десатуразы, что проиллюстрировано как стадия Δ 17-десатуразы на фиг. 1, для превращения арахидоновой кислоты (АРК, 20:4ω6) в ЭПК. Некоторые члены семейства ω3-десаmуразы могут воздействовать на различные субстраты, варьирующие от ЛК до АРК. Растительные ω3-десатуразы часто специфично катализируют Δ15-десатурацию ЛК до АЛК, тогда как грибковые и дрожжевые ω3-десатуразы могут быть специфичными в отношении Δ 17-десатурации АРК до ЭПК (Pereira et al., 2004a; Zank et al., 2005). Некоторые отчеты наводят на мысль о том, что могут существовать неспецифичные ω3-десатуразы, которые могут превращать широкий спектр ω6 субстратов в соответствующие ω3 продукты (Zhang et al., 2008).
Превращение ЭПК в ДГК в таких организмах происходит путем Δ5-элонгации ЭПК, с образованием ДПК, после чего следует Δ4-десатурация с образованием ДГК (фиг. 1). И наоборот, млекопитающие используют так называемый путь Шпрехера, в котором ДПК превращается в ДГК в ходе трех отдельных реакций, независимых от Δ4-десатуразы (Sprecher et al., 1995).
Фронт-энд десатуразы, в общем найденные в растениях, мхах, микроводорослях и низших животных, например Caenorhabditis elegans, в основном принимают субстраты жирных кислот, этерифицированных в положении sn-2 фосфатидилхолинового (ФХ) субстрата. Указанные десатуразы, таким образом, известны как ацил-ФХ, связанные с липидом, front-end десатуразы (Domergue et al., 2003). И наоборот, фронт-энд десатуразы высших животных в общем принимают субстраты ацил-КоА, где жирнокислотный субстрат связан с КоА вместо ФХ (Domergue et al., 2005). Известно, что некоторые десатуразы микроводорослей и одна растительная десатураза используют жирнокислотные субстраты, этерифицированные до КоА (табл. 2).
Каждая реакция элонгации ПНЖК состоит из четырех стадий, катализируемых многокомпонент- 1 037817 ным белковым комплексом: вначале, реакция конденсации приводит к добавлению модуля 2C из малонил-КоА к жирной кислоте, результатом чего является образование β-кетоацильного промежуточного соединения. Далее оно восстанавливается НАДФ-Н, с последующей дегидратацией и образованием еноильного промежуточного соединения. В конце данное промежуточное соединение повторно восстанавливается с образованием удлиненной жирной кислоты. В общем, считается, что стадия конденсации в числе указанных четырех реакций является специфичной для субстрата, а другие стадии - нет. На практике это означает, что природный аппарат элонгации растения способен к элонгации ПНЖК при условии, что введен конденсационный фермент (обычно под названием элонгаза), специфичный в отношении ПНЖК, хотя эффективность природного аппарата элонгации растения с точки зрения элонгации неприродных субстратов ПНЖК может быть низкой. В 2007 году была опубликована информация относительно идентификации и описания цикла элонгации дегидратазы дрожжей (Denic and Weissman, 2007).
Десатурация ПНЖК в растениях, мхах и микроводорослях естественным путем происходит на жирнокислотных субстратах, в основном в пуле ацил-ФХ, тогда как элонгация происходит на субстратах в пуле ацил-КоА. Перенос жирных кислот от молекул ацил-ФХ к носителю КоА выполняется фосфолипазами (ФЛА), тогда как перенос жирных кислот ацил-КоА к носителю ФХ выполняется лизофосфатидилхолин ацилтрансферазами (ЛФХАТ) (фиг. 9) (Singh et al., 2005).
Сконструированная выработка ДЦ-ПНЖК.
Большая часть метаболического конструирования ДЦ-ПНЖК осуществлялась с использованием аэробного пути Δ6-десатурация/элонгация. О биосинтезе γ-линоленовой кислоты (ГЛК, 18:3 ω6) в табаке с использованием Δ6-десатуразы из цианобактерии Synechocystis впервые сообщалось в 1996 году (Reddy and Thomas, 1996). Позже, ГЛК была получена в культивируемых растениях, таких как сафлор (73% ГЛК в масле из семян; WO 2006/127789) и соя (28% ГЛК; Sato et al., 2004). Выработка ДЦ-ПНЖК, например ЭПК и ДГК, включает более сложное конструирование за счет увеличения количества вовлеченных стадий десатурации и элонгации. О выработке ЭПК в наземном растении впервые сообщалось Qi et al. (2004), которые ввели гены, кодирующие Δ9-элонгазу из Isochrysis galbana, Δ8-десатуразу из Euglena gracilis и Δ5-десатуразу из Mortierella alpina в Arabidopsis с получением до 3% ЭПК. Данная работа была завершена Abbadi et al. (2004), которые сообщали о выработке до 0,8% ЭПК в зерне льна с использованием генов, кодирующих Δ6-десатуразу и Δ6-элонгазу из Physcomitrella patens и Δ5-десатуразу из Phaeodactylum tricornutum.
Первый отчет о получении ОДЦ-ДГК содержится в WO 04/017467, где раскрыта выработка 3% ДГК в зародышах сои, но не семени, посредством введения генов, кодирующих Δ6-десатуразу Saprolegnia diclina, Δ6-десатуразу Mortierella alpina, Δ5-десатуразу Mortierella alpina, Δ4-десатуразу Saprolegnia diclina, Δ 17-десатуразу Saprolegnia diclina, Δ6-элонгазу Mortierella alpina и Δ5-элонгазу Pavlova lutheri. Максимальный уровень ЭПК в эмбрионах, также вырабатывающих ДГК, составлял 19,6%, указывая на низкую эффективность превращения ЭПК в ДГК (WO 2004/071467). Это открытие было подобно опубликованному Robert et al. (2005), где выход превращения ЭПК в ДГК был низким, с выработкой 3% ЭПК и 0,5% ДГК в Arabidopsis с использованием Δ5/6-дсатуразы Danio rerio, Δ6-элонгазы Caenorhabditis elegans и Δ5-элонгазы и Δ4-десатуразы Pavlova salina. Также, в 2005 году Wu et al. опубликовали сообщение о выработке 25% АРК, 15% ЭПК и 1,5% ДГК в Brassica juncea с использованием Δ6-десатуразы Pythium irregulare, Δ5-десатуразы Thraustochytrid, Δ6-элонгазы Physcomitrella patens, Δ12-десатуразы Calendula officianalis, Δ5-элонгазы Thraustochytrid, Δ 17-десатуразы Phytophthora infestans, элонгазы ДЦ-ПНЖК Oncorhyncus mykiss, Δ4-десатуразы Thraustochytrid и ЛФХАТ Thraustochytrid (Wu et al., 2005). Краткое описание усилий по получению урожая семян масличных культур, которые синтезирует ω 3 ДЦПНЖК, приведено в Venegas-Caleron et al. (2010) и Ruiz-Lopez et al. (2012). Как указано Ruiz-Lopez et al. (2012), на дату публикации результаты по получению ДГК в трансгенных растениях даже отдаленно не напоминают уровней, наблюдаемых в рыбьем жире. Позже, Petrie et al (2012) сообщали о выработке около 15% ДГК в семенах Arabidopsis thaliana, и в WO2013/185184 сообщалось о выработке некоторых масел из семян, содержащих от 7 до 20% ДГК. Однако, не существует сообщений о выработке растительных масел, содержащих более 20% ДГК.
Не существует сообщений о выработке ДПК в рекомбинантных клетках на значимых уровнях без сопутствующей выработки ДГК. В действительности, авторам настоящего изобретения неизвестно о какой-либо опубликованной наводящей мысли или идее выработки ДПК в рекомбинантные клетках без выработки ДГК.
Таким образом, остается потребность в более эффективной выработке ДЦ-ПНЖК в рекомбинантных клетках, в частности ДГК или ДПК в семенах растений масличных культур.
Краткое описание сути изобретения
Авторами настоящего изобретения идентифицированы способы и растения для получения липида с высокими уровнями ДГК и/или ДПК. Как описано в WO 2013/185184, авторами настоящего изобретения ранее был раскрыт экстрагированный растительный липид, а также растения и части растений для выработки такого липида, содержащие ДГК в количестве от 7 до 20% от общего содержания жирных кислот в экстрагированном липиде. Был определен верхний предел 20%, поскольку в то время это считалось мак- 2 037817 симальным количеством ДГК, которое может вырабатываться в растениях. Однако, как описано в данном документе , изобретатели неожиданно обнаружили, что можно получить уровни ДГК более 20% от общего содержания жирных кислот. Кроме того, авторами найден растительный липид, а также части растений и растения для выработки липида, содержащего ДПК в количестве от 7 до 35% от общего содержания жирных кислот в экстрагированном липиде, особенно в отсутствие ДГК.
Соответственно, в первом аспекте настоящего изобретения предлагается экстрагированный растительный липид, содержащий жирных кислот в этерифицированной форме, причем жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), докозапентаеновой кислоты (ДПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), и при этом уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%.
В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается экстрагированный растительный липид, содержащий жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), докозапентаеновой кислоты (ДПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом что уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 2 до 16%, и при этом уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, если она присутствует, составляет менее 1%, причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%.
В другом аспекте изобретения предлагается экстрагированный липид, предпочтительно экстрагированный растительный липид или экстрагированный микробный липид, содержащий жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие αлиноленовую кислоту (АЛК) и докозапентаеновую кислоту (ДПК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), и при этом уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 35%. В вариантах реализации данного аспекта, уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 12%, около 15%, около 18%, около 20%, около 22%, около 24%, около 26%, около 28%, около 30%, от около 7 до около 28%, от около 7 до около 25%, от около 10 до 35%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25%, от около 10 до около 22%, от около 14 до 35%, от около 16 до 35%, от около 16 до около 30%, от около 16 до около 25% или от около 16 до около 22%.
В варианте реализации упомянутого выше аспекта ДГК присутствует на уровне менее 0,5% от общего содержания жирных кислот экстрагированного липида и более предпочтительно отсутствует в общем содержании жирных кислот липида.
В другом аспекте изобретения предлагается экстрагированный липид, предпочтительно экстрагированный растительный липид или экстрагированный микробный липид, содержащий жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК) и/или докозагексаеновую кислоту (ДГК), и при этом по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК, этерифицированных в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицированы в положении sn-2 ТАГ. В варианте реализации изобретения экстрагированный липид дополнительно обладает одним или более или всеми из следующих признаков:
(i) он содержит жирные кислоты, включая олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие кислоту линолевую (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК);
(ii) по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 48%, от 35 до около 60% или от 35 до около 50% ДРК и/или ДГК, этерифицированных в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицированы в положении sn-2 ТАГ; и (iii) уровень ДПК и/или ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до 35%, или от около 7 до 35% или от около 20,1 до 35%.
В вариантах реализации данного аспекта уровень ДПК и/или ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 12%, около 15%, около 18%, около 20%, около 22%, около 24%, около 26%, около 28%, около 30%, от около 7 до около 28%, от около 7 до около 25%, от около 10 до 35%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25%, от около 10 до около 22%, от около 14 до 35%, от около 16 до 35%, от около 16 до около 30%, от
- 3 037817 около 16 до около 25% или от около 16 до около 22%. В предпочтительных вариантах реализации изобретения экстрагированный липид обладает признаками (i) и (ii), (i) и (iii) или (ii) и (iii), более предпочтительно всеми из (i), (ii) и (iii). Предпочтительно экстрагированный липид дополнительно характеризуется уровнем пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, который составляет от около 2 до 16%, и при этом уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, если она присутствует, составляет менее 1%.
Варианты реализации каждого из четырех описанных выше аспектов более подробно раскрыты ниже. Как будет понятно квалифицированному специалисту, любые из вариантов реализации изобретения, описанные шире соответствующего признака в упомянутом выше аспекте, не применяются к данному аспекту.
В варианте реализации изобретения экстрагированный липид обладает одним или более из следующих признаков:
i) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 2 до 18%, от около 2 до 16%, от около 2 до 15% или от около 3 до около 10%;
ii) уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее 6%, менее 3%, менее 2%, менее 1% или около 0,1%;
iii) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до около 30%, от около 3 до около 30%, от около 6 до около 30%, от 1 до около 20%, от около 30 до около 60%, от около 45 до около 60%, около 30% или от около 15 до около 30%;
iv) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, от около 4 до около 20%, от около 4 до около 17% или от около 5 до около 10%;
v) уровень α-линоленовой кислоты (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 40%, от около 7 до около 40%, от около 10 до около 35%, от около 20 до около 35%, от около 4 до 16% или от около 2 до 16%;
vi) уровень γ-линоленовой кислоты (ГЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 4%, менее чем около 3%, менее чем около 2%, менее чем около 1%, менее чем около 0,5%, от 0,05 до около 7%, от 0,05 до около 4%, от 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%;
vii) уровень стеаридоновой кислоты (СДК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 10%, менее чем около 8%, менее чем около 7%, менее чем около 6%, менее чем около 4%, менее чем около 3%, от около 0,05 до около 7%, от около 0,05 до около 6%, от около 0,05 до около 4%, от около 0,05 до около 3%, от около 0,05 до около 10% или от 0,05 до около 2%;
viii) уровень эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 6%, менее чем около 5%, менее чем около 4%, менее чем около 1%, менее чем около 0,5%, от 0,05 до около 6%, от 0,05 до около 5%, от 0,05 до около 4%, от 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%;
ix) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭТрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее 4%, менее 2%, менее чем около 1%, от 0,05 до 4%, от 0,05 до 3% или от 0,05 до около 2% или от 0,05 до около 1%;
х) уровень эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 15%, менее чем 4%, менее чем около 3%, менее чем около 2%, от 0,05 до 10%, от 0,05 до 5%, от 0,05 до 3% или от 0,05 до 2%;
xi) если уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 35%, то уровень докозапентаеновой кислоты (ДПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 4%, менее чем около 3%, менее чем около 2%, от 0,05 до 8%, от 0,05 до 5%, от 0,05 до 3%, от 5 до 15%, от 5 до 10% или от 0,05 до около 2%;
xii) уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 22%, около 24%, около 26%, около 28%, около 31%, от 20,1 до 29%, от 20,1 до 28%, от 20,1 до около 27%, от 20,1 до около 26%, от 20,1 до около 25%, от 20,1 до около 24%, от 21 до 35%, от 21 до 30%, от 21 до 28%, от 21 до около 26% или от 21 до около 24%;
xiii) липид содержит ω6-докозапентаеновую кислоту (22:5Δ4,7,10,13,16) в числе содержащихся в нем жирных кислот, xiv) липид содержит менее 0,1% ω6-докозапентаеновой кислоты (22:5Δ4,7,10,13,16) в числе содержащихся в нем жирных кислот, xv) липид содержит менее 0,1% одной или более или всех из СДК, ЭПК и ЭТК в числе содержащихся в нем жирных кислот, xvi) уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 25%, от около 4 до около 20%, от около 6 до около 20% или от около 6 до около 12%;
xvii) уровень общих мононенасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 40%, от около 4 до около 35%, от около 8 до около
- 4 037817
25%, от 8 до около 22%, от около 15 до около 40% или от около 15 до около 35%;
xviii) уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, от около 30 до около 75%, от около 50 до около 75%, около 60%, около 65%, около 70%, около 75% или от около 60 до около 75%;
xix) уровень общих ω6 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 35 до около 50%, от около 20 до около 35%, от около 6 до 20%, менее чем 20%, менее чем около 16%, менее чем около 10%, от около 1 до около 16%, от около 2 до около 10% или от около 4 до около 10%;
хх) уровень новых ω6 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 10%, менее чем около 8%, менее чем около 6%, менее чем 4%, от около 1 до около 20%, от около 1 до около 10%, от 0,5 до около 8% или от около 0,5 до 4%;
xxi) уровень общих ω 3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 36 до около 65%, от 36 до около 70%, от около 40 до около 60%, от около 30 до около 60%, от около 35 до около 60%, от 40 до около 65%, от около 30 до около 65%, от около 35 до около 65%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 65% или около 70%;
xxii) уровень новых ω3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 21 до около 45%, от 21 до около 45%, от около 23 до около 35%, от около 25 до около 35%, от около 27 до около 35%, около 23%, около 25%, около 27%, около 30%, около 34%, около 40% или около 45%;
xxiii) соотношение общих ω6 жирных кислот:общих ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1,0 до около 3,0, от около 0,1 до около 1, от около 0,1 до около 0,5, менее чем около 0,50, менее чем около 0,40, менее чем около 0,30, менее чем около 0,20, менее чем около 0,15, около 1,0, около 0,1, от около 0,1 до около 0,4 или около 0,2;
xxiv) соотношение новых ω6 жирных кислот:новых ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1,0 до около 3,0, от около 0,02 до около 0,1, от около 0,1 до около 1, от около 0,1 до около 0,5, менее чем около 0,50, менее чем около 0,40, менее чем около 0,30, менее чем около 0,20, менее чем около 0,15, около 0,02, около 0,05, около 0,1, около 0,2 или около 1,0;
xxv) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, от около 60 до около 98%, от около 70 до около 95% или от около 75 до около 90%;
xxvi) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения АЛК в СДК под действием Δ6-десатуразы по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, от около 30 до около 70%, от около 35 до около 60% или от около 50 до около 70%;
xxvii) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения СДК в кислоту ЭТК под действием Δ6-элонгазы по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 88% или от около 75 до около 85%;
xxviii) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения ЭТК в ЭПК под действием Δ5-десатуразы по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, от около 60 до около 99%, от около 70 до около 99% или от около 75 до около 98%;
xxix) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, от около 50 до около 99%, от около 85 до около 99%, от около 50 до около 95% или от около 85 до около 95%;
ххх) если уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, то состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения ДПК в ДГК под действием Δ4-десатуразы по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 93%, от около 50 до около 95%, от около 80 до около 95% или от около 85 до около 95%;
xxxi) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения олеиновой кислоты в ДГК и/или ДПК по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, около 20%, около 25%, около 30%, от около 10 до около 50%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25% или от около 20 до около 30%;
xxxii) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения ЛК в ДГК и/или ДПК по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 22%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, от около 15 до около 50%, от около 20 до около 40% или от около 20 до около 30%;
xxxiii) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения АЛК в ДГК и/или ДПК по меньшей мере около 17%, по меньшей мере около 22%, по меньшей мере около 24%, по меньшей мере около 30%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около
- 5 037817
60%, от около 22 до около 70%, от около 17 до около 55%, от около 22 до около 40% или от около 24 до около 40%;
xxxiv) общие жирные кислоты в экстрагированном липиде содержат менее чем 1,5% C20:1, менее чем 1% C20:1 или около 1% C20:1, xxxv) содержание триацилглицерида (ТАГ) в липиде составляет по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере 95%, от около 70 до около 99% или от около 90 до около 99%;
xxxvi) липид содержит диацилглицерид (ДАГ), причем ДАГ предпочтительно содержит ДГК и/или ДПК;
xxxvii) липид содержит менее чем около 10%, менее чем около 5%, менее чем около 1% или от около 0,001 до около 5% свободных (неэтерифицированных) жирных кислот и/или фосфолипида, или по существу не содержит их;
xxxviii) по меньшей мере 70%, по меньшей мере 72% или по меньшей мере 80% этерифицированной ДГК и/или ДПК в форме ТАГ находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ, xxxix) наиболее распространенными ДГК-содержащими видами ТАГ в липиде являются ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), липид, содержащий три-ДГК ТАГ (TAG 66:18); и xl) уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 12%, около 15%, около 18%, около 20%, около 22%, около 24%, около 26%, около 28%, около 31%, от около 7 до около 31%, от около 7 до около 28%, от около 10 до 35%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25%, от около 10 до около 22%, от около 14 до 35%, от около 16 до 35%, от около 16 до около 30%, от около 16 до около 25%, или от около 16 до около 22%, причем уровень ДГК необязательно составляет менее чем 0,5% от общего содержания жирных кислот экстрагированного липида.
В другом варианте реализации экстрагированный липид обладает одним или более из следующих признаков:
i) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 2 до 15%;
ii) уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет около 0,1%;
iii) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 1 до 30%;
iv) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 4 до 20%;
v) уровень α-линоленовую кислоту (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 4 до 40%;
vi) уровень γ-линоленовой кислоты (ГЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 0,05 до 7%;
vii) уровень стеаридоновой кислоты (СДК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 0,05 до 10%;
viii) уровень эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет менее чем 6%;
ix) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭтрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет менее чем 4%;
x) экстрагированный растительный липид содержит менее чем 0,1% ω6-докозаnентаеновой кислоты (22:5Δ4,7,10,13,16) в числе содержащихся в нем жирных кислот;
xi) уровень новых ω6 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет менее чем 10%;
xii) соотношение общего содержания ω6 жирных кислот: общего содержания ω 3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 1,0 до 3,0 или от 0,1 до 1;
xiii) соотношение новых ω6 жирных кислот : новых ω 3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 1,0 до 3,0, от 0,02 до 0,1 или от 0,1 до 1;
xiv) состав жирных кислот экстрагированного растительного липида основывается на эффективности превращения олеиновой кислоты в ДГК по меньшей мере 10%;
xv) состав жирных кислот экстрагированного растительного липида основывается на эффективности превращения ЛК в ДГК по меньшей мере 15%;
xvi) состав жирных кислот экстрагированного растительного липида основывается на эффективности превращения АЛК в ДГК по меньшей мере 17%;
xvii) общие жирные кислоты в экстрагированном растительном липиде содержат менее чем 1,5% C20;
xviii) содержание триацилглицеридов (ТАГ) экстрагированного растительного липида составляет по меньшей мере 70%, и может характеризоваться одним или более из следующих признаков:
- 6 037817 xix) экстрагированный растительный липид содержит диацилглицерид (ДАГ), который содержит
ДГК;
хх) экстрагированный растительный липид содержит менее чем 10% свободных (неэтерифицированных) жирных кислот и/или фосфолипида или по существу не содержит их;
xxi) по меньшей мере 70% ДГК, этерифицированной в форме ТАГ, находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ;
xxii) наиболее распространенные ДГК-содержащие виды ТАГ в экстрагированном растительном липиде представляют собой ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12); и xxiii) экстрагированный растительный липид содержит три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
В варианте реализации уровень эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 0,05 до 10%.
В другом варианте реализации, в котором ДГК присутствует в количестве от 20,1 до 35%, уровень докозапентаеновой кислоты (ДПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет менее чем около 4%.
В дальнейшем варианте: реализации уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 20,1 до 30%.
В другом варианте реализации экстрагированный липид находится в форме масла, причем липид составляет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или от около 95 до около 98 мас.% масла.
В предпочтительном варианте реализации описанных выше первых двух аспектов липид или масло, предпочтительно масло из семян, обладают следующими признаками:
в общем содержании жирных кислот липида или масла уровень ДГК составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, уровень пальмитиновой кислоты составляет от около 2 до около 16%, уровень миристиновой кислоты составляет менее чем около 6%, уровень олеиновой кислоты составляет от около 1 до около 30%, уровень ЛК составляет от около 4 до около 35%, АЛК присутствует, уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 25%, соотношение общего содержания ω6 жирных кислот:общего содержания ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 до около 3,0, и содержание триацилглицеридов (ТАГ) липида составляет по меньшей мере около 70%, и необязательно липид по существу не содержит холестерина и/или липид содержит три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
Более предпочтительно липид или масло, предпочтительно масло семян, дополнительно обладает одним или более или всеми из следующих признаков:
по меньшей мере 70% ДГК этерифицировано в положении sn-1 или sn3 триацилглицерида (ТАГ),
АЛК присутствует на уровне от 4 до 40% от общего содержания жирных кислот,
ГЛК присутствует и/или уровень ГЛК составляет менее чем 4% от общего содержания жирных кислот, уровень СДК составляет от 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 4%, уровень ЭПК составляет от 0,05 до около 10%, уровень ДПК составляет от 0,05 до около 8%, уровень общих мононенасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, соотношение новых ω6 жирных кислот:новых ω 3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 0,03 до около 3,0, предпочтительно менее чем около 0,50, состав жирных кислот липида основан на эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения СДК в кислоту ЭТК под действием Δ6-элонгазы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы от около 50 до около 95%, эффективности превращения ДПК в ДГК под действием Δ4-десатуразы от около 50 до около 95%, эффективности превращения олеиновой кислоты в ДГК по меньшей мере около 10%.
Наиболее предпочтительно по меньшей мере 81% ДГК этерифицировано в положении sn-1 или sn-3 триацилглицерида (ТАГ).
В предпочтительном варианте реализации описанного выше третьего аспекта липид или масло,
- 7 037817 предпочтительно масло из семян, обладает следующими признаками:
в общем содержании жирных кислот липида или масла уровень ДПК составляет от около 7 до 30% или от 7 до 35%, уровень пальмитиновой кислоты составляет от около 2 до около 16%, уровень миристиновой кислоты составляет менее чем 1%, уровень олеиновой кислоты составляет от 1 до около 30%, уровень ЛК составляет от около 4 до около 35%, АЛК присутствует, уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 25%, соотношение общего содержания ω6 жирных кислот:общего содержания ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 до около 3,0, и содержание триацилглицеридов (ТАГ) липида составляет по меньшей мере около 70%, и необязательно липид по существу не содержит холестерина и/или липид содержит три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15).
Более предпочтительно липид или масло, предпочтительно масло семян, дополнительно обладает одним или более или всеми из следующих признаков:
по меньшей мере 70% ДПК этерифицировано в положении sn-1 или sn-3 триацилглицерида (ТАГ),
АЛК присутствует на уровне от 4 до 40% от общего содержания жирных кислот,
ГЛК присутствует и/или уровень ГЛК составляет менее чем 4% от общего содержания жирных кислот, уровень СДК составляет от 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 4%, уровень ЭПК составляет от 0,05 до около 10%, уровень общих мононенасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, соотношение новых ω6 жирных кислот:новых ω 3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 0,03 до около 3,0, предпочтительно менее чем около 0,50, состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения СДК в ЭТК кислоту под действием Δ6-элонгазы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы от около 50 до около 95%, и эффективности превращения олеиновой кислоты в ДПК по меньшей мере около 10%.
Наиболее предпочтительно по меньшей мере 81% ДПК этерифицировано в положении sn-1 или sn-3 триацилглицерида (ТАГ).
В другом предпочтительном варианте описанного выше четвертого аспекта липид или масло, предпочтительно масло семян, содержащий ДГК и/или ДПК, обладает следующими признаками:
в общем содержании жирных кислот липида или масла уровень пальмитиновой кислоты составляет от около 2 до около 16%, уровень миристиновой кислоты составляет менее чем 1%, уровень олеиновой кислоты составляет от около 1 до около 30%, уровень ЛК составляет от около 4 до около 35%, АЛК присутствует, общий уровень насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 25%, соотношение общего содержания ω6 жирных кислот:общего содержания ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 до около 3,0, содержание триацилглицеридов (ТАГ) липида составляет по меньшей мере около 70%, и необязательно липид содержит три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18) и/или три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15), причем по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК, этерифицированных в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ.
Более предпочтительно липид или масло, предпочтительно масло семян, дополнительно обладают одним или более или всеми из следующих признаков:
АЛК присутствует на уровне от 4 до 40% от общего содержания жирных кислот,
ГЛК присутствует и/или уровень ГЛК составляет менее чем 4% от общего содержания жирных кислот, уровень СДК составляет от 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 4%, уровень ЭПК составляет от 0,05 до около 10%,
- 8 037817 уровень общих мононенасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, соотношение новых ω6 жирных кислот: новых ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 0,03 до около 3,0, предпочтительно менее чем около 0,50, состав жирных кислот липида основан на эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения СДК в кислоту ЭТК под действием Δ6-элонгазы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы от около 50 до около 95%, эффективности превращения ДПК в ДГК под действием Δ4-десатуразы (если они присутствуют) от около 50 до около 95%, эффективность превращения олеиновой кислоты к ДПК по меньшей мере около 10%.
В контексте экстрагированного липида или масла по изобретению уровень ДГК и/или ДПК в экстрагированном липиде или масле не повышен или является в существенной мере таким же, как уровень ДГК и/или ДПК в липиде или масле части растения или микроба до экстракции. Другими словами, после экстракции не проводилось процедур для повышения уровня ДГК и/или ДПК в липиде или масле относительно других жирных кислот. Как будет очевидно, липид или масло впоследствии могут быть обработаны фракционированием или другими методами с целью модификации состава жирных кислот.
В еще одном предпочтительном варианте реализации липид или масло, предпочтительно масло из семян, обладают следующими признаками:
в общем содержании жирных кислот липида или масла уровень ДГК составляет от около 20,1 до 30% или от около 20,1 до 35%, уровень пальмитиновой кислоты составляет от около 2 до около 16%, уровень миристиновой кислоты составляет менее чем около 6% и предпочтительно менее чем около 1%, уровень олеиновой кислоты составляет от около 1 до около 30%, уровень ЛК составляет от около 4 до около 35%, АЛК присутствует, ГЛК присутствует, уровень СДК составляет от около 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 6%, уровень ЭПК составляет от около 0,05 до около 10%, уровень ДПК составляет от около 0,05 до около 8%.
В другом предпочтительном варианте реализации липид или масло, предпочтительно масло семян и более предпочтительно масло семян Brassica, такое как горчичное масло или рапсовое масло, обладают следующими признаками:
в общем содержании жирных кислот липида или масла уровень ДПК составляет от около 7 до 35%, уровень пальмитиновой кислоты составляет от около 2 до около 16%, уровень миристиновой кислоты составляет менее чем около 6% и предпочтительно менее чем 1%, уровень олеиновой кислоты составляет от около 1 до около 30%, уровень ЛК составляет от около 4 до около 35%, АЛК присутствует, уровень СДК составляет от около 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 6%, уровень ЭПК составляет от около 0,05 до около 10%.
ДГК может присутствовать или может отсутствовать в липиде или масле. Предпочтительно ДГК, если она присутствует, присутствует на уровне не более чем 0,5% от общего содержания жирных кислот липида или масла и более предпочтительно отсутствует в общем содержании жирных кислот липида или масла. Необязательно, липид по существу не содержит холестерина и/или липид содержит три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15). Более предпочтительно липид или масло, предпочтительно масло семян, дополнительно обладают одним или более или всеми из следующих признаков:
по меньшей мере 70% ДПК этерифицировано в положении sn-1 или sn-3 триацилглицерида (ТАГ),
АЛК присутствует на уровне от 4 до 40% от общего содержания жирных кислот,
ГЛК присутствует и/или уровень ГЛК составляет менее чем 4% от общего содержания жирных кислот, уровень СДК составляет от 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 4%, уровень ЭПК составляет от 0,05 до около 10%, уровень общих ненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%,
- 9 037817 уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, соотношение новых ω6 жирных кислот:новых ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 0,03 до около 3,0, предпочтительно менее чем около 0,50, состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения СДК в ЭТК кислоту под действием Δ6-элонгазы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы от около 50 до около 95%, и эффективности превращения олеиновой кислоты в ДПК по меньшей мере около 10%.
В варианте реализации по меньшей мере 81% ДПК этерифицировано в положении sn-1 или sn-3 триацилглицерида (ТАГ). В качестве альтернативы по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме ТАГ, этерифицировано в положении sn-2 ТАГ.
В дальнейшем варианте реализации экстрагированный липид по изобретению дополнительно содержит один или более стеролов, предпочтительно растительных стеролов.
В другом варианте реализации экстрагированный липид находится в форме масла и содержит менее чем около 10 мг стеролов/г масла, менее чем около 7 мг стеролов/г масла, от около 1,5 до около 10 мг стеролов/г масла или от около 1,5 до около 7 мг стеролов/г масла.
Примеры стеролов, которые могут присутствовать в экстрагированном липиде, включают, необязательно ограничиваясь ими, один или более или все из следующего: кампэстрол/24-метилхолестерин, Δ5-стигмастерол, эбурикол, в-ситостерол/24-этилхолестерин, Δ5-авенастерол/изофукостерол, Δ7стигмастерол/стигмаст-7-ен-3в-ол и Δ7-авенастерол.
В варианте реализации вид растения представляет собой один из перечисленных в табл. 14, например рапс, и уровень стеролов является около таким же, как приведенный в табл. 14 для данного конкретного вида растений. Виды растений могу представлять собой горчицу (B. juncea) или C. sativa и содержат уровень стеролов около найденного в экстрагированном масле горчицы дикого типа или C. sativa соответственно.
В варианте реализации экстрагированный растительный липид содержит один или более или все из кампэстерола/24-метилхолестерина, Δ5-стигмастерола, эбурикола, в-ситостерола/24-этилхолестерина, Δ5-авенастерола/изофукостерола, Δ7-стигмастерола/стигмаст-7-ен-3β-ола и Δ7-авенастерола, или содержит уровень стеролов, по существу такой же:, как в масле рапса дикого типа.
В варианте реализации экстрагированный липид содержит уровень стеролов, по существу такой же, как в масле рапса, горчичном масле или масле C. sativa дикого типа.
В варианте реализации экстрагированный липид содержит менее чем около 0,5 мг холестерина/г масла, менее чем около 0,25 мг холестерина/г масла, от около 0 до около 0,5 мг холестерина/г масла или от около 0 до около 0,25 мг холестерина/г масла или по существу не содержит холестерина.
В дальнейшем варианте реализации липид представляет собой масло, предпочтительно масло из масличной культуры. Примеры таких масел включают, без ограничения, масло вида Brassica, например масло рапса или масло горчицы, масло Gossypium hirsutum, масло Linum usitatissimum, масло вида Helianthus, масло Carthamus tinctorius, масло Glycine max, масло Zea mays, масло Arabidopsis thaliana, масло Sorghum bicolor, масло Sorghum vulgare, масло Avena saliva, масло вида Trifolium, масло Elaesis guineenis, масло Nicotiana benthamiana, масло Hordeum vulgare, масло Lupinus angustifolius, масло Oryza sativa, масло Oryza glaberrima, масло Camelina sativa, масло Crambe abyssinica, масло Miscanthus x giganteus, или масло Miscanthus sinensis. Более предпочтительно масло представляет собой масло вида Brassica, масло Camelina sativa или масло Glycine max (сои). В варианте реализации липид содержит или представляет собой масло вида Brassica, такое как масло Brassica napus или масло Brassica juncea, масло Gossypium hirsutum, масло Linum usitatissimum, масло вида Helianthus, масло Carthamus tinctorius, масло Glycine max, масло Zea mays, масло Elaesis guineenis, масло Nicotiana benthamiana,, масло Lupinus angustifolius, масло Camelina sativa, масло Crambe abyssinica, масло Miscanthus x giganteus или масло Miscanthus sinensis. В дальнейшем варианте реализации масло представляет собой масло рапса, масло горчицы (B. juncea), масло сои (Glycine max), масло Camelina sativa или масло Arabidopsis thaliana. В альтернативном варианте реализации масло представляет собой масло растения, кроме масла A. thaliana и/или кроме масла C. sativa. В варианте реализации масло растения представляет собой масло, кроме масла G. max (сои). В варианте реализации масло было получено из растения, выращенного в стандартных условиях, например, как описано в Примере 1, или из растения, выращенного в поле или в теплице в стандартных условиях.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения экстрагированного растительного липида, включающий стадии:
i) получение части растения, содержащей липид, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и при этом жирные кислоты, содержат олеиновую кислоту, пальмитиновую ки-
- 10 037817 слоту, ω6 жирные кислоты, включающие кислоту линолевую (ЛК) и γ-линоленовую кислоту (ГЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), стеаридоновую кислоту (СДК), докозапентаеновую кислоту (ДПК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК), и необязательно одну или более из эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом что уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида в части растения составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, и ii) экстракция липида из части растения, причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%.
В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения экстрагированного растительного липида, включающий стадии:
i) получение части растения, содержащей липид, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и при этом жирные кислоты содержат олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие кислоту линолевую (ЛК) и γ-линоленовую кислоту (ГЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), стеаридоновую кислоту (СДК), докозапентаеновую кислоту (ДПК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК), и необязательно одну или более из эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом что уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 2 до 16%, и при этом уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, если она присутствует, составляет менее чем 1%, притом что уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида в части растения составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, и ii) экстракция липида из части растения, причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%.
В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения экстрагированного растительного липида, включающий стадии:
i) получение части растения, содержащей липид, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и при этом жирные кислоты содержат олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие кислоту линолевую (ЛК), ω 3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), стеаридоновую кислоту (СДК), докозапентаеновую кислоту (ДИК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК), и необязательно одну или более из эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом, что уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 2 до 16%, и при этом уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, если она присутствует, составляет менее чем 1%, притом, что уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида в части растения составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, и ii) экстракция липида из части растения, причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%.
В варианте реализации трех вышеуказанных аспектов изобретения предлагается способ получения экстрагированного растительного липида, включающий стадии:
i) получение части растения, содержащей липид, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и при этом состав жирных кислот липида включает олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω 3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК), и одну или больше из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), докозапентаеновой кислоты (ДПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом что:
(i) уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%, (ii) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 2 до 16%, (iii) уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 1%, (iv) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 1 до 30%, (v) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 35%, (vi) уровень α-линоленовую кислоту (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 40%, (vii) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭтрК) в общем содержании жирных кислот экстрагирован-
- 11 037817 ного липида составляет менее чем 4%, (viii) общий уровень насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 25%, (ix) соотношение общего содержания ω6 жирных кислот:общего содержания ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 и 1, (x) содержание триацилглицеридов (ТАГ) липида составляет по меньшей мере 70%, и (xi) по меньшей мере 70% ДГК, этерифицированной в форме ТАГ, находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ, и ii) экстракция липида из части растения, причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%.
Предпочтительно по меньшей мере 81% или по меньшей мере 90% ДГК, этерифицированной в форме ТАГ, находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ.
В дальнейшем аспекте изобретения предлагается способ получения экстрагированного растительного липида или микробного липида, включающий стадии:
i) получение содержащей липид части растения или микробных клеток, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и при этом жирные кислоты содержат олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК) и докозапентаеновую кислоту (ДПК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), причем уровень ДПК в общем содержании жирных кислот липида из части растения или микробных клеток составляет от около 7 до 35%, и ii) экстракция липида из части растения или микробных клеток, причем уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 35%.
В варианте реализации уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 20% или от 20,1 до 35%.
В варианте реализации упомянутого выше аспекта изобретения предлагается способ получения экстрагированного растительного липида или микробного липида, включающий стадии:
i) получение содержащей липид части растения или микробных клеток, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и при этом состав жирных кислот липида включает олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω 3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК) и докозагексаеновую кислоту (ДПК), и одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), причем:
(i) уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 7 до 30% или от 7 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%, (ii) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 2 до 16%, (iii) уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 6%, предпочтительно менее чем 1%, (iv) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 1 до 30%, (v) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 35%, (vi) уровень α-линоленовую кислоту (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 40%, (vii) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭТрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 4%, (viii) уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 25%, (ix) соотношение общих ω6 жирных кислот:общих ω 3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 до 1, (x) содержание триацилглицеридов (ТАГ) в липиде составляет по меньшей мере 70%, и (xi) по меньшей мере 70% этерифицированной ДПК в форме ТАГ находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ, и ii) экстракция липида из части растения, причем уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 30% или от 7 до около 35%, предпочтительно от 30% около 35%.
Предпочтительно по меньшей мере 81% или по меньшей мере 90% ДПК, этерифицированной в форме ТАГ, находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения экстрагированного ли- 12 037817 пида, включающий стадии:
i) получение содержащих липид клеток, предпочтительно части растения, содержащей клетки, или микробных клеток, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и при этом жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК) и/или докозагексаеновую кислоту (ДГК), притом, что по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, и ii) экстракция липида из клеток, причем по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, этерифицировано в положении sn-2 ТАГ.
В варианте реализации экстрагированный липид, полученный по способу, дополнительно характеризуется одним или более или всеми из следующего:
(i) он содержит жирные кислоты, включающие олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК) и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), (ii) по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 48%, от 35 до около 60% или от 35 до около 50%, ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, и (iii) уровень ДПК и/или ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до 35% или от около 7 до 35% или от около 20,1 до 35%.
В вариантах реализации данного аспекта уровень ДПК и/или ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 12%, около 15%, около 18%, около 20%, около 22%, около 24%, около 26%, около 28%, около 30%, от около 7 до около 28%, от около 7 до около 25%, от около 10 до 35%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25%, от около 10 до около 22%, от около 14 до 35%, от около 16 до 35%, от около 16 до около 30%, от около 16 до около 25%, или от около 16 до около 22%. В предпочтительных вариантах реализации экстрагированный липид характеризуется (i) и (ii), (i) и (iii) или (ii) и (iii), более предпочтительно, всеми из (i), (ii) и (iii). Предпочтительно экстрагированный липид дополнительно характеризуется уровнем пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, который составляет от около 2 до 16%, причем уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, если она присутствует, составляет менее чем 1%.
В варианте реализации упомянутого выше аспекта изобретения предлагается способ получения экстрагированного липида, включающий стадии:
i) получение содержащих липид клеток, предпочтительно части растения, содержащей клетки, или микробных клеток, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и при этом жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК) и/или докозагексаеновую кислоту (ДГК) и дополнительно включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), и одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), причем:
(i) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 2 до 16%, (ii) уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 1%, (iii) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 1 до 30%, (iv) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 35%, (v) уровень α-линоленовой кислоты (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 40%, (vi) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭтрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида и составляет менее 4%, (vii) уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 25%, (viii) соотношение общих ω6 жирных кислот:общих ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 до около 1%, (ix) содержание триацилглицерида (ТАГ) в липиде составляет по меньшей мере около 70%, и (x) по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, и ii) экстракция липида из части растения,
- 13 037817 причем по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, этерифицировано в положении sn-2 ТАГ.
Стадия получения части растения или микробных клеток может включать сбор урожая частей растения, предпочтительно семени, с растений, которые образуют части растения, выделение микробных клеток из культур таких клеток или получение частей растения или микробных клеток путем приобретения у производителя или поставщика или посредством импорта. Способ может включать стадию определения состава жирных кислот липида в образце частей растения или микробных клеток или экстрагированного липида.
В предпочтительном варианте реализации экстрагированный липид, полученный способом по изобретению, обладает, если это уместно, одним или более признаков, определенных в данном описании, например, как определено выше для первых четырех аспектов.
Варианты реализации каждого из пяти раскрытых выше аспектов описаны более подробно ниже. Квалифицированному специалисту будет понятно, что никакие из вариантов реализации, описанных шире, чем соответствующий признак в упомянутом выше аспекте, не применяются к этому аспекту.
В варианте реализации часть растения является семенем, предпочтительно семенем масличной культуры. Примеры таких семян включают, без ограничения, семя вида Brassica, Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, вида Helianthus, Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, вида Trifolium, Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima,
Camelina sativa или Crambe abyssinica, предпочтительно семя вида Brassica, семя C. sativa или семя G. max (сои), более предпочтительно семя Brassica napus, B. juncea или C. sativa. В варианте реализации часть растения является семенем, предпочтительно масличной культуры, такой как вид Brassica, такой как Brassica napus или Brassica juncea, Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, вид Helianthus, Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Lupinus angustifolius, Camelina sativa или Crambe abyssinica, предпочтительно семенем Brassica napus, B. juncea или C. sativa. В варианте реализации семя представляет собой семя рапса, семя горчицы, семя сои, семя Camelina sativa или семя Arabidopsis thaliana. В альтернативном варианте реализации семя представляет собой семя кроме семени A. thaliana и/или кроме C. sativa. В варианте реализации семя представляет собой семя, кроме семени сои. В варианте реализации часть растения представляет собой семя вида Brassica. В варианте реализации семя было получено от растения, выращенного в стандартных условиях, например, как описано в Примере 1, или от растения, выращенного в поле или в теплице в стандартных условиях.
В другом варианте реализации семя содержит по меньшей мере около 18 мг, по меньшей мере около 22 мг. по меньшей мере около 26 мг, от около 18 мг до около 100 мг, от около 22 мг до около 70 мг, около 80 мг, от около 30 мг до около 80 мг, или от около 24 мг до около 50 мг ДГК и/или ДПК на 1 г семени.
В дальнейшем варианте реализации часть растения, такая как семя, содержит экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:
i) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iii) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iv) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,
v) ω3-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vi) Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vii) Δ12-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, viii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке части растения.
В дальнейшем варианте реализации часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, содержат экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов;
i) ω3-десаmураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iv) ω3-десаmураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза,
v) Δ12-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vi) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза
- 14 037817 и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке части растения или клетках.
В варианте реализации, если часть растения или клетки содержат липид, который содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты содержат докозапентаеновую кислоту (ДПК) и/или докозагексаеновую кислоту (ДГК), причем по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, то часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, содержат экзогенный полинуклеотид, кодирующий 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), и при этом полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, которые способны управлять экспрессией полинуклеотида в клетке части растения или клетках. В дальнейшем варианте реализации клетки содержат экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов;
i) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ω3-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, ii) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ15-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, iii) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза,
Δ6-десатураза,
Δ6-десатураза,
Δ6-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, iv) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза,
v) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ω3-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, vi) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ15-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, vii) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза,
Δ8-десатураза,
Δ8-десатураза,
Δ8-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, viii) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке. Предпочтительно ЛФААТ может использовать полиненасыщенный C22 жирный ацил-КоА субстрат, такой как ДГК-КоА и/или ДПК-КоА.
В варианте реализации Δ12-дезатураза дополнительно обладает ω3-десатуразной и/или Δ15-десатуразной активностью, т.е. виды активности обеспечиваются единым полипептидом. В качестве альтернативы, Δ12-десатураза не обладает ω3-десатуразной активностью и не обладает Δ15-десатуразной активностью, т.е. Δ12-десатураза представляет собой отдельный полипептид от полипептида, обладающего ω3-десатуразной и/или Δ15-десатуразной активностью.
Еще в одном варианте реализации часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, обладает одним или более или всеми из следующих признаков:
i) Δ12-десатураза превращает олеиновую кислоту в линолевую кислоту в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 90% или от около 75 до около 85%, ii) ω3-десатураза превращает ω6 жирные кислоты в ω3 жирные кислоты в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 85%, от около 65 до около 95%, от около 75 до около 91% или от около 80 до около 91%, iii) Δ6-десатураза превращает АЛК в СДК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, от около 30 до около 70%, от около 3:5 до около 60% или от около 50 до около 70%, iv) Δ6-десатураза превращает линолевую кислоту в γ-линоленовую кислоту в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью менее чем около 5%, менее чем около 2,5%, менее чем около 1%, от около 0,1 до около 5%, от около 0,5 до около 2,5%, или от около 0,5 до около 1%,
v) Δ6-элонгаза превращает СДК в ЭТК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 80% или от около 75 до около 80%, vi) Δ5-десатураза превращает ЭТК в ЭПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, от около 60 до около
- 15 037817
95%, от около 70 до около 95% или от около 75 до около 95%, vii) Δ5-элонгаза превращает ЭПК в ДПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, от около 50 до около 90% или от около 85 до около 95%, viii) Δ4-десатураза превращает ДПК в ДГК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 93%, от около 50 до около 95%, от около 80 до около 95% или от около 85%о до около 95%, ix) эффективность превращения олеиновой кислоты в ДГК или ДПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках составляет по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, около 20%, около 25%, около 30%, от около 10 до около 50%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25% или от около 20 до около 30%,
x) эффективность превращения ЛК в ДГК или ДПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках составляет по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 22%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, около 25%, около 30%, около 35%, от около 15 до около 50%, от около 20 до около 40% или от около 20 до около 30%, xi) эффективность превращения АЛК в ДГК или ДПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках составляет по меньшей мере около 17%, по меньшей мере около 22%, по меньшей мере около 24%, по меньшей мере около 30%, около 30%, около 35%, около 40%, от около 17 до около 55%, от около 22 до около 35% или от около 24 до около 35%, xii) одна или более клеток части растения или рекомбинантных клеток содержат по меньшей мере около на 25%, по меньшей мере около на 30%, от около 25 до около 40% или от около 27,5 до около 37,5%, больше жирных кислот ω3, чем соответствующие клетки без экзогенных полинуклеотидов, xiii) Δ6-десатураза предпочтительно уменьшает степень насыщенности α-линоленовую кислоту (АЛК) относительно линолевой кислоты (ЛК), xiv) Δ6-элонгаза дополнительно обладает активностью Δ9-элонгазы, xv) Δ12-десатураза дополнительно обладает активностью Δ 15-десатуразы, xvi) Δ6-десатураза дополнительно обладает активностью Δ8-десатуразы, xvii) Δ8-десаmураза дополнительно обладает активностью Δ6-десаmуразы или не обладает активностью Δ6-десатуразы, xviii) Δ 15-десатураза дополнительно обладает активностью ω3-десатуразы в отношении ГЛК, xix) ω3-десатураза дополнительно обладает активностью Δ 15-десатуразы в отношении ЛК, хх) ω3-десаmураза уменьшает степень насыщенности ЛК и/или ГЛК, xxi) ω3-десатураза предпочтительно уменьшает степень насыщенности ГЛК относительно ЛК, xxii) одна или более или все десатуразы, предпочтительно Δ6-десатураза и/или Δ5-десатураза, обладают более высокой активностью на субстрате ацил-КоА, чем на соответствующем субстрате ацилфосфатидилхолина (ацил-ФХ), xxiii) Δ6-десатураза обладает более высокой Δ6-десатуразной активностью в отношении АЛК, чем ЛК как жирнокислотного субстрата, xxiv) Δ6-десатураза обладает более высокой Δ6-десатуразной активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата, xxv) Δ6-десатураза обладает по меньшей мере в 2 раза более высокой Δ6-десатуразной активностью, по меньшей мере в 3 раза более высокой активностью, по меньшей мере в 4 раза более высокой активностью или по меньшей мере в 5 раз более высокой активностью в отношении АЛК как субстрата, по сравнению с ЛК, xxvi) Δ6-десатураза обладает более высокой активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата, xxvii) Δ6-десатураза обладает по меньшей мере в 5 раз более высокой активностью Δ6-десатуразы или по меньшей мере в 10 раз более высокой активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата, xxviii) десатураза представляет собой фронт-энд десатуразу, xxix) Δ6-десатураза не обладает обнаружимой активностью Δ5-десатуразы в отношении ЭТК.
Еще в одном варианте реализации часть растения, такая как семя, или рекомбинантная клетка, такая как микробные клетки, обладает одним или более или всеми из следующих признаков:
i) Δ12-десатураза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 4, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 50% иден- 16 037817 тичную SEQ ID NO: 4, ii) ω3-десаmураза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 6, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 6, iii) Δ6-десатураза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 9, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 9, iv) Δ6-элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 16, ее биологически активный фрагмент, такой как SEQ ID NO: 17, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 16 и/или SEQ ID NO: 17,
v) Δ5-десатураза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 20, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 20, vi) Δ5-элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 25, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 25, vii) Δ4-десаmураза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 28, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 28.
В варианте реализации часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, дополнительно содержит(ат) экзогенный полинуклеотид, кодирующий диацилглицеридацилтрансферазу (ДГАТ), моноацилглицеридацилтрансферазу (МГАТ), глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ГФАТ), 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФКАТ), предпочтительно ЛФКАТ, которая может использовать полиненасыщенный жирный ацил-КоА субстрат C22, такой как ДГК-КоА или ДПК-КоА, ацил-КоА:лизофосфатидилхолинацилтрансферазу (ЛФХАТ), фосфолипазу A2 (РЛК2), фосфолипазу C (PLC), фосфолипазу D (PLD), СДП-холин диацилглицеридхолин фосфотрансферазу (ХФТ), фосфатидилхолин диацилглицерид ацилтрансферазу (ФДАГ), фосфатидилхолин : диацилглицерид холин фосфотрансферазу (ФДХТ), ацил-КоА синтетазу (АКС) или комбинацию двух или более из указанных ферментов.
В другом варианте реализации часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, дополнительно содержит(ат) введенную мутацию или экзогенный полинуклеотид, который в клетке части растения отрицательно регулирует выработку и/или активность эндогенного фермента, выбранного среди FAE1, ДГАТ, МГАТ, ГФАТ, ЛФКАТ, ЛФХАТ, РЛК2, PLC, PLD, ХФТ, ФДАГ, тиоэстеразы, например FATB или Δ12-десатуразы, или комбинации двух или более из указанных ферментов.
В дальнейшем варианте реализации по меньшей мере один или все промоторы представляют собой специфичные для семени промоторы. В варианте реализации по меньшей мере один или все промоторы получены из гена биосинтеза или аккумуляции масла, такого как ген, кодирующий олеозин, или из генов хранения белка в семени, таких как ген, кодирующий конлинин.
В другом варианте реализации промотор(ы), направляющий(ие) экспрессию экзогенных полинуклеотидов, кодирующих Δ4-десатуразу и Δ5-элонгазу, инициирует экспрессию полинуклеотидов в развивающемся семени растения или рекомбинантных клетках, таких как микробные клетки, или достигает пика экспрессии перед промотором(ами), направляющим(и) экспрессию экзогенных полинуклеотидов, кодирующих Δ12-десатуразу и ω3-десатуразу.
В дальнейшем варианте реализации экзогенные полинуклеотиды ковалентно соединены в молекулу ДНК, предпочтительно молекулу T-ДНК, интегрированную в геном клеток части растения или рекомбинантных клеток, таких как микробные клетки, причем количество таких молекул ДНК, интегрированных в геном клеток части растения или рекомбинантных клеток, предпочтительно составляет не более одной, двух или трех, или составляет две или три.
Еще в одном варианте реализации часть растения содержит по меньшей мере два различных экзогенных полинуклеотида, каждый из которых кодирует Δ6-десатуразу с такой же или другой последовательностью аминокислот.
В дальнейшем варианте реализации общее содержание масла в части растения, содержащей экзогенные полинуклеотиды, составляет по меньшей мере около 40%, или по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 70%, от около 50 до около 80% или от около 80 до около 100% от общего содержания масла в соответствующей части растения, в которой отсутствуют экзогенные полинуклеотиды. В дальнейшем варианте реализации масса семени, содержащего экзогенные полинуклеотиды, составляет по меньшей мере около 40%, меньшей мере около 50%, меньшей мере около 60%, меньшей мере около 70%, от около 50 до около 80% или от около 80 до 100% от массы соответствующего семени, не содержащего экзогенных полинуклеотидов.
В другом варианте реализации липид находится в форме масла, предпочтительно масла из семян
- 17 037817 масличной культуры, причем по меньшей мере около 90%, или по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или от около 95 до около 98 мас.% липида составляют триацилглицериды.
В дальнейшем варианте реализации способ дополнительно включает обработку липида с целью повышения уровня ДГК и/или ДПК как процента от общего содержания жирных кислот. Например, обработка может включать переэтерификацию. Например, липид, такой как масло рапса, может быть подвергнут обработке с целью превращения жирных кислот в масле в алкиловые эфиры, например метиловые или этиловые эфиры, которые далее могут быть фракционированы с обогащением липида или масла ДГК и/или ДПК. В вариантах реализации состав жирных кислот липида после такой обработки включает по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% ДГК и/или ДПК. Соотношение ДГК:ДПК в липиде после обработки предпочтительно превышает 2:1 или в качестве альтернативы будет составлять менее чем 0.5:1. В качестве альтернативы уровень ДГК в общем содержании жирных кислот липида после обработки составляет менее чем 2,0% или менее чем 0,5%, предпочтительно она отсутствует в липиде.
Кроме того, раскрыт липид или масло, содержащее липид, полученные с применением способа по изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ получения метиловых или этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот, включающий введение триацилглицеридов в реакцию с метанолом или этанолом, в экстрагированном растительном липиде или в ходе процесса экстракции соответственно, причем экстрагированный растительный липид содержит этерифицированные жирные кислоты в форме ТАГ, и при этом жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), и докозагексаеновую кислоту (ДГК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), докозапентаеновой кислоты (ДПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом что уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%, с получением таким образом метила или этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения метиловых или этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот, включающий введение триацилглицеридов в реакцию с метанолом или этанолом, в экстрагированном растительном липиде или в ходе процесса экстракции соответственно, причем экстрагированный растительный липид содержит жирные кислоты, этерифицированные в форме ТАГ, и при этом жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω 3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК) и докозапентаеновую кислоту (ДПК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом что уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 35%, предпочтительно от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, с получением таким образом метиловых или этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения метиловых или этиловых эфиров докозапентаеновой кислоты (ДПК) и/или кислоты докозагексаеновой (ДГК), включающий введение триацилглицеридов (ТАГ) в реакцию с метанолом или этанолом, в экстрагированном растительном липиде или в ходе процесса экстракции соответственно, причем экстрагированный растительный липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и при этом жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК) и/или докозагексаеновую кислоту (ДГК), причем по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме ТАГ, этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, с получением таким образом метиловых или этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот.
В предпочтительном варианте реализации липид, который используется в способе согласно описанным выше трем аспектам, обладает одним или более признаков, определенных в данном описании в контексте экстрагированного липида или масла по изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается масличное растение или его часть, такая как семя, содержащая:
а) липид в его семени, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и
б) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:
i) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза,
Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза или ii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза,
Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более специфических для семени промоторов, способных управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в развивающемся семени растения, и при этом жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК) и γ-линоленовую кислоту (ГЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), стеаридоновую кислоту (СДК), докозапентаеновую
- 18 037817 кислоту (ДПК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК) и необязательно эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК) и/или эйкозатетраеновую кислоту (ЭТК), причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот липида семени составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается растение масличной культуры или его часть, такая как семя, содержащее:
а) липид в семени, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и
б) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:
i) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза,
Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, или ii) Δ12-десатураза, (ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза,
Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан к одним или более специфических для семени промоторов, способных управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в развивающемся семени растения, и при этом жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АПК), стеаридоновую кислоту (СДК), докозапентаеновую кислоту (ДПК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК) и необязательно эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК) и/или эйкозатетраеновую кислоту (ЭТК), притом, что уровень ДГК в общем содержании жирных кислот липида семени составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается растение масличной культуры или его часть, такая как семя, содержащее:
а) липид в семени, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и
б) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:
i) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза,
Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, или ii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза,
Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, притом, что каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более специфичными для семян промоторами, которые способны управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в развивающемся семени растения, и при этом жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты включают линолевую кислоту (ЛК) и γ-линоленовую кислоту (ГЛК), ω3 жирные кислоты включают α-линоленовую кислоту (АЛК), стеаридоновую кислоту (СДК), докозапентаеновую кислоту (ДПК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК) и необязательно эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК) и/или эйкозатетраеновую кислоту (ЭТК), причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот липида семени составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, и при этом уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот липида составляет от около 2 до 16%, и причем уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот липида, если присутствуют, составляет менее чем 1%.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается растение масличной культуры или его часть, такая как семя, содержащее липид в семени, или микробной клетке, содержащих:
а) липид, который содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и
б) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов;
i) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, iii) ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, или iv) ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более специфических для семени промоторов, способных управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в развивающемся семени растения, или одним или более промоторов, способных управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в микробной клетке, и при этом жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК) и необязательно γ-линоленовую кислоту (ГЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), стеаридоновую кислоту (СДК), и докозапентаеновую кислоту (ДПК), и необязательно докозагексаеновую кислоту (ДГК), эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК) и/или эйкозатетраеновую кислоту (ЭТК), притом, что уровень ДПК в общем содержании жирных кислот липида семени или микробной клетки составляет от 7 до 35%. В предпочтительном варианте реализации данного аспекта ДГК присутствует на уровне менее чем 0,5% от общего содержания жирных кислот липида семени и экстрагированного липида и более предпочтительно
- 19 037817 отсутствует в общем содержании жирных кислот липидов.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается клетка, предпочтительно клетка в или из растения, такого как растение масличной культуры, или его части, такой как семя, или растение масличной культуры или его часть, или микробная клетка, содержащие:
а) жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК) и/или докозагексаеновую кислоту (ДГК), и при этом по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, и
б) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:
i) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ω3-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, ii) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ 15-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, iii) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза,
Δ6-десатураза,
Δ6-десатураза,
Δ6-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, iv) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза,
v) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ω3-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, vi) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ15-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, vii) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза,
Δ8-десатураза,
Δ8-десатураза,
Δ8-десатураза,
Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, viii) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке. Предпочтительно ЛФААТ может использовать полиненасыщенный жирный ацил-КоА субстрат C22, такой как ДГК-КоА и/или ДПК-КоА, и уровень ДПК и/или ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до 35% или от около 7 до 35% или от около 20,1 до 35%. В вариантах реализации по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 48%, от 35 до около 60% или от 35 до около 50% ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ.
В вариантах реализации каждого из упомянутых выше пяти аспектов, Δ 15-десатураза представляет собой грибковую Δ15-десатуразу, и ω3-десатураза представляет собой грибковую ω3-десатуразу.
В предпочтительном варианте реализации растение масличной культуры, микробная клетка или клетка по изобретению обладает, если это уместно, одним или более признаков, определенных в данном описании, например, как определено выше для экстрагированного растительного липида, экстрагированного микробного липида или способа их получения.
Примеры растений масличной культуры включают, без ограничения, вид Brassica, Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, вид Helianthus, Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, вид Trifolium, Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa или Crambe abyssinica. В варианте реализации растение масличной культуры представляет собой растение вида Brassica, растение C. sativa или растение G. max (соя). В варианте реализации масличное растение представляет собой растение рапса, B. juncea, Glycine max, Camelina sativa или Arabidopsis thaliana. В альтернативном варианте реализации растение масличной культуры представляет собой растение, кроме A. thaliana и/или кроме C. sativa. В варианте реализации растение масличной культуры представляет собой растение, кроме G. max (сои). В варианте реализации растение масличной культуры находится в поле или было выращено в поле или было выращено в теплице в стандартных условиях, например, как описано в Примере 1.
В варианте реализации одна или более десатураз, применяемых в способе по изобретению или присутствующих в клетке или растении или его части по изобретению, способны использовать субстрат ацил-КоА. В предпочтительном варианте реализации одна или более из Δ6-десатуразы, Δ5-десатуразы, Δ4-десатуразы и Δ8-десатуразы, если они присутствуют, способны использовать субстрат ацил-КоА, предпочтительно каждая из i) Δ6-десатуразы, Δ5-десатуразы и Δ4-десатуразы или ii) Δ5-десатуразы, Δ4-десатуразы и Δ8-десатуразы способна использовать субстрат ацил-КоА. В варианте реализации Δ12-десатураза и/или ω3-десатураза способны использовать субстрат ацил-КоА. Субстрат ацил-КоА предпочтительно представляет собой АЛК-КоА для Δ6-десатуразы, ЭТК-КоА для Δ5-десатуразы, ДПК-КоА для Δ4-десатуразы, ЭТрК-КоА для Δ8-десатуразы, олеоил-КоА для Δ8-десатуразы или один
- 20 037817 или более из ЛК-КоА, ГЛК-КоА и АРК-КоА для ω3-десатуразы.
В варианте реализации зрелое, собранное в процессе сбора урожая семя растения содержит ДГК и/или ДПК в количестве по меньшей мере около 28 мг на 1 г семени, предпочтительно по меньшей мере около 32 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 36 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 40 мг на 1 г семени, более предпочтительно по меньшей мере около 44 мг на 1 г семени или по меньшей мере около 48 мг на 1 г семени, около 80 мг на 1 г семени, или от около 30 мг до около 80 мг на 1 г семени.
В дальнейшем аспекте настоящего изобретения раскрывается растение Brassica napus, B. juncea или Camelina sativa, которое способно давать семя, содержащее ДГК и/или ДПК, причем собранное в процессе сбора урожая зрелое семя растения содержит ДГК и/или ДПК в количестве по меньшей мере около 28 мг на 1 г семени, предпочтительно по меньшей мере около 32 мг на 1 гсемени, по меньшей мере около 36 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 40 мг на 1 г семени, более предпочтительно по меньшей мере около 44 мг на 1 г семени или по меньшей мере около 48 мг на 1 г семени, около 80 мг на 1 г семени или от около 30 до около 80 мг на 1 г семени.
В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается клетка растения по изобретению, содержащая экзогенные полинуклеотиды, раскрытые в данном описании.
Также раскрыта часть растения, предпочтительно семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, которые обладают одним или более из следующих признаков:
i) получена из растения по изобретению, ii) содержит липид, раскрытый в настоящем документе, или iii) может использоваться в способе по изобретению.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения раскрывается зрелое, собранное в процессе сбора урожая семя Brassica napus, B. juncea или Camelina sativa, содержащее ДГК и/или ДПК, с содержанием влаги от около 4 до около 15 мас.%, предпочтительно от около 6 до около 8 мас.% или от около 4 до около 8 мас.%, более предпочтительно от около 4 до около 6 мас.%, причем содержание ДГК и/или ДПК в семени составляет по меньшей мере около 28 мг на 1 г семени, предпочтительно по меньшей мере около 32 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 36 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 40 мг на 1 г семени, более предпочтительно по меньшей мере около 44 мг на 1 г семени или по меньшей мере около 48 мг на 1 г семени, около 80 мг на 1 г семени или от около 30 мг около 80 мг на 1 г семени.
В варианте реализации клетка по изобретению, растение масличной культуры по изобретению, растение Brassica napus, B. juncea или Camelina sativa по изобретению, часть растения по изобретению или семя по изобретению могут применяться для получения экстрагированного липида, обладающего одним или более или всеми признаками, определенными в настоящем документе.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения раскрывается способ получения растения или клетки по изобретению, которые могут применяться для получения экстрагированного липида по изобретению, причем способ включает:
а) анализ уровня ДГК и/или ДПК в липиде, продуцированном одной или более частями растения, такими как семена, или рекомбинантными клетками, такими как микробные клетки, от нескольких растений или рекомбинантных клеток, таких как микробные клетки, причем каждое растение или рекомбинантная клетка, такая как микробная: клетка, содержит один или более экзогенных полинуклеотидов, кодирующих один из следующих наборов ферментов:
i) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iii) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iv) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,
v) ω3-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vi) Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vii) Δ12-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, viii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, 4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, ix) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,
х) Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, xi) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, xiii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, или xiv) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке части растения или рекомбинантной клетке, и
- 21 037817
б) идентификацию из множества растений или рекомбинантных клеток растения или рекомбинантной клетки, которые могут применяться для получения экстрагированного растительного липида или клеточного липида по изобретению в одной или более их частей, и
в) необязательно, получение потомства растений или рекомбинантных клеток от идентифицированного растения или рекомбинантной клетки, или их семени.
В варианте реализации растение или рекомбинантная клетка дополнительно содержат экзогенный полинуклеотид, кодирующий ЛФААТ, как определено в данном описании.
Предпочтительно растение-потомок принадлежит по меньшей мере ко второму или третьему поколению относительно идентифицированного растения и предпочтительно является гомозиготным по одному или более полинуклеотидам. Более предпочтительно один или более полинуклеотидов присутствуют в растении-потомке только в одном инсерционном локусе. Таким образом, в изобретении предлагается способ, который может применяться в качестве способа скрининга для идентификации растения или его семени из множества трансформированных растений или семян кандидатов, причем идентифицированное растение или его растение-потомок вырабатывает липид по изобретению, предпочтительно в семени. Такое растение или растение-потомок или его семя отбирают, если оно вырабатывает липид по изобретению, в частности, с указанным уровнем ДГК и/или уровнем ДПК, или не отбирают, если оно не вырабатывает липида по изобретению.
В варианте реализации экзогенные полинуклеотиды, которые присутствуют в клетке, такой как микробная клетка, или растении или его части, как определено в данном описании, становятся стабильно интегрированными в геном клетки, растения или части растения, такой как семя. Предпочтительно экзогенный(е) полинуклеотид(ы) становится стабильно интегрированным в геном клетки, растения или части растения, такой как семя, в одном локусе в геноме, и предпочтительно являются гомозиготными для вставки. Более предпочтительно растение, часть растения или семя дополнительно характеризуется тем, что в нем отсутствуют экзогенные полинуклеотиды, кроме одной или более молекул T-ДНК.
Таким образом, никакие экзогенные векторные последовательности не интегрированы в геном, кроме последовательностей T-ДНК.
В варианте реализации перед стадией а) способ включает введение одного или более экзогенных полинуклеотидов в одну или более клеток растения.
Дополнительно предлагается растение, полученное с применением способа по изобретению, и семена такого растения.
В варианте реализации растение по изобретению обладает как мужской, так и женской фертильностью, предпочтительно с уровнями как мужской, так и женской фертильности, которые составляют по меньшей мере 70% относительно соответствующего растения дикого типа, или предпочтительно являются такими же. В варианте реализации пыльца, вырабатываемая растением по изобретению или растением, полученным из семени по изобретению, является на 90-100% жизнеспособной по данным окрашивания красителем для определения жизнеспособности. Например, жизнеспособность пыльцы можно оценить, как описано в Примере 1.
В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ получения семени, включающий:
а) выращивание растения по изобретению или растения, которое образует часть по изобретению, предпочтительно в поле как часть популяции размером по меньшей мере 1000 или 2000 или 3000 таких растений или на площади по меньшей мере 1, или 2, или 3 га со стандартной плотностью насаждения, или в качестве альтернативы в теплице со стандартными условиями,
б) сбор урожая семени с растения или растений, и
в) необязательно, экстракцию липида из семени, предпочтительно с получением масла с общим выходом ДГК и/или ДПК по меньшей мере 60, или 70. или 80 кг ДГК и/или ДПК на 1 га.
В варианте реализации растение, клетка растения, часть растения или семя или рекомбинантная клетка по изобретению обладают одним или более из следующих признаков:
i) масло является таким, как раскрыто в настоящем документе, или ii) часть растения или семя или рекомбинантная клетка могут применяться в способе по изобретению,
Например, семя может применяться для получения растения по изобретению. Растение может быть выращено в поле или в теплице со стандартными условиями, например, как описано в Примере 1.
В дальнейшем аспекте настоящего изобретения раскрывается липид или масло, продуцированные или полученные, с применением способа по изобретению, из клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, B. juncea, G. max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению или растения, клетки растения, части растения или семени по изобретению. Предпочтительно липид или масло очищают для удаления загрязняющих веществ, таких как нуклеиновая кислота (ДНК и/или РНК), белок и/или углевод, или пигментов, таких как хлорофилл. Кроме того, липид или масло могут быть очищены с целью увеличения содержания ТАГ, например, путем удаления свободных жирных кислот (СЖК) или фосфолипида.
В варианте реализации липид или масло получены экстракцией масла из масличной культуры. Примеры масла из масличных культур включают, без ограничения, масло рапса (Brassica napus, подвид
- 22 037817
Brassica rapa), горчичное масло (Brassica juncea), масло другого вида Brassica, масло подсолнечника (Helianthus annus), льняное масло (Linum usitatissimum), соевое масло (Glycine max), сафлоровое масло (Carthamus tinctorius), кукурузное масло (Zea mays), масло табака (Nicotiana tabacum), арахисовое масло (Arachis hypogaea), пальмовое масло, хлопковое масло (Gossypium hirsutum), кокосовое масло (Cocos nucifera), масло авокадо (Persea americana), оливковое масло (Olea europaea), масло кешью (Anacardium occidentale), масло макадамии (Macadamia intergrifolia), миндальное масло (Prunus amygdalus) или масло семени Arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
В варианте реализации клетка (рекомбинантная клетка) по изобретению или применяемая согласно изобретению представляет собой микробную клетку, такую как клетка, подходящая для ферментации, предпочтительно маслянистая микробная клетка, способная аккумулировать триацилглицериды до уровня по меньшей мере 25% в пересчете на массу. Предпочтительными процессами ферментации являются анаэробные процессы ферментации, как хорошо известные из уровня техники. Подходящие ферментирующие клетки, обычно микроорганизмы, способны ферментировать, т.е. превращать сахара, такие как глюкоза или мальтоза, прямо или косвенно, в желательные жирные кислоты. Примеры ферментирующих микроорганизмов включают грибковые организмы, такие как дрожжи. В данном списании дрожжи включают виды Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, виды Candida, виды Kluveromyces, виды Pichia, виды Hansenula, виды Trichoderma, Lipomyces starkey и предпочтительно Yarrowia lipolytica.
В дальнейшем аспекте настоящего изобретения раскрывается жирная кислота, продуцированная или полученная с применением способа по изобретению, из клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, B. juncea, G. max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению или растения, клетки растения, части растения или семени по изобретению. Предпочтительно жирная кислота представляет собой ДГК и/или ДПК. Жирная кислота может находиться в смеси жирных кислот, состав жирных кислот в которой является таким, как описано в настоящем документе, или смесь может быть обогащена таким образом, чтобы жирная кислота составляла по меньшей мере 40% или по меньшей мере 90% от содержания жирных кислот в смеси. В варианте реализации жирная кислота является неэтерифицированной. В качестве альтернативы жирная кислота этерифицирована с применением, например, метильной, этильной, пропильной или бутильной группы.
Дополнительно раскрывается жмых, полученный из семени по изобретению или полученный из растения по изобретению. Предпочтительный жмых включает, но не ограничиваясь этим, жмых Brassica napus, B. juncea, Camelina sativa или Glycine max. В варианте реализации жмых содержит экзогенный(е) полинуклеотид(ы) и/или генетические конструкции, как раскрыто в настоящем документе. В предпочтительном варианте реализации в жмыхе остается часть липида или масла, выработанного в семени, из которого получен жмых, но на низком уровне (например, менее чем 2 мас.%) после экстракции большей части липида или масла. Жмых может применяться в качестве корма для животных или в качестве ингредиента в производстве пищевых продуктов.
В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается композиция, содержащая одно или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, B. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению или жмыха по изобретению. В вариантах реализации композиция содержит носитель, подходящий для фармацевтического, пищевого или сельскохозяйственного применения, соединение для обработки семени, удобрение, другой пищевой продукт, или питательный ингредиент, или дополнительный белок или витамины.
Кроме того, раскрыты корма, косметика или химические вещества, содержащие одно или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, B. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению, жмыха по изобретению или композиции по изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ получения корма, включающий смешивание одного или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, B. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению, жмыха по изобретению или композиции по изобретению, по меньшей мере с еще одним питательным ингредиентом. Способ может включать стадии смешивания, термической обработки, выпечки, экструдирования, эмульгации или другой обработки фуража, или упаковки фуража, или анализа содержания липида или масла в фураже.
В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ лечения или предупреждения состояния, при котором ПНЖК, предпочтительно ДГК и/или ДПК, оказывают благоприятное воздействие, причем указанный способ включает введение субъекту одного или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, B. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобрете- 23 037817 нию, части растения по изобретению, семени по изобретению, жмыха по изобретению, композиции по изобретению или корма по изобретению. В предпочтительном варианте реализации ПНЖК вводят в форме фармацевтической композиции, содержащей этиловый эфир ПНЖК. Субъект может быть человеком или животным, кроме человека.
Примеры состояний, при которых ПНЖК оказывают благоприятное воздействие, включают, без ограничения, повышенные уровни триглицеридов в сыворотке, повышенные уровни холестерина в сыворотке, например, повышенные уровни ЛПНП холестерина, сердечную аритмию, ангиопластику, воспаление, астму, псориаз, остеопороз, камни в почках, СПИД, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, болезнь Крона, шизофрению, рак, плодный алкогольный синдром, синдром гиперактивности и дефицита внимания, муковисцидоз, фенилкетонурию, униполярную депрессию, агрессивную враждебность, адренолейкодистрофию, заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, диабет, ожирение, болезнь Альцгеймера, хроническое обструктивное заболевание легких, язвенный колит, рестеноз после ангиопластики, экзему, гипертонию, агрегацию тромбоцитов, желудочно-кишечное кровотечение, эндометриоз, предменструальный синдром, миалгический энцефаломиелит, хроническую усталость после вирусных инфекций или заболевание глаз.
Также раскрыто применение одного или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, B. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению, жмыха по изобретению, композиции по изобретению или корма по изобретению для производства лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, при котором ПНЖК, предпочтительно ДГК и/или ДПК, оказывают благоприятное воздействие.
Получение лекарственного средства может включать смешивание масла по изобретению с фармацевтически приемлемым носителем с целью лечения состояния, раскрытого в настоящем документе. Способ может включать, во-первых, очистку, и/или переэтерификацию, и/или фракционирование масла с целью повышения уровня ДГК и/или ДПК. В конкретном варианте реализации способ включает обработку липида или масла, например масла рапса, с целью превращения жирных кислот в масле в алкиловые эфиры, например метиловые или этиловые эфиры. Дальнейшая обработка, например, фракционирование или дистилляция, может применяться для обогащения липида или масла ДГК и/или ДПК. В предпочтительном варианте реализации лекарственное средство содержит этиловые эфиры ДГК и/или ДПК. В еще более предпочтительном варианте реализации уровень этиловых эфиров ДГК и/или ДПК в лекарственном средстве составляет от 30 до 50%. Лекарственное средство может дополнительно содержать этиловые эфиры ЭПК, например, от 30 до 50% или по меньшей мере 90% от общего содержания жирных кислот в лекарственном средстве. Такие лекарственные средства пригодны для введения субъектамлюдям или животным при лечении медицинских состояний, как раскрыто в настоящем документе.
В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ торговли семенем, включающий получение семени по изобретению и торговли полученным семенем с получением денежной выгоды.
В варианте реализации получение семени включает культивацию растений по изобретению и/или сбор урожая семени с растений.
В другом варианте реализации получение семени дополнительно включает помещение семени в емкость и/или хранение семени.
В дальнейшем варианте реализации получение семени дополнительно включает перевозку семени в другое место.
Еще в одном варианте реализации способ дополнительно включает перевозку семени в другое место после продажи семени.
В дальнейшем варианте реализации торговля осуществляется с использованием электронных средств, например компьютера.
Еще в одном аспекте: настоящего изобретения раскрывается способ получения бункеров с семенем, включающий:
а) валкование, рядковое компостирование и/или жатву наземных частей растений, содержащих семя по изобретению,
б) молотьбу и/или веяние частей растений, с отделением семени от остатка частей растения, и
в) просеивание и/или сортировку семени, отделенного на стадии б), и загрузку просеянного и/или сортированного семени в бункеры с получением таким образом бункеров с семенем.
В варианте реализации, если это уместно, липид или масло, предпочтительно масло из семян, по изобретению или пригодные в соответствии с изобретением, содержат такие уровни жира, как раскрыто в таблице в разделе Примеры, например семя 14 CT136-27-18-2 или CT136-27-18-19 из табл. 10 или масло семян из табл. 12, 20, 22, 23 или 24.
Любой вариант реализации в настоящем документе следует интерпретировать как применимый с соответствующими поправками к любому другому варианту, если конкретно не указано иное.
Контекст настоящего изобретения не должен ограничиваться конкретными вариантами, раскрытыми в настоящем документе, которые приведены только с целью иллюстрации. Функционально эквивалентные продукты, композиции и способы, очевидно, находятся в пределах контекста изобретения, рас- 24 037817 крытого в настоящем документе.
В настоящем документе, если конкретно не указано иное или из контекста очевидно не следует иное, ссылка на единственную стадию, композицию вещества, группу стадий или группу композиций вещества должна быть интерпретирована как включающая единственное и множественное число (т.е.
одна или более) таких стадий, композиций вещества, групп стадий или групп композиций вещества.
Изобретение дополнительно раскрыто посредством следующих неограничивающих примеров, со ссылкой на прилагаемые графические материалы.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Аэробные пути биосинтеза ДГК.
Фиг. 2. Карта участка вставки T-ДНК от левой до правой границ pJP3416-GA7. RB обозначает правую границу; LB, левая граница; TER, участок терминатора транскрипции/полиаденилирования; PRO, промотор; кодирующие участки показаны над стрелками, промоторы и терминаторы - под стрелками. Micpu-Δ6D, Δ6-десатураза Micromonas pusilla; Pyrco-Δ6E, Δ6-элонгаза Pyramimonas cordata; Pavsa-A5D, Δ5-десатураза Pavlova salina; Picpa-ω3D, ω3-десатураза Pichia pastoris; Pavsa-Δ4D, Δ4-десатураза P. salina; Lackl-Δ12D, Δ12-десатураза Lachancea kluyveri; Pyrco-Δ5E, Δ5-элонгаза Pyramimonas cordata. NOS обозначает участок терминатора транскрипции/полиаденилирования нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens; FP1, укороченный промотор напина Brassica napus; FAE1, промотор Arabidopsis thaliana FAE1; Lectin, участок терминатора транскрипции/полиаденилирования лектина Glycine max; Cnl1 и Cnl2 обозначают промотор или терминатор конлинина 1 или конлинина 2 Linum usitatissimum. УПМ обозначает участок прикрепления к матриксу Rb7 из Nicotiana tabacum.
Фиг. 3. Карта участка вставки T-ДНК от левой до правой границы pJP3404. Обозначения такие же, как на фиг. 2.
Фиг. 4. Содержание масла (мас./мас.) против содержания ДГК, как процент от общего содержания жирных кислот в липиде из трансгенных семян Arabidopsis thaliana.
Фиг. 5. Позиционный анализ распределения ЯМР на A) жире тунца и B) масле трансгенных семян ДГК Arabidopsis. Пики, обозначенные ДГК-альфа, представляют количество ДГК, присутствующей в положениях sn-1 и sn-2 ТАГ (без позиционного предпочтения это равнялось бы 66% об общей ДГК), тогда как пики, обозначенные ДГК-бета, представляют количество ДГК, присутствующей в положении sn-2 ТАГ (без предпочтения это равнялось бы 33% ДГК).
Фиг. 6. Анализ методом ЖХ-МС основных ДГК-содержащих разновидностей триацилглицеридов в трансгенных развивающихся (серые) и зрелых (черные) семенах A. thaliana. Число, следующее за ДГК, обозначает общее количество атомов углерода и общее количество двойных связей в двух других жирных кислотах. Таким образом, ДГК/34:1 может также быть обозначена как ТАГ 56:7 и т.п.
Фиг. 7. (A) Основная структура фитостерина с кольцом и нумерацией боковой цепи. (B) Химические структуры некоторых фитостеринов.
Фиг. 8. Филогенетическое дерево известных ЛФКАТ (ЛФААТ).
Фиг. 9. Различные ферменты обмена ацила, которые переносят жирные кислоты между ФХ, пулами КоА и пулами ТАГ. Адаптировано из Singh et al. (2005).
Фиг. 10. Уровни ДГК в общем содержании жирных кислот масла из семян, полученного из индивидуальных семян T2 от семян B. napus, трансформированных T-ДНК из конструкции GA7-modB. Каждая точка иллюстрирует уровень ДГК в индивидуальном семени, причем каждый столбик точек представляет семя T2 от индивидуального растения T1.
Ключ к перечню последовательностей
SEQ ID NO: 1 - последовательность нуклеотидов pJP3416-GA7.
SEQ ID NO: 2 - последовательность нуклеотидов pGA7-mod_B.
SEQ ID NO: 3 - ЭПК кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ12-десатуразы Lachancea kluyveri в растениях.
SEQ ID NO: 4 - Δ12-десатураза Lachancea kluyveri.
SEQ ID NO: 5 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии ω3-десатуразы Pichia pastoris в растениях.
SEQ ID NO: 6 - ω3-десатураза Pichia pastoris.
SEQ ID NO: 7 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ6-десатуразу Micromonas pusilla.
SEQ ID NO: 8 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ6-десатуразы Micromonas pusilla в растениях (версия 2).
SEQ ID NO: 9 - Δ6-десатураза Micromonas pusilla.
SEQ ID NO: 10 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ6-десатуразу Ostreococcus lucimarinus.
SEQ ID NO: 11 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ6-десатуразы Ostreococcus lucimarinus в растениях.
SEQ ID NO: 12 - Δ6-десатураза Ostreococcus lucimarinus.
SEQ ID NO: 13 - Δ6-десатураза Ostreococcus tauri.
SEQ ID NO: 14 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ6-элонгазу Pyramimonas cordata.
- 25 037817
SEQ ID NO: 15 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ6-элонгазы
Pyramimonas cordata в растениях (укороченная на 3'-конце и кодирующая функциональную элонгазу) (версия 1).
SEQ ID NO: 16 - Δ6-элонгаза Pyramimonas cordata.
SEQ ID NO: 17 - укороченная Δ6-элонгаза Pyramimonas cordata.
SEQ ID NO: 18 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ5-десатуразу Pavlova salina.
SEQ ID NO: 19 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ5-десатуразы Pavlova salina в растениях.
SEQ ID NO: 20 - Δ5-десатураза Pavlova salina.
SEQ ID NO: 21 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ5-десатуразу Pyramimonas cordata.
SEQ ID NO: 22 - Δ5-десатураза Pyramimonas cordata.
SEQ ID NO: 23 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ5-элонгазу Pyramimonas cordata.
SEQ ID NO: 24 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ5-элонгазы Pyramimonas cordata в растениях.
SEQ ID NO: 25 - Δ5-элонгаза Pyramimonas cordata.
SEQ ID NO: 26 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ4-десатуразу Pavlova salina.
SEQ ID NO: 27 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ4-десатуразы Pavlova salina в растениях.
SEQ ID NO: 28 - Δ4-десатураза Pavlova salina.
SEQ ID NO: 29 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ9-элонгазу Isochrysis galbana.
SEQ ID NO: 30 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ9-элонгазы Emiliania huxleyi в растениях.
SEQ ID NO 32 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ9-элонгазу Pavlova pinguis.
SEQ ID NO 33 - Δ9-элонгаза Pavlova pinguis.
SEQ ID NO 34 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ9-элонгазу Pavlova salina.
SEQ ID NO 35 - Δ9-элонгаза Pavlova salina.
SEQ ID NO 36 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ8-десатуразу Pavlova salina.
SEQ ID NO 37 - Δ8-десатураза Pavlova salina.
SEQ ID NO 38 - вирусный супрессор V2.
SEQ ID NO 39 - открытая рамка считывания, кодирующая вирусный супрессор V2.
SEQ ID NO 40 - ЛФКАТ2. Arabidopsis thaliana.
SEQ ID NO 41 - ЛФКАТ Limnanthes alba.
SEQ ID NO 42 - ЛФКАТ Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID NO 43 - ЛФКАТ Micromonas pusilla.
SEQ ID NO 44 - ЛФКАТ Mortierella alpina.
SEQ ID NO 45 - ЛФКАТ Braccisa napus.
SEQ ID NO 46 - ЛФКАТ Brassica napus.
SEQ ID NO 47 - ω3 десатураза Phytophthora infestans.
SEQ ID NO 48 - ω3 десатураза Thalassiosira pseudonana.
SEQ ID NO 49 - ω3 десатураза Pythium irregulare.
SEQ ID NO: 50-58 - Олигонуклеотидные праймеры/зонды.
Подробное описание сущности изобретения
Общие методы и определения.
Если конкретно не определенно иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, следует понимать, как имеющие такое же значение, как обычно придает им средний специалист в данной области (например, в культивировании клеток, молекулярной генетике, синтезе жирных кислот, трансгенных растениях, рекомбинантных клетках, химии белка и биохимии).
Если не указано иное, белок, культура клеток и иммунологические методы, используемые в настоящем изобретении, представляют собой стандартные методики, хорошо известные специалистам из уровня техники. Такие методики описаны и объяснены в литературных источниках, например, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (редактор), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (редакторы), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 и 1996), F.M. Ausubel et al. (редакторы), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все издания до сегодняшнего дня), Ed Harlow and David Lane (редакторы), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988) и J.E. Coligan et al. (редакторы), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая все издания до сегодняшнего дня).
Термин и/или, например X и/или Y, следует понимать как подразумевающий любой из X и Y или X или Y и следует интерпретировать как явно поддерживающий оба значения или любое из значе- 26 037817 ний.
В настоящем документе термин около, если только не указано противоположное, подразумевает ±10%, более предпочтительно ±5%, более предпочтительно ±1% от приведенного значения.
В настоящем документе слово включают или вариации, например включает или включающий, следует понимать как обозначающие включение заявленного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий.
Некоторые определения.
В настоящем документе термины экстрагированный растительный липид и выделенный растительный липид обозначают липидную композицию, которая извлечена, например, путем измельчения из растения или его части, такой как семя. Экстрагированный липид может представлять собой относительно неочищенную композицию, полученную, например, путем измельчения семени растения, или в большей степени очищенную композицию, из которой большинство, если не все из одного или более или каждого из воды, нуклеиновых кислот, белков и углеводов, происходящих из растительного материала, удалены. Ниже раскрыты примеры способов очистки. В варианте реализации экстрагированный или выделенный растительный липид содержит по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, или по меньшей мере около 95% (мас./мас.) липида в композиции. Липид может быть твердым или жидким при комнатной температуре, если он представляет собой жидкость, то называется маслом. В варианте реализации экстрагированный липид по изобретению не смешивается с другим липидом, например, ДГК и/или ДПК, продуцированной другим источником (например, ДГК из рыбьего жира). В варианте реализации после экстракции одно или более или все из соотношений олеиновая кислота:ДГК и/или ДПК, пальмитиновая кислота:ДГК и/или ДПК, линолевая кислота:ДГК и/или ДПК, и общие ω6 жирные кислоты:общие ω3 жирные кислоты в существенной мере не изменяются (например, не более чем 10 или 5% изменений) по сравнению с соотношением в интактном семени или клетке. В другом варианте реализации экстрагированный растительный липид не обрабатывается процедурой, такой как гидрогенизация или фракционирование, которая может изменить одно или более или все из соотношений олеиновая кислота:ДГК и/или ДПК, пальмитиновая кислота:ДГК и/или ДПК, линолевая кислота:ДГК и/или ДПК и общие ω6 жирные кислоты:общие ω3 жирные кислоты по сравнению с соотношением в интактном семени или клетке. Если экстрагированный растительный липид по изобретению содержится в масле, масло может дополнительно содержать молекулы, не являющиеся жирными кислотами, например стеролы.
В настоящем документе термины экстрагированное растительное масло и выделенное растительное масло обозначают вещество или композицию, содержащую экстрагированный растительный липид или выделенный растительный липид, которая является жидкой при комнатной температуре. Масло получают из растения или его части, например семени. Экстрагированное или выделенное масло может представлять собой относительно неочищенную композицию, полученную, например, путем измельчения семени растения, или в большей степени очищенную композицию, из которой большинство, если не все, из одного или более или каждого из воды, нуклеиновых кислот, белков и углеводов, происходящих из растительного материала, удалены. Композиция может содержать другие компоненты, которые могут быть липидными или нелипидными. В варианте реализации масляная композиция содержит по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90% или по меньшей мере около 95% (мас./мас.) экстрагированного растительного липида. В варианте реализации экстрагированное масло по изобретению не смешивается с другим маслом, таким как ДГК и/или ДПК, продуцированная другим источником (например, ДГК из рыбьего жира). В варианте реализации после экстракции одно или более или все из соотношений олеиновая кислота:ДГК и/или ДПК, пальмитиновая кислота:ДГК и/или ДПК, линолевая кислота:ДГК и/или ДПК и общие ω6 жирные кислоты:общие ω3 жирные кислоты существенно не изменяются (например, не более чем 10 или 5% изменений) по сравнению с соотношением в интактном семени или клетке. В другом варианте реализации экстрагированное масло растения не обрабатывают процедурой, такой как гидрогенизация или фракционирование, которая может изменять одно или более или все из соотношений олеиновая кислота:ДГК и/или ДПК, пальмитиновая кислота:ДГК и/или ДПК, линолевая кислота:ДГК и/или ДПК и общие ω6 жирные кислоты:общие ω 3 жирные кислоты по сравнению с соотношением в интактном семени или клетке. Экстрагированное растительное масло по изобретению может содержать молекулы, не являющиеся жирными кислотами, например стеролы.
В данном описании такие термины, как экстрагированный микробный липид или экстрагированное микробное масло, имеют значение, аналогичное соответствующим терминам экстрагированный растительный липид и экстрагированное растительное масло соответственно, причем основное различие состоит в источнике липида или масла.
В настоящем документе масло представляет собой композицию, которая содержит в основном липид и является жидкой при комнатной температуре. Например, масло по изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере
- 27 037817 мас.% липида. Обычно очищенное масло содержит по меньшей мере 90 мас.% триацилглицеридов (ТАГ) от содержания липида в масле. Незначительные компоненты масла, такие как диацилглицериды (ДАГ), свободные жирные кислоты (СЖК), фосфолипид и стеролы, могут присутствовать, как раскрыто в настоящем документе.
В настоящем документе термин жирная кислота обозначает карбоновую кислоту (или органическую кислоту), часто с длинным алифатическим хвостом, насыщенным или ненасыщенным. Обычно жирные кислоты содержат цепь углерод-углеродных связей длиной по меньшей мере 8 атомов углерода, более предпочтительно длиной по меньшей мере 12 атомов углерода. Предпочтительные жирные кислоты по изобретению содержат углеродные цепи длиной 18-22 атомов углерода (жирные кислоты C18, C20, C22), более предпочтительно 20-22 атома углерода (C20, C22) и наиболее предпочтительно 22 атома углерода (C22). Большинство встречающихся в природе жирных кислот содержит четное количество атомов углерода, поскольку в их биосинтезе принимает участие ацетат, содержащий два атома углерода. Жирные кислоты могут быть в свободном состоянии (неэтерифицированные) или в этерифицированной форме, например, как часть триглицерида, диацилглицерида, моноацилглицерида, связи с ацил-КоА (тиоэфир) или другой формы связи. Жирная кислота может быть этерифицированной как фосфолипид, например, формы фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерида, фосфатиилинозитола или дифосфатидилглицерида. В варианте реализации жирная кислота этерифицирована метильной или этильной группой, например метил или этиловый эфир ПНЖК C20 или C22. Предпочтительными жирными кислотами являются метиловые или этиловые эфиры ЭПК, ДПК или ДГК или смеси ЭПК и ДГК или ЭПК, ДПК и ДГК или ЭПК и ДПК.
Насыщенные жирные кислоты не содержат двойных связей или других функциональных групп вдоль цепи. Термин насыщенный обозначает водород, с тем, что все атомы углерода (кроме группы карбоновой кислоты [-COOH]) содержат максимально возможное количество водорода. Другими словами, омега (ω) конец содержит три атома водорода (CH3-), и каждый атом углерода в пределах цепи содержит два атома водорода (-CH2-).
Ненасыщенные жирные кислоты по форме сходны с насыщенными жирными кислотами, за исключением того, что одна или более алкеновых функциональных групп присутствуют вдоль цепи, причем каждый алкен заменяет одинарную связь -CH2-CH2- части цепи двойной связью -CH=CH- (т.е. углерод присоединен двойной связью к другому атому углерода). Два следующих атома углерода в цепи, которые присоединены к каждой из сторон двойной связи, могут присутствовать в цис- или трансконфигурации, предпочтительно в цис-конфигурации. В варианте реализации состав жирных кислот липида или масла по изобретению включает менее чем 1% жирных кислот, содержащих двойные углеродуглеродные связи в транс-конфигурации (транс-жирные кислоты).
В настоящем документе термин мононенасыщенная жирная кислота обозначает жирную кислоту, которая содержит по меньшей мере 12 атомов углерода в углеродной цепи и только одну алкеновую группу (двойная углерод-углеродная связь) в цепи. В настоящем документе термины полиненасыщенная жирная кислота или ПНЖК обозначают жирную кислоту, которая содержит по меньшей мере 12 атомов углерода в углеродной цепи и по меньшей мере две алкеновые группы (двойные углеродуглеродные связи).
В настоящем документе термины длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота и ДЦ-ПНЖК обозначают жирную кислоту, которая содержит по меньшей мере 20 атомов углерода в углеродной цепи и по меньшей мере две двойные углерод-углеродныее связи и, таким образом, включают ОДЦ-ПНЖК. В настоящем документе термины полиненасыщенная жирная кислота с очень длинной цепью и О ДЦ-ПНЖК обозначают жирную кислоту, которая содержит по меньшей мере 22 атома углерода в углеродной цепи и по меньшей мере три двойные углерод-углеродные связи. Обычно количество атомов углерода в углеродной цепи жирных кислот относится к неразветвленной углеродной цепи. Если углеродная цепь разветвлена, количество атомов углерода исключает атомы углерода боковых групп. В одном варианте реализации длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота представляет собой ω3 жирную кислоту, т.е. содержит десатурацию (двойную углерод-углеродную связь) в положении третьей углерод-углеродной связи от метильного конца жирной кислоты. В другом варианте реализации длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота представляет собой ω6 жирную кислоту, т.е. содержит десатурацию (двойную углерод-углеродную связь) в положении шестой углеродуглеродной связи от метильного конца жирной кислоты. В другом варианте реализации длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота выбрана из группы, состоящей из арахидоновой кислоты (АРК, 20:4Δ5,8,11,14; ω6), эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК, 20:4Δ8,11,14,17, ω3), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК, 20:5Δ5,8,11,14,17; ω3), докозапентаеновой кислоты (ДПК, 22:5Δ7,10,13,16,19, ω3) или докозагексаеновой кислоты (ДГК, 22:6Δ4,7,10,13,16,19, ω3). Кроме того, ДЦ-ПНЖК могут представлять собой дигомо-γлинолевую кислоту (ДГЛК) или эйкозатриеновую кислоту (ЭТрК, 20:3Δ11,14,17, ω3). Будет очевидно, что ДЦ-ПНЖК, полученная в соответствии с изобретением, может быть смесью любых или всех упомянутых выше соединений и может содержать другую ДЦ-ПНЖК или производные любой из перечисленных ДЦПНЖК. В предпочтительном варианте реализации ω3 жирные кислоты представляют собой по меньшей
- 28 037817 мере ДГК и/или ДПК, предпочтительно ДПК и ДГК, или ЭПК, ДПК и ДГК, или ЭПК и ДПК. После экстракции от растения ДГК присутствует в липиде или масле на уровне 20,1-30% или от 20,1 до 35%, предпочтительно от 30 до 35% от состава общих жирных кислот. Например, ДГК присутствует на уровне от 30,1 до 35% от состава общих жирных кислот. В варианте реализации уровень ДГК превышает уровень ДПК, более предпочтительно, превышает уровень каждой из ЭПК и ДПК, наиболее предпочтительно, превышает суммарный уровень ЭПК и ДПК. В альтернативном варианте реализации ДПК присутствует на уровне от около 7 до 30 или 35%, и ДГК присутствует или отсутствует или, если она присутствует, присутствует на уровне менее чем 2,0%, предпочтительно менее чем 1,0%, более предпочтительно менее чем 0,5% от общего состава жирных кислот в композиции и наиболее предпочтительно отсутствует или не поддается обнаружению. Это может обеспечиваться отсутствием активности Δ4-десатуразы в клетке. В варианте реализации уровень ДПК превышает ЭПК, более предпочтительно превышает уровень каждой из ЭПК и ДГК, наиболее предпочтительно превышает суммарный уровень ЭПК и ДГК. В данном варианте реализации ДГК может отсутствовать или, если она присутствует, то присутствует на уровне менее чем 0,5% от состава общих жирных кислот.
Дополнительно, в настоящем документе термины длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота (ДЦ-ПНЖК) и полиненасыщенная жирная кислота с очень длинной цепью (ОДЦ-ПНЖК) обозначают жирную кислоту, находящуюся в свободном состоянии (неэтерифицированную) или в этерифицированной форме, например, как часть триглицерида (триглицерид), диацилглицерида, моноацилглицерида, связи с ацил-КоА (тиоэфир) или другой формы связи. В триглицериде, ДЦ-ПНЖК или ОДЦ-ПНЖК, такие как ДГК или ДПК, могут быть этерифицированы в положениях sn-1/3 или sn-2 или триглицерид может содержать две или три ацильные группы, выбранные из ацильных групп ДЦ-ПНЖК и ОДЦ-ПНЖК. Например, триглицерид может содержать ДГК или ДПК как в sn-1, так и в sn-3 положениях. Жирная кислота может быть этерифицированной как фосфолипид, например формы фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерида, фосфатидилинозитола или дифосфатидилглицерида. Поэтому ДЦ-ПНЖК может присутствовать как смесь форм в липиде клетки или очищенного масла или липиде, экстрагированном из клеток, тканей или организмов. В предпочтительных вариантах реализации изобретения раскрывается масло, содержащее по меньшей мере 75% или по меньшей мере 85% триацилглицеридов, причем остаток представляет собой другие формы липида, такие как упомянутые выше, в которых присутствуют по меньшей мере указанные триацилглицериды, содержащие ДЦ-ПНЖК. Впоследствии масло может быть дополнительно очищено или обработано, например, гидролизом с сильным основанием с целью высвобождения свободных жирных кислот или переэтерификацией, дистилляцией и т.п.
В настоящем документе выражение общие ω6 жирные кислоты, или общее содержание ω6 жирных кислот, или подобное обозначает сумму всех ω6 жирных кислот, этерифицированных и неэтерифицированных, в экстрагированном липиде, масле, рекомбинантной клетке, части растения или семени, как определяется контекстом, выраженную как процент от общего содержания жирных кислот. Указанные ω6 жирных кислот включают (если они присутствуют) ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК и ω6-ДЦК, но исключают любые ω 3 жирные кислоты и мононенасыщенные жирные кислоты. Все ω6 жирные кислоты, присутствующие в растениях, семенах, липиде или маслах по изобретению, входят в класс полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК).
В настоящем документе выражение новые ω6 жирные кислоты, или содержание новых ω6 жирных кислот, или подобное обозначает сумму всех ω6 жирных кислот, за исключением ЛК, этерифицированных и неэтерифицированных, в экстрагированном липиде, масле, рекомбинантной клетке, части растения или семени, как определяется контекстом, выраженную как процент от общего содержания жирных кислот. Такие новые ω6 жирные кислоты представляют собой жирные кислоты, продуцированные в клетках, растениях, частях растения и семенах по изобретению посредством экспрессии генетических конструкций (экзогенные полинуклеотиды), введенных в клетки, и включают (если они присутствуют) ГЛК, ДГЛК, AFK, ЭДК и ω6-ДЦК, но исключают ЛК и любые ω3 жирные кислоты и мононенасыщенные жирные кислоты. Характерное общее содержание ω6 жирных кислот и содержание новых ω6 жирных кислот определятся по превращению жирных кислот в образце в МЭЖК и результатам анализа ГХ, как раскрыто в Примере 1.
В настоящем документе выражение общие ω3 жирные кислоты, или общее содержание ω3 жирных кислот, или подобное обозначает сумму всех ω3 жирных кислот, этерифицированных и неэтерифицированных, в экстрагированном липиде, масле, рекомбинантной клетке, части растения или семени, как определяется контекстом, выраженную как процент от общего содержания жирных кислот. Такие ω 3 жирных кислот включают (если они присутствуют) АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК и исключают любые ω6 жирные кислоты и мононенасыщенные жирные кислоты. Все ω 3 жирные кислоты, присутствующие в растениях, семенах, липиде или маслах по изобретению, входят в класс полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК).
В настоящем документе выражение новые ω3 жирные кислоты, или содержание новых ω3 жирных кислот, или подобное обозначает сумму всех ω3 жирных кислот, за исключением АЛК, этерифици- 29 037817 рованных и неэтерифицированных, в экстрагированном липиде, масле, рекомбинантной клетке, части растения или семени, как определяется контекстом, выраженную как процент от общего содержания жирных кислот. Такие новые ω3 жирные кислоты представляют собой ω3 жирные кислоты, продуцированные в клетках, растениях, частях растений и семенах по изобретению посредством экспрессии генетических конструкций (экзогенные полинуклеотиды), введенных в клетки, и включают (если они присутствуют) СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК, но исключают АЛК и любые ω6 жирные кислоты и мононенасыщенные жирные кислоты. Характерное общее содержание ω3 жирных кислот и содержание новых ω3 жирных кислот определяются по превращению жирных кислот в образце в МЭЖК и результатам анализа ГХ, как описано в Примере 1.
Как будет понятно квалифицированному специалисту, термин получение части растения в качестве стадии в способе по изобретению может включать получение одной или более частей растения для использования в способе. Получение части растения включает сбор урожая части растения с растения, например, с помощью комбайна или приобретение части растения или получение части растения от поставщика. В другом примере получение части растения может быть приобретением растения у кого-либо другого, кто собрал урожай части растения.
Белки десатураза, элонгаза и ацилтрансфераза и гены, кодирующие их, которые могут применяться в соответствии с изобретением, представляют собой любые из известных в уровне техники или их гомологи или производные. Примеры таких генов и размер кодируемых белков приведены в табл. 1. Ферменты десатуразы, для которых продемонстрировано участие в биосинтезе ДЦ-ПНЖК, все принадлежат к группе так называемых фронт-энд десатураз. Предпочтительными белками или комбинациями белков являются кодируемые генетическими конструкциями, предложенными в данном описании как SEQ ID NO: 1 и 2.
Таблица 1. Клонированные гены, принимающие участие в биосинтезе ДЦ-ПНЖК.
Фермент Тип организма Вид Номера доступа Размер белка (ак) Ссылки
А4-десатураза Простейшие Euglena gracilis AY278558 541 Meyer et al., 2003
Водоросли Pavlova lutherii AY332747 445 Tonon et al., 2003
Isochrysis galbana AAV33631 433 Pereira et al., 2004b
Pavlova salina AAY15136 447 Zhou et al., 2007
Траустохитри диевые Thrausfochytrium aureuni AAN75707 AAN75708 AAN75709 AAN75710 515 Отсутствуют
вид Thraustochytrium ATCC21685 AAM0968 8 519 Qiu et al., 2001
А5-десатураза Млекопитающ ие Homo sapiens AF199596 444 Choetal., 1999b Leonard et al., 2000b
Нематода Caenorhabditis elegans AFI 1440, NM 06935 0 447 Michaelson et al., 1998b; Watts and Browse, 1999b
Грибы Mortierella alpina AF067654 446 Michaelson et al., 1998a; Knutzon et al., 1998
- 30 037817
Pythium irregulare AF419297 456 Hong et al., 2002a
Dictyostelium discoideum AB022097 467 Saito et al., 2000
Saprolegnia diclina 470 WO02081668
Диатомовые Phaeodactylum tricornutum AY082392 469 Domergue et al., 2002
Водоросли вид Thraustochytrium AF489588 439 Qiu et al., 2001
Thraustochytrium aureum 439 WO02081668
Isochrysis galbana 442 WO02081668
Мох Marchantia polymorpha AY583465 484 Kajikawa et al., 2004
Δό-десатураза Млекопитающ ие Homo sapiens NM_01340 2 444 Cho et al., 1999a; Leonard et al., 2000
Mus musculus NM01969 9 444 Cho et al., 1999a
Нематода Caenorhabditis elegans Z70271 443 Napier et al., 1998
Растения Borago officinales U79010 448 Sayanova et al., 1997
Echium AY055117 AY055118 Garcia-Maroto et al., 2002
Primula vialii AY234127 453 Sayanova et al., 2003
Anemone leveillei AF536525 446 Whitney et al., 2003
Мхи Ceratodon purpureus AJ250735 520 Sperling et al., 2000
Marchantia polymorpha AY583463 481 Kajikawa et al., 2004
Physcomitrella patens CAA11033 525 Girke et al., 1998
Грибы Mortierella alpina AFI 10510 AB020032 457 Huang et al., 1999; Sakuradani et al., 1999
Pythium irregulare AF419296 459 Hong et al., 2002a
Mucor circinelloides AB052086 467 NCBI*
вид Rhizopus AY320288 458 Zhang et al., 2004
Saprolegnia diclina 453 WO02081668
Диатомовые Phaedactylum tricornutum AY082393 477 Domergue et al., 2002
Бактерии Synechocystis L11421 359 Reddy et al., 1993
Водоросли Thraus tochytrium aureum 456 WO02081668
Бифункциона льная Δ5/Δ6десатураза Рыба Danio rerio AF309556 444 Hastings et al., 2001
С20 Δ8десатураза Водоросли Euglena gracilis AF139720 419 Wallis and Browse, 1999
Растения Borago officinales AAG43277 446 Sperling et al., 2001
А6-элонгаза Нематода Caenorhabditis elegans NM 06928 8 288 Beaudoin et al., 2000
Мхи Physcomitrella patens AF428243 290 Zank et al., 2002
Marchantia polymorpha AY583464 290 Kajikawa et al., 2004
Грибы Mortierella alpina AF206662 318 Parker-Barnes et al., 2000
Водоросли Pavlova lutheri** 501 WO 03078639
- 31 037817
Thraustochytrium AX951565 271 WO 03093482
вид Thraustochytrium * * AX214454 271 WO 0159128
ПНЖКэлонгаза Млекопитающ ие Homo sapiens AF231981 299 Leonard et al., 2000b; Leonard et al., 2002
Rattus norvegicus AB071985 299 Inagaki et al., 2002
Rattus norvegicus** AB071986 267 Inagaki et al., 2002
Mus musculus AFI70907 279 Tvrdik et al., 2000
Mus musculus AF170908 292 Tvrdik et al., 2000
Рыба Danio rerio AF532782 291 (282) Agaba et al., 2004
Danio rerio** NM 19953 2 266 Lo et al., 2003
Червь Caenorhabditis elegans Z68749 309 Abbott etal., 1998 Beaudoin et al., 2000
Водоросли Thraustochytrium aureum** AX464802 272 WO 0208401-A2
Pavlova lutheri** 320 WO 03078639
А9-элонгаза Водоросли Isochrysis galbana AF390174 263 Qi et al., 2002
Euglena gracilis 258 WO 08/128241
Д5-элонгаза Водоросли Ostreococcus tauri AAV67798 300 Meyer et al., 2004
Pyramimonas cordata 268 WO 2010/057246
вид Pavlova CCMP459 AAV33630 277 Pereira et al., 2004b
Pavlova salina AAY15135 302 Robert et al., 2009
Диатомовые Thalassiosira pseudonana AAV67800 358 Meyer et al., 2004
Рыба Oncorhynchus mykiss CAM55862 295 WO 06/008099
Мох Marchantia polymorpha BAE71129 348 Kajikawa et al., 2006
* http://www.ncbi.nlm.nih.gov/;
** Функция не доказана/не продемонстрирована.
В настоящем документе термин фронт-энд десатураза обозначает члена класса ферментов, которые вводят двойную связь между карбоксильной группой и уже существующей ненасыщенной частью ацильной цепи липидов, которые структурно характеризуются присутствием домена N-концевого цитохрома b5, наряду с типичным доменом десатуразы жирных кислот, содержащим три в высокой степени консервативных гистидиновых бокса (Napier et al., 1997).
Активность любой из элонгаз или десатураз для применения в соответствии с изобретением может быть протестирована посредством экспрессии гена, кодирующего фермент, в клетке, такой как, например, дрожжевая клетка, растительная клетка или предпочтительно в соматических эмбрионах или трансгенных растениях, и определения того, обладает ли клетка, эмбрион или растение повышенной способностью к выработке ДЦ-ПНЖК по сравнению со сравнимой клеткой, эмбрионом или растением, в котором фермент не экспрессируется.
В одном варианте реализации одна или более десатураз и/или элонгаз для применения в соответствии с изобретением могут быть получены из микроводоросли и очищены, т.е. иметь последовательность аминокислот, идентичную полипептиду, который может быть получен из микроводоросли и очищен.
Хотя некоторые ферменты конкретно раскрываются в настоящем документе как бифункциональные, отсутствие такого термина необязательно подразумевает, что конкретный фермент не обладает другой активностью, кроме конкретно раскрытой.
Десатуразы.
В настоящем документе термин десатураза обозначает фермент, который способен вводить двойную углерод-углеродную связь в ацильную группу жирнокислотного субстрата, который обычно находится в этерифицированной форме, например эфиры ацил-КоА. Ацильная группа может быть этерифицирована до фосфолипида, например фосфатидилхолин (ФХ), или до белка-носителя ацила (БНА), или в предпочтительном варианте реализации до КоА. Десатуразы в общем могут быть разделены на три группы соответственно. В одном варианте реализации десатураза представляет собой фронт-энд десатуразу.
В настоящем документе Δ4-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 4-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Δ4-десатураза по меньшей мере способна трансформировать ДПК в ДГК. Предпочтительно Δ4-десатураза способна преобразовывать ДПК-КоА в ДГК-КоА, т.е. она является ацил-КоА десатуразой. В варианте реализации Δ4-десатураза способна преобразовывать ДПК, этерифицированную в положении sn-2 ФХ в ДГК-ФХ. Предпочтительно Δ4-десатураза обладает более высокой активностью в отношении ДПК-КоА, чем в отношении ДПК-ФХ. Стадия десатурации с образованием ДГК из ДПК катализируется Δ4-десаmуразой в организмах, не отно
- 32 037817 сящихся к млекопитающим, и ген, кодирующий данный фермент, выделен от вида пресноводных простейших Euglena gracilis и морских видов Thraustochytrium (Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003). В одном варианте реализации Δ4-десатураза содержит последовательность аминокислот, соответствующую представленной в SEQ ID NO: 28 или Δ4-десатуразе вида Thraustochytrium, ее биологически активному фрагменту, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 28. В варианте реализации растение, часть растения (такая как семя) или клетка по изобретению или применяемые согласно изобретению, которые продуцируют высокие уровни ДПК, например ДПК составляет от 5 до 35% от общего содержания экстрагируемых жирных кислот, не содержат гена, кодирующего функциональную Δ4-десатуразу.
В настоящем документе Δ5-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 5-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. В варианте реализации жирнокислотный субстрат представляет собой ЭТК, и фермент продуцирует ЭПК. Предпочтительно Δ5-десатураза способна трансформировать ЭТК-КоА в ЭПК-КоА, т.е. является ацил-КоА десатуразой. В варианте реализации Δ5-десатураза способна трансформировать ЭТК, этерифицированную в положении sn-2 ФХ. Предпочтительно Δ5-десатураза обладает более высокой активностью в отношении ЭТК-КоА, чем в отношении ЭТК-ФХ. Примеры Δ5-десатураз приведены в Ruiz-Lopez et al. (2012) и Petrie et al. (2010a), а также в табл. 1 настоящего документа. В одном варианте реализации последовательность аминокислот Δ5-десатуразы соответствует представленной в SEQ ID NO: 20, ее биологически активному фрагменту или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO: 20. В другом варианте реализации последовательность аминокислот Δ5-десатуразы соответствует представленной SEQ ID NO: 22, ее биологически активному фрагменту, или последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 53% идентична SEQ ID NO: 22. В другом варианте реализации Δ5-десатураза получена из вида Thraustochytrium или Emiliania huxleyi.
В настоящем документе Δ6-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 6-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. В варианте реализации жирнокислотный субстрат представляет собой АЛК, и фермент продуцирует СДК. Предпочтительно Δ6-десатураза способна преобразовывать АЛК-КоА в СДК-КоА, т.е. является ацил-КоА десатуразой. В варианте реализации Δ6-десатураза способна преобразовывать АЛК, этерифицированную в положении sn-2 ФХ. Предпочтительно Δ6-десатураза обладает более высокой активностью в отношении АЛК-КоА, чем в отношении АЛК-ФХ. Кроме того, Δ6-десатураза может обладать активностью Δ5-десатуразы и при этом носить название Δ5/Δ6 бифункциональной десатуразы при условии, что она обладает более высокой активностью Δ6-десатуразы в отношении АЛК, чем активностью Δ5-десатуразы в отношении ЭТК. Примеры Δ6-десатураз приведены в Ruiz-Lopez et al. (2012) и Petrie et al. (2010a), a также в табл. 1 настоящего документа. Предпочтительные Δ6-десатуразы получены из Micromonas pusilla, Pythium irregulare или Ostreococcus taurii.
В варианте реализации Δ6-десатураза дополнительно характеризуется наличием по меньшей мере двух, предпочтительно всех трех и предпочтительно в растительной клетке, из следующего: i) более высокая активность Δ6-десатуразы в отношении α-линоленовой кислоты (АЛК, 18:3Δ9,12,15, ω3), чем в отношении линолевой кислоты (ЛК, 18:2Δ9,12, ω6) в качестве жирнокислотного субстрата; ii) более высокая активность Δ6-десатуразы в отношении АЛК-КоА в качестве жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной в положении sn-2 ФХ, в качестве жирнокислотного субстрата; и iii) активность Δ8-десатуразы в отношении ЭТрК. Примеры таких Δ6-десатураз приведены в табл. 2.
Таблица 2. Десатуразы, которые продемонстрировали активность на субстрате ацил-КоА.
Фермент Тип организма Вид Номера доступа Размер белка (ак) Ссылки
А6-десатураза Водоросли Manfoniella squamata CAQ30479 449 Hoffmann et al., 2008
Ostreococcus tauri AAW70159 456 Domergue et al.,
- 33 037817
2005
Micromonas pusilia EEH58637 Petrie et al., 2010a (SEQ ID NO: 13)
А5-десатураза Водоросли Mantoniella squamata CAQ30478 482 Hoffmann et al., 2008
Растение Anemone leveillei Отсутствует Sayanova et al., 2007
ω3-десатураза Грибы Pythium aphanidermatum FW362186.1 359 Xueet al., 2012; WO2008/054565
Грибы (оомицет) Phytophthora sojae FW362214.1 363 Xue et al., 2012; WO2008/054565
Грибы (оомицет) Phytophthora rumorum FW362213.1 361 Xue et al., 2012; WO2008/054565
В варианте реализации Δ6-десатураза обладает более высокой активностью в отношении ω3 субстрата, чем в отношении соответствующего ω6 субстрата, и обладает активностью в отношении АЛК с образованием октадекатетраеновой кислоты (стеаридоновая кислота, СДК, 18:4Δ6,9,12,15, ω3), с эффективностью по меньшей мере 30%, более прецпочтительно по меньшей мере 40% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%, при экспрессии из экзогенного полинуклеотида в рекомбинантной клетке, такой как растительная клетка, или по меньшей мере 35% при экспрессии в дрожжевой клетке. В одном варианте реализации Δ6-десатураза обладает более высокой активностью, например, по меньшей мере около в 2 раза более высокой активностью Δ6-десатуразы в отношении АЛК, чем в отношении ЛК как жирнокислотного субстрата. В другом варианте реализации Δ6-десатураза обладает более высокой активностью, например, по меньшей мере около в 5 раз более высокой активностью Δ6-десатуразы или по меньшей мере в 10 раз более высокой активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной в положении sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата. В другом варианте реализации, Δ6-десатураза обладает активностью в отношении обоих жирнокислотных субстратов - АЛК-КоА и АЛК, присоединенных в положении sn-2 ФХ.
В одном варианте реализации Δ6-десатураза не обладает обнаружимой активностью Δ5-десатуразы в отношении ЭТК. В другом варианте реализации последовательность аминокислот Δ6-десатуразы представлена SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, их биологически активным фрагментом, или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 77% идентичной SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13. В другом варианте реализации последовательность аминокислот Δ6-десатуразы представлена SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, их биологически активным фрагментом или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 67% идентичной одной или обеим из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13. Кроме того, Δ6-десатураза может обладать активностью Δ8-десатуразы.
В настоящем документе Δ8-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 8-ой углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Δ8-Десатураза по меньшей мере способна превращать ЭТрК в ЭТК. Предпочтительно Δ8-десатураза способна преобразовывать ЭТрК-КоА в ЭТК-КоА, т.е. является ацил-КоА десатуразой. В варианте реализации Δ8-десатураза способна преобразовывать ЭТрК, этерифицированную в положении sn-2 ФХ. Предпочтительно Δ8-десатураза обладает более высокой активностью в отношении ЭТрК-КоА, чем в отношении ЭТрК-ФХ. Кроме того, Δ8-десатураза может обладать активностью Δ8-десатуразы и при этом носить название Δ6/Δ8 бифункциональной десатуразы при условии, что она обладает более высокой активностью Δ8-десатуразы в отношении ЭТрК, чем активностью Δ6-десатуразы в отношении АЛК. Примеры Δ8-десатураз приведены в табл. 1. В одном варианте реализации последовательность аминокислот Δ8-десатуразы соответствует представленной SEQ ID NO: 37, ее биологически активным фрагментом или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO: 37.
В настоящем документе ω3-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 3-й углерод-углеродной связи от метилового конца жирнокислотного субстрата. Таким образом, ω3-десатураза может превращать ЛК в АЛК и ГЛК в СДК (все C18 жирные кислоты) или ДГЛК в ЭТК и/или АРК в ЭПК (C20 жирные кислоты). Некоторые ω3-десатуразы (группа I) обладают активностью только на C18 субстратах, таких как растительные и цианобактериальные ω3-десатуразы. Такие ω3-десатуразы также являются Δ 15-десатуразами. Другие ω3-десатуразы проявляют активность на субстратах C20 без активности (группа II) или с некоторой активностью (группа III) на субстратах C18. Такие ω3-десатуразы также являются Δ 17-десатуразами. Предпочтительными ω3-десатуразами является группа III типа, которая превращает ЛК в АЛК, ГЛК в СДК, ДГЛК в ЭТК и АРК в ЭПК, например Pichia pastoris ω3-десатураза (SEQ ID NO: 6). Примеры ω3-десатураз включают описанные Pereira et al. (2004a) (ω3-десатураза Saprolegnia diclina, группа II), Horiguchi et al. (1998), Berberich et al. (1998) и Spychalla et al. (1997)
- 34 037817 (ω3-десатураза C. elegans, группа III). В предпочтительном варианте реализации ω3-десатураза представляет собой грибковую ω3-десатуразу. В настоящем документе грибковая ω3-десатураза обозначает ω3-десатуразу, которая получена из грибкового источника, в том числе оомицетного источника, или ее вариант с последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 95% идентичной ей. Гены, кодирующие многочисленные ω3-десаmуразы, выделены из грибковых источников, таких как, например, Phytophthora infestans (номер доступа CAJ30870, WO 2005/083053; SEQ ID NO: 47), Saprolegnia diclina (номер доступа AAR20444, Pereira et al., 2004a и US 7211656), Pythium irregulare (WO 2008/022963, Группа II; SEQ ID NO: 49), Mortierella alpina (Sakuradani et al., 2005; номер доступа BAD91495; WO 2006/019192), Thalassiosira pseudonana (Armbrust et al., 2004; номер доступа XP_002291057; WO 2005/012316, SEQ ID NO: 48), Lachancea kluyveri (также известный как Saccharomyces kluyveri; Oura et al., 2004; номер доступа AB118663). Xue et al. (2012) описывает ω3-десатуразы из оомицетов Pythium aphanidermatum, Phytophthora sojae и Phytophthora ramorum, способные эффективно превращать жирнокислотные субстраты ω6 в соответствующие ω3 жирные кислоты, с предпочтением в отношении субстратов C20, т.е. обладающие более выраженной активностью Δ 17-десатуразы, чем активностью Δ15-десатуразы. Такие ферменты не обладают активностью Δ12-десаmуразы, но способны использовать жирных кислот в ацил-КоА и фосфолипидной фракции в качестве субстратов.
В более предпочтительном варианте реализации грибковая ω3-десаmураза представляет собой ω3-десатуразу/Δ15 -десатуразу Pichia pastoris (также известна как Komagataella pastoris) (Zhang et al., 2008; номер доступа EF116884; SEQ ID NO: 6) или полипептид, который по меньшей мере на 95% идентичен ей.
В варианте реализации ω3-десаmураза способна осуществлять по меньшей мере одну из следующих трансформаций: АРК в ЭПК, ДГЛК в ЭТК, ГЛК в СДК, АРК в ЭПК и ДГЛК в ЭТК, АРК в ЭПК и ГЛК в СДК или все три из них.
В одном варианте реализации ω3-десатураза обладает активностью Δ 17-десатуразы в отношении жирной кислоты C20, которая содержит по меньшей мере три двойные углерод-углеродных связи, предпочтительно АРК. В другом варианте реализации ω3-десаmураза обладает активностью Δ 15-десатуразы в отношении жирной кислоты C18, которая содержит три двойные углерод-углеродных связи, предпочтительно ГЛК. Предпочтительно оба вида активности присутствуют.
В настоящем документе Δ12-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 12-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Δ12-Десатуразы обычно превращают олеоилфосфатидилхолин или олеоил-КоА в линолеоил-фосфатидилхолин (18:1-ФХ) или линолеоил-КоА (18:1КоА) соответственно. Подкласс, использующий связанный с ФХ субстрат, называют фосфолипидзависимыми Δ12-десатуразами, второй подкласс - ацил-КоА-зависимыми Δ12-десатуразами. Растительные и грибковые Δ12-десатуразы обычно относятся к первому подклассу, тогда как животные Δ12-десатуразы относятся ко второму подклассу, например Δ12-десатуразы, кодируемые генами, которые клонированы из насекомых Zhou et al. (2008). Множество других последовательностей Δ12-десатуразы могут быть легко идентифицированы посредством поиска в базах данных последовательностей.
В настоящем документе Δ15-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 15-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Многочисленные гены, кодирующие Δ15-десатуразы, клонированы из растительных и грибковых видов. Например, в US 5952544 раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие растительные Δ15-десатуразы (FAD3). Эти ферменты содержат мотивы аминокислот, которые были характерны для растительных Δ 15-десатураз. В WO 2001/14538 раскрыт ген, кодирующий FAD3 сои. Множество других последовательностей Δ 15-десатуразы могут быть легко идентифицированы посредством поиска в базах данных последовательностей.
В настоящем документе Δ17-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 17-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Δ17-Десатураза также расценивается как ω3-десатураза, если она действует на субстрат C20, с введением десатурации в положении связи ω3.
В предпочтительном варианте реализации Δ12-десатураза и/или Δ 15-десатураза представляет собой грибковую Δ12-десатуразу или грибковую Δ15-десатуразу. В настоящем документе грибковая Δ12десатураза или грибковая Δ 15-десатураза обозначает Δ12-десатуразу или Δ 15-десатуразу, полученную из грибкового источника, в том числе оомицетного источника, или ее вариант, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 95% идентична ей. Гены, кодирующие многочисленные десатуразы, выделены из грибковых источников. В US 7211656 раскрыта Δ12-десатураза из Saprolegnia diclina. В WO 2009/016202 раскрыты грибковые десатуразы из Helobdella robusta, Laccaria bicolor, Lottia gigantea, Microcoleus chthonoplastes, Monosiga brevicollis, Mycosphaerella fijiensis, Mycospaerella graminicola, Naegleria gruben, Nectria haematococca, Nematostella vectensis, Phycomyces blakesleeanus, Trichoderma resii,
- 35 037817
Physcomitrella patens, Postia placenta, Selaginella moellendorffii и Microdochium nivale. В WO 2005/012316 раскрыта Δ12-десатураза из Thalassiosira pseudonana и других грибов. В WO 2003/099216 раскрыты гены, кодирующие грибковые Δ12-десаmуразы и Δ 15-десатуразы, выделенные из Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Botrytis cinerea и Mortierella alpina. В WO 2007/133425 раскрыты грибковые Δ15 десатуразы, выделенные из: Saccharomyces kluyveri, Mortierella alpina, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme и Magnaporthe grisea. Предпочтительная Δ12 десатураза выделена из Phytophthora sojae (Ruiz-Lopez et al., 2012).
Отличным подклассом грибковых Δ12-десатураз и грибковых Δ15-десатураз являются бифункциональные грибковые Δ12/Δ15-десатуразы. Гены, кодирующие их, клонированы из Fusarium monoliforme (номер доступа DQ272516, Damude et al., 2006), Acanthamoeba castellanii (номер доступа EF017656, Sayanova et al., 2006), Perkinsus marinus (WO 2007/042510), Claviceps purpurea (номер доступа EF536898, Meesapyodsuk et al., 2007) и Coprinus cinereus (номер доступа AF269266, Zhang et al., 2007).
В другом варианте реализации ω3-десатураза обладает по меньшей мере некоторой активностью, предпочтительно большей активностью, в отношении субстрата ацил-КоА, чем субстрата соответствующего ацил-ФХ. В настоящем документе соответствующий субстрат ацил-ФХ обозначает этерифицированный жирной кислотой в положении sn-2 фосфатидилхолин (ФХ), в котором жирная кислота представляет собой такую же жирную кислоту, как в субстрате ацил-КоА. Например, субстрат ацил-КоА может представлять собой АРК-КоА, и соответствующий субстрат ацил-ФХ представляет собой sn-2 АРК-ФХ. В варианте реализации активность по меньшей мере двукратно выше. Предпочтительно ω3-десаmураза обладает по меньшей мере некоторой активностью в отношении субстрата ацил-КоА и соответствующего субстрата ацил-ФХ, и обладает активностью в отношении субстратов C18 и C20. Примеры таких ω3-десаmураз известны среди клонированных грибковых десатураз, перечисленных выше.
В другом варианте реализации ω3-десатураза содержит последовательность аминокислот, представленную SEQ ID NO: 6, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 12, предпочтительно по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6.
Еще в одном варианте реализации десатураза для использования в настоящем изобретении обладает более высокой активностью в отношении субстрата ацил-КоА, чем соответствующего субстрата ацилФХ. В другом варианте реализации десатураза для использования в настоящем изобретении обладает более высокой активностью в отношении субстрата ацил-ФХ, чем соответствующего субстрата ацилКоА, но обладает некоторой активностью в отношении обоих субстратов. Как очерчено выше, соответствующий субстрат ацил-ФХ обозначает этерифицированный жирной кислотой в положении sn-2 фосфатидилхолин (ФХ), в котором жирная кислота является такой же, как жирная кислота в субстрате ацилКоА. В варианте реализации более высокая активность обозначает по меньшей мере двукратно более высокую активность. В варианте реализации десатураза представляет собой Δ5, или Δ6-десатуразу, или ω3-десатуразу, примеры которых раскрыты, без ограничения, в табл. 2. Чтобы протестировать, на какой субстрат действует десатураза, а именно на субстрат ацил-КоА или ацил-ФХ, могут быть проведены анализы на дрожжевых клетка, как описано в Domergue et al. (2003 и 2005). Кроме того, способность десатуразы действовать на субстрат ацил-КоА может предполагаться, если элонгаза, которая экспрессируется вместе с десатуразой, демонстрирует эффективность ферментного превращения в растительных клетках по меньшей мере около 90%, если элонгаза катализирует элонгацию продукта десатуразы. На этой основе Δ5-десатураза и Δ4-десатуразы, экспрессирующиеся из конструкта GA7 (Примеры 2 и 3) и их варианты (Пример 4) способны к десатурации соответствующих ацил-КоА субстратов, ЭТК-КоА и ДПК-КоА.
Элонгазы.
Биохимическое доказательство наводит на мысль о том, что элонгация жирной кислоты состоит из 4 стадий: конденсация, восстановление, дегидратация и второе восстановление. В контексте данного изобретения элонгаза обозначает полипептид, катализирующий стадию конденсации в присутствии других членов комплекса элонгации, в подходящих физиологических условиях. Показано, что гетерологичная или гомологичная экспрессия в клетке только конденсирующего компонента (элонгаза) комплекса элонгации белка требуется для элонгации соответствующей ацильной цепи. Поэтому введенная элонгаза может успешно рекрутировать восстанавливающую и дегидратирующую активность из трансгенного хозяина с целью осуществления успешной элонгации ацила. Считается, что за специфичность реакции элонгации относительно длины цепи и степени десатурации жирнокислотных субстратов отвечает компонент конденсации. Кроме того, считается, что данный компонент является ограничивающим скорость в реакции элонгации.
В настоящем документе Δ5-элонгаза по меньшей мере способна превращать ЭПК в ДПК. Примеры Δ5-элонгаз включают раскрытые в WO 2005/103253. В одном варианте реализации Δ5-элонгаза обладает активностью в отношении ЭПК с образованием ДПК с эффективностью по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 80 или 90%. В дополнительном варианте реализации последователь- 36 037817 ность аминокислот Δ5-элонгазы представлена SEQ ID NO: 25, ее биологически активным фрагментом, или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 47% идентичной SEQ ID NO: 25. В дальнейшем варианте реализации Δ6-элонгаза происходит из Ostreococcus taurii или Ostreococcus lucimarinus (US 2010/088776).
В настоящем документе Δ6-элонгаза по меньшей мере способна превращать СДК в ЭТК. Примеры Δ6-элонгаз включают перечисленные в табл. 1. В одном варианте реализации элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную SEQ ID NO: 16, ее биологически активный фрагмент (например, фрагмент, раскрытый как SEQ ID NO: 17) или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 55% идентичную одной или обеим из SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 17. В варианте реализации Δ6-элонгаза получена из Physcomitrella patens (Zank et al., 2002; номер доступа AF428243) или Thalassiosira pseudonana (Ruiz-Lopez et al., 2012).
В настоящем документе Δ9-элонгаза по меньшей мере способна превращать АЛК в ЭТрК. Примеры Δ9-элонгаз включают приведенные в табл. 1. В одном варианте реализации последовательность аминокислот Δ9-элонгазы представлена SEQ ID NO: 43, ее биологически активным фрагментом или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO: 43. В другом варианте реализации Δ9-элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 31, ее биологически активный фрагмент или последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 81% идентична SEQ ID NO: 31. В другом варианте реализации Δ9-элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 33, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот, по меньшей на мере 50% идентичную SEQ ID NO: 33. В другом варианте реализации последовательность аминокислот Δ9-элонгазы представлена SEQ ID NO: 35, ее биологически активным фрагментом или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 50% идентичной SEQ ID NO: 35. В дальнейшем варианте реализации Δ9-элонгаза обладает более высокой активностью в отношении ω6 субстрата, чем соответствующего ω3 субстрата, или наоборот.
В настоящем документе термин обладает более высокой активностью в отношении субстрата ω6, чем соответствующего субстрата ω3, обозначает относительную активность фермента в отношении субстратов, которая отличается по активности ω3 десатуразы. Предпочтительно субстрат ω6 представляет собой ЛК, и субстрат ω3 представляет собой АЛК.
Элонгаза с активностью Δ6-элонгазы и Δ9-элонгазы по меньшей мере способна (i) превращать СДК в ЭТК и (ii) превращать АЛК в ЭТрК, а также обладает более высокой активностью Δ6-элонгазы, чем активностью Δ9-элонгазы. В одном варианте реализации элонгаза обладает эффективностью превращения СДК с образованием ЭТК, которая составляет по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, и/или эффективностью превращения АЛК с образованием ЭТрК, которая составляет по меньшей мере 6% или более предпочтительно по меньшей мере 9%. В другом варианте реализации элонгаза обладает активностью Δ6-элонгазы, по меньшей мере около в 6,5 раз превышающей активность Δ9-элонгазы. В дальнейшем варианте реализации элонгаза не обладает обнаружимой активностью Δ5-элонгазы.
Другие ферменты.
Трансгены, введенные в рекомбинантную клетку, такую как микробная клетка, или трансгенное растение или его часть, могут дополнительно кодировать ЛФААТ. В настоящем документе термин 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФКАТ), также называемый ацилтрансферазой лизофосфатидиновой кислоты или ацил-КоА-лизофосфатидат-ацилтрансферазой, обозначает белок, который ацилирует sn-1-ацил-глицерид-3-фосфат (sn-1 G-3-P) в положении sn-2, с образованием фосфатидной кислоты (ФК). Таким образом, термин активность 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазы обозначает ацилирование (sn-1 G-3-P) в положении sn-2 с образованием ФК (EC 2.3.1,51). Предпочтительными ЛФКАТ являются такие, которые могут использовать полиненасыщенный C22 анил-КоА в качестве субстрата для переноса полиненасыщенной группы ацила C22 в положение sn-2 ЛФК с образованием ФК. В варианте реализации полиненасыщенный C22 ацил-КоА представляет собой ДГК-КоА и/или ДПК-КоА. Примеры таких ЛФКАТ приведены в Примере 13 и могут быть протестированы, как раскрыто в настоящем документе. В варианте реализации последовательность аминокислот ЛФКАТ, пригодная в соответствии с изобретением, представлена любой из SEQ ID NO: 40-46, ее биологически активным фрагментом или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 40% идентичной любой из SEQ ID NO: 4046. В другом варианте реализации ЛФААТ не содержит последовательности аминокислот, представленной в любой из SEQ ID NO: 44. В предпочтительном варианте реализации ЛФААТ, пригодная в соответствии с изобретением, которая может использовать полиненасыщенный жирный ацил-КоА субстрат C22, предпочтительно ДГК-КоА и/или ДПК-КоА, содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 41, 42 и 44, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 40% идентичную любой одной или более из SEQ ID NO: 41, 42 и 44. В предпочтительном варианте реализации ЛФААТ, пригодная в соответствии с изобретением, которая может использовать полиненасыщенный жирный ацил-КоА субстрат C22, предпочтительно ДГК-КоА
- 37 037817 и/или ДПК-КоА, содержит последовательность аминокислот, представленную любой из SEQ ID NO: 41 или 42, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 40% идентичную любой одной или более из SEQ ID NO: 41 и 42. В варианте реализации, в котором генетическая конструкция экспрессирует Δ4-десатуразу в трансгенной клетке и/или трансгенная клетка продуцирует ДГК, ЛФААТ предпочтительно представляет собой ЛФААТ, кроме ЛФААТ Mortierella alpina, последовательность аминокислот которой представлена как SEQ ID NO: 44. В качестве альтернативы, если генетическая конструкция не экспрессирует Δ4-десатуразы в трансгенной клетке и/или трансгенная клетка продуцирует ДПК, но не ДГК, ЛФААТ предпочтительно представляет собой ЛФААТ Mortierella alpina, последовательность аминокислот которой приведена как SEQ ID NO: 44, или другую ЛФААТ, которая способна использовать ДПК-КоА в качестве субстрата для переноса ДПК в ЛПК, с образованием ДАГ, содержащего ДПК в положении sn-2.
Трансгены, введенные в рекомбинантную клетку, трансгенное растение или его часть, могут дополнительно кодировать ДГАТ. В настоящем документе термин диацилглицерид ацилтрансфераза (EC 2.3.1.20; ДГАТ) обозначает белок, который переносит жирную группу ацила из ацил-КоА к диацилглицеридьному субстрату, с образованием триацилглицерида. Поэтому термин активность диацилглицерид ацилтрансферазы обозначает перенос ацил-КоА к диацилглицериду с образованием триацилглицерида. Существует три известных вида ДГАТ, обозначенных как ДГАТ1, ДГАТ2 и ДГАТ3 соответственно. Полипептиды ДГАТ1 обычно содержат 10 трансмембранных доменов, ДГАТ2 обычно содержат два трансмембранных домена, тогда как ДГАТ3 обычно является растворимым. Примеры полипептидов ДГАТ1 включают полипептиды, кодируемые генами ДГАТ1 из Aspergillus fumigatus (номер доступа XP_755172), Arabidopsis thaliana (CAB44774), Ricinus communis (AAR11479), Vernicia fordii (ABC94472), Vernonia galamensis (ABV21945, ABV21946), Euonymus alatus (AAV31083), Caenorhabditis elegans (AAF82410), Rattus norvegicus (NP_445889), Homo sapiens (NP_036211), а также их варианты и/или мутанты. Примеры полипептидов ДГАТ2 включают полипептиды, кодируемые генами ДГАТ2 из Arabidopsis thaliana (номер доступа NP_566952), Ricinus communis (AAY16324), Vernicia fordii (ABC94474), Mortierella ramanniana (AAK84179), Homo sapiens (Q96PD7, Q58HT5), Bos taurus (Q70VD8), Mus musculus (AAK84175), Micromonas CCMP1545, а также их варианты и/или мутанты. Примеры полипептидов ДГАТ3 включают полипептиды, кодируемые генами ДГАТ3 из арахиса (Arachis hypogaea, Saha, et al., 2006), а также их варианты и/или мутанты.
Полипептиды/пептиды.
Термины полипептид и белок в общем используются равнозначно.
Полипептид или класс полипептидов может быть определен по степени идентичности (% идентичности) его последовательности аминокислот референтной последовательности аминокислот или по большему % идентичности одной референтной последовательности аминокислот, чем другой. % идентичности полипептида референтной последовательность аминокислот обычно определяется анализом GAP (Needleman and Wunsch, 1970; программа GCG) с параметрами штраф на открытие промежутка = 5 и штраф на продление промежутка = 0,3. Длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 15 аминокислот, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 15 аминокислот. Более предпочтительно длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 50 аминокислот, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 50 аминокислот. Более предпочтительно длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 100 аминокислот, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 100 аминокислот. Даже более предпочтительно, длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 250 аминокислот, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 250 аминокислот. Даже более предпочтительно анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении их полной длины. Полипептид или класс полипептидов может обладать такой же ферментной активностью или иной активностью или не обладать активностью референтного полипептида. Предпочтительно полипептид обладает ферментной активностью по меньшей мере 10%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 90% от активности референтного полипептида.
Биологически активный фрагмент представляет собой часть полипептида, определенного в настоящем документе, которая сохраняет определенную активность полноразмерного референтного полипептида, например, обладающую активностью десатуразы и/или элонгазы или другой ферментной активностью. Биологически активные фрагменты в настоящем документе исключают полноразмерный полипептид. Биологически активные фрагменты могут быть частью любого размера до тех пор, пока они сохраняют определенную активность. Предпочтительно биологически активный фрагмент сохраняет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 90% активности полноразмерного белка.
Относительно определенного полипептида или фермента необходимо понимать, что % идентичности, превышающий раскрытые в настоящем документе, включает предпочтительные варианты. Таким образом, если это уместно, в свете минимума % идентичности, предпочтительно, чтобы полипеп
- 38 037817 тид/фермент содержал последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 76%, более предпочти тельно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтитель но по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8% и даже более предпочти тельно по меньшей мере на 99,9% идентична указанной в связи с ней SEQ ID NO.
Варианты/мутанты аминокислотной последовательности полипептидов, раскрытых в настоящем документе, могут быть получены посредством введения подходящих модификаций нуклеотидов в нуклеиновую кислоту, раскрытую в настоящем документе, или синтеза целевого полипептида in vitro. Такие варианты/мутанты включают, например, делеции, инсерции или замены остатков в пределах последовательности аминокислот. Комбинация делеции, вставки и замены может быть осуществлена таким образом, чтобы получить конечную конструкцию при условии, что конечный пептидный продукт обладает желательной ферментной активностью.
Мутантные (модифицированные) пептиды могут быть получены с применением любой техники, известной из уровня техники. Например, полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, может быть обработан методами мутагенеза in vitro или тасования ДНК, как подробно описано Harayama (1998). Скрининг продуктов, получаемых из видоизмененной/модифицированной ДНК, может быть с легкостью проведен с применением способов, раскрытых в настоящем документе, для определения того, обладают ли они, например, десатуразной или элонгазной активностью.
При конструировании мутантов последовательности аминокислот местоположение сайта мутации и природа мутации будут зависеть от характеристики(ик), которую модифицируют. Сайты для мутации могут быть модифицированы индивидуально или посерийно, например, посредством (1) замены вначале выбранных консервативных аминокислот, а затем более радикальных замен, в зависимости от достигнутых результатов, (2) удаления остатка-мишени или (3) вставки других остатков, смежных с размещенным сайтом.
Делеции в аминокислотной последовательности в общем варьируют от около 1 до 15 остатков, более предпочтительно от около 1 до 10 остатков и обычно около от 1 до 5 смежных остатков.
В мутантах замены удален по меньшей мере один остаток аминокислоты в молекуле полипептида, и другой остаток вставлен на его место. Наиболее интересные положения для мутагенеза посредством замены включают сайты, которые не являются консервативными в природных десатуразах или элонгазах. Эти сайты предпочтительно заменяются относительно консервативным образом для того, чтобы сохранить акгивность фермента. Такие консервативные замены проиллюстрированы в табл. 3 под заголовком Примеры замен.
В предпочтительном варианте мутантный/вариантный полипептид содержит только или не более чем один или два или три или четыре консервативные модификации аминокислоты, по сравнению с природным полипептидом. Подробности консервативных модификаций аминокислот приведены в табл. 3. Как будет понятно квалифицированному специалисту, такие незначительные модификации могут в разумных пределах быть спрогнозированы как не влияющие на активность полипептида, при экспрессии в рекомбинантной клетке.
Полинуклеотиды.
Кроме того, в изобретении предлагается применение полинуклеотидов, которые могут представлять собой, например, ген, выделенный полинуклеотид, химерную генетическую конструкцию, такую как молекула T-ДНК или химерная ДНК. Это может быть ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, двухцепочечная или одноцепочечная, а также комбинированная с углеводом, липидами, белком или другими материалами для осуществления конкретной активности, раскрытой в настоящем документе. Термин полинуклеотид используется в настоящем документе равнозначно с термином молекула нуклеиновой кислоты.
В варианте реализации полинуклеотид не является природным. Примеры неприродных полинуклеотидов включают, но не ограничиваясь этим, мутировавшие (например, с применением способов, описанных в данном описании) и полинуклеотиды, в которых открытая рамка считывания, кодирующая белок, функционально связана с промотором, с которым она не связана в природе (как, например, в конструкциях, описанных в данном описании).
- 39 037817
Таблица 3. Примеры замен.
Исходный остаток Примеры замен
Ala (А) val; leu; ile; gly
Arg (R) lys
Asn (N) gin: his
Asp (D) glu
Cys (C) ser
Gln(Q) asn., his
Glu (E) asp
Gly(G) pto, ala
His (H) asn; gin
He (I) leu; val; ala
Leu (L) ile; val; met; ala; phe
Lys(K) arg
Met (M) leu: phe
Phe (F) leu: val; ala
Pro (P) giy
Ser(S) thr
Thr (T) ser
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp; phe
Vai (V) ile; leu; met; phe; ala
В настоящем документе термин ген используется в самом широком контексте и включает дезоксирибонуклеотидные последовательности, содержащие транскрибированный участок и, в случае трансляции, участок кодирования белка структурного гена, включая: последовательности, размещенные смежно с кодирующим участком на 5'- и 3'-концах на расстоянии по меньшей мере около 2 тысячи пар оснований на любом конце, которые принимают участие в экспрессии гена. В этом отношении ген содержит контрольные сигналы, например промоторы, энхансеры, сигналы терминации и/или полиаденилирования, которые в природе ассоциированы с данным геном, или гетерологичные контрольные сигналы, и в этом случае ген носит название химерного гена. Последовательности, которые размещены на 5'конце кодирующего белок участка и которые присутствуют на. мРНК, обозначаются как 5'нетранслируемые последовательности. Последовательности, которые размещены на 3'-конце или ниже по отношению к кодирующему белок участку и которые присутствуют на мРНК, обозначаются как 3'нетранслируемые последовательности. Термин ген включает кДНК и геномные формы гена. Геномная форма или клон гена содержат кодирующий участок, который может прерываться некодирующими последовательностями под названием интроны, или промежуточные участки, или промежуточные последовательности . Интроны представляют собой сегменты гена, которые транскрибированы в ядерную РНК (гетерогенную ядерную РНК, гяРНК). Интроны могут содержать регуляторные элементы, например энхансеры. Интроны удаляют или сращивают с ядерным или первичным транскриптом; таким образом, интроны отсутствуют в транскрипте матричной РНК (мРНК). Функция мРНК в ходе трансляции состоит в конкретизации последовательности или порядка аминокислот в возникающем полипептиде. Термин ген включает синтетическую или слитую молекулу, кодирующую все или часть белков, раскрытых в настоящем документе, и комплементарную нуклеотидную последовательность к любому из упомянутого выше.
В настоящем документе химерная ДНК, или химерная генетическая конструкция, или подобное выражение обозначает любую молекулу ДНК, которая не является природной молекулой ДНК в ее природном местоположении, также обозначаемую в настоящем документе как конструкция ДНК. Обычно химерная ДНК или химерный ген содержат регуляторную и транскрибируемую или кодирующую белок последовательности, которые не найдены функционально связанными друг с другом в природе, т.е. которые гетерологичны по отношению друг к другу. Соответственно, химерная ДНК или химерный ген могут содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из одного источника, но организованные отличным образом от найденных в природе.
Эндогенный ген обозначает природный ген в его естественном положении в геноме организма. В настоящем документе молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, рекомбинантный полинуклеотид или их вариации обозначают молекулу нуклеиновой кислоты, которая конструируется или модифицируется с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Термины чужеродный полинуклеотид, или экзогенный полинуклеотид, или гетерологичный полинуклеотид и подобные обозначают любую
- 40 037817 нуклеиновую кислоту, которая введена в геном клетки с помощью экспериментальных манипуляций.
Чужеродные или экзогенные гены могут представлять собой гены, вставленные в неприродный организм, природные гены, которые введены в новое местоположение в пределах природного хозяина, или химерные гены. Трансген представляет собой ген, который введен в геном процедурой трансформации. Термины генетически модифицированный, трансгенный и их вариации включают введение генов в клетки посредством трансформации или трансдукции, мутацию генов в клетках и модификацию или мо дулирование регуляции гена в клетке или организмах, с которыми осуществлялись указанные действия, или их потомстве. Геномный участок в настоящем документе обозначает положение в пределах генома, в котором трансген или группа трансгенов (также обозначенная в настоящем документе как кластер) вставлены в клетку или ее предка. Такие участки включают только нуклеотиды, которые введены путем вмешательства человека, например, способами, раскрытыми в настоящем документе.
Термин экзогенный в контексте полинуклеотида обозначает полинуклеотид, присутствующий в клетке в измененном количестве, по сравнению с его природным состоянием. В одном варианте реализации клетка представляет собой клетку, которая в природе не содержат полинуклеотида. Однако клетка может быть клеткой, которая содержит неэндогенный полинуклеотид, что приводит к изменению уровня выработки кодируемого полипептида. Экзогенный полинуклеотид включает полинуклеотиды, которые не отделены от других компонентов трансгенной (рекомбинантной) клетки или неклеточной системы экспрессии, в которой он присутствует, и полинуклеотиды, продуцированные в таких клетках или неклеточных системах, которые впоследствии были очищены по меньшей мере от некоторых других компонентов. Экзогенный полинуклеотид (нуклеиновая кислота) может представлять собой непрерывную цепь нуклеотидов, существующую в природе, или содержать два или более смежных нуклеотидных участка из различных источников (природных и/или синтетических), соединенных таким образом, чтобы образовать единый полинуклеотид. Обычно такие химерные полинуклеотиды содержат по меньшей мере открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, функционально связанный с промотором, подходящим для управления транскрипцией открытой рамки считывания в целевой клетке.
Относительно раскрытых полинуклеотидов необходимо понимать, что более высокий % идентичности, чем раскрытые выше, будет включать предпочтительные варианты. Таким образом, если это уместно, в свете минимального % идентичности полинуклеотид предпочтительно содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична соответствующей указанной SEQ ID NO.
Полинуклеотиды могут содержать по сравнению с встречающимися в природе молекулами одну или больше мутаций, которые представляют собой делеции, вставки или замены нуклеотидных остатков. Полинуклеотиды, которые содержат мутации относительно референтной последовательности, могут быть природными (т.е. выделенными из природного источника) или синтетическими (например, полученными в результате сайт-направленного мутагенеза или тасования ДНК из нуклеиновой кислоты, как раскрыто выше). Таким образом, очевидно, что полинуклеотиды могут быть получены из природного источника или могут быть рекомбинантными. Предпочтительными полинуклеотидами являются содер жащие кодирующие участки, которые кодон-оптимизированы для трансляции в клетках растения, как известно из уровня техники.
Рекомбинантные векторы.
Рекомбинантная экспрессия может применяться для получения рекомбинантных клеток, или растений, или частей растения по изобретению. Рекомбинантные векторы содержат гетерологичные полинуклеотидные последовательности, т.е. полинуклеотидные последовательности, которые в природе не найдены смежными с молекулами полинуклеотида, раскрытыми в настоящем документе, которые предпочтительно получены из других видов, нежели те, из которых получена(ы) молекула(ы) полинуклеотида. Вектор может представлять собой РНК или ДНК и обычно является плазмидой. Плазмидные векторы обычно содержат дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, которые обеспечивают простоту селекции, амплификации и трансформации кассеты экспрессии в прокариотных клетках, например, полученные из pUC векторы, полученные из pSK векторы, полученные из pGEM векторы, полученные из pSP векторы, полученные из pBS векторы, или предпочтительно бинарные векторы, содержащие один или более участков T-ДНК. Дополнительные последовательности нуклеиновых кислот включают источ- 41 037817 ники репликации для обеспечения автономной репликации вектора, гены селекционных маркеров, предпочтительно кодирующие резистентность к антибиотику или гербициду, уникальные множественные сайты клонирования, обеспечивающие множественные сайты вставки последовательностей нуклеиновых кислот или генов, кодируемых в конструкции нуклеиновой кислоты, и последовательности, которые повышают активность трансформации прокариотных и эукариотных (особенно растительных) клеток. Рекомбинантный вектор может содержать более чем один полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, например три, четыре, пять или шесть полинуклеотидов, раскрытых в настоящем документе, в комбинации, предпочтительно химерную генетическую конструкцию, описанную в данном описании, в которой каждый полинуклеотид функционально связан с последовательностями контроля экспрессии, которые активны в целевой клетке. Предпочтительно контроль экспрессии последовательностей включает или представляет собой все из гетерологичных промоторов, т.е. гетерологичных в отношении кодирующих участков, которые они контролируют. Более чем один полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, например 3, 4, 5 или 6 полинуклеотидов, предпочтительно 7 или 8 полинуклеотидов, каждый из которых кодирует другой полипептид, предпочтительно ковалентно соединены в едином рекомбинантном векторе, предпочтительно в пределах единой молекулы T-ДНК, которая в дальнейшем может быть введена как единая молекула в клетку, с получением рекомбинантной клетки по изобретению, и предпочтительно интегрирована в геном рекомбинантной клетки, например, в трансгенном растении. Интеграция в геном может осуществляться в ядерном геноме или в пластидном геноме трансгенного растения. Таким образом, полинуклеотиды, соединенные таким способом, будут унаследованы вместе как единый генетический локус у потомка рекомбинантной клетки или растения. Рекомбинантный вектор или растение могут содержать два или более таких рекомбинантных вектора, каждый из которых содержит несколько полинуклеотидов, например каждый рекомбинантный вектор содержит 3, 4, 5 или 6 полинуклеотидов.
Функционально связанный в настоящем документе обозначает функциональное взаимоотношение между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Обычно это обозначает функциональное взаимоотношение транскрипционального регуляторного элемента (промотора) и транскрибируемой последовательности. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке. В общем, транскрипциональные регуляторные элементы промотора, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, являются физически смежными с транскрибируемой последовательностью, т.е. они являются cis-действующими. Однако для некоторых транскрипциональных регуляторных элементов, таких как энхансеры, нет необходимости быть физически смежными или расположенными в непосредственной близости от кодирующих последовательностей, транскрипцию которых они увеличивают.
Если присутствуют несколько промоторов, каждый промотор независимо может быть таким же или отличным. Предпочтительно по меньшей мере 3 и максимум до 6 различных промоторных последовательностей применяются в рекомбинантном векторе, чтобы управлять экспрессией экзогенных полинуклеотидов.
Кроме того, рекомбинантные молекулы, например химерные ДНК или генетические конструкции, могут содержать (а) один или более секреторных сигналов, кодирующих сигнальные пептидные последовательности, чтобы позволить экспрессируемому полипептиду, раскрытому в настоящем документе, секретироваться из клетки, которая вырабатывает полипептид или которая обеспечивает локализацию экспрессируемого полипептида, например, для удержания полипептида в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) клетки или переноса в пластиду, и/или (б) слитые последовательности, которые приводят к экспрессии молекул нуклеиновых кислот как слитых белков. Примеры подходящих сигнальных сегментов включают любой сигнальный сегмент, способный направлять секрецию или локализацию полипептида, раскрытого в настоящем документе. Дополнительно, рекомбинантные молекулы могут содержать промежуточные и/или нетранслируемые последовательности, вокруг и/или в пределах последовательностей нуклеиновых кислот молекул нуклеиновых кислот, раскрытых в настоящем документе.
Чтобы упростить идентификацию трансформантов, желательно, чтобы конструкция нуклеиновой кислоты содержала ген селекционного или скринингового маркера как или в дополнение к чужеродному или экзогенному полинуклеотиду. Ген маркера обозначает ген, который придает отличный фенотип клеткам, экспрессирующим ген маркера, таким образом, что трансформированные клетки отличаются от клеток, не содержащих маркера. Ген селекционного маркера предоставляет признак, по которому можно осуществлять селекцию на основании резистентности к селекционному агенту (например, гербицид, антибиотик, излучение, тепло или другой вид обработки, повреждающий нетрансформированные клетки). Ген пригодного для скрининга маркера (или репортерный ген) обеспечивает признак, по которому можно идентифицировать посредством наблюдения или тестирования, например посредством скрининга (например, активность β-глюкуронидазы, люциферазы, зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ) или другого фермента, отсутствующую в нетрансформированных клетках). Ген маркера и целевая нуклеотидная последовательность не должны быть связаны. Фактически выбор маркера не является критическим до тех пор, пока он функционален (т.е. селективен) в сочетании с клетками выбора, такими как рас
- 42 037817 тигельная клетка.
Примерами селекционных маркеров являются маркеры, которые обеспечивают резистентность к антибиотикам, например резистентность к ампициллину, эритромицину, хлорамфениколу или тетрациклину, предпочтительно резистентность к канамицину. Примеры селекционных маркеров для селекции растений-трансформантов включают, без ограничения, ген hyg, который кодирует резистентность к гигромицину B; ген неомицин фосфотрансферазы (nptII), обеспечивающий резистентность к канамицину, паромомицину, G418; ген глутатион-S-трансферазы из печени крыс, обеспечивающий резистентность к гербицидам-производным глутатиона, таким как, например, раскрытые в EP 256223; ген глутаминсинтетазы, при чрезмерной экспрессии обеспечивающий резистентность к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин, например, раскрытый в WO 87/05327; ген ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromogenes, обеспечивающий резистентность к селекционному агенту фосфинотрицину, например, раскрытый в EP 275957; ген, кодирующий 5-енолшикимат-3-фосфат синтазу (ЭШФС), обеспечивающий переносимость N-фосфонометилглицина, например, раскрытый Hinchee et al. (1988); или предпочтительно ген bar, обеспечивающий резистентность к биалафосу, например, раскрытый в WO 91/02071.
Предпочтительно конструкция нуклеиновой кислоты стабильно инкорпорирована в геном клетки, например растительной клетки. Соответственно, нуклеиновая кислота может содержать подходящие элементы, которые позволяют молекуле инкорпорироваться в геном, предпочтительно последовательности правой и левой границ молекулы T-ДНК, или конструкция размещена в подходящем векторе, который может быть инкорпорирован в хромосому клетки.
Экспрессия.
В настоящем документе вектор экспрессии представляет собой вектор ДНК, который способен трансформировать клетку-хозяина и осуществлять экспрессию одной или более указанных молекул полинуклеотида. Векторы экспрессии по настоящему изобретению могут управлять экспрессией гена в растительных клетках или в рекомбинантных клетках, таких как микробные клетки. Векторы экспрессии, пригодные в соответствии с изобретением, содержат регуляторные последовательности, например последовательности для контроля транскрипции, последовательности для контроля трансляции, источники репликации и другие регуляторные последовательности, которые совместимы с рекомбинантной клеткой и которые управляют экспрессией молекул полинуклеотида по настоящему изобретению. В частности, полинуклеотиды или векторы, пригодные в соответствии с настоящим изобретением, содержат последовательности для контроля транскрипции. Последовательности для контроля транскрипции представляют собой последовательности, которые управляют инициацией, элонгацией и терминацией транскрипции. Особенно важными последовательностями для контроля транскрипции являются такие, которые управляют инициацией транскрипции, например последовательности промотора и энхансера. Подходящие последовательности для контроля транскрипции включают любую последовательность для контроля транскрипции, которая может функционировать по меньшей мере в одной из рекомбинантных клеток по настоящему изобретению. Выбор используемых регуляторных последовательностей зависит от организма-мишени, такого как растение, и/или органа-мишени или целевой ткани. Такие регуляторные последовательности могут быть получены из любого эукариотного организма, такого как растения или вирусы растений, или могут быть химически синтезированы. Множество таких последовательностей для контроля транскрипции известно специалистам из уровня техники. Особенно предпочтительными последовательностями для контроля транскрипции являются промоторы, активно направляющие транскрипцию в растениях, конститутивно или специфичных для стадии и/или ткани образом, в зависимости от использования растения или его частей.
Целый ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции растительных клеток или получения трансгенных растений, описаны, например, в Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; и Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Обычно векторы экспрессии в растениях содержат, например, один или более клонированных генов растения под транскрипциональным контролем 5'- и 3'-регуляторных последовательностей и доминантный селекционный маркер. Дополнительно, такие векторы экспрессии в растениях могут содержать регуляторный участок промотора (например, регуляторный участок, управляющий индуцибельной или конститутивной, регулируемой условиями окружающей среды или стадией развития, или клеточно- или тканеспецифичной экспрессией), старт-сайт инициации транскрипции, сайт связывания с рибосомой, сигнал процессинга РНК, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.
Описан целый ряд конститутивных промоторов, которые активны в клетках растения. Подходящие промоторы для конститутивной экспрессии в растениях включают, без ограничения, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV), 35S мозаичного вируса норичника шишковатого (FMV) и индуцибельный светом промотор из маленькой субъединицы рибулозо-1,5-бис-фосфат карбоксилазы.
С целью экспрессии в исходных тканях растения, таких как лист, семя, корень или стебель, промоторам, используемым в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно свойственна относительно высокая экспрессия в этих конкретных тканях. Множество примеров хорошо известно из уровня
- 43 037817 техники. Кроме того, различные промоторы растительных генов, которые регулируются в ответ на экологические, гормональные, химические и/или связанные с развитием сигналы, могут использоваться для экспрессии генов в клетках растения или может быть предпочтительным использование органспецифичных промоторов.
В настоящем документе термин промотор, специфичный для семени или его вариации обозначает промотор, который предпочтительно по сравнению с другими тканями растения направляет транскрипцию гена в развивающемся семени растения, предпочтительно растения вида Brassica, Camelina sativa или G. max. В варианте реализации промотор, специфичный для семени, экспрессируется по меньшей мере в 5 раз активнее в развивающемся семени растения относительно листьев и/или стеблей растения и предпочтительно экспрессируется активнее в эмбрионе развивающегося семени по сравнению с другими тканями растения. Предпочтительно промотор только направляет экспрессию целевого гена в развивающемся семени и/или экспрессия целевого гена в других частях растения, таких как листья, не может быть обнаружена нозерн-блоттингом и/или ОТ-ПЦР. Обычно промотор управляет экспрессией генов в процессе роста и развития семени, в частности в ходе фазы синтеза и аккумуляции запасных веществ в семени. Такие промоторы могут управлять экспрессией гена в целом запасном органе растения или только в его части, например оболочке семени или семядоле(ях), предпочтительно в эмбрионах, в семенах двудольных растений или эндосперме или алейроновом слое семян однодольных растений.
Предпочтительные промоторы специфичной для семени экспрессии включают i) промоторы из генов, кодирующих ферменты, принимающие участие в биосинтезе жирных кислот и их аккумуляции в семенах, например десатуразы и элонгазы жирных кислот, ii) промоторы из генов, кодирующих запасные белки для хранения в семени, и iii) промоторы из генов, кодирующих ферменты, принимающие участие в биосинтезе углеводов и их аккумуляции в семенах. Подходящими специфичными для семени промоторами являются промотор гена напина масличного рапса (US 5608152), промотор USP Vicia faba (Baumlein et al., 1991), промотор олеозина Arabidopsis (WO 98/45461), промотор фазеолина Phaseolus vulgaris (US 5504200), промотор Bce4 Brassica (WO 91/13980) или промотор легумина LeB4 из Vicia faba (Baumlein et al., 1992) и промоторы, которые обеспечивают специфичную для семени экспрессию в однодольных, таких как маис, ячмень, пшеница, рожь, рис и т.п. В качестве подходящих следует отметить такие промоторы: промотор гена Ipt2 или lpt1 ячменя (WO 95/15389 и WO 95/23230) или промоторы, раскрытые в WO 99/16890 (промоторы из гена гордеина ячменя, гена глютелина риса, гена оризина риса, гена проламина риса, гена глиадина пшеницы, гена глютелина пшеницы, гена зеина маиса, гена глютелина овса, гена казирина сорго, гена секалиеа ржи). Другие промоторы включают раскрытые Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), US 20070192902 и US 20030159173. В варианте реализации специфичный для семени промотор предпочтительно экспрессируется в определенных частях семени, таких как эмбрион, семядоля(и) или эндосперм. Примеры таких специфичных промоторов включают, без ограничения, промотор FP1 (Ellerstrom et al., 1996), промотор легумина гороха (Perrin et al., 2000), промотор фитогемагглютинина боба (Perrin et al., 2000), промоторы конлинин 1 и конлинин 2 для генов, кодирующих запасные белки 2S льна (Cheng et al., 2010), промотор гена FAE1 из Arabidopsis thaliana, промотор BnGLP гена глобулин-подобного белка Brassica napus, промотор LPXR гена пероксиредоксина из Linum usitatissimum.
5'-Нетранслируемая лидерная последовательность может быть получена из промотора, выбранного для экспрессии гетерологичной последовательности гена полинуклеотида по настоящему изобретению или предпочтительно является гетерологичной относительно участка, кодирующего фермент, который вырабатывается, и может быть специфично модифицирована, при желании, таким образом, чтобы увеличить трансляцию мРНК. Обзор оптимизации экспрессии трансгенов см. в Koziel et al. (1996). Дополнительно, 5'-нетранслируемые участки могут быть получены из РНК вирусов растений (среди прочего, вирус мозаики табака, вирус гравировки табака, вирус карликовой мозаичности маиса, вирус мозаики люцерны), из подходящих эукариотных генов, растительных генов (лидер гена связывающегося белка a/b хлорофилла пшеницы и маиса) или из синтетической последовательности гена. Настоящее изобретение не ограничивается конструкциями, в которых нетранслируемый участок получен из 5'-нетранслируемой последовательности, сопровождающей последовательность промотора. Дополнительно, лидерная последовательность может быть получена из неродственного промотора или кодирующей последовательности. Лидерные последовательности, пригодные в контексте настоящего изобретения, включают лидер Hsp70 маиса (US 5362865 и US 5859347) и омега-элемент вируса мозаики табака (TMV).
Терминация транскрипции обеспечивается 3'-нетранслируемой последовательностью ДНК, функционально связанной в химерном векторе с целевым полинуклеотидом. 3'-Нетранслируемый участок рекомбинантной молекулы ДНК содержит сигнал полиаденилирования, функционирующий в растениях, чтобы обеспечить добавление аденилатных нуклеотидов к 3'-концу РНК. 3'-Нетранслируемые участки могут быть получены из различных генов, которые экспрессируются в клетках растений. 3'-Нетранслируемый участок нопалинсинтазы, 3'-нетранслируемый участок из маленькой субъединицы гена Rubisco гороха, 3'-нетранслируемый участок из гена запасного белка 7S семени сои или гена конлинина льна обычно используются в таком случае. 3'-Транскрибируемые, нетранслируемые участки, содержащие полиаденилатный сигнал индуцирующих опухоль (Ti) Agrobacterium плазмидных генов, также
- 44 037817 являются подходящими.
Технологии рекомбинантной ДНК могут применяться для улучшения экспрессии трансформированной молекулы полинуклеотида, посредством манипуляции, например, количеством копий молекулы полинуклеотида в пределах клетки-хозяина, эффективностью, с которой такие молекулы полинуклеотида транскрибируются, эффективностью, с которой образующиеся в результате копии транслируются, и эффективностью посттрансляционных модификаций. Рекомбинантные методы, пригодные для увеличения экспрессии молекул полинуклеотида, раскрытых в настоящем документе, включают, без ограничения, интеграцию молекулы полинуклеотида в одну или более хромосом клетки-хозяина, введение стабилизирующих последовательностей в мРНК, замены или модификации сигналов контроля транскрипции (например, промоторы, операторы, энхансеры), замены или модификации сигналов контроля трансляции (например, сайты связывания с рибосомой, последовательности Шайна-Дальгарно), модификацию молекул полинуклеотида для соответствия использованию кодонов в клетке-хозяине и делецию последовательностей, которые дестабилизируют транскрипты.
Трансгенные растения.
Термин растение в настоящем документе как имя существительное обозначает целые растения, но при использовании в качестве прилагательного (растительный) обозначает любую субстанцию, в которой присутствует, полученную из, происходящую из или связанную с растением, например органы растения (такие как листья, стебли, корни, цветки), единичные клетки (такие как пыльца), семена, растительные клетки и т.п. Термин часть растения обозначает все части растения, которые содержат ДНК растения, в том числе вегетативные структуры, например листья или стебли, корни, цветочные органы или структуры, пыльца, семя, части семени, такие как эмбрион, эндосперм, щиток зародыша или оболочка семени, ткань растения, такую как сосудистая ткань, клетки и их потомство, до тех пор, пока часть растения синтезирует липид по изобретению.
Трансгенное растение, генетически модифицированное растение или их вариации обозначают растение, которое содержит генетическую конструкцию (трансген), не найденную в растении дикого типа такого же вида, разновидности или сорта. Трансгенные растения в контексте настоящего изобретения включают растения и их потомство, генетически модифицированные с применением рекомбинантных методов, что приводит к выработке липида или по меньшей мере одного полипептида, раскрытого в настоящем документе в целевом растении или органе растения. Трансгенные клетки растения и трансгенные части растения имеют соответствующее значение. Трансген в настоящем документе имеет обычное значение для данной области биотехнологии и содержит генетическую последовательность, которая получена или модифицирована технологией рекомбинации ДНК или РНК и которая введена в клетку растения. Трансген может содержать генетические последовательности, полученные из клетки растения, которая может принадлежать к тому же виду, разновидности или сорту, что и клетка растения, в которую введен трансген, или к другому виду, разновидности или сорту, или из клетки, не являющейся растительной. Обычно трансген вводят в клетку, например растительную, посредством манипуляции человеком, например трансформации, причем может применяться любой способ на усмотрение специалиста в данной области.
Термины семя и зерно в настоящем документе используются равнозначно. Зерно обозначает зрелое семя, например, собранное в процессе сбора урожая семя, или семя, которое еще находится на растении, но готово для сбора урожая, а также может обозначать семя после набухания или прорастания согласно контексту. Зрелое семя или семя обычно содержит влагу в количестве менее чем около 18-20%, предпочтительно менее чем 10%. Содержание влаги в семени Brassica, например семени рапса в зрелом состоянии, обычно составляет около 4-8% или 6-8%, предпочтительно от около 4 до около 6%. Развивающееся семя в настоящем документе обозначает семя до наступления зрелости, обычно найденное в репродуктивных структурах растения после оплодотворения или цветения, но может также обозначать такие семена до наступления зрелости, которые выделены из растения.
В настоящем документе термин получение части растения или получение семени обозначает любые средства для получения части растения или семени соответственно, в том числе сбор урожая частей растения или семян с растений в поле или в закрытом пространстве, таком как теплица или камера для роста, или покупка или получение от поставщика частей растения или семян. Стандартные условия роста в теплице включают дневную температуру 22-24°C и ночную температуру 16-18°C, с естественным солнечным светом. Семя может быть пригодным для высадки, т.е. способным к прорастанию и образованию растения-потомка или, альтернативно, обработано таким образом, что больше не может прорасти, например расколотое, шлифованное или смолоченное семя, которое пригодно для применения при получении пищевых продуктов или в питании, или для экстракции липида по изобретению.
В настоящем документе термин запасающий орган растения обозначает часть растения, специализирующуюся на хранении энергии в форме, например, белков, углеводов, жирных кислот и/или масел. Примерами запасающих органов растения являются семя, плод, клубневидные корни и клубни. Предпочтительным запасающим органом растения является семя.
Растения или части растений по изобретению или применяемые в соответствии с изобретением предпочтительно являются фенотипически нормальными. В настоящем документе термин фенотипиче
- 45 037817 ски нормальный обозначает генетически модифицированное растение или орган растения, особенно запасающий орган, такой как семя, клубень или плод, не обладающий в существенной мере сниженной способностью к росту и воспроизведению по сравнению с немодифицированным растением или органом растения. В варианте реализации генетически модифицированное растение или орган растения, которые являются фенотипически нормальными, обладают способностью к росту или воспроизводству, по существу такой же, как изогенное растение или орган, не содержащие экзогенного(ых) полинуклеотида(ов). Предпочтительно биомасса, темпы роста, скорость прорастания, размер запасающего органа, жизнеспособность пыльцы, фертильность мужских и женских растений, размер семени и/или количество образованных жизнеспособных семян составляет не менее 90% от показателей растения, не содержащего указанного экзогенного полинуклеотида, при выращивании в идентичных условиях. Предпочтительно жизнеспособность пыльцы растения по изобретению или растений, полученных из семени по изобретению, составляет около 100% относительно жизнеспособности пыльцы соответствующего растения дикого типа. Данный термин не охватывает признаков растения, которое может отличаться от растения дикого типа, но которые не влияют отрицательно на полноценность растения с точки зрения коммерческих целей, например фенотип балерины листьев саженца.
Растения, раскрытые или включенные для использования в практике настоящего изобретения, включают однодольные растения и двудольные растения.
В предпочтительных вариантах реализации растения по настоящему изобретению представляют собой урожайные растения (например, злаковые и зернобобовые, маис, пшеницу, картофели, тапиоку, рис, сорго, просо, маниоку, ячмень или горох) или другие бобовые. Растения могут быть выращены для получения съедобных корней, клубней, листьев, стеблей, цветков или плода. Растения могут быть овощными или декоративными растениями. Растения по изобретению или пригодные в соответствии с изобретением могут представлять собой кукурузу (Zea mays), рапс (Brassica napus, подвид Brassica rapa), горчицу (Brassica juncea), лен (Linum usitatissimum), люцерну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cerale), сорго (Sorghum bicolour, Sorghum vulgare), подсолнечник (Helianthus annus), пшеницу (Tritium aestivum), сою (Glycine max), табак (Nicotiana tabacum), картофель (Solarium tuberosum), арахис (Arachis hypogaea), хлопчатник (Gossypium hirsutum), сладкий картофель (Lopmoea batatus), маниоку (Manihot esculenta), кофе (вид Cofea), кокосовый орех (Cocos nucifera), ананас (Anana comosus), цитрусовое дерево (вид Citrus), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia senensis), банан (вид Musa), авокадо (Persea americana), смоковницу (Ficus casica), гуаву (Psidium guajava), манго (Mangifer indica), маслину (Olea europaea), папайю (Carica papaya), кэшью (Anacardium occidentale), макадамию (Macadamia intergrifolia), миндаль (Prunus amygdalus), сахарную свеклу (Beta vulgaris), овес или ячмень.
В предпочтительном варианте реализации растение представляет собой покрытосеменное растение.
В варианте реализации растение представляет собой растение масличной культуры, предпочтительно урожайное растение масличной культуры. В настоящем документе растение масличной культуры представляет собой вид растения, используемый для коммерческого получения масел из семян растения. Растение масличной культуры может представлять собой масличный рапс (например, рапс), маис, подсолнечник, сою, сорго, лен (семя льна) или сахарную свеклу. Кроме того, растение масличной культуры может быть другими представителями Brassica, хлопчатником, арахисом, маком, горчицей, клещевиной обыкновенной, кунжутом, подсолнечником, сафлором, Camelina, Crambe или дающим орехи растением. Растение может вырабатывать высокие уровни масла в плоде, например маслина, масличная пальма или кокосовый орех. Садовые растения, к которым может быть применено настоящее изобретение, представляют собой салат, эндивий или крестоцветные овощи, включая капусту, брокколи или цветную капусту. Настоящее изобретение может быть применено к табаку, тыквенным, моркови, землянике, помидору или перцу.
В еще одном предпочтительном варианте реализации нетрансгенное растение, используемое для получения трансгенного растения по изобретению, вырабатывает масло, особенно в семени, которое содержит i) менее 20%, менее 10% или менее 5% жирных кислот 18:2 и/или ii) менее 10% или менее 5% жирных кислот 18:3.
В предпочтительном варианте реализации трансгенное растение или его часть являются гомозиготным по всем и каждому гену (экзогенный полинуклеотид), которые были введены (трансгену), таким образом, что его потомство не разделяется для желательного фенотипа. Кроме того, трансгенное растение может быть гетерозиготным по введенному(ым) трансгену(ам), предпочтительно однородно гетерозиготным по трансгену, например, в потомстве F1, которое выращено из гибридного семени. Такие растения могут обеспечивать преимущества, например гибридную силу, хорошо известную из уровня техники, или могут применяться в разведении или обратном скрещивании растений.
Если это уместно, трансгенное растение или его часть могут содержать дополнительные трансгены, кодирующие ферменты, которые принимают участие в выработке ДЦ-ПНЖК, такие как, без ограничения, Δ6-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ8-десатураза, Δ6-элонгаза, Δ5-десатураза, ω3-десатураза, Δ4-десатураза, Δ5-элонгаза, диацилглицерид ацилтрансфераза, ЛФКАТ, Δ 17-десатураза, Δ15-десатураза и/или Δ12-десатураза. Примеры таких ферментов с одним или более из указанных видов активности из- 46 037817 вестны из уровня техники и включают раскрытые в настоящем документе. В конкретных примерах трансгенное растение по меньшей мере содержит набор экзогенных полинуклеотидов, кодирующих:
а) Δ4-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-элонгазу и Δ6-элонгазу,
б) Δ4-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-элонгазу и Δ9-элонгазу,
в) Δ4-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-элонгазу, Δ6-элонгазу и Δ 15-десатуразу,
г) Δ4-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-элонгазу, Δ9-элонгазу и Δ15-десатуразу,
д) Δ4-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-элонгазу, Δ6-элонгазу и Δ17-десатуразу,
е) Δ4-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-элонгазу, Δ9-элонгазу и Δ17-десатуразу,
ж) ω3-десатуразу или Δ 15-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу,
з) ω3-десатуразу или Δ15-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ9-элонгазу и Δ5-элонгазу,
и) Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу или Δ15-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу,
й) Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу или Δ15-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ9-элонгазу и
Δ5-элонгазу,
к) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), ω3-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-элонгазу, Δ5-элонгазу и необязательно Δ4-десатуразу,
л) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ 15-десатуразу, Δ6-десатуразу,
Δ5-десатуразу, Δ6-элонгазу, Δ5-элонгазу и необязательно Δ4-десатуразу,
м) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ12-десатуразу, Δ6-десатуразу,
Δ5-десатуразу. Δ6-элонгазу, Δ5-элонгазу и необязательно Δ4-десатуразу,
н) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу и/или Δ15-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу и необязательно Δ4-десатуразу,
о) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), ω3-десатуразу, Δ8-десатуразу,
Δ5-десатуразу, Δ9-элонгазу, Δ5-элонгазу и необязательно Δ4-десатуразу,
п) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ15-десатуразу, Δ8-десатуразу,
Δ5-десатуразу, Δ9-элонгазу, Δ5-элонгазу и необязательно Δ4-десатуразу,
р) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ12-десатуразу, Δ8-десатуразу,
Δ5-десатуразу, Δ9-элонгазу, Δ5-элонгазу и необязательно Δ4-десатуразу, или
с) 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу и/или Δ15-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ9-элонгазу, Δ5-элонгазу и необязательно Δ4-десатуразу.
В варианте реализации экзогенные полинуклеотиды кодируют набор полипептидов, которые представляют собой Δ6-десатуразу Pythium irregulare, Δ5-дезатуразу Thraustochytrid или Δ5-дезатуразу Emiliana huxleyi, Δ6-элонгазу. Physcomitrella patens, Δ5-элонгазу Thraustochytrid или Δ5-элонгазу Ostreocccus taurii, ω3-десатуразу Phytophthora infestans или ω3-десатуразу Pythium irregulare и Δ4-десатуразу Thraustochytrid.
В варианте реализации растения по изобретению или применяемые в соответствии с изобретением выращены в поле, предпочтительно как популяция размером по меньшей мере 1000, 1000000 или 2000000 растений, которые по существу одинаковы, или на площади по меньшей мере 1 или 2 га. Плот ность насаждения варьирует в соответствии с видом растения, разновидностью растения, климатом, условиями почвы, нормами применения удобрений и другими факторами, как известно из уровня техники. Например, рапс обычно выращивают с плотностью насаждения 1,2-1,5 млн растений/га. Урожай растений собирают, как известно из уровня техники, что может включать валкование, рядковое компостирование и/или жатву плодов растений, с последующей молотьбой и/или веянием растительного материала для отделения семени от остальных частей растения, часто в форме мякины. Альтернативно, урожай семени может быть собран с растений в поле в ходе единственного процесса, а именно комбайнирования.
Трансформация растений.
Трансгенные растения могут быть получены с применением методов, известных из уровня техники, таких как в общем описаны в A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003) и P. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).
В настоящем документе термины стабильно трансформирующий, стабильно трансформированный и их вариации обозначают интеграцию экзогенных молекул нуклеиновых кислот в геном клетки таким образом, что они передаются клеткам потомства в процессе деления клетки, без необходимости в проведении положительной селекции на предмет их присутствия. Стабильные трансформанты или их потомство могут быть отобраны любыми средствами, известными из уровня техники, такими как саузерн-блоты на хромосомной ДНК или гибридизация геномной ДНК in situ. Предпочтительно трансформацию растений осуществляют так, как описано в примерах в данном описании.
Опосредованный Agrobacterium перенос представляет собой широко применяемую систему для введения генов в клетки растения, поскольку ДНК может быть введена в клетки в цельных тканях растения или органах растения или эксплантах в культуре ткани, с целью временной экспрессии или стабиль- 47 037817 ной интеграции ДНК в геном клетки растения. Использование опосредованных Agrobacterium интегрирующихся векторов для растений с целью введения ДНК в клетки растения хорошо известно из уровня техники (см., например, US 5177010, US 5104310, US 5004863 или US 5159135), включая методы погружения цветков с использованием Agrobacterium или других бактерий, которые могут переносить ДНК в клетки растения. Участок ДНК для переноса определяется последовательностями границы, причем промежуточная ДНК (T-ДНК) обычно вставляется в геном растения. В дальнейшем, интеграция T-ДНК представляет собой относительно точный процесс, приводящих к нескольким реорганизациям. В тех разновидностях растений, в которых опосредованная Agrobacterium трансформация является эффективной, она является способом выбора благодаря легкой и определенной природе переноса гена. Предпочтительные векторы трансформации Agrobacterium способны к репликации в Е. coli, так же как Agrobacterium, позволяя осуществить необходимые манипуляции, как было описано (Klee et al., в Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, New York, p. 179-203 (1985)).
Способы ускорения, которые могут применяться, включают, например, баллистическую трансфекцию и т.п. Один из примеров способа доставки трансформирующих молекул нуклеиновых кислот в клетки растения представляет собой баллистическую трансфекцию. Данный способ рассмотрен Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Небиологические частицы (микрочастицы) в нем могут быть покрыты нуклеиновыми кислотами и доставлены в клетки движущей силой. Примеры частиц включают состоящие из вольфрама, золота, платины и т.п. Конкретное преимущество баллистической трансфекции, в дополнение к тому, что она является эффективным средством воспроизводимой трансформации однодольных, является то, что не требуется ни выделения протопластов, ни восприимчивости к инфекции Agrobacterium.
В другом альтернативном варианте реализации пластиды могут быть стабильно трансформированы. Способы, раскрытые для трансформации пластиды в высших растениях, включают доставку с помощью генной пушки частицы ДНК, содержащей селекционный маркер, и нацеливание ДНК на геном пластиды посредством гомологичной рекомбинации (US 5451513, US 5545818, US 5877402, US 5932479 и WO 99/05265).
Другие способы превращения клетки могут также применяться и включают, без ограничения, введение ДНК в растения прямым переносом ДНК в пыльцу, прямой инъекцией ДНК в репродуктивные органы растения или прямой инъекцией ДНК в клетки незрелых эмбрионов с последующей регидратацией высушенных эмбрионов.
Регенерация, развитие и культивирование растений из одинарных трансформантов протопласта растения или из различных трансформированных эксплантов хорошо известны из уровня техники (Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif. (1988)). Такая регенерация и процесс роста обычно включают стадии селекции трансформированных клеток, культивирования таких индивидуальных клеток через обычные стадии эмбрионального развития, в том числе, стадию укоренения саженца. Трансгенные эмбрионы и семена регенерируют подобным образом. Полученные трансгенные укоренившиеся побеги в дальнейшем высаживают в подходящую среду для роста растения, такую как грунт.
Развитие или регенерация растений, содержащих чужеродный, экзогенный ген, хорошо известны из уровня техники. Предпочтительно регенерируемые растения являются самоопыляющимися, чтобы обеспечить гомозиготные трансгенные растения. В другом случае пыльцу, полученную от регенерируемых растений, скрещивают с выращенными из семян растениями важных с агрономической точки зрения линий. С другой стороны, пыльца растений таких важных линий используется для опыления регенерируемых растений. Трансгенное растение по настоящему изобретению, содержащее желательную экзогенную нуклеиновую кислоту, культивируют с применением способов, хорошо известных специалисту в данной области.
Чтобы подтвердить присутствие трансгенов в трансгенных клетках и растениях, может быть осуществлена амплификация с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или анализ методом саузернблота, с применением способов, известных специалистам в данной области. Продукты экспрессии трансгенов могут быть обнаружены любым из множества путей, в зависимости от природы продукта, и включают вестерн-блот и ферментный анализ. Как только трансгенные растения получены, их можно выращивать для получения тканей или частей растения, содержащих желательный фенотип. Ткань растения или части растения могут быть собраны как урожай и/или собрано семя. Семя может служить источником выращивания дополнительных растений с тканями или частями, которые обладают желательными характеристиками.
Трансгенное растение, полученное с применением Agrobacterium или других способов трансформации, обычно содержит единственный генетический локус на одной хромосоме. Такие трансгенные растения могут носить название гемизиготных по введенному(ым) гену(ам). Более предпочтительным является трансгенное растение, гомозиготное по введенному(ым) гену(ам), т.е. трансгенное растение, которое содержит два дополнительных гена, один ген в таком же локусе на каждой хромосоме из пары хромосом. Гомозиготное трансгенное растение может быть получено путем самооплодотворения гемизиготного трансгенного растения, проращивания части полученных семян и анализа полученных растений на
- 48 037817 предмет присутствия целевого гена.
Кроме того, необходимо понимать, что два различных трансгенных растения, которые содержат два независимо сегрегирующих экзогенных гена или локуса, могут быть скрещены (спарены) с целью получения потомства, которое содержит оба набора генов или локусов. Самооплодотворение подходящего потомка F1 может давать растения, гомозиготные по обоим экзогенным генам или локусам. Обратное скрещивание с материнским растением и уничтожение нетрансгенного растения также рассматриваются, как вегетативное разведение. Описание других способов разведения, которые обычно используются для различных признаков и урожая, можно найти в Fehr, в Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).
Повышение уровней экзогенной РНК и стабилизированная экспрессия.
Супрессоры сайленсинга.
В варианте реализации растительная клетка, растение или часть растения содержат экзогенный полинуклеотид, кодирующий белок супрессора сайленсинга.
Посттранскрипциональный сайленсинг гена (ПТСГ) представляет собой специфичный для последовательности нуклеотидов механизм защиты, который может быть нацелен как на клеточные, так и на вирусные мРНК с целью разложения. ПТСГ возникает в растениях или грибах, стабильно или временно трансформированных чужеродной (гетерологичной) или эндогенной ДНК, и приводит к уменьшению аккумуляции молекул РНК, последовательность которых сходна с введенной нуклеиновой кислотой.
Широко изучен тот факт, что соэкспрессия супрессора сайленсинга с целевым трансгеном будет повышать уровни присутствующей в клетке РНК, которая транскрибирована из трансгена. Хотя это доказанный факт для клеток in vitro, значимые побочные эффекты наблюдаются во многих исследованиях соэкспрессии в цельных растениях. Более конкретно, как описано в Mallory et al. (2002), Chapman et al. (2004), Chen et al. (2004), Dunoyer et al. (2004), Zhang et al. (2006), Lewsey et al. (2007) и Meng et al. (2008) растения, экспрессирующие супрессоры сайленсинга, в общем под контролем конститутивных промоторов, часто являются фенотипически аномальными до такой степени, что они непригодны для коммерческого производства.
Недавно было обнаружено, что уровни молекул РНК могут быть увеличены и/или уровни молекул РНК могут быть стабилизированы на протяжении множества поколений посредством ограничения экспрессии супрессора сайленсинга семенем растения или его частью (WO 2010/057246). В настоящем документе белок-супрессор сайленсинга или БСС представляет собой любой полипептид, который может экспрессироваться в клетке растения, что повышает уровень продукта экспрессии другого трансгена в клетке растения, особенно в последующих поколениях, полученных от изначально трансформированного растения. В варианте реализации БСС представляет собой вирусный супрессор сайленсинга или его мутант. Большое количество вирусных супрессоров сайленсинга известно из уровня техники и включает, без ограничения, P19, V2, P38, Pe-Po и RPV-P0. В варианте реализации вирусный супрессор сайленсинга содержит последовательность аминокислот, представленную SEQ ID NO: 38, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 38, которая дополнительно обладает активностью супрессора сайленсинга.
В настоящем документе термины стабилизирующий экспрессию, стабильно экспрессируемый, стабилизированная экспрессия и их вариации обозначают уровень молекулы РНК, по существу такой же или превышающий уровень в растениях-потомках на протяжении следующих поколений, например по меньшей мере 3, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 поколений, по сравнению с изогенными растениями, которые не содержат экзогенного полинуклеотида, кодирующего супрессор сайленсинга. Однако данный(ые) термин(ы) не исключает(ю) возможности некоторого снижения уровней молекулы РНК в следующих поколениях по сравнению с предыдущим поколением, например снижение не менее 10% на поколение.
Супрессор может быть выбран из любого источника, например растения, вируса, млекопитающего, и т.п. См. WO 2010/057246 относительно перечня вирусов, из которых может быть получен супрессор, и обозначения белка (например, B2, P14 и т.д.) или кодирующего участка для супрессора из каждого конкретного вируса. Множественные копии супрессора могут быть использованы. Различные супрессоры могут использоваться совместно (например, в тандеме).
Молекулы РНК.
По существу любая молекула РНК, которую желательно экспрессировать в семени растения, может быть соэкспрессирована с супрессором сайленсинга. Кодируемые полипептиды могут принимать участие в метаболизме масла, крахмала, углеводов, питательных веществ и т.п. или могут быть ответственными за синтез белков, пептидов, жирных кислот, липидов, восков, масел, крахмалов, сахара, углеводов, вкусоароматических веществ, ароматических веществ, токсинов, каротиноидов, гормонов, полимеров, флавоноидов, запасаемых белков, феноловых кислот, алкалоидов, лигнина, таннинов, целлюлозы, гликопротеинов, гликолипидов и т.д., предпочтительно биосинтез или сборку ТАГ.
В конкретном примере растения вырабатывают повышенные уровни ферментов для продуцирования масла в растениях, например видах Brassica, таких как рапс, или подсолнечнике, сафлоре, льне, хлопчатнике, соевом бобе, Camelina или маисе.
- 49 037817
Уровни выработки ДЦ-ПНЖК.
Уровни ДЦ-ПНЖК или комбинации ДЦ-ПНЖК, вырабатываемые в рекомбинантной клетке или части растения, например семени, имеют большое значение. Уровни могут быть выражены как состав (в процентах) общих жирных кислот, которые представляют собой конкретные ДЦ-ПНЖК или группу родственных ДЦ-ПНЖК, например ω3 ДЦ-ПНЖК, или ω6 ДЦ-ПНЖК, или ОДЦ-ПНЖК, или другие, что может быть определено способами, известными из уровня техники. Кроме того, уровень может быть выражен как содержание ДЦ-ПНЖК, например как процент ДЦ-ПНЖК в сухой массе материала, содержащего рекомбинантные клетки, например процент от массы семени, который представляет ДЦ-ПНЖК. Необходимо понимать, что уровень ДЦ-ПНЖК, вырабатываемой в масличной культуре, может быть значительно более высоким в показателях содержания ДЦ-ПНЖК, чем в овоще или семени, которое не выращивалось для целей получения масла, хотя оба могут иметь сходный состав ДЦ-ПНЖК и оба могут использоваться в качестве источников ДЦ-ПНЖК для потребления человеком или животным.
Уровни ДЦ-ПНЖК могут быть определены любым из способов, известных в данной области. В предпочтительном способе общий липид извлекают из клеток, тканей или организмов и жирную кислоту превращают в метиловые эфиры перед анализом газовой хроматографией (ГХ). Такие методы описаны в Примере 1. Положение пика на хроматограмме может использоваться для идентификации каждой конкретной жирной кислоты, и площадь каждого пика интегрируют для определения количества. В настоящем документе, если не указано иное, процент конкретной жирной кислоты в образце определяют, выражая площадь пика указанной жирной кислоты как процент от общей площади пиков жирных кислот на хроматограмме. По существу, это соответствует массовому проценту (мас./мас.). Идентичность жирных кислот может быть подтверждена ГХ-МС. Общие липиды могут быть выделены методами, известными из уровня техники, для очистки фракций, например фракции ТАГ. Например, тонкослойная хроматография (ТСХ) может быть выполнена в аналитическом масштабе, чтобы отделить ТАГ от других фракций липида, таких как ДАГ, ацил-КоА или фосфолипид, для того, чтобы определить состав жирных кислот конкретно для ТАГ.
В одном варианте реализации общая сумма АРК, ЭПК, ДНК и ДГК в жирных кислотах экстрагированного липида составляет от около 21 до около 40% общих жирных кислот в клетке. В дальнейшем варианте реализации общие жирных кислот в клетке содержат менее 1% C20:1. В предпочтительных вариантах реализации экстрагируемый ТАГ в клетке содержит жирных кислот в количествах, указанных в настоящем документе. Каждая из возможных комбинаций признаков, определяющих липид, раскрытый в настоящем документе, также включена.
Дополнительно, уровень выработки ДЦ-ПНЖК в рекомбинантной клетке, растении или части растения, например семени, может быть выражен как процент превращения конкретного жирнокислотного субстрата в один или более жирнокислотных продуктов, который в настоящем документе дополнительно носит название эффективности превращения или эффективности фермента. Данный параметр основан на жирнокислотном составе липида, экстрагированного из клетки, растения, части растения или семени, т.е. количестве образованной ДЦ-ПНЖК (в том числе другой ДЦ-ПНЖК, полученной из нее), выраженном как процент от одного или более жирнокислотных субстратов (в том числе все другие жирные кислоты, полученные из него).
Общая формула для процента превращения:
100 х (сумма процентов продукта ДЦ-ПНЖК и всех продуктов, полученных из него)/(сумма процентов жирнокислотного субстрата и всех продуктов, полученных из него).
Относительно ДГК, например, это может быть выражено как соотношение уровня ДГК (в виде процента от общего содержания жирных кислот в липиде) к уровню жирнокислогного субстрата (например ОК, ЛК, АЛК, СДК, ЭТК или ЭПК) и всех продуктов, включая ДГК, полученных из субстрата. Процент превращения или эффективность превращения могут быть выражены для единой ферментной стадии в пути, а также для части или целого пути.
Специфическая эффективность превращения вычислена в настоящем документе по следующим формулам:
- 50 037817
1. ОК в ДГК = 100 X ( %ДГК)/(сумма % для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК,
АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).
2. ЛК в ДГК = 100 х ( %ДГК)/(сумма % для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).
3. АЛК в ДГК = 100 х ( %ДГК)/(сумма % для АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).
4. ЭПК в ДГК = 100 х ( %ДГК)/(сумма % для ЭПК, ДПК и ДГК).
5. ДПК в ДГК (эффективность А4-десатуразы) = 100 х ( %ДГК)/(сумма % для
ДПК и ДГК).
6. Эффективность А12-десатуразы = 100 х (сумма % для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма % для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).
7. Эффективность соЗ-десатуразы = 100 х (сумма % для АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма % ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).
8. ОК в АЛК = 100 х (сумма % для АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма % для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).
9. Эффективность А6-десатуразы (на ω3 субстрате АЛК) = 100 х (сумма % для СДК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/( % АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).
10. Эффективность А6-элонгазы (на ω3 субстрате СДК) = 100 х (сумма % для
ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма % для СДК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).
11. Эффективность Д5-десатуразы (на ω3 субстрате ЭТК) = 100 х (сумма % для ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма % для ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).
12. Эффективность А5-элонгазы (на ω3 субстрате ЭПК) = 100 х (сумма % для
ДПК и ДГК)/(сумма % для ЭПК, ДПК и ДГК).
Жирнокислотный состав липида, предпочтительно масла из семян, по изобретению также отличается соотношением ω6 жирных кислот: ω3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот, для любых общих ω6 жирных кислот:общих ω3 жирных кислот или для новых ω6 жирных кислот : ω3 новых жирных кислот. Термины общие ω6 жирные кислоты, общие ω3 жирные кислоты, новые ω6 жирные кислоты и новые ω3 жирные кислоты имеют значения, определенные в настоящем документе. Соотношения вычисляют на основе состава жирных кислот в липиде, экстрагированном из клетки, растения, части растения или семени липида, способом, пример которого приведен в настоящем документе. Желательно присутствие в липиде более высокого уровня ω3 жирных кислот, чем ω6 жирных кислот, и таким образом соотношение ω6: ω3 менее 1,0 является предпочтительным. Соотношение 0,0 указывает на полное отсутствие определенных ω6 жирных кислот; соотношение 0,03 было достигнуто. Такие низкие значения соотношения могут быть достигнуты посредством сочетанного использования Δ6-десатуразы с предпочтением в отношении субстрата ω3, вместе с ω3-десатуразой, особенно грибковой ω3-десатуразой, такой как ω3-десатураза Pichia pastoris, пример которого приведен в настоящем документе.
Дополнительно, выход ДЦ-ПНЖК на массу семени может быть вычислен на основании общего содержания масла в семени и %ДГК и/или ДПК в масле. Например, если содержание масла в семени рапса составляет около 40% (мас./мас.), и около 12% от общего содержания жирных кислот в масле составляет ДГК, содержание ДГК в семени составляет около 4,8% или около 48 мг на 1 г семени. Как раскрыто в Примере 2, содержание ДГК в семени Arabidopsis, содержащем около 9% ДГК, в котором содержание масла ниже, чем в рапсе, составляло 25 мг/г семени. При содержании ДГК около 21%, семя рапса или семя Camelina sativa имеет уровень ДГК около 84 мг на 1 г семени. В настоящем изобретении таким образом раскрываются растения Brassica napus, B. juncea и Camelina sativa и полученные из них семена, которые содержат по меньшей мере около 80 мг или по меньшей мере около 84 мг ДГК на 1 г семени. Содержание влажности в семени стандартное для собранного в процессе сбора урожая зрелого семени после сушки (4-15% влажности). В изобретении также раскрывается способ получения масла, включающий получение семени и извлечение масла из семени, применение масла и способы получения семени, включающие сбор урожая семян с растений по изобретению.
- 51 037817
Кроме того, может быть вычислено количество ДГК и/или ДПК, вырабатываемое на 1 га, если выход семени с 1 га гектара известен или может быть оценен. Например, рапс в Австралии обычно дает около 2,5 тонны семени на 1 га, что при содержании масла 40% дает около 1000 кг масла. При содержании ДГК и/или ДПК 20,1% в конечном масле это обеспечивает около 200 кг ДГК и/или ДПК на 1 га. Если содержание масла снижается на 50%, это все еще обеспечивает около 100 кг ДГК и/или ДПК на 1 га.
Полученные на сегодняшний день доказательства свидетельствуют о том, что некоторые десатуразы, гетерологично экспрессируемые в дрожжах или растениях, обладают относительно низкой активностью в комбинации с некоторыми элонгазами. Данную ситуацию можно улучшить, придавая десатуразе способность использовать форму ацил-КоА жирной кислоты в качестве субстрата в синтезе ДЦ-ПНЖК, и это считается предпочтительным в рекомбинантных клетках, особенно в клетках растения. Особенно предпочтительная комбинация для эффективного синтеза ДГК и/или ДПК представляет собой грибковую ω3-десатуразу, например, такую как ω3-десатурαза Pichia pastoris (SEQ ID NO: 6), которая представляет собой Δ6-десатурαзу с предпочтением в отношении ω3 ацильных субстратов, например, такую как Δ6-десатураза Micromonas pusilla (SEQ ID NO: 9), или ее варианты с идентичностью последовательности аминокислот по меньшей мере 95%.
В настоящем документе термин по существу не содержащий означает, что композиция (например, липид или масло) содержит небольшое количество (например, менее чем около 0,5%, менее чем около 0,25%, менее чем около 0,1% или менее чем около 0,01%) или не содержит определенного компонента. В варианте реализации по существу не содержащий означает, что компонент невозможно обнаружить с помощью шаблонной методики анализа, например конкретная жирная кислота (например, ω6докозапентаеновая кислота) не может быть обнаружена с помощью газовой хроматографии, как в общих чертах описано в Примере 1.
Получение масел.
Методы, которые шаблонно практикуются в данной области, могут применяться для выделения, обработки и анализа масел, продуцированных клетками, растениями, семенами и т.п. по настоящему изобретению. Обычно семени растения термически обрабатывают, прессуют и экстрагируют, чтобы продуцировать неочищенное масло, которое далее дегуммируют, рафинируют, отбеливают и дезодорируют. В общем, методы измельчения семени известны из уровня техники. Например, семена масличных культур могут быть смягчены посредством обрызгивания их водой для повышения содержания влажности, например, до 8,5% и провальцованы с помощью гладкого валика с щелями размером 0,23-0,27 мм. В зависимости от вида семени, перед измельчением можно не добавлять воду. Применение нагревания инактивирует ферменты, облегчает дальнейший разрыв клетки, объединение масляных капелек и обеспечивает агломерацию частиц белка, все из этого упрощают процесс экстракции.
В варианте реализации большинство масла из семени высвобождается при пропускании сквозь винтовой пресс. Жмых, выходящий из винтового пресса, в дальнейшем экстрагируют, например, гексаном с использованием колонки с сопроводительным теплоконтролем. Альтернативно, неочищенное масло, полученное в ходе операции прессования, может быть пропущено сквозь резервуар для осаждения с проволочным дренажным верхом с прорезями, чтобы удалить твердые вещества, которые попадают в масло в ходе операции прессования. Осветленное масло может быть пропущено сквозь рамный и фильтр-пресс для удаления любых оставшихся тонких механических включений. При желании, масло после процесса экстракции может быть объединено с осветленным маслом, с получением смешанного сырого масла.
Как только растворитель десорбирован из неочищенного масла, прессованные и экстрагированные порции объединяют и обрабатывают обычными процедурами обработки масла. В настоящем документе термин очищенный используемый в связи с липидом или маслом по изобретению обычно означает, что экстрагированный липид или масло прошли одну или более стадий обработки, которые повышают степень чистоты липидного/масляного компонента. Например, стадия очистки может включать одно или более или все из группы, состоящей из: дегуммирования, дезодорирования, отбеливания, сушки и/или фракционирования экстрагированного масла. Однако в настоящем документе термин очищенный не включает процесс переэтерификации или другой процесс, модифицирующий состав жирных кислот липида или масла по изобретению для увеличения содержания ДГК как процента от общего содержания жирных кислот. Другими словами, состав жирных кислот очищенного липида или масла по существу такой же, как состав неочищенного липида или масла.
Дегуммирование.
Дегуммирование представляет собой раннюю стадию рафинации масел, и его основная цель состоит в удалении из масла большинства фосфолипидов, которые могут присутствовать, как около 1-2% от общего экстрагированного липида. Добавление к неочищенному маслу 2% воды, обычно содержащей фосфорную кислоту, при 70-80°C приводит к отделению большинства фосфолипидов, в сопровождении следовых металлов и пигментов. Нерастворимый материал, который удаляется, в основном представляет собой смесь фосфолипидов и триацилглицеридов и также известен как лецитин. Дегуммирование может выполняться посредством добавления концентрированной фосфорной кислоты к неочищенному маслу из семян, чтобы перевести неспособные к гидратации фосфатиды в способную к гидратации форму и обра- 52 037817 зовать хелаты металлов, которые присутствуют в незначительных количествах. Смолу отделяют от масла из семян центрифугированием.
Щелочная рафинация.
Щелочная рафинация представляет собой один из способов очистки для обработки неочищенного масла, который иногда также называют нейтрализацией. Она обычно следует за дегуммированием и предшествует отбеливанию. После дегуммирования масло из семян может быть обработано добавлением достаточного количества раствора щелочи, чтобы оттитровать все жирные кислоты и фосфорные кислоты, с последующим удалением образовавшегося мыла.
Подходящие щелочные материалы включают натрия гидроксид, калия гидроксид, натрия карбонат, лития гидроксид, кальция гидроксид, кальция карбонат и аммония гидроксид. Данный способ обычно осуществляют при комнатной температуре с удалением фракции свободных жирных кислот. Мыло удаляют центрифугированием или экстракцией в растворитель для мыла, и нейтрализованное масло промывают водой. При необходимости, избыток щелочи в масле может быть нейтрализован подходящей кислотой, такой как хлористоводородная кислота или серная кислота.
Отбеливание.
Отбеливание представляет собой способ очистки, при котором масла нагревают до 90-120°C, выдерживая при этой температуре в течение 10-30 мин в присутствии отбеливающей глины (0,2-2,0%) и в отсутствие кислорода, в атмосфере азота или пара или в вакууме. Данная стадия обработки масла разработана таким образом, чтобы удалять нежелательные пигменты (каротиноиды, хлорофилл, госсипол, и т.д.), причем способ дополнительно удаляет продукты окисления, следовые металлы, соединения серы и следы мыла.
Дезодорирование
Дезодорирование представляет собой обработку масел и жиров при высокой температуре (200260°C) и низком давлении (0,1-1 мм рт. ст.). Это обычно достигается посредством введения пара в масло из семян со скоростью около 0,1 мл/мин/100 мл масла из семян. Около через 30 мин орошения маслу из семян дают остыть под вакуумом. Масло из семян обычно переносят в стеклянный контейнер и пропускают аргон, после чего хранят при низких температурах. Такая обработка улучшает цвет масла из семян и удаляет большинство летучих субстанций или пахучих соединений, включая оставшиеся свободные жирные кислоты, моноацилглицериды и продукты окисления.
Винтеризация.
Винтеризация представляет собой способ, иногда применяемый в коммерческом производстве масел с целью разделения масел и жиров на твердые (стеарин) и жидкие (олеин) фракции посредством кристаллизации при температурах ниже температуры окружающей среды. Первоначально его применяли к хлопковому маслу для получения продукта, не содержащего твердых веществ. Обычно данный способ применяют для уменьшения содержания насыщенных жирных кислот в масле.
Переэтерификация.
В данном документе переэтерификация обозначает способ обмена жирных кислот в пределах и между ТАГ или переноса жирных кислот на другой спирт с образованием эфира. Это может включать первичное высвобождение жирных кислот из ТАГ в форме свободных жирных кислот или прямое получение эфиров жирных кислот, предпочтительно метиловых эфиров или этиловых эфиров жирных кислот. В ходе реакции переэтерификации ТАГ со спиртом, таким как метанол или этанол, алкильная группа спирта образует эфирную связь с ацильными группами (включая ДГК) ТАГ. В случае сочетания со способом фракционирования переэтерификация может применяться для модификации жирнокислотного состава липидов (Marangoni et al., 1995). Для переэтерификации могут использоваться химические (например, катализируемые сильной кислотой или основанием) или ферментные средства, причем последние включают липазы, которые могут быть специфичными для положения (sn-1/3 или sn-2 специфичными) жирной кислоты в ТАГ или с предпочтением в отношении некоторых жирных кислот по сравнению с другими (Speranza et al., 2012). Фракционирование жирных кислот с целью повышения концентрации ДЦ-ПНЖК в масле может быть осуществлено любым из способов, известных из уровня техники, таких как, например, кристаллизация вымораживанием, образование комплексов с использованием мочевины, молекулярная дистилляция, экстракция сверхкритической жидкостью, противоточная хроматография и образование комплексов с ионом серебра. Образование комплексов с мочевиной является предпочтительным способом вследствие его простоты и эффективности с точки зрения снижения уровня насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот в масле (Gamez et al., 2003). Вначале ТАГ в масле расщепляют на составляющие жирные кислоты, часто в форме эфиров жирных кислот, посредством гидролиза в условиях катализа кислотой или основанием, в результате чего один моль ТАГ реагирует по меньшей мере с 3 моль спирта (например, этанола для этиловых эфиров или метанола для метиловых эфиров), причем используют избыток спирта, чтобы позволить разделение образовавшихся алкиловых эфиров и глицерина, который также образуется, или с помощью липаз. Такие свободные жирные кислоты или эфиры жирных кислот, которые обычно остаются в неизмененном виде в составе жирных кислот после обработки, в дальнейшем могут быть смешаны с этанольным раствором мочевины для образования комплексов. Насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты легко образуют комплексы с мочевиной, кристалли- 53 037817 зуются при охлаждении и впоследствии могут быть удалены фильтрацией. Фракция, не образовавшая комплексы с мочевиной, таким образом, обогащается ДЦ-ПНЖК.
Продукты питания (корма).
Настоящее изобретение включает композиции, которые могут использоваться в качестве продуктов питания (кормов). Для целей настоящего изобретения продукты питания (корма) включают любой продукт питания или препарат для потребления человеком или животным, который при попадании в организм (а) служит целям питания или образования тканей или снабжения энергией и/или (б) поддерживает, восстанавливает или способствует надлежащему пищевому статусу или метаболической функции. Продукты питания (корма) по изобретению включают питательные составы для младенцев и/или детей младшего возраста, такие как, например, молочная смесь для детского питания, и жмых по изобретению.
Продукты питания (корма) по изобретению включают, например, клетку по изобретению, растение по изобретению, часть растения по изобретению, семя по изобретению, экстракт по изобретению, продукт способа по изобретению, продукт процесса ферментации по изобретению или композицию вместе с подходящим(и) носителем(ями). Термин носитель используется в самом широком смысле и включает любой компонент, который может иметь или не иметь пищевого значения. Как будет понятно квалифицированному специалисту, носитель должен быть пригодным для использования (или используемым в достаточно низкой концентрации) в продукте питания (корме), таким образом, что он не оказывает вредного влияния на организм, потребляющий продукт питания (корм).
Продукт питания (корм) по настоящему изобретению включает масло, эфир жирной кислоты или жирную кислоту, полученную прямо или косвенно с применением способов, клеток или растений, раскрытых в настоящем документе.
Дополнительно, композиция может находиться в твердой или жидкой форме. Кроме того, композиция может содержать съедобные микронутриенты, белок, углеводы, витамины и/или минералы в количествах, желательных для конкретного применения. Количества этих ингредиентов будут варьировать в зависимости от того, предназначается ли композиция для применения у здоровых индивидуумов или для применения у индивидуумов с особыми потребностями, например индивидуумов, страдающих метаболическими расстройствами, и т.п.
Примеры подходящих носителей, имеющих пищевое значение, включают, без ограничения, макронутриенты, например съедобные жиры, углеводы и белки. Примеры таких съедобных жиров включают, без ограничения, кокосовое масло, масло бурачника, грибное масло, масло черной смородины, соевое масло, а также моно- и диглицериды. Примеры таких углеводов включают (без ограничения) глюкозу, съедобную лактозу и гидролизованный крахмал. Дополнительно, примеры белков, которые могут использоваться в питательном составе по изобретению, включают (без ограничения) белки сои, обработанную электродиализом сыворотку, обработанное электродиализом снятое молоко, молочную сыворотку или гидролизаты указанных белков.
Относительно витаминов и минералов, следующее может быть добавлено к композициям пищевых продуктов (кормов) по настоящему изобретению: кальций, фосфор, калий, натрий, хлорид, магний, марганец, железо, медь, цинк, селен, йод, витамины A, E, D, C и витамины группы B. Кроме того, другие такие витамины и минералы могут быть добавлены.
Компоненты, используемые в композициях продукта питания (корма) по настоящему изобретению, могут быть полуочищенными или очищенными. Под полуочищенным или очищенным подразумевается материал, который получен посредством очистки природного материала или синтеза de novo.
Дополнительно, композиция пищевого продукта (корма) по настоящему изобретению может быть добавлена к пище даже в том случае, если нет необходимости в добавках к рациону. Например, композиция может быть добавлена к пище любого типа, в том числе (без ограничения) маргарин, модифицированное масло, сыры, молоко, йогурт, шоколад, конфеты, легкие закуски, масла для салатов, масла для приготовления пищи, кулинарные жиры, мясо, рыба и напитки.
Дополнительно, жирные кислоты, продуцированные в соответствии с настоящим изобретением или клетками-хозяевами, трансформированными таким образом, что в них содержатся и экспрессируются целевые гены, могут использоваться в качестве пищевых добавок для животных с целью модификации состава жирных кислот в ткани, яйце или молоке животного до более желательного для потребления человеком или животным. Примеры таких животных включают овцу, крупный рогатый скот, лошадей, домашнюю птицу, например кур, и т.п.
К тому же, продукты питания (корма) по изобретению могут использоваться в аквакультуре с целью повышения уровней жирных кислот в организме рыбы или ракообразных, таких как, например, креветки, для потребления человеком или животным. Предпочтительно рыба является лососем.
Предпочтительные продукты питания (корма) по изобретению представляют собой растения, семя и другие части растения, например листья и стебли, которые непосредственно могут использоваться в качестве пищи или корма для человека или животных. Например, животные могут непосредственно пастись на таких растениях, выращиваемых в поле, или им могут скармливаться более точные количества в ходе контролируемого кормления. Изобретение включает применение таких растений и частей растения в качестве пищи для повышения уровней ДЦ-ПНЖК в организме человека и животных.
- 54 037817
Композиции.
Настоящее изобретение также включает композиции, особенно фармацевтические композиции, содержащие одну или более жирных кислот и/или масел, полученных с применением способов по изобретению, предпочтительно в форме этиловых эфиров жирных кислот.
Фармацевтическая композиция может содержать одну или более жирных кислот и/или масел в комбинации со стандартным, известным, нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем, адъювантом или растворителем, таким как фосфатно-солевой буфер, вода, этанол, полиолы, растительные масла, увлажняющий агент или эмульсия, например эмульсия вода/масло. Композиция может находиться в жидкой или твердой форме. Например, композиция может находиться в форме таблетки, капсулы, проглатываемой жидкости или порошка, в инъекционной форме или в форме мази или крема для местного применения. Необходимая текучесть может поддерживаться, например, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и использования поверхностно-активных веществ. Кроме того, может быть желательным введение изотонических агентов, например сахара, натрия хлорида и т.п. Кроме таких инертных разбавителей, композиция может содержать адъюванты, такие как увлажнители, эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы.
Суспензии, в дополнение к активным соединениям, могут содержать суспендирующие агенты, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, сложные эфиры сорбита и полиоксиэтилен сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, мета-гидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант или смеси этих субстанций.
Твердые лекарственные формы, такие как таблетки и капсулы, могут быть получены с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Например, жирные кислоты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть таблетированы с обычными основами таблеток, такими как лактоза, сахароза и кукурузный крахмал, в комбинации со связующими веществами, такими как акация, кукурузный крахмал или желатин, дезинтегрантами, такими как картофельный крахмал или альгиновая кислота, и смазывающими веществами, такими как стеариновая кислота или магния стеарат. Капсулы могут быть получены путем объединения этих вспомогательных веществ в желатиновой капсуле с антиоксидантами и подходящей жирной(ыми) кислотой(ами).
Для внутривенного введения жирные кислоты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, или их производные могут быть введены в коммерческие препараты.
Типичные дозы конкретной жирной кислоты составляют от 0,1 мг до 20 г, при введении от 1 до 5 раз в день (до 100 г ежедневно) и предпочтительно находятся в интервале от около 10 мг до около 1, 2, 5 или 10 г ежедневно (в виде одной или нескольких доз). Как известно из уровня техники, желательно вводить по меньшей мере около 300 мг/день жирной кислоты, особенно ДЦ-ПНЖК. Однако необходимо понимать, что любое количество жирной кислоты будет благоприятным для субъекта.
Возможные способы введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают, например, энтеральный (например, пероральный и ректальный) и парентеральный. Например, жидкий препарат может быть введен перорально или ректально. Дополнительно, гомогенная смесь может быть полностью диспергирована в воде, предварительно смешанной в стерильных условиях с физиологически приемлемыми разбавителями, консервантами, буферами или пропеллентами для получения спрея или средства для ингаляций.
Дозы композиции для введения пациенту могут быть определены обычным специалистом в данной области и зависят от различных факторов, таких как масса тела пациента, возраст пациента, общее состояние здоровья пациента, анамнез пациента, иммунный статус пациента и т.п.
Дополнительно, композиции по настоящему изобретению могут применяться для косметических целей. Они могут добавляться к существующим косметическим композициям таким образом, что образуется смесь или жирная кислота, полученная в соответствии с настоящим изобретением, может использоваться в качестве единственного активного ингредиента в косметической композиции.
Примеры
Пример 1. Материалы и методы.
Экспрессия генов в клетках растения в системе временной экспрессии.
Экзогенные генетические конструкции экспрессируют в клетках растения в системе временной экспрессии, как по существу описано Voinnet et al. (2003) и Wood et al. (2009).
Анализ жирных кислот методом газовой хроматографии (ГХ).
МЭЖК анализируют методом газовой хроматографии с помощью газового хроматографа Agilent Technologies 7890A GC (Пало-Альто, Калифорния, СшА), оборудованного колонкой SGE-BPX70 (70% цианопропил полисилфенилин-силоксана, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мм) длиной 30 м, ПИД (плазменно-ионизационным детектором), инжектором с разделением/без разделения, а также серийным аутосемплером Agilent Technologies 7693 и инжектором. Гелий используют в качестве газа-носителя. Образцы вводят инжекцией в методе с разделением (соотношение 50:1) при температуре печи 150°C. После инжекции температуру печи поддерживают на уровне 150°C в течение 1 мин, затем повышают до 210°C со скоростью 3°С/мин, снова повышают до 240°C со скоростью 50°С/мин и окончательно поддерживают в течение 1,4 мин на уровне 240°C. Площадь пиков определяют с помощью про- 55 037817 граммного обеспечения Agilent Technologies ChemStation (версия Rev B.04.03 (16), Пало-Альто, Калифорния, США) на основании ответа известного количества внешнего стандарта GLC-411 (Nucheck) и внутреннего стандарта C17:0-ME.
Анализ липидов методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).
Общие липиды экстрагируют из лиофилизированных развивающихся семян через 12 дней после цветения (дпц) и зрелых семян после добавления известного количества три-С17:0-ТАГ в качестве внутреннего стандарта для количественной оценки. Экстрагированные липиды растворяют в 1 мл 10 мМ бутилированного гидрокситолуола в смеси бутанол/метанол (1:1, об./об.) на 5 мг сухого материала и анализируют с помощью жидкостного хроматографа серии Agilent 1200 с ЖХ и ионизацией электрораспылением с помощью ЖХ-МС 6410b с тремя квадрупольными линзами. Липиды хроматографически разделяют с использованием колонки Ascentis Express RP-Amide (50x2,1 мм, 2,7 мкм, Supelco) в режиме бинарного градиента со скоростью потока 0,2 мл/мин. Подвижные фазы: A) 10 мМ аммония формиата в смеси H2O:метанол:тетрагидрофуран (50:20:30 об./об./об.); B) 10 мМ аммония формиата в смеси H2O/метанол/тетрагидрофуран (5:20:75, об./об./об.). Перечни для мониторинга множественных реакций (ММР) основаны на следующих основных жирных кислотах: 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 18:4, 20:1, 20:2, 20:3, 20:4, 20:5, 22:4, 22:5, 22:6, с использованием энергии столкновения 30 B и фрагментора 60 B. Индивидуальные ТАГ согласно ММР идентифицируют на основании иона аммонизированного прекурсора и иона продукта, образованного в результате потери нейтральных частиц 22:6. Количество ТАГ определяют с использованием 10 мкМ внешнего стандарта тристеарина.
Определение профиля липидов с помощью ЖХ-МС.
Экстрагированные общие липиды были проанализированы с применением ЖХ серии Agilent 1200, соединенной с устройством для ионизации электрораспылением (Agilent, Пало-Альто, Калифорния, США). Инжекцию 5 мкл каждого экстракта общих липидов разделяли хроматографически с помощью ВЭЖХ колонки Ascentis Express RP-Amide 50x2,1 мм, 2,7 мкм (Sigma-Aldrich, Касл-Хилл, Австралия) с применением бинарного градиента со скоростью потока 0,2 мл/мин. Подвижные фазы: A) 10 мМ аммония формиата в H2O:метаноле:тетрагидрофуране (50:20:30, об./об./об.); B). 10 мМ аммония формиата в H2O:метаноле:тетрагидрофуране (5:20:75, об./об./об.). Выбранные нейтральные липиды (ТАГ и ДАГ) и фосфолипиды (ФЛ, в том числе ФХ, ФЭ, ФИ, ФС, ФА, ФГ) были проанализированы с помощью мониторинга множественных реакций (ММР) с применением энергии столкновения 30 B и энергии фрагментации 60 B. Нейтральные липиды исследовали на предмет следующих основных жирных кислот: 16:0 (пальмитиновая кислота), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1ω9 (олеиновая кислота, ОК), 18:2ω6 (линолевая кислота, ЛК), 18:3ω3 (α-линоленовая кислота, АЛК), 18:4ω3 (стеаридоновая кислота, СДК), 20:1, 20:2, 20:3, 20:4ω3, 20:5ω3, 22:4ω3, 22:5ω3, 22:6ω3, в то время как фосфолипиды сканировали на предмет наличия молекул C16, C18, C20 и C22 с двойными связями 0-3, 0-4, 0-5, 4-6 соответственно.
Отдельные ММР ТАГ были идентифицированы на основе аммонизированного иона-прекурсора и иона продукта, образованного в результате потери нейтронов 20:1, СДК, ЭПК и ДГК. ТАГ и ДАГ количественно определяли с применением 50 мкМ тристеарина и дистеарина в качестве внешних стандартов. ФЛ количественно определяли с использованием 10 мкМ внешних стандартов ди-18:0-ФХ, ди-17:0-ФА, ди-17:0-ФЭ, 17:0-17:1-ФГ, ди-18:1-ФИ и ди-17:0-ФС (Avanti Polar Lipids, Алабастер, Алабама, США). Для выбранных видов ТАГ, ДАГ и ФЛ проводили дальнейшее подтверждение с помощью МС/МС 6520 Q-TOF.
Определение профиля жирных кислот и содержания масла в семени.
Если необходимо определить содержание масла в семени, семена сушат в эксикаторе в течение 24 ч и около 4 мг семени переносят в стеклянный флакон емкостью 2 мл с покрытой Тефлоном навинчивающейся крышкой. 0,05 мг тригептадеканоина, растворенного в 0,1 мл толуола, добавляют во флакон в качестве внутреннего стандарта.
МЭЖК семени получают, добавляя 0,7 мл 1н. метанольного HCl (Supelco) во флакон, содержащий материал семени, кратковременно обрабатывают вихревым перемешиванием и инкубируют при 80°C в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры 0,3 мл 0,9% (мас./об.) раствора NaCl и 0,1 мл гексана добавляют во флакон и тщательно перемешивают в течение 10 мин в Heidolph Vibramax 110. МЭЖК собирают в стеклянную вставку емкостью 0,3 мл и анализируют методом ГХ с плазменноионизационным детектором (ПИД), как было упомянуто ранее.
Площадь пика отдельного МЭЖК вначале корректируют на основании ответа в виде площади пика известного количества таких же МЭЖК, присутствующих в коммерческом стандарте GLC-411 (NU-CHEK PREP, INC., США). GLC-411 содержит разные количества 31 жирной кислоты (мас.%), в интервале от C8:0 до C22:6. В случае жирных кислот, которые отсутствуют в стандарте, изобретатели использовали ответы в виде площади пика наиболее сходного МЭЖК. Например, ответ в виде площади пика МЭЖК 16:1d9 использовали для 16:1d7 и ответ МЭЖК C22:6 использовали для C22:5. Скорректированные значения площади пика используют для вычисления массы каждого МЭЖК в образце, в сравнении с массой внутреннего стандарта. Масло хранится в основном в форме ТАГ, и его массу вычисляют на основании массы МЭЖК. Общее количество моль глицерина определяют путем вычисления количе
- 56 037817 ства моль каждого МЭЖК и деления общего количества моль МЭЖК на три. Содержание ТАГ вычисляют как сумму глицерина и жирных ацильных фрагментов с использованием соотношения:
мас.% масла = 100 х ((41 х общее количество моль МЭЖК/3) + (общее количество грамм МЭЖК - (15 х общее количество моль МЭЖК)))/грамм семени, где 41 и 15 - молекулярная масса остатка глицерида и метильной группы соответственно.
Анализ содержания стеролов в образцах масла.
Образцы около по 10 мг масла, вместе с добавленной аликвотой C24:0 монола в качестве внутреннего стандарта, омыляют с помощью 4 мл 5% раствора KOH в 80% MeOH и нагревания до 80°C, выдерживания в течение 2 ч при этой температуре, в покрытой Тефлоном стеклянной пробирке с навинчивающейся крышкой. После охлаждения реакционной смеси добавляют 2 мл воды Milli-Q и стеролы экстрагируют 2 мл смеси гексан:дихлорметан (4:1, об./об.) при встряхивании и вихревом перемешивании. Смесь центрифугируют, экстракт стеролов извлекают и промывают 2 мл воды Milli-Q. Затем экстракт стеролов отделяют после встряхивания и центрифугирования. Экстракт упаривают в потоке газообразного азота и стеролы силилируют с использованием 200 мл N,O-бис-(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА) при нагревании до 80°C, выдерживая в течение 2 ч при этой температуре.
Для анализа стеролов методом ГХ/ГХ-МС производные стерол-О-триметилсилила (стерол-OTMSi) сушат в потоке газообразного азота на термоблоке при 40°C, а затем повторно растворяют в хлороформе или гексане непосредственно перед анализом методом ГХ/ГХ-МС. Производные стерол-OTMS анализируют газовой хроматографией (ГХ) с помощью газового хроматографа Agilent Technologies 6890A GC (Пало-Альто, Калифорния, США), оборудованного капиллярной колонкой из кварцевого стекла Supelco Equity™-1 (15 м х 0,1 мм внутренний диаметр, толщина пленки 0,1 мкм), ПИД и инжектором с расщеплением/без расщепления, а также серийным аутосемплером Agilent Technologies 7683B и инжектором. В качестве газа-носителя используют гелий. Инжекцию образцов осуществляют в режиме без расщепления при температуре печи 120°C. После инжекции температуру печи повышают до 270°C со скоростью 10°С/мин и в конце до 300°C со скоростью 5°С/мин. Площадь пиков определяют с помощью программного обеспечения Agilent Technologies ChemStation (Пало-Альто, Калифорния, США). Результаты ГХ содержат ошибку ±5% от значений площади пика отдельных компонентов.
Анализы методом ГХ-масс-спектрометрии (ГХ-МС) выполняют с помощью приборов для ГХ-МС Finnigan Thermoquest GCQ и Finnigan Thermo Electron Corporation, притом что обе системы оборудованы инжектором для введения проб непосредственно на колонку, и программного обеспечения Thermoquest Xcalibur (Остин, Техас, США). Каждый из приборов для ГХ оборудован капиллярной колонкой, полярность которой сходна с описанной выше. Индивидуальные компоненты идентифицируют, используя данные масс-спектрометрии и сравнивая данные времени удерживания с полученными для аутентичных и лабораторных стандартов. Полную методику холостого анализа осуществляют параллельно с серией образцов.
Условия ОТ-ПЦР.
Амплификацию методом ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) обычно осуществляют с использованием системы ОТ-ПЦР Superscript III One-Step (Invitrogen) в объеме 25 мкл, с использованием 10 пмоль прямого праймера и 30 пмоль обратного праймера, MgSO4 до конечной концентрации 2,5 мМ, 400 нг общей РНК с буфером и нуклеотидными компонентами согласно инструкциям производителя. Типичные температурные режимы представляли собой: 1 цикл при температуре 45°C в течение 30 мин для возникновения обратной транскрипции; затем 1 цикл при температурю 94°C в течение 2 мин и далее 40 циклов с температурой 94°C в течение 30 с, 52°C в течение 30 с, 70°C в течение 1 мин; затем 1 цикл при температуре 72°C в течение 2 мин перед охлаждением реакционных смесей до 5°C.
Определение количества копий трансгенов с помощью цифровой ПЦР.
Для определения количества копий трансгенов в трансгенном растении применяли метод ПЦР, как описано ниже. Кроме того, данный метод может быть применен для определения, является ли растение трансгенным по генетическим конструкциям, описанным в данном документе. Около 1 см2 листовой ткани получают от каждого индивидуального растения и помещают в коллекционную микропробирку (Qiagen). Далее образцы сушат вымораживанием в течение 24-48 ч. Для разрушения образцов с целью экстракции ДНК к каждому высушенному образцу добавляют шарики из нержавеющей стали и пробирки встряхивают на лизаторе для тканей Qiagen. 375 мкл буфера для экстракции (0,1 М Трис-HCl, рН 8, 0,05 М ЭДТА, рН 8 и 1,25% НДС) добавляют в каждую пробирку, смеси инкубируют при 65°C в течение 1 ч и затем охлаждают перед добавлением 187 мкл 6 М аммония ацетата в каждую пробирку (4°C) при тщательном перемешивании. Далее образцы центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин. Супернатант из каждой пробирки переносят в новые микропробирки, каждая из которых содержит 220 мкл изопропанола, для осаждения ДНК при комнатной температуре в течение 5 мин. ДНК собирают центрифугированием пробирок при 3000 об/мин в течение 30 мин, гранулы ДНК промывают 320 мкл 70% этанола и сушат перед ресуспендированием ДНК в 225 мкл воды. Нерастворенный материал гранулируют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин и 150 мкл каждого супернатанта переносят на 96-луночные планшеты для длительного хранения.
- 57 037817
Для эффективного и количественного проведения цифровой ПЦР (ddPCR) ДНК расщепляют рестрикционными ферментами перед проведением реакций амплификации, чтобы гарантировать физическое разделение нескольких копий трансгенов или множественных инсерций. Таким образом, аликвоты препаратов ДНК расщепляют с помощью EcoRI и BamHI, вместе взятых, в объеме 20 мкл, с применением 10х буфера EcoRI, 5 мкл ДНК и около 4 единиц каждого фермента на образец, с инкубацией протяжении на ночи при 37°C.
Праймеры, применяемые в этих реакциях ПЦР, были сконструированы с применением программного обеспечения Primer3, чтобы подтвердить, что предсказано отсутствие взаимодействия между праймерами для референтных генов и генов-мишеней или такое взаимодействие не создает проблем при используемых условиях. Референтным геном в анализе был ген рапса Hmg (группа высокой подвижности), присутствующий в одном экземпляре в геноме рапса (Weng et al., 2004). Поскольку рапс является аллотетраплоидом, было допущено наличие 4 копий гена Hmg, т.е. 2 аллелей каждого из двух генов, в Brassica napus. В реакциях референтного гена применяли пару праймеров и содержащий двойную метку зонд, как указано ниже:
Смысловой праймер, GCGAAGCACATCGAGTCA (SEQ ID NO: 50);
Антисмысловой праймер, Can12 GGTTGAGGTGGTAGCTGAGG (SEQ ID NO: 51);
Hmg-P3 5'-Hex/TCTCTAC/zen/CCGTCTCACATGACGC/3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO: 52).
Размер продукта амплификации составлял 73 пары оснований.
В одной реакции амплификации гена-мишени, в ходе которой обнаруживали ген селекционного маркера ФФТ для скрининга всех трансгенных растений, смысловой праймер представлял собой Can17, ATACAAGCACGGTGGATGG (SEQ ID NO: 53); антисмысловой праймер, Can18 TGGTCTAACAGGTCTAGGAGGA (SEQ ID NO: 54); зонд, PPT-P3 5'-/FAM/TGGCAAAGA/zen/GATTTCGAGCTTCCTGC/3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO: 55).
Размер данного продукта амплификации гена-мишени составлял 82 пары оснований. В некоторых случаях параллельно выполняли второй анализ гена-мишени, чтобы обнаружить частичные инсерции T-ДНК. В ходе такого второго анализа обнаруживали участок гена Δ6-десатуразы с помощью смыслового праймера, Can23 CAAGCACCGTAGTAAGAGAGCA (SEQ ID NO: 56), антисмыслового праймера, Can24 CAGACAGCCTGAGGTTAGCA (SEQ ID NO: 57); зонда, D6des-P3 5'-/FAM/TCCCCACTT/zen/CTTAGCGAAAGGAACGA/3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO: 58). Размер данного продукта амплификации гена-мишени составлял 89 пар оснований. В реакциях шаблонно использовали 2 мкл расщепленных препаратов ДНК. Состав реакционной смеси на образец: референтный смысловой праймер (10 пМ), 1 мкл; референтный антисмысловой праймер (10 пМ), 1 мкл; зонд референтного гена (10 пМ), 0,5 мкл; смысловой праймер гена-мишени (10 пМ), 1 мкл; антисмысловой праймер гена-мишени (10 пМ), 1 мкл; зонд гена-мишени (10 пМ), 0,5 мкл; смесь реактивов ddPCR, 12,5 мкл; вода 5,5 мкл, в общем объеме 25 мкл.
Далее смеси помещали в генератор капелек QX100, который делил каждый образец на 20000 капелек в диапазоне нл. Это проделывали в 8-луночных картриджах до тех пор, пока все образцы не были обработаны и перенесены на 96-луночный ПЦР планшет. Затем планшет опечатывали термоусадочной прокалываемой фольгой с помощью устройства для запечатывания планшетов. После этого образцы обрабатывали со следующими условиями реакции: 95°C, 10 мин, подъем со скоростью 2,5°C/c; затем 39 циклов при 94°C, 30 с подъем со скоростью 2,5°C/c; 61°C, 1 мин, подъем со скоростью 2,5°C/c; 98°C, 10 мин, с последующим охлаждением до 12°C. После реакций амплификации ДНК в капельках планшеты помещали на устройство для считывания капелек QX100, с помощью которого анализировали каждую капельку индивидуально с применением двухцветной системы обнаружения (набор для обнаружения FAM или Hex). Цифровые данные ПЦР капельки рассматривали как 1-D график, на котором каждая капелька образца была нанесена на график интенсивности флуоресценции, или 2-D график, на который наносили флуоресценцию (FAM) против флуоресценции (Hex) для каждой капельки. С помощью программного обеспечения измеряли количество положительных и отрицательных капелек для каждого флюорофора (FAM или Hex) в каждом образце. Далее с помощью программного обеспечения аппроксимировали фракцию положительных капелек к алгоритму Пуассона, чтобы определить концентрацию целевой молекулы ДНК в единицах копий/мкл входа. Вариацию количества копий вычисляли с применением формулы CNV - (A/B) х Nb, где концентрация A = концентрация гена-мишени, B = концентрация референтного гена и Nb = 4, количество копий референтного гена в геноме.
Оценка жизнеспособности пыльцы.
Флуоресцеина диацетат (ФДА) растворяли в ацетоне в концентрации 2 мг/мл с получением запасного раствора. Разведения ФДА готовили непосредственно перед использованием, по каплям добавляя запасной раствор ФДА к 2 мл раствора сахарозы (0,5 М) до насыщения, на которое указывало появление устойчивой мутности.
Пропидия йодид (ПЙ) растворяли в стерильной дистиллированной воде в концентрации 1 мг/мл с получением запасного раствора. Непосредственно перед использованием 100 мкл запасного раствора добавляли к 10 мл стерильной дистиллированной воды с получением рабочего раствора. Для проверки
- 58 037817 соотношения жизнеспособной и нежизнеспособной пыльцы запасные растворы ПЙ и ФДА смешивали в соотношении 2:3.
Растения рапса и горчицы, трансгенные и дикого типа, выращивали в стандартных условиях в теплице при 22±2°C с фотопериодом 16 ч в сутки. Зрелые бутоны, которые были готовы раскрыться на следующий день, маркировали и собирали на следующее утро в 9-10 ч. Пыльцу из раскрытых цветков окрашивали смесью ФДА/ПЙ и визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica MZFLIII. Использовали эмиссионный фильтр с пропусканием в длинноволновой области спектра GFP-2 510 нм (пропускание красного и зеленого света) с фильтром возбуждения 480/40 нм для обнаружения жизнеспособной и нежизнеспособной пыльцы. Нежизнеспособная пыльца, которая захватывала краситель ПЙ, имела красный цвет под флуоресцентным микроскопом, тогда как жизнеспособная пыльца при окрашивании ПИ и ФДА имела ярко-зеленый цвет.
Пример 2. Стабильная экспрессия трансгенных путей ДГК в семенах Arabidopsis thaliana.
Конструкция бинарного вектора.
Бинарные векторы pJP3416-GA7 (также обозначены в данном описании как GA7, описанные в WO 2013/185184) и pJP3404, каждый из которых содержит 7 гетерологичных генов биосинтеза жирных кислот, кодирующих 5 десатураз и 2 элонгазы, и селекционный маркер для растений между повторами левой и правой границ T-ДНК, присутствующими в каждом векторе (фиг. 2 и 3). В SEQ ID NO: 1 раскрыта нуклеотидная последовательность участка T-ДНК pJP3416-GA7 от правой до левой граничных последовательностей. Обе генетические конструкции содержат растительные кодон-оптимизированные гены, кодирующие Δ12-десатуразу Lachancea kluyveri (содержит нуклеотиды 14143-16648 из SEQ ID NO: 1), ω3-десатуразу Pichia pastoris (содержит нуклеотиды 7654-10156 из SEQ ID NO: 1), Δ6-десатуразу Micromonas pusilia (содержит нуклеотиды 226-2309 из SEQ ID NO: 1), Δ5- и Δ4-десатуразы Pavlova salina (содержат нуклеотиды 4524-6485 и 10157-14142 из SEQ ID NO: 1 соответственно) и Δ6- и Δ5-элонгазы Pyramimonas cordata (содержит нуклеотиды 2310-4523 и 17825-19967 из SEQ ID NO: 1 соответственно).
Каждый из 7 кодирующих участков в конструкциях находится под контролем специфичного для семени промотора, причем используются три различных промотора, а именно укороченный промотор напина Brassica napus (pBnFP1), промотор Arabidopsis thaliana FAE1 (pAtFAE1) и промотор конлинина 1 Linum usitatissimum (pLuCnl1). Семь генов биосинтеза жирных кислот совместно кодируют полный путь синтеза ДГК, сконструированный с целью превращения 18:1Δ9 (олеиновая кислота) в 22:6Δ4,7,10,13,16,19 (ДГК). Оба бинарных вектора содержат селекционный маркер для растений BAR, кодирующий участок, функционально связанный с промотором вируса мозаики цветной капусты 35S (CaMV), который содержит удвоенный участок энхансера, а также с терминатором транскрипции-участком полиаденилирования nos3' A. tumefaciens. Селекционный маркер для растений расположен смежно с левой границей T-ДНК, т.е. дистально на T-ДНК относительно ориентации переноса T-ДНК в клетки растения. Это повышает вероятность того, что частичный перенос T-ДНК, который, вероятно, не включает ген селекционного маркера, не пройдет селекцию. Каждый из pJP3416-GA7 и pJP3404 содержит источник репликации RiA4 из Agrobacterium rhizogenes (Hamilton, 1997).
Конструкция GA7 также содержит две последовательности участка прикрепления к матриксу Rb7 (УПМ) Nicotiana tabacum, как описано Hall et al. (1991). Последовательности УПМ, иногда называемые ядерными участками прикрепления, известны как специфично связывающиеся с ядерным матриксом in vitro и могут опосредовать связывание хроматина с ядерным матриксом in vivo. Считается, что УПМ уменьшают сайленсинг трансгена. В pJP3416-GA7 УПМ также вставлены и расположены в пределах участка T-ДНК для того, чтобы они выполняли функцию распорок ДНК, с целью изоляции трансгенных кассет экспрессии. Вектор pJP3416 перед вставкой участка GA7 содержит только кассету селекционного маркера для растений между границами.
Трансформация A. thaliana и анализ состава жирных кислот.
Химерные векторы вводят в A. tumefaciens, штамм AGL1 и клетки из культур трансформированной Agrobacterium используют для обработки, растений A. thaliana (экотипы Columbia и мутант fad2), применяя для трансформации способ погружения цветков (Clough and Bent, 1998). После созревания урожай семян T1 с обработанных растений собирают и наносят на планшеты MS, содержащие фосфинотрицин (ФФТ), с целью селекции растений, содержащих ген селекционного маркера BAR. Выжившие, здоровые саженцы T1 переносят в грунт. После выращивания растений до состояния зрелости и предоставления им возможности для самооплодотворения собирают урожай семян T2 с полученных растений и состав жирных кислот в липиде их семени анализируют методом ГХ, как раскрыто в Примере 1.
Конструкция pJP3416-GA7 приводит к выработке несколько более высоких уровней ДГК, выраженных как процент от общего содержания жирных кислот, в среднем относительно конструкции pJP3404. Эффективность превращения для каждой стадии ферментации в продуцировании ДГК из олеиновой кислоты вычислена как (% продуктов х 100)/(% оставшегося субстрата + % продуктов) и, таким образом. выражена в процентах.
Наиболее высокий наблюдаемый уровень выработки ДГК в трансформированных pJP3416GA7 линиях T2 составляет 6,2%, дополнительно с 0,5% ЭПК и 0,2% ДПК (линия #14). Указанные семена T2 все
- 59 037817 еще были сегрегированными по трансгену, т.е. еще не были однородно гомозиготными. Уровень ω3 жирных кислот, продуцированных в результате наличия трансгенов в этих семенах (новые общие ω3 жирные кислоты, за исключением уровня АЛК, которая вырабатывается эндогенно в экотипе Columbia), составляет 10,7%, в то время как уровень ω6 жирных кислот (новые общие ω6 жирные кислоты, за исключением 18:2Δ9,12) составляет 1,5%. Это представляет чрезвычайно благоприятное соотношение новых ω3 жирных кислот: новых ω6 жирных кислот, а именно 7,3:1.
Семена T2 отобранных линий, трансформированных pJP3416-GA7, а именно линий, обозначенных 7, 10, 14, 22 и 34 в экотипе Columbia, и линий, обозначенных 18, 21 и 25 в мутантном экотипе fad2, наносят на планшеты со средами MS, содержащими ФФТ для селекции трансгенных саженцев in vitro. По 20 ФФТ-резистентных саженцев из каждой линии переносят в грунт и выращивают до состояния зрелости после самооплодотворения. Было в высокой степени вероятным, эти растения будут гомозиготными по гену селекционного маркера и, таким образом, по меньшей мере по одной вставке T-ДНК в геноме растений. Урожай семян T3 с этих растений собирают и анализируют состав жирных кислот в масле из семян методом ГХ. Данный анализ выявил, что конструкции pJP3416-GA7 генерируют более высокие уровни ω3 ДЦ-ПНЖК ДГК в семенах T3 гомозиготных растений, чем в сегрегированном семени T2. До около 13,9% ДГК наблюдается в трансформированной pJP3416-GA7 линии T3, обозначенной 22.2 в экотипе Columbia, что означает увеличение с уровня около 5,5% в гемизиготном семени T2, причем суммарный уровень новых ω3 жирных кислот составляет около 24,3% от содержания общих жирных кислот в липиде семени. Уровень новых ω6 жирных кислот составляет 1,1% от общих жирных кислот, представляя очень благоприятное соотношение новых ω3 жирных кислот:новых ω6 жирных кислот, а именно около 22:1. Подобным образом, трансформанты в экотипе fad2 дают суммарное количество новых ω3 жирных кислот 20,6%, включая 11,5% ДГК, как процент от общего содержания жирных кислот в липиде семени.
Эффективность ферментного превращения для каждой ферментной стадии в пути получения ДГК из олеиновой кислоты приведена в табл. 4 для семян T3 с более высокими уровнями ДГК. Эффективность превращения под действием Δ12-десатурαзы в семенах линии 22.2 составила 81,6%, и эффективность ω3-десатурaзы составила 89,1%, причем оба значения являются весьма высокими и указывают на то, что данные грибковые (дрожжевые) ферменты могут хорошо функционировать в развивающихся семенах. Активность других экзогенных ферментов в пути ДГК была сходным образом высокой в отношении субстратов ω3, причем эффективность Δ6-десатуразы составляет 42,2%, Δ6-элонгαзы - 76,8%, Δ5-десатуразы - 95,0%, Δ5-элонгазы - 88,7 до Δ4-десатуразы - 93,3%. Активность Δ6-десатуразы в отношении субстрата ω6 ЛК намного ниже, и эффективность превращения ЛК под действием Δ6-десатуразы составляет только 0,7%. ГЛК присутствует на уровне всего 0,4 и представляет собой единственный новый продукт ω6, за исключением 20:2ω6, обнаруженной в семенах T3 с наиболее высоким содержимым ДГК. Компилированные данные из профилей общего липида семени для независимого трансгенного семени приведены в табл. 5.
Таблица 4. Эффективность превращения для отдельных ферментных стадий получения ДГК из олеиновой кислоты, наблюдаемая в общем липиде семени для трансгенных семян T3 Arabidopsis.
GA7_Col_7.2 РЭ ДУЭ П‘01 РЭ ДУЭ GA7_Col_22.2 GA7_Col_14.19 GA7_FAD2_25.10 GA7_FAD2_21.2 GA7_FAD2_18.14 T4 Col_22.2 (среднее значение +/стандартное отклонение) Т4 Col_22.2 (лучшая линия)
<112-дес 75,4 % 73,1 % 75,7 % 81,6% 73,4 % 66,6 % 78,5 % 63,1 % 67,6 % 82,7 %
<115-дес 85,3 % 84,4 % 86,2 % 89,1 % 70,2 % 87,5 % 82,2 % 87,6 % 81,0% 90,9 %
о 1 ёб-дес 0,3 % 0,3 % 0,3 % 0,7 % 0,3 % 0,6 % 1,0% 0,2 % 1,3 % 0,7 %
(<19-эло) 1,7% 1,7% 1,2 % 1,2% 2,6 % 1,1 % 2,0 % 1,3 % 1,6 % 1,5 %
ёб-эло
dS-дес
dS-эло
44-дес
Омега 3 йб-дес 30,7 % 29,3 % 28,2 % 42,2 % 30,2 % 38,5 % 40,0 % 29,2 % 41,0 % 45,7 %
Щ9-эло) 2,7 % 2,7 % 2,3 % 2,4 % 3,0 % 2,3 % 2,7 % 2,9 % 2,8 % 3,1 %
de-эло 79,0 % 81,1 % 79,0 % 76,8 % 70,9 % 79,2 % 73,2 % 79,1 % 77,5 % 77,7 %
dS-дес 94,0 % 94,6 % 94,5 % 95,0 % 97,9 % 87,8 % 93,3 % 91,1 % 95,0 % 95,8 %
dS-эло 91,9% 91,7% 93,6 % 88,7 % 89,5 % 89,9 % 92,2 % 91,6% 90,8 % 90,2 %
d4-aec 93,2 % 93,7 % 94,4 % 93,3 % 93,7 % 92,5 % 95,0 % 93,9 % 92,2 % 90,9 %
- 60 037817
Таблица 5. Компилированные данные из профилей общего липида семени для независимого трансгенного семен.
о η Tf я
г] ец 2 о «ч ri о М| ОО ^1 я я я к S я
г** % м гч гч ГЧ И м в
-1 -1 -1 -1 е 5 5 ri м еч .
и 1 “Ί ГЧ| V я я © я Ч а о 9
<< ◄ ◄ ◄ и « ~ а и г ь
Параметр о 0 и 0 0 0 0 0 Н -3
Общие w3 ( % от общих ЖК) 50,0 48,9 51,6 55,8 38,6 47,1 49,4 44,8 54,0 55,9
Общие w6 ( % от общих ЖК) 8,7 9,1 8,3 6,7 16,3 6,7 10,7 6,3 6,7 5,7
Соотношение w3/w6 5,75 5,37 6,22 8,33 2,37 7,03 4,62 7,11 806 9,81
Соотношение w6/w3 0,17 0,19 0,16 0,12 0,42 0,14 0,22 0,14 0,12 0,10
Общие новые w3 ( % от общих ЖК) 16,3 15,2 15,5 24,3 12,5 18,8 20,5 14,0 23,0 26,4
Общие новые w6 ( % от общих ЖК) 1,2 1,2 0,9 1,1 1,5 0,9 1,8 0,7 1,4 1,4
Соотношение новых w3/w6 13,58 12,67 17.22 22,09 8,33 20,89 11,39 20,00 16,43 18,86
Соотношение новых w6/w3 0,07 0,08 0,06 0,05 0,12 0,05 0,09 0,05 0,06 0,05
Эффективность 14,1 13,3 13,4 21,8 10,2 15,0 16,8 11,2 20,4 24,5 %
превращения ОК в ЭПК % % % % % % % % %
Эффективность 12,0 11,4 11,8 18,0 8,6 % 12,6 14,8 9,6 % 17,1 20,1 %
превращения ОК в ДГК % % % % % % %
Эффективность 18,9 18,4 17,9 26,9 14,2 22,9 21,8 18,0 26,2 29,9 %
превращения ЛК в ЭПК % % % % % % % % %
Эффективность 16,2 15,9 15,7 22,2 12,0 19,1 19,1 15,5 21,9 24,5 %
превращения ЛК в ДГК % % % % % % % % %
Эффективность 22,2 21,9 20,7 30,1 20,2 26,1 26,5 20,5 29,4 32,9 %
превращения АЛК в ЭПК % % % % % % % % %
Эффективность 19,0 18,8 18,2 24,9 17,1 21,9 23,3 17,6 24,6 27,0 %
превращения АЛК в ДГК % '/о % % % % % % %
Общие насыщенные 16,0 14,7 15,4 16,0 16,2 13,4 16,5 12,9 16,0 17,8
жирные кислоты Общие мононенасыщенные 23,7 25,8 23,4 19,2 26,5 30,9 21,3 34,3 21,1 18,1
жирные кислоты Общие полиненасыщенные 58,7 58,0 59,9 62,5 54,9 53,8 60,1 51,1 60,7 61,6
жирные кислоты Общие С20 19 19,8 16,8 15,9 19,1 21,5 18,2 23,3 18 16,6
Общие С22 11,4 11 10,8 15,5 8,6 12,1 13,2 9,9 15,4 17,5
Соотношение С20/С22 1,67 1,80 1,56 1,03 2,22 1,78 1,38 2,35 1,17 0,95
Семена T3 линии pJP3416-GA7 22.2 в экотипе Columbia, которые являются потомками линии T2 22, высевают непосредственно в грунт и состав жирных кислот в зрелом семени, полученных в результате растений T3, анализируют методом ГХ. Средний уровень ДГК в данных семенах составляет 13,3±1,6% (n=10) как процент от общих жирных кислот в липиде семени. Линия с наиболее высоким уровнем ДГК содержит 15,1% ДГК от общего содержания жирных кислот в липиде семени. Ферментная эффективность превращения приведена в табл. 8 для каждой стадии получения ДГК из олеиновой кислоты.
Выполняют анализ гибридизации методом саузерн-блота. Результаты показывают, что линии с высоким уровнем аккумуляция ДГК содержат одинарную или двойную копию T-ДНК из конструкции pJP3416-GA7, за исключением трансгенной линии Columbia #22, которая содержит три вставки T-ДНК в геноме растения Arabidopsis. Семя поколения T5 также проанализировано, и обнаружено содержание до 13,6% ДГК в общих липидах семени. Конструкция GA7 продемонстрировала устойчивость на протяжении нескольких поколений с точки зрения способности к образованию ДГК.
Определение содержимого масла в трансгенных линиях A. thaliana ДГК.
Содержание масла в трансгенных семенах A. thaliana с различными уровнями ДГК определяют методом ГХ, как раскрыто в Примере 1. Данные проиллюстрированы на фиг. 4, где приведен график содержания масла (% масла от массы семени) против содержания ДГК (как процента от общих жирных кислот). Найдено до 26,5 мг ДГК на 1 г семени (табл. 6). Обнаружено, что содержание масла в трансгенных семенах Arabidopsis отрицательно коррелирует с содержимым ДГК. Количество ДГК на массу семени было большим в трансформированных семенах, с уровнем ДГК около 9% относительно семян с содержанием ДГК около 14%. Последующие данные для других видов, кроме Arabidopsis, продемонстрировали, что данная отрицательная корреляция более выражена для Arabidopsis, чем для видов C. sativa или Brassica (Пример 8 ниже).
- 61 037817
Таблица 6. Доля и количество ДГК в семенах трансформированного GA7 Arabidopsis.
Содержание ДГК ( % от ОЖК) Содержание масла (% масла на грамм семян) Содержание ДГК по массе (мг/г семени)
GA7/col 22.2-1 14,2 14,89 20,2
GA7/col 22.2-2 14,3 15,02 20,5
GA7/col 22.2-3 14,0 15,92 21,2
GA7/col 10,15-1 8,7 30,23 25,06
GA7/col 10,15-2 8,6 31,25 25,77
GA7/col 10,15-3 8,8 31,70 26,49
Пример 3. Стабильная экспрессия трансгенного пути ДГК в семенах Camelina sativa.
Бинарный вектор pJP3416-GA7, раскрытый выше, вводят в A. tumefaciens, штамм AGL1 и клетки из культуры трансформированного Agrobacterium используют для обработки цветущего растения C. sativa с применением способа погружения цветков для трансформации (Lu and Kang, 2008). После выращивания и созревания растений, урожай семян T1 с обработанных растений собирают, высевают в грунт и полученные в результате растения обрабатывают путем опрыскивания гербицидом BASTA для селекции трансгенных растений, которые экспрессируют ген селекционного маркера bar на T-ДНК pJP3416-GA7. Выжившие растения T1, толерантные к гербициду, выращивают до состояния зрелости после того, как им давали возможность самооплодотворения, и собирают урожай образовавшегося семени T2. Пять трансгенных растений были получены, только три из них содержали полную T-ДНК.
Липид экстрагируют из пула около 20 семян каждого из трех растений, которые содержали полную T-ДНК. Два из объединенных в пул образцов содержали очень низкие, едва обнаружимые уровни ДГК, но третий пул образцов содержал около 4,7% ДГК. Таким образом, липид был извлечен от 10 индивидуальных семян T2 данного растения, и состав жирных кислот проанализирован методом ГХ. Данные относительно состава жирных кислот индивидуальных семян для данной трансформированной линии также приведены в табл. 7. Компилированные данные из профилей (табл. 7) общего липида семян приведены в табл. 8.
ДГК присутствовала в шести из 10 индивидуальных семян. Четыре других семени не содержали ДГК и были приняты в качестве нулевых сегрегантов, не содержащих T-ДНК, на основании гемизиготности инсерции T-ДНК в материнском растении. Экстрагированный липид из единственного семени с наиболее высоким уровнем ДГК содержал 9,0% ДГК, в то время как суммарный процент для ЭПК, ДПК и ДГК составил 11,4%.
Таблица 7. Состав жирных кислот общего липида семян из трансгенных семян T2 Camelina sativa, трансформированных T-ДНК из pJP3416-GA7. Состав жирных кислот приведен для объединенной в пул серии (FD5.46) семени и для 10 отдельных семян, ранжированных (слева направо) от самого высокого до самого низкого уровня ДГК.______
Жирная кислота Пул FD5.46 #2 #4 #8 #7 #9 #1 #3 #5 #6 #10
14:0 0 0,2 0,2 ο,ι 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,2 0,2
16:0 11,6 12,1 12,3 12,1 13,2 12,3 12,8 11,9 11,4 11,5 11,7
16:1 0,2 0,0 0,1 ο,ι 0,0 0,2 0,0 0,2 0,2 0,2 0,2
16:3 0,3 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
18:0 3,7 3,3 3,2 3,2 3,0 3,1 3,2 3,3 3,1 3,2 3,2
18:1 10,8 8,0 8,0 8,6 8,5 9,4 11,0 10,2 8,3 9,4 8,6
18:ldll 1,7 1,3 1,4 1,4 1,7 1,4 1,5 1,3 1,3 1,3 1,3
18:2 24,7 18,2 19,5 19,2 18,5 20,1 23,8 32,2 30,3 29,8 31,6
18:3ω3 27,4 26,7 26,6 27,3 28,9 28,2 27,4 28,3 29,2 29,5 28,2
18:3ω6 0,2 1,4 0,3 0,3 0,4 0,2 0,5 0,0 0,5 0,4 0,6
20:0 1,6 1,4 1,3 1,4 1,2 1,4 1,4 1,8 2,1 1,9 2,0
18:4ω3 2,2 6,8 6,4 5,7 7,2 5,7 4,1 0,0 0,0 0,0 0,0
20:ldll 5,3 4,4 4,5 4,8 3,3 4,1 3,5 4,4 6,1 5,8 5,5
20:1 iso 0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,0 0,5 0,6 0,5 0,5
20:2ω6 0,8 0,8 0,9 0,8 0,6 0,8 0,7 1,3 1,5 1,4 1,4
20:3ω3 0,6 0,8 0,8 0,8 0,7 0,8 0,7 0,6 0,7 0,7 0,6
22:0 0,4 0,5 0,5 0,5 0,4 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6
20:4ω3 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0
22:1 1,1 1,1 1,2 1,1 0,5 0,9 0,8 1,6 2,2 1,9 2,0
20:5ω3 0,7 1,3 1,6 1,5 1,6 1,1 1,7 0,0 0,0 0,0 ο,ι
22:2ω6 ο,ι 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,3 0,2 0,2
- 62 037817
22:4ω6+22:3ω3 0,3 0,2 0,3 0,3 0,0 0,3 0,0 0,4 0,6 0,5 0,5
24:0 0,3 0,3 о,3 0,3 0,0 0,3 0,0 0,4 0,4 0,4 0,4
24:1 0,3 0,4 0,4 0,3 0,0 0,3 0,0 0,5 0,6 0,5 0,5
22:5ω3 0,3 1,1 1,2 1,1 1,1 0,9 0,8 0,0 0,0 0,0 0,0
22:6ω3 4,7 9,0 8,5 8,3 8,3 7,1 4,9 0,0 0,0 0,0 0,0
Таблица 8. Компилированные данные из профилей общего липида семян для трансгенного семени, приведенного в табл. 7. Вычисления не включают незначительных жирных кислот, включенных в табл. 7.
Параметр Пул FD5.46 #2 #4 #8 #7 #9 #1 #3 #5 #6 #10
Общие w3 ( % от общих ЖК) 36,1 46 45,4 45 48,2 44,2 40,1 28,9 29,9 30,2 28,9
Общие w6 ( % от общих ЖК) 25,8 20,4 20,7 20,3 19,5 21,1 25 33,7 32,6 31,8 33,8
Соотношение w3/w6 1,40 2,25 2,19 2,22 2,47 2,09 1,60 0,86 0,92 0,95 0,86
Соотношение w6/w3 0,71 0,44 0,46 0,45 0,40 0,48 0,62 1,17 1,09 1,05 1,17
Общие новые w3 8,1 18,5 18 16,9 18,6 15,2 12 0 0 0 0,1
( % от общих ЖК) Общие новые w6 1,1 2,2 1,2 1,1 1 1 1,2 1,5 2,3 2 2,2
( % от общих ЖК) Соотношение новых w3/w6 7,36 8,41 15,00 15,36 18,60 15,20 10,00 0,05
Соотношение новых w6/w3 0,14 0,12 0,07 0,07 0,05 0,07 0,10 22,00
Эффективность 8,2 % 15,6 15,5 15,1 15,1 12,8 10,5 0,0 0,0 0,0 0,1
превращения ОК в ЭПК % % % % % % % % % %
Эффективность 6,7 % 12,3 11,6 11,5 11,4 10,0 7,0 % 0,0 0,0 0,0 0,0
превращения % % % % % % % % %
ОК в ДГК Эффективность 9,2 % 17,2 17,1 16,7 16,2 13,9 11,4 0,0 0,0 0,0 0,2
превращения ЛК в ЭПК % % % % % % % % % %
Эффективность 7,6 % 13,6 12,9 12,7 12,3 10,9 7,5 % 0,0 0,0 0,0 0,0
превращения % % % % % % % % %
ЛК в ДГК Эффективность 15,8% 24,8 24,9 24,2 22,8 20,6 18,5 0,0 0,0 0,0 0,3
превращения АЛК в ЭПК % % % % % % % % % %
Эффективность 13,0 % 19,6 18,7 18,4 17,2 16,1 12,2 0,0 0,0 0,0 0,0
превращения % % % % % % % % % %
АЛК в ДГК Общие 17,6 17,8 17,8 17,6 18 17,8 18,1 18,2 17,7 17,8 18,1
насыщенные
жирные
кислоты
Общие мононенасыщенные жирные кислоты 19,8 15,5 16 16,6 14,3 16,6 16,8 18,7 19,3 19,6 18,6
Общие полиненасыщенные жирные кислоты 62,5 66,6 66,4 65,6 67,7 65,6 65,1 63 63,1 62,5 63,2
Общие С20 9,6 9,3 9,8 9,9 8,1 8,9 8,5 8,6 И 10,3 10,1
Общие С22 5,4 10,3 10 9,7 9,4 8,3 5,7 0,6 0,9 0,7 0,7
Соотношение Общие С20/С22 1,78 0,90 0,98 1,02 0,86 1,07 14,9 14,33 12,22 14,71 14,43
Гомозиготное семя данной линии получают в поколении T4. До 10,3% ДГК вырабатывается в событии FD5-46-18-110 со средней величиной 7,3% ДГК, наблюдаемой для всего поколения T4. Последующее поколение (Т5) было получено с целью дополнительного тестирования стабильности выработки ПНЖК
- 63 037817 на протяжении нескольких поколений, особенно ДГК. Обнаружено, что наблюдаемые максимальные уровни ДГК были стабильными в пятом поколении, даже несмотря на то, что содержание ДГК в пуле семени не стабилизировалось до поколения T4 из-за присутствия многочисленных трансгенных локусов. Дополнительно, партии семени T5 проращивали на средах МС in vitro вместе с семенем материнской C. sativa, причем очевидных различий в эффективности или скорости прорастания не наблюдалось. Дальнейшие поколения трансгенной линии (поколения T6, T7 и т.д.) не проявляли снижения уровня ДГК в семени. Трансгенные растения обладали полноценной мужской и женской фертильностью, и пыльца продемонстрировала около 100% жизнеспособности относительно растений дикого типа. Анализ содержания масла в семенах, содержащих различные уровни ДГК, не выявил корреляции между уровнем ДГК и содержанием масла, в противоположность корреляции, наблюдаемой для Arabidopsis thaliana.
В нескольких дальнейших трансгенных линиях содержание ДГК в отдельных семенах от независимых событий превышало 12%. Соотношение трансгенных:нулевых для этих линий составляло около от 3:1 до 15:1. Анализ характерных профилей жирных кислот для образцов с наиболее высоким содержанием ДГК от каждой конструкции выявил только 1,2-1,4% ГЛК при отсутствии других новых ω6 РНЖК. И наоборот, было обнаружено, что новые ω3 ПНЖК (СДК) ω3 ДЦ-ПНЖК (ЭТК, ЭПК, ДПК, ДГК) аккумулируются до 18,5% при уровне ДНК 9,6% в общем содержании жирных кислот. Степень Δ6-десатурации составляла 32%, и содержание ЭПК составляло 0,8% от общего содержания жирных кислот. Эффективность Δ5-элонгации составляла 93%, и эффективность Δ6-элонгации составляла 60%. ДГК была обнаружена в полярной фракции липидов семени линий GA7.
Было отмечено, что наблюдаемые соотношения сегрегации (от ~3:1 до ~15:1) указывают на то, что один или максимум два трансгенных локуса были необходимы для выработки ДГК в C. sativa на уровнях, подобных уровням в рыбьем жире. Это имеет важное значение для простоты разведения трансгенного признака, а также для стабильности трансгена.
Гомозиготное семя высаживают в несколько теплиц с целью получения в сумме свыше 600 индивидуальных растений. Масло экстрагировали из семени с применением различных способов, в том числе аппарата Сокслета, экстракции ацетоном и гексаном.
Проводили 13C ЯМР анализ региоспецифичности для масла семени трансгенной C. sativa с целью определения позиционного распределения ω3 ДЦ-ПНЖК в ТАГ. Событие с около равным содержанием ЭПК и ДГК было выбрано для максимизации ответа на данные жирные кислоты, причем соотношение sn-1,3 к sn-2 было найдено на уровне 0,75:0,25 для ЭПК и 0,86:0,14 для ДГК, притом что объективное распределение должно было бы составлять 0,66:0,33. Т.е. 75% ЭПК и 86% ДГК были расположены в положении sn-1,3 ТАГ. Это показывает, что обе жирные кислоты были предпочтительно локализованы в положениях ТАГ C. sativa, хотя предпочтение для ЭПК было выражено слабее, чем для ДГК. Тот факт, что ДГК была предпочтительно найдена в sn-1,3, был сходен с результатами, о которых ранее сообщалось для семени A. thaliana (Petrie et al., 2012).
Поскольку количество независимых трансгенных линий, полученных в раскрытых выше экспериментах с трансформацией, было низким, дальнейшие трансформации C. sativa были осуществлены с применением конструкции мотива GA7-modB (Пример 4). Получено большее количество трансформантов, иидентифицированы гомозиготные линии, вырабатывающие ДГК в количестве более 20,1%.
Пример 4. Модификации T-ДНК, кодирующих пути ДГК в семенах растений.
Для улучшения уровня выработки ДГК в B. napus по сравнению с уровнями, описанными в WO 2013/185184, бинарные векторы pJP3416-GA7-modA, pJP3416-GA7-modB, pJP3416-GA7-modC, pJP3416-GA7-modD, pJP3416-GA7-modE и pJP3416-GA7-modF были сконструированы, как описано в WO 2013/185184, и протестированы на трансгенных растениях. Эти бинарные векторы представляют собой варианты конструкции pJP3416-GA7, раскрытой в Примере 2, и были сконструированы с целью дальнейшего повышения синтеза ДГК в семенах растений, особенно путем улучшения функций Δ6десатуразы и Δ6-элонгазы. Наблюдалась аккумуляция СДК в некоторых семенах, трансформированных конструкцией GA7, вследствие относительно низкой эффективности Δ6 элонгации, по сравнению с Δ5-элонгазой, поэтому, среди прочих модификаций, положение двух генов элонгазы было поменяно в T-ДНК.
Две последовательности, кодирующие элонгазы в pJP3416-GA7, были поменяны местами на T-ДНК с получением pJP3416-GA7-modA первым клонированием новой кассеты Δ6-элонгазы P. cordata между сайтами SbfI pJP3416-GA7, для замены кассеты Δ5-элонгазы P. cordata. Данная конструкция была дополнительно модифицирована посредством обмена промотора FP1, управляющего Δ6-десатуразой M. pusilla, с промотором конлинина Cnl2 (pLuCnl2), чтобы получить pJP3416-GA7-modB. Данная модификация была осуществлена с целью увеличения экспрессии Δ6-десатуразы и, таким образом, эффективности фермента. Считается, что промотор Cnl2 может давать более высокую экспрессию трансгена в B. napus, чем укороченный промотор напина.
Получены 8 трансгенных событий pJP3416-GA7-modB A. thaliana и 15 трансгенных событий pJP3416-GA7-modG A. thaliana. Наблюдается от 3,4 до 7,2% ДГК в пуле семени pJP3416-GA7-modB и от 0,6 до 4,1% ДГК в пуле семени T2 pJP3416-GA7-modG. Некоторые из событий pJP3416-GA7-modB с наи
- 64 037817 более высоким уровнем высевают на селекционные среды и выжившие саженцы отбирают для следующего поколения. Семя анализируют на предмет содержания ДГК. Поскольку объединенные в пул семена Т1 представляют популяции, сегрегированные по трансгенам, и включают любые нулевые сегреганты, ожидается, что в гомозиготном семени растений-потомков уровни ДГК будут выше, до 30% от общего содержания жирных кислот в масле семени. Другие модифицированные конструкции использовались для трансформации A. thaliana. Хотя получено только небольшое количество трансформированных линий, ни одна из них не давала более высоких уровней ДГК, чем конструкция modB.
Конструкцию pJP3416-GA7-modB дополнительно применяли для генерации трансформированных растений B. napus сорта Oscar и серии сортовых линий, обозначенных NX002, NX003, NX005, NX050, NX052 и NX054. Всего было получено 1558 трансформированных растений, включая 77 независимых трансформированных растений: (T0) для трансформации Oscar и 1480 независимых растений для сортовых линий, включая 189 для NX005, которая представляет собой линию с высоким содержанием олеиновой кислоты в масле семян благодаря мутациям в генах FAD2. Другие сортовые линии содержали более высокие уровни ЛК и АЛК. Трансгенные растения, которые продемонстрировали более 4 копий T-ДНК по данным метода цифровой ПЦР (Пример 1), были отброшены; около 25% растений T0 было отброшено по данному критерию. Около 53% трансгенных растений T0 содержали 1 или 2 копии T-ДНК, по данным метода цифровой ПЦР, 12% содержали около 3 копий, и 24% - 4 или более копий. Урожай семян (семя Т1) был собран около с 450 трансгенных линий после самоопыления, достигнутого путем изолирования растений мешочками во время цветения, чтобы избежать скрещивания. Урожай семян Т1 собран с остальных трансгенных растений после созревания. Около 1-2% линий растений были стерильными с точки зрения мужской или женской фертильности и не давали жизнеспособных семян; такие растения T0 были отброшены.
Пулы семени (по 20 семян Т1 в каждом пуле) тестировали на предмет уровней ДГК в пуле масла семян и линии, которые продемонстрировали самые высокие уровни, отбирали. В частности, были отобраны линии с содержанием ДГК по меньшей мере 2% от общего содержания жирных кислот в пуле семян Т1. Около 15% трансгенных линий было отобрано таким образом; остальные 85% были отброшены. Некоторые из них были обозначены как линии CT132-5 (сорт Oscar), CT133.15-15, -24, -63, -77, -103, -129 и -130 (в NX005). Отобранные линии в NX050 включали CT136-4, -8, -12, -17, -19, -25, -27, -49 и -51. Обеспечивали набухание 20 семян из отобранных линий, включая CT132.5 и 11 семян CT133.15 и через два дня экстрагировали масло из половины семядоли каждого из индивидуальных семян. Вторую половину семядоль с эмбриональными осями содержат и культивируют на средах, чтобы сохранить конкретные линии потомков. Состав жирных кислот в масле определяют; данные для CT132.5 приведены в табл. 9. Уровень ДГК в 10 из проанализированных 20 семян, по данным анализа методом ГХ, находится в интервале 7-20% от общего содержания жирных кислот. Другие семена содержали менее 7% ДГК и могли содержать частичную (неполную) копию T-ДНК из pJP3416-GA7-modB. По-видимому, трансгенная линия содержит множественные вставки трансгена, которые были генетически разъединены. Семена трансгенной линии CT133.15 продемонстрировали уровни ДГК в интервале 0-5%. Семена без ДГК, вероятно, были нулевыми сегрегантами. Эти данные подтверждают, что конструкция modB функционирует надлежащим образом для получения ДГК в семени рапса.
или 40 индивидуальных семян (семена T2), полученных от каждого из множества растений Т1 после самоопыления, от отобранных трансформированных линий, индивидуально тестировали на предмет состава жирных кислот. Были идентифицированы семена, содержащие уровни ДГК выше 20% (табл. 10). Два репрезентативных образца, CT136-27-18-2 и CT136-27-18-19, содержали 21,2 до 22,7% ДГК соответственно. Общее содержание ω3 жирных кислотных в этих семенах составило около 60% как процент от общего содержания жирных кислот, и содержание ω6 составило менее чем 10%. Другие наборы по 20 или 40 семян T2 от каждого из растений Т1 тестировали на предмет состава жирных кислот. Репрезентативные данные уровней ДГК в общем содержании жирных кислот масла семян из индивидуальных семян T2 проиллюстрированы на фиг. 10. Семена, содержащие до 34,3% ДГК, были идентифицированы, например, среди семени CT136-27-47-25 (табл. 12). Состав жирных кислот для масла семян, полученного из CT136-27-47-25, приведен в табл. 12. Состав жирных кислот включал 34,3% ДГК, вместе с около 1,5% ДНК, 0,6% ЭПК и 0,5% ЭТК. Уровень СДК составлял около 7,5%, АЛК - около 21,9%, и ЛК около 6,9%. Новые ω6 ПНЖК продемонстрировали 1,1% ГЛК, при отсутствии обнаружимых ω6-C20 или -C22 ДЦ-ПНЖК. Общие насыщенные жирные кислоты: 9,6%; мононенасыщенные жирные кислоты: 12,5%; общие ПНЖК: 75,2%; общие об ПНЖК (включая ЛК): 7,2%; общие ω3 ПНЖК: 66,9%; соотношение общего содержания ω6:ω3 жирных кислот: 9.3:1; новые ω6:новые ω3 жирные кислоты: 37:1. Эффективность каждой из стадий ферментации от олеиновой кислоты к ДГК была такой, как указано ниже: Δ12-десатураза, 90%; Δ15/ω3-десатураза, 89%; Δ6-десатураза, 67%; Δ6-элонгаза, 83%; Δ5-десатураза, 99%; Δ5-элонгаза, 98%; Δ4-десатураза, 96%. Общая эффективность превращения олеиновой кислоты в ДГК составила около 50%. Таким образом, было очевидно, что семена, вырабатывающие ДГК в диапазоне 20,1-35% от общего содержания жирных кислот в масле семян, могли бы быть идентифицированы и отобраны, в том числе семена, содержащие от 20,1 до 30% ДГК или от 30 до 35% ДГК в общем содержа- 65 037817 нии жирных кислот.
Содержание масла в некоторых семенах было снижено от около 44% в семенах дикого типа до около 31-39% в некоторых из вырабатывающих ДГК семян, но было сходным с уровнями дикого типа в других вырабатывающих ДГК семенах.
Различные трансформированные линии растений, которые вырабатывали ДГК на уровнях по меньшей мере 10% в семени T2, скрещивали и добивались самоопыления потомства F1, чтобы получить потомство F2, гомозиготное по множественным инсерциям T-ДНК. Масло семян из гомозиготного семени проанализировано и обнаружили, что ДГК составляет 30 или 35% от общего содержания жирных кислот в масле семени.
ТАГ в масле, полученном из CT136-27-18-2 и CT136-27-18-19, проанализировали региоспецифичным методом 13C ЯМР на предмет позиционного распределения ДГК в глицериновой основе молекул ТАГ. ДГК была преимущественно присоединена в положении sn-1,3. Более чем 70%, фактически более чем 90% ДГК находилось в положении sn-1,3.
В нескольких дальнейших трансгенных линиях содержание ДГК в индивидуальных семенах от независимых событий превышало 12%. Соотношение трансгенных:нулевых для этих линий составляло около 3:1, что соответствовало одному трансгенному локусу, или 15:1, что соответствовало двум трансгенным локусам. Анализ характерных профилей жирных кислот для образцов от каждой конструкции с наиболее высокими уровнями ДГК выявил только 1,2-1,4% ГЛК при отсутствии других обнаружимых новых ω6 ПНЖК. В противоположность этому, новые ω3 ПНЖК (СДК) и ω3 ДЦ-ПНЖК (ЭТК, ЭПК, ДПК, ДГК) аккумулировались до суммарного уровня 25,8% для конструкции modF и 21,9% для конструкции modG по сравнению с 18,5% для GA7-трансформированного семени. Уровни ДГК в масле из этих семян составляли 9,6, 12,4 и 11,5% соответственно. Степень Δ6-десатурации была ниже в GA7трансформированных семенах, чем в modF- и modG-трансформированных семенах (32% против 47% и 43%), что приводило к снижению уровня АЛК в семенах modF и modG, по сравнению с GA7. Другим значимым отличием была аккумуляция ЭПК в семени modF (3,3% против 0,8% в двух других трансгенных семенах), и это отображалось в снижении степени Δ5-элонгации, наблюдаемом в семени modF (80%), по сравнению с семенами GA7 и modG (93 и 94%). Наблюдалось небольшое увеличение степени Δ6-элонгации в этих семенах (66% против 60% и 61%), хотя количество СДК фактически увеличивалась вследствие несколько более активной Δ6-десатурации. ДГК была обнаружена в полярной фракции липидов семени линий GA7.
Проанализирован состав жирных кислот в липиде семени Т1 для 70 независимых трансгенных растений B. napus сортовой линии NX54, трансформированной конструкцией modB T-ДНК. Обнаружено, что одно из этих трансгенных растений дает семя, содержащее ДПК, но в масле семян ДГК отсутствовала. В семени Т1 данной линии (CT-137-2) вырабатывалось около 4% ДПК, при отсутствии обнаружимой ДГК в пуле семени Т1. Изобретателями был сделан вывод о том, что это вызвано инактивацией гена Δ4-десатуразы в конкретной инсерционной T-ДНК, возможно, в результате спонтанной мутации. Около 50 семян Т1 от данной трансгенной линии прорастили, и один появившийся котиледон из каждого проанализировали на предмет состава жирных кислот в остаточном масле. Отобранные саженцы, демонстрирующие более чем 5% ДПК, в дальнейшем были выращены до состояния зрелости, и собран урожай семени T2.
Состав жирных кислот в пуле семени проиллюстрирован в табл. 11, причем в этих линиях наблюдалось более чем 7% ДПК.
Хотя фокус данного эксперимента находился на демонстрации выработки ДГК в видах масличной культуры, отмеченные выше различия также были интересными с точки зрения перспективы дизайна конструкции. Во-первых, переключение локализации участка, кодирующего Δ6- и Δ5-элонгазу в конструкции modF приводит к предусмотренным модификациям профиля, когда аккумулируется больше ЭПК вследствие более низкой степени Δ5-элонгации. Сопутствующее увеличение степени Δ6-элонгации наблюдалось, но не приводило к более низким уровням СДК. Это было результатом повышения степени Δ6-десатурации в трансформированном modF семени, вызванной добавлением дополнительной экспрессионной кассеты Δ6-десатуразы M. pusilla, а также заменой укороченного промотора напина (FP1) более активным промотором конлинина 2 льна. Несколько менее выраженное повышение степени Δ6-десатурации, наблюдаемое в случае конструкта modG, было вызвано капитализацией на кассете Δ5-элонгазы с высокой экспрессией в GA7. Переключение положений участков, кодирующих Δ6-десатуразу и Δ5-элонгазу, приводило к более высокой степени Δ6-десатурации. Активность Δ5-элонгазы не снижалась в этом случае благодаря замене промотора FP1 промотором Cnl2.
Эти данные подтверждают, что конструкции modB, modF и modG эффективны с точки зрения выработки ДГК в семени Camelina, относительно Arabidopsis и рапса.
Авторы изобретения считали, что, в общем, эффективность ограничивающей скорость ферментной активности в биохимическом пути ДГК может быть более высокой в мультикопийных T-ДНК трансформантах по сравнению с однокопийными T-ДНК трансформантами или может быть увеличена путем инсерции в T-ДНК нескольких генов, кодирующих фермент, который может быть ограничивающим в био
- 66 037817 химическом пути. Доказательства возможной важности мультикопийных трансформантов наблюдались в семенах Arabidopsis, трансформированных конструкцией GA7 (Пример 2), в которых событие с наиболее высоким выходом ДГК содержало три инсерции T-ДНК в геноме хозяина. Несколько генов могут быть идентичными или предпочтительно представляют собой различные варианты, которые кодируют один и тот же полипептид или находятся под контролем различных промоторов с перекрывающимися паттернами экспрессии. Например, повышенная экспрессия может быть достигнута путем экспрессии нескольких участков, кодирующих Δ6-десатуразу, даже если вырабатывается один и тот же белок. Например, в pJP3416-GA7-modF и pJP3416-GA7-modC две версии Δ6-десатуразы M. pusilla присутствовали и экспрессировались различными промоторами. В кодирующих последовательностях кодоны использовались по-разному, и, таким образом, их нуклеотидные последовательности были различными, чтобы снизить потенциал сайленсинга или эффекты косупрессии, но приводили к выработке одного и того же белка.
Таблица 9. Профили жирных кислот в половинках семядоль проращенных трансгенных семян Т1 B. napus, содержащих конструкт modB. До 18,1% ДГК наблюдалось во многочисленных образцах, со держащих более 10% ДГК.
Семя © 16:0 16:1(13? 16:1 16:3 18:0 18:1 18:1(111 18:2 V© й ОО Ή й ГН ОО © © гд Й X C20:ldll 20:1(113 С20:2п6 ГН Й © ГД W С22:0 20:4пЗ 20:5пЗ 22:ЗпЗ С24:0 С24:1 22:5пЗ С22:6пЗ
1 ОД 4,2 0,1 0,1 0,2 1,8 29,9 2,5 9,9 0,1 38,4 0,5 0,8 1,0 0,0 0,1 2,1 0,3 2,8 0,3 0,1 0,2 0,2 0,5 3,9
2 о,1 4,7 о,1 0,1 0,2 4,0 23,0 2,3 7,4 0,3 29,3 1,0 4,3 1,1 0,0 о,1 1,9 0,4 6,9 1,0 0,0 0,3 о,1 1,7 9,5
3 0,1 3,7 0,2 0,1 0,2 1,8 55,1 1,9 4,7 0,2 15,2 0,8 1,8 1,4 0,0 0,1 0,3 0,5 11,3 0,0 0,0 0,3 0,2 0,0 0,0
4 0,1 4,6 0,2 0,2 0,2 2,9 22,1 1,8 6,6 0,4 26,5 1,0 7,2 1,0 0,0 0,1 0,8 0,5 П,2 1,9 0,0 0,2 0,2 1,7 8,7
5 од 4,0 о,1 о,1 0,2 1,7 27,4 2,1 8,1 0,3 26,4 0,6 2,8 1,0 0,0 од 1,5 0,3 7,6 1,5 0,0 о,1 о,1 1,8 12,2
6 0,1 3,5 0,1 0,1 0,2 1,6 59,8 2,0 4,3 0,1 18,5 0,6 0,5 1,3 0,0 0,0 0,7 0,3 6,0 0,0 0,0 0,2 0,1 0,0 0,0
7 од 6,0 0,3 0,3 0,3 1,7 16,6 2,6 23,9 1,о 23,2 0,6 5,4 0,8 0,0 0,2 0,6 0,4 2,6 1,1 0,0 0,3 0,3 1,7 9,9
8 0,1 4,9 0,1 0,1 0,2 2,7 12,9 1,4 11,7 0,3 34,3 0,9 5,0 0,9 0,0 0,2 2,4 0,5 4,1 1,3 0,0 0,2 0,2 1,8 13,8
9 0,1 3,9 0,1 0,1 0,1 2,4 41,6 1,7 21,5 0,0 23,4 0,7 0,0 1,2 0,0 0,1 2,2 0,4 0,0 0,0 0,1 0,3 0,2 0,0 0,0
10 0,1 3,7 0,2 0,1 0,1 2,1 30,9 1,7 19,2 0,4 23,6 0,7 2,1 1,1 0,0 0,1 1,5 0,4 3,6 0,6 0,0 0,2 0,1 0,7 6,9
11 0,1 5,7 0,4 0,3 0,2 3,8 41,2 2,4 26,7 2,1 7,2 1,3 0,3 1,2 0,0 0,2 0,3 0,8 4,8 0,0 0,0 0,6 0,3 0,0 0,0
12 0,1 4,6 0,0 0,1 0,2 2,4 25,5 1,7 16,1 0,3 28,9 0,8 3,9 1,1 0,0 0,1 1,9 0,4 3,9 0,6 0,0 0,2 0,0 1,1 6,2
13 0,1 4,3 0,1 0,1 0,1 4,2 19,4 1,6 9,2 ОД 45,5 1,0 0,2 1,1 0,0 0,1 5,2 0,4 2,6 0,3 0,2 0,2 0,1 0,4 3,4
14 0,1 6,3 0,2 0,2 0,2 4,0 10,5 2,3 8,4 1,3 31,1 1,3 3,9 0,8 0,0 0,1 2,3 0,6 4,6 1,8 0,1 0,3 0,2 2,5 18,1
15 0,1 5,1 0,1 0,2 0,2 3,3 16,8 2,4 П,2 0,3 28,8 1,0 4,5 0,9 0,0 0,1 2,1 0,6 3,2 1,5 0,1 0,3 0,1 1,8 15,1
16 0,1 4,4 0,1 0,1 0,2 4,0 16,2 1,5 11,6 0,2 33,5 0,9 2,8 1,1 0,0 0,2 3,7 0,4 4,6 0,7 0,1 0,3 0,1 1,3 12,1
17 0,2 7,2 0,2 0,2 0,2 4,9 15,0 2,1 8,9 0,3 25,9 1,4 5,1 0,9 0,0 0,0 1,6 0,8 4,9 2,1 0,0 0,6 0,3 2,2 15,0
18 0,1 4,0 о,1 о,1 0,2 2,3 64,8 1,2 7,2 о,1 12,5 1,0 3,5 1,5 0,0 0,1 0,0 0,7 0,0 0,0 0,0 0,5 0,2 0,0 0,0
19 0,1 3,9 0,1 0,1 0,2 4,6 36,9 1,7 7,1 0,2 28,6 1,2 1,8 1,2 0,0 0,1 1,4 0,5 4,3 0,4 0,0 0,4 0,1 0,8 4,3
20 0,1 4,8 0,1 0,1 0,2 6,0 18,5 1,2 12,8 0,2 34,8 1,4 2,4 1,1 0,0 0,1 3,4 0,6 3,2 0,4 0,1 0,3 0,1 0,7 7,6
Таблица 10. Профили жирных кислот трансгенных . семян T2 B. . napus, содержащих конструкт modB
Образец (семя Т2) О С16:0 С18:0 С18:1 C18:ldll С18:2 С18:3п6 С18:ЗпЗ 18:4пЗ C20:ldll С20:2пб и Й тГ 20:5пЗ 22:5пЗ С22:6пЗ Общие ω3 ( %) Общие шб ( %) Соотношени ею6:шЗ Общее содержание IIU'IL· ί Ο/Λ__
СТ136-27-18-1 0,1 5,0 2,6 25,4 3,6 6,7 0,2 37,5 1,4 1,0 0,1 2,1 0,8 0,4 0,9 10,2 53,4 7,1 0,13 60,5
СТ136-27-18-2 0,2 7,1 2,8 16,9 4,3 5 5 0,4 29,1 5,4 0,8 0,1 1,2 0,5 0,5 1,9 21,2 59,8 6,1 0,10 66,0
СТ136-27-18-3 0,1 5,4 2,5 26,5 3,8 6,4 0,4 26,4 4,7 1,0 0,1 0,7 1,1 0,6 1,2 17,3 52,0 6,9 0,13 58,9
СТ136-27-18-4 0,1 5,3 2,4 34,7 4,0 5,9 0,3 30,3 1,3 1,1 0,1 1,1 1,5 0,3 0,4 9,3 44,4 6,3 0,14 50,7
СТ136-27-18-5 0,1 4,8 2,7 34,5 3,8 5,6 о,з 23,5 3,9 1,2 0,1 0,7 1,1 0,5 1,1 14,2 45,1 6,0 0,13 51,1
СТ136-27-18-6 0,1 5,0 2,1 54,3 3,8 5,7 0,2 18,2 0,6 1,5 0,1 1,1 0,7 0,1 0,2 4,4 25,5 6,1 0,24 31,5
СТ136-27-18-7 0,1 5,3 2,1 43,8 4,2 5,6 0,4 18,3 2,2 1,3 0,2 0,6 1,5 0,4 0,5 11,6 35,2 6,2 0,18 41,4
СТ136-27-18-8 0,1 5,4 2,7 25,8 4,1 6,7 0,4 26,6 5,7 1,0 0,1 0,6 1,3 0,6 1,2 15,8 51,9 7,1 0,14 59,0
СТ136-27-18-9 0,1 4,6 1,6 53,8 3,7 17,5 0,5 9,2 0,5 1,6 0,3 0,6 0,4 0,1 0,1 3,7 14,5 18,3 1,26 32,8
СТ136-27-18-10 0,1 4,8 2,4 44,1 3,7 5,4 0,4 19,1 2,3 1,1 0,1 0,6 1,5 0,5 0,8 И,4 36,1 5,9 0,16 42,0
СТ136-27-18-11 0,1 5,1 2,2 48,3 4,1 10,9 0,7 12,5 1,2 1,3 0,2 0,5 1,5 о,з о,з 9,1 25,3 11,8 0,47 37,1
СТ136-27-18-12 0,1 5,3 2,7 23,3 3,7 6,0 0,4 27,9 4,9 0,9 0,1 0,7 1,3 0,8 1,5 18,5 55,7 6,6 0,12 62,2
СТ136-27-18-13 0,1 5 5 3,4 30,7 5,6 5,1 0,4 23,1 3,5 1,1 0,1 1,2 1,1 0,6 1,2 14,9 45,8 5 5 0,12 51,3
СТ136-27-18-14 0,1 5,4 2,3 23,9 3,5 6,0 0,4 30,1 3,7 1,0 0,1 1,0 0,7 0,6 1,2 18,2 55 5 6,6 0,12 62,1
СТ136-27-18-15 0,1 5,0 2,3 45,4 4,0 5,3 0,4 16,2 2,3 1,2 0,1 0,5 1,9 0,6 0,7 12,3 34,4 5,8 0,17 40,3
СТ136-27-18-16 0,1 4,8 2,7 37,9 4,1 6,2 0,4 22,0 2,4 1,0 0,1 0,7 1,4 0,5 0,8 13,1 41,0 6,7 0,16 47,7
СТ136-27-18-17 0,1 4,5 2,3 38,8 3,3 7,6 о,з 26,8 0,9 1,4 0,2 1,6 0,9 0,2 0,7 8,6 39,9 8,0 0,20 47,9
СТ136-27-18-18 0,1 5,1 2,3 29,0 3,6 5,7 0,4 26,5 3,8 1,1 0,2 0,8 0,8 0,6 1,0 17,4 50,8 6,3 0,12 57,1
СТ136-27-18-19 0,1 5,8 2,3 19,7 4,2 6,7 0,7 23,7 7,7 0,9 0,1 0,4 0,7 0,6 1,7 22,7 57,6 7,5 0,13 65,1
СТ136-27-18-20 0,1 5,7 2,9 23,2 4,0 5,6 о,з 35,8 2,4 1,0 0,1 1,3 1,1 0,5 1,0 13,0 55,1 6,1 0,11 61,2
АРК (C20:4ω6) не была обнаружена ни в одном из образцов. Кроме того, образцы содержали около 0,2 или 0,3% C16:1, около 0,1-0,3% C16:3, от около 0,7 до 1,0% C20:0, около 0,3% C22:0, и некоторые образцы содержали следовые количества (<0,1%) C20:1Δ13, C22:3ω3, C24:0 и C24:1.
- 67 037817
Таблица 11. Состав жирных кислот липида в трансгенных семенах T2 B. napus, трансформированных T-ДНК конструкцией modB, с предполагаемой мутацией в гене Δ4-десатуразы. Липиды дополнительно содержали около 0,1% 14:0, 0,2% 16:3, 0,2-0,4% ГЛК, 0,1% 20:1Δ13, 0,3-0,4% 22:0, а 16:2 и 22:1 не были обнаружены. ____________________________________________________________________
16:0 й S ч» гН 16:1 18:0 18:1 ιΉ ά5 18:2 m α tn 90 20:0 18:4η3 О η 20:2η6 20:3η6 20:4п6 tn а tn о гч 20:4пЗ 20:5пЗ 22:2п6 22:ЗпЗ 24:0 24:1 22:5пЗ 1________ 22:6пЗ
СТ-137-2-34 5,3 0,0 0,2 3,7 26,8 3,1 12,4 29,1 0,8 2,5 0,8 ο,ι 0,0 0,0 1,1 1,7 0,8 0,0 0,1 о,1 0,1 10,0 0,0
СТ-137-2-38 5,3 0,0 0,2 4,2 24,4 3,0 12,6 29,4 0,9 2,5 0,8 ο,ΐ 0,0 0,0 1,3 2,2 0,9 0,0 0,1 0,2 0,1 10,8 0,0
СТ-137-2-48 5,0 0,0 0,2 4,2 24,1 3,1 11,9 31,0 0,9 2,4 0,9 ο,ι 0,0 0,0 1,5 2,0 1,0 0,0 0,1 0,1 0,1 10,5 0,0
СТ-137-2-51 5,7 0,0 0,2 4,6 22,3 3,4 12,3 34,5 ι,ο 2,0 0,8 ο,ι 0,0 0,0 1,9 1,2 0,5 0,0 0,1 0,2 0,2 7,9 0,0
СТ-137-2-59 5,4 0,0 0,2 3,9 25,7 3,4 12,9 27,8 0,9 2,6 0,8 ο,ι 0,0 0,0 1,0 1,9 0,9 0,0 0,1 0,2 0,1 11,0 0,0
Таблица 12. Состав жирных кислот в масле из семян T2 B. napus, трансформированного T-ДНК из GA7-modB.
С16:0 С18:0 1.................................................................................. я ос и гя 90 и С18:2п6 С18:3п6 С18:ЗпЗ С20:0 С18:4пЗ С20:1п9с С20:2п6 + С21:0 С20:ЗпЗ С20:4пЗ С20:5пЗ С22:5п6 С22:5пЗ С22:6пЗ
6,3 2,4 8,4 3,1 6,9 1,1 21,9 0,7 7,5 0,7 о,1 0,5 0,5 0,6 0,2 1,5 34,3
Образцы масла из семян дополнительно содержали 0,1% C14:0; 0,2% C16:1; 0,1% C20:3ω6; не содержали C22:1 и C22:2ω6; содержали 0,1% C24:0 и 0,2% C24:1, 2.6% других жирных кислот.
Пример 5. Анализ ТАГ из трансгенного семени A. thaliana, вырабатывающего ДГК.
Позиционное распределение ДГК в ТАГ из трансформированного семени A. thaliana определяли методом ЯМР. Общий липид экстрагируют около из 200 мг семени, вначале раздавливая его под слоем гексана, с последующим переносом давленного семени в стеклянную пробирку, содержащую 10 мл гексана. Пробирку нагревают около до 55°C на водяной бане, после чего обрабатывают вихревым перемешиванием и центрифугируют. Гексановый раствор извлекают и процедуру повторяют с дополнительными порциями 4x10 мл. Экстракты объединяют, упаривают с помощью роторного испарителя и ТАГ в экстрагированном липиде очищают от полярных липидов путем пропускания сквозь короткую колонку с кремния диоксидом с использованием 20 мл 7% диэтилового эфира в гексане. Позиционное распределение ацильной группы на очищенном ТАГ определяют количественно, как было описано ранее (Petrie et al., 2010a и b).
Анализ продемонстрировал, что большая часть ДГК в общем масле из семян расположена в положениях sn-1/3 ТАГ, и небольшое количество обнаружено в положении sn-2 (фиг. 5). В противоположность этому, ТАГ из вырабатывающих АРК семян продемонстрировали, что 50% АРК (20:4Δ5,8,11,14) расположены в положении sn-2 масла трансгенного рапса, тогда как ожидаемая величина для случайного распределения составляет только 33% (Petrie et al., 2012).
Дополнительно, общий липид из трансгенного, семени A. thaliana был проанализирован ЖХ-МС с тройной квадрупольной линзой, чтобы определить основные ДГК-содержащие разновидности триацилглицерида (ТАГ) (фиг. 6). Обнаружено, что разновидности ТАГ с наиболее высоким содержанием ДГК представляют собой ДГК-18:3-18:3 (ТАГ 58:12; номенклатура не описывает позиционного распределения), и на втором месте находится ДГК-18:3-18:2 (ТАГ 58:11). Три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18) наблюдается в общем масле семян, хотя и с низкими, но обнаружимыми уровнями. Другие основные ДГК-содержащие разновидности ТАГ включали ДГК-34:3 (ТАГ 56:9), ДГК-36:3 (ТАГ 58:9), ДГК-36:4 (ТАГ 58:10), ДГК36:7 (ТАГ 58:13) и ДГК-38:4 (ТАГ 60:10). Идентичность двух основных ДГК-содержащих ТАГ была дополнительно подтверждена квадрупольной времяпролетной (Q-TOF) МС/МС.
Пример 6. Анализ содержания и состава стеролов в маслах.
Фитостерины из 12 образцов растительного масла, приобретенных из коммерческих источников в Австралии, охарактеризованы методами ГХ и ГХ-МС. как производные O-триметилсилилового эфира (OTMSi-эфир), как раскрыто в Примере 1. Стеролы идентифицировали по данным удерживания, интерпретацией масс-спектров и сравнением с литературными данными и данными масс-спектроскопии лабораторных стандартов. Количество стеролов определяют с использованием внутреннего стандарта 5β(H)-холан-24-ола. Базовая структура фитостерина и химическая структура некоторых из идентифицированных стеролов проиллюстрированы на фиг. 7 и в табл. 13.
Анализировали растительные масла кунжута (Sesamum indicum), маслины (Olea europaea), подсолнечника (Helianthus annus), клещевины (Ricinus communis), рапса (Brassica napus), сафлора (Carthamus tinctorius), арахиса (Arachis hypogaea), льна (Linum usitatissimum) и сои (Glycine max). В порядке снижения относительного содержания во всех образцах масла основными фитостеринами были β-ситостерол
- 68 037817 (интервал 28-55% от общего содержания стеролов), Δ5-авенастерол (изофукостерол) (3-24%), кампэстерол (2-33%), Δ5-стигмастерол (0,7-18%), Δ7-стигмастерол (1-18%) и Δ7-авенастерол (0,1-5%). Были идентифицированы несколько других минорных стеролов: холестерин, брассикастерол, чалинастерол, кампестанол и эбурикол. Дополнительно, были обнаружены четыре C29:2 и два С30:2 стерола, но необходимо дальнейшее исследование для окончательной идентификации этих минорных компонентов. Кроме того, в некоторых из масел присутствовали несколько других неидентифицированных стеролов, но из-за очень низкого их содержания, масс-спектры не были достаточно интенсивными, чтобы позволить идентификацию их структуры.
Таблица 13. Названия по ИЮПАК/систематические названия идентифицированных стеролов.
Стерол № Общее название(я) ИЮПАК/систематическое
название
1 холестерин холест-5-ен-З β-ол
2 брассикастерол 24-мeτилxoлecτa-5,22E-диeн-Зβ-oл
3 чалинастерол / 24-метиленхолестерин 24-метилхолеста-5,24(28)Е-диенЗβ-oл
4 кампэстерол / 24-метилхолестерин 24-мeτилxoлecτ-5-eн-Зβ-oл
5 кампэстанол / 24-метилхолестанол 24-метилхолестан-З β-ол
7 Δ5 -стигмастерол 24-этилхолеста-5,22Е-диен-3 β-ол
9 эргост-7-ен-ЗР-ол 24-метилхолест-7-ен-3 β-ол
11 эбурикол 4,4,14-триметилэргоста-8,24(28)диeн-3β-oл
12 β-ситостерол / 24-этилхолестерин 24-этилхолест-5-ен-3 β-ол
13 О5-авенастерол / изофукостерол 24-этилхолеста-5,24(28)7-диен-3 βол
19 О7-стигмастерол / стигмаст-7-ен-ЗЬ-ол 24-этилхолест-7-ен-3 β-ол
20 О7-авенастерол 24-эτилxoлecτa-7,24(28)-диeн-Зβол
Содержание стеролов, выраженное как мг/г масла, в порядке уменьшения количества было следующим: масло рапса (6,8 мг/г), кунжутное масло (5,8 мг/г), льняное масло (4,8-5,2 мг/г), масло подсолнечника (3,7-4,1 мг/г), арахисовое масло (3,2 мг/г), сафлоровое масло (3,0 мг/г), соевое масло (3,0 мг/г), оливковое масло (2,4 мг/г), касторовое масло (1,9 мг/г). Состав стеролов в % и общее содержание стеролов приведены в табл. 14.
В общем, среди всех образцов масла из семян основным фитостерином был β-ситостерол (интервал 30-57% от общего содержания стеролов). Для масел наблюдался широкий интервал доли других основных стеролов: кампэстерол (2-17%), Δ5-стигмастерол (0,7-18%), Δ5-авенастерол (4-23%), Δ7-стигмастерол (1-18%). Масла различных видов содержали другой профиль стеролов, причем некоторые профили были весьма отличными. В случае масла рапса оно содержало самую высокую долю кампэстерола (33,6%), в то время как образцы других видов в общем содержали более низкие уровни, например до 17% в арахисовом масле.
Сафлоровое масло содержало относительно высокую долю Δ7-стигмастерола (18%), в то время как содержание данного стерола обычно было низким в маслах других видов, до 9% в масле подсолнечника. Поскольку они являются характерными для каждого вида, профили стеролов могут, таким образом, использоваться как вспомогательные для идентификации конкретных овощных или растительных масел и проверки их неподдельности или подделки другими маслами.
Сравнивали по два образца из подсолнечника и сафлора, в каждом случае один из них был получен холодным прессованием семян и был нерафинированным, в то время как другой не был получен холодным прессованием и был рафинированным. Хотя наблюдались некоторые отличия, два источника масел имели подобный состав стеролов и общее содержание стеролов, указывая на то, что обработка и рафинация оказывают небольшое влияние на эти два параметра. Содержание стеролов варьировало в три раза между образцами и находилось в диапазоне от 1,9 до 6,8 мг/г. Масло рапса имело самое высокое, а касторовое масло - самое низкое содержание стеролов.
Пример 7. Повышение аккумуляции ДГК в положении sn-2 ТАГ.
Авторы настоящего изобретения считали, что аккумуляция ДГК и/или ДПК в положении sn-2 в
- 69 037817
ТАГ могла бы быть увеличена путем соэкспрессии 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазы (ЛФААТ) и путем биосинтеза ДГК или ДПК, например, как обеспечивается конструкцией GA7 или ее вариантами. Предпочтительными ЛФААТ являются такие, которые могут воздействовать на полиненасыщенный C22 жирный ацил-КоА как субстрат, предпочтительно ДГК-КоА и/или ДПК-КоА, приводя к увеличению инсерции полиненасыщенной цепи C22 в положении sn-2 ЛФХ с образованием ФХ, относительно эндогенного ЛФААТ. Цитоплазматические ферменты ЛФААТ часто демонстрируют разнообразные предпочтения в отношении субстрата, особенно, если виды синтезирует и аккумулирует необычные жирные кислоты в ТАГ. Было показано, что ЛФААТ2 из Limnanthes douglasii использует эрукоил-КоА (С22:1-КоА) в качестве субстрата для синтеза ФХ, в противоположность ЛФААТ1 тех же видов, которые не могли бы утилизировать субстрат C22 (Brown et al., 2002).
Таблица 14. Содержание и состав стеролов в проанализированных растительных маслах.
Номер стерола* Общее название стерола Кунжут Олива Подсолнечник Подсолнечник Клещевина Рапс Сафлор Сафлор Арахис Лен (семя льна) Лен (семя льна) Соя
холодное прессование холодное прессование
1 холестерин 0,2 0,8 0,2 0,0 0,1 0,3 0.2 0,1 0,2 0,4 ОД 0,2
2 брассикастерол 0,1 0,0 0,0 0,0 0,3 0,1 0,0 0,0 0,0 0.2 0,2 о,о
3 чалинастерол / 24метиленхолестерин 1,5 0,1 0,3 0,1 1,1 2,4 0,2 0,1 0,9 1,5 1,4 0,8
4 кампэстерол / 24метилхолестерин 16,2 2,4 7,4 7,9 8,4 33,6 12,1 8,5 17,4 15,7 14,4 16,9
5 кампэстанол / 24метилхолестанол 0,7 0,3 0,3 0,1 0,9 0,2 0,8 0,8 0,3 0,2 0,2 0,7
6 С29:2* о.о 0,0 0,1 0,2 0,0 0,1 0,5 0,5 0,0 1,2 1,3 0,1
7 Д5-стигмастерол 6,4 1.2 7,4 7,2 18,6 0,7 7,0 4,6 6,9 5,1 5,8 17,6
8 неизвестен 0,5 1,3 0,7 0,6 0,8 0,7 0,7 1,3 0,4 0,7 0,6 1,3
9 эргост-7-ен-ЗР-ол 0,1 0,1 1,9 1,8 0,2 0,4 2,7 4,0 1,4 1,4 1,4 1,0
10 неизвестен 0,0 1,3 0,9 0,8 1,2 0,9 1,8 0,7 1,2 0,7 0,5 0,7
11 эбурикол 1,6 1,8 4,1 4,4 1,5 1.θ 1,9 2,9 1,2 3,5 3,3 0,9
12 β-ситостерол / 24-этилхолестерин 55,3 45,6 43,9 43,6 37,7 50,8 40,2 35,1 57,2 29,9 28,4 40,2
13 Δδ-авенастерол / изофукостерол 8,6 16,9 7,2 4,1 19,3 4,4 7,3 6,3 5,3 23,0 24,2 3,3
14 тритерпеновый спирт 0,0 2,4 0,9 1,1 0,0 0,0 1,6 1,9 0,0 0,0 0,0 0,9
15 тритерпеновый спирт 0,0 0,0 0,7 0,6 0,0 0,0 2,8 1,8 0,0 0,0 0,3 0,0
16 С29:2* 0,0 0,5 0,7 0,7 1,5 1,2 2,8 1,9 2,0 1.0 0,7 0,5
17 С29:2* 1,0 0,9 2,3 2,4 0,6 0,4 1,3 1,9 0,9 1,0 1,0 1,0
18 С30:2* 0,0 0,0 0,0 0,0 1,9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
19 Д7-стигмастерол / стигмаст-7-ен-Зр-ол 2,2 7,1 9,3 10,9 2,3 0,9 10,5 18,3 1,1 7,9 8,7 5,6
20 Д7-авенастерол 1,3 0,1 4,0 3,6 0,6 0,2 2,0 4,7 0,7 0,4 0,4 0,6
21 неизвестен 0,7 7,1 0,9 0,8 0,0 0,4 0,3 0,4 0,0 3,0 3,6 0,0
22 неизвестен 0,3 0,0 0,3 0,9 0,0 0,0 1,2 1,3 0,2 0,1 0,0 0,3
23 неизвестен 0,2 0,2 0,3 0,3 0,2 0,1 0,3 0,2 0,2 0,1 0,2 0,5
24 неизвестен 0,0 3,1 0,9 1,3 0,6 0,4 0,2 0,4 0,7 1,7 1,9 0,8
25 неизвестен 0,9 0,4 0,3 0,5 0,3 0,1 0,5 0,7 0,3 0,1 0,1 0,6
26 030:2 2,2 6,0 4,6 5,7 1,4 0,6 1,0 1,2 1,2 1,2 1,1 5,2
27 неизвестен 0,0 0,4 0,4 0,3 0,3 0,2 0,1 0,2 0,3 0,1 0,0 0,3
Сумма 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
Общий стерол (мг/г масла) 5,8 2,4 4,1 3,7 1,9 6,8 3,2 3,0 3,2 4,8 5,2 3,0
C29:2* и С30:2* обозначают стерол C29 с двумя двойными связями и стерол C30 с двумя двойными связями соответственно.
Рассматривались известные ЛФКАТ, и многие были выбраны для тестирования, в том числе те, от которых не ожидалось увеличения инкорпорации ДГК в положении sn-2, в качестве контроля. Известные ЛФКАТ включали ЛФКАТ2 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 40, номер доступа ABG48392, Kim et al., 2005), ЛФКАТ Limnanthes alba (SEQ ID NO: 41, номер доступа ACC49185, Lassner et al., 1995), Slc 1p Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 42, номер доступа NP_010231, Zou et al., 1997), ЛФКАТ 1 Mortierella alpina (SEQ ID NO: 44, номер доступа AED33305; US 7879591) и ЛФКАТ Brassica napus (SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, номера доступа ADC97479 и ADC97478 соответственно).
ЛФКАТ2 Arabidopsis (также обозначенная ЛФАТ2) представляет собой локализованный в эндоплазматическом ретикулуме фермент, который продемонстрировал активность в отношении субстратов
- 70 037817
C16 и C18, однако активность в отношении субстратов C20 или C22 не тестировалась (Kim et al., 2005). ЛФКАТ2 Limnanthes alba продемонстрировала вставку ацильной цепи C22:1 в положение sn-2 ФК, хотя способность использовать ДГК или ДПК в качестве субстрата не тестировалась (Lassner et al., 1995). Выбранная ЛФКАТ S. cerevisiae Slc1p продемонстрировала активность в виде использования 22:1-КоА в дополнение к 18:1-КоА в качестве субстратов, указывая на широкую специфичность в отношении субстратов с учетом длины цепи (Zou et al., 1997). Снова, ДГК-КоА, ДПК-КоА и другие ДЦ-ПНЖК не тестировались в качестве субстратов. Ранее было продемонстрировано, что ЛФКАТ Mortierella обладает активностью в отношении жирнокислотных субстратов ЭПК и ДГК в трансгенном Yarrowia lipolytica (US 7879591), но их активность в растительных клетках неизвестна.
Дополнительные ЛФКАТ были идентифицированы изобретателями. Micromonas pusilla представляет собой микроводоросль, которая вырабатывает и аккумулирует ДГК в масле, хотя позиционное распределение ДГК на ТАГ в данном виде не было подтверждено. ЛФКАТ Micromonas pusilla (SEQ ID NO: 43, номер доступа XP002501997) была идентифицирована посредством поиска среди геномных последовательностей Micromonas pusilla с использованием ЛФКАТ2 Arabidopsis в качестве последовательности запроса BLAST. Возникли несколько последовательностей-кандидатов, и последовательность XP_002501997 была синтезирована для тестирования в отношении C22 ДЦ-ПНЖК. ЛФКАТ Ricinus communis была аннотирована как предполагаемая ЛФКАТ в последовательности генома клещевины (Chan et al., 2010). Четыре кандидата на ЛФКАТ из генома клещевины были синтезированы и протестированы на неочищенных лизатах листьев инфильтрованной ткани листа N. benthamiana. Раскрытая в настоящем документе последовательность-кандидат продемонстрировала активность ЛФКАТ.
Целый ряд кандидатов на ЛФКАТ был выровнен с известным ЛФКАТ на филогенетическом дереве (фиг. 8). Следует отметить, что предполагаемая ЛФКАТ Micromonas не группируется с предполагаемыми C22 ЛФКАТ, но имеет дивергирующую последовательность.
В качестве первичного анализа различных ЛФКАТ на предмет их способности использовать ДГК-КоА в качестве субстрата получены химерные генетические конструкции для конститутивной экспрессии экзогенных ЛФКАТ в листьях N. benthamiana, каждая под контролем промотора 35S, как раскрыто ниже: 35S:Arath-ЛФАТ2 (Arabidopsis ER ЛФКАТ); 35S:Limal-ЛФКАТ (ЛФКАТ Limnanthes alba); 35S:Sacce-Slc1p (ЛФКАТ S. cerevisiae); 35S:Micpu-ЛФКАТ (ЛФКАТ Micromonas pusilla), 35S:Moral-ЛФКАТ1 (ЛФКАТ Mortierella alpina); 35S:Brana-LPAAT1.13 (Brassica napus ЛФААТ1.13); 35S:Brana-LPAAT1,5 (Brassica napus ЛФААТ1,5). Конструкции 35S:p19, не содержащие экзогенной ЛФКАТ, использовали в эксперименте в качестве контроля. Каждую из указанных конструкций вводили с помощью Agrobacterium в листья N. benthamiana, как раскрыто в Примере 1, и через 5 дней после инфильтрации обработанные зоны листьев вырезали и измельчали для получения лизата листьев. Каждый лизат содержит экзогенную ЛФКАТ, а также эндогенные ферменты для синтеза ЛФК. Реакционные смеси получали in vitro, по отдельности добавляя меченые 14C ОК и ДГК к лизатам. Реакционные смеси инкубировали при 25°C и уровень инкорпорации меченных 14C жирных кислот в ФК определяют методом ТСХ. Оценивали способность каждой ЛФКАТ использовать ДГК относительно АРК и жирных кислот C18. Обнаружено, что ЛФКАТ пенника лугового (Limnanthes alba), Mortierella и Saccharomyces обладают активностью в отношении субстрата ДГК, причем радиомеченая ФК возникает в случае этих, но не других ЛФКАТ.
Активность всех ЛФКАТ была подтверждена контрольным потреблением олеиновой кислоты.
Для тестирования активности ЛФКАТ в семенах некоторое количество кодирующих белок последовательностей или ЛФКАТ вставляли в бинарный вектор под контролем промотора конлинина (pLuCnl1). Получающиеся в результате генетические конструкции, содержащие химерные гены CnHArath-ЛФКАТ (отрицательный контроль), CnΠ:Limal-ЛФКАТ, Cn1:Sacce-Slc1p и CnHMoral-ЛФКАТ соответственно, далее использовали для трансформации растений A. thaliana, образующих ДГК в семени, чтобы получить стабильные трансформанты, экспрессирующие ЛФКАТ и трансгенный путь ДНК в специфичной для семени форме, чтобы протестировать, будет ли увеличиваться инкорпорация ДГК в положении sn-2 ТАГ. Кроме того, конструкции используются для трансформации растений B. napus и C. sativa, которые уже содержат конструкцию GA7 и ее варианты (Примеры 2-4), с целью получения потомства, несущего материнские и ЛФКАТ генетические конструкции. Протестировано увеличение инкорпорации ДГК в положении sn-2 ТАГ относительно инкорпорации в растениях без кодирующих ЛФКАТ трансгенов. Содержание масла также повышается в семенах, особенно в случае семян, вырабатывающих более высокие уровни ДГК, нейтрализуя тенденцию, наблюдаемую в семени Arabidopsis, как раскрыто в Примере 2.
Конструкцию 35S:Moral-LPAAT1 использовали для трансформации уже трансгенной линии Arabidopsis thaliana, которая была гомозиготной по T-ДНК из конструкции GA7 и семя которой содержало около 15% ДГК в липидах семени (Petrie et al., 2012). Для этого применяли ген селекционного маркера канамицина в конструкции 35S:Moral-LPAAT1, который был отличен от гена селекционного маркера bar, уже присутствующего в трансгенной линии. Были отобраны трансгенные саженцы, устойчивые к канамицину, и выращены до состояния зрелости в теплице. Урожай семян T2 был собран, и состав жирных кислот в общих липидах семян проанализирован методом ГХ (табл. 15). Три фенотипа наблюдали среди
- 71 037817 независимо трансформированных линий. В первой группе (6/33 линий) содержание ДПК существенно повышалось до значительно более высокого уровня, чем уровень ДГК, до около 10,6% в общих липидах семян. Это происходило за счет ДГК, содержание которой было существенно снижено в данной группе линий. В двух линиях из указанной первой группы суммарное содержание ДПК + ДГК был снижено, но не в других 4 линиях. Во второй группе (5/33) уровни ДПК и ДГК были равными, с около таким же суммарным содержанием ДПК + ДГК, как и в семени материнского растения. В третьей группе уровни ДПК и ДГК были сходны с уровнями в семенах материнских растений. Одно из возможных объяснений для повышенного уровня ДПК в первой и второй группах состоит в том, что ЛФААТ вытесняет Δ4-десатуразу на субстрате ДПК-КоА и преимущественно инкорпорирует ДПК в ФХ и далее в ТАГ, относительно Δ4-десатурации. Второе возможное объяснение состоит в том, что Δ4-десатурацuя частично ингибируется.
Собирали семена растений Arabidopsis, трансформированных T-ДНК конструкцией GA7, которые были дополнительно трансформированы вектором Cnn::Moral-LPAAT, и из семян экстрагировали масло. Далее фракцию ТАГ выделяли из экстрагированного масла методами ТСХ и выделяли с пластинки ТСХ. Полученные образцы ТАГ и образцы масла семян до фракционирования анализированы при помощи расщепления липазой Rhizopus, чтобы определить позиционное распределение ДГК. Липаза специфична в отношении ацильных групп, этерифицированных в положении sn-1 или sn-3 ТАГ. Это осуществляли путем приготовления эмульсии каждого образца липида в 5% аравийской камеди, применяя устройства для обработки ультразвуком и добавляя раствор липазы Rhizopus в 0,1 М Трис-HCl, рН 7,7, содержащий 5 мМ CaCl2, с инкубацией смесей при 30°C и непрерывном встряхивании. Реакцию в каждой реакционной смеси останавливали, добавляя хлороформ:метанол (2/1, об./об.) и один объем 0,1 М KCl к каждой смеси. Липид экстрагировали в хлороформную фракцию и определяли относительные количества sn-2 МАГ, sn-1/3 ФФХ, ДАГ и компонентов ТАГ полученного липида разделением на пропитанной 2,3% борной кислотой пластинке ТСХ с применением гексана/диэтилового эфира/уксусной кислоты (50/50/1, об./об.). Полосы липидов визуализировали, обрызгивая 0,01% примулином в ацетоне/воде (80/20, об./об.) на пластинке ТСХ с визуализацией в УФ-свете. Отдельные полосы липидов идентифицировали на основании пятен липидных стандартов, нанесенных на такую же пластинку ТСХ. ТСХ полосы липидов собирали в стеклянные флаконы и получали из них метиловые эфиры жирных кислот с применением 1н. метанольной HCl (Supelco), с инкубацией при 80°C в течение 2 ч. Состав жирных кислот индивидуальных липидов был проанализирован ГХ.
Данный анализ продемонстрировал, что ДГК в семенах материнских растений, трансформированных GA7 (линии 22-2-1-1 и 22-2-38-7), преимущественно была этерифицирована в положении sn-1 или sn-3 ТАГ. И наоборот, липиды в семени NY11 и NY15, трансформированном как конструкцией GA7, так и трансгеном, кодирующим ЛФААТ, были обогащены ДГК в sn-2, причем 35% ДГК в одной из линий и 48% ДГК в другой линии были этерифицированы в положении sn-2 ТАГ, т.е. после расщепления липазой ДГК присутствовала, как sn-2-МАГ (табл. 16). Аналогичные результаты получены для семени B. napus и B. juncea, трансформированного как T-ДНК из конструкции GA7-modB, так и геном, кодирующим ЛФААТ, и вырабатывающие ДГК.
Для того чтобы определить, существует ли предпочтение ЛФААТ Mortierella или другой ЛФААТ в отношении ДПК-КоА или ДГК-КоА, in vitro получали реакционные смеси, добавляя по отдельности 14C-меченый-ДПК-КоА или -ДГК-КоА к лизатам листьев N. benthamiana, временно экспрессирующих ЛФААТ-кандидата под контролем конститутивного промотора, как изложено выше. Реакционные смеси инкубировали при 25°C и уровни инкорпорации меченных 14C жирных кислот в ФХ определяли ТСХ методом анализа липидов. Оценивали способность каждой ЛФААТ использовать ДГК-КоА относительно ДПК-КоА. Гены, кодирующие ЛФААТ с доказанно высокой ДГК инкорпорирующей активностью ЛФААТ, применяли для получения трансформированных ДГК-вырабатывающих растений рапса и семени.
Гены, кодирующие ЛФААТ с высокой активностью использования ДПК-КоА, применяли для трансформации ДПК-вырабатывающих растений и семени, чтобы увеличить количество ДПК, этерифицированной в положении sn-2 ТАГ.
- 72 037817
Таблица 15. Состав жирных кислот (% общих жирных кислот) трансгенных семян A. thaliana, трансформированных конструкцией ЛФААТ1, а также конструкцией GA7 для выработки ДГК.______
О чэ 0 СЮ и СЮ и C18:ldll еч 00 и 40 S б ГО 09 и О й и *с 90 пргогэ О еч С20:2п6 С20:4п6 С20:ЗпЗ О еч 2 *g о еч гч гч и V) о еч с •л еч С22:6пЗ
NY-1 9,3 3,2 9,1 6,8 9,4 0,5 23,8 1,6 4,1 7,9 5,1 0,6 0,0 0,9 0,4 0,6 0,6 1,2 7,9 4,5
NY-2 10,7 3,3 6,5 4,4 7,6 0,3 28,1 1,9 4,3 8,5 3,7 0,7 0,0 1,1 0,5 1,1 0,8 1,4 1,1 11,6
NY-3 9,3 2,8 6,3 3,4 10,3 0,2 32,8 2,2 2,7 6,2 3,6 1,1 0,0 1,9 0,5 1,4 0,9 0,7 1,0 10,7
NY-4 11,4 3,5 4,5 3,1 7,0 0,3 32,5 2,1 4,7 5,5 2,3 1,0 0,0 1,9 0,6 0,8 0,6 1,1 0,9 14,3
NY-5 14,6 4,5 7,0 7,7 6,7 0,3 20,7 2,2 5,7 5,4 4,8 0,4 0,0 0,9 0,9 0,8 0,4 1,2 1,0 11,7
NY-6 7,8 2,7 12,5 2,2 18,0 0,1 24,9 1,8 0,7 15,5 3,1 1,4 0,0 1,2 0,3 0,5 1,5 0,3 3,0 0,8
NY-7 9,3 29 6 7 3,8 9,2 0,2 31,5 2Д Ч 9 7 7 0 9 0,0 1 6 0 5 1 я 0,8 0 о 1,1 10,9
NY-8 8,8 3,2 8,2 5,5 11,0 0,3 25,3 1,9 3,0 8,3 5,4 1,0 0,0 1,2 0,5 0,8 0,8 0,8 6,1 6,0
NY-9 12,3 3,7 5,0 4,6 7,1 0,2 28,3 2,3 4,2 5,6 3,8 0,8 0,0 1,6 0,7 0,7 0,6 1,1 1,2 13,8
NY-10 8,6 3,2 8,5 3,1 9,7 0,3 31,5 1,6 3,4 8,7 2,8 1,0 0,0 1,3 0,3 0,9 0,6 1,1 10,6 1,0
NY-11 11,5 3,2 4,5 2,5 7,1 0,3 33,3 2,1 3,9 5,7 1,9 0,9 0,0 2,0 0,5 0,7 0,7 0,8 1,0 15,6
NY-12 8,7 3,2 7,5 5,1 8,5 0,2 26,8 2,0 3,7 8,7 5,1 0,9 0,0 1,2 0,5 1,1 0,8 1,2 10,0 2,6
NY-13 11,5 3,4 5,2 3,4 8,3 0,3 30,0 2,2 5,0 6,2 3,2 0,9 0,0 1,7 0,6 1,5 0,8 1,1 1,0 11,6
NY-14 9,2 2,9 6,6 2,0 10,3 0,2 34,7 1,9 3,3 7,7 1,6 1,2 0,0 1,8 0,4 1,2 0,8 0,9 0,8 И,1
NY-15 10,9 3,3 4,6 2,7 7,0 0,3 34,1 1,9 5,1 5,5 2,0 0,9 0,0 1,8 0,5 0,8 0,5 1,0 1,0 14,7
NY-16 10,5 3,4 6,0 4,6 7,8 0,3 30,3 1,8 4,4 5,4 2,9 0,7 0,0 1,5 0,5 0,9 0,5 1,1 1,3 14,2
NY-17 9Д 2,4 5,9 2,5 10,4 0,2 35,4 1,6 3,6 6,4 2,1 1,1 0,0 1,9 0,4 1,2 0,7 1,0 0,9 П,7
NY-18 9,7 3,6 8,8 6,2 12,1 0,3 21,0 1,9 4,0 8,3 5,9 0,8 0,0 0,9 0,5 0,6 0,9 1,0 5,7 5,1
NY-19 8,4 3,1 12,0 3,1 14,6 0,2 28,8 1,7 1,6 п,з 3,2 1,0 0,0 1,4 0,4 0,6 1,0 0,6 3,9 1,2
NY-20 10,1 3,2 5,4 з,з 8,9 0,3 32,8 2,1 4,1 5,5 2,8 1,0 0,0 1,9 0,5 1,1 0,7 0,9 1,1 12,1
NY-21 10,5 3,6 5,6 3,8 8,2 0,3 31,9 2,0 4,6 5,9 2,8 0,9 0,0 1,7 0,5 0,8 0,6 1,0 0,9 12,5
NY-22 8,4 3,3 7,4 2,3 9,4 0,2 33,5 1,8 3,4 8,8 2,2 1,2 0,0 1,7 0,4 1,3 0,7 1,0 5,5 6,1
NY-23 8,3 2,8 7,0 1,9 11,0 0,2 34,6 1,9 2,6 9,3 1,7 1,4 0,0 2,0 0,4 1,2 1,0 0,7 0,7 9,9
NY-24 9,0 3,3 7,0 4,3 9,9 0,2 30,0 1,8 3,2 7,7 4,3 1,0 0,0 1,6 0,4 0,6 0,8 0,8 3,4 8,8
NY-25 9,4 3,3 6,0 3,6 8,2 0,2 32,6 1,8 4,0 6,8 3,6 1,0 0,0 1,7 0,4 0,6 0,7 0,9 4,8 8,7
NY-26 10,4 4,2 8,0 3,8 16,0 0,4 18,7 2,5 2,5 10,1 4,0 1,0 0,0 0,8 0,8 1,9 1,0 1,4 1,4 8,4
NY-27 9,4 3,2 7,5 5,3 11,4 0,2 28,6 2,0 2,3 7,5 5,5 1,0 0,0 1,8 0,5 0,6 0,9 0,6 1,5 7,6
NY-28 9,4 3,4 6,5 3,6 8,8 0,3 32,4 1,8 3,9 6,7 3,3 0,9 0,0 1,6 0,4 0,7 0,6 1,0 10,1 2,7
NY-29 10,2 3,7 7,6 4,3 8,0 0,4 28,8 1,7 4,8 7,6 2,9 0,7 0,0 1,1 0,4 0,7 0,5 1,4 1,9 11,6
NY-30 11,1 3,5 5,4 4,1 7,3 0,3 30,2 2,0 4,7 6,0 3,0 0,8 0,0 1,7 0,5 0,7 0,7 1,1 1,0 13,7
NY-31 9,6 3,0 5,6 2,1 8,5 0,2 35,4 2,0 3,9 7,1 1,7 1,2 0,0 2,1 0,4 0,9 0,8 0,8 0,8 12,3
NY-32 8,5 3,1 8,0 1,9 9,5 0,3 31,7 1,5 3,3 12,9 1,4 1,0 0,1 1,1 0,3 1,2 0,8 1,2 0,8 9,8
NY-33 10,3 3,8 7,7 6,3 8,1 0,3 24,4 2,0 4,4 7,5 4,8 0,7 0,0 1,1 0,5 0,6 0,6 1,1 2,8 10,7
Таблица 16. Присутствие ДГК в положении sn-2 ТАГ в липиде из трансгенных семян A. thaliana, трансформированные вектором Cnl1::Moral-LPAAT, а также T-ДНК конструкцией GA7, относительно присутствия ДГК в ТАГ. Состав жирных кислот ТАГ и sn-2 МАГ также включал по 0-0,4% каждой из 14:0, 16:1w13t, 16:2, 16:3, 22:0 и 24:0.
Образец О <0 о σ» <0 о do Q do Q ’Γ- ΟΟ Q C18:2 C18:3n6 C18:3n3 О о CM Q do C20:1d11 CO о CM ^20:2n6 C20:3n6 C20:4n6 ic20:3n3 CO c о CM CM CM Q ^0:5n3 j ^22:4η6 ^2:5η6 22:4n3 22:5n3 С22:6пЗ
22-2-1-1 ТАГ 12,2 0,4 4,4 6,4 3,9 7,2 0,8 28,8 1,6 4,3 9,7 2,3 0,7 0,1 0,1 1,3 1.0 0,6 2,1 0,0 0,7 10,1
2-МАГ 0,6 0,1 0,3 8,3 2,5 10,1 0,7 53,9 0,2 6,5 0,3 0,1 0,1 0,0 0,0 0,3 0,2 0,0 3,8 0,0 2,3 9,1
ДГК в sn-2 = 30%
22-2-38-7 масло 10,0 I 3,7 6,0 2,7 I 6,4 0,4 I I 33,8 1,6 3,7 11,3 1,8 I 0,8 1,3 0,9 0,6 1,2 0,1 0,7 11,6
2-МАГ 0,5 0,1 0,3 9,7 2,4 11,1 0,6 I 60,0 0,1 3,6 0,3 0,1 0,1 0,0 0,0 0,4 0,2 0,0 2,1 0,1 1,3 6,7
ДГК в sn-2 = 19%
Дополнительная трансформация геном, кодирующим Mortierella alpina ЛФААТ
ΝΥ11-ΤΑΓ 11,0 0,2 3,4 6,0 2,8 9,2 0,3 34,8 1,6 3,6 6,3 1,8 1,0 0,0 0,0 1,8 0,7 0,6 0,9 0,0 0,1 0,6 12,2
2-МАГ 0,7 0,1 0,2 6,7 1,1 11,8 0,3 49,8 0,2 3,7 0,5 1,5 0,3 0,0 0,0 1,6 0,6 0,1 0,8 0,1 0,2 1,6 17,8
ДГК в sn-2 = 48 %
NY-15масло 11,0 0,0 3,3 4,6 2,8 6,9 0,3 33,6 2,0 5,1 5,5 2,1 0,9 0,0 0,0 1,9 0,7 0,6 0,9 0,1 0,4 0,9 14,9
2-МАГ 0,8 0,1 0,3 6,4 1,3 11,4 0,3 50,2 0,2 4,9 0,4 1,4 0,2 0,0 0,0 1,5 0,6 0,1 0,9 0,0 0,0 0,2 1,6 16,7
ДГК в sn-2 = 37%
Пример 8. Дальнейший анализ трансгенных семян Camelina sativa.
Общее содержание липидов.
Семя C. sativa, гомозиготное по T-ДНК из конструкции GA7 и содержащее ДГК в общем содержании жирных кислот, было проанализировано на предмет содержания состава общих липидов и как указано ниже. Для семян выполняли две последовательные стадии экстракции растворителем, вначале с применением гексана и затем с применением хлороформа/метанола. В ходе экстракции и анализа не добавляли антиоксидантов. Метод экстракции Сокслета, который обычно применяется для извлечения липидов из семени путем длительного нагревания и кипячения с обратным холодильником смеси липида/растворителя, в данном случае не применялся из-за потенциального разложения или окисления ω3 ПНЖК, таких как ДГК.
Гексан применяли в качестве растворителя для первой экстракции, поскольку он является промышленным стандартом для масличных культур. Кроме того, он преимущественно экстрагирует ТАГ-содержащее масло за счет своих сольватирующих свойств и относительно слабой солюбилизации полярных липидов, особенно при комнатной температуре. Трансформированные и контрольные семена Camelina (130 и 30 , соответственно) смачивали гексаном и измельчали при помощи электрической агатовой ступки и пестика (Retsch Muhle, Германия). Смеси переносили в делительные воронки и четыре
- 73 037817 раза экстрагировали с применением общего объема 800 мл гексана, включая статическую экстракцию на протяжении ночи для третьей экстракции. Для каждой экстракции экстракты фильтровали сквозь фильтр из стекловолокна GFC под вакуумом для удаления мелких частиц, после чего выпаривали на ротационном испарителе при 40°C под вакуумом. Экстракты объединяли в пул с получением богатых ТАГ гексановых экстрактов.
После экстракции гексаном оставшийся жмых семян далее экстрагировали с применением хлороформа-метанола (ХМ, 1:1 об./об.) по такой же методике, как проводили экстракцию гексаном. Затем жмых удаляли фильтрацией и объединенные экстракты выпаривали на роторном испарителе. Объединенные в пул неочищенные ХМ общего липида затем растворяли с применением однофазной смеси метанола-хлороформа-воды (2:1:0.8, об./об./об.). Фракции разделяли добавлением хлороформа-воды (конечное соотношение растворителей, 1:1:0,9 об./об./об. метанола/хлороформа/воды). Очищенный липид в каждом экстракте, распределенный в нижней хлороформной фазе, концентрировали с применением роторного испарения и получали ХМ экстракты, богатые полярными липидами. Содержание липида в каждом из этих экстрактов определяли гравиметрически.
Для анализа состава жирных кислот аликвоты гексановых и ХМ экстрактов трансметилировали по способу Christie et al. (1982) с получением метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК), применяя метанол-хлороформ-конц. хлористоводородную кислоту (3 мл, 10:1:1, 80°C, 2 ч). МЭЖК экстрагировали гексаном-хлороформом (4:1, 3x1,8 мл). Кроме того, образцы жмыха семени (1-2 г), оставшегося после экстракции гексаном и ХМ, транс-метилировали для гравиметрического измерения содержания любого остаточного липида в виде МЭЖК. Общее содержание липидов в семени вычисляли, суммируя содержание липидов в гексановых и ХМ экстрактах и содержание МЭЖК в трансметилированном жмыхе после экстракции растворителями.
Трансгенные семена содержали несколько меньшее количество общих липидов, на уровне 36,2% от массы семени, по сравнению с семенами Camelina sativa дикого типа, 40,9% от массы семени. Для семян, включая семена масличных культур, общие липиды определяли как сумму экстрагированного растворителями липида, полученного последовательной экстракцией гексаном, а затем хлороформом-метанолом, и остаточного липида, высвобожденного трансметилированием экстрагированного жмыха после экстракции растворителями, как описано в качестве примера в данном документе. Такие общие липиды состояли по большей части из липидов, содержащих жирные кислоты, таких как триацилглицериды и полярные липиды, и небольших количеств липидов, не содержащих жирных кислот, таких как фитостеролы и жирные спирты, которые могут присутствовать в свободной неэтерифицированной форме или могут быть этерифицированы жирными кислотами. Кроме того, любые эфиры стеролов или эфиры восков и углеводороды, такие как каротиноиды, например β-каротин, также входили в экстрагируемый растворителями липид, если они присутствовали. Они были включены в общее гравиметрическое определение и были показаны в анализе ТСХ-ПИД (табл. 17).
Из общих липидов 31-38% липидов от массы семени было экстрагировано гексаном для трансгенных и контрольных семян соответственно, что отвечает 86 и 92% общих липидов в семенах. С помощью экстракции ХМ извлекали еще 4,8 и 2,4% (от массы семени) в основном богатый полярными липидами экстракт из трансгенных и контрольных семян соответственно. Остаточный липид, высвобождающийся трансметилированием оставшегося после экстракции растворителями жмыха семян масличной культуры, составил 0,3 и 0,4% от массы семени соответственно. Т.е. первая и вторая экстракция растворителями суммарно извлекает 99% от общего содержимого липидов в семени (т.е.36,2 или 40,9% от массы семени, что в основном представляет собой липид, содержащий жирные кислоты, например триглицериды и полярные липиды, состоящие из глико- и фосфолипидов (см. следующий раздел - анализ классов липидов)).
Анализ классов липидов.
Классы липида в гексановых и ХМ экстрактах были проанализированы тонкослойной хроматографией с обнаружением при помощи плазменно-ионизационного детектора (ТСХ-ПИД; Iatroscan Mark V, Iatron Laboratories, Токио, Япония), с применением гексана/диэтилового эфира/ледяной уксусной кислоты (70:10:0,1, об./об./об.) в качестве системы растворителей для проявления в сочетании с кремния диоксидом Chromarod S-III на кварцевых палочках. Подходящие калибровочные кривые получали с применением репрезентативных стандартов, полученных от Nu-Chek Prep, Inc. (Элизайан, Миннесота, США). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения SIC-480II (Версия SISC: 7.0-E). Различные виды фосфолипидов разделяли с применением очищенной фосфолипидной фракции, полученной после колоночной хроматографии на кремния диоксиде, с проявлением палочек в хлороформе/метаноле/ледяной уксусной кислоте/воде (85:17:5:2, об./об./об.) перед обнаружением с помощью ПИД.
Для отделения ТАГ, гликолипидных и фосфолипидных фракций от ХМ экстрактов применяли гель кремния диоксида 60 (100-200 меш) (0,3-1 г) в короткой стеклянной колонке или пипетке Пастера, заполненной стекловатой, чтобы очистить 10 мг очищенного ХМ экстракта липидов. Остаточную фракцию ТАГ в ХМ экстракте элюировали с применением 20 мл 10% диэтилового эфира в гексане, гликолипиды
- 74 037817 элюировали 20 мл ацетона и фосфолипиды элюировали в две стадии, вначале 10 мл метанола и затем мл метанола-хлороформа-воды (5:3:2). Указанная вторая элюация увеличивает выход фосфолипидов.
Выход каждой фракции определяли гравиметрически и чистоту проверяли ТСХ-ПИД. Все экстракции и фракции хранили в дихлорметане при -20°C до дальнейшего анализа ГХ и ГХ-МС.
Богатые ТАГ гексановые экстракты от каждого из трансгенных и контрольных семян содержали около 96% ТАГ. ХМ экстракты содержали остаточные количества ТАГ 44% и 13 мас.% ХМ экстрактов соответственно для трансгенных семян и семян дикого типа. В противоположность гексановым экстрактам, ХМ экстракты были богаты полярными липидами, а именно фосфолипидами и гликолипидами, содержание которых соответствовало 50% и 76 мас.% ХМ экстрактов соответственно для трансгенных и контрольных семян (табл. 17). Основным фосфолипидом был фосфатидилхолин (ФХ), который составлял 70-79% общих фосфолипидов, далее следовал фосфатидилэтаноламин (ФЭ, 7-13%), при относительно низких уровнях фосфатидиновой кислоты (ФК, 2-5%) и фосфатидилсерина (ФС, <2%).
Состав жирных кислот.
В общем для семян, вырабатывающих ДГК и/или ДПК, авторы изобретения наблюдали состав жирных кислот общих липидов в семенах, по данным прямого трансметилирования общих липидов в семени, сходный с составом липидов во фракции ТАГ. Это было результатом того, что более 90% общих липидов, присутствующих в семени, находились в форме ТАГ.
Состав жирных кислот различных классов липидов в гексановых и ХМ экстрактах определяли газовой хроматографией (ГХ) и методом ГХ-МС, с применением прибора для ГХ Agilent Technologies 6890A (Пало-Альто, Калифорния, США), оборудованного капиллярной колонкой из плавленного кварца Supelco Equity™-1 (15 м х 0,1 мм в.д., толщина пленки 0,1 мкм, Беллефонт, Пенсильвания, США), ПИД, инжектором с расщеплением/без расщепления, аутосемлером Agilent Technologies серии 7683В и инжектором. Газом-носителем был гелий. Образцы вводили инжекцией в режиме без расщепления при температуре печи 120°C. После инжекции температуру печи повышали до 270°C со скоростью 10°С/мин и в конце до 300°C со скоростью 5°С/мин. Элюированные соединения определяли количественно с помощью программного обеспечения Agilent Technologies ChemStation (Пало-Альто, Калифорния, США). Результаты ГХ содержали ошибку не более чем ±5% площади пика индивидуальных соединений.
Таблица 17. Состав класса липидов (% от общих липидов, полученный для каждой стадии экстракции) в гексановых и ХМ экстрактах трансгенного и контрольного семени Camelina sativa. ЭС, ЭВ и УВ не разделяли.
Класс липидов Трансгенные семена Контрольные семена
Гексановый ХМ Гексановый ХМ
ЭС/ЭВ/УВ* 1,0 1,4 1,0 1,4
ТАГ 95,6 44,2 96,0 13,1
СЖК 0,9 1,3 0,8 1,4
Н/о** 0,9 1,1 0,8 1,2
СТ 0,5 0,7 0,4 0,4
МАГ 0,7 1,1 0,8 6,2
ФЛ 0,3 50,3 0,3 76,3
Всего 100,0 100,0 100,0 100,0
Сокращения: эфиры стеролов (ЭС), эфиры восков (ЭВ), углеводороды (УВ), триацилглицериды (ТАГ), свободные жирные кислоты (СЖК), не определено (н/о), стеролы (СТ), моноацилглицериды (МАГ), полярные липиды (ПЛ), состоящие из гликолипидов и фосфолипидов;
* ЭС, ЭВ и УВ из этой системы элюировались вместе;
* * может содержать жирные спирты и диацилглицериды (ДАГ).
Анализы методом ГХ-масс-спектрометрии (ГХ-МС) выполняли на приборе ГХ-МС с квадрупольными линзами Finnigan Trace ultra (модель: ThermoQuest Trace DSQ, Thermo Electron Corporation). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения ThermoQuest Xcalibur (Остин, Техас, США). Прибор для ГХ был оборудован инжектором на колонке и капиллярной колонкой HP-5 Ultra Agilient J & W (50 м х 0,32 мм в.д., толщина пленки 0,17 мкм, Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) с полярностью, сходной с описанной выше. Индивидуальные компоненты были идентифицированы с применением данных масс-спектра и сравнением времени удерживания с полученным для аутентичных и лабораторных стандартов. Холостой анализ по полной методике проводили параллельно с серией образцов.
Данные состава жирных кислот в различных классах липидов в экстрактах приведены в табл. 18. В ДГК-вырабатывающем семени Camelina ДГК распределяются на основные липидные фракции (ТАГ, фосфолипиды и гликолипиды) в пропорции, варьирующей от 1,6 до 6,8%, с обратной корреляцией между долями ДГК и АЛК. Богатый ТАГ гексановый экстракт из трансгенного семени содержал 6,8% ДГК и 41% АЛК (табл. 18). Богатый полярными липидами ХМ экстракт содержал 4,2% ДГК и 50% АЛК, т.е.
- 75 037817 относительно меньшее количество ДГК и больше АЛК. Остаточные ТАГ из богатого полярными липидами ХМ экстракта содержали 6% ДГК и 40% АЛК. Гликолипидная фракция, выделенная из ХМ экстракта, содержала 3% ДГК и 39% АЛК, и фосфолипидная фракция содержала самый низкий уровень ДГК (1,6%) и самые высокие уровни АЛК (54%). Трансгенное семя Camelina содержало более высокие уровни АЛК и более низкие уровни ЛК (линолевая кислота, 18:2ω6) по сравнению с контрольными семенами, в основных классах липидов (ТАГ, гликолипиды и фосфолипиды). Доли АЛК и ЛК составляли: АЛК 39-54% и ЛК 4-9% для трансгенных семян и АЛК 12-32% и ЛК 20-29% для контрольных семян. Относительный уровень эруковой кислоты (22:1 ω9) был ниже во всех фракциях из трансгенных семян, чем в контрольных семенах, например 1,3% против 2,7% в гексановых экстрактах (табл. 18).
Состав стеролов в семенах.
Для определения содержания и состава стеролов в экстрагированных липидах образцы, содержащие около 10 мг общих липидов из богатого ТАГгексанового экстракта и богатого полярными липидами ХМ экстракта, омыляли с применением 4 мл 5% KOH в 80% MeOH и нагревали в течение 2 ч при 80°C в покрытой тефлоном стеклянной пробирке с навинчивающейся пробкой. После охлаждения реакционных смесей добавляли 2 мл воды Milli-Q, стеролы и спирты экстрагировали трижды по 2 мл гексана:дихлорметана (4:1, об./об.), встряхивая и перемешивая вихревым перемешиванием. Смеси центрифугировали и каждый экстракт в органичной фазе промывали 2 мл воды Milli-Q, встряхивая и центрифугируя. После отбора верхнего стерол-содержащего органического слоя растворитель выпаривали при помощи потока газообразного азота, а стеролы и спирты силилировали с применением 200 мкл бис-(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА, Sigma-Aldrich), нагревая в течение 2 ч при 80°C в закупоренном ГХ флаконе. Таким способом свободные гидроксильные группы превращали в их триметилсилиловые эфиры. Производные стерол- и спирт-OTMSi сушили в потоке газообразного азота на нагревательном блоке (40°C) и повторно растворяли в дихлорметане (ДХМ) непосредственно перед анализом ГХ/ГХ-МС, как изложено выше.
Таблица 18. Состав жирных кислот (% общих жирных кислот) липидных экстрактов и фракции из трансгенных и контрольных семян C. sativa.
общие: богатый полярными липидами экстракт, содержащий ГЛ и ПЛ из ХМ экстракта; ТАГ, ГЛ и
ФЛ разделяли хроматографией на колонке с кремния диоксидом из ХМ экстрактов;
* суммарное содержание минорных жирных кислот.
Основными стеролами как в трансгенных, так и в контрольных семенах были 24-этилхолестерин (ситостерол, 43-54% от общих стеролов), 24-метилхолестерин (кампэстерол, 20-26%) с более низкими уровнями холестерина (5-8%), брассикастерол (2-7%), изофукостерол (Δ5-авенастерол, 4-6%), стигмастерол (0,5-3%), холест-7-ен-3в-ол, (0,2-0,5%), 24-метилхолестанол (кампэстанол, 0,4-1%) и
- 76 037817
24-дегидрохолестерин (0,5-2%) (табл. 19). Эти девять стеролов отвечают за 86-95% общих стеролов, тогда как остальные компоненты, являющиеся стеролами, идентифицированы только частично по количеству атомов углерода и двойных связей. Общие профили стеролов были сходными для трансгенных и контрольных семян как в случае гексановых, так и в случае ХМ экстрактов.
Анализ жирных спиртов.
Жирные спирты в экстрактах были дериватизированы и проанализированы на предмет стеролов. Серии жирных спиртов от C16-C22 с сопутствующими изо-разветвленными жирными спиртами были идентифицированы как в гексановых, так и ХМ экстрактах. Сходные профили наблюдались для трансгенных и контрольных семян, с некоторой вариацией в долях наблюдаемых индивидуальных компонентов. Фитол, образованный из хлорофилла, был основным алифатическим спиртом и отвечал за 47 и 37% общих жирных спиртов в гексановых фракциях из трансгенных и контрольных семян соответственно. Спирты с нечетной длиной цепи присутствовали с более высокими уровнями в ХМ экстракте (37-38% от общего содержания жирных спиртов), чем в гексановом экстракте (16-23%). Изо-17:0 (16-38%) преобладал над 17:0 (0,3-5,7%). Содержание других спиртов с нечетной длиной цепи составляло 19:0 (4,5-6,5%). Другие обнаруженные спирты включали изо-16:0, 16:0, изо-18:0, 18:1, 18:0, с незначительными уровнями изо-20:0, 20:1, 20:0, а также присутствовали изо-22:0, 22:1 и 22:0.
Обсуждение.
Результаты показывают, что измельчение с помощью механизированной ступки и пестика с многократной экстракцией гексаном при комнатной температуре было эффективным с точки зрения извлечения большей части ТАГ-содержащего масла из трансгенных семян. В дополнение к маслу из трансгенных семян, содержащему умеренные уровни ДГК, трансгенные семени также содержали значительно более высокие уровни АЛК в основных классах липидов (триацилглицериды, гликолипиды и фосфолипиды) по сравнению с контрольными семенами. Это показало, что активность Δ 15-десатуразы значительно повышалась в трансгенных семенах в ходе развития семени. Интересно, что существовали некоторые небольшие отличия в составе жирных кислот и долях ДГК в различных экстрактах и фракциях, причем уровни ДГК были выше в богатом ТАГ гексановом экстракте и ТАГ из ХМ экстракта (6-6,8%) и ниже во фракциях полярных липидов (3% в гликолипидах и 1,6% в фосфолипидах). Уровень 16:0 был выше во фракциях полярных липидов, гликолипидов и фосфолипидов в ХМ экстрактах (19-21%) по сравнению с богатым ТАГ гексановым экстрактом и ТАГ из ХМ экстракта (6-7%).
Таблица 19. Состав стеролов (% от общих стеролов) в трансгенных и контрольных семенах Camelina.
Трансгенные семена Контрольные семена
Стеролы Гексан ХМ Гексан хм
24-дегидрохолестерин 0,8 1,8 0,5 1,4
Холестерин 5,7 7,6 4,7 7,2
Брассикастерол 4,4 6,5 1,9 4,2
Холест-7-ен-ЗР-ол 0,2 0,5 0,3 0,4
Кампэстерол 24,5 20,8 25,7 21,7
Кампэстанол 0,4 1,1 0,4 0,9
Сигмастерол 1,0 2,6 0,5 1,6
Ситостерол 54,3 43,7 53,8 42,9
А5-авенастерол 4,2 5,2 4,7 5,5
Сумма 95,5 89,6 92,6 85,9
Другие
UNI С28 Idb 0,6 1,2 0,7 1,2
UN2C29 Idb 1,2 2,0 1,2 2,4
UN3 С29 2db 0,9 1,8 1,3 2,4
UN4 С28 Idb 0,3 0,9 0,6 1,1
UN5 C30 2db 1,2 1,8 1,4 1,8
UN6 C29 Idb + C30 2db 0,3 2,7 2,2 5,2
Сумма других 4,5 10,4 7,4 14,1
Всего 100 100 100 100
Сокращения: Н/о означает неизвестный стерол, число после C указывает на количество атомов углерода и db обозначает количество двойных связей.
- 77 037817
Состав стеролов в трансгенных семенах и контрольных семенах был сходным к найденному в рафинированном масле Camelina (Shukla et al., 2002), присутствовали те же основные стеролы, указывая на то, что добавленные гены не влияли на синтез стеролов в семенах. Уровень холестерина в масле Camelina был выше встречающегося в большинстве растительных масел. Присутствовал брассикастерол, который является характерным стеролом, найденным в семействе Brassicaceae, которое включает Camelina sativa.
Пример 9. Выработка ДЦ-ПНЖК в семенах Brassica juncea.
Трансгенные растения Brassica juncea получали с применением конструкции GA7-modB (Пример 4) для выработки ДГК, как указано ниже. Семена B. juncea сорта, чувствительного к длительному световому дню, стерилизовали с применением газообразного хлора, как описано Kereszt et al. (2007). Стерилизованные семени проращивали средах МС с 1/2 активности (Murashige and Skoog, 1962), затвердевших с 0,8% агара, с коррекцией рН до 5,8, и выращивали при 24°C и флуоресцентном освещении (50 мкЕ/м2-с) с фотопериодом 16/8 ч (свет/темнота) в течение 6-7 дней. Черешки котиледонов со стеблем 2-4 мм были выделены из этих саженцев в асептических условиях и использовались в качестве эксплантов. Agrobacterium tumefaciens штамм AGL1 трансформировали бинарной конструкцией GA7. Культура Agrobacterium была высеяна и обработана для инфицирования, как описано Belide et al. (2013). Для всех трансформаций около 50 свежевыделенных котиледонных черешков инфицировали 10 мл культуры A. tumefaciens в течение 6 мин. Инфицированные черешки промокали стерильной фильтровальной бумагой для удаления избытка A. tumefaciens и переносили в среды для совместного культивирования (МС, содержащие 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК и 100 мкМ ацетосирингона, также содержащие L-цистеин (50 мг/л), аскорбиновую кислоту (15 мг/л) и МЭС (250 мг/л)). Все планшеты опечатывали микропористой лентой и инкубировали в темноте при 24°C в течение 48 ч совместного культивирования. Далее экспланты переносили в предселекционную среду (агар МС, содержащий 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК, 3 мг/л AgNO3, 250 мг/л цефотаксима и 50 мг/л тиментина) и культивировали в течение 4-5 дней при 24°C с фотопериодом 16/8 ч, после чего экспланты переносили в селекционную среду (агар МС, содержащий 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК, 3 мг/л AgNO3, 250 мг/л цефотаксима, 50 мг/л тиментина и 5 мг/л ФФТ) и культивировали в течение 4 недель при 24°C с фотопериодом 16/8 ч. Экспланты с зеленым каллусом переносили в среду для регенерации побегов (агар МС, содержащий 2,0 мг/л БА, 3 мг/л AgNO3, 250 мг/л цефотаксима, 50 мг/л тиментина и 5 мг/л ФФТ) и культивировали еще на протяжении 2 недель. Маленькие почки регенерирующих побегов переносили в среду МС без гормонов (агар МС, содержащий 3 мг/л AgNO3, 250 мг/л цефотаксима, 50 мг/л тиментина и 5 мг/л ФФТ) и культивировали еще в течение 2-3 недель.
Потенциально трансгенные побеги размером по меньшей мере 1,5 см выделяли и переносили в среду для корнеобразования (агар МС, содержащий 0,5 мг/л НКК, 3 мг/л AgNO3, 250 мг/л цефотаксима и 50 мг/л тиментина) и культивировали в течение 2-3 недель. Трансгенные побеги с большим количеством корней, подтвержденные ПЦР, переносили в грунт в теплице и выращивали с фотопериодом 16/8 ч (свет/темнота) при 22°C. Были получены три подтвержденных трансгенных растения. Трансформированные растения выращивали в теплице, позволяли им самоопылиться и собирали урожай семян Т1. Состав жирных кислот липида анализировали в пулах семян Т1 от каждого из трансформированных растений T0 и обнаружили присутствие 2,8% ДПК и 7,2% ДГК в одной линии, обозначенной JT1-4, тогда как другая линия, обозначенная JT1-6, продемонстрировала 2,6% ДПК.
Масло семян из индивидуальных семян Т1 проанализировали на предмет состава жирных кислот; часть данных приведена в табл. 20. Несколько семян Т1 вырабатывали ДГК на уровне от 10 до около 21% от общего содержания жирных кислот, включая JT1-4-A-13, JT1-4-A-5 и JT1-4-B-13. Удивительно и неожиданно было обнаружено, что некоторые из семян Т1 содержали ДПК на уровнях от 10 до около 18% от общего содержания жирных кислот, при отсутствии обнаружимой ДГК (<0,1%). Одно из возможных объяснений для таких семян состоит в том, что ген Δ4-десатуразы в T-ДНК, вставленной в этих растениях, инактивировался, возможно в результате спонтанной мутации. Семена Т1 проращивали и один появляющийся котиледон с каждого анализировали на предмет состава жирных кислот в оставшемся масле. Остальную часть каждого саженца сохраняли и выращивали до состояния зрелости, чтобы получить семя T2.
Трансгенные растения, которые были гомозиготными по единичным инсерциям T-ДНК, были идентифицированы и отобраны. Растения одной отобранной линии, обозначенной JT1-4-17, содержали единичную инсерцию T-ДНК и вырабатывали ДГК, и только низкие уровни ДПК, тогда как растения из второй отобранной линии, обозначенной JT1-4-34, также содержали единичную инсерцию T-ДНК, но вырабатывали ДПК без выработки ДГК. Авторами изобретения был сделан вывод, что оригинальный трансформант содержал две отдельные T-ДНК, одна из которых обеспечивала выработку ДГК, а другая обеспечивала выработку ДПК без ДГК. Растения B. juncea, вырабатывающие ДГК в семени, были скрещены с растениями, вырабатывающими ДПК в семени. Потомство F1 включало растения, которые были гетерозиготными по обеим инсерциям T-ДНК. В семенах этих растений-потомков наблюдалась выработка около 20% ДГК и около 6% ДПК, с общим содержанием ДГК + ДПК 26%. Растения F1 самоопылялись, и ожидалось, что потомство, гомозиготное по обеим инсерциям T-ДНК, будет вырабатывать до 35% ДГК и
- 78 037817
ДПК.
Около 18% ДПК наблюдалось в липиде пула семени потомства T3, обозначенного JT1-4-34-11. Подобным образом, около 17,5% ДГК наблюдалось в липиде пула семени потомства T3 JT1-4-17-20. Состав жирных кислот пула семени JT1-4 Т1, единичного семени Т1, пула семени T2, единичного семени T2 и пула семени T3, единичного семени T3 приведен в табл. 21-24. JT1-4 T3 сегрегант JT-1-4-34-11 содержал в пуле семени T3 18% ДПК, и единичное семя от данного конкретного сегреганта содержало около 26% ДПК, в каждом случае как процент от общего содержания жирных кислот.
Следующие параметры были вычислены для масла из семени, содержащего 17,9% ДПК: общие насыщенные жирные кислоты, 6,8%, общие мононенасыщенные жирные кислоты, 36,7%; общие полиненасыщенные жирные кислоты, 56,6%, общие ω6 жирные кислоты, 7,1%; новые ω6 жирные кислоты, 0,4% из которых составляла ГЛК; общие ω3 жирные кислоты, 46,5%; новые ω3 жирные кислоты, 24,0%; соотношение общих ω6:общих ω3 жирных кислот, 6,5; соотношение новых ω6:новых ω3 жирных кислот, 60; эффективность превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы, 61%; эффективность превращения АЛК в СДК под действием Δ6-десатуразы, 51%; эффективность превращения СДК в кислоту ЭТК под действием Δ6-элонгазы, 90%; эффективность превращения ЭТК в ЭПК под действием Δ5-десатуразы, 87%; эффективность превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы, 98%.
Для получения большего количества трансгенных растений B. juncea с конструкцией modB трансформацию повторяли пять раз и регенерировали 35 предполагаемых трансгенных побегов/саженцев. Провели анализ семени Т1, чтобы определить содержание ДПК и ДГК.
Для получения дальнейшего семени, содержащего ДПК и не содержащего ДГК, ген Δ4-десатуразы был удален из конструкции modB, и полученную в результате конструкцию применяли для трансформации B. juncea и B. napus. Получено семя потомства, содержащее до 35% ДПК в общем содержании жирных кислот в липиде семени.
При анализе методом ЯМР масла, экстрагированного из семян растения, вырабатывающего ДГК, по меньшей мере 95% наблюдаемой ДГК присутствовало в положении sn-1,3 молекул ТАГ.
Таблица 20. Состав жирных кислот в масле семян из семян T1 B. juncea, трансформированных T-ДНК из GA7.________ _________ ________ _________ _____ ______
Семя Т1 № С16:0 16:ld9 С18:0 90 и C18:ld 11 С18:2 С18:3п 6___ С18:3п 3 С20.0 _____ 18:4пЗ C20:ld 11 9 С20:Зп 3 20:4пЗ а •л о гч 22:5пЗ ε П9=го
JT1-4-A-1 5,0 0,2 2,7 23,5 3,4 17,0 0,7 24,8 0,7 2,0 1,1 0,2 0,8 4,0 0,6 2,4 9,9
JT1-4-A-2 4,3 0,3 2,6 37,2 3,2 11,0 0,3 22,1 0,7 0,9 1,3 0,2 1,4 3,2 0,3 9,4 0,0
JT1-4-A-3 5,6 0,3 2,7 20,8 3,7 16,0 0,6 24,4 0,7 2,0 0,9 0,2 1,1 4,5 0,7 3,1 11,4
JT1-4-A-4 4,6 0,4 2,8 36,2 3,4 10,6 0,3 24,5 0,8 9,9 1,7 0,2 0,3 0,5 0,0 2,5 0,0
JT1-4-A-5 5,0 0,2 3,2 20,3 3,6 13,7 0,7 25,9 0,7 2,0 0,9 0,2 1,3 4,4 1,5 1,6 13,5
JT1-4-A-6 4,8 0,4 3,4 37,9 3,7 7,4 0,4 19,9 0,9 1,4 1,4 0,1 0,8 1,9 0,4 13,9 0,0
JT1-4-A-7 5,6 0,3 3,0 26,2 4,0 8,9 0,3 26,6 0,6 1,8 1,0 0,1 1,8 3,7 1,3 2,2 11,3
JT1-4-A-8 4,8 0,4 2,9 40,3 3,4 7,8 0,3 22,2 0,8 1,4 1,3 0,1 0,8 2,4 0,4 9,6 0,0
JT1-4-A-9 7,1 0,3 3,6 17,7 4,3 17,9 0,7 23,1 1,0 2,1 0,8 0,2 1,5 3,6 0,8 2,0 11,9
JT1-4-A-10 5,1 0,2 4,2 22,3 3,4 19,5 0,7 21,7 0,8 1,5 0,9 0,2 1,7 7,8 0,9 1,0 6,5
JT1-4-A-11 5,0 0,5 2,8 37,6 4,0 7,1 0,4 19,2 0,7 1,9 1,4 0,2 0,5 1,6 0,3 15,5 0,0
JT1-4-A-12 5,2 0,3 3,0 28,2 4,0 9,2 0,3 27,4 0,6 1,9 0,9 0,1 1,5 3,2 1,1 1,8 10,2
JT1-4-A-13 5,4 0,2 3,0 16,7 4,1 9,9 0,6 29,9 0,7 2,2 1,0 0,2 1,7 2,0 1,1 2,0 17,9
JT1-4-A-14 5,1 0,4 3,1 30,0 4,0 11,5 0,3 27,7 0,7 2,2 1,0 0,1 0,6 2,4 0,8 1,3 7,8
JT1-4-A-15 5,1 0,4 2,5 34,2 3,6 6,9 0,6 20,4 0,7 1,6 1,1 0,2 0,6 4,7 0,9 15,2 0,0
JT1-4-B-1 5,5 0,2 2,7 18,9 4,0 17,6 0,8 24,1 0,8 2,2 1,0 0,2 1,2 4,6 0,9 2,2 11,5
JT1-4-B-2 5,5 0,2 2,7 20,2 4,0 14,3 0,5 25,5 0,7 1,7 0,9 0,2 1,6 8,7 1,3 2,2 8,5
JT1-4-B-3 5,3 0,3 3,6 34,1 3,5 35,0 0,6 9,3 0,8 0,2 1,4 0,4 0,6 0,9 0,1 0,3 2,1
JT1-4-B-4 5,3 0,3 3,1 25,2 3,6 17,0 0,7 24,1 0,7 1,9 1,0 0,2 0,8 4,3 0,5 2,3 7,8
JT1-4-B-5 5,5 0,5 2,2 30,1 4,6 10,2 0,5 21,7 0,6 1,4 1,1 0,2 0,9 2,4 0,5 16,1 0,0
JT1-4-B-6 5,6 0,3 2,5 19,5 3,8 15,2 0,5 27,7 0,6 2,1 0,9 0,2 1,1 3,7 0,6 3,3 11,1
JT1-4-B-7 5,9 0,5 2,0 29,9 4,0 11,2 0,3 26,2 0,6 11,5 1,4 0,2 0,3 0,4 0,0 4,1 0,1
JT1-4-B-8 6,2 0,5 1,9 33,1 4,0 30,0 0,5 12,7 0,6 0,3 1,3 0,4 1,4 0,9 0,1 4,4 0,0
JT1-4-B-9 4,9 0,2 3,4 24,6 3,0 18,5 0,3 26,2 0,8 1,3 1,1 0,2 2,0 5,5 0,6 0,8 5,2
JT1-4-B-10 5,2 0,3 2,7 19,0 4,0 12,0 0,6 30,5 0,7 1,6 1,0 0,2 1,7 4,9 1,1 3,0 10,2
JT1-4-B-11 4,8 0,2 3,0 23,7 3,1 18,1 0,6 23,5 0,7 1,6 1,2 0,2 1,5 4,5 0,8 1,6 9,6
JT1-4-B-12 5,0 0,2 2,6 19,6 3,4 12,5 0,6 26,9 0,8 3,1 1,1 0,2 0,9 5,6 0,9 3,5 И,7
JT1-4-B-13 5,6 0,3 2,8 20,9 3,9 И,9 0,4 27,0 0,7 2,0 1,о 0,2 1,7 2,3 0,7 4,1 13,5
JT1-4-B-14 5,1 0,3 3,1 25,5 з,з 16,7 0,7 23,9 0,8 1,8 1,2 0,2 0,9 2,6 0,4 2,9 9,2
JT1-4-B-15 5,6 0,3 2,7 19,5 4,1 14,0 0,8 24,6 0,7 2,7 0,9 0,2 0,7 9,4 1,3 2,5 8,5
Образцы масла семян дополнительно содержали 0,1% C14:0; 0,1-0.2% C16:3; по 0,0-0,1% каждой из C20:1Δ13, C20:3ω6 и C20:4ω6; 0,3-0,4% C22:0; не содержали C22:1 и C22:2ω6; содержали 0,2% C24:0 и 0,2-0,4% C24:1.
- 79 037817
Таблица 21. Состав жирных кислот липида из семян (пул) Т1 B. juncea, трансформированных
T-ДНК из GA7-modB. Липид дополнительно содержал около по 0,1% каждой из 14:0, 16:3, 20:1d13 и 16:2; 22:1 не была обнаружена.
JTl-2 4,2 0,3 2,5 42,4 3,2 27,7 0,1 16,4 0,6 0,0 1,2 0,1 0,0 0,0 0,0 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,4 0,0 0,0
JT1-3 4,5 0,3 2,7 44,6 3,1 26,8 0,1 14,8 0,7 0,0 1,2 0,1 0,0 0,0 0,0 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,4 0,0 0,0
JT1-4 5,1 0,3 3,2 26,8 3,5 17,4 0,5 22,8 0,7 2,5 1,1 0,2 0,0 0,0 1,2 0,3 2,9 0,7 0,0 0,1 0,2 0,3 2,8 7,2
JT1-5 4,7 0,4 2,4 41,6 3,4 28,4 0,1 15,8 0,7 0,0 1,2 0,1 0,0 0,0 0,0 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,4 0,0 0,0
JT1-6 4,8 0,4 2,3 37,3 3,3 30,2 0,4 13,2 0,7 0,2 1,4 0,3 0,0 0,0 0,7 0,3 0,6 0,1 0,0 0,3 0,2 0,5 2,6 0,0
Таблица 22. Состав жирных кислот в масле семени из семян Т1 (индивидуальных) B. juncea, трансформированных T-ДНК из GA7-modB.
Семя T1 № C16:0 16:ld9 C18:0 OO О C18:ldl 1 Ci oo 6 C18:3n6 C18:3n3 C20:0 18:4n3 C20:ldl 1 C20:2n6 C20:3n3 20:4n3 20:5n3 22:5n3 C22:6n3
JT1-4-A-1 5,0 0,2 2,7 23,5 3,4 17,0 0,7 24,8 0,7 2,0 1,1 0,2 0,8 4,0 0,6 2,4 9,9
JT1-4-A-2 4,3 0,3 2,6 37,2 3,2 11,0 0,3 22,1 0,7 0,9 1,3 0,2 1,4 3,2 0,3 9,4 0,0
JT1-4-A-3 5,6 0,3 2,7 20,8 3,7 16,0 0,6 24,4 0,7 2,0 0,9 0,2 1,1 4,5 0,7 3,1 11,4
JT1-4-A-4 4,6 0,4 2,8 36,2 3,4 10,6 0,3 24,5 0,8 9,9 1,7 0,2 0,3 0,5 0,0 2,5 0,0
JT1-4-A-5 5,0 02 3,2 20,3 3 6 13,7 0,7 25,9 0,7 2,0 0,9 П 9 1,3 4,4 1 < 1 A 13,5
JT1-4-A-6 4,8 0,4 3,4 37,9 3,7 7,4 0,4 19,9 0,9 1,4 1,4 o,l 0,8 1,9 0,4 13,9 0,0
JT1-4-A-7 5,6 0,3 3,0 26,2 4,0 8,9 0,3 26,6 0,6 1,8 1,0 0,1 1,8 3,7 1,3 2,2 11,3
JT1-4-A-8 4,8 0,4 2,9 40,3 3,4 7,8 0,3 22,2 0,8 1,4 1,3 0,1 0,8 2,4 0,4 9,6 0,0
JT1-4-A-9 7,1 0,3 3,6 17,7 4,3 17,9 0,7 23,1 1,0 2,1 0,8 0,2 1,5 3,6 0,8 2,0 11,9
JT1-4-A-10 5,1 0,2 4,2 22,3 3,4 19,5 0,7 21,7 0,8 1,5 0,9 0,2 1,7 7,8 0,9 l,o 6,5
JT1-4-A-11 5,0 0,5 2,8 37,6 4,0 7,1 0,4 19,2 0,7 1,9 1,4 0,2 0,5 1,6 0,3 15,5 0,0
JT1-4-A-12 5,2 0,3 3,0 28,2 4,0 9,2 0,3 27,4 0,6 1,9 0,9 0,1 1,5 3,2 1,1 1,8 10,2
JT 1-4-A-13 5,4 0,2 3,0 16,7 4,1 9,9 0,6 29,9 0,7 2,2 1,0 0,2 1,7 2,0 1,1 2,0 17,9
JT1-4-A-14 5,1 0,4 3,1 30,0 4,0 11,5 0,3 27,7 0,7 2,2 1,0 0,1 0,6 2,4 0,8 1,3 7,8
JT1-4-A-15 5,1 0,4 2,5 34,2 3,6 6,9 0,6 20,4 0,7 1,6 1,1 0,2 0,6 4,7 0,9 15,2 0,0
JT1-4-B-1 5,5 0,2 2,7 18,9 4,0 17,6 0,8 24,1 0,8 2,2 1,0 0,2 1,2 4,6 0,9 2,2 11,5
JT1-4-B-2 5,5 0,2 2,7 20,2 4,0 14,3 0,5 25,5 0,7 1,7 0,9 0,2 1,6 8,7 1,3 2,2 8,5
JT1-4-B-3 5,3 0,3 3,6 34,1 3,5 35,0 0,6 9,3 0,8 0,2 1,4 0,4 0,6 0,9 0,1 0,3 2,1
JT1-4-B-4 5,3 0,3 3,1 25,2 3,6 17,0 0,7 24,1 0,7 1,9 1,0 0,2 0,8 4,3 0,5 2,3 7,8
JT1-4-B-5 5,5 0,5 2,2 30,1 4,6 10,2 0,5 21,7 0,6 1,4 1,1 0,2 0,9 2,4 0,5 16,1 0,0
JT1-4-B-6 5,6 0,3 2,5 19,5 3,8 15,2 0,5 27,7 0,6 2,1 0,9 0,2 1,1 3,7 0,6 3,3 11,1
JT1-4-B-7 5,9 0,5 2,0 29,9 4,0 11,2 0,3 26,2 0,6 11,5 1,4 0,2 0,3 0,4 .0,0 4,1 0,1
JT1-4-B-8 6,2 0,5 1,9 33,1 4,0 30,0 0,5 12,7 0,6 0,3 1,3 0,4 1,4 0,9 0,1 4,4 0,0
JT1-4-B-9 4,9 0,2 3,4 24,6 3,0 18,5 0,3 26,2 0,8 1,3 1,1 0,2 2,0 5,5 0,6 0,8 5,2
JT1-4-B-10 5,2 0,3 2,7 19,0 4,0 12,0 0,6 30,5 0,7 1,6 1,0 0,2 1,7 4,9 1,1 3,0 10,2
JT1-4-B-11 4,8 0,2 3,0 23,7 3,1 18,1 0,6 23,5 0,7 1,6 1,2 0,2 1,5 4,5 0,8 1,6 9,6
JT1-4-B-12 5,0 0,2 2,6 19,6 3,4 12,5 0,6 26,9 0,8 3,1 1,1 0,2 0,9 5,6 0,9 3,5 11,7
JT1-4-B-13 5,6 0,3 2,8 20,9 3,9 11,9 0,4 27,0 0,7 2,0 1,0 0,2 1,7 2,3 0,7 4,1 13,5
JT1-4-B-14 5,1 0,3 3,1 25,5 3,3 16,7 0,7 23,9 0,8 1,8 1,2 0,2 0,9 2,6 0,4 2,9 9,2
JT1-4-B-15 5,6 0,3 2,7 19,5 4,1 14,0 0,8 24,6 0,7 2,7 0,9 0,2 0,7 9,4 1,3 2,5 8,5
Образцы масла из семени дополнительно содержали 0,1% C14:0; 0,1-0,2% C16:3; по 0,0-0,1% каж дой из C20:1Δ13, C20:3ω6 и C20:4ω6; 0,3-0,4% C22:0; не содержали C22:1 и C22:2 ω6; содержали 0,2% C24:0 и 0,2-0,4% C24:1.
- 80 037817 масле семян из индивидуальных семян T2 B. juncea, трансгч
Таблица 23. Состав жирных кислот в формированных T-ДНК из GA7-modB.
JT-1-4-19
JT-1-4-19
JT-1-4-19
JT-1-4-19
JT-1-4-19
JT-1-4-19
JT-1-4-19
4,4
5,6
5,5
4,7
5,6
4,6
4,9
JT-1-4-19
JT-1-4-19
JT-1-4-19
JT-1-4-19
4,8
5,8
4,8
JT-1-4-19
JT-1-4-19
JT-1-4-19
4,7
4,9
JT-1-4-19
0,3
0,4
0,4
0,3
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0,3
0,2
0,1
0,2
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,2
0,1
1,7
1,9
1,8
2,3
1,5
1,8
2,2
2,1
1,7
1,8 2,0
1,6
36,3
39,1
42,3
42,1
36,8
36,3
38,3
36,2
41,0
36,6
47,1
37,4
37,3
37,9
35,7
2,9
3,1
3,2
2,8
3,7
3,0
3,0
3,7
2,9
3,3
JT-1-4-34
JT-1-4-34
JT-1-4-34
JT-1-4-34
5,3
4,9
5,0
JT-1-4-34
JT-1-4-34
JT-1-4-34
4,8
5,0
JT-1-4-34
JT-1-4-34
6,2
0,4
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,5
0,1
0,1 од ОД
0,1
0,1
0,1
0,1
0,2
1,8
1,6
1,7
1,8
1,8
1,8
2,0
1,6
2,1
37,6
35,3
39,4
38,5
39,5
38,2
39,7
36,0
32,0
3,0
3,2
ЗД
3,5
3,3
3,1
2,9
3,2
2,9
3,3
4,4
8,3
8,4
9,9
10,0
9,4
7,4
8,2
9,8
9,1
7,4
7,9
6,9
7,8
8,1
7,8
9,0
7,8
7,9
8,3
0,5
0,4
0,3
0,2
0,3
0,3
0,3
0,4
0,2
0,3
0,2
0,3
0,4
0,4
0,3 о^з
0,5
0,3
0,4
0,2
0,4
0,4
0,3
0,6
22,0
18,9
24,0
27,1
19,6
22,6
20,2
20,9
27,0
21,3
23,9
20,7
20,6
20,1
22,4
23,7
21,1
21,1
20,5
22,2
21,1
20,2
23,7
19,4
0,5
0,6
0,6
0,6
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,6
0,6
0,6
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,6
0,5
0,5
0,5
0,6
1,4
1,2
5,9
4,1 0,6
1,0 0,8 0,7
0,9
4,8 0,9
0,7
0,6
0,8
0,7
0,8
0,6
0,7
0,7
0,6
1,2
Таблица 24. Состав жирных кислот формированных T-ДНК из GA7-modB.
1,2
1,3
1,5
1,6
1,4
1,5
1,3
1,3
1,8
1,4
1,3
1,3
1,4
1,2
1,4
1,3
1,5
1,4
1,3
1,5
1,2
0,1 0,1
0,2
0,2
0,2
0,1
0,1
0,2 0,2 0,2
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1 oj
0,1
0,2
0,2
0,2
0,2
0,1 0,2
0,2
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 ол
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,4
0,5
0,2
0,2
1,4
0,7
0,8
0,9
0,3
0,8
0,2
0,8
0,5
0,6
1,3
1,2
0,7
0,8
0,8
1,0
0,7
0,7
1,2
0,6
0,3
0,3
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3 оУ
0,3
0,3
0,2
0,3
0,3
0,3
0,3
0,4
4,2
0,5
0,5
1,9
2,9 0,5 1,5 0,5
2,5
4,3
3,0 зд
2,0
2,3
2,3 масле семян из
0,6
0,4
0,0
0,0
0,3
0,3
0,5
0,5
0,0
0,3
0,0
0,4
0,6
0,5
0,5
0,3
0,5
0,3
0,3
0,2
0,4
0,3 0,3
0,5
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 оо
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0 о,1 од 0,0 0,1
0,2 о,1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,1
0,2
0,2
0,2
0,3 индивидуальных
0,1
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,2
0,1
0,1
0,1
0,2
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
1,8
1,5
0,4
0,6
1,6
1,7
2,0
0,7
1,2
0,5
1,6
2,2
2,1
1,9 семян
0,0 : о,о : о,о : о,о ; о,о : о,о : о,о : о,о : о,о :
T3
1,8
1,9
2,0
1,6
1,9
1,8
1,6
0,3
0,4
0,4
0,3
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,4
0,3
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,4
12,1
12,6
1,5
13,1
14,4
13,7
14,2
2,2
12,7
13,6 12,3
12,6 14,0
11,4
13,9
12,3
13,1
10,2
13,3
12,2
12,7
17,6
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
B. juncea, транс3
JT-1-4-34-11 4,8 0,4 0,1 2,8 38,4 3,7 5,7 0,4 18,0 0,7 1,0 1,5 0,1 0,1 0,0 0,0 1,1 0,3 1,4 0,4 0,0 0,3 0,0 1,4 0,5 16,3 0,0
JT-1-4-34-11 4,3 0,4 0,1 3,0 43,3 3,6 5,2 0,2 18,5 0,7 0,8 1,7 0,1 0,1 0,0 0,0 1,4 0,3 1,2 0,3 0,0 0,2 0,0 1,2 0,3 12,4 0,0
JT-1-4-34-11 4,6 0,4 0,1 2,8 33,1 4,1 5,1 0,4 18,5 0,7 1,2 1,4 0,1 0,1 0,0 0,0 1,1 0,3 1,6 0,5 0,0 0,3 0,0 1,4 0,4 20,8 0,0
JT-1-4-34-11 4,5 0,4 0,1 2,9 39,5 3,3 6,3 0,4 18,5 0,8 1.2 1.5 0,1 0,1 0,0 0,0 1,0 0,3 1,7 0,3 0,0 0,7 0,0 1,8 0,3 14,2 0,0
JT-1-4-34-11 4,9 0,5 0,2 2,8 32,2 3,9 4,7 0,3 20,7 0,8 1,2 1,4 0,1 0,2 0,0 0,0 2,0 0,3 1,4 0,5 0,0 0,3 0,0 1,2 0,4 19,4 0,0
JT-1-4-34-11 4,3 0,3 0,1 3,0 38,1 3,2 5,8 0,3 19,4 0,7 1,1 1,5 0,1 0,1 0,0 0,0 1,2 0,3 1,5 0,4 0,0 0,2 0,0 1,3 0,4 16,0 0,0
JT-1-4-34-11 5,4 0,5 0,2 3,2 29,3 4,0 4,6 0,4 18,6 0,9 1,7 1,3 0,1 0,1 0,0 0,0 1,2 0,4 1,6 0,7 0,0 0,3 0,0 1,4 0,5 22,9 0,0
JT-1-4-34-11 5,2 0,5 0,2 3,7 34,5 4,1 4,5 0,3 17,2 1,0 1,4 1,4 0,1 0,1 0,0 0,0 1,5 0,4 1,4 0,6 0,0 0,3 0,0 1,2 0,5 19,4 0,0
JT-1-4-34-11 5,3 0,5 0,1 3,4 33,4 3,7 4,6 0,3 17,6 0,9 1,7 1,2 0,1 0,1 0,0 0,0 1,1 0,4 1,5 0,6 0,0 0,2 0,0 1,2 0,5 20,7 0,0
JT-1-4-34-11 4,6 0,4 0,1 3,0 39,5 3,5 5,1 0,3 17,8 0,8 0,8 1,6 0,1 0,1 0,0 0,0 1,4 0,4 1,3 0,4 0,0 0,3 0,0 1,3 0,4 16,1 0,0
JT-1-4-34-11 4,3 0,4 0,1 3,1 41,7 3,5 5,6 0,2 19,0 0,7 0,9 1,6 0,1 0,1 0,0 0,0 1,3 0,3 1,4 0,3 0,0 0,2 0,0 1,5 0,3 12,7 0,0
JT-1-4-34-11 4,8 0,5 0,2 2,8 33,8 4,0 5,3 0,4 18,2 0,7 1,4 1,3 0,1 0,1 0,0 0,0 1,2 0,3 1,6 0,6 0,0 0,3 0,0 1,3 0,4 20,1 0,0
JT-1-4-34-11 4,4 0,4 0,1 3,5 40,3 3,5 5,2 0,2 19,1 0,7 1,0 1,5 0,1 0,1 0,0 0,0 1,6 0,3 1,4 0,4 0,0 0,2 0,0 1,4 0,3 13,8 0,0
JT-1-4-34-11 4,8 0,4 0,1 3,2 36,1 3,7 5,9 0,3 19,9 0,7 1,4 1,3 0,1 0,1 0,0 0,0 1,1 0,3 1,9 0,5 0,0 0,2 0,0 1,7 0,3 15,4 0,0
JT-1-4-34-11 4,0 0,3 0,1 2,8 37,2 3,2 4,9 0,3 19,6 0,8 0,9 1,6 0,1 0,1 0,0 0,0 1,5 0,4 1,3 0,5 0,0 0,3 0,0 1,1 0,4 17,9 0,0
JT-1-4-34-11 4,5 0,4 0,1 3,8 36,7 3,2 4,5 0,2 19,0 0,9 1,1 1,4 0,1 0,1 0,0 0,0 1,8 0,4 1,2 0,5 0,0 0,2 0,0 1,0 0,5 17,8 0,0
JT-1-4-34-11 5,2 0,4 0,2 2,8 27,8 3,7 5,3 0,5 18,3 0,8 1,7 1,3 0,1 0,1 0,0 0,0 1,0 0,4 1,9 0,7 0,0 0,3 0,0 1,7 0,5 24,7 0,0
JT-1-4-34-11 5,4 0,6 0,2 2,8 31,7 4,1 4,6 0,3 18,5 0,8 1,3 1,3 0,1 0,1 0,0 0,0 1,4 0,4 1,4 0,6 0,0 0,2 0,0 1,3 0,4 21,8 0,0
JT-1-4-34-11 6,4 0,6 0,1 2,7 30,3 3,5 4,1 0,4 16,1 0,8 2,1 1,1 0,1 0,1 0,0 0,0 0,9 0,4 1,4 0,7 0,0 0,2 0,0 1,1 0,5 25,8 0,0
JT-1-4-34-11 4,3 0,3 0,1 3,2 39,2 3,3 5,7 0,2 20,1 0,7 0,9 1,6 0,1 0,1 0,0 0,0 1,7 0,3 1,3 0,3 0,0 0,2 0,0 1,3 0,3 14,1 0,0
JT-1-4-34-21 4,2 0,4 0,1 2,3 39,9 3,9 5,9 0,3 20,2 0,6 0,9 1,6 0,1 0,1 0,0 0,0 1,1 0,3 1,5 0,3 0,0 0,3 0,0 1,8 0,4 13,3 0,0
JT-1-4-34-21 4,4 0,4 0,1 2,7 38,8 3,9 5,7 0,4 18,5 0,6 1,3 1,3 0,1 0,1 0,0 0,0 0,8 0,3 1,8 0,4 0,0 0,3 0,0 1,7 0,3 15,6 0,0
JT-1-4-34-21 4,2 0,4 0,1 2,0 42,4 3,6 6,0 0,4 19,1 0,5 1,0 1,6 0,1 0,1 0,0 0,0 0,9 0,2 1,5 0,3 0,0 0,3 0,0 1,6 0,3 12,9 0,0
Пример 10. Дальнейший анализ трансформированных растений и полевые испытания.
Гибридизационный анализ методом саузерн-блоттинга проводили для отобранных растений T2 B. napus, трансформированных T-ДНК из конструкции GA7-modB. ДНК, экстрагированную из образцов ткани растения, расщепляли несколькими рестрикционными ферментами для гибридизационного анализа методом саузерн-блоттинга. Радиоактивный зонд, соответствующий части T-ДНК, гибридизовали с пятнами, которые промывали в строгих условиях, и пятна приводили в контакт с пленкой, чтобы обнаружить полосы гибридизации. Некоторые из образцов продемонстрировали единичные полосы гибридизации для каждой из смесей после расщепления рестрикционными ферментами, что соответствовало единичным инсерциям T-ДНК в растениях, в то время как другие продемонстрировали две полосы, а следующие снова продемонстрировали несколько полос T-ДНК, что соответствовало 4-6 инсерциям. Ко личество полос гибридизации, наблюдаемых в саузерн-блоттинг анализе, хорошо соотносилось с количеством копий T-ДНК в трансгенных растениях, определенным методом цифровой ПЦР, до количества копий около 3 или 4. При количестве копий, большем чем около 5, метод цифровой ПЦР был менее на дежным.
Некоторые из отобранных линий использовали в качестве доноров пыльцы при скрещивании с сериями из около 30 различных сортов B. napus с различным фоновым генотипом. Дальнейшее обратное скрещивание проводили, чтобы определить, являются ли множественные инсерции T-ДНК генетически связанными или нет, и позволить сегрегацию генетически несвязанных трансгенных локусов. Таким об- 81 037817 разом, были отобраны линии, содержащие единичные трансгенные локусы.
Однопраймерные реакции ПЦР проводили в трансгенных линиях с применением праймеров, смежных с левыми и правыми границами T-ДНК, и любые линии, демонстрирующие присутствие обращенных повторов T-ДНК, отбрасывали.
Некоторое количество трансгенных линий продемонстрировало задержку цветения, тогда как у других было снижено семяобразование и, таким образом, снижен выход семян на растение после выращивания в теплице, что согласовалось со сниженной мужской или женской фертильностью. Исследовали морфологию цветка в этих растениях и наблюдали, что в некоторых случаях раскрытие семенных коробочек и высвобождение пыльцы от пыльников задерживалось таким образом, что рыльца пестика удлинялись до раскрытия семенных коробочек и высвобождения пыльцы, таким образом отдаляя пыльники от рылец. Полная фертильность могла бы быть восстановлена искусственным опылением. Кроме того, определяли жизнеспособность пыльцы в момент раскрытия семенных коробочек и высвобождения пыльцы с помощью окрашивания красителями для определения жизнеспособности ФДА и ПЙ (Пример 1) и показано, что она была снижена в некоторых линиях, тогда как в большинстве трансгенных линий жизнеспособность пыльцы составила около 100% от жизнеспособности в контрольных растениях дикого типа. В качестве дальнейшего анализа для выявления возможной причины уменьшения выхода семени с некоторых растений анализировали содержание и состав жирных кислот в цветочных почках, включая пыльники и рыльца/пестики некоторых растений T3 и T4. ДГК не была обнаружена в экстрагированных липидах, указывая на то, что гены в генетической конструкции не экспрессировались в цветочных почках в процессе развития растения, и исключая это как причину сниженного выхода семян.
Содержание масла измеряли методом ЯМР, и определяли уровень ДГК в общем содержании жирных кислот для семян T2. Трансгенные линии, содержащие менее чем 6% ДГК, отбрасывали. Количество копий T-ДНК в образцах листьев растений поколений T1, T2 и T3 определяли методом цифровой ПЦР (Пример 1).
Отобранные партии семян T3 и T4 высевали в поле на двух участках в Виктории, Австралия, каждую в рядах длиной 10 м с плотностью высева 10 семян/м. Отобранные партии семян включали полученную из B003-5-14 линию, которая демонстрирует уровни ДГК в пуле семени около 8-11% и уровни ДГК для индивидуальных семян T2 до около 19%, с количеством копий T-ДНК 3 в растении T0. Кроме того, отобранные партии семян включали полученные из B0050-27 линии, которые продемонстрировали уровни ДГК в семенах T2 свыше 20%, и количество копий T-ДНК 1 или 2 в растениях T2. Семена, высеваемые в поле, прорастали и давали побеги с той же скоростью, что и семена дикого типа. Растения, выращенные из большинства, но не всех высеянных партий семян, были фенотипически нормальными, например демонстрировали морфологию, скорость роста, высоту растений, мужскую и женскую фертильность, жизнеспособность пыльцы (100%), образование семян, размер и морфологию стручков, которые были по существу такими же, как у контрольных растений дикого типа, выращенных в таких же условиях. Выход семян на растение был сходен с выходом для контрольных растений дикого типа, выращенных в таких же условиях. Другие образцы семени высевали на больших площадях для массового производства отобранных трансгенных линий. Общее содержание ДГК в урожае собранных семян составляло по меньшей мере 30 мг/г семян.
Квалифицированным специалистам в данной области будет понятно, что многочисленные вариации и/или модификации изобретения могут быть осуществлены, как раскрыто в конкретных вариантах, без отхода от духа или контекста изобретения в его широком смысле. Представленные варианты, таким образом, следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, но не ограничивающие.
В заявке на данное изобретение заявлен приоритет по AU 2013905033, поданной 18 декабря 2013 г., и AU 2014902471, поданной 27 июня 2014 г., US 61/697676, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Все публикации, обсуждаемые и/или на которые есть ссылки в настоящем документе, включены в настоящий документ в полном объеме.
Любое обсуждение документов, действий, материалов, устройств, изделий, и т.п., которое включено в настоящий документ, предназначено исключительно для целей обеспечения контекста для настоящего изобретения. Не следует делать допущение, что любые или все эти вопросы образуют часть известного уровня техники или представляли собой общедоступное знание в области, к которой относится настоящее изобретение, в том виде, в котором оно существовало до даты приоритета каждого из пунктов формулы данного документа.
- 82 037817
Ссылки
Abbadi et al. (2004) Plant Cell 16: 2734-2748.
Abbott et al. (1998) Science 282:2012-2018.
Agaba et al. (2004) Marine Biotechnol. (NY) 6:251-261.
Alvarez et al. (2000) Theor Appl Genet 100:319-327.
Armbrust et al. (2004) Science 306:79-86.
Baumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225:459-467.
Baumlein et al. (1992) Plant J. 2:233-239.
Beaudoin et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6421-6426.
Belide et al. (2002) Curr. Biol. 12:684-688(2013) Plant Cell Tiss Organ Cult. 113:543-553.
Berberich. et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36:297-306.
Broun et al. (1998) Plant J. 13:201-210.
Brown et al. (2002) Biochem J. 364:795-805.
Chan et al. (2006) Nature Biotechnology 28:951-956.
Chapman et al. (2004) Gen. Dev. 18:1179-1186.
Chen et al. (2004) The Plant Cell 16:1302-1313.
Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657.
Cheng et al. (2010) Transgenic Res 19: 221-229.
Cho et al. (1999a) J. Biol. Chem. 274:471-477.
Cho et al. (1999b) J. Biol. Chem. 274:37335-37339.
Christie (1982) J. Lipid Res. 23:1072-1075.
Clough and Bent (1998) Plant J. 16:735-43.
Damude et al. (2006). Proc Natl Acad Sci USA 103: 9446-9451.
Denic and Weissman (2007) Cell 130:663-677.
Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:4105-4113.
Domergue et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 35115-35126.
Domergue et al. (2005) Biochem. J. 1 389: 483-490.
Dunoyer et al. (2004) The Plant Cell 16:1235-1250.
Ellerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:1019-1027.
Gamez et al. (2003) Food Res International 36: 721-727.
Garcia-Maroto et al. (2002) Lipids 37:417-426.
- 83 037817
Girke et al. (1998) Plant J. 15:39-48.
Hall et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9320-9324
Hamilton et al. (1997) Gene 200:107-16.
Harayama (1998). Trends Biotechnol. 16: 76-82.
Hastings et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14304-14309.
Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-922.
Hoffmann et al. (2008) J Biol. Chem. 283:22352-22362.
Hong et al. (2002a) Lipids 37:863-868.
Horiguchi et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39:540-544.
Huang et al. (1999) Lipids 34:649-659.
Inagaki et al. (2002) Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:613-621.
Kajikawa et al. (2004) Plant Mol. Biol. 54:335-52.
Kajikawa et al. (2006) FEBS Lett 580:149-154.
Kereszt et al. (2007) Nature Protoc 2:948-952.
Kim et al. (2005) Plant Cell. 2005 1073-89.
Knutzon et al. (1998) J. Biol Chem. 273:29360-6.
Koziel et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:393-405.
Lassner (1995) Plant Physiol. 109:1389-94.
Leonard et al. (2000) Biochem. J. 347:719-724.
Leonard et al. (2000b) Biochem. J. 350:765-770.
Leonard et al. (2002) Lipids 37:733-740.
Lewsey et al. (2007) Plant J. 50:240-252.
Lo et al. (2003) Genome Res. 13:455-466.
Lu and Kang (2008) Plant Cell Rep. 27:273-8.
Mallory et al. (2002) Nat. Biotech. 20:622-625.
Marangoni et al. (1995) Trends in Food Sci. Technol. 6: 329-335.
Meesapyodsuk et al. (2007) J Biol Chem 282: 20191-20199.
Meng et al. (2008) J. Gen. Virol. 89:2349-2358.
Meyer et al. (2003) Biochem. 42:9779-9788.
Meyer et al. (2004) Lipid Res 45:1899-1909.
Michaelson et al. (1998a) J. Biol. Chem. 273:19055-19059.
Michaelson et al. (1998b) FEBS Lett. 439:215-218.
- 84 037817
Murashige and Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15:473-497.
Napier et al. (1998) Biochem. J. 330:611-614.
Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453.
Parker-Barnes et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8284-8289.
Pereira et al. (2004a) Biochem. J. 378:665-671.
Pereira et al. (2004b) Biochem. J. 384:357-366.
Perrin et al. (2000) Mol Breed 6:345-352.
Petrie et al. (2010a) Metab. Eng. 12:233-240.
Petrie et al. (2010b) Plant Methods 11:6:8.
Petrie et al. (2012) Transgenic Res. 21:139-147.
Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol - Plant 40:1-22.
Qi et al. (2002) FEBS Lett. 510:159-165.
Qi et al. (2004) Nat. Biotech. 22: 739-745.
Qiu et al. (2001) J. Biol. Chern. 276:31561-31566.
Reddy and Thomas (1996) Nat. Biotech. 14:639-642.
Reddy et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:293-300.
Robert et al. (2005) Func. Plant Biol. 32:473-479.
Robert et al. (2009) Marine Biotech 11:410-418.
Ruiz-Lopez et al. (2012) Transgenic Res. 21:139-147.
Saha et al. (2006) Plant Physiol. 141:1533-1543.
Saito et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:1813-1818.
Sakuradani et al. (1999) Gene 238:445-453.
Sato et al. (2004) Crop Sci. 44: 646-652.
Sakuradani et al. (2005) Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:648-654.
Sayanova et al. (2006) J Biol Chern 281: 36533-36541.
Sayanova et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4211-4216.
Sayanova et al. (2003) FEBS Lett. 542:100-104.
Sayanova et al. (2006) Planta 224:1269-1277.
Sayanova et al. (2007) Plant Physiol 144:455-467.
Shukla et al. (2002) J. Amer. Oil Chern. Soc. 79:965-969.
Singh et al. (2005) Curr. Opin. in Plant Biol. 8:197-203.
Speranza et al. (2012) Process Biochemistry (In Press).
- 85 037817
Sperling et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:3801-3811.
Sperling et al. (2001) Arch. Biochm. Biophys. 388:293-8.
Sprecher et al. (1995) J. Lipid Res. 36:2471-2477.
Spychalla et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:1142-1147.
Tonon et al. (2003) FEBS Lett. 553:440-444.
Trautwein (2001) European J. Lipid Sci. and Tech. 103:45-55.
Tvrdik (2000) J. Cell Biol. 149:707-718.
Venegas-Caleron et al. (2010) Prog. Lipid Res. 49:108-119.
Voinnet et al. (2003) Plant J. 33:949-956.
Wallis and Browse (1999) Arch. Biochem. Biophys. 365:307-316.
Watts and Browse (1999b) Arch. Biochem. Biophys. 362:175-182.
Weiss et al. (2003) Int. J. Med. Microbiol. 293:95:106.
Weng et al., (2004) Plant Molecular Biology Reporter 22:289-300.
Whitney et al. (2003) Planta 217:983-992.
Wood (2009) Plant Biotechnol J. 7:914-24.
Wu et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1013-1017.
Yang et al. (2003) Planta 216:597-603.
Zank et al. (2002) Plant J. 31:255-268.
Zank et al. (2005) WO 2005/012316
Zhang et al. (2004) FEBS Lett. 556:81-85.
Zhang et al. (2006) 20:3255-3268.
Zhang et al. (2007) FEBS Letters 581: 315-319.
Zhang et al. (2008) Yeast 25: 21-27.
Zhou et al. (2007) Phytochem. 68:785-796.
Zhou et al. (2008) Insect Mol Biol 17: 667-676.
Zou et al. (1997) Plant Cell. 9:909-23.

Claims (32)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Экстрагированный растительный липид, содержащий жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты содержат олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, содержащие линолевую кислоту (ЛК) и γ-линоленовую кислоту (ГЛК), ω3 жирные кислоты, содержащие α-линоленовую кислоту (АЛК), докозагексаеновую кислоту (ДГК), стеаридоновую кислоту (СДК) и докозапентаеновую кислоту (ДПК), при этом уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 2 до 16%, и при этом уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 1%, причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%.
  2. 2. Липид по п.1, отличающийся тем, что характеризуется одним или более из следующих признаков:
    i) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 2 до 15% или от около 3 до около 10;
    ii) уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 0,1%;
    iii) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до около 30%, от около 3 до около 30%, от около 6 до около 30%, от 1 до около 20%, от около 30 до около 60%, от около 45 до около 60%, около 30% или от около 15 до около 30%;
    iv) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, от около 4 до около 20%, от около 4 до около 17% или от около 5
    - 86 037817 до около 10%;
    v) уровень α-линоленовой кислоты (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 40%, от около 7 до около 40%, от около 10 до около 35%, от около
    20 до около 35%, от около 4 до 16% или от около 2 до 16%;
    vi) уровень γ-линоленовой кислоты (ГЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее 4%, менее чем около 3%, менее чем около 2%, менее чем около 1%, менее чем около 0,5%, от 0,05 до 7%, от 0,05 до 4%, от 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%;
    vii) уровень стеаридоновой кислоты (СДК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 10%, менее чем около 8%, менее чем около 7%, менее чем около 6%, менее чем около 4%, менее чем около 3%, от около 0,05 до около 7%, от около 0,05 до около 6%, от около 0,05 до около 4%, от около 0,05 до около 3%, от около 0,05 до около 10% или от 0,05 до около 2%;
    viii) уровень эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 6%, менее чем около 5%, менее чем около 4%, менее чем около 1%, менее чем около 0,5%, от около 0,05 до около 6%, от около 0,05 до около 5%, от около 0,05 до около 4%, от около 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%;
    ix) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭТрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 4%, менее чем около 2%, менее чем около 1%, от 0,05 до 4%, от 0,05 до 3%, или от 0,05 до около 2%, или от 0,05 до около 1%;
    x) уровень эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 15%, менее чем 4%, менее чем около 3%, менее чем около 2%, от 0,05 до 10%, от 0,05 до 5%, от 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%;
    xi) если уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, то уровень докозапентаеновой кислоты (ДПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 4%, менее чем около 3%, менее чем около 2%, от 0,05 до 8%, от 0,05 до 5%, от 0,05 до около 3%, от 5 до 15%, от 5 до 10% или от 0,05 до около 2%;
    xii) уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 22%, около 24%, около 26%, около 28%, около 31%, от 20,1 до 29%, от 20,1 до 28%, от 20,1 до около 27%, от 20,1 до около 26%, от 20,1 до около 25%, от 20,1 до около 24%, от 21 до 35%, от 21 до 30%, от 21 до 28%, от 21 до около 26% или от 21 до около 24%;
    xiii) липид содержит ω6-докозаnентаеновую кислоту (22:5Δ4,7,10,13,16) в числе содержащихся в нем жирных кислот;
    xiv) липид содержит менее чем 0,1% ω6-докозаnентаеновой кислоты (22:5Δ4,7,10,13,16) в числе содержащихся в нем жирных кислот;
    xv) липид содержит менее чем 0,1% одной или более или всех из СДК, ЭПК и ЭТК в числе содержащихся в нем жирных кислот;
    xvi) уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 25%, от около 4 до около 20%, от около 6 до около 20%, от около 6 до около 12%;
    xvii) уровень общих мононенасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 40%, около 4 до около 35%, от около 8 до около 25%, от 8 до около 22%, от около 15 до около 40% или от около 15 до около 35%;
    xviii) уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, от 30 до 75%, от около 50 до около 75%, около 60%, около 65%, около 70%, около 75% или от около 60 до около 75%;
    xix) уровень общих ω6 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 35 до около 50%, от около 20 до около 35%, от около 6 до 20%, менее чем 20%, менее чем около 16%, менее чем около 10%, от около 1 до около 16%, от около 2 до около 10% или от около 4 до около 10%;
    хх) уровень общих ω6 жирных кислот, которые не включают ЛК, в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 10%, менее чем около 8%, менее чем около 6%, менее чем 4%, от около 1 до около 20%, от около 1 до около 10%, от 0,5 до около 8% или от 0,5 до 4%;
    xxi) уровень общих ω 3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 36 до около 65%, от 36 до около 70%, от 40 до около 60%, от около 30 до около 60%, от около 35 до около 60%, от 40 до около 65%, от около 30 до около 65%, от 35 до около 65%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 65% или около 70%;
    xxii) уровень общих ω 3 жирных кислот, которые не включают ЛК, в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 21 до около 45%, от 21 до около 35%, от около 23 до около 35%, от около 25 до около 35%, от около 27 до около 35%, около 23%, около 25%, около 27%, около 30%, около 35%, около 40% или около 45%;
    - 87 037817 xxiii) соотношение общих ω6 жирных кислот к общему содержанию ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1,0 до около 3,0, от около 0,1 до около 1, от около 0,1 до около 0,5, менее чем около 0,50, менее чем около 0,40, менее чем около 0,30, менее чем около 0,20, менее чем около 0,15, около 1,0, около 0,1, от около 0,10 до около 0,4 или около 0,2;
    xxiv) соотношение общих ω6 жирных кислот, которые не включают ЛК, к новым ω3 жирным кислотам в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1,0 до около 3,0, от около 0,02 до около 0,1, от около 0,1 до около 1, от около 0,1 до около 0,5, менее чем около 0,50, менее чем около 0,40, менее чем около 0,30, менее чем около 0,20, менее чем около 0,15, около 0,02, около 0,05, около 0,1, около 0,2 или около 1,0;
    xxv) композиция жирных кислот липида базируется на эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы на уровне по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, от около 60 до около 98%, от около 70 до около 95% или от около 75 до около 90%;
    xxvi) композиция жирных кислот липида базируется на эффективности превращения АЛК в СДК под действием Δ6-десаmуразы на уровне по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, от около 30 до около 70%, от около 35 до около 60% или от около 50 до около 70%;
    xxvii) композиция жирных кислот липида базируется на эффективности превращения СДК в кислоту ЭТК под действием Δ6-элонгазы на уровне по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 88% или от около 75 до около 85%;
    xxviii) композиция жирных кислот липида базируется на эффективности превращения ЭТК в ЭПК под действием Δ5-десаmуразы на уровне по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, от около 60 до около 99%, от около 70 до около 99% или от около 75 до около 98%;
    xxix) композиция жирных кислот липида базируется на эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы на уровне по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, от около 50 до около 99%, от около 85 до около 99%, от около 50 до около 95% или от около 85 до около 95%;
    ххх) композиция жирных кислот липида базируется на эффективности превращения ДПК в ДГК под действием Δ4-десаmуразы на уровне по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 93%, от около 50 до около 95%, от около 80 до около 95% или от около 85 до около 95%;
    xxxi) композиция жирных кислот липида базируется на эффективности превращения олеиновой кислоты в ДГК на уровне по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, около 20%, около 25%, около 30%, от около 10 до около 50%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25% или от около 20 до около 30%;
    xxxii) композиция жирных кислот липида базируется на эффективности превращения ЛК в ДГК на уровне по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 22%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, от около 15 до около 50%, от около 20 до около 40% или от около 20 до около 30%;
    xxxiii) композиция жирных кислот липида базируется на эффективности превращения АЛК в ДГК на уровне по меньшей мере около 17%, по меньшей мере около 22%, по меньшей мере около 24%, по меньшей мере около 30%, около 30%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, от около 22 до около 70%, от около 17 до около 55%, от около 22 до около 40% или от около 24 до около 40%;
    xxxiv) общие жирные кислоты в экстрагированном липиде составляют менее чем 1,5% C20:1, менее чем 1% C20:1 или около 1% C20:1;
    xxxv) содержание триацилглицерида (ТАГ) в липиде составляет по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере 95%, от около 70 до около 99% или от около 90 до около 99%;
    xxxvi) по меньшей мере 70%, по меньшей мере 72% или по меньшей мере 80% этерифицированной ДГК в форме ТАГ находится в положении sn-1 или sn-2 ТАГ;
    xxxvii) наиболее распространенными ДГК-содержащими видами ТАГ в липиде являются ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12);
    xxxviii) наиболее распространенными ДГК-содержащими видами ТАГ в липиде являются ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12);
    xxxix) липид содержит три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
  3. 3. Липид по п.1 или 2, отличающийся тем, что представляет собой масло масличной культуры.
  4. 4. Липид по п.3, отличающийся тем, что содержит или представляет собой масло вида рода Brassica,
    - 88 037817 масло Gossypium hirsutum, масло Linum usitatissimum, масло вида Helianthus, масло Carthamus tinctorius, масло Glycine max, масло Zea mays, масло Elaesis guineenis, масло Nicotiana benthamiana, масло Lupinus angustifolius, масло Camelina sativa, масло Crambe abyssinica, масло Miscanthus x giganteus или масло
    Miscanthus sinensis.
  5. 5. Способ получения экстрагированного растительного липида по п.1, который включает экстрагирование липида из части растения, причем часть растения содержит липид, который содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты содержат олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, содержащие линолевую кислоту (ЛК) и γ-линоленовую кислоту (ГЛК), ω3 жирные кислоты, содержащие α-линоленовую кислоту (АЛК), стеаридоновую кислоту (СДК), докозапентаеновую кислоту (ДПК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК), причем уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 2 до 16%, и при этом уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 1%, при том что уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида в части растения составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, и причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%.
  6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что экстрагированный липид характеризуется одним или более признаков по любому из пп.2-4.
  7. 7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что часть растения представляет собой семя масличной культуры, такой как вид рода Brassica, такой как Brassica napus или Brassica juncea, Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, вида Helianthus, Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Lupinus angustifolius, Camelina saliva или Crambe abyssinica.
  8. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное семя масличной культуры представляет собой семя Brassica napus, B. juncea или C. sativa.
  9. 9. Способ по любому из пп.5-8, отличающийся тем, что часть растения содержит экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:
    i) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iii) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iv) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,
    v) ω3-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vi) Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vii) Δ12-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, viii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, ix) ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,
    x) ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, xi) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, или xii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторов, способных управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке части растения.
  10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что часть растения характеризуется одним или более или всеми из следующих признаков:
    i) Δ12-десатураза превращает олеиновую кислоту в линолевую кислоту в одной или более клеток части растения с эффективностью на уровне по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 90% или от около 75 до около 85%;
    ii) ω3-десатураза превращает ω6 жирных кислот в ω3 жирных кислот в одной или более клеток части растения с эффективностью на уровне по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 85%, от около 65 до около 95%, от около 75 до около 91% или от около 80 до около 91%;
    iii) Δ6-десатураза превращает АЛК в СДК в одной или более клеток части растения с эффективностью на уровне по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, от около 30 до около 70%, от около 35 до около 60% или от около 50 до около 70%;
    iv) Δ6-десатураза превращает линолевую кислоту в γ-линоленовую кислоту в одной или более клеток части растения с эффективностью на уровне менее чем около 5%, менее чем около 2,5%, менее чем
    - 89 037817 около 1%, от около 0,1 до около 5%, от около 0,5 до около 2,5% или от около 0,5 до около 1%;
    v) Δ6-элонгаза превращает СДК в ЭТК в одной или более клеток части растения с эффективностью на уровне по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 80% или от около 75 до около 80%;
    vi) Δ5-десатураза превращает ЭТК в ЭПК в одной или более клеток части растения с эффективностью на уровне по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 95% или от около 75 до около 95%;
    vii) Δ5-элонгаза превращает ЭПК в ДПК в одной или более клеток части растения с эффективностью на уровне по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, от около 50 до около 90% или от около 85 до около 95%;
    viii) Δ4-десатураза превращает ДПК в ДГК в одной или более клеток части растения с эффективностью на уровне по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 93%, от около 50 до около 95%, от около 80 до около 95% или от около 85 до около 95%;
    ix) эффективность превращения олеиновой кислоты в ДГК в одной или более клеток части растения составляет по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 25%, около 20%, около 25%, около 30%, от около 10 до около 50%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25% или от около 20 до около 30%;
    x) эффективность превращения ЛК в ДГК в одной или более клеток части растения составляет по меньшей мере около 15%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 22%, по меньшей мере около 25%, по меньшей мере около 30%, около 25%, около 30%, около 35%, от около 15 до около 50%, от около 20 до около 40% или от около 20 до около 30%;
    xi) эффективность превращения АЛК в ДГК в одной или более клеток части растения составляет по меньшей мере около 17%, по меньшей мере около 22%, по меньшей мере около 24%, по меньшей мере около 30%, около 30%, около 35%, около 40%, от около 17 до около 55%, от около 22 до около 35% или от около 24 до около 35%;
    xii) одна или более клеток части растения содержат по меньшей мере около на 25%, по меньшей мере около на 30%, от около 25 до около 40% или от около 27,5 до около 37,5% больше ω3 жирных кислот, чем соответствующие клетки без экзогенных полинуклеотидов;
    xiii) Δ6-десатураза имеет большую активность в отношении α-линоленовой кислоты (АЛК), чем линолевой кислоты (ЛК);
    xiv) Δ6-элонгаза также характеризуется активностью Δ9-элонгазы;
    xv) Δ12-десатураза также характеризуется активностью Δ15-десатуразы;
    xvi) Δ6-десатураза также характеризуется активностью Δ8-десатуразы;
    xvii) Δ8-десатураза также характеризуется активностью Δ6-десатуразы или не характеризуется активностью Δ6-десатуразы;
    xviii) Δ 15-десатураза также характеризуется активностью ω3-десатуразы в отношении ГЛК;
    xix) ω3-десатураза также характеризуется активностью Δ 15-десатуразы в отношении ЛК;
    хх) ω3-десатураза осуществляет десатурацию ЛК и/или ГЛК;
    xxi) ω3-десатураза имеет большую активность в отношении ГЛК, чем в отношении ЛК;
    xxii) одна или более или все десатуразы характеризуются более высокой активностью на субстрате ацил-КоА, чем на соответствующем субстрате ацил-ФХ (ацил-фосфатидилхолин);
    xxiii) Δ6-десатураза характеризуется более высокой активностью Δ6-десатуразы в отношении АЛК, чем в отношении ЛК как жирнокислотного субстрата;
    xxiv) Δ6-десатураза характеризуется более высокой активностью Δ6-десатуразы в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата;
    xxv) Δ6-десатураза характеризуется по меньшей мере в 2 раза более высокой Δ6-десатуразной активностью, по меньшей мере в 3 раза более высокой активностью, по меньшей мере в 4 раза более высокой активностью или по меньшей мере в 5 раз более высокой активностью в отношении АЛК как субстрата по сравнению с ЛК;
    xxvi) Δ6-десатураза характеризуется более высокой активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата;
    xxvii) Δ6-десатураза характеризуется по меньшей мере в 5 раз более высокой Δ6-десатуразной активностью или по меньшей мере в 10 раз более высокой десатуразной активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата; и xxviii) десатураза представляет собой фронт-энд десатуразу.
  11. 11. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что часть растения дополнительно содержит экзоген-
    - 90 037817 ный полинуклеотид, кодирующий диацилглицерид ацилтрансферазу (ДГАТ), моноацилглицерид ацилтрансферазу (МГАТ), глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ГФАТ), 1-ацил-глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФКАТ), ацил-КоА:лизофосфатидилхолин ацилтрансферазу (ЛФХАТ), фосфолипазу A2 (РЛК2), фосфолипазу C (PLC), фосфолипазу D (PLD), СДФ-холин диацилглицеридхолин фосфотрансферазу (ХФТ), фосфатидилхолин диацилглицерид ацилтрансферазу (ФДАГ), фосфатидилхолин:диацилглицерид холин фосфотрансферазу (ФДХТ), ацил-КоА синтазу (АКС) или комбинацию двух или более из указанных ферментов.
  12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что ЛФКАТ может использовать полиненасыщенный жирный C22 ацил КоА субстрат, такой как ДГК-КоА.
  13. 13. Способ по любому из пп.9-12, отличающийся тем, что экзогенные полинуклеотиды ковалентно соединены в молекулу T-ДНК, интегрированную в геном клеток части растения.
  14. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что количество молекул T-ДНК, интегрированных в геном клеток части растения, составляет одну, две или три.
  15. 15. Способ по любому из пп.5-14, отличающийся тем, что общее содержание масла в части растения, содержащей экзогенные полинуклеотиды, составляет по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, от около 50 до около 80% или от около 80 до около 100% от общего содержания масла в соответствующей части растения, в которой отсутствуют экзогенные полинуклеотиды.
  16. 16. Способ по любому из пп.5-15, отличающийся тем, что дополнительно включает обработку липида для повышения уровня ДГК в процентном выражении от общего содержания жирных кислот, причем обработка включает одно или более из фракционирования, перегонки или переэтерификации, такой как получение метиловых или этиловых эфиров ДГК.
  17. 17. Растение масличной культуры или его часть, содержащее:
    а) липид в семени по п.1, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме; и
    б) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:
    i) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза,
    Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, или ii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза,
    Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, при том, что каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более специфичных для семени промоторов, способных управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в развивающемся семени растения, и при этом жирные кислоты содержат олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, содержащие линолевую кислоту (ЛК) и γ-линоленовую кислоту (ГЛК), ω3 жирные кислоты, содержащие α-линоленовую кислоту (АЛК), стеаридоновую кислоту (СДК), докозапентаеновую кислоту (ДПК) и докозагексаеновую кислоту (ДГК), причем уровень ДГК в общем содержании жирных кислот липида семени составляет от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35% и уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот липида составляет от около 2 до 16%, и при этом уровень миристиновой кислоты (C14:0) в общем содержании жирных кислот липида, в случае если она присутствует, составляет менее чем 1%.
  18. 18. Растение масличной культуры по п.17, которое представляет собой Brassica napus, B. juncea или Camelina sativa, которое способно к образованию семени, содержащему ДГК, причем собранное в процессе сбора урожая зрелое семя растения содержит ДГК в количестве по меньшей мере около 28 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 32 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 36 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 40 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 44 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 48 мг на 1 г семени, около 80 мг на 1 г семени или от около 30 до около 80 мг на 1 г семени.
  19. 19. Клетка растения по п.17 или 18, содержащая экзогенные полинуклеотиды.
  20. 20. Часть растения, которая получена из растения по п.17 или 18 и которая содержит липид по любому из пп.1-4.
  21. 21. Семя, которое является частью растения по п.20.
  22. 22. Семя по п.21, отличающееся тем, что представляет собой зрелое, собранное семя Brassica napus, B. juncea или Camelina sativa, содержащее ДГК, с содержанием влаги от около 4 до около 15 мас.%, от около 6 до около 8 мас.% или от около 4 до около 8 мас.%, причем содержание ДГК в семени растения составляет по меньшей мере около 28 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 32 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 36 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 40 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 44 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 48 мг на 1 г семени, около 80 мг на 1 г семени или от около 30 до около 80 мг на 1 г семени.
  23. 23. Способ получения растения, которое может применяться для получения экстрагированного растительного липида по любому из пп.1-4, который включает:
    а) количественное определение уровня ДГК в липиде, выработанном одной или более частей растения от множества растений, причем каждое растение содержит один или более экзогенных полинуклеотидов, кодирующих один из следующих наборов ферментов:
    - 91 037817
    i) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iii) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iv) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза,
    Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,
    v) ω3-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vi) Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vii) Δ12-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, viii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ4-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, ix) ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,
    х) ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, xi) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, или xii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке части растения; и
    б) идентификацию растения из множества растений, полученных из семян масличной культуры по пп.17 или 18, которые могут применяться для получения экстрагированного растительного липида по любому из пп.1-4 в одной или более его частей.
  24. 24. Способ по п.23, дополнительно включающий получение потомства растений от идентифицированного растения или их семени.
  25. 25. Способ получения семян, содержащих липид по пп.1-4, включающий:
    а) выращивание растения по п.17 или 18 или растения, которое образует часть растения по п.20 или которое образует семя по п.21 или 22, в поле как часть популяции размером по меньшей мере 1000, или 2000, или 3000 таких растений или на площади размером по меньшей мере 1, или 2, или 3 га, культивируемых со стандартной плотностью насаждения; и
    б) сбор урожая семян растения или растений.
  26. 26. Способ по п.23, отличающийся тем, что липид экстрагируют из семени для получения масла с общим выходом ДГК по меньшей мере 60, или 70, или 80 кг ДГК на 1 га.
  27. 27. Растение или часть растения, в том числе клетка или семя растения по любому из пп.17-22, отличающиеся тем, что характеризуются одним или более из следующих признаков:
    i) содержат масло по любому из пп.2-4;
    ii) часть растения или семя пригодны для применения в способе по любому из пп.5-16.
  28. 28. Жмых, полученный из семени по п.21 или 22 или полученный из растения по п. 17 или 18.
  29. 29. Композиция, содержащая одно или более из липида или масла по пп.1-4, носитель, подходящий для фармацевтического, пищевого или сельскохозяйственного применения, соединение для обработки семени, удобрение, другой пищевой продукт или питательный ингредиент или дополнительный белок или витамины для использования в пищевой промышленности или сельском хозяйстве.
  30. 30. Корма, содержащие одно или более из липида или масла по п.29, семени по п.21 или 22 или жмыха по п.28.
  31. 31. Способ получения корма, включающий смешивание одного или более из липида или масла по любому из пп.1-4, клетки по п.19, растения масличной культуры по п.17 или 18, растительной клетки по п.19, части растения по п.27, семени по п.21 или 22, жмыха по п.28 или композиции по п.29, по меньшей мере с еще одним питательным ингредиентом.
  32. 32. Применение одного или более из липида или масла по любому из пп.1-4 для производства лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, при котором ПНЖК оказывают благоприятное воздействие, включая, без ограничения, повышенные уровни триглицеридов в сыворотке, повышенные уровни холестерина в сыворотке, например повышенные уровни ЛПНП холестерина, сердечную аритмию, ангиопластику, воспаление, астму, псориаз, остеопороз, камни в почках, СПИД, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, болезнь Крона, шизофрению, рак, плодный алкогольный синдром, синдром гиперактивности и дефицита внимания, муковисцидоз, фенилкетонурию, униполярную депрессию, агрессивную враждебность, адренолейкодистрофию, заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, диабет, ожирение, болезнь Альцгеймера, хроническое обструктивное заболевание легких, язвенный колит, рестеноз после ангиопластики, экзему, гипертонию, агрегацию тромбоцитов, желудочно-кишечное кровотечение, эндометриоз, предменструальный синдром, миалгический энцефаломиелит, хроническую усталость после вирусных инфекций или заболевание глаз.
EA201600471A 2013-12-18 2014-12-18 Экстрагированный растительный липид, содержащий длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты EA037817B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2013905033A AU2013905033A0 (en) 2013-12-18 Production of increased levels of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
AU2014902471A AU2014902471A0 (en) 2014-06-27 Production of increased levels of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
PCT/AU2014/050433 WO2015089587A1 (en) 2013-12-18 2014-12-18 Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201600471A1 EA201600471A1 (ru) 2016-10-31
EA037817B1 true EA037817B1 (ru) 2021-05-25

Family

ID=53367674

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201600471A EA037817B1 (ru) 2013-12-18 2014-12-18 Экстрагированный растительный липид, содержащий длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты
EA202092987A EA202092987A3 (ru) 2013-12-18 2015-06-18 Липид, содержащий докозапентаеновую кислоту

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202092987A EA202092987A3 (ru) 2013-12-18 2015-06-18 Липид, содержащий докозапентаеновую кислоту

Country Status (18)

Country Link
US (6) US9725399B2 (ru)
EP (1) EP3082405A4 (ru)
JP (3) JP6726619B2 (ru)
KR (2) KR102535223B1 (ru)
CN (2) CN104726473B (ru)
AU (1) AU2014366839B2 (ru)
BR (1) BR112016014508A2 (ru)
CA (2) CA3241340A1 (ru)
CL (2) CL2016001560A1 (ru)
EA (2) EA037817B1 (ru)
IL (1) IL246275B (ru)
MX (2) MX2016008270A (ru)
NZ (1) NZ721036A (ru)
PE (2) PE20170253A1 (ru)
PH (1) PH12016501194A1 (ru)
SG (1) SG11201604871VA (ru)
UA (1) UA122768C2 (ru)
WO (1) WO2015089587A1 (ru)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559364B (zh) 2004-04-22 2016-08-17 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
US7834250B2 (en) 2004-04-22 2010-11-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
EP2358882B1 (en) 2008-11-18 2017-07-26 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
US8946460B2 (en) 2012-06-15 2015-02-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Process for producing polyunsaturated fatty acids in an esterified form
US11718577B2 (en) * 2013-12-18 2023-08-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid compositions comprising triacylglycerol with long-chain polyunsaturated fatty acids
SG11201604871VA (en) 2013-12-18 2016-07-28 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
CN113980730A (zh) * 2014-06-27 2022-01-28 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质
KR102527795B1 (ko) 2014-06-27 2023-05-02 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 도코사펜타에노산을 포함하는 지질
MX2017006304A (es) 2014-11-14 2018-02-16 Basf Plant Science Co Gmbh Materiales y metodos para aumentar el contenido de tocoferol en semillas oleaginosas.
AU2017283710B2 (en) 2016-06-16 2022-07-14 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd Inbred transgenic canola line NS-B50027-4 and seeds thereof
JP7086329B2 (ja) 2016-06-16 2022-06-20 ニューシード ニュートリショナル オーストラリア ピーティーワイ リミテッド エリートイベントキャノーラｎｓ－ｂ５００２７－４
JP7246644B2 (ja) * 2016-12-03 2023-03-28 ザ ユーエービー リサーチ ファウンデイション 肺炎球菌表面プロテインａの選択されたアルファヘリカルドメインおよびプロリンリッチドメインを組み合わせた肺炎球菌ワクチン
CN107048405A (zh) * 2017-03-03 2017-08-18 武汉锶博睿医药技术有限公司 脂肪酸组件微胶囊及其制备方法
US11913006B2 (en) 2018-03-16 2024-02-27 Nuseed Global Innovation Ltd. Plants producing modified levels of medium chain fatty acids
CN112040766A (zh) 2018-04-13 2020-12-04 嘉吉公司 栽培含lc-pufa的转基因芸苔属植物的方法
ES2816008T3 (es) 2018-04-25 2021-03-31 Nuseed Pty Ltd Composiciones de ácidos grasos poliinsaturados enriquecidas en DHA
MX2020011185A (es) 2018-04-25 2021-02-09 Nuseed Nutritional Us Inc Composiciones de acidos grasos poliinsaturados enriquecidos con dha.
CN108929784A (zh) * 2018-06-21 2018-12-04 江南大学 一种富含多不饱和脂肪酸的甘二酯油脂及其制备方法
EP3586642A1 (en) * 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Ala enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586641A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586640A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586643A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
CA3129494A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Cargill, Incorporated Brassica plants producing elevated levels of polyunsaturated fatty acids
CN109796328B (zh) * 2019-03-14 2022-03-25 浙江工业大学 一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法
AU2020336357A1 (en) * 2019-08-26 2022-04-21 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd. Brassica juncea line NUBJ1207
CN110438175A (zh) * 2019-09-16 2019-11-12 东北农业大学 一种冷冻分离后的轻相米糠油与共轭亚油酸酯交换制备功能性油脂的方法
MX2022004887A (es) 2019-10-25 2022-08-04 Nuseed Nutritional Us Inc Composiciones enriquecidas de acidos grasos poliinsaturados.
US20230397562A1 (en) 2020-11-04 2023-12-14 Cargill, Incorporated Harvest Management
CA3202599A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Johnathan Andrew Napier Increasing the accumulation of epa and dha in recombinant camelina
WO2022204454A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Cargill, Incorporated Fertilizer management
US11186597B1 (en) 2021-06-24 2021-11-30 King Abdulaziz University Method of extracting phospholipids from fish roe
CA3236983A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Can Technologies, Inc. High plant pufa fish food

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005103253A1 (en) * 2004-04-22 2005-11-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
US7550286B2 (en) * 2004-11-04 2009-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
WO2010147900A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company IMPROVEMENT OF LONG CHAIN OMEGA-3 AND OMEGA-6 POLYUNSATURATED FATTY ACID BIOSYNTHESIS BY EXPRESSION OF ACYL-CoA LYSOPHOSPHOLIPID ACYLTRANSFERASES
US20130309772A1 (en) * 2010-10-01 2013-11-21 Kyushu University, National University Corporation Method for transformation of stramenopile
WO2013185184A2 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells

Family Cites Families (286)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
CA1338902C (en) 1986-02-27 1997-02-11 Howard M. Goodman Plant cells resistant to herbicidal glutamine synthetase inhibitors
MA20977A1 (fr) 1986-05-19 1987-12-31 Ciba Geigy Ag Plantes tolerant les herbicides contenant le gene de gluthathione S-Transferase
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
CN87100603A (zh) 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
ATE115999T1 (de) 1987-12-15 1995-01-15 Gene Shears Pty Ltd Ribozyme.
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5932479A (en) 1988-09-26 1999-08-03 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
EP0814166A3 (en) 1989-08-09 1998-05-13 DeKalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed fertile monocot plants and cells thereof
EP0472712B1 (en) 1990-03-16 2001-09-12 Calgene LLC Novel sequences preferentially expressed in early seed development and methods related thereto
US5877402A (en) 1990-05-01 1999-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey DNA constructs and methods for stably transforming plastids of multicellular plants and expressing recombinant proteins therein
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US7135614B1 (en) 1990-08-30 2006-11-14 Cargill, Incorporated Brassica or helianthus plants having mutant delta-12 or delta-15 sequences
US5861187A (en) 1990-08-30 1999-01-19 Cargill, Incorporated Oil from canola seed with altered fatty acid profiles and a method of producing oil
US5518908A (en) 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
US6355861B1 (en) 1991-10-10 2002-03-12 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase
PH31293A (en) 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
US5614393A (en) 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
US6683232B1 (en) 1991-10-10 2004-01-27 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ linolenic acid by a Δ6-desaturase
DE69233118T2 (de) 1991-12-04 2004-04-15 E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington Fettsäure-desaturase gene aus pflanzen
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
CA2113557A1 (en) 1992-05-15 1993-11-25 Kazunaga Yazawa Gene which codes for eicosapentaenoic acid synthetase group and process for producing eicosapentaenoic acid
US5683898A (en) 1992-05-15 1997-11-04 Sagami Chemical Research Center Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid
US5798259A (en) 1992-05-15 1998-08-25 Sagami Chemical Research Center Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
DE69410247T2 (de) 1993-03-11 1998-09-03 Canada Nat Res Council Verbessertes regenerationssystem für getreide
CA2092588C (en) 1993-03-26 2008-07-08 Narender S. Nehra Enhanced regeneration system for cereals
SE9302431D0 (sv) 1993-07-16 1993-07-16 Ab Astra Use of indenoindole compounds
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
US6310194B1 (en) 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5834293A (en) 1994-09-28 1998-11-10 Vanderbilt University Cytochrome P450 arachidonic acid epoxygenase genetic mutation associated with hypertension
DE4435392B4 (de) 1994-10-04 2008-02-07 Immuno Ag Verfahren zur Trennung von vWF in hochmolekularen vWF und niedermolekularen vWF
JPH08163991A (ja) * 1994-12-15 1996-06-25 Mitsui Petrochem Ind Ltd タキサン型ジテルペンの製造方法
GB9515941D0 (en) 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
US6342658B1 (en) 1995-12-14 2002-01-29 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
US7541519B2 (en) 1995-12-14 2009-06-02 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
AU750363B2 (en) 1997-06-12 2002-07-18 Cargill Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
CA2557769A1 (en) 1995-12-14 1997-06-19 Cargill, Incorporated Plants having mutant sequences that confer altered fatty acid profiles
SE9601236D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Sten Stymne Novel plant enzyme and use thereof
EP0856060A2 (en) 1996-06-21 1998-08-05 Monsanto Company METHODS FOR THE PRODUCTION OF STABLY-TRANSFORMED, FERTILE WHEAT EMPLOYING $i(AGROBACTERIUM)-MEDIATED TRANSFORMATION AND COMPOSITIONS DERIVED THEREFROM
US5850026A (en) 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
AU727694B2 (en) 1996-07-10 2000-12-21 Sagami Chemical Research Center Process for producing icosapentaenoic acid by genetic recombination
US6337266B1 (en) 1996-07-22 2002-01-08 Micron Technology, Inc. Small electrode for chalcogenide memories
US7109392B1 (en) 1996-10-09 2006-09-19 Cargill, Incorporated Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase
WO1998018952A1 (fr) 1996-10-30 1998-05-07 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Procede de production de matieres grasses contenant des acides gras hautement insatures contenant eux-memes un acide docosahexaenoique a concentration selective
US6194167B1 (en) 1997-02-18 2001-02-27 Washington State University Research Foundation ω-3 fatty acid desaturase
AT406373B (de) 1997-02-27 2000-04-25 Immuno Ag Verfahren zur reinigung von faktor viii/vwf-komplex mittels kationenaustauscherchromatographie
WO1998039468A1 (fr) 1997-03-04 1998-09-11 Suntory Limited Procede pour preparer un acide gras hautement insature (aghi) et lipide contenant cet aghi
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US6428990B1 (en) 1997-04-11 2002-08-06 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6051754A (en) 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6075183A (en) 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
CN1253588A (zh) 1997-04-11 2000-05-17 艾博特公司 在植物中合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物
BR9808676B1 (pt) 1997-04-15 2010-10-05 construção genética, processos para produzir um polipeptìdeo epoxigenase enzimaticamente ativo, recombinante, e, polipeptìdeo recombinante de ocorrência não natural.
US7589253B2 (en) 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
US6235529B1 (en) 1997-04-29 2001-05-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
US6140486A (en) 1997-06-04 2000-10-31 Calgene Llc Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
WO1999005265A2 (en) 1997-07-23 1999-02-04 Sanford Scientific, Inc. Improved plastid transformation of higher plants and production of transgenic plants with herbicide resistance
NZ503137A (en) 1997-09-12 2000-10-27 Groupe Limagrain Pacific Pty L Sequence and promoters for starch branching enzyme I, starch branching enzyme II, soluble starch synthase I and starch debranching enzyme derived from Triticum tauschii to modulate gene expression
EP1019517B2 (en) 1997-09-30 2014-05-21 The Regents of The University of California Production of proteins in plant seeds
GB9724783D0 (en) 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
HUP0101153A3 (en) 1997-12-23 2006-03-28 Univ Bristol Bristol Desaturase
US20030152983A1 (en) 1997-12-23 2003-08-14 University Of Bristol Desaturase
US6100447A (en) 1998-02-12 2000-08-08 Applied Phytologics, Inc. Method of barley transformation
CA2783215C (en) 1998-03-20 2015-11-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Limnanthes oil genes
US6838594B1 (en) 1998-03-20 2005-01-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Limnanthes oil genes
US6492108B1 (en) 1998-03-26 2002-12-10 Incyte Genomics, Inc. Delta-6 desaturase homologs
CA2329159A1 (en) 1998-05-29 1999-12-02 Bruce Kelder Compositions and methods for the synthesis of fatty acids, their derivatives and downstream products
AU4564399A (en) 1998-06-12 1999-12-30 Abbott Laboratories Polyunsaturated fatty acids in plants
CA2330024C (en) 1998-06-12 2012-01-24 Calgene Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
US7135617B2 (en) 1998-07-02 2006-11-14 Calgene Llc Diacylglycerol acyl transferase proteins
AU5674699A (en) 1998-08-20 2000-03-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for plant fatty acid modifying enzymes associated with conjugated double bond formation
WO2000011012A1 (en) 1998-08-24 2000-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey Synthetic fatty acid desaturase gene for expression in plants
US6677145B2 (en) 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6913916B1 (en) 1998-09-02 2005-07-05 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US20030163845A1 (en) 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
AU1097900A (en) 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Delta 6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis and products produced therefrom
AU6503699A (en) 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
EP1121150A4 (en) 1998-10-09 2003-06-04 Merck & Co Inc DELAT 6 FATTY ACID DESATURASE
JP4182192B2 (ja) 1998-11-26 2008-11-19 独立行政法人産業技術総合研究所 イコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子
US6864077B1 (en) 1998-12-03 2005-03-08 Edgar B. Cahoon Membrane-bound desaturases
JP2001095588A (ja) 1998-12-04 2001-04-10 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth 緑藻のω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びその利用
US6825017B1 (en) 1998-12-07 2004-11-30 Washington State University Research Foundation Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids
US8003772B2 (en) 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7271315B2 (en) 1999-01-14 2007-09-18 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US20070244192A1 (en) 1999-01-14 2007-10-18 Martek Biosciences Corporation Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
WO2000052183A1 (en) 1999-03-05 2000-09-08 Monsanto Technology Llc Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways
EP1035207A1 (en) 1999-03-09 2000-09-13 MultiGene Biotech GmbH cDNA molecules of the members of gene family encoding human fatty acid desaturases and their use in diagnosis and therapy
AU3308500A (en) 1999-03-18 2000-10-04 University Of Bristol, The Polysaturated fatty acid (pufa) elongase from caenorhabditis elegans
KR20020025069A (ko) 1999-06-07 2002-04-03 바스프 플랜트 사이언스 게엠베하 쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 δ6-아세틸레나제 및δ6-데새처라제
WO2001002591A1 (de) 1999-07-06 2001-01-11 Basf Plant Science Gmbh Δ6-desaturasegene exprimierende pflanzen und pufas enthaltende öle aus diesen pflanzen und ein verfahren zur herstellung ungesättigter fettsäuren
AU6091600A (en) 1999-07-12 2001-01-30 Ohio University Mammalian cells expressing desaturases and elongases
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
EP1206558B1 (en) 1999-08-26 2008-01-09 Calgene LLC Plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
WO2001020000A1 (de) 1999-09-10 2001-03-22 Celanese Ventures Gmbh Nucleinsäure aus tetrahymena kodierend für eine delta-6-desaturase, ihre herstellung und verwendung
FR2798391B1 (fr) 1999-09-15 2001-12-14 Inst Nat Sante Rech Med Enzyme thyroidienne nadph oxydase, acide nucleique codant pour cette enzyme et leurs applications
DE19950589A1 (de) 1999-10-20 2001-05-23 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Elongasepromotoren für gewebespezifische Expression von Transgenen in Pflanzen
JP4221476B2 (ja) 1999-11-19 2009-02-12 独立行政法人産業技術総合研究所 イコサペンタエン酸生合成遺伝子群をクローニングしたプラスミド及びイコサペンタエン酸を産生するラン藻
JP4884628B2 (ja) 1999-11-22 2012-02-29 プラント・バイオサイエンス・リミテッド 発現の増強
US6620986B1 (en) 1999-11-23 2003-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformation of Ricinus communis, the castor plant
AU1499601A (en) 1999-11-25 2001-06-04 Basf Plant Science Gmbh Moss genes from physcomitrella patents encoding proteins involved in the synthesis of polyunsaturated fatty acids and lipids
GB9929681D0 (en) 1999-12-15 2000-02-09 Implyx Ltd Transgenic insect
JP2001169780A (ja) 1999-12-15 2001-06-26 Natl Inst Of Advanced Industrial Science & Technology Meti ドコサヘキサエン酸生産細菌の遺伝子
GB9929897D0 (en) 1999-12-18 2000-02-09 Slabas Antoni R Improvements in or relating to conjugated fatty acids and related compounds
US20030172398A1 (en) 1999-12-21 2003-09-11 Browse John A. Novel delta-12 desaturase and methods of using it for synthesis of polyunsaturated fatty acids
US6591257B1 (en) 1999-12-23 2003-07-08 Hewlett-Packard Development Company Apparatus and method for a compositional decision support reasoning system
WO2001059128A2 (de) 2000-02-09 2001-08-16 Basf Aktiengesellschaft Neues elongasegen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren
US20040157221A9 (en) 2000-03-07 2004-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 25869, 25934, 26335, 50365, 21117, 38692, 46508, 16816, 16839, 49937, 49931 and 49933 molecules and uses therefor
US20020107373A1 (en) 2000-08-21 2002-08-08 Curtis Rory A.J. 49937, 49931, and 49933, novel human transporter family members and uses thereof
US6686185B1 (en) 2000-03-07 2004-02-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25934, a novel fatty acid desaturase and uses therefor
US7411054B2 (en) 2000-03-07 2008-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, 25934, 26335, 50365, 21117, 38692, 46508, 16816, 16839, 49937, 49931 and 49933 molecules and uses therefor
US6492577B1 (en) 2000-03-16 2002-12-10 The Regents Of The University Of California Leafy cotyledon2 genes and their uses
WO2001073060A2 (en) 2000-03-24 2001-10-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18221, dual specificity phosphatase and uses thereof
CA2301158A1 (en) 2000-03-24 2001-09-24 Stephen J. Allen Screening methods for compounds useful for modulating lipid metabolism in disease
WO2001075069A1 (fr) 2000-03-31 2001-10-11 Idemitsu Petrochemical Co., Ltd. Procede de production de lipides et micro-organismes secretant des lipides
DE60142734D1 (de) 2000-04-18 2010-09-16 Commw Scient Ind Res Org Verfahren zur modifizierung des baumwollölgehaltes
US7091005B2 (en) 2000-05-16 2006-08-15 Merck & Co., Inc. Gene responsible for Stargardt-like dominant macular dystrophy
AU2001266579A1 (en) 2000-05-16 2001-11-26 Dario B. Crosetto Method and apparatus for anatomical and functional medical imaging
EP1404820A2 (en) 2000-05-19 2004-04-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 50365, a hexokinase family member and uses therefor
AU2001263473A1 (en) 2000-05-26 2001-12-11 Washington State University Research Foundation Palmitate desaturase gene
WO2001096363A1 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Boyce Thompson Institute For Plant Research Fatty acid desaturase gene and protein for modulating activation of defense signaling pathways in plants
AU7007701A (en) 2000-06-23 2002-01-08 Millennium Pharm Inc 46508, a novel human peptidyl-trna hydrolase family member and uses thereof
EP1297155A2 (en) 2000-06-29 2003-04-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, a human carboxylesterase and uses thereof
WO2002006302A2 (en) 2000-07-17 2002-01-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 16816 and 16839, novel human phospholipase c molecules and uses therefor
GB0316629D0 (en) 2003-07-16 2003-08-20 Univ York Transgenic cell
US7232662B2 (en) 2000-09-26 2007-06-19 Xenon Pharmaceuticals Inc. Methods and compositions employing a novel stearoyl-CoA desaturase-hSCD5
DK1911837T3 (da) 2000-09-28 2011-08-29 Bioriginal Food & Science Corp FAD5-2 fedtsyredesaturasefamiliemedlem og anvendelser deraf
JP2004513662A (ja) 2000-11-29 2004-05-13 キセノン　ジェネティックス　インコーポレイテッド ヒトエロンガーゼ遺伝子、その使用およびそれを調節する化合物
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
DE10102338A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
CA2435685C (en) 2001-01-25 2011-06-07 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
DE10106660A1 (de) 2001-02-12 2002-08-29 Celanese Ventures Gmbh Verfahren zur Herstellung von gamma-Linolensäure aus einer Ciliaten-Kultur durch Zusatz geeigneter Vorläufermoleküle zu dem Kulturmedium
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
WO2002081702A1 (en) 2001-04-05 2002-10-17 Idemitsu Technofine Co., Ltd. Fatty acid δ6-position desaturase genes and plasmids and tra nsformant containing these genes
TWI350854B (en) 2001-04-16 2011-10-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
TWI337619B (en) 2001-04-16 2011-02-21 Martek Biosciences Corp Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
US20030082754A1 (en) 2001-05-04 2003-05-01 Pradip Mukerji Delta4 - desaturase genes and uses thereof
US7045683B2 (en) 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
MX281182B (es) * 2001-05-14 2010-11-22 Martek Biosciences Boulder Corp Produccion y uso de una fraccion rica en lipidos polares, que contienen acidos grasos altamente insaturados omega-3 y/u omega-6, procedentes de microbios, de semillas de plantas y de organismos marinos geneticamente modificados.
ATE404672T1 (de) 2001-06-06 2008-08-15 Bioriginal Food & Science Corp Samen-spezifische sequenzen aus flachs (linum usitatissimum l.)
DE10134660A1 (de) 2001-07-20 2003-02-06 Basf Plant Science Gmbh Fettsäure-Desaturase-Gene aus Granatapfel und Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
US20050089879A1 (en) 2001-07-31 2005-04-28 Ivo Feussner Method for producing arachidonic acid in transgenic organisms
US6875595B2 (en) 2001-09-13 2005-04-05 Divergence, Inc. Nematode fatty acid desaturase-like sequences
JP2003116566A (ja) 2001-10-12 2003-04-22 Osamu Suzuki ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法
ES2337564T3 (es) 2002-01-30 2010-04-27 Basf Plant Science Gmbh Metodo para elaborar acidos grasos poliinsaturados mediante un nuevo gen de elongasa.
US7211656B2 (en) 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
US7700833B2 (en) 2002-03-01 2010-04-20 Cornell University Process for the production of unsaturated fatty acids
CA2519169C (en) 2002-03-16 2013-04-30 The University Of York Transgenic plants expressing enzymes involved in fatty acid biosynthesis
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
EP1549133B1 (en) 2002-05-22 2015-04-22 Monsanto Technology LLC Fatty acid desaturases from fungi
JP2005530506A (ja) 2002-06-21 2005-10-13 モンサント テクノロジー エルエルシー 改変された脂肪酸組成を持つ植物の生成のためのチオエステラーゼ関連核酸配列およびその使用方法
AU2003258496A1 (en) 2002-07-03 2004-01-23 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of conjugated polyunsaturated fatty acids comprising at least two double bonds in plants
AU2003298548A1 (en) 2002-08-12 2004-05-25 Monsanto Technology Llc Methods for increasing total oil levels in plants
DE10246125A1 (de) 2002-10-01 2004-04-15 Aventis Behring Gmbh Konzentrat eines Faktor VIII:C-haltigen von-Willebrand-Faktors und das dazu gehörige Verfahren
BR0317304A (pt) 2002-12-19 2005-11-08 Univ Bristol Processo para a produção de compostos, sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácidos, construção gênica, vetor, e, organismo
US8084074B2 (en) 2003-02-12 2011-12-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oil seed plants
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
ATE517984T1 (de) 2003-02-27 2011-08-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren
JP3840459B2 (ja) * 2003-03-20 2006-11-01 裕司 島田 グリセリドおよびその製造方法
EP1613746B1 (de) 2003-03-31 2013-03-06 University Of Bristol Neue pflanzliche acyltransferasen spezifisch für langkettige, mehrfach ungesättigte fettsäuren
DE10315026A1 (de) 2003-04-02 2004-10-14 Bioplanta Arzneimittel Gmbh Zusammensetzungen enthaltend omega-3-fettsäurehaltige Öle und Pflanzenextrakte
WO2004090123A2 (de) 2003-04-08 2004-10-21 Basf Plant Science Gmbh Δ-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle
WO2004092367A1 (en) 2003-04-16 2004-10-28 Basf Plant Science Gmbh Use of genes for increasing the oil content in plants
US7125672B2 (en) 2003-05-07 2006-10-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7238482B2 (en) 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US8313911B2 (en) 2003-05-07 2012-11-20 E I Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US20110059496A1 (en) 2003-06-25 2011-03-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US7267976B2 (en) 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
CA2530123C (en) * 2003-07-09 2012-05-01 The Nisshin Oillio Group, Ltd. Method for producing symmetric triglycerides
US9433228B2 (en) 2003-08-01 2016-09-06 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of multiple-unsaturated fatty acids in transgenic organisms
EP1656449B1 (en) 2003-08-21 2009-05-06 Monsanto Technology LLC Fatty acid desaturases from primula
WO2005047480A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 E.I. Dupont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous plants and yeast
US7504259B2 (en) 2003-11-12 2009-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ12 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeast
MY140210A (en) 2003-12-22 2009-11-30 Suntory Holdings Ltd Marchantiales-derived unsaturated fatty acid synthetase genes and use of the same
US7951994B2 (en) 2004-02-17 2011-05-31 The University Of York Desaturase enzymes
CN1930277B (zh) 2004-02-27 2011-02-02 巴斯福植物科学有限公司 在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法
EP1720988B1 (de) 2004-02-27 2011-10-12 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen
EP4219670A3 (de) 2004-02-27 2023-08-09 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen pflanzen
DE102004017370A1 (de) 2004-04-08 2005-10-27 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh PUFA-PKS Gene aus Ulkenia
DE102004017369A1 (de) 2004-04-08 2005-11-03 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Screeningverfahren zur Identifizierung von PUFA-PKS in Proben
CN1968688A (zh) 2004-04-16 2007-05-23 孟山都技术有限公司 脂肪酸去饱和酶在玉米中的表达
CN102559364B (zh) 2004-04-22 2016-08-17 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
CA2568689A1 (en) 2004-06-04 2005-12-15 Fluxome Sciences A/S Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids
AU2005267202B2 (en) 2004-06-25 2011-10-27 Corteva Agriscience Llc Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
DE102004060340A1 (de) 2004-07-16 2006-02-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
JP4587451B2 (ja) 2004-08-20 2010-11-24 サントリーホールディングス株式会社 ω３脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにそれらの利用
WO2006031699A2 (en) * 2004-09-10 2006-03-23 Diversa Corporation Compositions and methods for making and modifying oils
DE102004044421B4 (de) 2004-09-14 2010-06-24 Biotest Ag Verfahren zur Trennung eines von Willebrand Faktors mit einer spezifischen VWF-Aktivität von wenigstens 50 E/mg VWF-Antigen von einem von Willebrand Faktor mit niedriger Aktivität und Verwendung von Hydroxylapatit dafür
GB0421937D0 (en) 2004-10-02 2004-11-03 Univ York Acyl CoA synthetases
US7198937B2 (en) 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US20060094102A1 (en) 2004-11-04 2006-05-04 Zhixiong Xue Ammonium transporter promoter for gene expression in oleaginous yeast
US7273746B2 (en) 2004-11-04 2007-09-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US8685679B2 (en) 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
US7192762B2 (en) 2004-11-04 2007-03-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina glycerol-3-phosphate o-acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7189559B2 (en) 2004-11-04 2007-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina lysophosphatidic acid acyltransferase homolog for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7879591B2 (en) 2004-11-04 2011-02-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company High eicosapentaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
CN101124330A (zh) 2004-12-14 2008-02-13 阿维斯塔金格兰技术有限公司 在酵母中重组生产二十二碳六烯酸（dha）
DE102004062294A1 (de) 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102004063326A1 (de) 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
EP1906725A4 (en) 2005-05-20 2010-04-28 Univ Washington State IMPROVING ACCUMULATION OF HYDROXY FATTY ACIDS IN OILSEED PLANTS
ES2550623T3 (es) 2005-05-23 2015-11-11 Blue Horse Labs, Inc. Cártamo con ácido gamma linolénico elevado
WO2006135866A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Martek Biosciences Corporation Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
WO2007005727A2 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Martek Biosciences Corporation Microwaveable popcorn and methods of making
US20110138495A1 (en) 2005-07-05 2011-06-09 Arthur Weissinger Methods and Compositions for Expressing Proteins In Plants
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
JP5123861B2 (ja) 2005-11-23 2013-01-23 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー Δ９エロンガーゼおよびそれらの多価不飽和脂肪酸製造における使用
RU2437583C2 (ru) * 2005-12-21 2011-12-27 Бруди Текнолоджи, С.Л. Применение дгк (dha), эпк (epa) или эпк, полученных из дгк, для лечения патологии, связанной с окислительным повреждением клетки, a также их нетерапевтические применения
EP1981331A4 (en) 2006-02-03 2009-09-09 Texas A & M Univ Sys IMPROVEMENT OF EXPRESSION OF ADDED GENES BY TRANSGENIC EXPRESSION OF TOMBUSVIRUS-BASED P19 GENE MUTANTS
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
WO2007106905A2 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Martek Biosciences Corporation Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems
US7943823B2 (en) 2006-04-28 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US20070254299A1 (en) 2006-05-01 2007-11-01 Yadav Narendra S Fungal delta 12 desaturase and delta 15 desaturase motifs
KR101515044B1 (ko) 2006-05-29 2015-05-19 아이콘 제네틱스 지엠비에이치 식물 바이러스 기반 유도성 발현 시스템
DE102006034313A1 (de) 2006-07-21 2008-01-24 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure
AU2007287585B2 (en) 2006-08-24 2013-08-29 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel Pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
CA2661697A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
EP2182056B1 (de) 2006-10-06 2015-12-23 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen nicht-humanen Organismen
US8916361B2 (en) 2006-11-17 2014-12-23 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US7709239B2 (en) 2006-12-07 2010-05-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mutant Δ8 desaturase genes engineered by targeted mutagenesis and their use in making polyunsaturated fatty acids
WO2008104559A1 (de) 2007-02-27 2008-09-04 Norddeutsche Pflanzenzucht Verfahren zur herstellung von mehrfach ungesättigten fettsäuren in transgenen organismen
JP2010523113A (ja) 2007-04-03 2010-07-15 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー マルチザイム（ｍｕｌｔｉｚｙｍｅ）および多価不飽和脂肪酸の製造におけるその使用
US7794701B2 (en) 2007-04-16 2010-09-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US7943365B2 (en) 2007-05-03 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
WO2008150892A2 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Monsanto Technology Llc Compositions for production of soybean with elevated oil content
CA2695112A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Basf Plant Science Gmbh Elongases and processes for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
DE112008001989A5 (de) 2007-07-31 2010-06-10 Basf Plant Science Gmbh Desaturasen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen
WO2009017821A1 (en) 2007-08-01 2009-02-05 Bioglow Inc. Bioluminescent plants comprising bacterial lux operon and methods of making same
US8119784B2 (en) 2008-04-02 2012-02-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-4 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
FR2929514B1 (fr) * 2008-04-08 2011-01-14 Lr Beva Compositions comprenant de l'acide myristique, des acides gras comprenant un diene conjugue n-5cis, n-7trans ou un triene conjugue n-5cis, n-7trans, n-9cis et leurs applications
WO2009130291A2 (de) * 2008-04-25 2009-10-29 Basf Plant Science Gmbh Pflanzensamenöl
AU2009240794A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids
AU2009242130B2 (en) 2008-04-30 2013-09-19 Rothamsted Research Ltd. Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
JP5047872B2 (ja) 2008-04-30 2012-10-10 篠田プラズマ株式会社 ガス放電管および表示装置
US7807899B2 (en) 2008-05-08 2010-10-05 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of hybrid corn variety CH720554
US8901374B2 (en) 2008-06-03 2014-12-02 Basf Plant Science Gmbh Fatty acid dehydratases and uses thereof
WO2010005724A2 (en) 2008-06-16 2010-01-14 Engineering Services Network, Inc. Systems and methods for automated simulation of a propulsion system and testing of propulsion control systems
US8168858B2 (en) 2008-06-20 2012-05-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 fatty acid elongase genes and their use in making polyunsaturated fatty acids
DE112009001585T5 (de) 2008-07-01 2012-02-23 Basf Plant Science Gmbh Promotoren von Brassica napus für samenspezifische Genexpression
AU2009273754B2 (en) 2008-07-21 2016-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved cottonseed oil and uses
CA2768737A1 (en) 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
DE112009002048T5 (de) 2008-08-26 2012-01-26 Basf Plant Science Gmbh Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl
US8329994B2 (en) 2008-10-14 2012-12-11 Monsanto Technology Llc Utilization of fatty acid desaturases from Hemiselmis spp
EP2358882B1 (en) 2008-11-18 2017-07-26 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
CA2744930C (en) 2008-12-12 2018-03-20 Basf Plant Science Gmbh Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
EP2821492A3 (en) 2009-05-13 2015-04-08 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
US8188335B2 (en) 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
CA3037072C (en) 2009-07-17 2022-07-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
EP3418387B1 (en) 2009-08-31 2020-11-25 Basf Plant Science Company GmbH Regulatory nucleic acid molecules for enhancing seed-specific gene expression in plants promoting enhanced polyunsaturated fatty acid synthesis
EP2504427B1 (en) 2009-11-24 2018-06-27 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturase and uses thereof
CA2781559C (en) 2009-11-24 2018-09-04 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid elongase and uses thereof
TW201144442A (en) 2010-05-17 2011-12-16 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC-PUFAs in plants
WO2012000026A1 (en) 2010-06-28 2012-01-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods of producing lipids
WO2012052468A2 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases, elongases, elongation components and uses therof
TW201307553A (zh) 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術
AU2013246661B2 (en) 2012-04-12 2018-12-20 Rothamsted Research Ltd Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids
CN104520313A (zh) 2012-08-03 2015-04-15 巴斯夫植物科学有限公司 新的酶、酶组合物及其用途
GB201217524D0 (en) 2012-10-01 2012-11-14 Rothamsted Res Ltd Recombinant organisms
SG11201604871VA (en) 2013-12-18 2016-07-28 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
KR102527795B1 (ko) * 2014-06-27 2023-05-02 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 도코사펜타에노산을 포함하는 지질

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005103253A1 (en) * 2004-04-22 2005-11-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
US7550286B2 (en) * 2004-11-04 2009-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
WO2010147900A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company IMPROVEMENT OF LONG CHAIN OMEGA-3 AND OMEGA-6 POLYUNSATURATED FATTY ACID BIOSYNTHESIS BY EXPRESSION OF ACYL-CoA LYSOPHOSPHOLIPID ACYLTRANSFERASES
US20130309772A1 (en) * 2010-10-01 2013-11-21 Kyushu University, National University Corporation Method for transformation of stramenopile
WO2013185184A2 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PETRIE, J.R. et al. "Metabolic engineering Camelina sativa with fish oil-like levels of DHA", PLoS One, January 2014, Vol. 9, page e85061, the whole document *
PETRIE, J.R. et al., "Metabolic engineering plant seeds with fish oil-like levels of DHA", PLoS One, 2012, Vol. 7, e49165, published online 7 November 2012, the whole document *
RUIZ-LOPEZ, N. et al., "Metabolic engineering of the omega-3 long chain polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathway into transgenic plants", Journal of Experimental Botany, 2012, Vol. 63, pages 2397-2410, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104726473B (zh) 2020-02-14
CN104726473A (zh) 2015-06-24
US11623911B2 (en) 2023-04-11
CL2019003105A1 (es) 2020-04-17
US20150374654A1 (en) 2015-12-31
US10125084B2 (en) 2018-11-13
MX2016017355A (es) 2017-07-11
EP3082405A1 (en) 2016-10-26
US9718759B2 (en) 2017-08-01
KR102386838B1 (ko) 2022-04-15
US9725399B2 (en) 2017-08-08
PE20170431A1 (es) 2017-05-10
IL246275A0 (en) 2016-07-31
EA202092987A3 (ru) 2021-11-30
CA2933909A1 (en) 2015-06-25
PE20170253A1 (es) 2017-04-14
US20170305834A1 (en) 2017-10-26
JP2020023700A (ja) 2020-02-13
CA3241340A1 (en) 2015-06-25
AU2014366839B2 (en) 2021-07-01
JP6855249B2 (ja) 2021-04-07
US20190100485A1 (en) 2019-04-04
CN111154724B (zh) 2024-02-06
CL2016001560A1 (es) 2017-10-20
US10800729B2 (en) 2020-10-13
JP6972074B2 (ja) 2021-11-24
EP3082405A4 (en) 2017-12-13
UA122768C2 (uk) 2021-01-06
BR112016014508A2 (pt) 2018-07-31
KR102535223B1 (ko) 2023-05-30
US10190073B2 (en) 2019-01-29
US20150166928A1 (en) 2015-06-18
JP6726619B2 (ja) 2020-07-22
US20170211013A1 (en) 2017-07-27
MX2016008270A (es) 2017-05-26
IL246275B (en) 2018-12-31
WO2015089587A1 (en) 2015-06-25
NZ721036A (en) 2023-07-28
KR20220052373A (ko) 2022-04-27
AU2014366839A1 (en) 2016-06-30
PH12016501194A1 (en) 2016-08-15
EA202092987A2 (ru) 2021-04-30
US20190194572A1 (en) 2019-06-27
CN111154724A (zh) 2020-05-15
SG11201604871VA (en) 2016-07-28
JP2017532949A (ja) 2017-11-09
KR20160111921A (ko) 2016-09-27
JP2017503053A (ja) 2017-01-26
EA201600471A1 (ru) 2016-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11834621B2 (en) Lipid comprising polyunsaturated fatty acids
US10800729B2 (en) Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
US10793507B2 (en) Lipid compositions comprising triacylglycerol with long-chain polyunsaturated fatty acids at the SN-2 position
JP2017503053A5 (ru)
US20230348357A1 (en) Lipid comprising docosapentaenoic
EA037184B1 (ru) Липид, содержащий докозапентаеновую кислоту