JP4884628B2 - 発現の増強 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、遺伝子サイレンシング、特に転写後遺伝子サイレンシングを抑制することに使用するための、および遺伝子発現を高めるための方法および物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物では、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ(post-transcriptional gene silencing)）が、植物ゲノムにおける相同配列の導入後に、特定のＲＮＡの定常レベルでの低減として現れる。この低減は、対応する遺伝子の転写レベルは影響を受けないままで、ターゲットＲＮＡ種の増大したターンオーバーによって引き起こされる（（１）参照）。
【０００３】
ＰＴＧＳは、種々の形態で開始され、内因性植物遺伝子の共同抑制、およびトランスジーンの低下した発現といった現象の基礎になると考えられている。トランスフォームされた植物では、対応する遺伝子産物が低レベルで蓄積するように、トランスジーンおよびあらゆる類似の内因性遺伝子の転写に対してＰＴＧＳが向けられる（Vaucheretら,1998）。
【０００４】
トランスジェニック植物におけるＰＴＧＳの最も興味をそそる特徴の一つは、それが細胞自律性でないことである。遺伝子サイレンシングのシグナルは、細胞間連絡（plasmodesmata）を介して細胞間を、そして、維管束系を通して長距離を移動し、ターゲットＲＮＡの配列特異的分解（デグラデーション）を指示することができる（２、３）。シグナルの性質は公知ではないが、その反応特異性から、核酸を含むことが考えられる。分解メカニズムの特異性は、ＰＴＧＳを示す組織に蓄積するターゲットＲＮＡに対応する短いＲＮＡ種により媒介されるかもしれない（HamiltonとBaulcombe, 1999 -これには２５ヌクレオチドと記載されているが、２１−２３ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡであろう）。
【０００５】
ＰＴＧＳが機能する正確なメカニズムは未だ解明されていないが、ウイルスがＰＴＧＳを開始しかつＰＴＧＳのターゲットでもあるという種々の知見（４）から、ＰＴＧＳは植物が外因性の核酸を認識して対処するという通常のメカニズムであるという示唆が導かれる（５）。ＰＴＧＳとウイルス耐性との間の提案された関係を養護するように、一部のウイルスが非トランスジェニック植物においてＲＮＡ介在防御（ＲＭＤ）を誘導することが示された。かかる誘導された防御は、ウイルス感染に対するヌクレオチド配列特異的耐性によって特徴付けられると言う点で、ＰＴＧＳと類似している（６）。感染細胞では、ＰＴＧＳは、ウイルスＲＮＡに対して向けられ、その蓄積を引き起こし、感染プロセスの後の段階でスローダウンまたは停止を引き起こす（Ratcliffら, 1999）。一部において、しかし全てではないが、低レベルのみのウイルスＲＮＡを含み症状を示さないことから、このＲＭＤを示す植物の上葉が回復したと言える（７、８）。
【０００６】
ウイルス防護におけるＰＴＧＳの役割は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）に感染したsgs2ミュータントシロイヌナズナ植物の表現型によって示される（Mourrainら, 2000）。これらの植物は、ＰＴＧＳに欠陥があり、ウイルスに対して過敏である。さらに、カウリモ(caulimo)-、ネポ(nepo)-、ポテックス(potex)-、およびトブラウイルス(tobravirus)では、ＰＴＧＳが、少なくとも一部において、二次ウイルス感染に対する交差保護を説明する証拠が存在する（Coveyら,1997; Ratcliffら,1977; Ratcliffら,1999）。第一のウイルスがＰＴＧＳを誘導し、その結果、感染した細胞が、ヌクレオチド特異的形態で第二のウイルスに対抗するように準備される。宿主配列のエレメントを有するトバモ(tobamo)-、ポテックス-およびジェミニ(gemini)-ウイルスベクターに感染した植物の内因性遺伝子のサイレンシングも、ＰＴＧＳが抗ウイルス防御メカニズムであることを示す（Baulcobme, 1999）。ウイルス複製の開始後、ＰＴＧＳはウイルスゲノムの配列に対して向けられ、対応する内因性遺伝子の発現が抑制される。
【０００７】
ＰＴＧＳがトランスジェニック植物において全身的に輸送されるという発見は、それが自然なウイルス感染の際に非細胞自律的に機能するというヒントを与えた（Voinnetら, 1998; Jorgensenら,1998; Carrington, 1999; LucasとWolf,1999）。ウイルス誘導サイレンシングシグナルは、感染に先だって細胞から細胞へと移動でき、篩部を介して長距離にわたって輸送される。この細胞間シグナリングの効果は、非感染組織においてＲＮＡ配列特異的ウイルス耐性を強化することであり、結果的に、その植物全体にわたるウイルスの拡散を遅延させることである。
【０００８】
以上にも関わらず、植物に感染するウイルスの能力は、ＲＭＤを避けるまたは抑制するように進化してきたことを示す。
【０００９】
この考えは、別のウイルスとのポチウイルス(potyviral)相乗的相互作用の分析により最初にヒントを得た（９）。この相乗性は、ポチウイルス性ゲノムにコードされるＨｃ-プロテアーゼ（HcPro）による宿主防御メカニズムの抑制によることが示され（１０）、例えば、タバコ葉脈斑ウイルス（ＴＶＭＶ(tobacco vein mottling virus)）；タバコ腐蝕ウイルス（ＴＥＶ(tobacco etch virus)）およびポテトウイルスＹ（ＰＶＹ）である。後の研究では、さらに、HcProがＰＴＧＳのサプレッサーであることを確立し、かつ、ＰＴＧＳと抗ウイルス防御との間の関係を示した（１１−１３）。おそらく、抑制は、引き起こされたＲＭＤに対して作用する。
【００１０】
第二のタンパク、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の２ｂタンパクも、N.benthamianaにおいてＰＴＧＳのサプレッサーであると同定された（１２）。タンパク２ｂおよびHcProは、タンパクの配列レベルでは非類似であり、かつ、興味深いことに、これらはサイレンシングメカニズムを同じ形態で標的とするものではない：すなわち、HcProは、サイレンシングが既に確立された組織内のサイレンシングを抑制するが、２ｂタンパクは、サイレンシングの開始に影響するのみである（１２、１４）。
【００１１】
遺伝子サイレンシングのサプレッサーは、とりわけ、植物における所望の遺伝子、特に異種遺伝子の発現を改善するために用いることができる（VanceらのWO98/44097参照）。さらに、ＰＴＧＳが動物でも機能するという証拠の拡大により、サイレンシング抑制が動物ウイルスによっても採用され（３１）、かつ、係るサプレッサーが、例えば哺乳動物における遺伝子発現に関連しているかもしれないという可能性が高められる。
【００１２】
かくして、遺伝子サイレンシングのサプレッサー、またはその源の同定は、当該技術に寄与することが解る。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
種々のウイルスから遺伝子サイレンシングの多数のサプレッサーを同定した。ＰＴＧＳを抑制する能力は、そのウイルスまたは、特定のウイルスの病原性決定因子を発現するＰＶＸベクターを、ＧＦＰトランスジーンのＰＴＧＳを示すN.benthamiana植物に感染させることによって評価した。
【００１４】
ここに開示されたサプレッサーは、とりわけ、所望でないサイレンシングを抑制するために用いられる。
【００１５】
別の実験では、ウイルス誘導シグナルの移動をウイルスの移動から切り離すことができる新規のＰＶＸをベースとする実験系を用いた。これは、抗ウイルスシグナル分子が、感染細胞から数センチメートルにわたって輸送され、受容側の葉脈の中および周りに蓄積し得ることを示した。しかしながら、ＰＶＸの２５ｋＤａタンパク（ｐ２５）は、全身性ＰＴＧＳ反応を抑制する。初期のモデルでは、ＰＶＸのｐ２５タンパクは、移動タンパクとして特徴付けられ、チャネルゲーティングの促進剤であると考えられていた（Angellら,1996）。以下に記載した研究は、そのさらなる促進的役割を示唆する。
【００１６】
ｐ２５を用いたさらなる実験は、ＰＴＧＳ経路に二つの分岐経路を示した。一方の分岐経路は、ウイルス性ＲＮＡを複製することによって活性化されるように見え、ｐ２５に影響されない。第二の分岐経路は、ウイルスまたはトランスジーン由来の非複製ＲＮＡによって活性化され、ｐ２５によって抑制される。全身性シグナルは、第二の、ｐ２５−感受性経路において産生されるように思われ、２１−２３ヌクレオチド程度の短いＲＮＡ種の前駆体であると思われる。他に、これらの観察は、ｐ２５がターゲット遺伝子の全身性サイレンシングを特異的に阻害する（すなわち、その発現を比較的増強する）ために用いられることを示す。これは、植物においてターゲットトランスジーンの発現を優先的に増強（抑制を低減）するために、ウイルスにより発現される遺伝子の抑制を同等に低減することなく、用いることができる（ウイルス性疾患に対する植物の感受性を増大することができる）。
【００１７】
本発明のさらなる態様では、種々のサプレッサー（新規サプレッサーと従来技術のものの両方）を、持続的発現期間（一般に数日）にわたって、そのタンパクの非常に高いレベルを生じる“一過的(transient)”発現系と共に用いた。特定の実験は、いずれも植物バイナリーベクターから、所望のタンパクの一過的発現と共に、サプレッサーの一過的発現を用いた。この結果は、高度に（i）強化され、かつ（ii）持続的な発現レベルが達成されただけでなく、このように用いられた構築物から得られる発現の“一過的”性質にＰＴＧＳが何らかの役割を演じることが今まで知られていなかったことから、特に驚くべきことであった。この結果は、一部の場合には、発現が、細胞が生存能力を維持する限り維持されることから、サプレッサーの存在下で用いる場合に、用語“一過的”が一部の態様では誤称であることを示す。それにもかかわらず、当業者になじみが深いであろうことから、用語“一過的”を都合よく用いる。本発明の好ましい態様では、このシステムは、植物またはその一部において、“安定な”（組み込み）トランスジーンまたはウイルスベクターの使用より、高レベルかつより簡便に、タンパクを生成する迅速な方法として用いられる。あるいは、推定のサプレッサーを同定するための敏感な“トラップ(trap)”アッセイとして用いられる。推定のサプレッサーは、あらゆる源、例えば、植物、動物、またはウイルスから誘導できる。
【００１８】
本発明の種々の態様、および以下のウイルスに関して、以下の略記を用いる：
タバコ葉脈斑ウイルス（ＴＶＭＶ）；
タバコ腐蝕ウイルス（ＴＥＶ）[ポチウイルス(potyvirus)]；
ポテトウイルスＹ（ＰＶＹ）[ポチウイルス]；
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）[ククモウイルス(cucumovirus)]；
タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）[トバモウイルス(tobamovirus)]；
ポテトウイルスＸ（ＰＶＸ）[ポテックスウイルス(potexvirus)]；
トマトブッシー発育阻害ウイルス（ＴＢＳＶ(tomato bushy stunt virus)）[トンブスウイルス(tombusvirus)]；
スイセンモザイクウイルス（ＮＭＶ）[ポテックスウイルス]；
ナンテンウイルスＸ（ＮＶＸ）[ポテックスウイルス]；
スミレモザイクウイルス（ＶＭＶ）[ポテックスウイルス]；
カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）[コモウイルス(comovirus)]；
エノコログサモザイクウイルス（ＦｏＭＶ）[ポテックスウイルス]；
アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）；
タバコブラックリングウイルス（ＴＢＲＶ）[ネポウイルス(nepovirus)]。
【００１９】
ＧＦＰのＰＴＧＳを妨げた、ＰＴＧＳ様耐性メカニズムのサプレッサーを産生した野生型および組み換えウイルスは、ＴＭＶ；ＴＢＳＶ；ＲＹＭＶ；ＡＣＭＶ；ＮＭＶ；ＮＶＸ；ＶＭＶおよびＣＰＭＶを含む。
【００２０】
以下の実施例に記載した最初のＰＴＧＳ抑制アッセイでは、関連するウイルスが、サイレンシング抑制の特徴的なパターンを生じた。ポチウイルスのような一部のウイルスは、若い葉および老いた葉において抑制した。他はＣＭＶ様であり、若い葉のみに影響した。組織特異性にも変化があって、ＡＣＭＶ、ＮＭＶ、ＮＶＸ、ＶＭＶ、およびＰＶＸ-Ｐ１は全ての組織に影響するが、ＴＢＳＶ、ＴＭＶおよびＣＰＭＶは葉脈内またはその近くの組織において特異的にサイレンシングを抑制した。葉脈の近くで機能するサイレンシング抑制のこのような表現型は、これまでに特徴決定されていない。興味深いことに、ＴＭＶ、ＴＢＳＶおよびＣＰＭＶは葉脈内またはその近くでＰＴＧＳを抑制することができるだけであるが、それにも関わらず感染した葉全体に高いレベルで蓄積することができる。それゆえ、明らかに、ＰＴＧＳの抑制は、病原性を増強し、かつＲＭＤの効果を妨げるための、ウイルスにより採用された唯一の戦略というわけでは決してない。
【００２１】
第二の（全身性）ＰＴＧＳ抑制アッセイでは、移植実験および／またはＰＶＸの移動欠陥形態に基づいて、ＰＴＧＳの全身性シグナリングは、２５ｋＤａウイルス性移動タンパク（ｐ２５）が修飾または除去された場合にのみ、ＰＶＸに観察されただけであった。
【００２２】
ｐ２５の新規の役割に加えて、ＰＴＧＳの少なくとも３つの新たなウイルス性タンパクサプレッサーが、特異的に単離された（ＡＣＭＶ ＡＣ２、ＲＹＭＶ Ｐ１およびＴＢＳＶ １９Ｋタンパク）。これらのウイルスは、上記ポチウイルスに密接に関連するものではない。ＡＣＭＶはＤＮＡジェミニウイルスである（２６、２７）。ＲＹＭＶは、ソベモウイルスであり、ＴＢＳＶはトンブスウイルスである。
【００２３】
興味深いことに、遺伝子サイレンシングのウイルス性サプレッサーは、極めて多様であり、これらのタンパクに共通の構造的特徴は同定されていない。かくして、サプレッサー機能は、ＲＭＤの効果をうち消す戦略として、独立に数回進化してきたと思われる。
【００２４】
本発明の特定の態様を、より詳細に記載する。
【００２５】
定義
用語“異種(heterologous)”は、遺伝子工学を用いて、すなわち人的介入により、問題のヌクレオチドの遺伝子／配列が、問題の細胞（例えば、植物またはその先祖）内に導入されたことを示すために以下において広く用いられる。異種遺伝子は、内因性の等価の遺伝子、すなわち、通常は同じまたは類似の機能を行うものを置換しうる。または、挿入された配列は、内因性遺伝子または他の配列に付加されうる。細胞に対して異種の核酸は、そのタイプ、種類、または種の細胞には通常生じないものであってもよい。かくして、異種核酸は、異なるタイプ、種、種類の植物の植物細胞内で配置される、特定のタイプの植物細胞、種または種類の植物のコード配列または誘導配列を含みうる。さらなる可能性は、核酸配列が、それまたはホモローグが自然に見出される細胞内に配置されることであるが、しかしここで、前記核酸配列は、細胞内に通常存在しない核酸に結合および／または隣接され、例えば、発現をコントロールするための、プロモーター配列のような一以上の調節配列に機能的に結合されている。
【００２６】
“遺伝子(gene)”は、他に必要としない限り、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクに翻訳される遺伝情報をコードするあらゆる核酸を指す。
【００２７】
“ベクター(vector)”は、とりわけ、あらゆるプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたはアグロバクテリウムバイナリーベクターを含むと定義され、これは、二本鎖または一本鎖の線形または環状形態であり、伝染性または可動性であってもなくてもよく、細胞ゲノムへの組み込みまたは染色体外に存在することにより原核性または真核性宿主をトランスフォームすることができるものである（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）。特に含まれるものは、シャトルベクターであり、これは、自然にまたは計画的に、放線菌および関連種、細菌および真核生物（例えば、高等植物、哺乳動物、酵母または真菌細胞）から選択される、二つの異なる宿主生物で複製可能なＤＮＡビークルを意味する。本発明に係るベクターは、特に、そのベクターが、ゲノムへの組み込みのために細胞に核酸を導入するために用いられる場合、プロモーターまたは他の調節配列を含む必要はない。
【００２８】
“発現ベクター(Expression vector)”は、核酸が、微生物または植物細胞のような宿主細胞における転写のための適切なプロモーターまたはその他の調節エレメントの調節下にあり、これらに機能的に結合しているベクターを指す。このベクターは、多様な宿主において機能する二機能性(bifunctional)発現ベクターであってもよい。ゲノムまたはサブゲノムＤＮＡの場合には、これは、それ自身のプロモーターまたは他の調節エレメントを含み、ｃＤＮＡの場合には、これは、宿主細胞での発現に適したプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下であってもよい。
【００２９】
“プロモーター(promoter)”は、下流（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖の３’方向）に機能的に結合したＤＮＡの転写がそこから開始されるヌクレオチド配列である。
【００３０】
“機能的に結合(operably linked)”は、同一の核酸分子の一部として連結され、プロモーターから開始される転写に関して適切に配置および配向されていることを意味する。
【００３１】
プロモーターに用いられる用語“誘導性(inducible)”は、当業者によく理解されている。本質においては、誘導性プロモーターの調節下の発現は、与えられた刺激に反応して“スイッチがオンされる”または増大する。刺激の性質は、プロモーターによって異なる。一部の誘導プロモーターは、適切な刺激がない場合には、ほとんど発現を引き起こさないか、検出不可能なレベルの発現を引き起こす（あるいは全く発現しない）。別の誘導可能なプロモーターは、刺激の不在下で、検出可能な構成的発現を引き起こす。刺激の不在下での発現レベルがどうであれ、あらゆる誘導プロモーターからの発現は、正確な刺激の存在下で増大する。
【００３２】
サプレッサーの使用
本発明の第一の態様では、ＰＶＸ；ＴＭＶ；ＴＢＳＶ；ＲＹＭＶ；ＡＣＭＶ；ＮＭＶ；ＮＶＸ；ＶＭＶおよびＣＰＭＶから選択されるウイルスから得られる遺伝子サイレンシングサプレッサータンパクの使用が開示されている。
【００３３】
本願明細書における用語“抑制(suppress)”は、ＰＴＧＳが完全に打ち消される必要性を含まない。抑制は、例えば局部的（例えば、葉脈内およびその周りに制限）、時期的（例えば、目下のサイレンシングよりむしろＰＴＧＳの開始の阻害）、または強度的（すなわち、ＰＴＧＳが低いレベルで続く）な意味で、部分的であってもよい。この用語は、当業者がこれについてよく理解しているので、都合よく用いる。
【００３４】
抑制は、ＰＴＧＳの全身性シグナルに関するものであってもよい。すなわち、ＰＴＧＳの拡散が阻害されうる。これは、ｐ２５またはそのバリアントを用いて実施してもよい。
【００３５】
好ましくは、サプレッサーは、ＡＣＭＶ ＡＣ２タンパク；ＰＶＸ ｐ２５タンパク；ＲＹＭＶ Ｐ１タンパク；またはＴＢＳＶ １９Ｋタンパク、あるいはこれらのバリアントから選択される。好ましくは、１９Ｋまたはｐ２５タンパク、またはこれらのバリアントである。最も好ましくは、１９Ｋタンパク、またはそのバリアントである。
【００３６】
特にＰ１タンパクは、単子葉および双子葉植物の両方で機能することが見出されている。これは、Ｐ１は単子葉類（例えば、小麦、イネ、および大麦）にのみ影響するウイルスに関連することから、驚くべきことである。このＰ１の多能性は、それ自身を、広範囲の種々の植物タイプにおいて発現を増強するのに特に適したものとする。
【００３７】
ｐ２５、ＡＣ２；Ｐ１、および１９Ｋタンパクの配列は以下に記載されている。
ｐ２５配列は、Huismanら(1988)J Gen Virol, Vol.69 pp1789-1798に記載されている。
ＡＣ２配列は、Stanley J(1983) Nature, vol.361 No.5897 pp260-262に記載されている。
Ｐ１配列は、Bonneau Cら(1998) Virology 244, pp 79-86に記載されている。
１９Ｋ配列は、Scholtoft Hら(1995) Plant Cell 7, pp1157-1172に記載されている。
これらの配列の全てを、参照としてここに特に含める。
【００３８】
サプレッサーが、ここで例えば核酸構築物内で用いられる場合、この構築物は、自然においてこのサプレッサーと結合したタンパク（例えば、サプレッサーがウイルスから誘導された場合には、ウイルスタンパク）または他の配列を含まないまたは実質的に含まない。
【００３９】
また本発明は、これらの配列のいずれかのバリアントの使用をも含む。バリアントタンパクは、上記配列の全てまたは一部と相同または同一であり、ＰＴＧＳを抑制することができ、その活性はここに記載される方法その他を用いて確認できる。係る方法は、天然または参照タンパクのＰＴＧＳ抑制効果を、バリアントの効果および対照（例えば、実施例に記載される“ｍ”対照）の効果と比較する工程を含む。
【００４０】
一般的に、ここで用いられる場合、バリアントは以下とすることができる：
（i）関連するサプレッサーの天然に生じる相同バリアント、例えば、上記で用いられるものとは異なるウイルス株から得られるものまたは単離物、あるいは、関連するウイルスから将来的に単離されうるもの。植物または動物のサプレッサーに関して用いる場合、同様に、アレル、パラログ（paralogue）、オーソログ（orthologue）等を含む。
（ii）例えば部位またはランダム突然変異誘発、または直接合成により、本願明細書の開示に基づいて当業者によって調製されうる人工的に作製されたホモローグバリアント（誘導体）。好ましくは、バリアントポリペプチドをコードするバリアント核酸は、直接的または間接的に（例えば、一以上の増幅または複製工程を経て）、上記の内の一つのサプレッサーをコードするオリジナルの核酸から生成される。核酸配列の変化は、核酸の一以上のヌクレオチドの一以上の付加、挿入、欠失または置換により誘導体を生じ、コードされたポリペプチドにおいて一以上のアミノ酸の付加、挿入、欠失または置換を引き起こす。所望の変異は、コードされたポリペプチドの安定性または活性（例えば、特異性）を変更するために、ランダムまたは部位突然変異誘発であってもよい。変化は、保存的変動、すなわちイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような一つの疎水性残基を他のものに置換するか、あるいは、極性残基を別のものに置換する、例えばアルギニンをリシン、グルタミン酸をアスパラギン酸、またはグルタミンをアスパラギンに置換するものであってもよい。また、非保存的置換を有するバリアントも含まれる。ペプチドのコンホメーションまたは活性を決定するのに重要な領域では、係る変化は、変更された安定性または特異性といった、ポリペプチドに有利な特性を付与しうる。ＰＴＧＳ抑制活性を維持するサプレッサーのフラグメントは、特に含まれる。
【００４１】
バリアントの場合の類似性または相同性は、好ましくは、FASTAおよびFASTPを用いて成された配列比較を介して確立される（Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63-98参照）。パラメーターは、好ましくは、以下のようにデフォルトマトリックスを用いてセットされる。
Gapopen (ギャップの最初の残基のペナルティー)：タンパクにつき−１２／ＤＮＡにつき−１６
Gapext（ギャップのさらなる残基のペナルティー）：タンパクにつき−２／ＤＮＡにつき−４
KTUPワード長：タンパクにつき２／ＤＮＡにつき６。
【００４２】
相同性は、ヌクレオチド配列および／またはコードされるアミノ酸配列のレベルとすることができる。好ましくは、核酸および／またはアミノ酸配列は、少なくとも約７５％、または８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【００４３】
相同性は、プローブ法の使用により評価することもできる（Sambrookら, 1989）。特定の配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要な厳密な条件を計算するためのある一般的な式は、Ｔ_m＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ[Ｎａ＋]＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／＃ｂｐ二本鎖。上記式の例として、［Ｎａ＋］＝[０．３６８]および５０−％ホルムアミド、ＧＣ含量４２％、および平均プローブサイズ２００ベースを用いて、Ｔ_mは５７℃である。ＤＮＡ二本鎖のＴ_mは、相同性が１％減る毎に１−１．５℃づつ低減する。かくして、約７５％より大きい配列同一性を有するターゲットは、４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いて観察される。
【００４４】
かくして、本発明の係る態様は、ｐ２５、ＡＣ２、Ｐ１または１９Ｋタンパク、あるいはこれらのいずれかのホモローグまたは誘導体の使用を特に含む。
【００４５】
一般的に、以下により詳細に記載するように、サプレッサーは、先祖ウイルスからの感染により、または適切な核酸構築物からの発現により（例えば、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ等に基づいて）、本発明の方法において用いられる。ＤＮＡ配列が特定されると、他に必要としなければ、ＴがＵに置換されているＲＮＡ等価物の使用が含まれる。本発明に係るサプレッサーをコードする核酸は、元のウイルス株の他のヌクレオチド配列を含む核酸を含まないかまたは実質的に含まない、単離されたおよび／または精製された形態で利用されてもよい。用いられる核酸分子は、全体的または部分的に合成されてもよい。特に、自然において共に見出されない（連続的につながっていない）核酸配列がリゲートまたは他の人工的に結合された組み換え体であってもよい。例えば、サプレッサーと発現が望まれる異種配列とである。
【００４６】
植物における使用
以下に記載するように、その種々の態様において、本発明は、本発明者らにより最初に同定されたサプレッサーをコードする核酸を用いて、またある場合には従来技術のものを用いて、一般に植物において用いられる。
【００４７】
植物に対して、以前から広く首尾よく用いられている特定の方法およびベクターは、GuerineauとMullineaux(1993)(Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp121-148）に記載されている。適切なベクターは、植物ウイルス誘導ベクターを含んでもよい（例えばEP-A-194809参照）。
【００４８】
植物で機能する適切なプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（CaMV 35S）を含む。別の例は、Lindsey & Jones (1989) "Plant Biotechnology in Agriculture" Pub.OU Press, Milton Keynes, UKのｐｇ１２０に開示されている。プロモーターは、発現の発達性および／または組織特異的制御調節を与える一以上の配列モチーフまたはエレメントを含むように選択されてもよい。誘導可能な植物プロモーターは、Caddickら(1998) Nature Biotechnology 16:177-180のエタノール誘導プロモーターを含む。
【００４９】
所望であれば、選択可能な遺伝子マーカーを構築物に含めてもよい。例えば、抗生物質または除草剤（例えば、カナマイシン、ヒグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキサート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダノリノン、およびグリホサート）に耐性であるといった選択可能な表現型を付与するものである。
【００５０】
また本発明は、適切なサプレッサーと異種配列とを含む上記構築物を、植物細胞に導入すること、および／または、有効な外因性の誘導物質のような適切な刺激を適用することにより、植物細胞内で構築物の発現を誘導することを含む方法を提供する。
【００５１】
核酸は、例えば、その自然な遺伝子輸送能を利用して、アグロバクテリウムが有する無力化したＴｉ-プラスミドベクター（EP-A-270355、EP-A-0116718、NAR12(22)8711-87215 1984）、粒子または微量発射ボンバードメント(Microprojectile bombardment)（US 5100792、EP-A-444882、EP-A-434616）、マイクロインジェクション（WO92/09696、WO94/00583、EP331083、EP175966、Greenら(1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press）、エレクトロポレーション（EP290395、WO8706614 Gelvin Debeyser）、直接的ＤＮＡ取り込みの他の形態（DE4005152、WO9012096、US4684611）、リポソーム媒介ＤＮＡ取り込み（例えば、Freemanら Plant Cell Physiol.29:1353(1984)）、あるいはボルテックス法（例えば、Kindle, PNAS U.S.A.87:1228(1990d)）のような、適切なあらゆる技術を用いて植物細胞に導入することができる。植物細胞の形質転換の物理的方法は、Oard, 1991, Biotech.Adv.9:1-11に概説されている。
【００５２】
Ｔｉ-プラスミド、特にバイナリーベクターについては、以下においてより詳細に記載する。
【００５３】
アグロバクテリウム形質転換は、双子葉種を形質転換するために当業者により広く用いられている。しかしながら、殆ど全ての経済的に関連する単子葉植物において、安定で豊富なトランスジェニック植物の機械的生産にも大いに成功している（例えば、Hieiら(1994) The Plant Journal 6, 271-282参照）。微量発射ボンバードメント、エレクトロポレーション、および直接的ＤＮＡ取り込みは、アグロバクテリウムのみでは不十分または効果的でない場合に好ましい。あるいは、種々の技術の組合せを用いて、トランスフォーメーションプロセスの効率を増加してもよい。例えば、アグロバクテリウム被覆微小粒子を用いたボンバードメント（EP-A-486234）または微量発射ボンバードメントで傷を誘導して、その後にアグロバクテリウムと共培養する（EP-A-486233）。
【００５４】
形質転換技術の特定の選択は、ある植物種を形質転換する効率、および本発明を実施する人の経験と好みによって決定される。当業者には、核酸を植物細胞に誘導する形質転換システムの特定の選択、あるいは植物再生の技術の選択が、本発明に必須でなく、制限とならないことは明らかであろう。
【００５５】
かくして、本発明の種々の態様が、植物組織（例えば植物細胞）に以下に記載するサプレッサーをベースとする構築物を導入することを含み、ベクターと植物細胞ゲノムとの間の組み換えを引き起こしまたは可能にして、ゲノムに本発明にかかる核酸を誘導する、植物細胞の形質転換方法を提供する。
【００５６】
これは、一過的発現を行うために実施することができる。あるいは、植物組織の形質転換後、例えば、当該技術分野で通常行われるように、単一の細胞、カルス組織、またはリーフディスクから植物を再生してもよい。ほとんどあらゆる植物が、植物の細胞、組織および器官から完全に再生される。利用可能な技術は、Vasilら, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vel I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, and Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989に概説されている。
【００５７】
トランスジェニック植物の再生は、穀物であるイネ、トウモロコシ、小麦、オート麦、および大麦で達成されている（Shimamoto, K.(1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162.; Vasilら(1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vainら,1995,Biotechnology Advances 13(4):653-671; Vasil,1996,Nature Biotechnology 14 702頁）。
【００５８】
再生された植物またはその一部は、クローン、種子、自殖または交雑の子孫および後代（例えば、Ｆ１およびＦ２子孫）、カッティング（例えば、食用部）などを与えるために用いられる。
【００５９】
哺乳動物における使用
サプレッサーは、遺伝子治療に用いられるウイルス性ベクターまたは他のベクターの活性を増強するために用いることができる（マウス胚におけるＲＮＡ干渉の証拠、Wianny Fら(2000) Nature Cell Biology 2 pp70-75）。係るベクターは、当業者に公知のあらゆる適切なベクターに基づくものとすることができる。例えば、欧州特許出願第909052736.3(VICAL)の開示内容を参照。公知のウイルスベクターは、ＨＳＶ、ワクシニアまたはアデノウイルスを含む（Principles of Gene Manipulation (1994) 5th Edit. Old and Primrose 5th Edition, Blackwell Scientific Publications）。遺伝子治療に用いるためのウイルスベクターは、Vile(1997) Nature Biotechnology 15: 840-841にも記載されている。非ウイルス性遺伝子治療方法は、Sebestyenら(1998) Nature Biotechnology 16:80-85に記載されている。
【００６０】
種々の遺伝子治療輸送システムの使用（ＨＳＶ ＶＰ２２を含む）が、Fernandez & Baylay (1998) Nature Biotechnology 16:418-420およびその参考文献に記載されている。
【００６１】
好ましい形態では、サプレッサーは、核酸トランスフェクションまたはリポフェクションの方法と関連して用いられる（例えば、Wiggler Mら 1977 Cell 11, 223-232; Ruyssaert J M,ら 1994 Biochem Biophys Res Comm 203,1622-1628; Biochem Biophys Res Comm 236.126-129を参照）。
【００６２】
種々のＰＴＧＳの状況
本発明は、正確なＰＴＧＳ起源に関わりなく、ＰＴＧＳを抑制することが望まれるあらゆる状況に適用される。上述したように、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、細胞性およびウイルス性ｍＲＮＡの両方を標的とすることができるヌクレオチド配列特異的防御メカニズムである。ＰＴＧＳは、外来性（異種）または内因性のＤＮＡで安定または一過的に形質転換された植物および菌において生じ、導入された核酸に対して配列同一性を有するＲＮＡ分子の蓄積低減をもたらす（Vaucheretら, Plant J.16,651-659 (1998); C.CogoniおよびG.Macino, Trends Plant Sci. 2, 438-443(1997)）。
【００６３】
特異的ＰＴＧＳは、例えば、さらなるコピーの遺伝子の使用による内因性遺伝子のサイレンシング（共同抑制−例えば、van der Krolら,(1990) The Plant Cell 2, 291-299; Napoliら(1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhangら(1992) The Plant Cell 4, 1575-1588,およびUS-A-5,231,020を参照）；相同遺伝子の挿入による内因性遺伝子のサイレンシング；細胞質で複製可能な構築物の使用から得られるサイレンシング（WO95/34668(Biosource); Angell & Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16,12:3675-3684）；相同核酸の細胞質における一過的存在から生じるトランスジーンまたは内因性遺伝子の全身性サイレンシング（およびVoinnet & Baulcombe (1997) Nature 389:pg553）、トランスジーンの“自己サイレンシング”；ウイルス誘導ＲＭＤ；トランスジーン介在ホモロジー依存性ウイルス耐性等を含む。
【００６４】
ＰＴＧＳに関連する短いＲＮＡ種（約２５ｎｔ、より好ましくは約２１−２３ｎｔのＲＮＡ）を観察することにより、または、ｍＲＮＡおよび／または発現されたタンパクを観察（ノーザンまたはウェスタンブロット）することにより、ＰＴＧＳの存在および深刻度を評価することができる。
【００６５】
発現の強化
好ましい実施態様では、サプレッサーは、細胞、特に植物細胞における、異種または内因性核酸の発現、特に翻訳レベルを強化するために用いられる。発現は、例えば、少なくとも約２５−５０％、好ましくは約５０−１００％、またはそれ以上増強される。ＰＴＧＳが特に深刻である好ましい実施態様では、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または５０倍の発現増強が達成されうる。
【００６６】
かくして、本発明は、上記本発明に係るサプレッサーを用いて、ＰＴＧＳを抑制し、かつ、細胞内で（異種または内因性のポリペプチドを生成するために）異種または内因性の核酸の発現を増強する方法を提供する。
【００６７】
当業者であれば、ここに記載された情報を用いて、そして実施例に記載されている一過的アッセイを用いて、ＰＴＧＳ経路における種々のサプレッサーのいずれが相乗的に作用し得るかを評価することができる。ここに記載したサプレッサーのさらなる使用は、それらと相互作用する細胞性ファクターの分析のためであり、これらは、通常の突然変異誘発では解明できないＰＴＧＳの成分の同定を可能にする。
【００６８】
増強する遺伝子の選択
関心の向けられた遺伝子は、農学的特性、昆虫耐性、疾患耐性、除草剤耐性、不稔性、穀物特性などをコードするものを含む。この遺伝子は、油、デンプン、炭水化物、栄養などの代謝に関連するものであってもよい。興味の遺伝子または特性は、これらに限定されるわけではないが、環境またはストレスに関連した特性、疾患に関連した特性、および農学的性能に影響する特性を含む。ターゲット配列は、タンパク、ペプチド、脂肪酸、脂質、ロウ、油、デンプン、糖、炭水化物、香味、臭い、毒素、カロテノイド、ホルモン、ポリマー、フラボノイド、貯蔵タンパク、石炭酸、アルカロイド、リグニン、タンニン、セルロース、グリコプロテイン、グリコリピド等の合成に重要な遺伝子を含む。
【００６９】
最も好ましくは、ターゲット化された単子葉類および／または双子葉類の内因性遺伝子は、ナタネ、ヒマワリ、ダイズおよびトウモロコシのような植物における油産生に重要な酵素；ジャガイモ、トウモロコシ、穀類のような植物におけるデンプン合成に関連する酵素；薬学的または獣医学的産物のような天然医薬を合成する酵素またはそれ自身であるタンパクをコードするものを含む。
【００７０】
異種核酸は、とりわけ、細菌、真菌、植物または動物由来の遺伝子をコードすることができる。ポリペプチドは、in plantaで用いられてもよく（例えば、害虫感受性、活力、組織分化、多産性、栄養価などに関して植物の特徴を変更するため）、また、植物はポリペプチドを産生するための媒介手段であってもよく、他で使用するためにそこから精製されてもよい。係るタンパクは、以下に限定されるものではないが、網膜芽腫タンパク、ｐ５３、アンギオスタチン、およびレプチンを含む。同様に、本発明の方法は、哺乳動物の調節タンパクを産生するために用いることができる。他の興味のある配列は、タンパク、ホルモン、成長因子、サイトカイン、血清アルブミン、ヘモグロビン、コラーゲン等を含む。
【００７１】
ターゲット遺伝子の発現
一般的に、異種核酸は、当該技術分野で用いられるあらゆる適切なプロセスによって発現されてもよい。例えば、発現アンプリコン（以下に記載）に加えて、以下のように転写または発現されてもよい。
（i）例えば異種配列に機能的に結合したプロモーターを含む、“裸の(naked)”ＤＮＡの一過的発現。
（ii）発現ベクター、特に複製ベクターからの発現。一般に、当業者であれば、ベクターを構築し、かつ、組み換え遺伝子発現のプロトコールを設計することができる。プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニレーション配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の適切な配列を含む、適切な調節配列を含む適切なベクターを選択または構築することができる。さらに詳しくは、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrookら, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubelら. eds.,John Wiley & Sons, 1992を参照。ウイルス性発現ベクター（以下参照）は、特に好ましい。
（iii）少なくとも一過的に細胞質に存在する組み込みベクター（例えば、バイナリーベクター）からの発現。
（iv）生物、特に植物のゲノムに安定に取り込まれたトランスジーンからの発現。
【００７２】
例えば、組み込みベクターは発現ベクター等であってもよいので、これらのカテゴリーは相互に排他的でないことが理解できよう。
【００７３】
係る発現を達成する方法は、他の箇所に記載されている。
【００７４】
サプレッサーの使用形式
一般的に、サプレッサーは、以下の形式で異種または内因性核酸の発現を増強するために用いることができる。
（i）サプレッサーをコードする先祖ウイルスからの感染によるサプレッサーの発現、
（ii）組み換え発現ベクター、特に複製ベクターからの発現、
（iii）生物に導入される組み込みベクター（例えばバイナリーベクター）からの発現、
（iv）生物、特に植物のゲノムに安定に取り込まれたトランスジーンからの発現（例えば、トランスジェニック植物において構成的(constitutively)に発現される）。
【００７５】
ウイルスベクターおよび祖先ウイルスに関して、サプレッサーは、その先祖ウイルスが自然に感染するまたは自然に感染しない植物においてＰＴＧＳを抑制するために用いられる。
【００７６】
あるいは、“天然の宿主(natural hosts)”でない植物または他の生物において用いられてもよい。
【００７７】
一部のウイルスにより発現されるサプレッサーは、以下の実施例の一部で用いられるＰＶＸをベースとする発現ベクターのように、特に効率的であることが見出された。他のウイルス性ベクターは、米国特許第5316931号および5589367号（Donsenら）；タカマツら(1990) FEBS Lett 269:73-76; ハマモト(1993) Bio/Technology 11: 930-932; Kumagagら(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:427-430に記載されている。
【００７８】
サプレッサーの発現は、（適切な）いずれの場合も、異種または内因性核酸の発現の前、同時、または後とすることができる。ただし、いずれの場合も、サプレッサーはＰＴＧＳを抑制することによって発現を増強する効果を有し、さもなければＰＴＧＳは、サプレッサーの不在下で高レベルで生じる。用語“共に(in conjunction)”は、これらの可能性の全てをカバーする。
【００７９】
サプレッサーの多重(multiple)コピーを用いることができる。少なくとも一つは本発明のサプレッサーであるという条件で、種々のサプレッサーを、共に用いることができる（例えば、タンデムで）。
【００８０】
サプレッサーは、その活性が調節されるように、誘導性プロモーターに機能的に結合されてもよい。
【００８１】
増強された発現のための好ましい形式および組合せ
Ｐ２５およびウイルス感受性
以下の例に記載するように、一部のサプレッサー（例えば、ＰＶＸ ｐ２５）は、ＰＴＧＳ経路の一態様に特異的に機能しうる。これは、複製ウイルスベース構築物からの遺伝子発現（これは別の経路でＰＴＧＳを開始し得る）よりも、組み込まれた、任意に安定なトランスジーンの発現を増強するのにより適しているかもしれないことを意味する。本願の開示に基づいて、当業者は、必要に応じて適切な形式で適切なサプレッサーを用いることができるであろう。
【００８２】
かくして、本発明の好ましい態様では、植物のゲノムに取り込まれた異種または内因性核酸の発現（特に翻訳）を特異的に増強するためのｐ２５（またはこのバリアント）の使用を開示する。ここでは、前記植物における局所的なウイルス誘導遺伝子サイレンシングは、この増強によって実質的に影響を受けない（ウイルス耐性は、サイレンシングの抑制により同等に低減されない）。
【００８３】
植物におけるウイルス誘導遺伝子サイレンシングおよび／またはウイルス耐性に対する増強の効果は、ｐ２５が存在しないコントロールの植物（または植物群）と比較することにより、当業者が容易に確かめることができる。接種後のウイルス感染の深刻さを、例えば以下の実施例に記載されている方法に類似した通常の方法で評価または評点することができる。本発明のこの態様では、植物におけるウイルス反応の一部の減損が、植物におけるあらゆる全身性サイレンシングシグナルの阻害の結果として生じうることが期待される。しかしながら、全ての効果は、サプレッサーが局部的および全身的サイレンシングの両方の抑制を引き起こす場合と比べて、深刻ではないかもしれない。
【００８４】
アンプリコン
本発明のサプレッサーと、サイレンシングシステム（Plant Bioscience LimitedのWO99/15682に記載されているもの）またはより好ましくは“アンプリコン(amplicon)”システム（Plant Bioscience LimitedのWO98/36083に記載されているもの）との組合せは、ＰＴＧＳの不在下であっても、通常の（非複製）トランスジーンから達成されるよりも高い、非常に高レベルの発現を生じるために用いられてもよい。
【００８５】
WO98/36083に記載されている“アンプリコン”は、ウイルスレプリカーゼに機能的に結合するプロモーター、または、ＲＮＡ分子の植物細胞における転写のためにＤＮＡに機能的に結合するプロモーター配列を含み、これは、ＲＮＡ分子に、転写後に植物細胞の細胞質において複製できる能力を付与する植物ウイルス配列を含む。転写複製物は、ウイルスＲＮＡに似ており、関心の遺伝子（“ターゲット遺伝子(target gene)”）に対応するターゲッティング配列を含む。ウイルスＲＮＡの別の配列は、最小アンプリコンを与えるために省略されてもよい。
【００８６】
これらは、トランスフォーメーションおよび／または交雑(crossing)により、同一の植物のゲノムに安定なトランスジーンとして導入されてもよい。あるいは、これらは、一過的発現のためにアグロ浸透(agroinfiltration)により導入されてもよい。
【００８７】
かくして、アンプリコンは、プロモーター、ウイルスゲノムの少なくとも一部のｃＤＮＡ、および、発現を妨げるのに十分な配列類似性、例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、および１００％までの配列同一性を有する、ターゲット配列またはその相補鎖に対応する配列を含むトランスジーンＤＮＡ構築物を含んでもよい。
【００８８】
本発明では、ターゲット配列は、内因性または異種配列とすることができ、アンプリコンはアンプリコン構築物の一部であってもなくてもよいエンハンサーと共に（上記）用いられる。それゆえ、異種または内因性核酸の発現増幅のためのアンプリコンの使用は、本発明の一つの実施態様を形成する。
【００８９】
かくして、適切に、サプレッサーおよび異種核酸は、例えば、適切なクローニング部位に（一般に全長の）異種核酸が挿入されているアンプリコン構築物のように、同一の構築物にコードされてもよい。
【００９０】
あるいは、好ましくは、これらが、互いと共に用いられる異なる構築物上に存在してもよい。例えば、アンプリコンは、上記サプレッサーをコードするバイナリーベクターと共に共同浸透(con-infiltrated)されてもよい。
【００９１】
ある状況（例えば、ターゲット遺伝子が発現アンプリコンから発現される場合、上記参照）では、サプレッサーは、複製ウィルス型構築物のＰＴＧＳを妨げるものが選択されることが好ましい。このような状況では、ｐ２５はあまり好ましくない。ｐ２５が用いられる場合、ＰＴＧＳを受ける見込みを最小にするため、細胞質で複製される構築物からそれ自身が発現されないことが望ましい。
【００９２】
バイナリーベクターからの増強された一過的発現
上述したように、本発明者等は、ＰＴＧＳのサプレッサーが、生物の細胞に（好ましくは高レベルで）導入された構築物からの発現を特に有利に増強するために用いることができることを見出した。この構築物は、ゲノムに組み込まれて、または組み込まれずに存在することができるが（例えば異所的(ectopically)）、いずれの場合も、転写されたｍＲＮＡを生じさせることができる。特定のメカニズムに縛られることを望まないが、サプレッサーは、このようにして産生されたｍＲＮＡの分解を阻害し、それによって非常に高いレベルでの蓄積を可能にし、相応して高レベルのタンパクを与えることができると思われる。構築物は、強力なプロモーターと共に、そして、構築物がゲノムに組み込まれた安定な形質転換体を選別する際に生じる本来的な緩和効果なしに、比較的高いコピー数で導入される（組み込まれた形態と組み込まれていない形態の両方）。結果的に、産生されたタンパクのレベルは、従来技術の方法の使用により得られるものをはるかに超え、タンパク（一般的にはその生物に対して異種）が宿主防御メカニズムのいずれかにより破壊される速度を一般に超える。サプレッサーの使用は、細胞に存在するターゲット核酸のコピーから産生されるｍＲＮＡのレベルおよび安定性を越えるように思われる。
【００９３】
かくして、本発明の一部の態様では、プロモーターに機能的に結合したターゲットヌクレオチド配列を含む一過的に導入された核酸構築物から転写により産生された、ターゲットタンパクをコードするｍＲＮＡの分解を阻害するためのＰＴＧＳサプレッサーの使用を開示する。ここで、前記構築物は、生物の細胞に導入される。
【００９４】
かくして、“導入された核酸(introduced nucleic acid)”は、
i）前記ＤＮＡ配列の安定なトランスジーン発現と通常関連するｍＲＮＡ産生のレベル、および／または
ii）（サプレッサーの不在下で）前記ＤＮＡ配列を含むバイナリーベクターを用いる一過的発現系と通常関連するｍＲＮＡのレベル
と比較して、サプレッサーＤＮＡをコードするＤＮＡと共に導入された場合に、対応するｍＲＮＡのレベルを上昇させることができる構築物の形態で提供されるＤＮＡ配列としてターゲットを含む。
【００９５】
好ましくは、細胞は、生きている生物の組織に存在する体細胞である。好ましくは、構築物は、生物の多数の細胞に同時に導入される。
【００９６】
本発明の一部の実施態様では、ここに記載されている使用および方法は、植物または動物である生物において、問題の種に適したサプレッサーを用いて、例えば、植物のRGF-CaMサプレッサー（これは、カルモジュリン関連タンパクであると考えられている）Anandalakshmi Rら(2000) Science 290 [5 October],142-144参照）を用いることができ、以下の記載は、これらに相応して適用すると考えられる。好ましくは、しかしながら、前記生物は植物であり、サプレッサーは、例えばウイルス起源の上記のものである。
【００９７】
かくして、本発明の好ましい態様では、植物においてターゲットヌクレオチド配列の発現増強を達成する方法を開示する。この方法は、植物物質に、ターゲットヌクレオチド配列を含む少なくとも第一の核酸配列と、上記本発明のサプレッサーをコードする少なくとも第二の核酸配列を一過的に導入する工程を含み、ここで前記第一および第二の核酸は、単一のバイナリーベクターに含まれるか、あるいは、第一および第二の核酸配列はそれぞれ第一バイナリーベクターおよび第二バイナリーベクターに含まれる。第一の核酸配列は、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を含んでもよい。第二の核酸配列は、二つ以上のサプレッサーをコードしてもよい。
【００９８】
当業者に周知であるように、バイナリーベクターシステムは、（ａ）植物細胞ゲノムへの所望のヌクレオチド配列の輸送を可能にする境界配列；（ｂ）(i)植物活性プロモーターが、(ii)適切なターゲット配列および／またはエンハンサーに機能的に結合した発現カセットを一般に含む、所望のヌクレオチド配列自身を含む。所望のヌクレオチド配列は、境界配列間に配置され、適切な条件下で植物ゲノムに挿入されうる。このバイナリーベクターシステムは、組み込みを実行する他の配列（A.tumafaciensから誘導）を一般に必要とする。一般に、これは、アグロバクテリウム介在性一過的トランスフォーメーションを用いる、いわゆる“アグロ浸透(agro-infiltration)”の使用により達成されうる。概して、この技術は、宿主細胞にそのＤＮＡの一部（“Ｔ-ＤＮＡ”）を輸送し、核ＤＮＡに組み込むというAgrobacterium tumafaciensの特性に基づいている。Ｔ-ＤＮＡは、約２１−２３ヌクレオチドの長さの左右の境界配列によって定義される。浸透は、例えば、注射（葉において）または真空（全体の植物）によって行われる。本発明では、境界配列は、一般的に所望のヌクレオチド配列（Ｔ-ＤＮＡ）の周りに含まれ、一以上のベクターがアグロ浸透により植物物質に導入される。それにも関わらず、たとえＴ-構築物が実際にゲノムに組み込まれないとしても、しかし、それにも関わらず（比較的高いコピー数で）存在するが、抑制効果が機能すると考えられる。好ましくは、バイナリー形質転換ベクターは、以下に記載するpBin19に基づいている（Materials and Methods参照; Frisch,D.A.,L.W.Harris-Hallerら(1995)."Complete Sequence of the binary vector Bin 19" Plant Molecular Biology 27:405-409参照）。
【００９９】
本発明の別の好ましい態様では、植物におけるターゲットヌクレオチド配列の発現増強を達成する方法を開示する。この方法は、植物物質に、ターゲットヌクレオチド配列を含み、かつ、上記本発明のサプレッサーをコードするバイナリーベクターである、少なくとも一つの核酸構築物を導入する工程を含む。このターゲット遺伝子は、植物物質に内因性のものまたはそれ以外であってもよい。
【０１００】
さらなる実施態様では、この方法は、ターゲットヌクレオチド配列を含むバイナリーベクターである第一核酸構築物を、サプレッサーをコードするバイナリーベクターである第二核酸構築物と共に用いる。これは、とりわけ、構築および操作が容易であるという点で有利である。
【０１０１】
好ましくは、この方法は、二種類のバイナリーベクターを植物（組織）に、例えば、アグロ浸透、注射または真空浸透により、共同導入する工程を用いる。
【０１０２】
一部の実施態様では、タンパクを生成する方法が提供される。この方法は、以下の工程：
（i）植物の組織に、ターゲットヌクレオチド配列を含む第一核酸および上記本発明の異種サプレッサーをコードする第二核酸を導入する工程であって、ここで第一および第二核酸は任意に単一のバイナリーベクター内に含まれる工程、
（ii）一定の期間にわたって、サプレッサーおよびターゲットタンパクの核酸からの発現を引き起こすまたは可能にする工程であって、ここでサプレッサーがターゲットタンパクをコードするｍＲＮＡの分解を阻害する工程、
（iii）少なくともターゲットタンパクが発現された組織を回収する工程、
（iv）任意に植物からターゲットタンパクを単離する工程
を含む。
【０１０３】
かくして、サプレッサーが、植物の葉の第一集団に接種されたトランスジーンから一過的に発現されて、前記葉の回収後に、第二またはそれ以上の集団の葉が、適切な一過的接種システムにおいてトランスジーンを用いて接種され、同一または異なる一過的サプレッサーを用いて植物において増殖されてもよい。
【０１０４】
結果的に、適切な葉の集団の回収後に、異なるサプレッサーおよび／または異なる所望のタンパクをコードする異なる核酸配列を用いることにより、同一の植物（トランスジェニックまたは非トランスジェニック）を用いて、その葉に所望のタンパクを連続的に産生させてもよい。さらに、本発明は、同一の植物の異なる葉の集団における、種々のサプレッサーおよび／または種々の所望のタンパクをコードする種々の核酸配列の使用も提供する。
【０１０５】
トランスジーンまたはターゲット遺伝子または他の配列は、植物物質にとって内因性のものであってもそれ以外であってもよい。
【０１０６】
単離は、完全に通常の手段によるものとすることができ、部分的または完全な精製を必要としてもそうでなくてもよい。あるいは、タンパクがin situで用いられてもよい。
【０１０７】
問題の植物物質または組織は、植物の全てまたは一部とすることができる（例えば、一枚の葉または数枚の葉）。これは、一般的に、“発達した”植物に存在する体細胞を含む（すなわち、再生のための小植物、胚形成組織または胚組織ではない）。
【０１０８】
前記期間は、組織が生存し続けるまでまたはそれ以上、あるいはそれがタンパクで満たされるまでのあらゆる期間とすることができ、一般には、約３から１０日、さらに好ましくは約４から７日の間とされる。
【０１０９】
当然、一以上のターゲット遺伝子および／またはサプレッサーが、そのまたは各構築物において用いられるが、いずれの場合も単一の配列が好ましい。多重バイナリーベクター（それぞれが一以上の配列、例えばサプレッサーを含む）が、一回の浸透で植物物質に高密度で導入されてもよい。これは、例えば酵素の、例えば多重サブユニットを産生するのに有益である。
【０１１０】
ある好ましい実施態様は、一時的に組織化された形式でタンパクの組合せの産生を可能にするために、細胞にｍＲＮＡが持続して存在させることを利用する。それによって、所定の順序で生物にタンパクを生成する方法が提供される。この方法は、以下の工程：
(i)植物の組織に、それぞれプロモーター（任意に誘導可能なプロモーター）に機能的に結合した少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列と、上記本発明に係る異種サプレッサーをコードする核酸とを含む二つ以上の核酸を導入する工程、
(ii)サプレッサーおよび第一ターゲットタンパクをコードする第一核酸の発現を引き起こすまたは可能にする工程、
(iii)次いで、さらなるターゲットタンパクをコードするさらなる核酸の発現を引き起こすまたは可能にする工程、
(iv)工程(iii)を任意に繰り返す工程、
(v)少なくとも、最終的なターゲットタンパクが発現された組織を回収する工程
を含む。
【０１１１】
タンパクの好ましい組合せは、タンパク（例えば酵素）が経路の初期のタンパクの産物である基質に作用する代謝または異化経路を形成するものである。あるいは、タンパクの一つが、それ自身他のタンパクの基質であってもよい。いずれの場合も、（ii）の第一ターゲットタンパクは、（iii）などの次なるターゲットタンパクの基質を生じると考えることができる。最終的に回収された組織は、それ自身、植物において直接発現されない複合産物を含むことができる。
【０１１２】
植物における安定なトランスジーンとしての上記経路の創造は極めて複雑で、おそらく多重トランスジェニック植物の交雑を必要とする。多数の活性を特定の順番で植物組織に付与する、上記サプレッサー増強構築物発現を用いることにより、これらの問題は避けられる。
【０１１３】
以下の実施例で示すように（特に実施例９）、このようにして導入されたターゲット配列／サプレッサーの一過的発現は、用いられた正確な方法および物質に依存して、一過的発現期間（一般的には数日間）にわたって非常に高レベルのターゲットポリペプチドを与えることができる。この方法を用いることにより、ｍＲＮＡレベルおよびポリペプチドレベルは、サプレッサーが存在しない場合よりも、より高レベル、かつより長い期間にわたって維持され得る。例えば、サプレッサーの不在下では、一過的に発現されたＧＦＰから生じた蛍光は、３から４dpiの間持続し、その後低減し、５−６dpiで徐々に検出不能になる。ここに記載する一以上のサプレッサーを用いることにより、これは１５dpiまで延びる。この結果は、発現の一過的性質が大きくＰＴＧＳによるものであることを示唆する。この効果は、ターゲット遺伝子のＰＴＧＳに関連する２１−２３ｎｔ ＲＮＡをモニタリングすることにより、あるいは、ｍＲＮＡおよび／または発現されたタンパクをモニタリング（ノーザンまたはウェスタンブロット）することにより確認された。
【０１１４】
これは、以前は不適切と考えられてきた多くの状況、例えば、不安定なターゲット配列の信頼できる発現などにおいて、一過的発現を有用なツールとする。
【０１１５】
この方法は、高レベルの発現が要求されるが、ウイルス構築物（植物“感染”に必要）または安定なトランスジェニック植物が望ましくない適用、例えば高速アッセイが重要である場合におて、あるいは、問題の配列が致死的表現型を付与する適用において、特に好ましい。
【０１１６】
上記構築物の組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１１７】
新規サプレッサーのアッセイ
上記方法を、新規サプレッサーを同定するために用いることができる。かくして、本発明の一つの態様では、遺伝子サイレンシングのサプレッサーを同定する方法を開示する。この方法は、植物物質に、レポーター分子をコードし、かつ、ＰＴＧＳの推定されるサプレッサーをコードするバイナリーベクターである少なくとも一つの核酸構築物を導入する工程を含む。好ましくは、この方法は、レポーター配列を含むバイナリーベクターである第一核酸構築物を、推定されるサプレッサーをコードするバイナリーベクターである第二核酸構築物と共に用いる。
【０１１８】
上述したように、ここに開示した結果に基づいて、サプレッサー活性は、より有力な、増強された、および持続されたレベルのレポーター遺伝子の発現をもたらすことが期待される。また、これは、直接的観察および／またはノーザンまたはウェスタンブロッティングにより確認することができる。
【０１１９】
推定されるサプレッサーは、例えば、植物、ウイルス、哺乳動物等のあらゆる起源から選択することができる。
【０１２０】
レポーターは、ＧＵＳ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ等の当該技術分野で一般に用いられる、マーカー遺伝子のような、検出可能なあらゆるタンパクとすることができる。好ましくは、レポーターは、ＧＦＰまたはルシフェラーゼのような非侵襲性のマーカーである。
【０１２１】
ここに記載する全ての参考文献を、本願開示を補うのに必要とされる限り、参考として完全にここに含める。
【０１２２】
本発明を、以下の非限定的な図面および実施例を参照してさらに記載する。本発明の別の実施態様は、これらに基づいて、当業者が考えられるであろう。
【０１２３】
表１は、“種々の植物ウイルスにより引き起こされるＧＦＰ ｍＲＮＡのＰＴＧＳの抑制”を示す。ＧＦＰ ｍＲＮＡのＰＴＧＳは、記載されているように（１７）、アグロバクテリウム浸透によりトランスジェニックN.benthamianaにおいて誘導された。全身的な感染後、遺伝子サイレンシングの抑制を、終始ＵＶ照射下で評価し、ＲＮＡゲルプロット分析により確認した。ウイルスが全身的に拡がる前に発生した古い葉、またはウイルス感染後に発生した新しい葉から、ＲＮＡサンプルを取り出した。試験した植物の全体数、並びに、葉における抑制の表現型（全組織または葉脈中心への影響）が示されている。ウイルスを、夏と冬に、二回の独立した実験で調べた。
【０１２４】
添付Iは、実施例１１で用いたＣＰＤＫの分配列を示す。
添付IIは、実施例１３で用いたＧＦＰ−ＲｄＲｐの配列を示す。
【０１２５】
【実施例】
一般的な物質と方法
植物物質、アグロバクテリウム浸透および移植方法
ＧＦＰトランスジーンを有するトランスジェニックN.benthamiana（系統１６ｃ(line 16c)）およびアグロバクテリウム浸透法は、以前に記載されている（Ref 12,-Voinnetら,1998）。共浸透のために、同じ量の両方のアグロバクテリウム培養物（ＯＤ₆₀₀＝１）を浸透の前に混合した。単独の浸透のために、３５Ｓ−２５ｋ構築物を含む培養物もＯＤ₆₀₀＝１まで希釈して、植物細胞への毒性を避けた。Ｒｘ座についてホモ接合のトランスジェニックN.benthamiana（Bendahmaneら,1999）と系統１６ｃとの間の交雑から、Ｒｘ−ＧＦＰ植物が得られた。移植は、Palauquiら,1997に従って行われた。
【０１２６】
実施例１−８のＰＴＧＳ抑制アッセイ
サイレンシング抑制の試験は、以前に記載された実験系（１２）に基づくものであった。この系は、紫外線（ＵＶ）照射の下で明るい緑色蛍光を示す高度に発現されたＧＦＰトランスジーンを有するトランスジェニックNicotiana benthamianaを含む。これらの植物における全身的サイレンシングは、記載されているように（１７）、Agrobacterium tumefaciensの株を用いたトランスジェニック種苗の下方の葉を浸透させることにより誘導された。浸透から２０日後まで、ＧＦＰのサイレンシングは、植物の全成長組織で強く、そして、結果的に、ＵＶ照射下で一様に赤く見えた。この段階で、植物の生長点にはＰＴＧＳが全くなく、サイレンシングは分裂組織の近くまたはその中に位置する非サイレンス化細胞において絶えず開始されることによって維持された（１７）。これらのサイレンス化された植物が、次いで、ある範囲の植物ウイルスに感染して、全身的な兆候が観察される場合の緑色蛍光の程度を、ＵＶ照射下で評価した。さらに、ノーザン分析を行って、感染した組織におけるＧＦＰ ｍＲＮＡのレベルを評価した。
【０１２７】
特に、系統１６ｃの種苗の葉を、報告されているように（１７）、機能的３５Ｓ-ＧＦＰカセットが挿入されたバイナリーＴｉプラスミドベクターを有するA.tumefaciensの株を用いて浸透させた。１５−２０日後、ＧＦＰのＰＴＧＳが全植物で達成されたときに、全身的な葉を野生型または組み換えウイルスを用いて接種した。この葉を、“接種した葉(inoculated leaf)”と称する。チャレンジ化ウイルスをサイレンス化された植物に拡散させ、二種類の葉を１４または２０DPIで回収した。“古い葉(old leaves)”は、ウイルスが全身に拡散する前に現れた感染した葉であり、一方、“新しい葉(new leaves)”は、ウイルスが全身に移動した後に発生した葉であった。
【０１２８】
実施例９のＰＴＧＳ抑制アッセイ
ＰＴＧＳのシグナリングの役割が全身的な抗ウイルス性防御であることを調べるために、ウイルスの移動がサイレンシングシグナルの輸送から分離されている移植実験を設計した。この実験は、高度に発現された緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）トランスジーンを有するNicotiana benthamianaの系統１６ｃを用いた。これらの植物は、紫外線（ＵＶ）照射の下では明るい緑色であるが、非形質転換（ＮＴ）植物は、クロロフィル蛍光発光のために赤い。
【０１２９】
トランスジーン誘導、ＧＦＰトランスジーンの全身性サイレンシングは、３５Ｓ−ＧＦＰ Ｔ-ＤＮＡ構築物（３５Ｓ−ＧＦＰ、図１）を有するAgrobacterium tumefaciensの株の局部的浸透により開始された。
【０１３０】
ＧＦＰトランスジーンのウイルス誘導ＰＴＧＳは、ＧＦＰレポーター遺伝子の５’端から４５０ヌクレオチドを有するＰＶＸベクター（ＰＶＸ−ＧＦ、図１）を用いて感染させることにより開始された。
【０１３１】
これらの実験の根茎は、５日前にＰＶＸ−ＧＦを接種させたＧＦＰトランスジェニック植物であった。これらの植物は、ＧＦＰのＰＴＧＳの早期サインを示した。接ぎ穂は、ＧＦＰトランスジーンと共に、ＰＶＸに対して強い耐性を付与するＲｘ遺伝子を有するものであった。Ｒｘの存在は、接ぎ穂においてＰＶＸ−ＧＦの複製を妨げたが、サイレンシングシグナルの全身的な輸送に対しては全く効果がない。
【０１３２】
野生型ウイルス
ＡＭＶ、ＦｏＭＶ、ＮＭＶ、ＮＶＸ、ＶＭＶおよびＴＢＳＶの単離物を、ＪＩＣコレクション（ＵＫ）から入手した。ＣＰＭＶは、George LomonosoffらJIC(UK)から入手した。ＡＣＭＶは、John StanleyらJIC(UK)から入手した。ＴＲＶ−ＰＰＫ２０は、John Bol (Leiden University, Netherlands)から入手した。他のウイルスおよび参考文献は以下の通りである：ＴＭＶ−Ｕ１（１８）、ＰＶＸ−ＵＫ３（１９）、ＰＶＹ^NおよびＣＭＶ（１２）、ＴＢＲＶ−Ｗ２２（８）およびＲＹＭＶ−Ｎ（２０）。
【０１３３】
組み換えウイルス
（i）Nigeria(２０)のイネ黄斑ウイルス単離物のＰ１タンパク配列を、以下の５’リン酸化プライマー；完全タンパク（Ｐ１）用にATG ACT CGG TTG GAA GTT C3'および翻訳できないタンパク（ｍＰ１）用にATC ACA CGG TTG TAA GGT TC3'を用いて増幅した。増幅に用いたリン酸化された下流プライマーは、CAT CCC GTG TCA GTC TGであった。この二つのＰＣＲフラグメントを、ＰＶＸベクター（ｐ２Ｃ２Ｓ）のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した（１９）。ＲＹＭＶ ＰＣＲフラグメントの配向を、ｐ２Ｃ２Ｓ多重クローニング部位の３’末端におけるベクター配列のアンチセンスプライマー（GTA GTT GAG GTA GTT GAC CC）、および上記センスＲＹＭＶ５’プライマーを用いて、コロニーＰＣＲにより確認した。
（ii）ＰＶＸ−ＡＣ２とＰＶＸ−ｍＡＣ２：参照（２１）。
（iii）ＰＶＸ−ＨＳ１４２とＰＶＸ−ＨＳ１６０：参照（２２）−ここでは、ＰＶＸ−１９ｋとＰＶＸ−ｍ１９ｋと称される。
【０１３４】
実施例９で用いられる種々のＰＶＸ−ＧＦＰ誘導体は、３５ＳプロモーターとＮｏｓターミネーターとの間に全長のＰＶＸベクターが挿入されたＰＵＣ１９をベースとするベクターであるｐＰＶＸ２０４をベースとする。ここでＰＶＸ−ＧＦＰと称される構築物は、ｐＢｉｎ-３５-ｍＧＦＰ５(Ruizら,1998)のｍＧＦＰ５を有するｐＰＶＸ２０４の誘導体である。ＰＶＸ−ＧＦは、ＰＶＸ−ＧＦＰから誘導された。完全なコートタンパクＯＲＦは、ＰＶＸ−ＧＦＰから、SalIおよびXhoIを用いた切断により除去され、次いでライゲーションされて、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰを得た。ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＴＧＢ−△ＣＰは、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰをAvrIIとEagIで切断することにより生成され、これは、レプリカーゼＯＲＦの３’端、全ＴＧＢ、およびＧＦＰ５ ＯＲＦの３’端を取り除いた。レプリカーゼとＧＦＰの機能を回復させるために、３ウェイライゲーションを、以下のようにＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰからＰＣＲ増幅し切断した二つのＤＮＡフラグメントを用いて行った。5'-GCACAGATTTTCCTAGGCACGTTATCと3'-GAAAGAAATTGGgccggctcttgaac（EagI部位に下線が付されている）を用いた増幅により、レプリカーゼＯＲＦの３’末端に対応するＤＮＡフラグメントを生じ、後にAvrIIとEagIで切断した；5'-cagaaaccggccgctagcGGGCCATTGCCG（EagI部位に下線が付されている）と3'-TGTACTGCTTGAGATTTACAGCTを用いた増幅により、ＧＦＰ５ ＯＲＦの５’末端に対応するＤＮＡフラグメントを生じ、後にEagIで切断した。ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ｒｅｐ−△ＣＰおよびＰＶＸ−△ｒｅｐ−ＧＦＰ−△ＴＧＢ−ＣＰは、それぞれBglIIを用いてＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰおよびＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＴＧＢ−△ＣＰを切断し、ライゲーションすることによって生成され、レプリカーゼＯＲＦに１７２９−ｎｔの欠失を生じた。個々のＴＧＢ変異体を、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰバックグラウンドに以前に特徴決定された変異を導入することによって生成した。ＰＶＸ−ＧＦＰ−１２ｋ−△ＣＰは、ApaI−BstBI切断したＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰにＰＶＸ−ＧＦＰ−１２Ｄ(Verchotら, 1998)のApaI−BstBI制限断片を挿入することにより作製した。ＰＶＸ−ＧＦＰ−△８ｋ−△ＣＰは、ｐＴＸＳ−８Ｋ−ＧＦＰ(Simon Santa Cruz, SCRI, Dundeeの好意により提供された)のApaI−BstBI制限フラグメントを、ApaI−BstBI切断ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰに挿入することによって生成した。ｐＴＸＳ−△８Ｋ−△ＧＦＰは、８ｋＤａのタンパクの開始コドンに変異（Ｍ→Ｔ）を有し、重複する１２ｋＤａのタンパクＯＲＦのコード容量を変更することなくインフレームストップコドンを導入する。ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰは、ｐＴＸＳ−ＧＦＰ−△Ａｐａ／Ａｐａから生成され、これは、ＰＶＸゲノムのヌクレオチド４５８８−４５９１の変異により挿入されたApaI部位と、４９５９位に自然に存在するApaI部位との間の２５ｋＤａ ＯＲＦに３５４ｎｔの欠失を有するものである。この欠失は、次いで、AvrII−BstBI切断ＰＶＸ−ＧＦＰにAvrII−BstBIフラグメントとして導入された。最後に、ＰＶＸ−ＧＦＰ−２５ｋＦＳ−△ＣＰ構築物は、ｐＴＸＳ−ＧＦＰ３Ａ（Simon Santa Cruz, SCRI, Dundeeの好意により提供された）のAvrII−BstBI制限フラグメントを、AvrII−BstBI切断ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰに挿入することにより生成した。ｐＴＸＳ−ＧＦＰ３Ａは、ＰＶＸゲノムのヌクレオチド４９４５においてApaI切断の３’オーバーハングの除去（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ）により４ｂｐの欠失を有する。この変異は、アミノ酸１５４において始まる２５ｋＤａ ＯＲＦにフレームシフトを引き起こし、アミノ酸１５９にインフレームストップコドンを導入し、切り詰められたタンパクを生じる（７３アミノ酸のＣ末端欠失）。内因性遺伝子のフラグメントを有する構築物（ＰＤＳおよびＲｂｃｓ）は、全て、上記ベクターの誘導体である。ＧＦＰ５の独特のＰｍｌＩブラント部位を、対応する挿入物をクローン化するために用いた（図面の説明を参照）。ここに記載した全ての構築物を配列決定により確認し、ｐＢｉｎ１９ベクタープラスミドのＴ−ＤＮＡにSacIフラグメントとして挿入した（Bevan, 1984）。３５Ｓ−２５ｋおよび３５Ｓ−２５ｋ−ＡＴＧ構築物は、ｐＪＩＴ６１（ＪＩＣ）の３５Ｓ発現カセットを含むpBin19に基づいている。２５ｋＤａの挿入物は、ＰＦＵポリメラーゼ（Promega）を用いて、ｐＰＶＸ２０４から増幅されたＰＣＲフラグメントであった。３５Ｓ−２５ｋ−ＡＴＧについては、出発コドンはフォワードプライマーにおいて省略されていた。両方の構築物を、配列決定により確認した。
【０１３５】
一般的な方法
感染性の組み換えＰＶＸ ＲＮＡを生じるin vitro転写反応と接種は、記載されているとおりである（１９）。ノーザン分析は、以前に記載されているとおりである（１３）。
【０１３６】
高および低分子量ＲＮＡのＲＮＡ単離およびノーザン分析は記載されているとおりである（Dalmayら,2000）。ＰＶＸ−ＧＦＰとＰＶＸ−ＧＦのウイルス性接種物は、以前に記載されている（Ruizら, 1998）。
【０１３７】
ＧＦＰの視覚的検出は記載されているとおりである（１２）。クローズアップは、蛍光モジュールに連結されたLEICA MZFLIII解剖実体顕微鏡を用いて得られた。ＧＦＰイメージングに用いたフィルターセットは、LeicaのＧＦＰ-プラス蛍光セットであった（励起480nm、二色ビームスプリッター、５０５ｎｍＬＰ、バリアフィルター５１０ｎｍＬＰ）。写真は、実体顕微鏡に連結されたLEICAMPS60装置を用いて得られた。
【０１３８】
実施例１−種々の植物ウイルスによる遺伝子サイレンシングの抑制
試験した一部のウイルスは、N.benthamianaにおいて遺伝子サイレンシングを抑制した。いくつかのウイルスでは、新たに発生した葉（ＮＬ）と同様に、ウイルスが拡散する前に発生した古い葉（ＯＬ）において抑制が生じた。これは、以前にＰＶＹについて記載されたサイレンシング抑制のパターンを思わせる（１２）。対照的に、トマトブッシー発育阻害ウイルス（ＴＢＳＶ）は、ＣＭＶについて以前に報告されているものと同様に（１２）、新たに発生した組織においてのみ遺伝子サイレンシングを抑制した。エノコログサモザイクウイルス（ＦｏＭＯ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）またはタバコブラックリングウイルス（ＴＢＲＶ）は、十分に感染性であるが、ＧＦＰサイレンシングには何の影響も与えなかったという点で、ＰＶＸに類似していた（しかしながら、以下の実施例９参照）。これらの結果に基づいて、ＰＴＧＳ抑制は、種々の植物ウイルスの特性であると思われる。しかしながら、抑制の空間的パターンと程度は、ウイルス間で大きく異なるので、種々のメカニズムが関与していると思われる。
【０１３９】
この結果は、遺伝子サイレンシングのウイルスがコードするサプレッサー（virus-encoded suppressor）が、異なる作用形式を有し、かつ、宿主遺伝子サイレンシング機構の異なる成分に対して向けられることを示唆する。感染した葉の全体にわたって一様に外来タンパクを発現することが示されているＰＶＸベクターから種々のサプレッサーが発現される場合に、同様のパターンが報告されていることから（１９）、これらの差異は、これらのウイルスの組織親和性を反映するものではないようである。よりもっともな説明は、サプレッサーの作用形式と、ターゲットとされる遺伝子サイレンシングメカニズムの成分とに連帯的に依存する。例えば、サプレッサーが、遺伝子サイレンシングのメンテナンスに必要な成分を分解できるのであれば、これは、新しい葉と古い葉の両方に影響するであろう。しかしながら、サプレッサーが、サイレンシングに必要な成分の活性化または合成をブロックするのであれば、抑制は、サイレンシングがウイルス性サプレッサーの存在下で確立される、新たに発生する葉に制限されるであろう。古い葉では、このような成分はサプレッサーの不在下で形成されているはずであるから、結果的に、ウイルスが植物に感染したときには影響を受けない。
【０１４０】
実施例２−ジェミニウイルスがコードするＡＣ２タンパクによるＰＴＧＳの抑制
組織を、１５DPIに解剖顕微鏡からＵＶ照射下で写真撮影した。赤い組織はＵＶ下でのクロロフィル蛍光に対応し、かくして、ＧＦＰの遺伝子サイレンシングの指標である。時に黄色く見える緑色蛍光組織は、ＧＦＰの発現によるものであり、かくして遺伝子サイレンシングの抑制を示す。表１に示すように、アフリカキャッサバモザイクジェミニウイルス（ＡＣＭＶ）の感染は、完全に発達した感染組織および新たに発達した感染組織の両方において、接種後約３週間で、ＧＦＰサイレンシングの抑制を誘導した。
【０１４１】
ノーザン分析を、ＡＣＭＶ、ＰＶＸ−ＡＣ２、ＰＶＸ−ｍＡＣ２またはＰＶＸに感染した、偽感染(mock infected)、非サイレンス化（ＮＳ）、またはサイレンス化（Ｓ）したN.benthamianaから２０DPIに抽出したＲＮＡに実施した。ＲＮＡサンプルは、接種した葉、ウイルスが全身的に拡がる前に発生した古い葉、または、ウイルスが感染した後に発生した新しい葉（ＮＬ）から得た。等量の各ＲＮＡサンプル（１０μｇ）を、プローブとして³²Ｐラベル化ＧＦＰ ｃＤＮＡを用いて、ＲＮＡゲルブロッティングによりアッセイした。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のエチジウムブロマイド染色は、サンプルの添加量が等しいことを示した。ノーザン分析は、ＧＦＰ ｍＲＮＡレベルが、両方のタイプの組織で高いこと、並びに、抑制が、より低い程度ではあるものの、接種した葉においても起こることを示した。それゆえ、これらの結果は、ＡＣＭＶゲノムにコードされるＰＴＧＳのサプレッサーと一致した。この推定されるサプレッサーを同定するために、ＡＣ２タンパクを発現するＰＶＸベクター（ＰＶＸ−ＡＣ２）が、野生型ＰＶＸよりもはるかに厳しい壊死的兆候を生じるという、ＡＣ２が宿主防御メカニズムを抑制することを示唆する、以前の知見を利用した。個々の配列を、ClaI-EcoRV-SalI多重クローニング部位（１９）を用いてP2C2S PVXベクターに挿入し、“ＰＶＸ−Ｘ”（例えばＰＶＸ−ＡＣ２）を得た。挿入物およびＰＶＸコートタンパクの発現は、二本鎖のコートタンパクプロモーターにより調節される。この研究で用いた全ての病原性決定因子のミュータントのバージョンは“ｍＸ”（例えば、ＰＶＸ−ｍＡＣ２）と称した。上記結果から、ＡＣ２はＲＭＤのサプレッサーであると思われた。
【０１４２】
この仮説の試験は、ＰＶＸ−ＡＣ２を用いてＧＦＰサイレンス化植物を感染させることであった。対照として、植物を、シングルポイントミューテーションがＡＣ２ ＯＲＦの早期ストップコドンを導入するＰＶＸ−ｍＡＣ２を用いて感染させた（２１）。接種から約２週間後に、報告されているように（２１）、ＰＶＸ−ＡＣ２感染植物は厳しい徴候を示した。ＵＶ照射下で、ウイルス接種前に発生した葉を含む感染組織の殆どが、緑色蛍光であり、ＧＦＰ ｍＲＮＡレベルは非サイレンス化ＧＦＰ植物と類似していた。対照的に、ＰＶＸ−ｍＡＣ２は、厳しい徴候を示さず、ＧＦＰサイレンシングを抑制しなかった。これらの結果から、ＡＣＭＶゲノムにコードされるＡＣ２タンパクがN.benthamianaにおけるＰＴＧＳの維持のサプレッサーであると結論付けた。
【０１４３】
実施例３−ＴＢＳＶの１９Ｋタンパクによるサイレンシングの葉脈特異的抑制
ＴＢＳＶに感染したN.benthamianaは、症状が完全に全身的である場合に、接種から約３週間後にＰＴＧＳの逆転を示した（表１）。再度、２０DPIにおいて解剖顕微鏡からＵＶ照射下で写真を撮影した。ＣＭＶ感染植物と同様に、緑色蛍光の回復は、新たに発生した感染した葉においてのみ生じた。しかしながら、このサイレンシングの抑制は、ＣＭＶを用いた場合よりも弱く、緑色蛍光は、ハンドヘルドランプからのＵＶ照射下ではかろうじて検出可能であるに過ぎなかった。また、ＣＭＶとは異なって、ＴＢＳＶは葉脈の内および周りにおいてＰＴＧＳを抑制するに過ぎなかった。ＧＦＰの葉脈特異的逆転は、分離した、新たに発生した葉を解剖顕微鏡下で観察した場合に、より明らかであった。
【０１４４】
ＲＮＡのノーザン解析を、ＰＶＸ−１９ＫまたはＰＶＸ−ｍ１９Ｋを用いて感染させたサイレンス化された（Ｓ）N.benthamianaから、２０DPIに抽出したサンプルに対して行った。ＲＮＡサンプルを、古い葉または新たに発生した葉から取り出した。等量のＲＮＡサンプル（１５μｇ）を、プローブとして³²Ｐラベル化ＧＦＰ ｃＤＮＡを用いてＲＮＡゲルブロッティングによりアッセイした。“偽(Mock)”接種物を、非形質転換植物の全ＲＮＡに、非サイレンス化植物の連続希釈ＧＦＰ ＲＮＡとして流した。ＧＦＰ ＲＮＡを、基準サンプル（１：１）の半分（１：２）または５倍（１：５）に希釈した。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のエチジウムブロマイド染色は、サンプルが同じ充填量であることを示した。ノーザン解析は、古い葉または偽接種、非サイレンス化植物におけるよりも、感染植物の新たな葉においてより豊富であることを示した。しかしながら、新たな葉におけるＧＦＰ ＲＮＡは、偽接種植物のレベルの２０％未満であった。
【０１４５】
ＴＢＳＶの１９Ｋタンパクは病原性決定因子であることが報告されている。例えば、１９Ｋタンパク（ｐＨＳ１４２）を発現するＰＶＸベクター、ＰＶＸ−１９Ｋと称する、は、N.benthamianaに厳しい症状を誘導した（２２）。さらに、ＴＢＳＶにおける１９Ｋタンパクの不活性化は、ＴＢＳＶにより植物に通常引き出される致死的な先端壊死症状表現型に緩和効果を与える（２２）。集合的に、これらのデータは、ＴＢＳＶ １９Ｋタンパクが、遺伝子サイレンシングのサプレッサーの特性を有することを示す。この仮説を調べるために、サイレンス化ＧＦＰ植物を、ＰＶＸ−１９Ｋを用いて接種した。対照として、植物を、１９Ｋタンパクの非翻訳可能形態を有するｐＨＳ１６０（ここではＰＶＸ−ｍ１９Ｋと称する）を用いて接種した（２２）。接種後２週間までに、ＰＶＸ−１９Ｋで感染させた植物は、非常に厳しい症状を示したが、ＰＶＸ−ｍ１９Ｋ感染植物は、報告されているように（２２）穏やかなモザイク症状を有していた。サイレンシングの抑制は、ＰＶＸ−１９Ｋ−感染植物で生じたが、新たに発生した組織においてのみ現れ、葉脈において最も著しかった。しかしながら、ＰＶＸ−１９Ｋの症状は、葉の全領域に見られた。ＰＶＸ−ｍ１９Ｋに感染した同様の組織は、一様に赤い蛍光のままであった。新たに発生した、感染した葉から抽出したＲＮＡのノーザン解析は、わずかに低レベルのＧＦＰ ＲＮＡがＰＶＸ−１９Ｋ−感染組織において観察されたこと、およびＧＦＰ ＲＮＡが、ＰＶＸ−ｍ１９Ｋ−感染組織において検出レベル以下であったことを示した。以上から、これらの結果は、ＴＢＳＶの１９Ｋタンパクが、新たに発生する葉脈組織の近傍において機能する、N.benthamianaのＰＴＧＳのサプレッサーであることを示唆する。
【０１４６】
実施例４−ＰＴＧＳの抑制が葉脈内またはその近傍で優先的に生じる他の例
それぞれトバモウイルスとコモウイルス群のタイプのメンバーである、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）とカウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の効果を、２０DPIにおいてハンドヘルドランプからのＵＶ照射の下で撮影した写真を用いて上述したように評価した。ＧＦＰサイレンス化植物に対する対応するウイルスの接種は、新たに発生および既に発達したサイレンス化組織の両方に影響する遺伝子サイレンシングの抑制を導き、かくしてＰＴＧＳの維持が緩和されることを示した（表１）。しかしながら、以前にＴＢＳＶおよびＰＶＸ−１９Ｋについて示したように、抑制は主に葉脈の中または近くにおいて現れ、葉身の殆どの組織がサイレンス化されたまま（すなわち、赤い蛍光）であるが、各ウイルスの症状は、全体の葉の葉身に観察された（データ示さず）。この表現型は、感染した葉が完全に発達し、完全に感染しても変化しなかった。両方のウイルスに関して、葉脈の近くの緑色蛍光は非常に強く、この効果は、ハンドヘルドランプからのＵＶ照射下で明らかなものであった。
【０１４７】
ＲＮＡのノーザン解析を、ＴＭＶおよびＣＰＭＶに感染したサイレンス化N.benthamianaから２０DPIに抽出した物質を用いて行った。ＲＮＡサンプルを、古い葉または新たに発生した葉から取り出した。等量の各ＲＮＡサンプル（１５μｇ）を、プローブとして³²Ｐラベル化ＧＦＰ ｃＤＮＡを用いて、ＲＮＡゲルブロッティングによりアッセイした。サンプルを、実施例で用いた同一のアガロースゲルで分離し、かつ同一のフィルターにブロットし、かくして、参照として同一の“偽(mock)”ＧＦＰ ＲＮＡ希釈シリーズを使用した。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のエチジウムブロマイド染色は、サンプルの等量の充填を示した。感染した葉から抽出されたＲＮＡのノーザン分析は、ＧＦＰ ＲＮＡの蓄積がこれらの組織において回復されたが、非サイレンス化、非感染植物の同組織から抽出された豊富なＧＦＰ ＲＮＡと比較して低レベルであることを示した。これは、葉身の最も豊富なサイレンス化組織に対する葉脈組織の希釈によるものであろう。それゆえ、この分子的分析は、ＵＶ照射下で観察されたサイレンシング抑制の特定の表現型と一致する。
【０１４８】
例えば、ＴＢＳＶの１９Ｋタンパクを用いた葉脈におけるサイレンシングの抑制は、このタンパクが葉脈で安定または発現されること、あるいは、脈管および非脈管組織間で量的または質的に異なるＰＴＧＳメカニズムの成分に対して向けられていることを示しうる。あるいは、サプレッサーは、ＰＴＧＳの全身的シグナルに対して向けられ得る。このシグナルが、篩部伝達されること、および、受容植物の葉において、葉脈の中および近傍に主として位置づけられることを示した（１７）。葉脈におけるサイレンシングの抑制に関するこれらの説明に関して、葉脈特異的成分またはサプレッサーの安定性に関する説明はもっともでないと思量する。なぜなら、あらゆる場合において、ＰＴＧＳ抑制は、維管束の外側の細胞にまで延び、正確な葉脈特異的サイレンシングプロセスよりもシグナルの移動を反映するように見えたからである。この理由として、ＴＭＶ、ＣＰＭＶ、およびＴＢＳＶのサプレッサーがサイレンシングの全身性シグナルに対して向けられ、それゆえ、全身性ＲＭＤに対するウイルスの適応を示すかもしれないことを提案する。
【０１４９】
ＴＭＶ、ＴＢＳＶおよびＣＰＭＶは葉脈の中または近傍においてのみＰＴＧＳを抑制できるが、それにも関わらずそれらは感染した葉の全体に高レベルで蓄積されうる。それゆえ、おそらく、これらのウイルスは、ＲＭＤの効果を妨げる二次的な戦略を備えているのであろう。
【０１５０】
実施例５−イネ黄斑ウイルス（ＲＹＭＶ）の病原性決定因子が非宿主Nicotiana benthamiana種におけるＰＴＧＳを抑制する
ＲＹＭＶは、非常に狭い宿主範囲を示すソベモウイルスである。これは、Oryzae、PhalaridaeおよびEragrostidae族に属する単子葉種のみに全身的に感染する（２３）。最近の研究は、ＲＹＭＶのＰ１タンパクをイネの病原性決定因子であると特徴付けた（２４）。ＲＹＭＶ非宿主種において遺伝子サイレンシングを抑制するか否かを調べるために、Ｐ１ ＯＲＦをＰＶＸベクターに導入し、ＧＦＰサイレンス化N.benthamianaを、得られた組み換えウイルス（ＰＶＸ−Ｐ１）で感染させた。対照として、Ｐ１の非翻訳可能形態を有するＰＶＸベクター（ＰＶＸ−ｍＰ１）も接種した。接種から約２週間後に、ＰＶＸ−Ｐ１に感染した組織は、深刻な萎黄病および白色壊死を示した。ＵＶ照射下では、ウイルス接種前に発生した葉を含むこれらの組織は、１４DPIに緑色蛍光を示し、新たに発生した組織と古い葉の両方においてサイレンシングの逆転を生じた。
【０１５１】
ＲＮＡのノーザン解析を、ＰＶＸ−Ｐ１またはＰＶＸ−ｍＰ１に感染させた、偽感染、非サイレンス化、またはサイレンス化N.benthamianaから、１４DPIに抽出された物質について行った。ＲＮＡサンプルを、古い葉または新たに発生した葉から得た。等量の各ＲＮＡサンプル（１０μｇ）を、³²Ｐラベル化ＧＦＰ ｃＤＮＡをプローブとして用いてＲＮＡゲルブロッティングによりアッセイした。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のエチジウムブロマイド染色は、サンプルの等量の充填を示した。若い感染組織では、ＧＦＰ ｍＲＮＡレベルは、非サイレンス化ＧＦＰ植物と類似していた。ＧＦＰ ｍＲＮＡは、低い程度ではあったが、ウイルス接種前に発生していた感染した葉において検出できた。対照的に、深刻な症状もＧＦＰサイレンシングの逆転も、ＰＶＸ−ｍＰ１−感染からは引き起こされなかった。このデータから、ＲＹＭＶのＰ１タンパクが、Nicotiana種に感染しないウイルスのゲノムにコードされているものの、N.benthamianaにおけるＰＴＧＳ維持のサプレッサーであると結論付けた。
【０１５２】
実施例６−ポテックスウイルス群の密接に関連するメンバー間のN.benthamianaにおけるＰＴＧＳ抑制能力のバリエーション
ＲＮＡのノーザン解析を、ＶＭＶ、ＮＭＶ、ＮＶＸ、またはＰＶＸのいずれかを用いて感染させたサイレンス化N.benthamianaから２０DPIに抽出した物質について行った。ＲＮＡサンプルを、古い葉または新たに発生した葉から得た。等量の各ＲＮＡサンプル（１５μｇ）を、プローブとして³²Ｐラベル化ＧＦＰ ｃＤＮＡを用いて、ＲＮＡゲルブロッティングによりアッセイした。サンプルを実施例３で用いたものと同一のアガロースゲルで分離し、同一のフィルターにブロットし、かくして、参照として同一の“偽”ＧＦＰ ＲＮＡ希釈シリーズの使用を可能にした。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のエチジウムブロマイド染色は、サンプルが同じ充填量であることを示した。
【０１５３】
このノーザン解析によると、いずれもポテックスウイルス群のメンバーとされるＰＶＸおよびＦｏＭＶは、N.benthamianaにおけるＧＦＰのＰＴＧＳに何の影響も与えなかった（表１）。
【０１５４】
これとは対照的に、他のポテックスウイルス、スイセン属モザイクウイルス（ＮＭＶ）、ナンテンウイルスＸ（ＮＶＸ）およびスミレ属モザイクウイルス（ＶＭＶ）を用いた感染は、N.benthamianaにおいて遺伝子サイレンシングの抑制を導いた（２０DPIで測定）。この抑制は、接種前に発達した葉、および若い発達中の組織において顕著であり（すなわち、新たに発生した組織および古い葉の両方においてサイレンシングの逆転が生じる）、２０DPIに解剖顕微鏡からＵＶ照射の下で撮影された。この抑制は、Hc-pro、２ｂおよびＡＣ２と同じくらい強く、感染組織におけるＧＦＰ ｍＲＮＡのレベルは、偽接種、非サイレンス化植物と同じくらいであった。
【０１５５】
これらの関連したウイルスの接種物は、局部障害宿主Chenopodium amaranticolor（２５）を用いて定量し、実質的な参照として用いられるＰＶＸ接種物に匹敵するように希釈した（葉当たり４０の障害）。感染後、これらのウイルスが、同様のタイプの症状を与えることを確認した。かくして、サイレンシング活性のサプレッサーのバリエーションは、感染の程度よりむしろウイルスの本質的な特性を反映した。驚くべきことに、これらの異なるサプレッサー活性は、これらのウイルスのヌクレオチド配列類似性と関連しなかった。サイレンシングを抑制しないＰＶＸおよびＦｏＭＶは、遠い関係にある。対照的に、強いサプレッサーをもたらすＮＶＸとＶＭＶは、コートタンパクと３つの移動タンパクにわたる領域の配列分析によれば、ヌクレオチドレベルでＰＶＸとそれぞれ９３％および９７％同一である（A.BendhamaneおよびD.C.Baulcombe、準備）。サプレッサーをもたらすＮＭＶは、ＰＶＸと遠い関係にある。それゆえ、単一のウイルス群の密接に関連するメンバーにおいてＰＴＧＳを抑制する能力に極度のバリエーションが存在する。
【０１５６】
実施例７−ＰＴＧＳのサプレッサーとしてのＡＣ２およびＰ１の使用
野生型N.benthamianaおよびN.tabaccumを、Ｐ１またはＡｃ２タンパクのｃＤＮＡが標準的な研究技術を用いて挿入された、３５Ｓ-nos発現カセットを含有するＴ-ＤＮＡを用いて形質転換する(１７)。安定な形質転換体をAcrobacterium tumefaciensリーフディスク接種により生成し（Horsch,R.B.,Fry,J.E.,Hoffmann,N.L,Eicbholtz,D.,Rogers,S.G.,およびFraley,R.R.(1985) A simple and general method of transferring genes into plants. Science 227, 1229-1231）、ノーザン解析により評価される高レベルの発現を示すものを、ＰＴＧＳ抑制の試験のために選択する。ＰＴＧＳ抑制試験は、Ｐ１またはＡｃ２に関してホモ接合のN.benthamiana形質転換体を得て、それらをホモ接合のＧＦＰトランスジェニックN.benthamianaと交雑させることにより行われる（Ruiz, M.T.,Voinnet,O.,およびBaulcombe,D.C.(1998) Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell 10, 937-946）。Ｆ１植物を、ＧＦＰ ｍＲＮＡのウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）を活性化するために、ＰＶＸ−ＧＦＰを用いて感染させる（Ruizら、上掲）。Ｆ１交雑種におけるＧＦＰのＶＩＧＳのＡｃ２およびＰ１による抑制は、トランスジェニックに発現した場合に、両方のタンパクがＰＴＧＳの機能的サプレッサーであることを示す。同様に、これらの交雑種におけるＧＦＰの全身的サイレンシングの欠如は、Ｐ１およびＡＣ２の両方が、ＧＦＰ ｍＲＮＡのトランスジーン誘導遺伝子サイレンシングを妨げることを示す。
【０１５７】
実施例８−アンプリコン介在遺伝子サイレンシングの抑制
上記実施例に記載されているN.tabaccum形質転換体を、ＰＶＸ−ＧＵＳアンプリコンのトランスジーンを有するトランスジェニックN.tabaccum系統と交雑させる（Angell,S.M.,とBaulcombe,D.C.(1997) Consistent gene silencing in transgenic plants expressing a replicating potato virus X RNA. EMBO J.16,3675-3684）。このアンプリコン系統は、ＰＶＸ−ＧＵＳ ＲＮＡの一貫したＰＴＧＳを示し、結果として、ＧＵＳタンパクは産生されない。しかしながら、アンプリコン／Ｐ１またはアンプリコン／Ａｃ２交雑種は、葉の組織化学的染色（Jefferson,R.A.,Kavanagb,T.A.,およびBevan,M.W.(1987) GUS fusions: B-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J.6, 3901-3907）およびノーザン解析により評価して、高レベルのＧＵＳ発現を示す。アンプリコンのＰＴＧＳは、Ｐ１およびＡＣ２タンパクにより低減され、高レベルのＧＵＳタンパクがＰＶＸ複製の結果として産生される。この植物は、最初のＰＶＸ−ＧＵＳアンプリコン系統と同様に無症状であり、高レベルのＰＶＸ複製が植物細胞により支持できることを示唆する。
【０１５８】
実施例９−ＰＴＧＳのサプレッサーとしてのＰＶＸ ｐ２５
ＰＶＸゲノムのファクターが全身的サイレンシングを妨げる
ＧＦＰトランスジーンまたは、ＧＦＰおよびＲｘトランスジーンの両方を有するトランスジェニック接ぎ穂を、根茎にウェッジグラフトした。ＧＦＰサイレンシングのグラフト伝達を、終始ＵＶ照射下で評点をつけた。グラフトから２０日後までに、ＵＶ照射下での緑色蛍光の減損により示されるように、ＧＦＰのＰＴＧＳが根茎に拡大した。予想されるとおり、ＰＶＸ症状がないこと、およびノーザン解析によりＰＶＸ−ＧＦ ＲＮＡを検出できなかったことから示されるように、Ｒｘ／ＧＦＰ接ぎ穂へのＰＶＸ−ＧＦの拡散はなかった。さらに、予想通り、Ｒｘを欠いたＧＦＰ接ぎ穂へのＰＶＸ−ＧＦおよび遺伝子サイレンシングの拡散が見られた。しかしながら、試験した１０のグラフトのいずれにも、Ｒｘ／ＧＦＰ接ぎ穂にＧＦＰの全身的サイレンシングは見られなかった。非感染ＧＦＰ植物と同様に、接ぎ穂は緑色蛍光のままであり、ＧＦＰ ｍＲＮＡレベルが高かった。
【０１５９】
ＧＦＰ／Ｒｘ接ぎ穂へのＧＦＰサイレンシングの全身的拡散の欠損は、Ｒｘが全身的サイレンシングを妨げることができるか否かに起因する。しかしながら、サイレンシングがアグロバクテリウム浸透により根茎に誘導された場合、試験した１０の移植のうちの８つにおいてＧＦＰ／Ｒｘ接ぎ穂への拡散が見られた：これらの接ぎ穂は緑色蛍光を減損し、ＧＦＰ ｍＲＮＡは検出されなかった。サイレンシングにおけるＲｘの効果を評価するためのさらなるコントロールにおいて、ＰＶＸ−ＧＦ−感染植物にグラフトされたＧＦＰ／Ｒｘ接ぎ穂に、３５Ｓ−ＧＦＰ Ｔ−ＤＮＡを有するアグロバクテリウム細胞を直接浸透させた。全部で５つのこれらの試験において、ＧＦＰサイレンシングが誘導され、ＧＦＰ／Ｒｘ接ぎ穂にわたって拡散され、ＲｘがＰＴＧＳの全身的拡散または開始のいずれにも影響しなかったことを示した。それゆえ、全身的サイレンシングがＰＶＸ−ＧＦ−感染根茎を越えて拡がることができないのは、ＰＶＸゲノムにコードされたファクター、恐らくはタンパクによるものと思われる。
【０１６０】
ＰＶＸ ＴＧＢタンパクは全身的サイレンシングを妨げる
ＰＶＸがコードするタンパクが、全身的サイレンシングを妨げるまたは妨害することができるか否かを調べるために、ＰＶＸ−ＧＦＰの欠失変異体を用いて実験を行った（図１）。これらの変異体ウイルスは、全て、ＰＶＸの細胞から細胞への移動および長距離の移動に必要とされるコートタンパク（ＣＰ）に欠点があるので、最初に感染した細胞に制限された。予想通り、ＰＶＸがコードするタンパクが全身的サイレンシングを妨げれば、対応するＰＶＸ−ＧＦＰ変異体により開始されたＰＴＧＳは、接種された細胞から離れて現れるであろう。対照的に、他のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に変異を有するＰＶＸ−ＧＦＰ構築物により開始されたサイレンシングは、接種されたエリアに制限されるであろう。
【０１６１】
最初に、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰおよびＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＴＧＢ−△ＣＰ（図１）がＧＦＰトランスジーンの全身的サイレンシングを誘導できる能力について調べた。これらの構築物は、ＣＰ ＯＲＦに欠失が存在すること以外は、ＰＶＸ−ＧＦＰベクター（図１）に類似している。ＣＰ変異に加えて、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＴＧＢ−△ＣＰは、トリプル遺伝子ブロック（ＴＧＢ(triple gene block)）の３つ全てのＯＲＦにわたる欠失を有する。このＴＧＢは、ＣＰに加えて、ＰＶＸの細胞から細胞への移動に厳密に必要とされる３つのタンパクをコードする（Verchotら, 1998）。
【０１６２】
これらの変異ウイルスの高力価接種物を生成するために、ＰＶＸ−ＧＦＰ構築物が３５Ｓプロモーターと結合しているpBin19 Ｔｉプラスミドベクター(Bevan, 1984)を用いた。これらの構築物を有するアグロバクテリウム培養物を、ＧＦＰトランスジェニック植物の葉に浸透させた。Ｔ−ＤＮＡの輸送は、浸透させた領域内の高い比率の細胞を、ＰＶＸ−ＧＦＰの移動欠陥変異体で感染させた。
【０１６３】
接種から３日後（dpi）に、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰおよびＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＴＧＢ−△ＣＰでは、浸透領域で明るい緑色蛍光として現れるＧＦＰの強力な発現があった（データ示さず）。しかしながら、５−６dpiから、浸透させた領域が赤い蛍光になり、ＧＦＰの局部的ＰＴＧＳがこれらの構築物の両方により開始されたことを示唆する。この局部的サイレンシングの発達は、３５Ｓ−ＧＦＰ構築物で浸透させた葉と同じ速さであった。
【０１６４】
ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＴＧＢ−△ＣＰと３５Ｓ−ＧＦＰの両方では、全身的サイレンシングは１００％のＧＦＰ植物において開始され、３５Ｓ−ＧＦＰ構築物と同じくらい早くかつ広く発達した（図２のグラフ）。対照的に、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰ構築物で開始された全身的サイレンシングは遅く（図２グラフ）、たったの３０％の接種植物にしか現れず、しかも、これらの植物において、数枚の葉の葉脈に制限されていた。ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＴＧＢ−△ＣＰとＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰとの間の差異は、ＴＧＢ ＯＲＦに関係するものであることから、これらの結果は、一以上のＴＧＢタンパクが、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰ感染細胞からの全身的サイレンシングを妨げることを示唆した。
【０１６５】
ＰＶＸがコードする２５ｋＤａタンパクが全身的サイレンシングを妨げる
同様の実験を、ＴＧＢ ＯＲＦを個々に変異させたＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰ誘導体（ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰ、ＰＶＸ−ＧＦＰ−２５ｋ_FS−△ＣＰ、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△１２Ｋ−△ＣＰ、およびＰＶＸ−ＧＦＰ−△８Ｋ−△ＣＰ；図１）を用いて実施した。
【０１６６】
構築物 局部的サイレンシング 全身的サイレンシング
PVX-ＧＦＰ-△8K-△CP ５０／５０ １２／５０
PVX-ＧＦＰ-△12K-△CP ５０／５０ １５／５０
PVX-ＧＦＰ-△25k-△CP ５０／５０ ５０／５０
PVX-ＧＦＰ-25k_FS-△CP ５０／５０ ５０／５０
（３つの独立した実験を行い、２１dpiに評価した）
【０１６７】
これらの変異体の全てに関して、浸透させた領域が赤い蛍光になり、ＧＦＰの局部的ＰＴＧＳの開始があったことを示唆している。しかしながら、唯一の広い全身的サイレンシングを生じたＴＧＢ変異体は、２５ｋＤａのタンパク（ｐ２５）のＯＲＦに欠失（ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰ、図１）またはフレームシフト変異（ＰＶＸ−ＧＦＰ−２５ｋ_FS−△ＣＰ、図１）のいずれかを有するものであった。
【０１６８】
１２ｋＤａと８ｋＤａのタンパクのＯＲＦに変異を有するウイルス（それぞれ、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△１２Ｋ−△ＣＰおよびＰＶＸ−ＧＦＰ−△８Ｋ−△ＣＰ、図１）は、機能的な２５ｋＤａタンパクをコードし、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰと同様に、全身的サイレンシングを殆ど誘導しなかった。これらの構築物を用いて接種した殆どのＧＦＰ植物は、ＧＦＰの全身的サイレンシングを全く示さなかった。しかしながら、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰと同様に、接種した植物の約２５％がＧＦＰの部分的サイレンシングを示した。２１dpiにおいて、この部分的サイレンシングは、一部の上葉の葉脈の中およびその周りの領域に制限され、さらに発展することはなかった。
【０１６９】
原則として、ＰＶＸ−ＧＦＰ ＴＧＢ変異体により誘発される対照的なサイレンシング表現型は、ｐ２５の直接的影響である。あるいは、変異が複製に影響するか、接種された葉においてＧＦＰのＰＴＧＳを誘導するこれらの変異体の能力に影響する場合には、間接的な影響かもしれない。これらの選択肢を解明するために、ＧＦＰ特異的プローブを用いて、２．５および５dpiに、浸透させた葉の組織からのＲＮＡをノーザン解析した。全ＲＮＡは、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△８Ｋ−△ＣＰ、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△１２Ｋ−△ＣＰ、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５Ｋ−△ＣＰ、または水のいずれかで浸透させたＧＦＰ植物の葉から２．５および５dpiに抽出した。ノーザン解析は、１０μｇの高分子量ＲＮＡフラクションに対して行い、ＧＦＰ ｃＤＮＡの中心領域に対応するプローブを用いて、ＰＶＸ−ＧＦＰおよびトランスジーンＧＦＰ ＲＮＡの蓄積を調べた。電気泳動ゲルのエチジウムブロマイド染色は、ｒＲＮＡの充填量を示した。
【０１７０】
２．５dpiに、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△１２Ｋ−△ＣＰ、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△８Ｋ−△ＣＰ、およびＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５Ｋ−△ＣＰを用いた場合、抽出物はＧＦＰプローブで検出された４つの主要ＲＮＡ種を含んでいた。ゲノムウイルスＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は最小であり、ウイルス性サブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡ１は最も豊富であった。ｓｇＲＮＡ２は共同移動し、ＧＦＰトランスジーンｍＲＮＡから区別できなかった。２．５dpiで、これらのＲＮＡは、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△１２Ｋ−△ＣＰ、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△８Ｋ−△ＣＰ、およびＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５Ｋ−△ＣＰ感染組織において全て豊富であった。しかしながら、５dpiでは、３つ全てのＴＧＢ変異体で、これらのＲＮＡ種のレベルが顕著に低かった。この低減は、ウイルスに依存する。なぜなら、偽接種組織では、ＧＦＰ ｍＲＮＡは、２．５および５dpiで同じレベルであったからである。かくして、ＲＮＡの豊富さにおけるこの変化は、ウイルス性およびトランスジーンＧＦＰ ＲＮＡ種の両方に対して向けられたＰＴＧＳによると考えられる。
【０１７１】
ＴＧＢ変異体により誘導されたＰＴＧＳのさらなる試験として、５dpiに２２−２５ｎｔのアンチセンスＧＦＰ ＲＮＡについてアッセイした。低分子量フラクションのノーザン解析を、各サンプルにおいて、エチジウムブロマイド染色を用いて標準化した充填およびｔＲＮＡの定量を用いて行った。用いたプローブは、全長ＧＦＰ ｃＤＮＡに対応するものであった。別の系では、これらの小さいアンチセンスＲＮＡの相対量は、ＰＴＧＳのレベルに相関する（HamiltonとBaulcombe, 1999; Dalmayら,2000）。予想通り、これらの２２−２５ｎｔのＧＦＰ ＲＮＡは、偽浸透の葉の抽出物には存在しなかった。しかしながら、ＰＶＸ−ＧＦＰ感染組織では、これらのＲＮＡは存在し、そのレベルはＴＧＢ ＯＲＦの変異により影響されなかった。このデータは、３つ全てのＴＧＢ変異体がＧＦＰのＰＴＧＳの効率的な誘導物質であることを示す。
【０１７２】
以上から、これらの結果は、ＴＧＢ変異体の全てが、複製し、細胞内ＰＴＧＳを同程度まで活性化したことを示す。しかしながら、サイレンシングの全身的拡散は、ＰＶＸ−ＧＦＰ構築物がｐ２５ ＯＲＦに変異を有する場合にのみ生じる。このブロックはＲＮＡが介在する効果であるとは考えられない。なぜなら、全身的サイレンシングは、ｐ２５ ＯＲＦにフレームシフト変異を有するＰＶＸ−ＧＦＰ変異により開始されたものだからである。それゆえ、ｐ２５タンパクが、ＧＦＰトランスジーンの全身的ＰＴＧＳを妨げることができると結論付けた。
【０１７３】
非トランスジェニック植物における全身的サイレンシング
上記実験は、浸透アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡおよび植物ゲノムに組み込まれたＧＦＰトランスジーンに関連することから、ウイルス感染植物における全身的サイレンシングの程度について直接的に有益なものではなかった。以前に示されているように（Voinnetら,1998）、あらゆるウイルス誘導効果が増幅され、これらのトランスジーンにリレーされ、全身的サイレンシングが、非トランスジェニック植物よりも大きくなった。それゆえ、ウイルス感染による全身的シグナリングのより正確な実像を得るために、非トランスジェニック植物において一連の実験を行った。これらの実験におけるＰＴＧＳは、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（rbcs）をコードする内因性遺伝子をターゲットとした。以前に示されているように、この遺伝子は、ＰＶＸ−誘導ＰＴＧＳの潜在的ターゲットであるが、トランスジーンと違って、このメカニズムの開始、増幅、または維持に関与しない（Jonesら,1999）。それゆえ、rbcsの全身的サイレンシングは、ウイルス感染細胞からのシグナル拡散の程度を示すと考えられる。
【０１７４】
これらの実験における構築物は、rbcs ｃＤＮＡの５００ｎｔフラグメントがＧＦＰ ＯＲＦに挿入されているＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰの誘導体（図１）である。これらの誘導体は、ＰＶＸ−rbcs−Ｘと集合的に称されている。ここで、“Ｘ”は、各構築物が有する種々の変異を意味する。アグロバクテリウム浸透方法を、非トランスジェニック植物の１または２の発達した葉にこれらのＰＶＸ構築物を接種するために用いた。１４日後、全身性の、新たに発生した葉を、rbcsのサイレンシングについて調べた。ＰＶＸ−rbcs−△ＴＧＢ−△ＣＰ誘導体の接種は、全身の葉の葉脈内およびその周りに黄緑萎黄病として現れるrbcsの全身的サイレンシングを導いた。
【０１７５】
広いＧＦＰサイレンシングとは対照的に、rbcsサイレンシングは、葉脈の近傍に制限されたままであり、１０−１６dpi内に現れた葉においてのみ明らかであった。この表現型は、rbcs遺伝子のＰＴＧＳと関連するリレー増幅の欠損と一致し、ウイルス誘導シグナルの直接的な指標となろう。
【０１７６】
構築物 全身的サイレンシング
PVX-rbcs-△TGB-△CP ３５／４０
PVX-rbcs-△rep-△TGB-△CP ０／４０
PVX-rbcs-△12K-△CP ０／４０
PVX-rbcs-△25K-△CP ３６／４０
【０１７７】
ＧＦＰサイレンシングと同様に、rbcs全身的効果は、（ＰＶＸ−rbcs−△ＴＧＢ−△ＣＰとＰＶＸ−rbcs−△２５ｋ−△ＣＰにおいて）２５ｋＤａ ＯＲＦの変異を必要とした。２５ｋＤａのＯＲＦが損なわれていない構築物（ＰＶＸ−rbcs−△１２Ｋ−△ＣＰ）は、全身的サイレンシングを誘導しなかった。これらの結果から、トランスジーンの不在下では、ウイルス誘導サイレンシングシグナルは、感染した細胞から数センチメートル移動でき、主として葉脈の近傍に局在化されると結論付けた。重要なことに、複製に欠陥を有するＰＶＸ−rbcs−△ｒｅｐ−△ＣＰは、rbcsの全身的サイレンシングを誘導しなかった。この結果は、非トランスジェニック植物において、シグナルの産生が、その誘導に重要なウイルスゲノムの複製能力に依存することを示唆する。
【０１７８】
同様の結果が、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）遺伝子をターゲットとするＰＶＸ−ＧＦＰ−△ＣＰ誘導体（フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）ｃＤＮＡの中心領域の４１５ヌクレオチドフラグメントが、対応するＰＶＸ−ＧＦＰ誘導体のＧＦＰ ＯＲＦに挿入されているもの−図１）を用いて得られた。rbcsのように、退色として現れるＰＤＳの全身的サイレンシングは、一過的であり、新たに発生した一部の葉の葉脈の周りに局在化していた。これはまた、ＰＶＸ複製にも依存していた。ＰＤＳ ｍＲＮＡは、rbcs ｍＲＮＡよりも数オーダー小さい。それゆえ、ターゲット遺伝子発現のレベルが、非トランスジェニック植物における全身的サイレンシングの持続性および葉脈パターンに影響したことを排除することができる。
【０１７９】
ｐ２５の異所発現と全身的サイレンシング
変異体ＰＶＸを用いた分析は、ｐ２５に加えて、他のウイルスコードタンパクが、全身的サイレンシングを妨げることに関与すると言うことを排除しなかった。この可能性と取り組むため、他のウイルスコードタンパクとは無関係に発現したｐ２５の存在下で全身的サイレンシングを誘導した。全身的サイレンシングの誘導は、３５Ｓ−ＧＦＰ構築物を有するアグロバクテリウム株、または参照として、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰ構築物（図１）を有する株の浸透によるものであった。これらの株を、ｐ２５ＯＲＦの開始コドンが除去されている３５Ｓ−２５ｋ構築物または３５S-２５ｋ−△ＡＴＧ構築物を有する第二の株と混合した（図１）。この実験を行うために、３５Ｓ−２５ｋまたは３５S-２５ｋ−△ＡＴＧ構築物を有するアグロバクテリウム株を、３５Ｓ−ＧＦＰまたはＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰ構築物（図１）のいずれかを含むアグロバクテリウム株の培養物と混合した（等量）。対応する懸濁物を、若いＧＦＰトランスジェニック種苗の１または２枚の葉に浸透させ、ＧＦＰトランスジーンの局部的および全身的サイレンシングの開始を、終始観察した。値は、それぞれ１０の植物を含む独立した実験に由来するものである。“葉脈(vein)”は、全身的サイレンシングが２１dpiに数枚の葉の葉脈にのみ現れたことを示す。“全体(full)”は、２１dpiに、広いGFPの全身的サイレンシングを示す。
【０１８０】
構築物 共同浸透 全身的サイレンシング
35S-GFP ： 35S-25k ４／４０（葉脈）
35S-25k-△ATG ３７／４０（全体）
PVX-GFP-△25k-△CP ： 35S-25k １／２０（葉脈）
35S-25k-△ATG ２０／２０（全体）
【０１８１】
３５Ｓ−２５ｋ−△ＡＴＧとの構築物の組合せは、35S-GFP構築物のみと同様に広く、そして急速に全身的サイレンシングを誘導した。対照的に、ＧＦＰの全身的サイレンシングは、３５Ｓ−２５ｋの組合せを用いて浸透させたいくつかの植物にのみ生じた。さらに、これらの植物では、完全なｐ２５ＯＲＦを有するＰＶＸ−ＧＦＰ誘導体に関与する実験と同様に、全身的サイレンシングが不完全であり、数枚の葉の葉脈に制限されていた。これらの結果から、ＰＶＸコードタンパクの内、ｐ２５がＧＦＰトランスジーンの全身的サイレンシングを妨げるのに十分であると結論付けた。
【０１８２】
ｐ２５の異所発現および局部的サイレンシング
全身的サイレンシングに対するｐ２５の効果は、浸透された細胞におけるブロックのシグナル産生から得ることができる。あるいは、このタンパクは、それが産生された細胞の外へのシグナルの移動を妨げることができる。これらの選択肢を調べるために、ＰＴＧＳが開始された葉におけるＧＦＰ蛍光およびＲＮＡレベルに対するｐ２５の局部的効果を観察した。シグナル移動がターゲットとされるのであれば、接種された細胞における局部的サイレンシングは影響されないであろう。しかしながら、シグナル産生に与えるｐ２５の効果は、局部的サイレンシングの開始に影響すると考えられる。高分子量ＲＮＡのノーザン解析を、以下のようにして行った。全ＲＮＡを、３５Ｓ−ＧＦＰ構築物を、それぞれ３５Ｓ−２５ｋ構築物、３５Ｓ−２５ｋ−△ＡＴＧ構築物、または水と組み合わせて浸透させたＧＦＰ植物の葉から２．５および５dpiに抽出した。ノーザン解析を、１０μｇの高分子量ＲＮＡフラクションに対して実施し、全長ＧＦＰ ｃＤＮＡに対応するプローブを用いて、ＧＦＰ ＲＮＡの蓄積を検出した。電気泳動したゲルのエチジウムブロマイド染色を用いてｒＲＮＡ充填を示した。５dpiまでに、この（３５Ｓ−２５ｋ−△ＡＴＧ＋３５Ｓ−ＧＦＰ）の組合せまたは３５Ｓ−ＧＦＰ構築物のみを用いて浸透させた葉において、予想通り、局部的ＰＴＧＳの開始を示唆するＧＦＰ蛍光の損失があった（データ示さず）。相応じて、これらの組織におけるＧＦＰ ＲＮＡのレベルは偽浸透組織よりも低く、ＧＦＰ２１−２３ｎｔアンチセンスＲＮＡが豊富であった。
【０１８３】
対照的に、前記（３５Ｓ−２５ｋ＋３５Ｓ−ＧＦＰ）の組合せを用いた浸透は、緑色蛍光を、浸透させた葉において増大させた（データ示さず）。ＧＦＰ ＲＮＡは、偽浸透組織よりも、前記組織においてはるかに豊富であった。これはおそらく、組み込まれた、および異所性の３５Ｓ−ＧＦＰトランスジーンが両方発現されたからであろう。
【０１８４】
相応じて、ＧＦＰ２１−２３ｎｔアンチセンスＲＮＡは、３５Ｓ−ＧＦＰまたは（３５Ｓ−ＧＦＰ＋３５Ｓ−２５ｋ−△ＡＴＧ）を用いて浸透させた組織よりも５倍未満も少なかった。低分子量ＲＮＡのノーザン解析を、上記解析した５dpiサンプルの２１−２３ｎｔのアンチセンスＧＦＰ ＲＮＡの蓄積を検出するために実施した。充填をエチジウムブロマイド染色および各サンプルのｔＲＮＡの定量を用いて標準化した。使用したプローブは、全長ＧＦＰ ｃＤＮＡに対応するものであった。
【０１８５】
集合的に、これらの結果は、ｐ２５の異所的な、構成的発現が、浸透された領域のＧＦＰトランスジーンのトランスジーン誘導サイレンシングを妨げたことを示す。
【０１８６】
サイレンシングのインデューサー（誘導物質）が複製ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰ構築物である場合、ｐ２５の効果はより複雑であった。高分子量ＲＮＡのノーザン解析を以下のようにして行った。全ＲＮＡを、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰ構築物を、それぞれ３５Ｓ−２５ｋ構築物、３５Ｓ−２５ｋ−△ＡＴＧ構築物、または水と組み合わせて浸透させたＧＦＰ植物の葉から２．５および５dpiに抽出した。（ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰ＋３５Ｓ−２５ｋ）サンプルでは、２．５dpiで、高分子量ＲＮＡの全てのレベルが、実質的にコントロールよりも高かった。
【０１８７】
このデータは、ｐ２５が、この早期時点におけるＰＴＧＳの抑制を引き起こしたことを示す。しかしながら、５dpiまでに、ｐ２５の存在下でさえ、ターゲットＲＮＡは全て２．５dpiより低レベルまで低下した。
【０１８８】
トランスジーンのＧＦＰ ｍＲＮＡはウイルス性サブゲノムＲＮＡの一つによりマスクされたが、偽浸透組織よりも明らかに少なかった。このターゲットＲＮＡレベルの低下は、少なくとも３つの独立した実験において観察され、２．５から５dpiの間に、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰにより開始された局部的ＰＴＧＳが、ｐ２５の最初の効果を克服したことを示す。
【０１８９】
ｐ２５がＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰを浸透させた組織においてＰＴＧＳを妨げられなかったことは、２１−２３ｎｔ ＧＦＰ ＲＮＡの解析によって確認された。この解析は、上述したように５dpiに行われた。５dpiでは、これらのＲＮＡは、３５Ｓ−２５ｋ−△ＡＴＧより３５Ｓ−２５ｋの存在下で２．５倍も豊富であり、ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰ ＲＮＡレベルにおける同様の差異に対応する。かくして、これらの２１−２３ｎｔ ＧＦＰ ＲＮＡは、主に複製ウイルスＲＮＡから生成されると考えられる。この考えと一致して、３５Ｓ−２５ｋと共に非複製性ＰＶＸ−ＧＦＰ−△ｒｅｐ−△ＣＰ構築物（図１）を用いて浸透させた組織では、低レベルの２１−２３ｎｔ ＲＮＡしか存在しなかった。
【０１９０】
集合的に、これらの結果は、インデューサーが非複製性トランスジーン構築物（３５Ｓ−ＧＦＰまたはＰＶＸ−ＧＦＰ−△ｒｅｐ−△ＣＰ）であるか、または複製性ＲＮＡ（ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰ）であるかに関わらず、異所的に発現されたｐ２５が全身的サイレンシングを妨げたことを示す。対照的に、インデューサーが非複製性トランスジーン構築物であるならば、局部的サイレンシングｐ２５によってのみ抑制される。このような状況では、ＰＴＧＳに対するブロックは、２１−２３ｎｔ ＧＦＰ ＲＮＡの蓄積の低減に関連し、おそらく、これらの２１−２３ｎｔ ＲＮＡの前駆体の合成またはプロセッシングをターゲットとするのであろう。
【０１９１】
ＰＴＧＳ経路の二つの分岐経路
アラビドーシス(Arabidopsis)におけるトランスジーン介在ＰＴＧＳは、約２１−２３ヌクレオチドの短いＲＮＡ種の産生に関与し、Sde1によりコードされるＲｄＲＰホモローグを必要とする；対照的に、一部のウイルスにより誘導されるＰＴＧＳはSde1とは独立と考えられるが、これも短いＲＮＡに関与する（Dalmayら,2000）。これらの知見を説明するため、植物におけるＰＴＧＳは、ショウジョウバエ(Drosophila)におけるＲＮＡ干渉に導く経路の分岐したバリエーションであることを提案する。この経路は、短い２１−２３ｎｔのＲＮＡへの二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡのプロセッシングを含む。これは、配列特異的ヌクレアーゼのガイドＲＮＡとして機能する（Zamoreら, 2000）。
【０１９２】
以前の示唆は、植物では、ＰＴＧＳ経路のSDE1依存性およびSDE1非依存性分岐経路が存在するというものであった（Dalmayら,2000）。両方の分岐経路がdsＲＮＡの合成に依存し、２１−２３ｎｔ ＲＮＡの生成時またはその前に収束する。ＳＤＥ１非依存性（独立性）分岐経路のdsＲＮＡは、ウイルスの複製を通して産生され、かくしてウイルスコードRdRpに依存する（図３）。このモデルでは、この経路のSde1-依存性分岐経路は、ウイルス性ＲＮＡによって影響されない。
【０１９３】
このモデルに関してｐ２５の効果を説明するために、局部的および全身的ＰＴＧＳを区別する。この局部的ＰＴＧＳは、それが３５Ｓ−ＧＦＰトランスジーンにより誘導され、しかし、インデューサーが複製性ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰでなければ、ｐ２５によって抑制された。それゆえ、このモデルによれば（図３ａ）、ｐ２５はこの経路のSde1−依存性分岐経路のサプレッサーであろう。対照的に、全身的ＰＴＧＳは、インデューサーが３５Ｓ−ＧＦＰトランスジーンであるか、複製性ＰＶＸ−ＧＦＰ−△２５ｋ−△ＣＰであるかによらず、ｐ２５によって抑制される。かくして、ウイルス誘導全身的サイレンシングに対するｐ２５のこの効果は、この経路のSde1−依存性分岐経路がトランスジーン特異的プロセスであり、ウイルス性ＲＮＡによって影響されない、図３ａに示されたモデルに一致させるのが難しい。
【０１９４】
原則として、これらのデータは、多重のｐ２５ターゲットを有する、別個の経路が存在して、局部的および全身的サイレンシングを導くことを示し得る。これはウイルスコードタンパクが、複製性ウイルスではなく、トランスジーンにより誘導された局部的ＰＴＧＳを抑制することを必要とするので、その可能性を排除することはできないが、その可能性はないと思える。それよりも、ｐ２５が局部的および全身的サイレンシングの両方に必要な単一のターゲットを有するという別の説明に賛同する。この説明によれば、全身的シグナルは、この経路のＳＤＥ１−依存性分岐経路において産生され、それゆえ、短いＲＮＡの前駆体であろう。
【０１９５】
この“単一のターゲット(single target)”の説明は、ＳＤＥ１依存性分岐経路がウイルスによって影響されない先のＰＴＧＳモデル（図ｅａ）の改善を必要とする。改善されたモデル（図３ｂ）では、ウイルス誘導局部的ＰＴＧＳが、この経路のＳＤＥ１非依存性、ｐ２５非敏感性分岐経路を必要とする。しかしながら、ＳＤＥ１依存性、ｐ２５敏感性分岐経路は、現在、ウイルス誘導性であると認識されている（図３ｂ）。この変化の結果、このモデルは、全身的シグナル産生がＰＶＸ複製により影響され、ｐ２５によって抑制されるという知見に順応する。
【０１９６】
この改善されたモデルのさらなる魅力は、Sde1に関する我々の結果と、Sde1と同じであるSgs2に関するMourrainら(2000)の結果の間の明白な矛盾を解決するということである。我々の解析では、Sde1／Sgs2の変異は、タバコモザイクウイルス、タバコラトルウイルス、およびカブクリンクルウイルス(Dalmayら,2000)に対する感染性に影響しないことを見出した。一方、Mourrainとその共同研究者らは、この座の変異は、キュウリモザイクウイルスに対する感受性過度をもたらすことを見出した（Mourrainら, 2000）。おそらく、試験したウイルスの内、ＣＭＶは、ＲＮＡ蓄積が全身的ＰＴＧＳにより強力に制限される唯一のウイルスであることから、これら二組のデータは異なるのであろう。別のウイルスは、上述したように、Sde1に依存しない局部的ＰＴＧＳにより制限されそうである。
【０１９７】
ウイルス性サプレッサーを用いたＰＴＧＳの精査
実施例１−８において、ＧＦＰのトランスジーン誘導ＰＴＧＳを示す植物の感染に関与する種々のウイルス性サプレッサーを特徴決定した。ＰＶＹおよび別のウイルスでは、一部または全ての感染組織においてＧＦＰの増大があり、対応するウイルスがＰＴＧＳのサプレッサーをコードすることを示した（Brignetiら,1998; Voinnetら,1999）。対照的に、ＰＶＸ感染植物では、ＰＴＧＳの逆転がなく、最初はこのウイルスはサプレッサーをコードしないと結論付けた。
【０１９８】
しかしながら、ここに示したデータに照らして、特にｐ２５の異所的発現から、ＰＶＸはＰＴＧＳのサプレッサーをコードすることが明らかである。おそらく、このＰＶＸの特性は、初期の実験では明らかではないであろう。なぜなら、ＰＶＸのｐ２５タンパクおよびＰＶＹのHcProを含む他のＰＴＧＳのサプレッサーは、遺伝子サイレンシングメカニズムの異なるステージで作用するからである。
【０１９９】
遺伝子サイレンシングにおいてHcproおよびｐ２５が異なるステージをターゲットとするという最も明白な示唆は、ウイルス誘導ＰＴＧＳを抑制するそれらの差別的な能力に基づく。PcProは、ＧＦＰのウイルス誘導ＰＴＧＳを抑制するが（Anandalakshmiら,1998）、本研究および以前の研究から、ｐ２５はそうではないことが明らかである。かくして、図３ｂのスキームによれば、HcProはＳＤＥ１依存性およびＳＤＥ１非依存性分岐経路の収束後のある箇所においてＰＴＧＳに作用するのであろう。シグナル産生が二つの分岐経路の収束の前に生じることを提案したので、HcProは全身的ＰＴＧＳを抑制しないと予想する。移植実験の最近のデータは、この予想を確認するものであり、ＰＴＧＳの種々のウイルス性サプレッサーの解析が根元的なメカニズムにいかに有益であるかを説明する。
【０２００】
実施例１０−アグロバクテリウム介在一過的発現における遺伝子サイレンシングのウイルスがコードするサプレッサーの使用
10.1 アグロバクテリウム介在遺伝子発現の一過的性質は、Ｔ−ＤＮＡ内に挿入された配列に対して向けられた転写後遺伝子サイレンシングの強力な活性化により説明される
緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を、３５ＳプロモーターとNosターミネーターの制御下にクローン化した。得られた発現カセットを、pBin19バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡに挿入した。ヘルパープラスミドpCh32(Hamiltonら(1996) PNAS 93 pp9975-9979)を有するアグロバクテリウム株c58c1(Farrandら(1989) J.Bacteriology 171 pp5314-5321)を、得られたプラスミドと共にエレクトロポレーションした。非トランスジェニックNicotiana benthamianaの一または数枚の成熟した葉を、予め、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂に再懸濁し、１００μＭのアセトシリンゴンとインキュベートした、対応するアグロバクテリウム株の飽和培養物を用いて浸透させた。
【０２０１】
接種から２．５日後（dpi）に、浸透させた組織は、ＵＶハンドヘルドランプからの照射下で緑色蛍光を示した。この緑色蛍光は、アグロバクテリウムから植物細胞にＴ−ＤＮＡの輸送が起こり、かつ、レポーター遺伝子の一過的発現が開始されたことを示す。２．５dpiから、２日の間隔をおいて、浸透した葉を、植物から切り離した。葉のサンプルを１１dpiまで回収した。全ＲＮＡをこれらのサンプルから抽出し、ノーザン解析を、全長GFP ｃＤＮＡに対応するプローブを用いて、抽出したＲＮＡの高および低分子量画分に対して行った。
【０２０２】
高分子量画分の解析は、２．５dpiにＧＦＰ ｍＲＮＡが豊富であることを示した。４−５dpiでも依然として豊富であったが、それ以降は、シグナルの累進的な減損があり、１１dpiには、ＧＦＰ ｍＲＮＡはノーザン検出のレベル以下であった。このＧＦＰ ｍＲＮＡの低減は、終始ＵＶ照射下で観察した緑色蛍光の低下と一致した。≧４dpiでは、緑色蛍光は、低減し始め、≧７．５dpiでは検出不能になった。
【０２０３】
短い２１−２３ｎｔのＲＮＡは、植物の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）およびC.elegansやDrosohilaのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の独特のマーカーである。これらのプロセスは、機械的に関連しており、ＲＮＡの配列特異的ターンオーバーに関与する。２１−２３ヌクレオチドＲＮＡ種は、ＰＴＧＳ／ＲＮＡｉに関与する細胞機構の主要成分として特徴決定されている。これらは、分解システムの特異性決定因子として機能すると考えられる。
【０２０４】
５dpiに、浸透させた葉から抽出された低分子量ＲＮＡを、おおよその分子サイズマーカーとして流した切断ＧＦＰプラスミドＤＮＡと共に電気泳動することにより分離した(HamiltonとBaulcombe, 1999)。ＲＮＡとＤＮＡを、ナイロン膜に移した。この膜を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Promega）を用いて、線形ＧＦＰプラスミドのin vitro転写(HamiltonとBaulcombe, 1999)を行うことによって製造したアンチセンス特異的ＧＦＰ ＲＮＡ³²Ｐラベル化プローブとハイブリダイズさせた。シグナルをホスホイメージング(BAS 1000, Fujix)により視覚化した。
【０２０５】
ＲＮＡブロットは、高い量のＧＦＰ特異的２１−２３ｎｔ ＲＮＡが、アグロバクテリウムの３５Ｓ−ＧＦＰ株を浸透させた非トランスジェニックN.benthamianaの組織に蓄積していることを示した。さらに、これらのＲＮＡ種の量は、安定に組み込まれたＧＦＰトランスジーンのＰＴＧＳを示すトランスジェニック植物と同じくらいの高さである（トラック３）。さらに、アグロバクテリウムのｐ１９株と３５Ｓ−ＧＦＰ株の共同浸透が、増強されたＧＦＰ ｍＲＮＡ、そしてその結果としてタンパク蓄積をもたらしたことも確認された（以下参照）。予想通り、２３−２１ｎｔのＲＮＡのレベルは、５dpiにおける上記サンプルからは、検出限界以下であった。
【０２０６】
以上から、これらの結果は、植物により活性化された強烈なＰＴＧＳ反応により、非トランスジェニックN.benthamianaにおけるGFPトランスジーンの一過的発現が抑制されることを示す。さらに、短いＲＮＡ種の量は、さらなる時点（例えば、１１dpiまで）に回収された組織において増大した。
【０２０７】
これらのデータから、経時的なＧＦＰ ｍＲＮＡの不安定性、およびその結果であるアグロバクテリウム浸透組織における緑色蛍光の停止は、Ｔ−ＤＮＡにコードされた遺伝子（例えばＧＦＰ遺伝子）に対して向けられたＰＴＧＳの非常に強い活性化により引き起こされると結論付けられる。このＰＴＧＳの活性化は、アグロバクテリウム介在遺伝子発現の一過的性質を完全に説明することができる。
【０２０８】
10.2 ＰＴＧＳのウイルスコードサプレッサーの一過的発現は、非トランスジェニックN.benthamianaにおけるアグロバクテリウム介在遺伝子発現に対する強力な遺伝子サイレンシング反応を妨げる
上述したように、ポチウイルスのHcPro、ククモウイルスの２ｂ、アフリカキャッサバモザイクウイルスのＡｃ２、ソベモウイルスのＰ１タンパク、およびトンブスウイルスの１９ｋタンパクは、ＰＴＧＳのウイルスコードサプレッサーである。これら全てのタンパクがＰＴＧＳのサプレッサーであると同定された。なぜなら、ポテトウイルスＸ（ＰＶＸ）ベクターから発現されたときに、ＧＦＰのＰＴＧＳを示すトランスジェニック植物の組織の一部または全部において、ＧＦＰ発現を回復させたからである。別のタンパク、ＰＶＸがコードする２５ｋＤａのタンパクも、遺伝子サイレンシングのサプレッサーであると同定された。このタンパクは、ＰＴＧＳ全身的シグナルの産生を妨げ、トランスジーンサイレンシングを廃止することが示された。
【０２０９】
上記サプレッサーが、非トランスジェニック植物におけるアグロバクテリウム介在一過的発現について活性化された強力なＰＴＧＳ反応に対して有効であるかを調べるために、これらのタンパクをコードする遺伝子を３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下でクローン化した。得られた発現カセットを、pBin19バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡに挿入した。次いで、ヘルパープラスミドpCh32を有するアグロバクテリウム株c58c1を、対応するプラスミドと共にエレクトロポレーションした。
【０２１０】
これらの実験では、ＧＦＰ遺伝子が、10.1に記載したように、レポーター遺伝子として用いられた。ＧＦＰレポーターを有するアグロバクテリウム株を、上記ＰＴＧＳサプレッサーの一つを有する別のアグロバクテリウム株と共に混合した（等量）。非トランスジェニックN.benthamianaの葉の浸透後、緑色蛍光の外観と持続性を、ＵＶ照射下で評価した。これらの共同浸透は、対応するＴ−ＤＮＡの最適な共同輸送を確実にする、飽和したアグロバクテリウム培養物を用いて行われた。
【０２１１】
４−５dpiでは、全ての共同浸透組織が、明らかにＧＦＰ株のみを用いて浸透させた組織よりも明るかった。この効果は、１９ｋタンパクを用いた場合に最も劇的であり、強い明るさの緑色蛍光を生じた。この効果は非常に強かったが、HcProおよび２５ｋＤａタンパクを用いた場合には、視覚的に弱かった。２ｂの効果は、HcProおよび２５ｋＤａタンパクの効果ほど強くなく、Ａｃ２の効果はそれ自体、２ｂタンパクの一つほど強くなかった。Ｐ１の効果は、全体の中で最も弱かったが、コントロールと比べればまだ顕著であった。これら全ての実験は、個々の処理について１０の植物を用いて少なくとも４回繰り返し（各処理当たり４０の植物）、類似した結果を得た。浸透組織は、その時点で毒性に関して何の兆候も示さなかった。
【０２１２】
レポーター遺伝子発現における観察された変化を定量するために、ＧＦＰ抗体を使用して、上記組織から抽出した全タンパクのウェスタンブロット解析を用いた。１９ｋ、HcProおよび２５ｋＤａタンパクの観察された効果から、ＧＦＰ発現は、対照組織と比べて少なくとも１０倍、そしておそらくは５０倍と予想された。
【０２１３】
初期（４−５dpi）においてのみＧＦＰ発現が強かっただけでなく、経時的に劇的に維持された。例えば、強い緑色蛍光は、１９ｋおよびHcPro−共同浸透組織において１８dpiにも観察され、この蛍光は葉の老年期まで持続した。他のサプレッサーの効果は、経時的に持続性が弱く、≧１２dpi以降には観察されなかった。また、２５ｋＤａ共同浸透組織が、７dpi付近で壊死として現れた毒性の徴候を示したことにも気づいた。
【０２１４】
ＧＦＰ発現に対するこれらの効果がＰＴＧＳの抑制によるものであることを確認するために、これらのサンプル組織中の高および低分子量ＲＮＡについてアッセイした。これらの結果は、蛍光データと一致した。５dpiでは、ＧＦＰ２１−２３ｎｔ ＲＮＡのレベルは、対照サンプル（ＧＦＰのみ）における２１−２３ｎｔ ＲＮＡのレベルと比べて、１９ｋＤａ、HcProおよび２５ｋＤａ−共同浸透組織において大きく低減（６倍以上）した。これらのＲＮＡは、対照サンプル（ＧＦＰのみ）と比べて、２ｂおよびＡｃ２−共同浸透サンプルにおいて少なくとも３倍少なかった。驚くべきことに、たったの一種（２３ｎｔ）のみは、Ｐ１−共同浸透組織において強力に影響された。１１dpiにおいて、２ｂ、Ａｃ２およびＰ１タンパクを用いて共同浸透させた組織において、より高レベルの２１−２３ｎｔ ＲＮＡが存在した。しかしながら、これらのレベルは、１９ｋ−およびHcPro−共同浸透組織において低く維持された。１１dpiにおいて、２５ｋＤａ−共同浸透組織の解析は、葉の壊死により妨げられた（上記参照）。
【０２１５】
以上の結果から、ＰＴＧＳのウイルスがコードするサプレッサーの一過的発現は、非トランスジェニック植物にアグロバクテリウムにより一過的に伝達された遺伝子の発現を劇的に増強すると結論付けることができる。
【０２１６】
10.3 非トランスジェニック植物における一過的発現を増強および安定化することに対するＰＴＧＳのサプレッサーの相加的効果
以上の実験を、ＧＦＰレポーター遺伝子と共に、サプレッサーの組合せを用いて繰り返した。サプレッサーを組み合わせることは、単に、個々のアグロバクテリウム培養物を共に混合し（飽和化培養物）、ＧＦＰ培養物においてそれらを組み合わせることにより達成された。種々の混合物の浸透後、より高レベルの緑色蛍光が、サプレッサーの以下の組合せを用いて達成されることを見出した：
（i）２ｂ＋Ｐ１は、個々の２ｂまたはＰ１浸透よりも多くの蛍光を与えた；
（ii）Ａｃ２＋Ｐ１は、個々のＡｃ２またはＰ１浸透よりも多くの蛍光を与えた；
（iii）Ａｃ２＋２ｂの組合せは、２ｂまたはＡｃ２のみで処理したものと比較して、蛍光の顕著な増加を示さなかった。
【０２１７】
また、ＧＦＰレポーター培養物と共に、（２ｂ＋HcPro＋Ａｃ２＋Ｐ１）の混合物を組み合わせた効果についても試験した。この場合には、強力な明るい緑色蛍光（１９ｋのみの効果に近い）が、浸透させた組織に観察され、１８日まで見ることができた。
【０２１８】
ウェスタンブロット解析を、観察された高レベルのＧＦＰを確認するためにこれらの葉のサンプルについて実施することができる。
【０２１９】
これらのサプレッサーの相加的／相乗的効果のさらなる試験として、（２ｂ＋HcPro＋Ａｃ２＋Ｐ１）サンプルにおける２１−２３ｎｔ ＲＮＡレベルを解析した。５dpiにおいて、これらのＲＮＡ種は、蛍光データによれば検出レベル以下であった。
【０２２０】
しかしながら、増強された遺伝子発現が、ＰＴＧＳのサプレッサーの組合せから得ることができることは既に明らかである。
【０２２１】
アグロバクテリウム一過的発現系における最小ＰＶＸ−ＧＦＰアンプリコンを用いたＰＴＧＳのサプレッサーの組合せ
ＰＶＸ−ＧＦＰ構築物は、コートタンパクオープンリーディングフレームをウイルスゲノムから取り出し、かくして植物におけるウイルス移動を妨げるように、先の実施例に記載されているように工作した。この構築物は、３５プロモーターおよびNosターミネーターの制御下にクローン化され、次いで、pBin19のＴ−ＤＮＡに導入された。このプラスミドを、pBin19バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡに挿入した。ヘルパープラスミドpCh32を有するアグロバクテリウム株c58c1を、このプラスミドとともにエレクトロポレーションした。
【０２２２】
次いで、3)に記載したＰＴＧＳの種々のサプレッサーと、最小ＰＶＸ−ＧＦＰアンプリコンを組み合わせ、非トランスジェニックN.benthamianaの葉に対応する培養物を導入した。極めて明るい緑色蛍光が、共同浸透させた組織に産生されることを見出した。この緑色蛍光は、ＰＴＧＳのサプレッサーとの組合せにおいてＧＦＰマーカー遺伝子を駆動させるために３５Ｓプロモーターを用いた場合（2)および3)に記載するように）よりも強かった。この結果は、ＰＶＸアンプリコンにより通常強力に活性化されるサイレンシングが、サプレッサーにより緩和されること、およびＧＦＰレポーター遺伝子を駆動させるsgRNAのウイルス複製、合成および翻訳を通じて強力な発現が生じうることを示唆する。
【０２２３】
実施例１１−非トランスジェニック植物においてタンパク合成を増強するＰＴＧＳのサプレッサーおよび一過的発現の使用
以下の二つの実施例は、遺伝子サイレンシングのサプレッサー（ここではＴＢＳＶのｐ１９タンパク）の使用が、如何に一過的発現アッセイでタンパク蓄積を劇的に増強および持続できるかについて例証する。以下に記載されている全ての実験を、非トランスジェニック植物において実施した。
【０２２４】
11.1 植物遺伝子ＣＤＰＫの発現
この実験の目的は、トマトカルシウム依存タンパクキナーゼのタバコホモローグの切り詰められた形態を一過的発現および検出することである（CDPK,Romeisら,2000）。過剰発現に用いた植物は、Nicotiana benthamianaであった。
【０２２５】
タバコＣＤＰＫのフラグメントに対応するｃＤＮＡ（添付 I）を３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下に、標準的な手法を用いて、pBin19バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡのSmaI部位に平滑末端フラグメントとして挿入した。この対応するプラスミドを、エレクトロコンピテントアグロバクテリウム細胞（ハイパービルレンスプラスミドpCh32を有する株c58c1）にエレクトロポレーションした。組み換え細菌（ＣＤＰＫ株と称する）を、２８度で増殖させ、一つの単離したコロニーを、飽和培養物を製造するために用いた。この培養物を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂に再懸濁し、上述したように、アセトシリンゴンで誘導した。誘導された培養物を、０．５の光学密度とした（６００ｎｍ）。
【０２２６】
アグロバクテリウム懸濁物を用いたN.benthamianaの葉の浸透後、ＣＤＰＫの蓄積を検出するためにタイムコース解析を行った。同様のタイムコース解析を、ｐ１９ ｃＤＮＡが３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下にクローン化されたpBin19バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム（ｐ１９株）の二次懸濁物と共同浸透させた組織から、平衡して実施した。この二次アグロバクテリウム培養物は、ＯＤ₆₀₀＝１．０で用いた。
【０２２７】
ＣＤＰＫの検出を、ウェスタンブロットにより、浸透組織から抽出した全タンパクの可溶化膜画分の１０μｇについて行った。ＨＡエピトープタグの配列(Nimanら,1983)を、ＣＤＰＫ ｃＤＮＡの３’末端に加え、カルボキシ末端エピトープ融合物を得た。ＨＡ抗体（Sigma）を、記載されているように（Romeisら,2000）、免疫検出に用いた。シグナルの定量を、MacBasソフトウェア(Koshin Graphics Systems Inc, USA)を用いて行った。
【０２２８】
結果
初期の時点（すなわち、接種後１．５日以前）では、ＣＤＰＫは、両方の実験的セットアップでは検出できなかった。しかしながら、１．５dpiから、ＣＤＰＫ株のみを用いて浸透させた組織から産生された検出可能な低レベルのＣＤＰＫが存在した。２dpiでは、これらのレベルは僅かに高いものであった（１．５dpiで前記レベルの２倍以上）。しかしながら、３dpi（そして５dpiまで）では、このシグナルは、ウェスタンブロット検出のレベル以下であり、ＣＤＰＫの切り詰められた形態が不安定であることを示した。さらに、シグナルは、空のpBin19ベクター（すなわちＴ−ＤＮＡに挿入物を含まない）を有するアグロバクテリウム培養物の一培養物を用いて浸透させた組織から抽出されたサンプルでは、いずれの時点でも全く検出されなかった。
【０２２９】
対照的に、１．５dpiには、アグロバクテリウムのｐ１９株と共に浸透させた組織のＣＤＰＫのレベルは、上記対照実験のものよりも既に少なくとも３倍高いものであった。２dpiでは、これらのレベルは、ＣＤＰＫのみで浸透させた組織よりも少なくとも５倍高いものであった。目立って、ＣＤＰＫは、ＣＤＰＫのみで浸透させたサンプルにおいて３dpi以降の時点では検出不能であったが（上記参照）、ｐ１９共同浸透組織に観察されたレベルは増大し、対照サンプルにおいて２dpiに観察された最大レベルよりも少なくとも１０倍高いものであった。ＣＤＰＫレベルの正確な定量化は、ｐ１９の存在下で形成された非常に高い量のタンパクにより損なわれ、シグナルの飽和を引き起こした。５０倍以上までのタンパクが産生されたと予想される。これらの高レベルのＣＤＰＫは、５dpiまたはそれ以上までに回収されたサンプルに検出可能であった。
【０２３０】
結論
ｐ１９の付加が、ＣＤＰＫ発現を劇的に増強しただけでなく、３dpi以降の時点でこのタンパクの分解を妨げるように見えた。かくして、この効果の最もらしい解釈は、ｐ１９タンパクが、その抗サイレンシング特性により、非常に高レベルのＣＤＰＫ ｍＲＮＡを細胞に蓄積させるということである。これらのｍＲＮＡは、植物のタンパク分解機構が飽和する程度にまで翻訳され、かくして過剰の不安定タンパクを最大にする。
【０２３１】
ｐ１９とＣＤＰＫ株の両方の飽和培養物の使用はより高レベルのタンパクを産生すると考えられる。
【０２３２】
11.2 植物耐性遺伝子の発現
この実施例は、一過的発現アッセイにおけるタンパク合成に対するｐ１９の効果がＣＤＰＫに特有のものでないことを示す。
【０２３３】
別のシリーズの実験では、ｐ１９の存在下でN.benthamianaに一過的に発現された二つのトマトタンパクの蓄積レベルを評価した。これら二つのタンパクは、Cf4およびCf9耐性遺伝子産物であり、トマトにCladosporium fulvumに対する耐性を付与するものである。
【０２３４】
これらの実験の原理は、上記と同じである。先ず、Cf4およびCf9をコードするｃＤＮＡを、ＴＡＰ（Rigautら,1999）エピトープＴＡＧの配列に融合させ（カルボキシ末端ＴＡＰ融合物を得る）、３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターの制御下に、pBin19のＴ−ＤＮＡに挿入した。得られたプラスミドを、その後、アグロバクテリウム細胞（ハイパービルレンスプラスミドpCh32を有するc58c1株）にエレクトロポレーションし、一つのコロニーを用いて、０．２の光学密度（６００ｎｍ）で培養物を生成し、それぞれ、Cf4TAPおよびCf9TAP株と称した。アグロバクテリウムのｐ１９株は上述したものであり、ＯＤ₆₀₀＝１．０で用いた。
【０２３５】
Cf4およびCf9の検出は、ウェスタンブロット解析により、浸透組織から抽出した全タンパクの１０μｇに対して行った。ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ抗体（Sigma）を、記載されているように（Romeisら,2000）免疫検出のために用いた。シグナルの定量は、MacBasソフトウェア（Koshin Graphics Systems Inc, USA）を用いて行った。
【０２３６】
結果
浸透後５日目の解析により、Cf4TAPおよびCf9TAPの両方が、対応するアグロバクテリウム株をｐ１９株の不在下で浸透させた場合に検出レベル以下であることが示された。しかしながら、ｐ１９培養物と共同浸透させたサンプルでは、両方のタンパクが容易に検出可能であった。
【０２３７】
実施例１２−非植物タンパクの発現の増強
この別のセットの実験では、クラゲAequoria victoriaの緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）の修飾ｃＤＮＡ（ＧＦＰ₅、Haseloffら,1997）を、標準的な技術を用いて、３５Ｓプロモーターとノパリン合成（nos）ターミネーターの制御下に、pBin19バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡにクローン化した。得られたベクターを、エレクトロコンピテントアグロバクテリウム（ハイパービルレンスプラスミドpCh32を含むC58c1株）にエレクトロポレーションした。これらの細菌を、実施例１０および１１に記載されているように、アセトシリンゴンを用いて増殖および誘導した。飽和培養物（ＧＦＰ株と称する）を用いて、野生型Nicotiana benthamianaの葉を浸透させた。
【０２３８】
平衡した組の実験では、このＧＦＰ株をアグロバクテリウムのｐ１９株と（等量で）混合し（実施例１−２参照）、得られた混合物を野生型Nicotiana benthamianaの葉を浸透させた。この実験では、ｐ１９株の培養物を、２．０の光学密度（６００ｎｍ）に設定した。
【０２３９】
さらに、高度に発現されたシングルコピーのＧＦＰトランスジーンを有する、二つの独立した、安定なNicotiana benthamiana形質転換体（ライン１６ｃおよび８, Ruizら, 1998; Voinnetら, 1998）を、これらの実験における基準として用いた。
【０２４０】
浸透組織におけるＧＦＰの蓄積を、ＵＶ照射下で終始評価した。ＧＦＰの定量化は、Invitrogenのウサギ抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫検出によるものであった。サンプルを、浸透後(dpi)４日目に回収し、全タンパクを抽出し、画分（３０μｌ）を記載（Romeisら, 2000）されているようにしてウェスタンブロットにより解析した。MacBasソフトウェア（Koshin Graphics Systems Inc, USA）を用いて定量を行った。
【０２４１】
結果
ＧＦＰ株のみを用いて浸透させた組織では、２−２．５dpiから５dpiまでに、視覚的に検出可能なＧＦＰの蓄積があった。その時点以降、緑色蛍光に低減があり、７dpiでは、浸透組織は、偽（水）浸透組織から区別できなかった。４dpiでは、二つの独立したサンプルに行ったウェスタンブロット解析は、ＧＦＰ発現におけるかかる急速な減退（一過的発現）にもかかわらず、二つの安定なトランスジェニック系統から抽出された同等の組織よりも少なくとも２倍のＧＦＰがあることを示した。この結果は、アグロバクテリウム介在性一過的発現が、安定なトランスフォーメーションによって得られたものより、一時的に高いタンパクレベルになりうることを示す。予想通り、水を浸透させた組織から抽出したサンプルには、全くＧＦＰが検出できなかった。
【０２４２】
アグロバクテリウムのｐ１９株を用いて共同浸透された組織では、ＵＶ光の下で強い緑色蛍光があり、これは１１日以上にわたって維持された。さらに、二つの独立したサンプルのウェスタンブロット解析により、４dpiにおいて、ＧＦＰ株のみを用いて浸透させた同様の組織と比べて、前記組織において少なくとも１０倍のＧＦＰが存在することが示された（パネルＡ）。
【０２４３】
結論
上記実施例と同様に、ｐ１９の効果は、外来タンパクの発現を、(i)劇的に増強、および(ii)持続するというものであった。また発現は、安定にトランスフォームした植物よりも、はるかに高いものであった。
【０２４４】
実施例１３−遺伝子サイレンシングのサプレッサーおよび一過的発現の組み合わせ使用は、酵素反応から得られた産物の合成を増強することを可能にする。
ＰＶＸ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（RdRp, Malcuitら,2000）のｃＤＮＡのフラグメントを、標準的な技術を用いて、修飾ＧＦＰ（ＧＦＰ₄、Haseloffら, 1997）をコードするｃＤＮＡの３’末端に融合させた。ポテトウイルスＹ（ＰＶＹ）のNiaプロテイナーゼの切断部位をコードする短い配列を、両方のｃＤＮＡの間に挿入した（Mestreら, 2000）。ＧＦＰ−ＲｄＲｐ融合ｃＤＮＡ（配列は以下）をpBinY53バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡに挿入した（Mestreら,2000）。得られたベクターを、エレクトロコンピテントアグロバクテリウム（ハイパービルレンスプラスミドpCh32を含むC58c1株）にエレクトロポレーションした。これらの細菌（ＧＦＰ−ＲｄＲｐ株と称する）を、実施例１、２および３に記載されているように、アセトシリンゴンを用いて増殖および誘導した。この構築物は、Niaプロテイナーゼの作用により有利のＧＦＰ₄を放出するNiaプロテイナーゼ切断部位を有する融合タンパク［ＧＦＰ₄アミノ末端／ＲｄＲｐカルボキシ末端］を生じるはずである。Proと称されるアグロバクテリウムの別株は、Niaプロテイナーゼのプロテアーゼドメインの発現を可能にするpBinYProバイナリーベクターを含むものであった（Mestreら,2000）。
【０２４５】
結果
ＧＦＰ−ＲｄＲｐ株の培養物の浸透は、ＵＶ照射下で視認できる緑色蛍光を何ら生じることがなく、これは、ＧＦＰ−ＲｄＲｐタンパク融合物がＧＦＰを不活性化したことを示している。しかしながら、アグロバクテリウムのPro株をＧＦＰ−ＲｄＲｐ株と混合した場合、緑色蛍光が、２dpiから５dpiまで、ＵＶ照射下で検出された。この結果は、pBinYproにより産生されたNiaプロテアーゼが融合ＧＦＰ−ＲｄＲｐタンパクを切断して、遊離のＧＦＰ₄を放出し、かくして緑色蛍光を生じていることを示している。
【０２４６】
上記アッセイを、アグロバクテリウムのｐ１９株の存在下で繰り返した。この実験に関して、Pro、ＧＦＰ−ＲｄＲｐ、およびｐ１９株の培養物を混合（１：１：１混合物）し、ＧＦＰの蓄積を終始評価した。３dpiに、浸透組織に強力な明るい緑色蛍光があった。この蛍光は、その後の時点で持続された。
【０２４７】
３dpiでのウェスタンブロット解析（実施例３に記載されているものと同様）は、Pro／ＧＦＰ−ＲｄＲｐ／ｐ１９の組合せを用いて浸透させた組織において産生された遊離のＧＦＰ₄のレベルが、Pro／ＧＦＰ−ＲｄＲｐを用いて浸透させた同様の組織におけるものよりも少なくとも６倍高いことを示した（パネルＢ９）。
【０２４８】
結論
ＧＦＰ−ＲｄＲｐタンパク融合物は、ＵＶ光の下で蛍光を発しない（これはおそらく、カルボキシ末端融合物がＧＦＰ₄タンパクの適切な折り畳みを妨げるからであろう）。この解釈は、Niaプロテイナーゼの存在下で緑色蛍光が回復し、遊離のＧＦＰ₄の蓄積を生じるという事実によって支持される。それゆえ、Pro／ＧＦＰ−ＲｄＲｐ／ｐ１９浸透組織における高レベルのフリーのＧＦＰ₄は、高レベルのＧＦＰ−ＲｄＲｐ融合タンパク基質をターゲットとするNiaプロテイナーゼの増強されたタンパク分解活性によるものと考えられる。植物細胞にＴ−ＤＮＡ構築物として導入された、これらの高レベルの酵素と基質の両方が、ｐ１９の抗サイレンシング特性から得られると考えられる。かくして、ＧＦＰ−ＲｄＲｐおよびPro ｍＲＮＡは高レベルで蓄積することができ、後に、高度に翻訳された。この実施例は、in plantaで複雑な生合成反応を急速に確立し、高度の量の特定の産物を産生するための浸透／抑制一過的アッセイの使用を例証する。
【０２４９】
【表１】

【０２５０】
「配列１」

【０２５１】
「配列２」

【０２５２】
「参考文献」

【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 実施例９およびその他で用いられるウイルス性およびトランスジーン構築物を示す。ＰＶＸ-ＧＦＰおよびＰＶＸ-ＧＦは、以前に記載されたとおりである（Ruizら,1998）。ＰＶＸベクターの挿入物の発現は、二本鎖コートタンパク（ＣＰ）プロモーターによって調節される。レプリカーゼＯＲＦは、ウイルスＲＮＡの複製に必須である；２５、１２および８ｋＤａのタンパクが、ウイルスＲＮＡの細胞−細胞間移動に厳密に必要とされる；ＣＰは、エンキャプシデーション、およびウイルスＲＮＡの細胞−細胞間および全身的移動に必須である。他の全てのウイルス構築物は、３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓターミネーターに結合されたＰＶＸ−ＧＦＰ構築物に基づき、かつ、pBin19バイナリーベクタープラスミドのＴ-ＤＮＡに挿入された。ＰＶＸ-ＧＦＰ-△ＣＰは、完全なＣＰ ＯＲＦにわたる欠失を有する；ＰＶＸ-ＧＦＰ-△ＴＧＢ-△ＣＰおよびＰＶＸ-ＧＦＰ-△ｒｅｐ-△ＣＰは、ＰＶＸ-ＧＦＰ-△ＣＰに基づき、それぞれ、ＴＧＢ ＯＲＦの全てにわたる欠失、およびレプリカーゼＯＲＦのインフレーム欠失を有する。ＰＶＸ-ＧＦＰ-△８ｋ-△ＣＰは、８ｋＤａ ＯＲＦの翻訳を妨げるフレームシフト変異を有する。
【図１ｂ】 ＰＶＸ-ＧＦＰ-△１２ｋ-△ＣＰおよびＰＶＸ-ＧＦＰ-△２５ｋ-△ＣＰ構築物は、それぞれ１２ｋＤａおよび２５ｋＤａのＯＲＦに欠失を有する。ＰＶＸ-ＧＦＰ-２５ｋ_FS-△ＣＰは、“ＦＳ”によって示される２５ｋＤａ ＯＲＦにフレームシフト変異を有する（詳細については“実験方法”参照）。３５Ｓ-ＧＦＰ構築物は、以前に記載されているものである。３５Ｓ-２５ｋおよび３５Ｓ-２５ｋ-△ＡＴＧ構築物は、３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネーターに結合したＰＶＸ ２５ｋＤａ ＯＲＦに基づき、pBin19のＴ-ＤＮＡに挿入されている。２５ｋＤａ ＯＲＦの開始コドンは、“△ＡＴＧ”により示されているように、３５Ｓ-２５ｋ-△ＡＴＧにおいて除去されている。ＬＢおよびＲＢは、それぞれ、pBin19 Ｔ-ＤＮＡの左右の境界を示す。
【図２】 ＧＦＰサイレンシングシグナルの全身的移動−ＧＦＰ全身的サイレンシングの動力学に対するＴＧＢタンパクの効果。グラフの各点は、ＵＶ照明下で評価されるＧＦＰ全身的サイレンシングを示す植物のパーセントを示す。平均値は、各処理毎に、３回の独立した実験で試験した３０の個別の植物に由来する。数枚の葉の葉脈の近くの小さい領域に全身的サイレンシングが制限される場合でも（すなわち、２１dpiのパネル(panel)Ｂ２）、植物はサイレンシングを受けたと評価した。全てのＰＶＸ-ＧＦＰ-△ＴＧＢ-△ＣＰ-接種植物が、２１dpiにおいて強い全身的サイレンシングを示した。
【図３】 ｐ２５の作用形式に関するモデル。
（Ａ）以前に提案されている（Dalmayら,2000）、ＰＴＧＳ経路の二つのＳＤＥ１-依存性およびＳＤＥ１-独立性分岐経路。ＳＤＥ１-独立性分岐経路では、ウイルス性ＲＮＡは、ウイルスがコードするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ウイルスRdRp）により二本鎖ＲＮＡ（ウイルスdsRNA）にコピーされる。トランスジーン転写物は、ＳＤＥ１に関係する一連の工程を通してdsRNAへと処理される。ウイルスdsRNAとトランスジーンdsRNAの両方が、２１−２５ｎｔ（現在は２１−２３ｎｔであると考えられる）ＲＮＡへと処理され、ＰＴＧＳの媒介となる配列特異的ヌクレアーゼに特性を与える（Zamoreら,2000）。このモデルでは、ＳＤＥ１−依存性分岐経路がウイルスＲＮＡにより影響されないことに注意すべきである。
（Ｂ）局部的および全身的サイレンシングに与えるｐ２５の影響に基づいたＰＴＧＳの洗練されたモデル。このモデルは、ＳＤＥ１依存性分岐経路へのウイルスＲＮＡの参与を認識している。この分岐経路は、全身的ＰＴＧＳシグナルの産生に関与し、ＰＶＸがコードするｐ２５によって抑制される。

Claims (14)

1. 植物においてターゲットヌクレオチド配列からのＰＴＧＳサプレッサータンパク質不在での発現と比較して増強された一過性発現を達成する方法であって、前記植物に、植物ウイルス由来転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）サプレッサータンパクをコードする遺伝子と共にプロモーターに機能的に結合したターゲットヌクレオチド配列を含むターゲット核酸構築物を、一過的発現のために伝染性でなく、かつ、可動性でないアグロバクテリウムベクターにより導入する工程を含み、前記サプレッサータンパクが前記植物中の前記構築物からの一過性の発現を増強する、方法。
2. 構築物が複製の起点を含まない、請求項１記載の方法。
3. 核酸構築物が、（ａ）所望のヌクレオチド配列を植物細胞ゲノムに転移させる境界配列；（ｂ）プロモーターに機能的に結合したターゲットヌクレオチド配列及び／または植物ウイルス由来転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）サプレッサータンパクをコードする遺伝子を含む発現カセットを含む所望のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
4. サプレッサータンパクが、そのサプレッサータンパクをコードするヌクレオチド配列を含む核酸から発現されることによって細胞に導入される、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
5. ターゲットヌクレオチド配列を含む第一（ターゲット）核酸が、サプレッサータンパクをコードする第二（サプレッサー）核酸と共に用いられる、請求項４記載の方法。
6. 植物の組織に、ターゲットヌクレオチド配列を含む第一核酸とＰＴＧＳサプレッサータンパクをコードする第二核酸とを同時に導入する工程を含み、前記第一および第二核酸が、単一のバイナリーベクター構築物内に含まれるか、あるいは、前記第一および第二核酸配列が、それぞれ第一バイナリーベクターおよび第二バイナリーベクター構築物内に含まれる、植物においてターゲットヌクレオチド配列のＰＴＧＳサプレッサータンパク質不在下における発現と比較して増強された一過性の発現を達成するための、請求項５記載の方法。
7. 以下の工程：
   （i）植物の組織に、一過的発現のための、ターゲットヌクレオチド配列を含む第一核酸および植物ウイルス由来ＰＴＧＳサプレッサータンパクをコードする第二核酸を導入する工程であって、いずれもプロモーターに機能的に結合されており、
   それぞれの核酸が、植物に共導入される別個のバイナリーベクター構築物中に存在するか、又は第一核酸及び第二核酸が、単一のバイナリーベクター構築物中に存在する、工程、
   （ii）一定の期間にわたって、サプレッサーおよびターゲットタンパクを核酸から発現させる工程であって、ここで前記サプレッサーがターゲットタンパクをコードするｍＲＮＡの分解を阻害する工程、
   （iii）少なくとも、ターゲットタンパクが発現された組織を回収する工程
   を含む、ターゲットタンパクを生成する方法。
8. 第一核酸が、二以上のターゲットヌクレオチド配列を含む、請求項５ないし７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記一定の期間が、３から１５日、さらに好ましくは３から１０日、さらに好ましくは４から７日の間である、請求項７記載の方法。
10. 植物組織が、一枚の葉または数枚の葉である、請求項７ないし９のいずれか一項に記載の方法。
11. サプレッサータンパクが、ポテトウイルスＸ(pvx)ｐ２５タンパク；アフリカキャッサバモザイクウイルス（acmv）ＡＣ２タンパク；イネ黄斑ウイルス（rymv）Ｐ１タンパク；トマトブッシー発育阻害ウイルス（tbsv）１９Ｋタンパク；またはこれらと少なくとも９５％の配列同一性を有するこれらのいずれか一つのサプレッサー機能を有するバリアントからなるリストから選択される、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
12. プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 発現が、ＰＴＧＳサプレッサータンパク質不在下におけるターゲットタンパク質の発現と比較して少なくとも２５−５０％、５０−１００％、５、１０、１５または２０倍以上増強される、請求項１ないし６または１１のいずれか一項に記載の方法。
14. ターゲット遺伝子またはヌクレオチド配列が、昆虫耐性タンパク；疾患耐性タンパク；除草剤耐性タンパク；哺乳動物タンパクであるターゲットタンパクをコードする、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法。

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