JP7246644B2 - 肺炎球菌表面プロテインaの選択されたアルファヘリカルドメインおよびプロリンリッチドメインを組み合わせた肺炎球菌ワクチン - Google Patents
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Description
本出願は、2016年12月3日付けで出願された米国仮特許出願第62/429,782号の優先権の利益を主張し、該仮特許出願はあらゆる目的のために本出願中に包含されている。
本発明は、NIH/NIAIDによって付与された認可番号R01AI118805号および2R56AI021548号に基づく政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本出願は、ASCIIフォーマットで同時に提出された配列表を含有し、その全体が本明細書の一部として組み入れられる。
本発明の実施形態は、組換え肺炎球菌タンパク質、それを発現する組換え遺伝学的コンストラクト、ならびにそのタンパク質を含む抗原、免疫原、およびワクチンに関する。
PRDは、通常60から100アミノ酸の間の長さの比較的短いポリペプチドである。PRDは、aHDの末端、つまり、PRD内およびPRD間で反復する数々のモチーフを形成する他のアミノ酸が散在した、一連のプロリンの第1のプロリンで始まる。PRDは、典型的には(ただし限定されないが)、アミノ酸残基PKTで終わるとみなされる。図1を参照されたい。本発明者らは、米国立医学図書館によりオンラインで提供されたBLASTサーバーに投稿された208種の完全PspA配列のうち124種の固有なPspA配列を同定し分析した。これらのPspA配列は、公開データベースで入手可能なほとんどの固有なPspAゲノム配列を占める。これらの124種のポリペプチド配列に、本発明者らは、これまでに分析されたが(Hollingsheadら、2000)、国立医学図書館オンラインBLASTサーバーから得られたものに包含されていない12種のPspAポリペプチド配列を追加した。本発明者らは、これらの136種の全PspAアミノ酸配列からPRD配列を抽出し、Geneious v7.1.7でBlosum30アミノ酸マトリックスを使用してそれらを並べた。その後、本発明者らは、近隣結合(NJ)方法を使用して系統樹を構築した。
PETPAPAPAPAPAPAPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPAPAPAPKPAPAPKPAPAPAPAPAPAPKPEKPAEKPAPAPKPETPKT(配列番号12)。
PETPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPKPAPAPKPAPAPKPAPAPAPAPAPKPEKPAEKPAPAPKPETPKT(配列番号13)。
PEKPAPAPETPAPE(配列番号157)。
PDGDEEETPAPAPQPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAKPEKPAEEPTQPEKPATPKT(配列番号14)。
PDGDEEETPAPAPQPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAKPEKPAEEPTQPEKPATPKT(配列番号15)。
PEKPAEETPAPAPKPEQPAEQPKPAPAPQPAPAPKPEKTDDQQAEEDYARRSEEEYNRLPQQQPPKAEKPAPAPKPEQPVPAPKT(配列番号16)。
QQAEEDYARRSEEEYNRLPQQQ(配列番号10)。
クレード定義領域(CDR)は、通常aHD中で最終的におよそ100アミノ酸からなり、これは、aHD内の最も高い抗原性を有するドメインであると考えられた。McDanielら、17 Microb.Pathog.323(1994);Rocheら、2003;Vadesilhoら、21 Clin.Vaccine Immunol.940(2014)。実施例1に記載の通りに同定された124種の固有なPspAゲノム配列を使用して、本発明者らは各配列由来のaHDを抽出した。この情報に、本発明者らは、これまでに分析した12種のaHD配列の情報を追加した(Hollingsheadら、2000を参照)。本発明者らは、Geneiousアライメント(Blosum62マトリックスを用いたグローバルアライメント)を一部使用したGeneiousソフトウェアプラットフォーム(v7.1.7、Biomatters Ltd.、ニュージーランド)で合計136種の固有なaHDのCDRを並べ、次いで本発明者らは、Geneiousツリービルダープラグインを使用して系統樹を作り出した(ツリー構造、図2に記載の通り)。近隣結合(NJ)方法をJukes Cantor遺伝子距離モデルと共に使用して系統樹を作製した。
LKEIDESESEDYAKEGFRAPLQSKLDARKAKLSKLEELSDKIDELDAEIAKLEDQLKAAEENNNVEDYFKEGLEKTIAAKKAELEKTEADLKKAVNE(配列番号25)。
LKDINESDSEDYVKEGLRAPLQSELDTKKAKLLKLEELSGKIEELDAEIAELEVQLKDAEGNNNVEAYFKEGLEKTTAEKKAELEKAEADLKKAVDE(配列番号26)
を有する株:DBL5、CGSP14、GA47439のうちの1つに由来するaHDを選択してもよいし、または以下のほぼ相同なCDR配列:
LKEIDESDSEDYIKEGFRAPLQSELDTKKAKLLKLEELSGKIEELDAEIAELEVQLKDAEGNNNVEAYFKEGLEKTTAEKKAELEKAEADLKKAVDE(配列番号27)
を有する株ND6012からのaHDを選択してもよい。
LAKKQTELEKLLDSLDPEGKTQDELDKEAEEAELDKKADELQNKVADLEKEISNLEILLGGADSEDDTAALQNKLATKKAELEKTQKELDAALNELG(配列番号32)。
LEKVLATLDPEGKTQDELDKEAAEAELNEKVEALQNQVAELEEELSKLEDNLKDAETNNVEDYIKEGLEEAIATKKAELEKTQKELDAALNELG(配列番号59)
であり;
その完全なEF5668のaHDのアミノ酸配列は配列番号60として示される。
LEKAEAELENLLSTLDPEGKTQDELDKEAAEAELNKKVEALQNQVAELEEELSKLEDNLKDAETNNVEDYIKEGLEEAIATKQAELEKTQKELDAALNELG(配列番号61)。
LEKAEAELENLLSTLDPEGKTQDELDKEAAEAELNKKVEALQNQVAELEEELSKLEDNLKDAETNNVEDYIKEGLEEAIATKKAELEKTQKELDAALNELG(配列番号63)。
LKEIDESDSEDYIKEGLRAPLQSKLDAKKAKLSKLEELSDKIDELDAEIAKLEKDVEDFKNSDGEQAEQYLVAAKKDLDAKKAELENTEADLKKAVDE(配列番号65)。
LKEIDESDSEDYVKEGLRAPLQSELDAKQAKLSKLEELSDKIDELDAEIAKLEKNVEDFKNSNGEQAEQYRAAAEEDLAAKQAELEKTEADLKKAVNE(配列番号76)
を有するCDRにおいて実質的な同一性を有する。
LKGIDESDSEDYVKEGLRAPLQSELDAKRTKLSTLEELSDKIDELDAEIAKLEKNVEYFKKTDAEQTEQYLAAAEKDLADKKAELEKTEADLKKAVNE(配列番号77)
を有する共通のCDRを有する。
LEDAELELEKVLATLDPEGKTQDELDKEAAEDANIEALQNKVADLENKVAELDKEVTRLQSDLKDAEENNVEDYVKEGLDKALTDKKVELNNTQKALDTAQKALDTALNELG(配列番号80)。
組換えaHD-PRDコンストラクトのアミノ酸配列を、実施例1および2に記載の実施形態に従って設計した。発現のために、3つの特定のaHD-PRDコンストラクトを選択した。ここで1つのコンストラクトは、クレード1または2のいずれか由来のファミリー1のaHDを含み、2つのコンストラクトは、ファミリー2由来のaHDを含み、そのうち一方はクレード3由来であってもよく、残りのaHDは、クレード4または5のいずれか由来であってもよい。
個々のaHD-PRDコンストラクトを含む筋肉内(IM)投与のための製剤をアラムアジュバントを用いて調製した。このアラム製剤は、実施例3に記載される個々のaHD-PRDコンストラクトを水酸化アルミニウム(Al(OH)3)ゲルに記載された通りに吸収させることによって作製した。Lindblad、82 Immuno.Cell Biol.497(2004)。
IN製剤のための送達担体は、カチオン性コレステリル基を有するプルラン(cCHPまたはナノゲル)を含有していた。プルランは、マルトトリオースのポリマーである。cCHPの産生は公知であり、他所より提供されている。例えば、Ayameら、19 Bioconj.Chem.882(2008);Nochiら、2010を参照されたい。工程は、酵母発現系を使用してプルランを製造すること、未加工の分子を50kDから100kDの質量に短くすること、コレステリル基(100グルコース単位当たり約1.1~1.6個)を共有結合させること、およびカチオン性アミノ基(100グルコース単位当たり約20個)を共有結合で付加すること、を含んでいる。
3つのaHD-PRDコンストラクトでのマウスの免疫は、個々の成分であるコンストラクトそれぞれに対して強い血清IgG応答を惹起し、免疫化コンストラクトのものと異なるaHDを有するS.pneumoniae株に対しても防御的な交差反応性免疫性を惹起した。これは、IMおよびIN(ナノゲル)の両方での投与後に達成された。
さらなる実験から、グループ2のPRD配列をPRDグループ1または3からの短いPRD配列で置換すること、またはPRD配列を全く含まないことも、より一層優れた免疫応答をもたらす可能性があることが示唆された。グループ3の15種のPRDの最初の14個のアミノ酸残基であるPEKPAPAPETPAPE(配列番号157)間の相同性を考慮して(実施例1および表3での考察を参照)、肺炎球菌株D39のaHDからなるaHD-PRDコンストラクトを、該PRDフラグメントを用いて構築した。このコンストラクトをPspA01.3(配列番号158を参照)と指定した。このコンストラクトは、肺炎球菌の天然に存在するD39株のPspAタンパク質のフラグメントを包含し、これは、動物モデルで防御免疫を誘導する可能性がある。Fukuyamaら、2015を参照されたい。
Claims (18)
- Streptococcus pneumoniaeの肺炎球菌表面プロテインA(PspA)タンパク質のアルファヘリカルドメイン(aHD)およびプロリンリッチドメイン(PRD)からなる、少なくとも2つの組換えaHD-PRDタンパク質コンストラクトを含む組成物であって、
前記2つの組換えaHD-PRDコンストラクトのaHDおよびPRDが、各々、下記の工程(a)および(b)で選択され、
(a)第1のaHD-PRDコンストラクトについてPspAの第1のファミリー内の第1のクレードから第1のaHDを選択し、第1のPRDグループから第1のPRDを選択する工程、
(b)第2のaHD-PRDコンストラクトについてPspAの第1または第2のファミリー内の第2のクレードから第2のaHDを選択し、第2のPRDグループから第2のPRDを選択する工程、
前記第1および第2のPRDグループは、各々、
配列番号14、配列番号15、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号126、配列番号127および配列番号128で表されるアミノ酸配列からなるPRDグループ1、
配列番号12、配列番号13、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103 および 配列番号104で表されるアミノ酸配列からなるPRDグループ2、または、
配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号95、配列番号114、配列番号125、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156および配列番号157で表されるアミノ酸配列からなるPRDグループ3、から選択され、
前記少なくとも2つの組換えaHD-PRDコンストラクトの第1のaHDが、PspAファミリー1のクレード1から選択され、前記少なくとも2つの組換えaHD-PRDコンストラクトの第2のaHDが、PspAファミリー2のクレード3、4または5から選択され、
前記組成物は抗原性または免疫原性を有し、および、前記組成物は天然に存在しない、前記組成物。 - 前記少なくとも2つの組換えaHD-PRDコンストラクトの各々が、そのC末端でPRDに連結されている1つのaHD、またはそのN末端でPRDに連結されている1つのaHDを含む、請求項1記載の組成物。
- 第3のaHD-PRDコンストラクトをさらに含む組成物であって、該第3のaHD-PRDコンストラクトの第3のaHDが、前記(a)または(b)の工程で選択されたクレードまたはファミリーと異なるクレードまたはファミリーから選択され、第3のPRDが第3のPRDグループから選択される、請求項1または2のいずれかに記載の組成物。
- 第1の組換えaHD-PRDタンパク質コンストラクトの第1のaHDが、PspAファミリー1のクレード1から選択され、第2の組換え免疫原性aHD-PRDタンパク質コンストラクトの第2のaHDがPspAファミリー2のクレード3、4または5から選択され、第3の組換えaHD-PRDタンパク質コンストラクトの第3のaHDがPspAファミリー2の1つのクレードであって第2の組換え免疫原性aHD-PRDタンパク質コンストラクトで選択されたクレードと異なるクレードから選択される、請求項3記載に記載の組成物。
- 前記aHD、前記PRD、またはその両方が、天然に存在するいずれのaHDタンパク質またはPRDタンパク質またはポリペプチドとも同一ではないが、免疫原性を強化するアミノ酸の置換、欠失、または付加を包含する、請求項1から4のいずれかに記載の組成物。
- 前記少なくとも2つの組換えaHD-PRDコンストラクトのaHDが、配列番号33~配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66~配列番号75、配列番号78、配列番号79または配列番号81から選択されるアミノ配列からなる、請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの組換えaHD-PRDコンストラクトのアミノ配列が、配列番号3または配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるか、または配列番号3または配列番号4に示される配列に少なくとも90%同一なアミノ酸配列からなる、請求項1から6のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1から7のいずれかに記載の組成物を含むワクチン。
- アジュバントをさらに含む、請求項8に記載のワクチン。
- 筋肉内投与のために製剤化された、請求項8または9に記載のワクチン。
- 粘膜投与のために製剤化されており、該粘膜投与は、鼻腔内、経口または気管支投与である、請求項8または9に記載のワクチン。
- 粘膜投与のための親水性多糖類中に封入された、少なくとも1つのaHD-PRDコンストラクトを含み、該親水性多糖類は、カチオン性コレステリル基を有するプルラン(cCHP)を含むナノゲルである、請求項11に記載のワクチン。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物に含まれる組換えaHD-PRDコンストラクトの1つをコードする組換え核酸分子。
- 請求項13に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項14に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 組換え免疫原性aHD-PRDタンパク質コンストラクト中への組み入れのために、肺炎球菌表面プロテインA(PspA)のアルファヘリカルドメイン(aHD)およびPspAのプロリンリッチドメイン(PRD)を選択するためのプロセスであって、
(a)PspAの第1のファミリー内の第1のクレードから第1のaHDを選択し、第1のPRDグループから第1のPRDを選択する工程;および、
(b)PspAの第1または第2のファミリー内の第2のクレードから第2のaHDを選択し、第2のPRDグループから第2のPRDを選択する工程;および任意選択で、
(c)工程(a)または(b)で選択されたクレードまたはファミリーと異なるクレードまたはファミリーから第3のaHDを選択し、第3のPRDグループから第3のPRDを選択する工程であり、
前記の第1から第3のPRDグループは、各々、
配列番号14、配列番号15、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号126、配列番号127および配列番号128で表されるアミノ酸配列からなるPRDグループ1、
配列番号12、配列番号13、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103 および 配列番号104で表されるアミノ酸配列からなるPRDグループ2、または、
配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号95、配列番号114、配列番号125、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156および配列番号157で表されるアミノ酸配列からなるPRDグループ3、からそれぞれ選択される、
を含む、プロセス。 - 少なくとも1つのaHDが、PspAファミリー1のクレード1または2から選択され、任意選択で、少なくとも1つのaHDが、PspAファミリー2のクレード3、4または5から選択される、請求項16に記載のプロセス。
- 少なくとも1つのaHDが、PspAファミリー1のクレード1または2から選択され、少なくとも1つのaHDが、PspAファミリー2の第1のクレードから選択され、少なくとも1つのaHDが、PspAファミリー2の第2のクレードから選択される、請求項16に記載のプロセス。
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