KR20230163500A - 면역원성 융합 단백질 - Google Patents

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KR20230163500A
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피셔 페르 보 페덜슨
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미네르박스 에이피에스
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Abstract

본 발명은 다음과 같은 서열 파트로 구성된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 면역원성 융합 단백질에 관한 것이다: i. 아미노산 170-178개, 바람직하게는 아미노산 174-175개로 구성되고, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인, 제1 아미노산 서열 파트; ii. 아미노산 165-174개, 바람직하게는 아미노산 169-170개로 구성되고, 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인, 제2 아미노산 서열 파트; 및 선택적으로, iii. 상기 제1 아미노산 서열 파트를 상기 제2 아미노산 서열 파트와 분리하는, 아미노산 1-20개로 이루어진 링커 아미노산 서열 파트. 면역원성 융합 단백질은 바람직하게는 아미노산 335-372개, 바람직하게는 아미노산 343-353개, 더 바람직하게는 아미노산 343-347개로 구성된다. 본 발명은 또한 면역원성 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 벡터; 숙주 세포; 백신; 및 B군 스트렙토코커스 감염에 대한 백신 접종 또는 B군 스트렙토코커스 감염에 대한 치료 방법에 관한 것이다. 도 3을 요약과 함께 공개할 것을 제안한다.

Description

면역원성 융합 단백질
본 발명은 미생물학 및 백신 기술 분야에 관한 것이며, B군 스트렙토코커스 감염 (B Streptococcus infection)에 대해 면역을 부여할 수 있는 면역원성 융합 단백질의 개발에 대한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 침습성 B군 스트렙토코커스 균주에 대해 면역을 부여하는 면역원성 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 면역원성 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 벡터; 숙주 세포; 백신; B군 스트렙토코커스 감염에 대해 백신 접종하거나 또는 B군 스트렙토코커스 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
B군 스트렙토코커스 (스트렙토코커스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae))(GBS)는 신생아기에 뇌수막염을 비롯한 침습성 박테리아 감염의 주요 원인이다. 미국에서만도 현재 이 박테리아로 인한 침습성 질환은 연간 약 5000건에 달한다. 이 감염은 전체 사망율이 약 10%이고, 살아남은 신생아 다수에는 영구적인 신경학적 후유증을 남긴다. 이런 관점에서, GBS가 감염을 유발하는 기전을 분석해 치료 및 예방 방법을 찾는데 많은 노력들이 이루어져 왔다.
또한, GBS는 경제적으로 상당히 중요한 소 질병인 유방염을 젖소에 유발할 수 있다. 그래서 GBS 감염에 대한 백신 개발은 수의학에서도 관심을 끌고 있다.
전체 여성의 약 20%가 질내 GBS 보균자로, 이 박테리아로 인한 신생아 질병 감염의 가장 흔한 원인은 아마도 산모 생식기로부터의 수직 감염이다. 그러나, 출산시 GBS에 의해 감염된 신생아는 약 1%만 심각한 감염을 앓게 된다. 즉, 출산시 박테리아 노출이 아닌 다른 원인이 신생아 질환 발병에 기여할 것이다.
B군 스트렙토코커스 균주는 다당류 피막 (polysaccharide capsule) 구조를 기초로 9가지 혈청형 (Ia, Ib 및 II-VIII)으로 나뉜다. 4종의 "고전적인" 혈청형 Ia, Ib, II 및 III는 정상 세균총의 균주들에서 대략 동일한 비율로 나타나지만, 타입 III는 특히 대부분의 뇌수막염 사례를 유발하는 임상적으로 가장 중요한 혈청형이다. 피막은 공지된 병독성 인자로, 특히 III 형 균주에서 상당히 상세히 연구되어 있다. III형 다당류 피막을 필수 성분으로 하는 백신 개발에 노력이 이루어지고 있다.
EP 0 866　133은 B군 스트렙토코커스에 의해 유발된 감염으로부터 수여체를 보호할 수 있는 백신을 개시하고 있다. 이 발명은 다당류와 엡실론 단백질 단편의 조합물의 용도에 관한 것이다. 여기에는, 타입-특이적인 피막이 B군 스트렙토코커스 감염에 대한 면역에 중요한 역할을 담당함을 시사하는 역학 데이터가 추가로 개시되어 있다 (7쪽 2-3번행 참조). 아울러, 이 출원에는 여러 가지 단백질과 다당류 간의 여러 조합들이 언급되어 있지만, 청구항 전체는 다당류를 포함하여 특정 성분의 중요성을 나타낸다. 하지만, 백신으로서 다당류 피막의 사용은 인간 조직과의 교차 반응으로 인해 문제를 일으킬 수 있다 (Pritchard et al., Infect Immun 1992. 60: 1598). 따라서, 다당류가 아닌 단백질에 기반한 백신을 개발할 수 있다면 매우 유익할 것이다.
문헌 Gravekamp et al., Infection and Immunity, Dec 1997, p 5216-5221은 면역원성 평가뿐 아니라 알파 (α) C 단백질의 반복 개수와 N-말단 부분 단독의 보호를 개시하고 있다. 면역원성은 반복체의 개수 증가에 따라 감소하는 것으로 나타나 있다 (도 2B 참조). 그러나, 보호 분석에서, N-말단 영역에 대한 항체가 N-말단 영역에 대한 항체와 비교해 보호에 주로 역할을 하는 것으로 또한 밝혀져 있다 (5219쪽 왼쪽 열 하단으로부터 6번째 행, 그리고 5220쪽 오른쪽 열 26-29번 행).
WO 9410317은 접합 백신의 개발에 GBS 표면 단백질로서 알파 단백질의 사용을 언급하고 있다. 이 단백질의 단점은 다수의 심각한 GBS 감염의 요인인 III형 균주에서는 일반적으로 발현되지 않는다는 것이다. 그래서, 알파 단백질 백신으로는 이 균주에 대해 보호 면역을 형성하지 못할 것이다.
WO 9421685는 백신 개발에 GBS 표면 단백질로서 Rib 단백질의 사용을 언급하고 있다. 이 단백질은 알럼과 함께 투여시 면역을 형성한다. 그러나, Rib 단백질은 전체 GBS 균주에 대해 보호 면역을 유발하지 못하는 단점이 있다.
문헌 Lindahl et al, Nonimmunodominant Regions Are Effective As Building Blocks In A Streptococcal Fusion Protein Vaccine, Cell Host & Microbe 2, 427-434, December 2007은 B군 스트렙토코커스 표면 단백질 Rib 및 AlpC의 N-말단 영역을 포함하는 융합 단백질을 개시하고 있다.
마찬가지로, WO 2008127179는 B군 스트렙토코커스 표면 단백질의 하나 이상의 제2 N-말단 영역 단편 또는 유사체, 상동체, 유도체 또는 면역학적으로 관련 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편과 융합된, B군 스트렙토코커스 표면 단백질의 하나 이상의 제1 N-말단 영역 단편 또는 유사체, 상동체, 유도체 또는 면역학적으로 관련 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하되, B군 스트렙토코커스 표면 단백질의 제1 및 제2 하나 이상의 N-말단 영역이 각각 서로 다른 B군 스트렙토코커스 균주로부터 유래하고, 융합 단백질이 B군 스트렙토코커스에 대해 보호 면역을 유발할 수 있는, 융합 단백질을 기술하고 있다.
GBS 질환을 예방하는데 적합한 백신 개발에서의 진보에도 불구하고, GBS 감염을 예방 및 치료하기 위한 추가적인 방법 및 백신에 대한 요구는 여전히 존재한다. 따라서, 광범위한 GBS 균주에 대해 보호 면역을 유발할 수 있는 백신 전략을 탐구할 필요성이 남아있다.
이에, 본 발명의 주요 과제는 GBS 감염에 대해 보호 면역을 유발할 수 있는, 백신에 이용가능한 면역원성 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 과제는 임상적으로 중요한 다수의 GBS 균주들에 대해 보호 면역을 유발하는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 GBS 감염에 대해 보호 면역을 유발하는 한종 또는 수종의 면역원성 융합 단백질을 포함하는 백신을 제공하는 것이다. 한종 또는 수종의 단백질은 많은 수의 단백질들로 구성된 백신에 비해 몇몇 이점, 예를 들어 생산 단가 및 안전성 이점을 가진다.
본 발명의 추가적인 과제는 GBS에 대해 개선된 보호를 제공할 수 있는 면역원성 융합 단백질을 제공하는 것이다.
이러한 과제뿐 아니라 기타 과제를 각각 달성하기 위한 수단은 후술한 본 발명의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 WO 2008127179에 개시된 융합 단백질에 대한 본 발명자들의 추가적인 연구를 기반으로 한다. 구체적으로, Rib 및 AlpC의 N 말단 영역의 더 짧은 아미노산 서열을 가진 면역원성 융합 단백질이 적합하다는 것을 알게 되었다. 이러한 면역원성 융합 단백질은 백신 접종용으로 생산 및 이용하기 더 용이할 수 있다. 나아가, 실시예 4 및 6에 나타낸 바와 같이, 이러한 더 짧은 융합 단백질은 특히 내피 세포의 부착 및/또는 침입에 대해 향상된 보호를 제공함으로써 GBS에 대한 개선된 보호를 제공할 것이다.
아울러, 면역원성 융합 단백질을 코딩하는 코돈 최적화된 상응하는 핵산 분자를 고안하였다. 이는 벡터에 제공될 수 있다. 이후, 숙주 세포가 이러한 면역원성 융합 단백질을 발현할 수 있거나 또는 벡터를 포함할 수 있다. 면역원성 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포는 각각 백신에 이용 가능하다. 면역원성 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 백신은 B군 스트렙토코커스 감염을 치료하거나 또는 B군 스트렙토코커스 감염에 대한 백신 접종 방법에 추가로 이용할 수 있다.
이에, 본 발명의 제1 측면은
i. 아미노산 170-178개, 바람직하게는 174-175개로 구성되고 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인, 제1 아미노산 서열 파트;
ii. 아미노산 165-174개, 바람직하게는 169-170개로 구성되고 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인, 제2 아미노산 서열 파트; 및 선택적으로:
iii. 제1 아미노산 서열 파트를 제2 아미노산 파트와 분리하는 아미노산 1-20개로 이루어진 링커 아미노산 서열 파트로 구성된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되고,
아미노산 335-372개, 바람직하게는 아미노산 343-353개, 더 바람직하게는 아미노산 343-347개로 구성되는 면역원성 융합 단백질에 관한 것이다.
전술한 바와 같이, 면역원성 융합 단백질은 백신 접종을 위해 생산하고 이용하기 더 용이할 수 있다. 면역원성 융합 단백질은, 보강제 없이도 면역원성인 이점이 있지만, 면역원성을 높이기 위해 알럼 또는 알루미늄 하이드록사이드 (AlOH)와 같은 보강제와 함께 사용할 수도 있다.
면역원성 융합 단백질과 관련한 다른 이점은 Alp1 및 Alp2의 N-말단 영역을 포함하는 추가의 면역원성 융합 단백질과 조합 가능하다 것이다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 이러한 면역원성 융합 단백질 2종의 조합은 이러한 조합을 면역화에 이용할 경우 달성되는 개수의 항체 (항체 역가)에 대해 상승적인 효과를 제공한다.
본 발명은 아래에서 더욱 상세히 기술될 것이다.
도 1은 보강제와 함께 또는 보강제 없이 여러가지 투여량에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 어느 하나의 면역원성 융합 단백질을 단독으로 또는 본 발명의 제5 측면에 따른 백신에 의해 포괄되는 바와 같은 추가의 면역원성 융합 단백질과 조합하여, 한가지 용량으로 사용해 면역화한 후, 29일 시점에 IgG 배수 증가가 달성됨을 보여준다.
도 2는 보강제와 함께 또는 보강제 없이 여러가지 투여량에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 어느 하나의 면역원성 융합 단백질을 단독으로 또는 본 발명의 제5 측면에 따른 백신에 의해 포괄되는 바와 같은 추가의 면역원성 융합 단백질과 조합하여, 제1 용량 및 제2 용량으로 사용해 면역화한 후, 57일 시점에 IgG 배수 증가가 달성됨을 보여준다.
도 3은 B군 스트렙토코커스 균주 BM110 (8 x 103 cfu)에 의한 신생아 박테리아 감염 후 마우스 새끼의 생존성을 도시한다. 마우스 새끼는 a) 서열번호 21의 면역원성 융합 단백질을 보강제 알루미늄 하이드록사이드 (AlOH)와 함께 사용하거나, 또는 b) 대조군 (보강제 알루미늄 하이드록사이드 단독)을 사용해 면역화한 마우스 암컷에서 출생한 것이다.
도 4A-4E는 임상 분리주를 이용한 인간 상피 세포 침입 실험에서 수득한 결과 및 서열번호 21의 면역원성 융합 단백질을 이용한 면역화로부터 수득한 항혈청 결과를 도시한다.
도 5A-5C는 서열번호 21에 따른 융합 단백질의 짧은 아미노산 서열과 서열번호 43에 따른 리딩 서열을 포함하는, WO2008127179에 따른 융합 단백질을 모형으로 나타낸 것이다.
도 6은 서열번호 21의 짧은 융합 단백질과 α1β1-인테그린 간의 상호작용을 모형으로 도시한 것이다.
본 명세서에서, 달리 언급되지 않은 한, 부정관사 ("a" 또는 "an")는 "하나 이상"을 의미한다.
명세서 전체에서 임의의 모든 참조문헌은 원용에 의해 본 출원에 구체적으로 포함된다.
상기와 같이, 본 발명의 제1 측면은
i. 아미노산 170-178개, 바람직하게는 174-175개로 구성되고 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인, 제1 아미노산 서열 파트;
ii. 아미노산 165-174개, 바람직하게는 169-170개로 구성되고 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인, 제2 아미노산 서열 파트; 및 선택적으로:
iii. 제1 아미노산 서열 파트를 제2 아미노산 파트와 분리하는 아미노산 1-20개로 이루어진 링커 아미노산 서열 파트로 구성된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되고,
아미노산 335-372개, 바람직하게는 아미노산 343-353개, 더 바람직하게는 아미노산 343-347개로 구성되는 면역원성 융합 단백질에 관한 것이다.
용어 "면역원성"은 면역 반응을 형성하는 능력을 가진 것을 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명의 면역원성 융합 단백질은 면역원성이고, N-말단 영역이 면역원성 융합 단백질에 포함된 표면 단백질을 함유한 적어도 GBS에 대해 보호 면역 반응을 유발하는 능력을 특징으로 한다. B군 스트렙토코커스에 대한 보호 면역 유발은 표면 단백질 Rib 및 AlpC 중 하나 이상을 가진 B군 스트렙토코커스에 대해 보호 면역을 유발하는 것을 망라하는 것으로 이해되어야 한다. "할 수 있는"은, 면역원성 융합 단백질이 면역 시스템을 가진 개체에 적량으로 투여하였을 때 그 개체에서 보호 면역을 유발하는 것을 의미한다. 면역원성 융합 단백질은 바람직하게는 B군 스트렙토코커스에 대해 보호 면역을 유발할 수 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "보호 면역"은 면역화 중에 혈청 항체 및/또는 세포독성 T 세포 반응이 B군 스트렙토코커스와 같은 감염성 물질에 의해 유발되는 질환에 대해 (부분적으로 또는 완전히) 보호하도록 유도하는 능력을 지칭한다. 즉, 본 발명의 백신에 의해 면역화된 척추동물은 B군 스트렙토코커스의 생장 및 전파 제한을 겪게 될 것이다. 보호 면역이 융합 단백질 또는 백신에 의해 유도되는 지를 확인하기 위해, 당해 기술 분야의 당업자에 잘 알려진 기술들을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질 또는 백신을 이용한 면역화가 B군 스트렙토코커스 감염에 대해 보호 면역을 유도하는 지를 확인하기 위해, 면역화된 실험 동물을 B군 스트렙토코커스로 기회 감염하여 B군 스트렙토코커스의 생장과 전파를 측정할 수 있다. 예를 들어, 보호 면역이 유도되는 지를 확인하기 위해, 아래 실시예에 기술된 방법에 따른 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 목적에서, 용어 "융합 단백질"은 2 이상의 단백질 영역 또는 이의 단편의 어셈블리를 지칭한다. 상기 언급된 바와 같이, 면역원성 융합 단백질은 적어도 제1 아미노산 서열 파트와 제2 아미노산 서열 파트로 구성된 아미노산 서열을 포함한다 (또는 바람직하게는 이들로 구성된다). 이들 파트는 B군 스트렙토코커스 표면 단백질 Rib 및 AlpC 각각의 N-말단 영역들과 관련 있다.
융합 단백질을 수득하기 위한 아미노산 서열 파트들의 조합은, 연결된 핵산 분자들이 번역시 단일한 연속적인 발현 산물로 만들어지도록, 각각의 아미노산 파트를 코딩하는 개별 핵산 분자들을 함께 연결함으로써, 또는 아미노산 서열 파트들을 한쪽 또는 양쪽 말단에서 융합, 즉 결착함으로써 (공유 커플링, 결합 또는 연결, 또는 접합함으로써), 달성할 수 있다.
융합 단백질에서, 제1 아미노산 서열 파트와 제2 아미노산 서열 파트는 링커 아미노산 서열 파트에 의해 분리되어 있을 수도 있다.
본 발명의 맥락에서, 융합 단백질은 아미노산 서열 파트들을 가교하거나 또는 이를 거대분자 구조 상에 포획함으로써 수득할 수 있는 것으로, 추가로 고려된다.
본 발명의 목적에서, 용어 "단백질"은 아미노산 분자 체인을 지칭한다. 단백질은 특정 길이인 것은 아니며, 필요에 따라, 예를 들어, 당화, 아미드화, 카르복시화 또는 인산화에 의해 생체내 또는 시험관내 변형될 수 있다. 특히, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드가 이러한 정의에 포함된다.
본 발명과 관련하여 용어 "N-말단 영역"은 단백질의 N-말단 영역 (N)을 지칭한다.
본원에서 GBS로도 지칭되는 B군 스트렙토코커스 균주는 공지되어 있으며, 감염된 인간 혈액으로부터 단리할 수 있다. GBS는 미국에서 신생아 패혈증의 가장 흔한 원인으로서, 연간 약 5000건을 유발한다.
표현 "B군 스트렙토코커스"는, 스트렙토콕시 (Streptococci)는 이의 세포 표면에 특정 탄수화물 항원의 존재에 따라 면역학적 군들로 분류된다는 점에서 유래한다. 현재 A군에서 O군까지 알려져 있다.
본 명세서에서 Rib 및 Rib 단백질로도 지칭되는 B군 스트렙토코커스 Rib 단백질은 당해 기술 분야에서 공지된 표면 단백질로서, 예를 들어 WO 9421685에 언급되어 있다. 용어 "Rib"는 다음을 지칭한다: 프로테아제 내성, 면역, 및 B군 (Resistance to proteases, immunity, and group B). Rib 단백질은 혈청형 III의 B군 스트렙토코커스 균주에서 별개의 95 kDa 단백질로서 최초로 분리되었다. 단백질 Rib는 대부분의 뇌수막염 사례를 유발하는 임상적으로 중요한 혈청형 III B군 스트렙토코커스 균주들 거의 전체에 의해, 그리고 II와 같은 다른 혈청형의 균주 일부에 의해 발현된다. 아울러, Rib는 모든 III형 고-병독성 클론 균주에 의해 발현된다. 단백질 Rib 정제 방법은 고안되어 있으며, 이 단백질에 대한 항체가 단백질 Rib를 발현하는 균주에 의한 치명적인 감염으로부터 보호하는 것으로 입증된 바 있다 (DNA 및 단백질 서열과 같은 추가적인 상세 내용은 WO 9421685를 참조함).
서열번호 7은 Rib의 더 짧은 N-말단 영역을 나타낸다:
MAEVISGSAVTLNTNMTKNVQNGRAYIDLYDVKNGKIDPLQLITLNSPDLKAQYVIRQGGNYFTQPSELTTVGAASINYTVLKTDGSPHTKPDGQVDIINVSLTIYNSSALRDKIDEVKKKAEDPKWDEGSRDKVLISLDDIKTDIDNNPKTQSDIANKITEVTNLEKILVPRIP
서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 DNA 분자는 서열번호 1, 3 및 5에 나타내며, 여기서 서열번호 3은 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 5는 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 상응되는 핵산 RNA 분자는 서열번호 2, 4 및 6에 나타내며, 여기서 서열번호 4는 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 6은 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
Rib의 더 짧은 N-말단, 즉 서열번호 7과 WO 2008127179에서 Rib N-말단에 대해 제시된 서열 간의 차이는 아미노산 5개 길이인 리딩 서열 GPLGS, 서열번호 44이다.
알파 단백질로도 알려진 B군 스트렙토코커스 AlpC 단백질은 당해 기술 분야에 공지된 B군 스트렙토코커스의 표면 단백질이다. WO 9410317은 알파 단백질을 포함하는 접합 백신 조성물을 언급하고 있다. WO 9410317에 언급된 바와 같이 네이티브 B군 스트렙토코커스 AlpC 전구체 단백질은 분자량이 108 kDa이다. 아미노산 41개로 된 추정의 신호 서열이 절단되면, 104 kDa의 성숙한 단백질이 만들어진다 (주의, 그러나, 이후 신호 서열이 아미노산 잔기 56개 길이인 것으로 밝혀짐: Stalhammar-Carlemalm et al., J Exp Med 177,1593; 1993). AlpC 항원의 20 kDa N-말단 영역은 이전에 언급된 단백질과는 상동성이 없으며, 그 다음으로 성숙 단백질의 74%를 구성하는 탠덤 반복 단위 9개가 연속적으로 존재한다. 각각의 반복 단위 (본원에서 "R"로 언급됨)들은 동일하고, 아미노산 82개로 구성되고, 분자량은 약 8500 달톤이며, 뉴클레오티드 246개에 의해 코딩된다. AlpC 항원의 C-말단 영역은 다수의 그람 양성 표면 단백질에 존재하는 세포벽 고정 도메인 모티프 (cell wall anchor domain motif)를 가지고 있다.
서열번호 14는 AlpC의 짧은 N-말단 영역을 나타낸다:
STIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKLGKIDPLQLIVLEQGFTAKYVFRQGTKYYGDVSQLQSTGRASLTYNIFGEDGLPHVKTDGQIDIVSVALTIYDSTTLRDKIEEVRTNANDPKWTEESRTEVLTGLDTIKTDIDNNPKTQTDIDSKIVEVNELEKLLVLS
AlpC의 더 짧은 N-말단, 즉 서열번호 14와 WO 2008127179에서 AlpC N-말단에 대해 제시된 서열 간의 차이는 아미노산 5개 길이인 리딩 서열 GPLGS, 서열번호 44이다.
서열번호 14의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 DNA 분자는 서열번호 8, 10 및 12에 나타내며, 여기서 서열번호 10은 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 12는 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
서열번호 14의 아미노산 서열을 코딩하는 상응되는 핵산 RNA 분자는 서열번호 9, 11 및 13에 나타내며, 여기서 서열번호 11은 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 13은 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
용어 "서열 동일성"은 동일한 길이의 뉴클레오티드 서열 2종 또는 동일한 길이의 아미노산 서열 2종 간의 상동성 정도에 대한 정량적인 수치 (quantitative measure)를 의미한다. 만일 비교하는 서열 2개가 길이가 동일하지 않다면, 이들이 가장 잘 피팅되게 정렬하여야 한다. 서열 동일성은, 예를 들어, BLAST 프로그램 예를 들어, BLASTP 프로그램 또는 BLASTN 프로그램 (Pearson W. R and D. J. Lipman (1988) PNAS USA 85:2444-2448)(www.ncbl.nlm.nlh.gov/BLAST)으로 계산할 수 있다.
바람직하게는, 면역원성 융합 단백질은 아미노산 서열로 구성된다.
아미노산 170-178개, 바람직하게는 174-175개로 구성된 제1 아미노산 서열 파트는 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진다.
아미노산 165-174개, 바람직하게는 169-170개로 구성된 제2 아미노산 서열 파트는 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열의 전장과 90% 이상의 서열 동일성을 가진다.
제1 아미노산 서열 파트는 아미노산 최대 178개, 예를 들어 아미노산 170-178개, 바람직하게는 174-175개로 구성되어야 한다. 언급한 바와 같이, 서열번호 7은 아미노산 175개를 포함한다. 서열에서 첫번째 M은 선택 사항이므로, 이럴 경우 아미노산은 174개가 된다.
제1 아미노산 서열 파트는 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예로 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
제2 아미노산 서열 파트는 아미노산 최대 174개, 예를 들어 아미노산 165-174개, 바람직하게는 169-170개로 구성되어야 한다. 언급한 바와 같이, 서열번호 14는 아미노산 170개를 포함한다. 서열에서 첫번째 A는 선택 사항일 수 있으므로, 이므로, 이럴 경우 아미노산은 169개가 된다.
제2 아미노산 서열 파트는 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예로 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
링커 아미노산 서열 파트는 선택 사항이다. 다시 말해, 링커 아미노산 서열 파트는, 포함되는 경우, 아미노산 0-20개로 구성될 수 있다. 링커 아미노산 서열 파트에서 아미노산은 무작위로, 즉 불규칙 코일 형태 (random coil formation)를 달성하도록 정해질 수 있다. 링커 아미노산 서열 파트는 존재할 경우 제1 아미노산 서열 파트를 제2 아미노산 서열 파트와 분리시킨다. 다시 말해, 링커 아미노산 서열 파트는 제1 아미노산 서열 파트와 제2 아미노산 서열 파트 사이에 제공된다.
제1 아미노산 서열 파트와 제2 아미노산 서열 파트 중 어느 하나에는 제1 아미노산 서열 파트 및 제2 아미노산 서열 중 다른 하나로부터 가장 멀리 떨어진 말단 위치에 선두/후행 아미노산 서열 파트가 제공될 수 있다. 선두/후행 아미노산 서열 파트는 아미노산 하나 이상을 포함할 수 있다.
면역원성 융합 단백질은 바람직하게는 아미노산 335-372개, 바람직하게는 아미노산 343-353개, 더 바람직하게는 아미노산 343-347개로 구성된다.
본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질에 대한 바람직한 구현예에서:
- 제1 아미노산 서열 파트는 서열번호 7에 나타낸 서열의 아미노산 1-175 또는 2-175를 포함하거나 또는 바람직하게는 이로 구성되고, 및
- 제2 아미노산 서열 파트는 서열번호 14에 나타낸 서열의 아미노산 1-170 또는 2-170을 포함하거나 또는 바람직하게는 이로 구성된다.
서열번호 7은 아미노산 175개를 포함한다. 아미노산 2-175는 메티오닌 첫번째 메티오닌 (M)이 제외된 서열번호 7의 아미노산 서열에 해당한다.
본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질에 대한 바람직한 구현예에서, 아미노산 서열은 링커 아미노산 서열 파트를 포함하고, 링커 아미노산 서열 파트는 아미노산 1-10개, 바람직하게는 아미노산 2-5개, 더 바람직하게는 아미노산 2개, 가장 바람직하게는 아미노산 서열 EF로 구성된다.
링커 아미노산 서열 파트가 아미노산 EF (글루타메이트-페닐알라닌)로 구성된다면, 제2 아미노산 서열 파트는 서열번호 14에 나타낸 서열의 아미노산 2-170을 포함하거나 또는 바람직하게는 이로 구성된다.
바람직하게는, 면역원성 융합 단백질은 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열과, 바람직하게는 전체와 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다.
바람직한 구현예에서, 면역원성 융합 단백질은 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열로 구성되거나 또는 대안적으로 면역원성 융합 단백질은 서열번호 21의 아미노산 2-347로 구성된다.
도면과 관련하여 나타낸 바와 같이, 이러한 면역원성 융합 단백질은 WO 2008127179에 개시된 면역원성 융합 단백질보다 짧지만 효과는 더 우수하고, GBS에 대한 백신으로 사용하기 적합하다.
나아가, 실시예 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 이렇듯 리딩 서열 서열번호 43의 제거로 인해 더 짧은 아미노산 서열은, 구체적으로는, 내피 세포의 부착 및/또는 침입에 대해 보다 효과적이고 및/또는 개선된 보호를 제공함으로써, GBS로부터 보호하는데 더 효과적이고 개선될 것이다.
서열번호 21은 하기 아미노산 서열에 해당한다:
MAEVISGSAVTLNTNMTKNVQNGRAYIDLYDVKNGKIDPLQLITLNSPDLKAQYVIRQGGNYFTQPSELTTVGAASINYTVLKTDGSPHTKPDGQVDIINVSLTIYNSSALRDKIDEVKKKAEDPKWDEGSRDKVLISLDDIKTDIDNNPKTQSDIANKITEVTNLEKILVPRIPEFSTIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKLGKIDPLQLIVLEQGFTAKYVFRQGTKYYGDVSQLQSTGRASLTYNIFGEDGLPHVKTDGQIDIVSVALTIYDSTTLRDKIEEVRTNANDPKWTEESRTEVLTGLDTIKTDIDNNPKTQTDIDSKIVEVNELEKLLVLS
서열번호 21에 따른 짧은 융합 단백질과 WO 2008127179의 융합 단백질에 대해 제시된 서열 간의 차이는 아미노산 32개 길이의 리딩 서열: GPLGSASVLIGISFLGGFTQGQFNISTDTVFA - 서열번호 43이며, 이 서열은 서열번호 21에는 없다.
본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질에 대한 추가적인 측면에서, 면역원성 융합 단백질은 당화, 아미드화, 카르복시화 또는 인산화에 의해 변형되거나, 또는 추가로 아래에서 본 발명의 제3 측면과 관련하여 기술된 바와 같이, 피막 다당류 또는 RSV 항원과 접합됨으로써 변형된다.
이는, 이러한 융합 단백질이 강화된 면역원성을 가질 수 있어 유익하다. 융합 단백질의 면역원성을 실질적으로 높이기 위해, 과도한 실험 없이도, 적용할 수 있는 수많은 기술들이 이용 가능하며 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 다이니트로페놀 기 또는 아르사닐산에 커플링함으로써 또는 열 및/또는 SDS로 변성함으로써 변형할 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질은 면역원성 담체와 커플링될 수 있다. 커플링 전략에서 몇가지 일반적인 고려사항에 대한 검토로서 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. E. Harlow and D. Lane (1988)을 참조한다. 이용가능한 면역원성 담체는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 담체의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin, KLH); 알부민, 예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA) 및 오발부민, PPD (투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체); 적혈구; 파상풍 톡소이드; 콜레라 톡소이드; 아가로스 비드; 활성탄; 또는 벤토나이트가 있다.
추가적인 구현예에서, 면역원성 융합 단백질은 피막 다당류, 바람직하게는 박테리아 다당류, 더 바람직하게는 B군 스트렙토코커스 다당류와 접합된다.
다당류는, 통상적으로 글리코시드 연결에 의해 연결된 다당류 잔기들로 구성된 임의의 선형 또는 분지형 폴리머를 의미하며, 따라서 올리고당을 포함한다. 바람직하게는, 다당류는 단당류 단위 2-50개, 더 바람직하게는 단당류 6-30개를 포함할 것이다.
다당류 성분은 헤모필러스 인플루엔자 (H. influenzae), 나이세리아 메닝기티디스 (N. meningitidis) 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (S. pneumoniae)와 같은 여러가지 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 병원체로부터 유래한 다당류 피막의 다당류 성분을 토대로 하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질과 접합될 수 있는 다당류 성분의 기원이 되는 기타 박테리아로는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 클렙시엘라 (Klebsiella), 슈도모나스 (Pseudomonas), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 시겔라 디센테리아 (Shigella dysenteriae)를 포함한다. 본 발명의 이러한 측면에 따른 이용하기 적합한 다당류 성분은 Hib 올리고당, 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래 리포폴리사카라이드, 살모넬라 유래 리포폴리사카라이드 및 시겔란 디센테리아 (Shigella dysenteriae) 유래 O-특이 다당류를 포함한다.
본 발명에 따라 이용하기 적합한 다른 다당류 성분은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지되어 있을 것이다.
박테리아 피막 다당류의 단편은 산 가수분해 또는 초음파 조사 (ultrasonic irradiation)에 의해서와 같이 임의의 적절한 방법에 의해 제조할 수 있다. 다당류 성분을 제조하는 다른 방법은 당해 기술 분야의 당업자에 잘 알려져 있을 것이다.
다당류는 바람직하게는 B군 스트렙토코커스로부터 유래한 피막 다당류 또는 이의 등가물이다.
다당류는 바람직하게는 공유 연결에 의해 융합 단백질에 커플링되어야 한다. 다당류와 단백질을 커플링하는 특히 바람직한 방법은 환원성 아민화에 의한 것이다. 다른 방법으로는 시아노겐 브로마이드를 이용해 다당류를 활성화한 다음 아디프산 다이하이드라지드 (스페이서)와 반응시키고, 담체 단백질의 카르복사이드 기에 용해성 카르보디이미드를 이용해 접합하고; 담체 단백질을 아디프산 다이하이드라지드를 이용해 관능화한 다음 시아노겐 브로마이드 활성화된 다당류에 커플링하고, 담체 단백질과 다당류를 둘다 화학적으로 변형한 다음 이를 커플링하는 것을 포함한다.
다당류 분자는 아디프산과 같은 스페이서 분자를 통해 융합 단백질에 커플링될 수 있다. 이 스페이서 분자를 이용해 융합 단백질과 다당류의 커플링을 용이하게 할 수 있다. 커플링 반응을 수행한 후, 정용여과에 의해 또는 다른 공지된 방법에 의해 접합체를 정제하여 미반응 단백질 또는 다당류 성분을 제거할 수 있다.
만일 다당류가 GBS와는 다른 박테리아 병원체로부터 유래한다면, 접합체는 2 이상의 병원체, 예를 들어 복수 타입의 박테리아에 대해 면역을 유발할 수 있다. 이는 면역원성 융합 단백질의 특히 중요한 적용예이다.
본 발명의 제2 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
이러한 핵산 분자는 예를 들어 면역원성 융합 단백질을 분리하여 수득하는 세포 배양물에서 직접, 또는 예를 들어 면역원성 융합 단백질을 면역화를 위해 발현시킬 개체에서 간접적으로 생산하기 위해 이용할 수 있다.
핵산 분자는, 예를 들어, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 mRNA 분자일 수 있다.
핵산 분자는 서열번호 8-13 중 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%인 제2 폴리뉴클레오티드에, 직접 또는 링커 폴리뉴클레오티드 서열을 통해 융합된, 서열번호 1-6 중 하나에 대한 서열 동일성이 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%인 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 바람직하게는 이로 구성될 수 있다.
링커 폴리뉴클레오티드 서열은 선택 사항이며, 만일 핵산 분자에 의해 코딩된 면역원성 융합 단백질이 제1 아미노산 융합 단백질 파트와 제2 아미노산 서열 파트 사이에 제공된 링커를 가져야 한다면, 이를 포함한다. 만일 제1 폴리뉴클레오티드가 제2 폴리뉴클레오티드와 직접 융합된다면, 핵산 분자에 존재하는 링커 폴리뉴클레오티드 서열은 존재하지 않는다.
상기에 언급된 서열번호 1-6 및 서열번호 8-13 각각은 핵산 분자에 의해 코딩되는 면역원성 융합 단백질의 제1 아미노산 서열 파트에서 첫번째 메티오닌 (M)과 면역원성 융합 단백질의 제2 아미노산 서열 파트에서 첫번째 알라닌 (A)을 코딩하는 처음 염기 3개를 제거함으로써 선택적으로 절단될 수 있다.
핵산 분자는 선택적으로 하나 이상의 정지 코돈을 포함할 수 있다.
핵산 분자는 선택적으로 하나 이상의 개시 코돈을 포함할 수 있다.
핵산 분자는 E. coli 또는 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포와 같은 특정 유기체에서 발현하기 위해 코돈 최적화될 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자에 대한 바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 15-20 중 하나에 나타낸 뉴클레오티드의 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진다.
바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 15-20 중 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 이러한 바람직한 구현예에서 참조되는 서열번호 15-20 각각은 선택적으로 핵산 분자에 의해 코딩된 면역원성 융합 단백질의 제1 아미노산 서열 파트에서 첫번째 메티오닌 (M)을 코딩하는 처음 염기 3개를 제거함으로써 단축될 수 있다. 나아가, 이러한 바람직한 구현예에서 참조되는 서열번호 15-20 각각은 선택적으로 정지 코돈 2개인 마지막 염기 1-6개를 제거함으로써 단축될 수 있다. 이는 예를 들어 핵산 분자가 DNA 또는 RNA 백신으로서 사용되는 경우에는 이용할 수 있으며 - 전사 및/또는 번역은 핵산 분자의 말단에서 끝날 것이다.
핵산 분자는 바람직하게는 염기 1044개 (첫번째 M이 없음) 내지 1047개 (첫번째 M 존재)로 구성될 수 있다.
본 발명의 제3 측면은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자를 포함하는 백터에 관한 것이다.
매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합들이 핵산 분자를 발현하는데 채택될 수 있다. 진핵생물 숙주에 이용가능한 발현 벡터로는 예를 들어 SV40, 보바인 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래한 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에서 이용가능한 발현 벡터로는 pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이의 유도체 등의 E. coli 유래 벡터와 같은 박테리아 플라스미드, 숙주 범위가 넓은 플라스미드, 예를 들어 RP4, 파지 DNA, 예를 들어, 다양한 파지 람다 유도체, 예를 들어, lambda GT10 및 lambda GT11, NM989, 및 기타 DNA 파지, 예를 들어 M13 및 필라멘트형 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다. 효모 세포에 대해 이용가능한 발현 벡터로는 2.mu. 플라스미드 및 이의 유도체를 포함한다. 곤충 세포에 이용가능한 발현 벡터로는 pVL 941을 포함한다.
아울러, 매우 다양한 임의의 발현 조절 서열들이 핵산 분자를 발현하기 위해 이러한 벡터에 사용될 수 있다. 이용가능한 발현 조절 서열로는 외래 발현 벡터의 구조 유전자와 연관된 발현 조절 서열을 포함한다. 이용가능한 발현 조절 서열의 예로는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터, 파지 람다의 주 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 외막 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 해당 효소의 프로모터, 산 포스파타제, 예를 들어, Pho5의 프로모터, 알파-메이팅 시스템의 프로모터 및 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 구성적인 프로모터 및 유도성 프로모터, 및 이들의 다양한 조합을 포함한다.
본 발명의 제4 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질을 발현하거나 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자를 포함하거나 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
숙주 세포는 그람 음성 박테리아 세포, 그람 양성 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 아프리카 녹색 원숭이 세포, 인간 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 E. coli, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 아스퍼질러스, 락토바실러스, 시겔라, 살모넬라, 리스테리아, 스트렙토코커스, 스타필로코커스 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나, E . coli가 바람직하다.
아울러, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 녹색 원숭이 세포, 인간 세포 및 식물 세포를 조직 배양에 이용할 수 있다. 바람직한 숙주 유기체는 조직 배양의 포유류 세포 및 E. coli 및 바실러스 섭틸리스와 같은 박테리아를 포함한다.
숙주 세포를 이용해 면역원성 융합 단백질을 생산하거나 또는 이의 제1 및 제2 아미노산 서열 파트를 생산하는 경우, 또는 링커 아미노산 서열 파트를 생산하는 경우, 만들어진 아미노산 서열 파트는 HPLC, FPLC 등을 이용한 정상 또는 역상 등의 액체 크로마토그래피; (예, 무기 리간드 또는 단일클론 항체를 이용한) 친화성 크로마토그래피; 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피; 고정된 금속 킬레이트 크로마토그래피; 겔 전기영동; 접선 유동 여과 등을 비롯한 다양한 통상적인 임의의 방법을 이용해 미생물 배양물 또는 세포 배양물로부터 단리하여 정제할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 가장 적절한 분리 및 정제 기술을 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 선택할 수 있다.
아울러, 면역원성 융합 단백질, 이의 제1 아미노산 서열 파트 및 제2 아미노산 서열 파트, 또는 링커 아미노산 서열 파트는 임의의 몇가지 화학적 기법을 통해 제조할 수 있다. 예를 들어, 이는 고상 합성 기술을 이용해 제조할 수 있거나 또는 용액 합성으로 제조할 수도 있다.
본 발명의 제5 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터 또는 본 발명의 제4 측면에 따른 숙주 세포 중 하나 이상을 포함하는 백신에 관한 것이다.
면역원성 융합, 핵산 분자, 벡터, 및/또는 숙주 세포 각각의 양은 바람직하게는 약제학적 유효량이거나 또는 B군 스트렙토코커스에 대해 보호 면역을 유발할 수 있는 양, 또는 면역 반응을 유발하기에 충분한 양이다. 나아가, 상기한 양은 백신을 투여받는 개체의 활성 및 반응에 임상적으로 중대한 결함을 낮추고, 가장 바람직하게는 방지하는데 충분한 것일 수 있다. 대안적으로, 상기한 양은 숙주 또는 개체에서 임상적으로 중대한 상태에 개선을 유발하기에 충분하다.
당해 기술 분야의 당업자에게 인지된 바와 같이, 화합물의 양은 이의 특정 활성에 따라 다양할 수 있다. 적합한 투여량은 필요한 희석제, 즉 담체 또는 첨가제와 연합하여 원하는 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 활성 조성물을 미리 지정된 양으로 함유할 수 있다. 나아가, 투여될 투여량은 사용된 활성 성분 또는 성분들, 치료할 개체의 나이, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
백신은 바람직하게는 B군 스트렙토코커스에 대해 보호 면역을 유발할 수 있다.
도면에 나타낸 바와 같이, 면역원성 융합 단백질은 개체에 투여시 면역 반응을 유발한다. 이러한 면역 반응은 또한 면역원성 융합 단백질을 발현하기 위한 후기 전사 및 번역을 위해 핵산 분자를 DNA 핵산 분자로서 또는 면역원성 융합 단백질을 번역 및 발현하기 위해 RNA 또는 mRNA 핵산 분자로서 투여함으로써, 간접적으로 달성할 수 있다. 핵산 분자는 전사 및/또는 번역 조절 강화를 위해 벡터에 제공될 수 있으며, 벡터는 이후 면역원성 융합 단백질의 발현을 추가로 통제 및/또는 높이기 위해 숙주 세포 내로 제공될 수 있다.
백신은 추가적으로 약제학적으로 허용가능한 비히클을, 선택적으로 보강제를 포함할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 비히클"은 약학적 제형에서 통상적으로 사용되는 임의의 적합한 허용가능한 부형제, 보강제, 담체, 희석제를 의미하는 것으로 의도된다.
백신은 백신 조성물을 망라할 수 있다.
백신은 부가적으로 염, 완충제, 면역활성 성분, 보강제 (AlOH), 습윤제, 유화제, 현탁화제, 감미제, 향미제, 향제 또는 조성물의 효능 개선에 바람직한 다른 물질 등의 약학적으로 허용가능한 기타 성분을 포함할 수 있다. 조성물은, 이의 투여가 수여 개체에 내약성일 수 있다면 "약리학적으로 허용가능한" 것으로 지칭된다.
보강제는 특이적인 면역 반응을 특이적으로 높이기 위해 이용할 수 있는 물질이다. 보통, 보강제 및 조성물은 면역 시스템에 제시하기 전 혼합하거나 또는 별도로, 그러나 면역화하는 동물 또는 인간의 동일 부위에 제시된다. 보강제는 대략적으로 이의 조성에 기반해 몇가지 군으로 나뉠 수 있다. 이들 군으로는 오일 보강제 (예를 들어, 프로인트 완전 및 불완전), 미네랄 염, 예를 들어, AlK (SO4)2, AlNa (SO4)2, AlNH4 (SO4), AlOH, 실리카, 카올린 및 탄소), 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, poly IC 및 poly AU 산), 및 일부 천연 물질 (예를 들어, 미코박테리아 투베르쿨로시스 유래 왁스 D뿐 아니라 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum) 또는 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis) 및 브루셀라 (Brucella) 속 구성원에서 발견되는 물질을 포함한다.
알하이드로겔 (Alhydrogel)(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드, AlOH)은 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질에 특히 유효한 보강제이며, 즉 본 발명의 제5 측면에 따른 백신에 특히 유용하다.
백신 및 백신 조성물의 제조 및 제형 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 충분히 공지되어 있다. 성분의 선택은 예를 들어 조성물의 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 비경구 투여용 조성물은 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁제 및 유제를 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트이다. 담체 또는 밀봉 드레싱 (occlusive dressing)을 이용해 피부 투과성을 높이고 항원 흡수를 강화할 수 있다. 경구 투여용 액체 투약 형태는 일반적으로 액체 투약 형태를 함유한 리포솜 용액을 포함할 수 있다. 리포솜을 현탁하는데 적합한 형태로는 정제수와 같이 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유한 엘릭실제 (elixir), 시럽제, 용액제, 현탁제 및 에멀젼 등이 있다.
백신은 설치류 (마우스, 랫, 기니아피그 또는 토끼)와 같은 포유류 및 조류; 조류 (칠면조, 암탉 또는 닭); 기타 농장 동물 (소, 말, 돼지 또는 새끼 돼지); 애완 동물 (개, 고양이 및 기타 애완 동물); 및 인간 등의, 인간 또는 동물에 투여할 수 있다. 많은 동물을 본 발명의 백신으로 처치할 수 있지만, 바람직한 처치 개체는 인간이거나 또는 어류, 예를 들어 틸라피아 및 낙타와 같이 상업적인 가치가 있는 동물이다.
백신은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 개체에 투여할 수 있다. 이러한 방법은 피부 내로 또는 피부를 통한 모든 주사 경로를 통해서와 같이, 예를 들어 비경구 적용을 포함한다: 예를 들어, 근육내, 정맥내, 복막내, 진피내, 점막, 점막하 또는 피하. 또한, 이는 점적제, 분무제, 겔 또는 연고와 같이 눈, 코, 입, 항문 또는 질의 점막 상피에 또는 임의 신체 부위에서 외부 피부의 표피로 국소 적용에 의해 적용할 수 있다. 기타 가능한 적용 경로는 호흡기를 통한 흡입에 의한 스프레이, 에어로졸 또는 분말 적용에 의한 것이다. 마지막의 경우, 사용되는 입자 크기는 입자가 호흡기에 침투될 깊이를 결정할 것이다. 대안적으로, 적용은 소화 경로를 통해, 음식물, 사료 또는 음용수와 조합하여, 예를 들어 분말, 액체 또는 정제로서, 또는 액체, 겔, 정제 또는 캡슐제와 같이 입으로 직접 투여함으로써 또는 좌제로서 항문에 투여함으로써, 이루어질 수 있다.
면역화 시기를 결정하는 많은 다양한 기법들이 존재한다. 면역화된 동물에 의해 발현되는 면역글로불린 레퍼토리의 발현 수준 및 다양성을 높이기 위해 백신 또는 성분 a-d를 1회보다 더 많이 투여하는 것도 가능하다. 전형적으로, 면역화를 수회 제공한다면, 이는 1주 내지 3개월 간격, 예를 들어 2주 내지 2개월 간격, 예를 들어 1-2개월 간격 또는 4개월 간격으로 제공할 수 있다.
아울러, 백신 또는 성분 a-d를 1회 또는 아마 수회 부스터 주사로 투여할 수도 있다. 바람직하게는, 부스터 주사는 일차 주사 또는 수회 주사 후 약 1개월 및 6개월에 투여할 수 있다.
본 발명의 제5 측면에 따른 백신은 바람직하게는 하나 이상의 부가적인 면역 활성 성분을 포함할 수 있다. 부가적인 면역활성 성분은 항원, 면역 강화 물질 및/또는 백신일 수 있으며; 이중 하나는 보강제를 포함할 수 있다.
이에, 본 발명의 제5 측면에 따른 백신에 대한 바람직한 구현예에서, 백신은 다음 중 하나 이상을 부가적으로 포함한다:
a) 서열번호 42에 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 예를 들어 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 가진 아미노산을 포함하거나 또는 이로 이루어진, 추가의 면역원성 융합 단백질;
b) 추가의 면역원성 융합 단백질을 코딩하되, 서열번호 36-41 중 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진, 추가의 핵산 분자;
c) 추가의 핵산 분자를 포함하는 추가의 벡터; 또는
d) 추가의 면역원성 융합 단백질을 발현하거나 또는 추가의 벡터를 포함하는 추가의 숙주 세포.
아래에서 추가로 논의된 바와 같이, 추가의 면역원성 융합 단백질은 WO 2017/068112에 또한 개시된 GBS 표면 단백질 Alp1 및 Alp2/3의 N-말단 영역으로부터 유래한다. 도면에 도시되고 아래에 논의된 바와 같이, 면역원성 융합 단백질과 추가의 면역원성 융합 단백질을 둘다 포함하는 백신을 이용하는 경우 상승 효과가 존재한다.
나아가, 백신은 부가적인 성분 a-d 중 하나 이상을 포함함으로써, 모든 B군 스트렙토코커스 균주에 대해 더 넓은 보호 범위 (coverage)를 제공할 수 있다.
면역원성 융합 단백질에 대해 전술한 바와 마찬가지로, 추가의 면역원성 융합 단백질은 추가의 핵산 분자, 추가의 벡터 및 추가의 숙주 세포에 의해 간접적으로 발현될 수 있다.
a-d 각각의 양은 바람직하게는 약제학적인 유효량이어야 하거나, 또는 B군 스트렙토코커스에 대해 보호 면역을 유발할 수 있는 양 또는 면역 반응을 유발하기에 충분한 양 또는 적어도 백신에 대해 전반적인 면역 반응을 높이는데 충분한 양이어야 한다.
전술한 바와 같이, 추가의 면역원성 융합 단백질은 서열번호 42에 나타낸 아미노산에 대해 적어도 90%, 예를 들어 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 서열번호 42는 하기 아미노산 서열을 나타낸다:
MAEVISGSAATLNSALVKNVSGGKAYIDIYDVKNGKIDPLNLIVLTPSNYSANYYIKQGGRIFTSVNQLQTPGTATITYNILDENGNPYTKSDGQIDIVSLVTTVYDTTELRNNINKVIENANDPKWSDDSRKDVLSKIEVIKNDIDNNPKTQSDIDNKIVEVNELEKLLVLPEFSTIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKNGLIDPQNLIVLNPSSYSANYYIKQGAKYYSNPSEITTTGSATITFNILDETGNPHKKADGQIDIVSVNLTIYDSTALRNRIDEVINNANDPKWSDGSRDEVLTGLEKIKKDIDNNPKTQIDIDNKINEVNEIEKLLVVSL
서열번호 42의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 DNA 분자, 즉 (b)에 의해 망라되는 핵산 DNA 분자는 서열번호 36, 38 및 40에 나타내며, 여기서 서열번호 38은 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 40은 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
서열번호 42의 아미노산 서열을 코딩하는 상응되는 핵산 RNA 분자는 서열번호 37, 39 및 41에 나타내며, 여기서 서열번호 39는 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 41은 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
전술한 바와 같이, 추가의 면역원성 융합 단백질은 GBS 표면 단백질 Alp1 및 Alp2/3의 N-말단 영역들로부터 유래한다.
Alp1 단백질은 또한 엡실론 단백질로도 알려져 있으며, B군 스트렙토코커스 알파-단백질-유사 단백질이다.
Alp1 N-말단 영역의 아미노산 서열은 서열번호 28로 제공된다:
MAEVISGSAATLNSALVKNVSGGKAYIDIYDVKNGKIDPLNLIVLTPSNYSANYYIKQGGRIFTSVNQLQTPGTATITYNILDENGNPYTKSDGQIDIVSLVTTVYDTTELRNNINKVIENANDPKWSDDSRKDVLSKIEVIKNDIDNNPKTQSDIDNKIVEVNELEKLLVLP
서열번호 28의 아미노산 서열을 코딩하는 상응되는 핵산 RNA 분자는 서열번호 22, 24 및 26에 나타내며, 여기서 서열번호 24는 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 26은 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
서열번호 28의 아미노산 서열을 코딩하는 상응되는 핵산 RNA 분자는 서열번호 23, 25 및 27에 나타내며, 여기서 서열번호 25는 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 27은 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
Alp2 단백질은 다른 알파-단백질-유사-단백질이다. 이 계열의 다른 구성원과 마찬가지로, Alp2 단백질은 N-말단 도메인과 수개의 반복 도메인을 C-말단 방향으로 가진다. Alp2의 N-말단 영역과 Alp3의 N-말단 영역은 동일하다. Alp3는 다른 알파-단백질-유사-단백질이며, R28로도 알려져 있다. 이는 스트렙토코커스 피로게네스 (S. pyrogenes)에서도 발견된 R28 단백질과 매우 유사하다.
Alp2의 N-말단 영역의 아미노산 서열은 서열번호 35로 제공된다:
STIPGSAATLNTSITKNIQNGNAYIDLYDVKNGLIDPQNLIVLNPSSYSANYYIKQGAKYYSNPSEITTTGSATITFNILDETGNPHKKADGQIDIVSVNLTIYDSTALRNRIDEVINNANDPKWSDGSRDEVLTGLEKIKKDIDNNPKTQIDIDNKINEVNEIEKLLVVSL
서열번호 35의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 RNA 분자는 서열번호 29, 31 및 33에 나타내며, 여기서 서열번호 31은 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 33은 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
서열번호 35의 아미노산 서열을 코딩하는 대응되는 핵산 RNA 분자는 서열번호 30, 32 및 34에 나타내며, 여기서 서열번호 32는 E. coli에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이고, 서열번호 34는 크리세툴러스 그리세우스 (Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소) 세포에서 발현하기 위해 최적화된 코돈이다.
따라서 서열번호 42는 아미노산 EF로 구성된 링커 아미노산 서열 파트를 통해 서열번호 35 (Alp2/3 N-말단)에 융합된 서열번호 28 (Alp1의 N-말단)에 해당한다.
제2 면역원성 융합 단백질은 따라서 하기로 이루어진 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다:
i. 서열번호 28에 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 추가의 제1 아미노산 서열 파트;
ii. 서열번호 35에 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 추가의 제2 아미노산 서열 파트;
iii. 추가의 제1 아미노산 서열 파트를 추가의 제2 아미노산 파트와 분리하는, 아미노산 1-20개로 이루어진, 추가의 링커 아미노산 서열 파트.
서열번호 28 및 42 각각에서, 첫번째 M은 선택 사항일 수 있다. 이에, 본 발명의 제5 측면에 따른 백신에 대한 바람직한 구현예에서, 백신은 하기를 포함한다:
a) 서열번호 21에 나타낸 아미노산의 서열로 구성되거나, 또는 대안적으로 서열번호 21의 아미노산 2-347로 구성된, 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질; 및
b) 서열번호 42에 나타낸 아미노산의 서열을 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되거나, 또는 대안적으로 서열번호 42의 아미노산 2-347을 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되는, 추가의 면역원성 융합 단백질.
이러한 구현예에서, 바람직하게는 명시된 면역원성 융합 단백질 및 명시된 추가의 면역원성 융합 단백질과는 다른 기타 단백질 또는 아미노산 서열은 백신에 존재하지 않는다.
본 발명의 제5 측면에 따른 백신에 대한 바람직한 구현예에서, 백신은 보강제로서 알루미늄 하이드록사이드를 추가로 포함한다. 이러한 구현예에서, 백신은 바람직하게는 약학적 조성물이고, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함한다.
본 발명의 제6 측면은 i) B군 스트렙토코커스 감염에 대한 백신 접종 또는 ii) B군 스트렙토코커스 감염 치료를 위해 사용하기 위한, 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터, 본 발명의 제4 측면에 따른 숙주 세포 또는 본 발명의 제5 측면에 따른 백신에 관한 것이다.
면역원성 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 백신은 면역원성 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 백신을 이를 필요로 하는 개체에 투여함으로써 이러한 백신 접종 또는 치료에 이용할 수 있다.
본 발명의 상응하는 제7 측면은 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터, 본 발명의 제4 측면에 따른 숙주 세포 또는 본 발명의 제5 측면에 따른 백신을 이를 필요로 하는 개체에 투여함에 의한, i) B군 스트렙토코커스 감염에 대한 백신 접종 방법 또는 ii) B군 스트렙토코커스 감염에 대한 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상응하는 제8 측면은 i) B군 스트렙토코커스 감염에 대한 백신 접종 또는 ii) B군 스트렙토코커스 감염 치료를 위한 백신과 같은 약학적 조성물 또는 의약제의 제조에 있어, 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터, 본 발명의 제4 측면에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터, 본 발명의 제4 측면에 따른 숙주 세포 또는 본 발명의 제5 측면에 따른 백신은 B군 스트렙토코커스에 의해 유발되는 감염을 예방 또는 치료하는 방법에 이용할 수 있다.
산모와 신생아 둘다에서 B군 스트렙토코커스 감염을 예방하기 위한, 백신을 이용한 산모의 면역 예방은, 오랫동안 가능한 경로로 제안되어 왔다.
따라서, 본 발명의 제6, 제7 및 제8 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질, 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 분자, 본 발명의 제3 측면에 따른 벡터, 본 발명의 제4 측면에 따른 숙주 세포 또는 본 발명의 제5 측면에 따른 백신을 인간 여성에 투여한다.
따라서, 투여는 인간 여성에서 임신 중인 태아에 GBS 감염에 대한 면역을 부여할 수 있다. 나아가, 남성의 나이가 많으면 남성에게 투여할 수도 있다.
이러한 구현예에 따르면, 면역원성 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 백신은 임신하지 않은 여성 또는 임산부에, 여성과 태아 또는 신생아를 둘다 보호하는 역할을 하는 항체 생산을 유발하기에 충분한 양 및 시간 조건 하에 (태반을 통한 항체의 수동 전달을 통해) 투여된다.
본 발명과 관련하여, 용어 "예방 또는 치료"는 다양한 문법적인 형태에서 (1) B군 스트렙토코커스 감염과 관련한 장애의 유해 효과, (2) 장애 진행, 또는 (3) 장애 원인 물질 (B군 스트렙토코커스)을 예방, 치유, 반전, 약화, 완화, 개선, 저해, 최소화, 억제 또는 중단을 달성하는 것을 의미한다. 나아가, 용어 "예방 또는 치료"는 개체에서 B군 스트렙토코커스 감염에 대해 완전한 또는 부분적인 면역을 구축하는 것을 포함하는 것으로 고려된다.
본 발명의 제9 측면은 제2 개체가 본 발명의 제1 내지 제5 측면에 따른 면역원성 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 백신에 노출됨으로써 유발되는 유효량으로 항체를 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, B군 스트렙토코커스에 의해 유발되는 감염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
이러한 측면에서, B군 스트렙토코커스에 대한 내성 또는 면역은 수동 면역화에 의해 개체에 부여되며, 그래서 유발된 항혈청을 회수하여 B군 스트렙토코커스에 의해 유발되는 감염이 있는 것으로 의심되는 수여체에 직접 제공한다. 이러한 항혈청은, 항혈청이 태아 또는 신생아를 보호하는 역할을 하도록 충분한 양 및 시간 조건 하에 임산부에 (분만시 또는 분만하기 전에) (태반을 통한 항체의 수동 투여를 통해) 투여될 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명의 백신 또는 항혈청은 따라서 감염 개시 전 (예상되는 감염을 예방 또는 약화하기 위해) 또는 실제 감염 개시 후 제공될 수 있다.
본 발명의 제10 측면은 하기 단계를 포함하는 면역원성 융합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다:
- 본 발명의 제4 측면에 따른 숙주 세포를 제공하는 단계,
- 숙주 세포를 증식시키는 단계,
- 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질을 정제하는 단계, 및
- 면역원성 융합 단백질을 수득하는 단계.
대안적으로, 면역원성 융합 단백질은 무세포 발현 시스템 (cell-free expression system)에서 생산할 수 있다. 이러한 시스템은 특정 시스템에서 작동될 프로모터와 작동가능하게 연결된, 적절한 재조합 핵산으로부터 발현하기 위한 모든 필수 인자를 포함한다.
실시예 1 - 건강한 여성의 면역화
건강한 성인 여성을 대상으로, 서열번호 21로 구성된 면역원성 융합 단백질을 단독으로 또는 서열번호 42에 따른 추가의 면역원성 융합 단백질과 함께, 그리고 보강제로서 알루미늄 하이드록사이드를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 사용해 면역화하였다.
도 1은 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질을 단독으로 또는 본 발명의 제5 측면에 따른 백신에 포함되는 바와 같은 추가의 면역원성 융합 단백질과 조합하여, 여러가지 투여량으로, 그리고 보강제로서 알루미늄 하이드록사이드를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 사용해 면역화한 다음 29일차에 수득한 IgG 배수 증가를 보여준다.
도 1에서, 처음 7가지 결과는 서열번호 21로 구성된 면역원성 융합 단백질을 단독으로 또는 보강제로서 알루미늄 하이드록사이드 (0.5 mg)와 함께 투여하여 수득하였다.
도 1에서 확인된 바와 같이, 알루미늄 하이드록사이드의 사용은 10 ㎍ 용량의 IgG 배수 증가를 50 ㎍ 용량의 IgG 배수 증가와 비슷한 수준까지 부스팅하므로, 유익하였다. 마찬가지로, 50 ㎍ 용량을 알루미늄 하이드록사이드와 함께 사용하였을 경우 250 ㎍ 용량과 비슷한 배수 증가가 달성되었다.
도 1은 알루미늄 하이드록사이드 및 서열번호 21에 따른 면역원성 융합 단백질과 서열번호 42에 따른 추가의 면역원성 융합 단백질을 둘다 포함하는 백신을 사용하였을 경우, 각 면역원성 융합 단백질 용량 25 ㎍이 서열번호 21에 따른 면역원성 융합 단백질 용량 250 ㎍과 비교해 동일하거나 또는 더 높은 배수 증가를 제공함을 추가로 보여준다. 알루미늄 하이드록사이드 및 각각 50 ㎍의 면역원성 융합 단백질은 29일에 최대 배수 증가를 제공하였다.
각 실험에서 개체 수 (n)는 도면에 표시한다.
도 2는 본 발명의 제1 측면에 따른 면역원성 융합 단백질을 단독으로 또는 본 발명의 제5 측면에 따른 백신에 포함되는 추가의 면역원성 융합 단백질과 조합하여, 그리고 보강제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고, 여러가지 용량으로, 제1 용량 및 제2 용량으로 사용해 면역화한 후 57일에 입수한 IgG 배수 증가를 보여준다.
도 2에서, 처음 7가지 실험은 서열번호 21로 구성되는 면역원성 융합 단백질을 단독으로 또는 보강제로서 알루미늄 하이드록사이드 (0.5 mg)를 함께 투여하여 수득하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 서열번호 21로 구성된 면역원성 융합 단백질과 알루미늄 하이드록사이드를 추가로 포함하는 면역원성 융합 단백질을 각각 50 ㎍ 및 100 ㎍ 용량으로 2회 투여하였을 경우, 배수 증가 약 100이 달성되었다. 그러나, 알루미늄 하이드록사이드 및 서열번호 21에 따른 면역원성 융합 단백질과 서열번호 42에 따른 추가의 면역원성 융합 단백질을 둘다 포함하는 백신을 이용하였을 경우에는, 각각의 면역원성 융합 단백질의 용량이 25 ㎍ 또는 50 ㎍에 불과하였음에도 불구하고, 심지어 더 높은 배수 증가가 관찰되었다.
각 실험의 개체 수 (n)는 도면에 표시한다.
실시예 2 - 새끼 동물을 보호하기 위한 마우스 암컷의 면역화
도 3은 B군 스트렙토코커스 균주 BM110 (8 x 103 cfu)를 신생아에 박테리아 감염한 후 마우스 새끼의 생존성을 나타낸 것이다. 마우스 새끼는 a) 서열번호 21의 면역원성 융합 단백질을 보강제로서 알루미늄 하이드록사이드 (AlOH)와 함께 사용해 면역화하거나, 또는 b) 대조군 (보강제 알루미늄 하이드록사이드 단독)을 이용해 면역화한 암컷 마우스에서 출생하였다. 도 3에서 확인되는 바와 같이, 서열번호 21에 따른 면역원성 융합 단백질 단백질로 면역화된 모체에서 태어난 마우스 새끼 (점선)는 대조군을 투여받은 모체에서 태어난 마우스 새끼 (실선)보다 생존율이 실험 내내 현저하게 더 우수하였다. 즉, 서열번호 21의 면역원성 융합 단백질은, 암컷 마우스에 투여하였을 경우, 암컷 마우스에서 태어난 마우스 새끼에서 GBS 감염 및 사망을 현저하게 예방하였다. 즉, 면역원성 융합 단백질은 Lindahl et al, Nonimmunodominant Regions Are Effective As Building Blocks In A Streptococcal Fusion Protein Vaccine, Cell Host & Microbe 2, 427-434, December 2007의 도 2의 패널 C 및 E에 마우스에 대해 보고된 바와 마찬가지로 GBS 감염 및 사망에 대해 예방 효과를 제공하였다.
실시예 3 - 상피 세포 침입 실험
도 4A-4E는 서열번호 21의 면역원성 융합 단백질을 이용한 면역화로부터 수득한 항혈청 및 임상 분리주를 이용한 인간 상피 세포 침입 실험의 결과를 보여준다. 각각의 막대는 대조군 (혈청 비첨가), 0일 면역화 전 단계 (D0) 및 면역화 후 단계 57일 (D57)의 상대적인 상피 세포 침입 퍼센트를 표시한다. 내피 세포 침입을 저해하는 양호한 효과가 확인되었다. 따라서, 면역원성 융합 단백질은 Lindahl et al, Nonimmunodominant Regions Are Effective As Building Blocks In A Streptococcal Fusion Protein Vaccine, Cell Host & Microbe 2, 427-434, December 2007의 도 3의 패널 B에 보고된 바와 마찬가지로 상피 세포 침입에 대해 저해 효과를 제공하였다.
따라서, 도 1 및 도 2는, 면역원성 융합 단백질을 추가의 융합 단백질과 함께 투여하는 것이 유익하고, 보강제, 예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드를 이용하는 것 역시 유익함을 보여준다.
그러나, 면역원성 융합 단백질은 면역 반응, 예를 들어, IgG 배수 증가를 또한 낮은 투여량 수준 (10 ㎍)에서도 보강제 첨가 없이 유발하였다.
나아가, 도 3 및 도 4A-4E는, 면역원성 융합 단백질이 Lindahl et al, Nonimmunodominant Regions Are Effective As Building Blocks In A Streptococcal Fusion Protein Vaccine, Cell Host & Microbe 2, 427-434, December 2007 및 WO 2008127179에 개시된 면역원성 융합 단백질에서 관찰된 바와 비슷한 효과를 제공함을, 보여준다.
각각의 면역원성 융합 단백질의 투여량과, 투여하는 경우 추가의 면역원성 융합 단백질의 투여량은 인간에서 10 ㎍ 내지 250 ㎍, 예를 들어 10 ㎍ 내지 100 ㎍, 예를 들어 15 ㎍ 내지 75 ㎍, 바람직하게는 25 ㎍ 내지 75 ㎍, 예를 들어 25 ㎍ 내지 50 ㎍ 범위일 수 있다.
따라서, 알루미늄 하이드록사이드와 같은 보강제의 존재 하에, 각각의 면역원성 융합 단백질의, 투여하는 경우 추가의 면역원성 융합 단백질의, 바람직한 투여량은 인간에서 10 내지 250 ㎍, 바람직하게는 10 내지 150 ㎍, 바람직하게는 25 내지 100 ㎍ 또는 25 내지 75 ㎍ 범위이다.
면역원성 융합 단백질을 추가의 면역원성 융합 단백질과 함께, 그리고 알루미늄 하이드록사이드와 같은 보강제의 존재 하에 투여하는 경우에는, 각 융합 단백질의 투여량은 바람직하게는 15 ㎍ 내지 75 ㎍, 바람직하게는 25 ㎍ 내지 75 ㎍, 예를 들어 25 ㎍ 내지 50 ㎍ 범위이다.
알루미늄 하이드록사이드와 같은 보강제 비-첨가 경우에는, 면역원성 융합 단백질, 및 투여한다면 추가의 면역원성 융합 단백질 각각의 인간에 대한 투여량은 10 내지 1000 ㎍, 바람직하게는 50 내지 500 ㎍, 또는 바람직하게는 100 내지 250 ㎍일 것이다.
면역원성 융합 단백질, 및 투여한다면 추가의 면역원성 융합 단백질을, 대응하는 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포를 투여함으로써 간접적으로 투여하고자 한다면, 해당 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포의 투여량은, 바람직하게는, 면역원성 융합 단백질 및 투여된다면 추가의 면역원성 융합 단백질을 개체에 직접 투여하는 경우에 달성되는 바와 비슷한 면역 반응이 달성되도록, 선택한다.
바람직하게는, 면역원성 융합 단백질, 및 투여된다면 추가의 면역원성 융합 단백질 각각의 투여는 반복된다. 이에, 면역원성 융합 단백질, 및 투여된다면 추가의 면역원성 융합 단백질은 제1 용량으로 투여하고, 1차 투여 후 일정 시점에 제2 용량으로 반복 투여한다. 제1 용량 및 제2 용량은 1주 내지 3개월 간격, 예를 들어 2주 내지 2개월 간격, 예를 들어 1-2개월 간격 또는 4개월 간격일 수 있다.
실시예 4 - 서열번호 21에 따른 융합 단백질은 Rib N-말단의 보존된 영역에 대한 스크리닝을 감소시킨다
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명은 WO 2008127179에 개시된 융합 단백질에 대한 추가적인 연구를 토대로 한다. 본 연구에서는 WO 2008127179에 개시된 면역원성 융합 단백질보다 짧은 면역원성 융합 단백질, 즉 서열번호 21을 동정하였으며, 이것은 상기에서 논의한 도면에서 확인된 바와 같이 GBS에 대한 백신으로 사용하기 적합하고, 효과가 양호하였다.
본 실시예는 더 짧은 면역원성 융합 단백질과 WO 2008127179의 융합 단백질 간의 차이에 대해 추가적인 통찰을 제공한다.
구체적으로, 서열 차이는 아미노산 32개 길이의 리딩 서열: GPLGSASVLIGISFLGGFTQGQFNISTDTVFA - 서열번호 43으로서, 이 서열은 서열번호 21에는 없다.
서열번호 43에 따른 리딩 서열을 가진 WO 2008127179의 면역원성 융합 단백질 서열에 대해 컴퓨터 시뮬레이션을 수행하였다. 시뮬레이션은 시스템의 각 원자가 명확하게 모델링된 분자 다이나믹스를 기반으로 하였다. 각 원자가 이웃 원자에 의해 영향을 받는 힘 역시 계산하였으며, 이를 이용해 짧은 시간 간격, 전형적으로 펨토초 단위로 각 원자의 상대적인 위치를 갱신하였다. 이 시뮬레이션으로 지정된 시간 간격으로 전체 입체형태를 기록한 분자 궤적을 생성하였다.
구체적으로, Alphafold2, version v2.1.0 (Jumper et al, Nature　volume　596,　pages583-589 (2021))을 이용해 WO 2008127179의 전장 융합 단백질에 대해 고-품질 모형을 제작하였다. C-말단 도메인, 즉 AlpC N-말단은 리딩 서열에서 멀리 떨어져 있어 제거하고, 아미노산 32개 길이의 리딩 서열과 아미노산 총 204개를 포함하는 N-말단 Rib 도메인을 입수하였다. Gromacs 2021.5를 이용해 다음과 같은 시스템을 준비하였다; Alphafold2 모델을 입방 단위 셀로 물 (gmx 용매화물)을 이용해 용매화하고, 시스템을 중성으로 만들기 위해 이온을 추가하였다 (gmx genion). 헤비 원자는 제한되게 유지시킨 다음 평형화 단계 (압력 및 온도 (300K))를 이행하여 에너지를 최소화하였다. 이 시스템은 다음과 같이 메인 시뮬레이션을 진행하기 전 정상 상태임을 검증하였다. 글로벌 시스템의 분자 거동은 총 5천만개 단계 동안 델타 시간 2fs로, 100ns 간 시뮬레이션하였으며, 시스템 입체형태를 단계 5000개 마다 저장하여, 10000개의 모델 궤적을 입수하였다. MDanalysis v2.0.0을 이용해 전역 궤적을 분석하였으며, 이로써 rib 도메인이 대략 바닥 상태에서 진동하는 것으로 검증되었는데, 이는 이 분자가 현 조건에서 안정적임을 의미한다. 이러한 분석을 3회 반복하였다 (Sim1-3).
일부 결과로서, 리딩 서열 (아미노산 1-32)은 약 60 ns 후 안정적인 입체구조를 찾기 전 큰 입체구조 변화를 이행하는 것으로 밝혀졌다. Gromacs mindist (gmx mindist)를 이용해 리딩 서열 간의 상호작용을 계산하였다. 리딩 서열과 rib 도메인 간의 엄밀하고 안정적인 상호작용을 탐색하기 위해, 마지막 30 ns 시뮬레이션 (모델 3000개)을 고려하였으며, 발생한 상호작용을 최소 30% 시간 동안 시뮬레이션 3번의 평균으로 계산하였다 (모델 900개 이상에서 상호작용). 이 지점에서의 상호작용은 아미노산의 임의 원자 간의 최소 거리가 0.3 nm 이하인 것으로 정의하였다. 그 결과를 아래 표 1 및 도 5A에 나타내며, 도면에서는 공-막대 모형으로 리딩 서열과 함께 RibN 말단의 표면이 표시된다. RibN 말단의 표면 모형은 접촉이 빈번한 부위 (높은 분율)에 해당하는 백색에서 접촉이 전혀 또는 거의 없는 부위에 해당하는 흑색으로 음영 처리하였다.
도 5B는 (카툰 모형으로 나타낸) RibN 말단 및 (공-막대 모형으로 나타낸) 리딩 서열의 대안적인 모형을 도시한다. RibN 말단의 카툰 모형은 접촉이 빈번한 부위 (높은 분율)에 해당하는 백색에서 접촉이 전혀 또는 거의 없는 부위에 해당하는 흑색으로 음영 처리하였다.
아울러, rib 도메인의 아미노산 보존을 다음과 같이 계산하였다; 완전한 스트렙토코커스 아갈락티애 게놈 144종을 PatricBRC에서 다운받았으며, blastp 2.9.0+를 이용해 이중 rib 도메인 95개를 검색하였다. 서열 95종을 Muscle v3.8.1551을 이용해 정렬하고, 아미노산 당 정규화된 정보량 (normalized information content)을 logomaker 0.8을 사용해 계산하였다. 보존 점수는 아래 표 1의 보존 (Cons.) 열에 기록하고, 도 5C에서 공-막대 모형으로 리딩 서열과 함께 RibN 말단의 표면을 나타내었다. RibN 말단의 표면 모형은 접촉이 보존 점수가 높은 부위에 해당하는 백색에서 보존 점수가 낮거나 또는 없는 부위에 해당하는 흑색으로 음영 처리하였다.
리드 서열의 AA 번호 도메인 (RibN) Sim .1 Sim .2 Sim .3 평균 분율 Cons.
1 91 2971 1 2 991 33.03% 0.60
2 93 3000 0 0 1000 33.32% 0.85
3 88 2553 1445 0 1333 44.41% 0.75
3 91 2298 403 344 1015 33.82% 0.60
3 93 2508 1872 0 1460 48.65% 0.85
4 92 0 0 2983 994 33.13% 0.66
4 93 862 0 2955 1272 42.40% 0.85
5 93 2162 0 2746 1636 54.52% 0.85
10 111 0 0 2745 915 30.49% 0.75
11 86 0 0 2729 910 30.31% 0.76
12 93 2763 1436 4 1401 46.68% 0.85
13 86 2754 556 0 1103 36.77% 0.76
14 86 339 2931 0 1090 36.32% 0.76
14 127 2824 0 0 941 31.37% 0.75
14 129 2474 1177 0 1217 40.55% 0.98
15 84 1877 1665 0 1181 39.34% 0.58
15 86 2 2980 0 994 33.12% 0.76
15 111 2893 2992 0 1962 65.37% 0.75
15 113 2986 0 0 995 33.17% 0.74
15 119 2971 0 0 990 33.00% 0.98
16 84 2723 1504 0 1409 46.95% 0.58
18 119 0 2680 32 904 30.12% 0.98
23 119 2230 2339 1223 1931 64.33% 0.98
23 127 2844 2907 2876 2876 95.82% 0.75
24 126 2989 2968 410 2122 70.72% 1.00
24 127 2994 2998 2953 2982 99.36% 0.75
24 129 0 0 2739 913 30.42% 0.98
25 126 2694 759 0 1151 38.35% 1.00
25 127 2907 2858 0 1922 64.03% 0.75
25 129 2818 2836 1203 2286 76.16% 0.98
26 109 0 0 2861 954 31.78% 0.77
26 126 2622 871 0 1164 38.80% 1.00
26 129 1002 1285 1504 1264 42.11% 0.98
27 93 0 2819 2968 1929 64.28% 0.85
28 88 0 2835 2985 1940 64.65% 0.75
29 131 2898 2893 0 1930 64.32% 0.77
30 130 2946 0 21 989 32.96% 0.79
30 131 3001 2257 938 2065 68.82% 0.77
31 107 0 1856 1464 1107 36.88% 0.75
31 131 2667 2987 2507 2720 90.65% 0.77
31 132 488 2558 0 1015 33.83% 0.85
31 133 754 2425 25 1068 35.59% 0.52
32 33 3001 3001 3001 3001 100.00% 1.00
32 34 1222 1801 1731 1585 52.80% 0.74
32 36 2987 2049 273 1770 58.97% 0.98
32 130 2805 0 0 935 31.16% 0.79
32 131 424 1753 2271 1483 49.41% 0.77
32 132 173 1229 1871 1091 36.35% 0.85
표 1은 리딩 서열 (아미노산 1-32)과 rib 도메인 (아미노산 33-204) 간의 안정적인 상호작용을 보여준다. 시뮬레이션 마지막 30 ns에 적어도 30% 시간 동안 상호작용하는 리딩 서열과 rib 도메인 간의 각 아미노산 쌍을 열거하였다. 각 리딩 서열 아미노산에서 가장 비율이 높은 것은 진하게 표시하였다. 아미노산 보존을 추정하여, Cons. 열에 기록하였다.
표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 4개의 구조 요소 쌍들이 상호작용을 지배하였다; 첫번째는 Rib 도메인의 메인 베타-시트들 (129-133) 중 하나에 병합된 도메인과 가장 가까운 리딩 서열 (29-32) 가닥이다. 2번째 요소는 베타-시트 2개를 연결하는 Rib 도메인의 루프 영역 (126-127)과 상호작용하는 리딩 서열 아미노산 23과 26 간이다. 3번째 상호작용은 수개의 베타-시트 (84, 113, 127)와 상호작용하는 리딩 서열 아미노산 12와 16 간이다. 마지막으로, 리딩 서열의 제1 파트 (1-5)는 Rib 도메인의 루프 (90-93)와 상호작용한다.
이러한 상호작용 쌍들은 Rib N-말단 파트를 수반하며, 보존된 아미노산 비율이 높으며, 이러한 높은 비율은 이들 파트가 GBS 박테리아의 세포 감염을 용이하게 하기 위한 Rib 단백질의 의도한 목적에 중요하다는 것을 의미한다.
이에, 표 1의 결과는, WO 2008127179의 RibN-AlpCN 융합 단백질의 32 아미노산 리딩 서열이 상당한 수준으로 융합 단백질 Rib 파트의 이러한 중요한 파트쪽으로 병합되어 상호작용함을 보여준다. 따라서, 리딩 서열은 시간적으로, 즉 시간의 적어도 30% 동안 이들 파트와 상호작용하여 이에 대한 접근성을 낮춘다. 이에, 면역 반응을 유도하기 위해 이용할 경우, 리딩 서열의 존재는 면역계가 Rib 단백질의 이러한 중요한 파트에 접근하는 접근성을 낮춘다. 이에 반하여, 서열번호 21에 따른 짧은 면역원성 융합 단백질은 이 리딩 서열을 포함하지 않는다. 따라서, 면역계가 이러한 중요한 파트에 접근하는 것을 낮추는 상호작용이 있을 수 없으며, 그래서 더 양호한 면역 반응이 달성될 것이다.
특히, 리딩 서열과 Rib 도메인 간의 상호작용은 리딩 서열의 여러 아미노산들에서 발생한다. 따라서, WO 2008127179의 면역원성 융합 단백질의 단축은 각 경우에 면역원성 융합 단백질의 RibN 도메인의 모든 파트들에 대한 상호작용의 감소 및 면역계의 접근 개선을 제공할 것이다. 이에, 리딩 서열의 아미노산 수개 제거와 같은 약간의 단축은 면역원성 융합 단백질의 RibN 도메인에 대한 면역계의 양호한 접근을 제공할 것이다.
도 5A-5C에 나타낸 바와 같이, 리딩 서열은 Rib N-말단의 한쪽 말단캡과 상호작용한다. 이러한 관찰 결과의 중요성은 하기 실시예 5에서 조사하였다.
실시예 5 - 리딩 서열에 의해 스크리닝한 Rib N-말단의 보존된 영역은, Rib 단백질이 상피 세포에 부착 및 침입하기 위해 α1β1 - 인테그린과 상호작용하는데 참여한다.
실시예 4에서 밝혀진 Rib N-말단의 보존된 영역의 중요성을 조사하였다. Rib가 GBS 표면 단백질이고 RibN 항체가 상피 세포 침입 등의 GBS 감염으로부터 보호를 제공한다는 점에서, 보존된 영역은 상피 세포에의 부착 및 침입을 촉진하는데 참여할 수 있다는 가설을 확립하였다.
Bolduc et al, Microbiology (2007), 153, 4039-4049에 언급된 서열로부터 α1β1-인테그린에 대해 알파폴드 (alphafold) 구조를 입수하였으며, 서열번호 21에 따른 융합 부분에 함유된 바와 같은 Rib N-말단과 α1β1-인테그린 간의 상호작용 시뮬레이션을 수행하였다. 도 6은 α1β1-인테그린이 흑색 표면 모형으로 표시되고 Rib N-말단이 연회색 표면 모형으로 표시된 결과를 보여준다. 도 6A에서, Rib N-말단은 도 5A-5C에서와 비슷한 방향성으로 도시하였다. 즉, 도 6에는 표시되지 않았지만, Rib N-말단의 우측 말단캡에 리딩 서열이 제공된다. 도 5A-5C와 비교한 바, 실시예 4에서 식별된 보존된 영역이 α1β1-인테그린과의 결합에 참여하는 것으로 추가로 확인되었다. 이들 결과는, N-말단이 α1β1-인테그린의 도메인 2 (폰 빌레브란트 인자, 타입 A) 및 도메인 3에 결합함을 추가로 보여준다.
따라서, 실시예 4 및 5는, 리딩 서열이 Rib N-말단의 보존된 영역과 상호작용하고 이를 스크리닝함을 입증해주며, 보존된 영역은 α1β1-인테그린과의 결합에, 즉 상피 세포 부착 및 침입에 참여한다.
이에, 리딩 서열이 구비된 Rib N-말단을 이용한 면역화는 리딩 서열의 스크리닝 효과로 인해 이들 보존된 영역의 노출 감소로 이어질 것이다. 이는 보존된 영역에 대한 면역 시스템 및/또는 항체 반응을 덜 효율적이게 만들 것이다.
이와는 대조적으로, N-말단을 단독으로 또는 본 발명의 제1 측면에 따른 융합 단백질 또는 서열번호 21의 일부로서 이용해, 리딩 서열 (서열번호 43)이 제거되거나 또는 적어도 단축된 Rib의 N-말단을 이용하여 면역화를 수행하면, 이들 보존된 영역은 면역계가 더 쉽게 접근할 수 있게 할 것이다. 따라서, 면역화된 숙주는 보존된 영역에 대한 항체의 형성이 더 용이해질 것이다. 보존된 영역에 대한 보다 효과적이고 완전한 중화는 α1β1-인테그린을 통한 상피 세포 부착 및 침입을 방지하는 보호를 높일 것이다.
요컨대, Rib 구성성분의 리딩 서열 (서열번호 43)이 제거되었거나 또는 적어도 단축된, 서열번호 21에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명의 제1 측면에 따른 융합 단백질의 사용은, 특히 내피 세포의 부착 및/또는 침입에 대해 개선된 보호를 제공함으로써, GBS에 대해 개선된 보호를 제공할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MinervaX Aps <120> IMMUNOGENIC FUSION PROTEIN <130> P30709PC <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 525 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 1 atggctgaag taatttcagg aagtgctgtt acgttaaaca caaatatgac taaaaatgtt 60 cagaatggta gagcatatat agatttatat gatgtgaaaa atgggaaaat agatccatta 120 caattaatta cgttaaattc acctgattta aaagctcagt atgtcattag gcaaggcggc 180 aattatttca cacaaccttc tgaattgact actgttggtg cagctagtat taattataca 240 gtattgaaga cagatggaag tcctcatacg aagcctgatg gacaagtgga tattataaac 300 gtttcattga ctatttacaa ttcttcagct ttgagagata aaatagatga agttaaaaag 360 aaagcggaag accctaaatg ggacgaggga agtcgcgata aagttttgat aagtttagat 420 gatatcaaaa cagatattga taataatcct aagacgcaat cagacattgc caataaaata 480 actgaagtta ctaatttaga aaaaatacta gtacctcgaa tccca 525 <210> 2 <211> 525 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 2 auggcugaag uaauuucagg aagugcuguu acguuaaaca caaauaugac uaaaaauguu 60 cagaauggua gagcauauau agauuuauau gaugugaaaa augggaaaau agauccauua 120 caauuaauua cguuaaauuc accugauuua aaagcucagu augucauuag gcaaggcggc 180 aauuauuuca cacaaccuuc ugaauugacu acuguuggug cagcuaguau uaauuauaca 240 guauugaaga cagauggaag uccucauacg aagccugaug gacaagugga uauuauaaac 300 guuucauuga cuauuuacaa uucuucagcu uugagagaua aaauagauga aguuaaaaag 360 aaagcggaag acccuaaaug ggacgaggga agucgcgaua aaguuuugau aaguuuagau 420 gauaucaaaa cagauauuga uaauaauccu aagacgcaau cagacauugc caauaaaaua 480 acugaaguua cuaauuuaga aaaaauacua guaccucgaa uccca 525 <210> 3 <211> 525 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 3 atggccgaag ttattagcgg tagcgcagtt accctgaata ccaatatgac caaaaatgtg 60 cagaatggcc gtgcctatat tgatctgtat gatgtgaaaa atggcaaaat cgatccgctg 120 cagctgatta ccctgaattc tccggatctg aaagcacagt atgttattcg tcagggtggt 180 aactatttta cccagccgag cgaactgacc accgttggtg cagcaagcat taactatacc 240 gttctgaaaa ccgatggtag tccgcatacc aaaccggatg gtcaggttga tattatcaat 300 gttagcctga ccatctataa tagcagcgca ctgcgtgata aaattgatga agtgaaaaag 360 aaagccgaag atccgaaatg ggatgaaggt agccgtgata aagttctgat tagcctggat 420 gatatcaaaa ccgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatattgc aaacaaaatt 480 accgaagtga ccaatctgga aaaaattctg gttccgcgta ttccg 525 <210> 4 <211> 525 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 4 auggccgaag uuauuagcgg uagcgcaguu acccugaaua ccaauaugac caaaaaugug 60 cagaauggcc gugccuauau ugaucuguau gaugugaaaa auggcaaaau cgauccgcug 120 cagcugauua cccugaauuc uccggaucug aaagcacagu auguuauucg ucaggguggu 180 aacuauuuua cccagccgag cgaacugacc accguuggug cagcaagcau uaacuauacc 240 guucugaaaa ccgaugguag uccgcauacc aaaccggaug gucagguuga uauuaucaau 300 guuagccuga ccaucuauaa uagcagcgca cugcgugaua aaauugauga agugaaaaag 360 aaagccgaag auccgaaaug ggaugaaggu agccgugaua aaguucugau uagccuggau 420 gauaucaaaa ccgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauauugc aaacaaaauu 480 accgaaguga ccaaucugga aaaaauucug guuccgcgua uuccg 525 <210> 5 <211> 525 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 5 atggccgaag tgatctccgg ctctgctgtg accctgaaca ccaacatgac caagaacgtg 60 cagaacggca gagcctacat cgacctgtac gatgtgaaga acggcaagat cgaccctctg 120 cagctgatca ccctgaactc tcccgatctg aaggcccagt acgtgatcag acaaggcggc 180 aactacttca cccagccttc cgagctgacc accgtgggag ccgcctctat caattacacc 240 gtgctgaaaa ccgacggctc ccctcacacc aagcctgatg gacaggtgga catcatcaac 300 gtgtccctga ccatctacaa cagcagcgcc ctgcgggaca agatcgatga agtgaagaag 360 aaggccgagg atcccaagtg ggacgagggc tctagagaca aggtgctgat ctccctggac 420 gacatcaaga ccgacatcga caacaacccc aagacacagt ccgatatcgc caacaagatc 480 accgaagtga ccaacctcga gaagatcctg gtgcctcgga tcccc 525 <210> 6 <211> 525 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 6 auggccgaag ugaucuccgg cucugcugug acccugaaca ccaacaugac caagaacgug 60 cagaacggca gagccuacau cgaccuguac gaugugaaga acggcaagau cgacccucug 120 cagcugauca cccugaacuc ucccgaucug aaggcccagu acgugaucag acaaggcggc 180 aacuacuuca cccagccuuc cgagcugacc accgugggag ccgccucuau caauuacacc 240 gugcugaaaa ccgacggcuc cccucacacc aagccugaug gacaggugga caucaucaac 300 gugucccuga ccaucuacaa cagcagcgcc cugcgggaca agaucgauga agugaagaag 360 aaggccgagg aucccaagug ggacgagggc ucuagagaca aggugcugau cucccuggac 420 gacaucaaga ccgacaucga caacaacccc aagacacagu ccgauaucgc caacaagauc 480 accgaaguga ccaaccucga gaagauccug gugccucgga ucccc 525 <210> 7 <211> 175 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 7 Met Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Val Thr Leu Asn Thr Asn Met 1 5 10 15 Thr Lys Asn Val Gln Asn Gly Arg Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val 20 25 30 Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Thr Leu Asn Ser Pro 35 40 45 Asp Leu Lys Ala Gln Tyr Val Ile Arg Gln Gly Gly Asn Tyr Phe Thr 50 55 60 Gln Pro Ser Glu Leu Thr Thr Val Gly Ala Ala Ser Ile Asn Tyr Thr 65 70 75 80 Val Leu Lys Thr Asp Gly Ser Pro His Thr Lys Pro Asp Gly Gln Val 85 90 95 Asp Ile Ile Asn Val Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Ser Ser Ala Leu Arg 100 105 110 Asp Lys Ile Asp Glu Val Lys Lys Lys Ala Glu Asp Pro Lys Trp Asp 115 120 125 Glu Gly Ser Arg Asp Lys Val Leu Ile Ser Leu Asp Asp Ile Lys Thr 130 135 140 Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile Ala Asn Lys Ile 145 150 155 160 Thr Glu Val Thr Asn Leu Glu Lys Ile Leu Val Pro Arg Ile Pro 165 170 175 <210> 8 <211> 516 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 8 tctacaattc cagggagtgc agcgacctta aatacaagca tcactaaaaa tatacaaaac 60 ggaaatgctt acatagattt atatgatgta aaattaggta aaatagatcc attacaatta 120 attgttttag aacaaggttt tacagcaaag tatgttttta gacaaggtac taaatactat 180 ggggatgttt ctcagttgca gagtacagga agggctagtc ttacctataa tatatttggt 240 gaagatggac taccacatgt aaagactgat ggacaaattg atatagttag tgttgcttta 300 actatttatg attcaacaac cttgagggat aagattgaag aagttagaac gaatgcaaac 360 gatcctaagt ggacggaaga aagtcgtact gaggttttaa caggattaga tacaattaag 420 acagatattg ataataatcc taagacgcaa acagatattg atagtaaaat tgttgaggtt 480 aatgaattag agaaattgtt agtattgtca taataa 516 <210> 9 <211> 516 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 9 ucuacaauuc cagggagugc agcgaccuua aauacaagca ucacuaaaaa uauacaaaac 60 ggaaaugcuu acauagauuu auaugaugua aaauuaggua aaauagaucc auuacaauua 120 auuguuuuag aacaagguuu uacagcaaag uauguuuuua gacaagguac uaaauacuau 180 ggggauguuu cucaguugca gaguacagga agggcuaguc uuaccuauaa uauauuuggu 240 gaagauggac uaccacaugu aaagacugau ggacaaauug auauaguuag uguugcuuua 300 acuauuuaug auucaacaac cuugagggau aagauugaag aaguuagaac gaaugcaaac 360 gauccuaagu ggacggaaga aagucguacu gagguuuuaa caggauuaga uacaauuaag 420 acagauauug auaauaaucc uaagacgcaa acagauauug auaguaaaau uguugagguu 480 aaugaauuag agaaauuguu aguauuguca uaauaa 516 <210> 10 <211> 516 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 10 agcaccattc cgggtagcgc agcaacactg aatacaagca ttaccaaaaa cattcagaac 60 ggcaacgcat atatcgatct gtacgacgtt aaactgggta aaattgatcc tctgcaactg 120 atcgttctgg aacagggttt taccgcaaaa tatgtgtttc gtcagggcac caaatactat 180 ggtgatgtta gccagctgca gagcaccggt cgtgcaagcc tgacctataa catttttggt 240 gaagatggtc tgccgcatgt taaaaccgat ggccagattg atatcgttag cgttgcactg 300 acgatttatg atagcaccac cctgcgcgat aaaatcgaag aagttcgtac caacgcaaac 360 gatcctaaat ggaccgaaga aagccgtacc gaagttctga ccggtctgga taccattaaa 420 acggatatcg acaataatcc taaaacgcag acagatattg atagcaaaat tgtggaagtg 480 aatgaactgg aaaaactgct ggttctgagc taataa 516 <210> 11 <211> 516 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 11 agcaccauuc cggguagcgc agcaacacug aauacaagca uuaccaaaaa cauucagaac 60 ggcaacgcau auaucgaucu guacgacguu aaacugggua aaauugaucc ucugcaacug 120 aucguucugg aacaggguuu uaccgcaaaa uauguguuuc gucagggcac caaauacuau 180 ggugauguua gccagcugca gagcaccggu cgugcaagcc ugaccuauaa cauuuuuggu 240 gaagaugguc ugccgcaugu uaaaaccgau ggccagauug auaucguuag cguugcacug 300 acgauuuaug auagcaccac ccugcgcgau aaaaucgaag aaguucguac caacgcaaac 360 gauccuaaau ggaccgaaga aagccguacc gaaguucuga ccggucugga uaccauuaaa 420 acggauaucg acaauaaucc uaaaacgcag acagauauug auagcaaaau uguggaagug 480 aaugaacugg aaaaacugcu gguucugagc uaauaa 516 <210> 12 <211> 516 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 12 agcacaatcc ctggatctgc cgccacactg aacacctcta tcaccaagaa catccagaat 60 gggaacgctt acatcgatct ctacgacgtc aagctgggca agattgatcc cctccagctc 120 atcgtgctgg aacagggctt caccgccaaa tacgtgttcc ggcagggcac caagtactac 180 ggggatgtgt cacagctgca gtccaccggc agagcttccc tgacctacaa catcttcggc 240 gaggatggcc tgcctcacgt gaaaacagat ggccagatcg acatcgtgtc tgtggctctg 300 acaatctacg actccaccac actgcgcgat aagattgagg aagtgcggac caacgccaac 360 gatcctaagt ggaccgagga atccagaacc gaggtgctga ccggcctgga caccattaag 420 acagatattg ataacaatcc taagactcag acagacatcg attccaagat cgtggaagtc 480 aacgagctgg aaaagctgct ggtgctgtcc tgatga 516 <210> 13 <211> 516 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 13 agcacaaucc cuggaucugc cgccacacug aacaccucua ucaccaagaa cauccagaau 60 gggaacgcuu acaucgaucu cuacgacguc aagcugggca agauugaucc ccuccagcuc 120 aucgugcugg aacagggcuu caccgccaaa uacguguucc ggcagggcac caaguacuac 180 ggggaugugu cacagcugca guccaccggc agagcuuccc ugaccuacaa caucuucggc 240 gaggauggcc ugccucacgu gaaaacagau ggccagaucg acaucguguc uguggcucug 300 acaaucuacg acuccaccac acugcgcgau aagauugagg aagugcggac caacgccaac 360 gauccuaagu ggaccgagga auccagaacc gaggugcuga ccggccugga caccauuaag 420 acagauauug auaacaaucc uaagacucag acagacaucg auuccaagau cguggaaguc 480 aacgagcugg aaaagcugcu ggugcugucc ugauga 516 <210> 14 <211> 170 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 14 Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr Lys 1 5 10 15 Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys Leu 20 25 30 Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Val Leu Glu Gln Gly Phe Thr 35 40 45 Ala Lys Tyr Val Phe Arg Gln Gly Thr Lys Tyr Tyr Gly Asp Val Ser 50 55 60 Gln Leu Gln Ser Thr Gly Arg Ala Ser Leu Thr Tyr Asn Ile Phe Gly 65 70 75 80 Glu Asp Gly Leu Pro His Val Lys Thr Asp Gly Gln Ile Asp Ile Val 85 90 95 Ser Val Ala Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Thr Leu Arg Asp Lys Ile 100 105 110 Glu Glu Val Arg Thr Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Thr Glu Glu Ser 115 120 125 Arg Thr Glu Val Leu Thr Gly Leu Asp Thr Ile Lys Thr Asp Ile Asp 130 135 140 Asn Asn Pro Lys Thr Gln Thr Asp Ile Asp Ser Lys Ile Val Glu Val 145 150 155 160 Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Ser 165 170 <210> 15 <211> 1047 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 15 atggctgaag taatttcagg aagtgctgtt acgttaaaca caaatatgac taaaaatgtt 60 cagaatggta gagcatatat agatttatat gatgtgaaaa atgggaaaat agatccatta 120 caattaatta cgttaaattc acctgattta aaagctcagt atgtcattag gcaaggcggc 180 aattatttca cacaaccttc tgaattgact actgttggtg cagctagtat taattataca 240 gtattgaaga cagatggaag tcctcatacg aagcctgatg gacaagtgga tattataaac 300 gtttcattga ctatttacaa ttcttcagct ttgagagata aaatagatga agttaaaaag 360 aaagcggaag accctaaatg ggacgaggga agtcgcgata aagttttgat aagtttagat 420 gatatcaaaa cagatattga taataatcct aagacgcaat cagacattgc caataaaata 480 actgaagtta ctaatttaga aaaaatacta gtacctcgaa tcccagaatt ctctacaatt 540 ccagggagtg cagcgacctt aaatacaagc atcactaaaa atatacaaaa cggaaatgct 600 tacatagatt tatatgatgt aaaattaggt aaaatagatc cattacaatt aattgtttta 660 gaacaaggtt ttacagcaaa gtatgttttt agacaaggta ctaaatacta tggggatgtt 720 tctcagttgc agagtacagg aagggctagt cttacctata atatatttgg tgaagatgga 780 ctaccacatg taaagactga tggacaaatt gatatagtta gtgttgcttt aactatttat 840 gattcaacaa ccttgaggga taagattgaa gaagttagaa cgaatgcaaa cgatcctaag 900 tggacggaag aaagtcgtac tgaggtttta acaggattag atacaattaa gacagatatt 960 gataataatc ctaagacgca aacagatatt gatagtaaaa ttgttgaggt taatgaatta 1020 gagaaattgt tagtattgtc ataataa 1047 <210> 16 <211> 1047 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 16 auggcugaag uaauuucagg aagugcuguu acguuaaaca caaauaugac uaaaaauguu 60 cagaauggua gagcauauau agauuuauau gaugugaaaa augggaaaau agauccauua 120 caauuaauua cguuaaauuc accugauuua aaagcucagu augucauuag gcaaggcggc 180 aauuauuuca cacaaccuuc ugaauugacu acuguuggug cagcuaguau uaauuauaca 240 guauugaaga cagauggaag uccucauacg aagccugaug gacaagugga uauuauaaac 300 guuucauuga cuauuuacaa uucuucagcu uugagagaua aaauagauga aguuaaaaag 360 aaagcggaag acccuaaaug ggacgaggga agucgcgaua aaguuuugau aaguuuagau 420 gauaucaaaa cagauauuga uaauaauccu aagacgcaau cagacauugc caauaaaaua 480 acugaaguua cuaauuuaga aaaaauacua guaccucgaa ucccagaauu cucuacaauu 540 ccagggagug cagcgaccuu aaauacaagc aucacuaaaa auauacaaaa cggaaaugcu 600 uacauagauu uauaugaugu aaaauuaggu aaaauagauc cauuacaauu aauuguuuua 660 gaacaagguu uuacagcaaa guauguuuuu agacaaggua cuaaauacua uggggauguu 720 ucucaguugc agaguacagg aagggcuagu cuuaccuaua auauauuugg ugaagaugga 780 cuaccacaug uaaagacuga uggacaaauu gauauaguua guguugcuuu aacuauuuau 840 gauucaacaa ccuugaggga uaagauugaa gaaguuagaa cgaaugcaaa cgauccuaag 900 uggacggaag aaagucguac ugagguuuua acaggauuag auacaauuaa gacagauauu 960 gauaauaauc cuaagacgca aacagauauu gauaguaaaa uuguugaggu uaaugaauua 1020 gagaaauugu uaguauuguc auaauaa 1047 <210> 17 <211> 1047 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 17 atggccgaag ttattagcgg tagcgcagtt accctgaata ccaatatgac caaaaatgtg 60 cagaatggcc gtgcctatat tgatctgtat gatgtgaaaa atggcaaaat cgatccgctg 120 cagctgatta ccctgaattc tccggatctg aaagcacagt atgttattcg tcagggtggt 180 aactatttta cccagccgag cgaactgacc accgttggtg cagcaagcat taactatacc 240 gttctgaaaa ccgatggtag tccgcatacc aaaccggatg gtcaggttga tattatcaat 300 gttagcctga ccatctataa tagcagcgca ctgcgtgata aaattgatga agtgaaaaag 360 aaagccgaag atccgaaatg ggatgaaggt agccgtgata aagttctgat tagcctggat 420 gatatcaaaa ccgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatattgc aaacaaaatt 480 accgaagtga ccaatctgga aaaaattctg gttccgcgta ttccggaatt tagcaccatt 540 ccgggtagcg cagcaacact gaatacaagc attaccaaaa acattcagaa cggcaacgca 600 tatatcgatc tgtacgacgt taaactgggt aaaattgatc ctctgcaact gatcgttctg 660 gaacagggtt ttaccgcaaa atatgtgttt cgtcagggca ccaaatacta tggtgatgtt 720 agccagctgc agagcaccgg tcgtgcaagc ctgacctata acatttttgg tgaagatggt 780 ctgccgcatg ttaaaaccga tggccagatt gatatcgtta gcgttgcact gacgatttat 840 gatagcacca ccctgcgcga taaaatcgaa gaagttcgta ccaacgcaaa cgatcctaaa 900 tggaccgaag aaagccgtac cgaagttctg accggtctgg ataccattaa aacggatatc 960 gacaataatc ctaaaacgca gacagatatt gatagcaaaa ttgtggaagt gaatgaactg 1020 gaaaaactgc tggttctgag ctaataa 1047 <210> 18 <211> 1047 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 18 auggccgaag uuauuagcgg uagcgcaguu acccugaaua ccaauaugac caaaaaugug 60 cagaauggcc gugccuauau ugaucuguau gaugugaaaa auggcaaaau cgauccgcug 120 cagcugauua cccugaauuc uccggaucug aaagcacagu auguuauucg ucaggguggu 180 aacuauuuua cccagccgag cgaacugacc accguuggug cagcaagcau uaacuauacc 240 guucugaaaa ccgaugguag uccgcauacc aaaccggaug gucagguuga uauuaucaau 300 guuagccuga ccaucuauaa uagcagcgca cugcgugaua aaauugauga agugaaaaag 360 aaagccgaag auccgaaaug ggaugaaggu agccgugaua aaguucugau uagccuggau 420 gauaucaaaa ccgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauauugc aaacaaaauu 480 accgaaguga ccaaucugga aaaaauucug guuccgcgua uuccggaauu uagcaccauu 540 ccggguagcg cagcaacacu gaauacaagc auuaccaaaa acauucagaa cggcaacgca 600 uauaucgauc uguacgacgu uaaacugggu aaaauugauc cucugcaacu gaucguucug 660 gaacaggguu uuaccgcaaa auauguguuu cgucagggca ccaaauacua uggugauguu 720 agccagcugc agagcaccgg ucgugcaagc cugaccuaua acauuuuugg ugaagauggu 780 cugccgcaug uuaaaaccga uggccagauu gauaucguua gcguugcacu gacgauuuau 840 gauagcacca cccugcgcga uaaaaucgaa gaaguucgua ccaacgcaaa cgauccuaaa 900 uggaccgaag aaagccguac cgaaguucug accggucugg auaccauuaa aacggauauc 960 gacaauaauc cuaaaacgca gacagauauu gauagcaaaa uuguggaagu gaaugaacug 1020 gaaaaacugc ugguucugag cuaauaa 1047 <210> 19 <211> 1047 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 19 atggccgaag tgatctccgg ctctgctgtg accctgaaca ccaacatgac caagaacgtg 60 cagaacggca gagcctacat cgacctgtac gatgtgaaga acggcaagat cgaccctctg 120 cagctgatca ccctgaactc tcccgatctg aaggcccagt acgtgatcag acaaggcggc 180 aactacttca cccagccttc cgagctgacc accgtgggag ccgcctctat caattacacc 240 gtgctgaaaa ccgacggctc ccctcacacc aagcctgatg gacaggtgga catcatcaac 300 gtgtccctga ccatctacaa cagcagcgcc ctgcgggaca agatcgatga agtgaagaag 360 aaggccgagg atcccaagtg ggacgagggc tctagagaca aggtgctgat ctccctggac 420 gacatcaaga ccgacatcga caacaacccc aagacacagt ccgatatcgc caacaagatc 480 accgaagtga ccaacctcga gaagatcctg gtgcctcgga tccccgagtt cagcacaatc 540 cctggatctg ccgccacact gaacacctct atcaccaaga acatccagaa tgggaacgct 600 tacatcgatc tctacgacgt caagctgggc aagattgatc ccctccagct catcgtgctg 660 gaacagggct tcaccgccaa atacgtgttc cggcagggca ccaagtacta cggggatgtg 720 tcacagctgc agtccaccgg cagagcttcc ctgacctaca acatcttcgg cgaggatggc 780 ctgcctcacg tgaaaacaga tggccagatc gacatcgtgt ctgtggctct gacaatctac 840 gactccacca cactgcgcga taagattgag gaagtgcgga ccaacgccaa cgatcctaag 900 tggaccgagg aatccagaac cgaggtgctg accggcctgg acaccattaa gacagatatt 960 gataacaatc ctaagactca gacagacatc gattccaaga tcgtggaagt caacgagctg 1020 gaaaagctgc tggtgctgtc ctgatga 1047 <210> 20 <211> 1047 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 20 auggccgaag ugaucuccgg cucugcugug acccugaaca ccaacaugac caagaacgug 60 cagaacggca gagccuacau cgaccuguac gaugugaaga acggcaagau cgacccucug 120 cagcugauca cccugaacuc ucccgaucug aaggcccagu acgugaucag acaaggcggc 180 aacuacuuca cccagccuuc cgagcugacc accgugggag ccgccucuau caauuacacc 240 gugcugaaaa ccgacggcuc cccucacacc aagccugaug gacaggugga caucaucaac 300 gugucccuga ccaucuacaa cagcagcgcc cugcgggaca agaucgauga agugaagaag 360 aaggccgagg aucccaagug ggacgagggc ucuagagaca aggugcugau cucccuggac 420 gacaucaaga ccgacaucga caacaacccc aagacacagu ccgauaucgc caacaagauc 480 accgaaguga ccaaccucga gaagauccug gugccucgga uccccgaguu cagcacaauc 540 ccuggaucug ccgccacacu gaacaccucu aucaccaaga acauccagaa ugggaacgcu 600 uacaucgauc ucuacgacgu caagcugggc aagauugauc cccuccagcu caucgugcug 660 gaacagggcu ucaccgccaa auacguguuc cggcagggca ccaaguacua cggggaugug 720 ucacagcugc aguccaccgg cagagcuucc cugaccuaca acaucuucgg cgaggauggc 780 cugccucacg ugaaaacaga uggccagauc gacaucgugu cuguggcucu gacaaucuac 840 gacuccacca cacugcgcga uaagauugag gaagugcgga ccaacgccaa cgauccuaag 900 uggaccgagg aauccagaac cgaggugcug accggccugg acaccauuaa gacagauauu 960 gauaacaauc cuaagacuca gacagacauc gauuccaaga ucguggaagu caacgagcug 1020 gaaaagcugc uggugcuguc cugauga 1047 <210> 21 <211> 347 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 21 Met Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Val Thr Leu Asn Thr Asn Met 1 5 10 15 Thr Lys Asn Val Gln Asn Gly Arg Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val 20 25 30 Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Thr Leu Asn Ser Pro 35 40 45 Asp Leu Lys Ala Gln Tyr Val Ile Arg Gln Gly Gly Asn 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gtggaagtga acgagctgga aaaactgctg gttctgccg 519 <210> 23 <211> 519 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 23 auggccgaag uuauuagcgg uagcgcagca acccugaaua gcgcacuggu uaaaaauguu 60 agcgguggca aagccuauau cgacaucuau gaugugaaaa acggcaaaau ugauccgcug 120 aaucugauug uucugccucc gagcaauuau agcgccaacu auuauaucaa acaggguggu 180 cgcauuuuca ccaauguuaa ucagcugcag acaccgggua cagcaaccau uaccuauaac 240 auucuggaug aaaauggcaa cccguauacc aaaagugaug gccagauuga uauuguuagc 300 cugguuacca ccguuuauga uaccaccgaa cugcgcaaua acaucaacaa aguuauugag 360 aaugccaacg acccgaaaug gucagaugau agccguaaag auguucugag caaaaucgag 420 gugaucaaaa acgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauaucga caacaaaauu 480 guggaaguga acgagcugga aaaacugcug guucugccg 519 <210> 24 <211> 519 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 24 atggccgaag ttattagcgg tagcgcagca accctgaata gcgcactggt taaaaatgtt 60 agcggtggca aagcctatat cgacatctat gatgtgaaaa acggcaaaat tgatccgctg 120 aatctgattg ttctgacccc gagcaattat agcgccaact attatatcaa acagggtggt 180 cgtattttca ccagcgttaa tcagctgcag acaccgggta cagcaaccat tacctataac 240 attctggatg aaaatggcaa cccgtatacc aaaagtgatg gccagattga tattgttagc 300 ctggttacca ccgtttatga taccaccgaa ctgcgcaata acatcaacaa agttattgag 360 aatgccaacg acccgaaatg gtcagatgat agccgtaaag atgttctgag caaaatcgag 420 gtgatcaaaa acgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatatcga caacaaaatt 480 gtggaagtga acgagctgga aaaactgctg gttctgccg 519 <210> 25 <211> 519 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 25 auggccgaag uuauuagcgg uagcgcagca acccugaaua gcgcacuggu uaaaaauguu 60 agcgguggca aagccuauau cgacaucuau gaugugaaaa acggcaaaau ugauccgcug 120 aaucugauug uucugacccc gagcaauuau agcgccaacu auuauaucaa acaggguggu 180 cguauuuuca ccagcguuaa ucagcugcag acaccgggua cagcaaccau uaccuauaac 240 auucuggaug aaaauggcaa cccguauacc aaaagugaug gccagauuga uauuguuagc 300 cugguuacca ccguuuauga uaccaccgaa cugcgcaaua acaucaacaa aguuauugag 360 aaugccaacg acccgaaaug gucagaugau agccguaaag auguucugag caaaaucgag 420 gugaucaaaa acgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauaucga caacaaaauu 480 guggaaguga acgagcugga aaaacugcug guucugccg 519 <210> 26 <211> 519 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 26 atggccgaag tgatctccgg ctctgctgct accctgaact ctgccctggt caagaatgtg 60 tctggcggca aggcctacat cgacatctac gacgtgaaga acggcaagat cgaccctctg 120 aacctgatcg tgctgacccc ttccaactac tccgccaact actacatcaa gcaaggcggc 180 agaatcttca cctccgtgaa ccagctgcag acccctggca ccgctaccat cacctacaac 240 atcctggacg agaatggcaa cccctacacc aagtccgacg gccagatcga tatcgtgtcc 300 ctggtcacca ccgtgtacga caccaccgag ctgcggaaca acatcaacaa agtgatcgag 360 aacgccaacg atcccaagtg gagcgacgac tctagaaagg acgtgctgtc caagatcgaa 420 gtcatcaaga acgacatcga caacaacccc aagacacagt ccgacattga taacaagatc 480 gtggaagtga acgagctgga aaagctgctg gtgctgccc 519 <210> 27 <211> 519 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 27 auggccgaag ugaucuccgg cucugcugcu acccugaacu cugcccuggu caagaaugug 60 ucuggcggca aggccuacau cgacaucuac gacgugaaga acggcaagau cgacccucug 120 aaccugaucg ugcugacccc uuccaacuac uccgccaacu acuacaucaa gcaaggcggc 180 agaaucuuca ccuccgugaa ccagcugcag accccuggca ccgcuaccau caccuacaac 240 auccuggacg agaauggcaa ccccuacacc aaguccgacg gccagaucga uaucgugucc 300 cuggucacca ccguguacga caccaccgag cugcggaaca acaucaacaa agugaucgag 360 aacgccaacg aucccaagug gagcgacgac ucuagaaagg acgugcuguc caagaucgaa 420 gucaucaaga acgacaucga caacaacccc aagacacagu ccgacauuga uaacaagauc 480 guggaaguga acgagcugga aaagcugcug gugcugccc 519 <210> 28 <211> 173 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 28 Met Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Ser Ala Leu 1 5 10 15 Val Lys Asn Val Ser Gly Gly Lys Ala Tyr Ile Asp Ile Tyr Asp Val 20 25 30 Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Asn Leu Ile Val Leu Thr Pro Ser 35 40 45 Asn Tyr Ser Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Arg Ile Phe Thr 50 55 60 Ser Val Asn Gln Leu Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ile Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Ile Leu Asp Glu Asn Gly Asn Pro Tyr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Ile 85 90 95 Asp Ile Val Ser Leu Val Thr Thr Val Tyr Asp Thr Thr Glu Leu Arg 100 105 110 Asn Asn Ile Asn Lys Val 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30 agcaccauuc cggguucagc agccacacug aauaccagca uuaccaaaaa cauucagaau 60 ggcaacgccu acauugaucu guacgaugua aaaaaugguc ugaucgaucc gcagaaccug 120 aucgugcuga auccgagcag cuauucagcc aauuauuaua uuaaacaagg cgcaaaauac 180 uauagcaacc cgagcgaaau uaccaccacc gguagcgcca ccauuacguu uaauauccug 240 gacgaaaccg guaacccgca uaaaaaagca gauggucaaa uugauaucgu gagcguuaac 300 cugacgauuu augauagcac agcccugcgu aaucguauug augaagugau uaauaacgcg 360 aaugauccua aaugguccga ugguagucgu gaugaaguac ugaccggucu ggaaaaaauc 420 aaaaaagaca ucgacaauaa uccgaaaacg cagauugaca uugacaauaa aaucaacgag 480 gugaacgaga ucgagaaacu gcugguaguu agccuguaau aa 522 <210> 31 <211> 522 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 31 agcaccattc cgggttcagc agccacactg aataccagca ttaccaaaaa cattcagaat 60 ggcaacgcct acattgatct gtacgatgta aaaaatggtc tgatcgatcc gcagaacctg 120 atcgtgctga atccgagcag ctattcagcc aattattata ttaaacaagg cgcaaaatac 180 tatagcaacc cgagcgaaat taccaccacc ggtagcgcca ccattacgtt taatatcctg 240 gacgaaaccg gtaacccgca taaaaaagca gatggtcaaa ttgatatcgt gagcgttaac 300 ctgacgattt atgatagcac agccctgcgt aatcgtattg atgaagtgat taataacgcg 360 aatgatccta aatggtccga tggtagtcgt gatgaagtac tgaccggtct ggaaaaaatc 420 aaaaaagaca tcgacaataa tccgaaaacg cagattgaca ttgacaataa aatcaacgag 480 gtgaacgaga tcgagaaact gctggtagtt agcctgtaat aa 522 <210> 32 <211> 522 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 32 agcaccauuc cggguucagc agccacacug aauaccagca uuaccaaaaa cauucagaau 60 ggcaacgccu acauugaucu guacgaugua aaaaaugguc ugaucgaucc gcagaaccug 120 aucgugcuga auccgagcag cuauucagcc aauuauuaua uuaaacaagg cgcaaaauac 180 uauagcaacc cgagcgaaau uaccaccacc gguagcgcca ccauuacguu uaauauccug 240 gacgaaaccg guaacccgca uaaaaaagca gauggucaaa uugauaucgu gagcguuaac 300 cugacgauuu augauagcac agcccugcgu aaucguauug augaagugau uaauaacgcg 360 aaugauccua aaugguccga ugguagucgu gaugaaguac ugaccggucu ggaaaaaauc 420 aaaaaagaca ucgacaauaa uccgaaaacg cagauugaca uugacaauaa aaucaacgag 480 gugaacgaga ucgagaaacu gcugguaguu agccuguaau aa 522 <210> 33 <211> 522 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 33 agcacaatcc ctggatctgc cgccacactg aacacctcca tcaccaagaa tatccagaac 60 gggaacgctt acatcgacct gtatgatgtc aagaacgggc tgatcgatcc ccagaatctg 120 attgtgctca acccctcctc ctactctgct aattactata ttaagcaggg cgccaagtac 180 tactctaacc cctccgagat caccaccacc ggctccgcca ccatcacatt caatattctg 240 gatgagacag gcaaccctca caagaaggct gacggacaga ttgacattgt gtctgtgaac 300 ctgaccatct acgattccac cgctctgcgg aaccggatcg atgaagtgat caacaacgct 360 aatgacccta agtggagtga cggctccaga gatgaggtgc tgaccggcct ggaaaagatc 420 aagaaggata tcgataacaa tcctaaaact cagatcgata ttgacaacaa gatcaacgaa 480 gtcaacgaga tcgagaagct cctggtcgtg tctctgtgat ga 522 <210> 34 <211> 522 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 34 agcacaaucc cuggaucugc cgccacacug aacaccucca ucaccaagaa uauccagaac 60 gggaacgcuu acaucgaccu guaugauguc aagaacgggc ugaucgaucc ccagaaucug 120 auugugcuca accccuccuc cuacucugcu aauuacuaua uuaagcaggg cgccaaguac 180 uacucuaacc ccuccgagau caccaccacc ggcuccgcca ccaucacauu caauauucug 240 gaugagacag gcaacccuca caagaaggcu gacggacaga uugacauugu gucugugaac 300 cugaccaucu acgauuccac cgcucugcgg aaccggaucg augaagugau caacaacgcu 360 aaugacccua aguggaguga cggcuccaga gaugaggugc ugaccggccu ggaaaagauc 420 aagaaggaua ucgauaacaa uccuaaaacu cagaucgaua uugacaacaa gaucaacgaa 480 gucaacgaga ucgagaagcu ccuggucgug ucucugugau ga 522 <210> 35 <211> 172 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 35 Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr Lys 1 5 10 15 Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys Asn 20 25 30 Gly Leu Ile Asp Pro Gln Asn Leu Ile Val Leu Asn Pro Ser Ser Tyr 35 40 45 Ser Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Ala Lys Tyr Tyr Ser Asn Pro 50 55 60 Ser Glu Ile Thr Thr Thr Gly Ser Ala Thr Ile Thr Phe Asn Ile Leu 65 70 75 80 Asp Glu Thr Gly Asn Pro His Lys Lys Ala Asp Gly Gln Ile Asp Ile 85 90 95 Val Ser Val Asn Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Ala Leu Arg Asn Arg 100 105 110 Ile Asp Glu Val Ile Asn Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser Asp Gly 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Val Leu Thr Gly Leu Glu Lys Ile Lys Lys Asp Ile 130 135 140 Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ile Asp Ile Asp Asn Lys Ile Asn Glu 145 150 155 160 Val Asn Glu Ile Glu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu 165 170 <210> 36 <211> 1047 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 36 atggccgaag ttattagcgg tagcgcagca accctgaata gcgcactggt taaaaatgtt 60 agcggtggca aagcctatat cgacatctat gatgtgaaaa acggcaaaat tgatccgctg 120 aatctgattg ttctgcctcc gagcaattat agcgccaact attatatcaa acagggtggt 180 cgcattttca ccaatgttaa tcagctgcag acaccgggta cagcaaccat tacctataac 240 attctggatg aaaatggcaa cccgtatacc aaaagtgatg gccagattga tattgttagc 300 ctggttacca ccgtttatga taccaccgaa ctgcgcaata acatcaacaa agttattgag 360 aatgccaacg acccgaaatg gtcagatgat agccgtaaag atgttctgag caaaatcgag 420 gtgatcaaaa acgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatatcga caacaaaatt 480 gtggaagtga acgagctgga aaaactgctg gttctgccgg aatttagcac cattccgggt 540 tcagcagcca cactgaatac cagcattacc aaaaacattc agaatggcaa cgcctacatt 600 gatctgtacg atgtaaaaaa tggtctgatc gatccgcaga acctgatcgt gctgaatccg 660 agcagctatt cagccaatta ttatattaaa caaggcgcaa aatactatag caacccgagc 720 gaaattacca ccaccggtag cgccaccatt acgtttaata tcctggacga aaccggtaac 780 ccgcataaaa aagcagatgg tcaaattgat atcgtgagcg ttaacctgac gatttatgat 840 agcacagccc tgcgtaatcg tattgatgaa gtgattaata acgcgaatga tcctaaatgg 900 tccgatggta gtcgtgatga agtactgacc ggtctggaaa aaatcaaaaa agacatcgac 960 aataatccga aaacgcagat tgacattgac aataaaatca acgaggtgaa cgagatcgag 1020 aaactgctgg tagttagcct gtaataa 1047 <210> 37 <211> 1047 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 37 auggccgaag uuauuagcgg uagcgcagca acccugaaua gcgcacuggu uaaaaauguu 60 agcgguggca aagccuauau cgacaucuau gaugugaaaa acggcaaaau ugauccgcug 120 aaucugauug uucugccucc gagcaauuau agcgccaacu auuauaucaa acaggguggu 180 cgcauuuuca ccaauguuaa ucagcugcag acaccgggua cagcaaccau uaccuauaac 240 auucuggaug aaaauggcaa cccguauacc aaaagugaug gccagauuga uauuguuagc 300 cugguuacca ccguuuauga uaccaccgaa cugcgcaaua acaucaacaa aguuauugag 360 aaugccaacg acccgaaaug gucagaugau agccguaaag auguucugag caaaaucgag 420 gugaucaaaa acgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauaucga caacaaaauu 480 guggaaguga acgagcugga aaaacugcug guucugccgg aauuuagcac cauuccgggu 540 ucagcagcca cacugaauac cagcauuacc aaaaacauuc agaauggcaa cgccuacauu 600 gaucuguacg auguaaaaaa uggucugauc gauccgcaga accugaucgu gcugaauccg 660 agcagcuauu cagccaauua uuauauuaaa caaggcgcaa aauacuauag caacccgagc 720 gaaauuacca ccaccgguag cgccaccauu acguuuaaua uccuggacga aaccgguaac 780 ccgcauaaaa aagcagaugg ucaaauugau aucgugagcg uuaaccugac gauuuaugau 840 agcacagccc ugcguaaucg uauugaugaa gugauuaaua acgcgaauga uccuaaaugg 900 uccgauggua gucgugauga aguacugacc ggucuggaaa aaaucaaaaa agacaucgac 960 aauaauccga aaacgcagau ugacauugac aauaaaauca acgaggugaa cgagaucgag 1020 aaacugcugg uaguuagccu guaauaa 1047 <210> 38 <211> 1047 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 38 atggccgaag ttattagcgg tagcgcagca accctgaata gcgcactggt taaaaatgtt 60 agcggtggca aagcctatat cgacatctat gatgtgaaaa acggcaaaat tgatccgctg 120 aatctgattg ttctgacccc gagcaattat agcgccaact attatatcaa acagggtggt 180 cgtattttca ccagcgttaa tcagctgcag acaccgggta cagcaaccat tacctataac 240 attctggatg aaaatggcaa cccgtatacc aaaagtgatg gccagattga tattgttagc 300 ctggttacca ccgtttatga taccaccgaa ctgcgcaata acatcaacaa agttattgag 360 aatgccaacg acccgaaatg gtcagatgat agccgtaaag atgttctgag caaaatcgag 420 gtgatcaaaa acgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatatcga caacaaaatt 480 gtggaagtga acgagctgga aaaactgctg gttctgccgg aatttagcac cattccgggt 540 tcagcagcca cactgaatac cagcattacc aaaaacattc agaatggcaa cgcctacatt 600 gatctgtacg atgtaaaaaa tggtctgatc gatccgcaga acctgatcgt gctgaatccg 660 agcagctatt cagccaatta ttatattaaa caaggcgcaa aatactatag caacccgagc 720 gaaattacca ccaccggtag cgccaccatt acgtttaata tcctggacga aaccggtaac 780 ccgcataaaa aagcagatgg tcaaattgat atcgtgagcg ttaacctgac gatttatgat 840 agcacagccc tgcgtaatcg tattgatgaa gtgattaata acgcgaatga tcctaaatgg 900 tccgatggta gtcgtgatga agtactgacc ggtctggaaa aaatcaaaaa agacatcgac 960 aataatccga aaacgcagat tgacattgac aataaaatca acgaggtgaa cgagatcgag 1020 aaactgctgg tagttagcct gtaataa 1047 <210> 39 <211> 1047 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 39 auggccgaag uuauuagcgg uagcgcagca acccugaaua gcgcacuggu uaaaaauguu 60 agcgguggca aagccuauau cgacaucuau gaugugaaaa acggcaaaau ugauccgcug 120 aaucugauug uucugacccc gagcaauuau agcgccaacu auuauaucaa acaggguggu 180 cguauuuuca ccagcguuaa ucagcugcag acaccgggua cagcaaccau uaccuauaac 240 auucuggaug aaaauggcaa cccguauacc aaaagugaug gccagauuga uauuguuagc 300 cugguuacca ccguuuauga uaccaccgaa cugcgcaaua acaucaacaa aguuauugag 360 aaugccaacg acccgaaaug gucagaugau agccguaaag auguucugag caaaaucgag 420 gugaucaaaa acgauauuga uaacaacccg aaaacccaga gcgauaucga caacaaaauu 480 guggaaguga acgagcugga aaaacugcug guucugccgg aauuuagcac cauuccgggu 540 ucagcagcca cacugaauac cagcauuacc aaaaacauuc agaauggcaa cgccuacauu 600 gaucuguacg auguaaaaaa uggucugauc gauccgcaga accugaucgu gcugaauccg 660 agcagcuauu cagccaauua uuauauuaaa caaggcgcaa aauacuauag caacccgagc 720 gaaauuacca ccaccgguag cgccaccauu acguuuaaua uccuggacga aaccgguaac 780 ccgcauaaaa aagcagaugg ucaaauugau aucgugagcg uuaaccugac gauuuaugau 840 agcacagccc ugcguaaucg uauugaugaa gugauuaaua acgcgaauga uccuaaaugg 900 uccgauggua gucgugauga aguacugacc ggucuggaaa aaaucaaaaa agacaucgac 960 aauaauccga aaacgcagau ugacauugac aauaaaauca acgaggugaa cgagaucgag 1020 aaacugcugg uaguuagccu guaauaa 1047 <210> 40 <211> 1047 <212> DNA <213> Streptococcus sp. <400> 40 atggccgaag tgatctccgg ctctgctgct accctgaact ctgccctggt caagaatgtg 60 tctggcggca aggcctacat cgacatctac gacgtgaaga acggcaagat cgaccctctg 120 aacctgatcg tgctgacccc ttccaactac tccgccaact actacatcaa gcaaggcggc 180 agaatcttca cctccgtgaa ccagctgcag acccctggca ccgctaccat cacctacaac 240 atcctggacg agaatggcaa cccctacacc aagtccgacg gccagatcga tatcgtgtcc 300 ctggtcacca ccgtgtacga caccaccgag ctgcggaaca acatcaacaa agtgatcgag 360 aacgccaacg atcccaagtg gagcgacgac tctagaaagg acgtgctgtc caagatcgaa 420 gtcatcaaga acgacatcga caacaacccc aagacacagt ccgacattga taacaagatc 480 gtggaagtga acgagctgga aaagctgctg gtgctgcccg agttcagcac aatccctgga 540 tctgccgcca cactgaacac ctccatcacc aagaatatcc agaacgggaa cgcttacatc 600 gacctgtatg atgtcaagaa cgggctgatc gatccccaga atctgattgt gctcaacccc 660 tcctcctact ctgctaatta ctatattaag cagggcgcca agtactactc taacccctcc 720 gagatcacca ccaccggctc cgccaccatc acattcaata ttctggatga gacaggcaac 780 cctcacaaga aggctgacgg acagattgac attgtgtctg tgaacctgac catctacgat 840 tccaccgctc tgcggaaccg gatcgatgaa gtgatcaaca acgctaatga ccctaagtgg 900 agtgacggct ccagagatga ggtgctgacc ggcctggaaa agatcaagaa ggatatcgat 960 aacaatccta aaactcagat cgatattgac aacaagatca acgaagtcaa cgagatcgag 1020 aagctcctgg tcgtgtctct gtgatga 1047 <210> 41 <211> 1047 <212> RNA <213> Streptococcus sp. <400> 41 auggccgaag ugaucuccgg cucugcugcu acccugaacu cugcccuggu caagaaugug 60 ucuggcggca aggccuacau cgacaucuac gacgugaaga acggcaagau cgacccucug 120 aaccugaucg ugcugacccc uuccaacuac uccgccaacu acuacaucaa gcaaggcggc 180 agaaucuuca ccuccgugaa ccagcugcag accccuggca ccgcuaccau caccuacaac 240 auccuggacg agaauggcaa ccccuacacc aaguccgacg gccagaucga uaucgugucc 300 cuggucacca ccguguacga caccaccgag cugcggaaca acaucaacaa agugaucgag 360 aacgccaacg aucccaagug gagcgacgac ucuagaaagg acgugcuguc caagaucgaa 420 gucaucaaga acgacaucga caacaacccc aagacacagu ccgacauuga uaacaagauc 480 guggaaguga acgagcugga aaagcugcug gugcugcccg aguucagcac aaucccugga 540 ucugccgcca cacugaacac cuccaucacc aagaauaucc agaacgggaa cgcuuacauc 600 gaccuguaug augucaagaa cgggcugauc gauccccaga aucugauugu gcucaacccc 660 uccuccuacu cugcuaauua cuauauuaag cagggcgcca aguacuacuc uaaccccucc 720 gagaucacca ccaccggcuc cgccaccauc acauucaaua uucuggauga gacaggcaac 780 ccucacaaga aggcugacgg acagauugac auugugucug ugaaccugac caucuacgau 840 uccaccgcuc ugcggaaccg gaucgaugaa gugaucaaca acgcuaauga cccuaagugg 900 agugacggcu ccagagauga ggugcugacc ggccuggaaa agaucaagaa ggauaucgau 960 aacaauccua aaacucagau cgauauugac aacaagauca acgaagucaa cgagaucgag 1020 aagcuccugg ucgugucucu gugauga 1047 <210> 42 <211> 347 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 42 Met Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Ser Ala Leu 1 5 10 15 Val Lys Asn Val Ser Gly Gly Lys Ala Tyr Ile Asp Ile Tyr Asp Val 20 25 30 Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Asn Leu Ile Val Leu Thr Pro Ser 35 40 45 Asn Tyr Ser Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Arg Ile Phe Thr 50 55 60 Ser Val Asn Gln Leu Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ile Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Ile Leu Asp Glu Asn Gly Asn Pro Tyr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Ile 85 90 95 Asp Ile Val Ser Leu Val Thr Thr Val Tyr Asp Thr Thr Glu Leu Arg 100 105 110 Asn Asn Ile Asn Lys Val Ile Glu Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser 115 120 125 Asp Asp Ser Arg Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Glu Val Ile Lys Asn 130 135 140 Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile Asp Asn Lys Ile 145 150 155 160 Val Glu Val Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Pro Glu Phe Ser 165 170 175 Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr Lys Asn 180 185 190 Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys Asn Gly 195 200 205 Leu Ile Asp Pro Gln Asn Leu Ile Val Leu Asn Pro Ser Ser Tyr Ser 210 215 220 Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Ala Lys Tyr Tyr Ser Asn Pro Ser 225 230 235 240 Glu Ile Thr Thr Thr Gly Ser Ala Thr Ile Thr Phe Asn Ile Leu Asp 245 250 255 Glu Thr Gly Asn Pro His Lys Lys Ala Asp Gly Gln Ile Asp Ile Val 260 265 270 Ser Val Asn Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Ala Leu Arg Asn Arg Ile 275 280 285 Asp Glu Val Ile Asn Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser Asp Gly Ser 290 295 300 Arg Asp Glu Val Leu Thr Gly Leu Glu Lys Ile Lys Lys Asp Ile Asp 305 310 315 320 Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ile Asp Ile Asp Asn Lys Ile Asn Glu Val 325 330 335 Asn Glu Ile Glu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu 340 345 <210> 43 <211> 32 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 43 Gly Pro Leu Gly Ser Ala Ser Val Leu Ile Gly Ile Ser Phe Leu Gly 1 5 10 15 Gly Phe Thr Gln Gly Gln Phe Asn Ile Ser Thr Asp Thr Val Phe Ala 20 25 30 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Streptococcus sp. <400> 44 Gly Pro Leu Gly Ser 1 5

Claims (15)

  1. 아미노산 서열을 포함하거나 또는 아미노산 서열로 구성된 면역원성 융합 단백질로서,
    상기 아미노산 서열이
    i. 아미노산 170-178개, 바람직하게는 아미노산 174-175개로 구성되고, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인, 제1 아미노산 서열 파트;
    ii. 아미노산 165-174개, 바람직하게는 아미노산 169-170개로 구성되고, 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인, 제2 아미노산 서열 파트; 및 선택적으로:
    iii. 상기 제1 아미노산 서열 파트를 상기 제2 아미노산 서열 파트와 분리하는, 아미노산 1-20개로 구성된 링커 아미노산 서열 파트
    로 구성되고,
    상기 면역원성 융합 단백질이 바람직하게는 아미노산 335-372개, 바람직하게는 아미노산 343-353개, 더 바람직하게는 아미노산 343-347개로 구성되는, 면역원성 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 아미노산 서열 파트가 서열번호 7에 나타낸 서열의 아미노산 1-175 또는 2-175를 포함하거나 또는 바람직하게는 이로 구성되고,
    상기 제2 아미노산 서열 파트가 서열번호 14에 나타낸 서열의 아미노산 1-170 또는 2-170을 포함하거나 또는 바람직하게는 이로 구성되는, 면역원성 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아미노산 서열이 링커 아미노산 서열 파트를 포함하고, 상기 링커 아미노산 서열 파트가 아미노산 1-10개, 바람직하게는 아미노산 2-5개, 더 바람직하게는 아미노산 2개, 가장 바람직하게는 아미노산 서열 EF로 구성되는, 면역원성 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역원성 융합 단백질이 서열번호 21에 대한 서열 동일성이 적어도 90%인, 면역원성 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역원성 융합 단백질이 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열로 구성되거나, 또는 대안적으로, 상기 면역원성 융합 단백질이 서열번호 21의 아미노산 2-347로 구성되는, 면역원성 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 핵산 분자가 서열번호 15-20 중 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진, 핵산 분자.
  8. 제6항 또는 제7항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 융합 단백질을 발현하거나 또는 제6항 또는 제7항에 따른 핵산 분자 또는 제8항에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 융합 단백질, 또는 제6항 또는 제7항에 따른 핵산 분자, 제8항에 따른 벡터, 또는 제9항에 따른 숙주 세포 중 하나 이상을 포함하는, 백신.
  11. 제10항에 있어서, 하기 성분 하나 이상을 추가로 포함하는, 백신:
    a) 서열번호 42에 나타낸 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 예를 들어 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 가진 아미노산을 포함하거나 또는 이로 이루어진, 추가의 면역원성 융합 단백질;
    b) 상기 추가의 면역원성 융합 단백질을 코딩하되, 서열번호 36-41 중 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 가진, 추가의 핵산 분자;
    c) 상기 추가의 핵산 분자를 포함하는 추가의 벡터; 또는
    d) 상기 추가의 면역원성 융합 단백질을 발현하거나 또는 상기 추가의 벡터를 포함하는 추가의 숙주 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 백신이 하기를 포함하는, 백신:
    a) 제5항에 따른 면역원성 융합 단백질; 및
    b) 서열번호 42에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 서열번호 42에 나타낸 아미노산 서열로 구성되거나, 또는 대안적으로 서열번호 42의 아미노산 2-347을 포함하거나, 바람직하게는 이로 구성된, 추가의 면역원성 융합 단백질.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 보강제로서 알루미늄 하이드록사이드를 추가로 포함하는, 백신.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) B군 스트렙토코커스 감염에 대한 백신 접종 또는 ii) B군 스트렙토코커스 감염에 대한 치료에 이용하기 위한 것인, 면역원성 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 백신.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 융합 단백질, 제6항 또는 제7항에 따른 핵산 분자, 제8항에 따른 벡터, 제9항에 따른 숙주 세포 또는 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 백신이 인간 여성 개체에 투여되는, 면역원성 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 백신 또는 용도.
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