JP2001515723A

JP2001515723A - Ａ群連鎖球菌ワクチン

Info

Publication number: JP2001515723A
Application number: JP2000510869A
Authority: JP
Inventors: デイル，ジエイムズ・ビー
Original assignee: アイ・デイー・バクシーン
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 2001-09-25
Also published as: CA2303478C; ES2280101T3; AU751009B2; WO1999013084A1; WO1999013084A9; DE69836744D1; EP1003875B1; ATE349527T1; DE69836744T2; EP1003875A1; CA2303478A1; AU9388498A

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答を刺激することができる、少なくとも１０個のアミノ酸の長さのＡ群連鎖球菌からの少なくとも２個の免疫原性ポリペプチドと、免疫原性部分の免疫原性を保護するがＡ群連鎖球菌に対する免疫応答を刺激する必要はない、免疫原性ポリペプチドのＣ末端ペプチドを含む、選択された病原体に対する免疫応答を刺激する免疫原性合成融合ポリペプチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の参照）本出願は、１９９７年９月１２日出願の米国仮出願第６０／０５８，６３５号
の恩典を主張するものであり、かかる仮出願はその全体が参照してここに組み込
まれる。

【０００２】（技術分野）本発明は、Ａ群連鎖球菌感染を予防するために使用する医薬組成物及び方法、
特にワクチンを提供する。

【０００３】（発明の背景）連鎖球菌は連鎖状に増殖する能力を備えた細菌群である。多くの種がヒトにお
ける常在細菌叢の一部であり、特別に有害というわけではない。しかしながら、
Ａ群と称され、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ
）に代表される特定群の連鎖球菌はヒトの病原体である。簡単に述べると、Ａ群
連鎖球菌は、合併症のない咽頭炎や膿皮症から、トキシックショック症候群、深
組織浸潤及び敗血症に関連する、生命を脅かす感染に至るまで、様々なヒトの疾
病を引き起こす。一部の人々では、連鎖球菌性咽頭炎を未処置のまま放置すると
急性リウマチ熱を続発することがある。近年、重篤な連鎖球菌感染症の発生率（
Ｄａｖｉｅｓら、「カナダ、オンタリオ州における侵襲性Ａ群連鎖球菌感染症。
オンタリオＡ群連鎖球菌調査グループ」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３５：
５４７−５５４，１９９６）、ならびにリウマチ熱の発生率（Ｖｅａｓｅｙら、
「米国山間地域における急性リウマチ熱の復活」、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
１６：４２１−４２７，１９８７）が劇的に上昇してきた。

【０００４】連鎖球菌感染は一般に抗生物質で治療することができるが、少なくとも４％の
症例で感染は急性リウマチ熱に至る。この疾患はインドのような発展途上国にお
いて特に有病率が高く、インドでは何百万人もの就学年齢の児童が罹患している
。

【０００５】本発明は、高い免疫原性を有する新しいＡ群連鎖球菌ワクチンを提供し、さら
に他の関連する利益も提供する。

【０００６】（発明の要旨）簡単に述べると、本発明は、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答を刺激する免疫原
性合成融合ポリペプチドを提供する。１つの局面では、そのようなポリペプチド
は、（ａ）少なくとも１０個のアミノ酸の長さのＡ群連鎖球菌由来の少なくとも
２個の免疫原性ポリペプチド、及び免疫原性部分の免疫原性を保護する、免疫原
性ポリペプチドのＣ末端ペプチドを含む。好ましい実施形態では、Ｃ末端ペプチ
ドはＡ群連鎖球菌に対する免疫応答を刺激する必要はなく、従って、重要性のな
い非免疫原性ペプチド、あるいは免疫原性ポリペプチドの反復であってもよい。
一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、例えば１、１．１、２、３、４
、５、６、１１、１２、１３、１４、１８、１９、２２、２４、２８、３０、４
８、４９、５２、５５及び５６型を含めて、極めて多様なＡ群連鎖球菌（「１」
から「９０」以上までの範囲にわたる）から得ることができる。

【０００７】本発明の他の側面では、（ａ）Ａ群連鎖球菌に対する防御免疫応答を刺激する
ことができる、少なくとも１０個のアミノ酸の長さのＡ群連鎖球菌由来の少なく
とも２個の免疫原性ポリペプチドと、（ｂ）免疫原性部分の免疫原性を保護する
が、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答を刺激する必要はない、免疫原性ポリペプチ
ドのＣ末端ペプチドを含む、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答を促進するためのワ
クチン剤を提供する。上記のように、当該ポリペプチドは、例えば１、１．１、
２、３、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１８、１９、２２、２４、２８
、３０、４８、４９、５２、５５及び５６型を含めて、極めて多様なＡ群連鎖球
菌（「１」から「９０」以上までの範囲にわたる）から選択しうる。さらなる一
部の実施形態では、当該ワクチン剤はさらに、例えばミョウバン、フロイントア
ジュバントのようなアジュバント、及び／又は免疫調節補因子（例えばＩＬ−４
、ＩＬ−１０、γ−ＩＦＮ、若しくはＩＬ−２、ＩＬ−１２又はＩＬ−１５）を
含みうる。

【０００８】また、上述したようなワクチン剤を投与することを含む、Ａ群連鎖球菌感染に
対して宿主を予防接種するための方法も提供される。

【０００９】本発明のこれら及びその他の側面は、以下の詳細な説明と添付の図面を参照す
れば明らかになるであろう。さらに、一部の手順あるいは組成物（例えばプラス
ミド等）をより詳細に説明する様々な引用文献を本文中に示しており、従ってそ
れらはその全体が参照してここに組み込まれる。

【００１０】（発明の詳細な説明）定義本発明について述べる前に、まず最初に下記で使用するいくつかの用語の定義
を示すことは本発明の理解に役立つであろう。

【００１１】「ワクチン剤」は、ワクチン剤を接種される宿主において防御免疫応答を刺激
することができる組成物を指す。当該ワクチン剤は、蛋白ベースあるいはＤＮＡ
ベース（例えば遺伝子送達ビヒクル）のいずれでもよい。さらなる側面では、原
核生物宿主をワクチン剤として作製し、本発明の免疫原性ポリペプチドあるいは
多価構築物（例えば米国特許願第０７／５４０，５８６号参照）を発現するよう
に設計しうる。

【００１２】「遺伝子送達ビヒクル」は、生物において１又はそれ以上の望ましい特性を持
つ核酸分子を宿主に供給送達することができる、組換えウイルスベクターのよう
な組換えビヒクル、核酸ベクター（プラスミドなど）、遺伝子のような裸核酸分
子、核酸分子上の負電荷を中和し、核酸分子をコンパクトな分子に圧縮すること
ができる多カチオン分子に複合した核酸分子、リポソームに結合した核酸（Ｗａ
ｎｇら、ＰＮＡＳ８４：７８５１，１９８７）、細菌、ならびにプロデューサ
ー細胞のような一部の真核細胞を指す。

【００１３】上述したように、本発明はＡ群連鎖球菌感染を予防するのに適したワクチン剤
を提供する。簡単に言えば、以下により詳細に説明するように、多価ワクチンの
すべての局面の免疫原性を至適化するために発見された。本発明のひとつの局面
では、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答を刺激する免疫原性合成融合ポリペプチド
が提供される。そのようなポリペプチドは一般に、（ａ）Ａ群連鎖球菌に対する
免疫応答を刺激することができる、少なくとも１０個のアミノ酸の長さのＡ群連
鎖球菌由来の少なくとも２個の免疫原性ポリペプチドと、（ｂ）免疫原性部分の
免疫原性を保護するが、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答を刺激する必要はない、
免疫原性ポリペプチドのＣ末端ペプチドを含む。特に好ましい保護ペプチドは一
般に少なくとも１０個のアミノ酸の長さであり、３０個のアミノ酸であるか又は
それより長くてもよい。

【００１４】ワクチン剤において使用するための免疫原性ポリペプチドの同定本発明における使用に適した免疫原性ポリペプチドは、本出願の開示に従って
容易に同定し、作製しうる（ＤａｌｅとＢｅａｃｈｅｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１６３：１１９１−１２０２，１９８６；Ｂｅａｃｈｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ２
９２：４５７−４５９，１９８１；Ｄａｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：
２１８８−２１９４，１９９３；及び米国特許第４，４５４，１２１号；同第４
，５２１，３３４号；同第４，５９７，９６７号；同第４，７０５，６８４号；
同第４，９１９，９３０号；及び５，１２４，１５３も参照のこと）。特に好ま
しいポリペプチドは、Ｍ蛋白のＮ末端の５０個のアミノ酸残基内で得られる。

【００１５】Ａ群連鎖球菌の血清型は、大学のコレクション（例えばＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅ
ｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０ＹｏｒｋＡｖ
ｅｎｕｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）あるいはＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣ
ｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢ
ｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）のような受託施設を
通して、臨床単離物から容易に入手できる。さらに、Ａ群連鎖球菌血清型につい
ての配列は、ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ，Ａｔ
ｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａから入手可能である。

【００１６】Ａ．Ｍ蛋白のオプソニンエピトープの同定オプソニンのＭ蛋白エピトープを自己免疫エピトープから分離しうることを直
接的に明らかにするため、種々の血清型（例えばＭ５のアミノ末端の２０−５０
個のアミノ酸（Ｂｅａｃｈｅｙら、「Ａ群連鎖球菌からペプシンで抽出したＭ蛋
白の精製と特性：２４型Ｍ抗原のアミノ末端領域の共有結合構造」、Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．１４５：１４６９−１４８３，１９７７）からペプチドをコピーする
。ＳＭ５（１−２０）は、アフィニティー精製したｐｅｐＭ５心臓反応性抗体
と反応することができなかった（Ｂｅａｃｈｅｙら、「Ａ群連鎖球菌からペプシ
ンで抽出したＭ蛋白の精製と特性：２４型Ｍ抗原のアミノ末端領域の共有結合構
造」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４５：１４６９−１４８３，１９７７）。破傷風
トキソイドに連結したＳＭ５（１−２０）で免疫したウサギは、ｐｅｐＭ５に
対する高い力価の抗体を発現し、かかる抗体は５型連鎖球菌をオプソニン化した
（Ｂｅａｃｈｅｙら、「Ａ群連鎖球菌からペプシンで抽出したＭ蛋白の精製と特
性：２４型Ｍ抗原のアミノ末端領域の共有結合構造」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
４５：１４６９−１４８３，１９７７）。最も重要な点として、いずれの免疫血
清もヒト心筋と交差反応しなかった。

【００１７】Ｂ．Ｍ蛋白の組織交差反応エピトープＭ蛋白は、様々なヒト組織及びそれらの組織内の抗原と交差反応する抗体を誘
発する（Ｂａｉｒｄら、「関節軟骨及び滑膜の抗原と共有されるＡ群連鎖球菌Ｍ
蛋白のエピトープ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３１３２−３１３７，１９
９１；Ｂｒｏｎｚｅ，Ｍ．Ｓ．とＤａｌｅ，Ｊ．Ｂ．、「ヒト脳と交差反応する
抗体を誘発する連鎖球菌Ｍ蛋白のエピトープ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：
２８２０−２８２８，１９９３；Ｄａｌｅ，Ｊ．Ｂ．とＢｅａｃｈｅｙＥ．Ｈ
．、「ヒト心臓の筋細胞膜蛋白と共有される連鎖球菌Ｍ蛋白の防御抗原決定基」
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５６：１１６５−１１７６，１９８２）。交差反応性
を調べるため、選択された断片（例えばＭ５）をコピーする一連の重複ペプチド
を合成し、組織交差反応抗体を抑制する又は誘発するために使用した。例えば、
ウサギにおいてｐｅｐＭ５によって誘発したミオシン交差反応抗体は、ｐｅｐ
Ｍ５のペプチド８４−１１６によってほぼ完全に抑制された。このペプチドは
Ｍ５のＡ反復とＢ反復の間の領域にまたがり、縮退Ａ６反復を含む。マウス及び
ヒトのミオシン交差反応抗体は、無傷Ｍ５分子のＢ反復とＣ反復の間の領域に位
置する、ペプチド１８３−１８９中のエピトープと反応した。

【００１８】さらなる筋細胞膜交差反応エピトープはペプチド１６４−１９７に局在する。
関節軟骨及び滑膜と交差反応する抗体を誘発したＭ５の数個のエピトープは、Ｂ
反復内及びＭ５のＡ反復とＢ反復間にまたがる領域内でも認めることができる。
他のＭ蛋白と共有されたＭ６の脳交差反応エピトープは、当該分子のＢ反復領域
に局在する。

【００１９】組織交差反応エピトープの多くが５、６、１８及び１９型Ｍ蛋白間で共有され
る（Ｂｒｏｎｚｅ，Ｍ．Ｓ．とＤａｌｅ，Ｊ．Ｂ．、「ヒト脳と交差反応する抗
体を誘発する連鎖球菌Ｍ蛋白のエピトープ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２
８２０−２８２８，１９９３）。一次構造データは、これらのＭ蛋白がすべてＢ
反復内に同様の配列を含むことを明らかにしており（Ｄａｌｅら、「組換え四価
Ａ群連鎖球菌Ｍ蛋白ワクチン」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２１８８−２１
９４，１９９３；Ｄａｌｅら、「組換え八価Ａ群連鎖球菌Ｍ蛋白ワクチン」、Ｖ
ａｃｃｉｎｅ１４：９４４−９４８，１９９６；Ｄａｌｅら、「５型連鎖球菌
Ｍ蛋白の化学合成したペプチド断片の型特異的免疫原性」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．１５８：１７２７−１７３２，１９８３）、これはおそらくＢ反復が共有され
る心臓、脳、及び関節交差反応エピトープの位置であろう。

【００２０】組織特異的エピトープを局在化する必要はなく、むしろ、最初に防御エピトー
プを局在化し、それらが組織反応性でないことを確認する必要があることを強調
しておかねばならない。

【００２１】ひとたび選択された血清型に適した免疫原性ポリペプチドが同定されれば、任
意に、多価ワクチンを構築するために、他の血清型からの免疫原性ポリペプチド
と組合わせてもよい。これに関して、好ましいワクチンは、１、１．１、２、３
、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１８、１９、２２、２４、２８、３０
、４８、４９、５２、５５及び５６（血清型３０については、Ｎａｋａｓｈｉｍ
ａら、ＣｌｉｎｉｃＩｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．２５：２６０，１９９７参照）のよ
うな血清型の組合せから開発されるワクチンを含む。代表的な例は、２４、５、
６、１９、１、３、Ｘ；ならびに１、３、５、６、１８、１９、２２、２４、２
８、３０、及びＸ［但しＸはＣ末端保護ポリペプチドである］のようなワクチン
を含む。

【００２２】ワクチン剤の調製本発明のワクチン剤は、化学合成するか（例えばＢｅａｃｈｅｙら、Ｎａｔｕ
ｒｅ２９２：４５７−４５９，１９８１参照）、あるいは組換え手法によって
作製することができる。組換え生産については、各ｅｍｍ遺伝子の所望する５’
配列を増幅するようにＰＣＲプライマーを合成することができ、個々のＰＣＲ産
物を縦列に連結するために使用するユニーク制限酵素を含むように各プライマー
を伸長する。

【００２３】上述したように、ワクチン剤のＣ末端部分は、ワクチンの効果に影響を及ぼさ
ずにｉｎｖｉｖｏで失われる又は開裂されうる選択的部分を含むように構築す
る。これは、例えば、末端に重要でない非免疫原性ポリペプチドを包含すること
によって、あるいはワクチンの効力に有害な影響を及ぼさない免疫原性ポリペプ
チドを包含することによって（例えば、ワクチンの末端に反復免疫原性ポリペプ
チドを包含してもよい）実現されうる。さらには、関連のない病原体からの防御
抗原を単一ポリペプチドに組み込むことも可能であり、それによってキャリアの
必要性を省くことができる。一部の病原体に対するワクチンは、同じハイブリッ
ド構築物上に元々は異なる蛋白から誘導されたＴ及びＢ細胞エピトープを含みう
る。その上に、多価ハイブリッド蛋白は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ）、Ｂインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａＢ）あるいはＢ群連鎖
球菌に関するもののように、炭水化物ワクチンにおける十分な複合体でありうる
。

【００２４】蛋白の発現のためには、適当な原核生物宿主株を形質転換するために使用する
適当な複製プラスミドに多価遺伝子を連結する。原核生物はグラム陰性又はグラ
ム陽性生物、例えば大腸菌あるいはバチルス菌を含む。形質転換のための適当な
原核生物宿主細胞は、例えば大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、
ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及び連鎖球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属に
属する他の様々な種を含む。

【００２５】原核生物宿主細胞にトランスフェクトする発現ベクターは一般に、例えば抗生
物質耐性を与える蛋白あるいは自己栄養必要量を供給する蛋白をコードする遺伝
子のような１又はそれ以上の表現型選択可能マーカー、及び宿主内での増幅を保
証するように宿主によって認識される複製起点を含む。原核生物宿主細胞にとっ
ての他の有用な発現ベクターは、市販のプラスミドから誘導される細菌由来の選
択可能マーカーを含む。この選択可能マーカーは、クローニングベクターｐＢＲ
３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的因子を含みうる。簡単に述べると、ｐ
ＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含み、従
って形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２の「バ
ックボーン」部分を適当なプロモーター及び哺乳類のＥＴＦ構造遺伝子配列と結
合する。他の市販のベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＱＥ３
０及びｐＧＥＭ１（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ
ＳＡ）を含む。

【００２６】原核細胞発現ベクターにおいて使用する一般的なプロモーター配列は、β−ラ
クタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎ
ａｔｕｒｅ２７５：６１５，１９７８；及びＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．８：４０５７，１９８０；及
びＥＰＡ３６，７７６号）ならびにｔａｃプロモーター（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
分子クローニング：実験室マニュアル、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））を含む。特に有用な原核宿主細胞発現系
は、ファージλＰ_Ｌプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ熱不安定レプレッサー配列
を用いる。λＰ_Ｌプロモーターの誘導体を組み込んだ、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙ
ｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なプラスミドベクタ
ーは、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌ＪＭＢ９系統（ＡＴＣＣ３７０９２）に
定住）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１系統（ＡＴＣＣ５３０８２）に定住）
を含む。

【００２７】大腸菌の宿主株の形質転換は標準的な方法を用いた電気穿孔法によって行われ
る（Ｄａｌｅら、「組換え四価Ａ群連鎖球菌Ｍ蛋白ワクチン」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５１：２１８８−２１９４，１９９３；Ｄａｌｅら、「組換え八価Ａ群
連鎖球菌Ｍ蛋白ワクチン」、Ｖａｃｃｉｎｅ１４：９４４−９４８，１９９６
）。成功した形質転換体を、天然Ｍ蛋白のひとつ、あるいは多価蛋白に含まれる
Ｍ蛋白のひとつのアミノ末端の合成ペプチドコピーに対して惹起したウサギ抗血
清を用いたコロニーブロットによって同定する。

【００２８】選択されたクローンによって発現される組換え蛋白の分子サイズと抗原性を、
生菌連鎖球菌のペプシン抽出物から精製した各天然Ｍ蛋白に対して惹起したウサ
ギ抗血清を用いて（Ｂｅａｃｈｅｙら、「Ａ群連鎖球菌からペプシンで抽出した
Ｍ蛋白の精製と特性：２４型Ｍ抗原のアミノ末端領域の共有結合構造」、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１４５：１４６９−１４８３，１９７７）、大腸菌抽出物のウエ
スタンブロット分析を行って決定する（Ｄａｌｅら、「組換え四価Ａ群連鎖球菌
Ｍ蛋白ワクチン」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２１８８−２１９４，１９９
３）。ジデオキシ−ヌクレオチド鎖終了法によって多価遺伝子を配列決定し、各
遺伝子断片が天然ｅｍｍ配列の正確なコピーであることを確認する。

【００２９】遺伝子送達ビヒクルをベースとするワクチン様々な病原体の抗原をコードする遺伝子送達ビヒクル（例えば裸ＤＮＡ）を哺
乳類に注入すると、防御免疫応答を生じることが示された（Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−９，１９９３；Ｂｏｕｒｎｅら、ＪＩｎｆｅ
ｃｔ．Ｄｉｓ．１７３：８００−７，１９９６；Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｖａｃｃｉ
ｎｅ１２：１５２９−３３，１９９４）。筋組織に注入した裸ＤＮＡからの異
種蛋白のｉｎｖｉｖｏでの発現が初めて記述されて以来（Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２４７：１４６５−８，１９９０）、ワクチン接種を目的とするＤ
ＮＡのデザインと供給送達にいくつかの進歩があった。

【００３０】防御免疫は最終的には抗体によって決定されるので、上述したＭ蛋白ワクチン
は裸ＤＮＡを通しての供給送達に理想的に適している。例えば、ひとつの実施形
態では、哺乳類細胞の発現用に特に設計されたプラスミドに多価遺伝子を連結す
る（例えばＨａｒｔｉｋｋａら、ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ７：１２０５−
１７，１９９６参照。これは、サイトメガロウイルス初期遺伝子からのプロモー
ター／エンハンサー因子、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子及びウシ成長ホ
ルモン遺伝子からのターミネーター因子を含む）。Ｍ蛋白ハイブリッド遺伝子を
、確実に組換え蛋白を発現するようにヒト細胞系をトランスフェクトするのに使
用するプラスミドにクローニングすることができる。当該プラスミドを大腸菌に
おいて、免疫試験に十分な量に増殖させ、塩化セシウム勾配遠心分離により精製
する。食塩水５０μｌ中５０μｇのプラスミドを大腿直筋に筋肉内投与してマウ
スを免疫する。最初の注射後３週目と６週目に同用量のブースター注射を行う。

【００３１】様々な他の遺伝子送達ビヒクルが、例えばウイルス、レトロトランスポゾン及
びコスミドを含めて、本発明の範囲内で同様に使用できる。代表的な例は、アデ
ノウイルスベクター（例えばＷＯ９４／２６９１４号、ＷＯ９３／９１９１号；
Ｙｅｉら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１：１９２−２００，１９９４；Ｋｏｌ
ｌｓら、ＰＮＡＳ９１（１）：２１５−２１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓ
ｌｅｒら、ＰＮＡＳ９０（２４）：１１４９８−５０２，１９９３；Ｇｕｚｍ
ａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８８（６）：２８３８−４８，１９９３；Ｇ
ｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−１２０７，１９９３；
Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ７５（２）：２０７−２１６、１９９３；Ｌｉら、
ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９，１９９３；Ｃａｉｌ
ｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７−１２９１
，１９９３）、アデノ関連１型（「ＡＡＶ−１」）又はアデノ関連２型（「ＡＡ
Ｖ−２」）ベクター（ＷＯ９５／１３３６５号；Ｆｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ９
０（２２）１０６１３−１０６１７，１９９３参照）、デルタ肝炎ベクター、弱
毒化デルタ肝炎ウイルス及びヘルペスウイルスベクター（例えば米国特許第５，
２８８，６４１号）、ならびに米国特許第５，１６６，３２０号の中に開示され
ているベクターを含む。他の代表的なベクターは、レトロウイルスベクター（例
えばＥＰ０４１５７３１号；ＷＯ９０／０７９３６号；ＷＯ９１／０２８
０５号；ＷＯ９４／０３６２２号；ＷＯ９３／２５６９８号；ＷＯ９３／２５２
３４号；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３／１１２３０号；ＷＯ９３
／１０２１８号）を含む。遺伝子治療においてそのようなベクターを使用する方
法は当該技術において周知であり、例えばＬａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．とＢｒｕｃ
ｋ，Ｋ．Ｌ．，遺伝子治療：分子生物学の応用、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎ
ｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＫｒｅｉｇｌｅｒ，Ｍ．、遺伝子の転移と発現：実験
室マニュアル、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹ
ｏｒｋ，１９９０参照。

【００３２】遺伝子送達ビヒクルは、ビヒクルを用いてあるいは様々な物理的方法によって
宿主細胞に導入しうる。そのような方法の代表的な例は、リン酸カルシウム沈降
反応を用いた形質転換（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、ＰＮＡＳ８１：７５２９−７５
３３，１９８４）、無傷標的細胞へのそのような核酸分子の直接顕微注射（Ａｓ
ｃａｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ３５２：８１５−８１８，１９９１）、ならびに膜
を一時的に分極させて核酸分子が入ることを可能にするために、伝導溶液中に懸
濁した細胞を強い電場に置く電気穿孔法を含む。他の手法は、不活性アデノウイ
ルスに結合した核酸分子の使用（Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ８９：６０９４，
１９９０）、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１７，１９８９）、マイクロプロ
ジェクタイル衝撃（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ８８：２７２６−２７３０
，１９９１）、ポリリシンのようなポリカチオン化合物、レセプタ特異的リガン
ド、核酸分子を取り込むリポソーム、核酸分子を含む大腸菌から外細胞壁を取り
除き、ポリエチレングリコールを用いて動物細胞に融合するスフェロプラスト融
合、ウイルス形質導入（Ｃｌｉｎｅら、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９
，１９８５；及びＦｒｉｅｄｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２７５，
１９８９）、及びＤＮＡリガンド（Ｗｕら、Ｊ．ｏｆＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）、ならびにセンダイウイルス又はア
デノウイルスのようなソラレン不活化ウイルスを含む。

【００３３】多価Ｍ蛋白遺伝子を含む遺伝子送達ビヒクルで免疫したマウスからの血清を、
抗原のような天然Ｍ蛋白を用いてＥＬＩＳＡにより総抗体力価について検定する
。血清オプソニン抗体を上述したように検定する。ＤＮＡＭ蛋白ワクチンの防
御効果を、ワクチン中に含まれる血清型のＡ群連鎖球菌を用いた直接マウス防御
試験によって測定する。

【００３４】製剤及び投与治療用途には、ワクチン剤を、例えば筋肉内、皮下及び粘膜経路を含めた様々
な経路で患者に投与することができる。ワクチン剤は単回投与としてあるいは長
期にわたり複数ユニットとして投与しうる。好ましい実施形態では、当該ワクチ
ン剤を１箇所の筋肉内注射部位につき５０−３００μｇの濃度でヒトに投与する
。ワクチンの効果をさらに高めるために少なくとも１ヵ月の間隔を置いて数回の
注射（例えば３回又は４回）を行うことができる。

【００３５】典型的には、当該ワクチン剤は、生理的に許容される担体、賦形剤あるいは希
釈剤と共に精製ポリペプチドを含む製薬組成物の形態で投与される。そのような
担体は、使用する投薬量および濃度で患者に無毒性である。通常、そのような組
成物の調製は、ワクチン剤を緩衝剤、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子
量（約１０残基未満）ポリペプチド、蛋白、アミノ酸、グルコース、スクロース
又はデキストランを含めた炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート化剤、グルタチ
オン及び他の安定剤や賦形剤と組合わせる必要がある。中性緩衝生理食塩水ある
いは同種血清アルブミンと混合した生理食塩水が適切な希釈剤の例である。

【００３６】本発明の好ましい実施形態では、ワクチン剤を、例えばフロイントアジュバン
ト、ミョウバン等のようなアジュバントと組合わせる。

【００３７】下記の実施例は例示として示すものであり、制限のためのものではない。

【００３８】

【実施例】

実施例１六価融合遺伝子の構築と発現基本的に以前に述べられているようにして（Ｄａｌｅら、「組換え四価Ａ群連
鎖球菌Ｍ蛋白ワクチン」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２１８８−２１９４，
１９９３；Ｄａｌｅら、「組換え八価Ａ群連鎖球菌Ｍ蛋白ワクチン」、Ｖａｃｃ
ｉｎｅ１４：９４４−９４８，１９９６）、６個の異なるｅｍｍ遺伝子（２４
、５、６、１９、１及び３）の特異的５’領域を増幅するようにＰＣＲを用いて
六価ｅｍｍ遺伝子を構築した。

【００３９】簡単に述べると、ＰＣＲと特異的５’ｅｍｍ遺伝子断片を規定するプライマー
を用いて多価遺伝子を構築する。遺伝子断片は３０ｂｐから３００ｂｐのサイズ
範囲をとりうる。各血清型のＡ群連鎖球菌からの染色体ＤＮＡをＰＣＲ反応のテ
ンプレートとして使用する。実施例の中で述べる六価ｅｍｍ遺伝子については、
ＰＣＲプライマーは次の通りである：

【００４０】Ｍ２４−１ＴＳＳｐｈＩ５’ＧＧＧＧＧＧＧＣＡＴＣＧＧＴＣＧＣＧＡＣＴＡＧＧＴＣ
ＴＣＡＧＡＣＡＧＡＴ３’（配列番号：１）Ｍ２４−１ＢＳＢａｍＨｌ５’ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＧＴＡＧＴＴＴＣＴＣＴＴ
ＴＡＧＣ３’（配列番号：２）Ｍ５ＴＳＢａｍＨｌ５’ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＣＴＡＧＧＧＧ
ＴＡＣＡ３’（配列番号：３）Ｍ５ＢＳＳａｌＩ５’ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＣＣ
ＣＴＴＣ３’（配列番号：４）Ｍ６ＴＳＳａｌＩ５’ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＧ
ＧＧＧＧ３’（配列番号：５）Ｍ６ＢＳＮｃｏＩ５’ＧＧＧＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＣＴＴＧＴＣＡＴＴＡＴ
ＴＡＧＣ３’（配列番号：６）Ｍ１９ＴＳＮｃｏＩ５’ＧＧＧＧＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＴＡＴＡＣ
ＴＡＧＧ３’（配列番号：７）Ｍ１９ＢＳＰｓｔＩ５’ＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＴＴＣＴＣＡＴ
ＴＣＴＧ３’（配列番号：８）Ｍ１ＴＳＰｓｔＩ５’ＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＡ
ＴＣＣＴ３’（配列番号：９）Ｍ１ＢＳＫｐｎＩ５’ＧＧＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＴＴＡＡＡＡＴ
ＣＴＣＴ３’（配列番号：１０）Ｍ３ＴＳＫｐｎＩ５’ＧＧＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＧＡＴＣＡＧＧＴ
ＴＡＣＡ３’（配列番号：１１）Ｍ３ＢＳＣｌａＩ５’ＧＧＧＧＧＧＡＴＣＧＡＴＡＴＴＴＡＡＣＴＣＴＴＧＴＡ
ＡＣＡＧ３’（配列番号：１２）Ｍ２４−２ＴＳＣｌａＩ５’ＧＧＧＧＧＧＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧＡＣＴＡＧＧＴＣ
ＴＣＡＧ３’（配列番号：１３）Ｍ２４−２ＢＳＨｉｎｄＩＩＩ５’ＧＧＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＧＴＧＣＣＴ
ＣＴＡＡＴＴＣ３’（配列番号：１４）

【００４１】以前に述べられているように（Ｄａｌｅら、「組換え四価Ａ群連鎖球菌Ｍ蛋白
ワクチン」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２１８８−２１９４，１９９３）染
色体テンプレートに関してＰＣＲを実施する。正しい方向と読み取り枠での断片
の連結を確実にするため、各々のＰＣＲ産物を精製し、連結し、その後５’断片
からの正プライマーと３’断片からの逆プライマーを用いて再びＰＣＲに供する
。例えば、２４、５、６、１９、１及び３型Ｍ蛋白からのＤＮＡ配列を含む六価
ｅｍｍ遺伝子を構築するには、Ｍ２４及びＭ５遺伝子断片を上述したプライマー
を用いてＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ産物をアガロースゲルから精製し、適
当な制限酵素で切断して、共に連結する（Ｄａｌｅら、「組換え四価Ａ群連鎖球
菌Ｍ蛋白ワクチン」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２１８８−２１９４，１９
９３；Ｄａｌｅら、「組換え八価Ａ群連鎖球菌Ｍ蛋白ワクチン」、Ｖａｃｃｉｎ
ｅ１４：９４４−９４８，１９９６）。次に連結混合物を正Ｍ２４プライマー
と逆Ｍ５プライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。その後、生じた適当な大
きさの産物を精製し、同様にして構築したＭ６及びＭ１９遺伝子断片に連結する
。最終的な連結反応後、遺伝子全体を再びＰＣＲによって増幅し、適当な制限酵
素で切断して、適当な発現ベクターに連結する。３’の位置に反復Ｍ２４遺伝子
断片を付加するため、宿主大腸菌からプラスミドを精製し、ｅｍｍ２４からの新
たなＰＣＲ産物を３’ＰｓｔＩ制限部位に強制クローニングした。

【００４２】六価遺伝子をジデオキシヌクレオチド鎖終了法によって配列決定し、各遺伝子
断片がそれぞれの天然ｅｍｍ配列の正確なコピーであることを確認した。

【００４３】実施例２六価ワクチンの精製Ａ．精製形質転換した大腸菌を振とうインキュベーターにおいて、アンピシリン１００
μｇ／ｍｌとカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ１ｌ中で対数期まで増殖
させた。増殖の最後の４時間はＩＰＴＧ（２ｍＭ）を加えた。細胞ペレットをＰ
ＢＳ３０ｍｌに懸濁し、１０００ｐｓｉでフレンチプレッシャーセルにおいて
溶解した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用し、製造者（Ｑｉａｇｅｎ）から提示されて
いるプロトコールに従って上清から六価蛋白を精製した。蛋白を含む溶出緩衝液
をスピンフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で１
５ｍｌから５ｍｌに濃縮した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（ｐｒｅｐグレード、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）でのゲル濾過により最終的な精製を実施し
た。ｐｅｐＭ２４に対するウサギ抗血清を使用し（Ｂｅａｃｈｅｙら、「Ａ群
連鎖球菌からペプシンで抽出したＭ蛋白の精製と特性：２４型Ｍ抗原のアミノ末
端領域の共有結合構造」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４５：１４６９−１４８３，
１９７７）、ウエスタンブロットによって活性分画を同定した（Ｄａｌｅ，Ｊ．
Ｂ．とＢｅａｃｈｅｙ，Ｅ．Ｈ．、「連鎖球菌Ｍ蛋白の多数の心臓交差反応性エ
ピトープ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：１１３−１２２，１９８５）。総蛋
白濃度を標準的な方法によって測定し、２００μｇ／ｍｌの六価蛋白を含むよう
にサンプルをＰＢＳ中で希釈した。ゲルスキャニング（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐデジ
タル画像およびＣｏｌｌａｇｅ画像分析）によりサンプルの純度を測定した。

【００４４】Ｂ．六価ワクチンの分析ハイブリッドｅｍｍ遺伝子の構造を、ｐＱＥ３０に連結したあと二本鎖配列決
定法によって確認した。各サブユニットの配列はそれぞれの天然ｅｍｍ遺伝子と
同じであった（図１）。断片は、結合を促進するために使用した各ユニーク制限
部位によって規定される２個のアミノ酸によってのみ結合された（図１）。

【００４５】精製六価蛋白は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で４５ｋＤａの見かけ分
子量で移動した（図２）。ゲルスキャン分析は、無傷六価蛋白がゲル中の総染色
性蛋白の約９０％を占めることを明らかにした。ｐｅｐＭ２４に対する抗血清
を用いたウエスタンブロット分析は、残りの蛋白バンドの大部分が免疫反応性で
あり、おそらく六価蛋白の断片であろうことを示した（データは提示していない
）。

【００４６】実施例３ウサギの免疫及び抗血清の検査Ａ．免疫３匹ずつの２群のウサギを、ミョウバンで沈降させるかあるいはフロイント完
全アジュバント中で乳化した六価ワクチン１００μｇで免疫した。ミョウバン中
での沈降については、六価蛋白（２００μｇ／ｍｌ）を等量の水酸化アルミニウ
ム（２ｍｇ／ｍｌ）（ＲｅｈｙｄｒａｇｅｌＨＰＡ，Ｒｅｈｅｉｓ，Ｉｎｃ．
，ＢｅｒｋｅｌｅｙＨｅｉｇｈｔｓ，ＮＪ）に加え、４℃で一晩静かに混合し
た。同様にＣＦＡ中にも六価蛋白を１００μｇ／ｍｌの最終濃度で乳化した。ミ
ョウバン中の六価ワクチンを接種したウサギには、初回注射として１００μｇを
Ｉ．Ｍ．投与し、４週目と８週目に同用量を反復投与した。二組目のウサギには
、初回注射として皮下経路でＣＦＡ中の六価ワクチン１００μｇを投与し、その
後４週目と８週目に生理食塩水中同用量のブースター注射を行った。１回目の注
射の前及びその後２週間隔で採血した。

【００４７】抗体アッセイ。精製した天然のペプシン抽出Ｍ蛋白（Ｂｅａｃｈｅｙら、「Ａ
群連鎖球菌からペプシンで抽出したＭ蛋白の精製と特性：２４型Ｍ抗原のアミノ
末端領域の共有結合構造」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４５：１４６９−１４８３
，１９７７）あるいは精製六価蛋白を用いて、以前に述べられているように（Ｄ
ａｌｅら、「Ａ群連鎖球菌の単一Ｍ蛋白内での型特異的な交差反応抗原決定基の
異質性」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５１：１０２６−１０３８，１９８０）ＥＬ
ＩＳＡを実施した。ｉｎｖｔｒｏでのオプソニン作用アッセイ及び間接殺菌ア
ッセイ（Ｂｅａｃｈｅｙら、「連鎖球菌Ｍ蛋白の構造的に定義されたポリペプチ
ド断片による免疫に対してのヒト免疫応答」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５０：８
６２−８７７，１９７９）によってオプソニン抗体を検出した。

【００４８】Ｂ．Ｍ蛋白抗体の検出免疫前及び免疫動物血清を、ワクチン蛋白及び天然のペプシン抽出Ｍ蛋白を固
相抗原として使用し、ＥＬＩＳＡによって検定する（Ｄａｌｅら、「Ａ群連鎖球
菌の単一Ｍ蛋白内での型特異的な交差反応抗原決定基の異質性」、Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１５１：１０２６−１０３８，１９８０）。ＥＬＩＳＡの力価は、４５
０ｎｍで＞０．１のＯＤを生じる抗血清の最終希釈の逆数として定義する。天然
Ｍ抗原に対する免疫血清の力価は、おそらく、それぞれの血清型の連鎖球菌の表
面Ｍ蛋白と反応する（すなわちオプソニン作用を促進する）、組換え蛋白によっ
て誘発される抗体のレベルを予測すると考えられる。

【００４９】Ｃ．オプソニン抗体の検出オプソニンＭ蛋白抗体は、同じ血清型のＡ群連鎖球菌による感染に対する防御
と相関する（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｃ．、「Ａ群連鎖球菌の型特異的Ｍ抗
原についての現在の知識」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：３０７−３１３，１９
６２；Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｃ．、「Ａ群連鎖球菌による感染後のヒトに
おける型特異的抗体の残存」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１０：２７１−２８２，
１９５９）。２つの関連するｉｎｖｉｔｒｏアッセイを用いて免疫血清中のオ
プソニン抗体を検出する。最初は、免疫血清、非免疫ヒト全血及び試験微生物の
混合物におけるオプソニン作用を測定するスクリーニングアッセイである（Ｂｅ
ａｃｈｅｙら、「Ａ群連鎖球菌からペプシンで抽出したＭ蛋白の精製と特性：２
４型Ｍ抗原のアミノ末端領域の共有結合構造」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４５：
１４６９−１４８３，１９７７）。試験血清０．１ｍｌを標準数の細菌に加え、
室温で１５分間インキュベートする。軽くヘパリン化したヒト血液０．４ｍｌを
加え、混合物全体を３７°で４５分間端から端まで回転させる。回転終了時に、
顕微鏡スライドにスミアを調製し、空気乾燥して、ライト染料で染色した。細菌
を取り込んだあるいは細菌と結合した多形核白血球のパーセンテージを計数して
「オプソニン作用パーセント」を定量する。解釈可能なアッセイは、１０％以下
のオプソニン作用の免疫前対照値を有していなければならない。

【００５０】オプソニン抗体の存在は、Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄによる最初の記述（Ｌａｎｃ
ｅｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｃ．、「Ａ群連鎖球菌の型特異的Ｍ抗原についての現在の知
識」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：３０７−３１３，１９６２）に従って間接殺
菌抗体アッセイによって確認できる。このアッセイは、より少ない細菌を加え、
回転を３時間行うことを除いて、上述したように試験混合物を用いて実施する。
回転終了時に、ヒツジ血液寒天中で混釈平板を作製し、３７°で一晩増殖させた
あと生菌を定量する。免疫血清の存在下での死滅のパーセントを非免疫血清での
増殖と比較して算定する。

【００５１】実施例４マウス防御アッセイＡ．全般的プロトコールＭ蛋白ワクチンの防御効果を間接又は直接（受動又は能動免疫）マウス防御試
験によって測定する。間接試験は、免疫又は免疫前血清１ｍｌを腹腔内（ｉ．ｐ
．）経路でマウスに投与し、２４時間後にｉ．ｐ．投与した試験微生物に誘発感
染させる（Ｂｅａｃｈｅｙら、「連鎖球菌Ｍ蛋白の構造的に定義されたポリペプ
チド断片による免疫に対してのヒト免疫応答」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５０：
８６２−８７７，１９７９）。各試験微生物について、２５匹ずつのマウスの群
に免疫前又は免疫血清のいずれかを投与する。次に動物を各々５匹ずつの５群に
分け、１０倍高い攻撃誘発用量の毒性連鎖球菌を各小群に投与する。７日間観察
した後、検討した各血清型についてＬＤ５０を計算する。

【００５２】直接マウス防御試験は、マウスを誘発感染の前にＭ蛋白ワクチンで能動免疫す
ることを除いて、同様に実施する。各々のマウスに、０時点、４週目及び８週目
にミョウバン中２５−５０μｇのワクチンを筋肉内（ｉ．ｍ．）投与する。初回
注射から１０週間後に攻撃誘発感染を行う。対照動物はミョウバンだけで偽免疫
する。ＬＤ５０を計算し、フィッシャー確率検定（ｅｘａｃｔｔｅｓｔ）を用
いて有意性を判定する。

【００５３】Ｂ．防御六価ワクチンによって誘発されるオプソニン抗体の防御効果を直接示すため、
マウスをミョウバンに吸着させたワクチンで免疫し、次いでワクチンに含まれる
血清型のうちの２種で攻撃誘発した。雌性非近交系スイスマウスを次のスケジュ
ールに従って後脚にＩ．Ｍ．経路で免疫した：０時点、２５μｇ；３週目、２５
μｇ；６週目、５０μｇ；及び１３週目、５０μｇ。２０匹の免疫マウスと２０
匹の免疫していない対照マウスに関して攻撃誘発実験を実施した（表１）。攻撃
誘発株は２４及び１９型で、これはＭ２４ペプチドが六価蛋白中最大の断片であ
り、反復されること、そしてＭ１９断片は３５個のアミノ酸の長さしかない２個
のうちの１個であることに基づく。これら２個の断片は六価蛋白の防御免疫原性
の範囲を反映するはずである。毒性連鎖球菌によるマウスの腹腔内攻撃誘発は、
オプソニン抗体に関する最も厳密な実験室アッセイである。

【００５４】この実験では、各々１０匹のマウスから成る２群を、各血清型についてＬＤ_７ _０ −ＬＤ_１００にほぼ等しい接種物で攻撃誘発し、かかる接種物は２×１０^４Ｃ
ＦＵであった。ワクチンの初回用量の投与から１５週間後に攻撃誘発実験を開始
し、死亡を１０日間記録した。六価ワクチンで免疫し、２４型連鎖球菌で攻撃誘
発したマウスは、対照群と比較して有意に死亡から防御された（ｐ＝０．０００
１）。１９型連鎖球菌で攻撃誘発したマウスはワクチン接種によって防御された
が、そのレベルは統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．１５）。攻撃誘発した群
が２倍のサイズであったならば、同じレベルの防御は統計的に有意の生存率をも
たらしたであろう。免疫群全体のマウスの生存率を分析すると、防御のレベルは
極めて有意であった（ｐ＝０．０００２）。

【００５５】

【表１】

【００５６】実施例５組織交差反応抗体に関するアッセイＭ蛋白ワクチンのいずれもが組織交差反応抗体を誘発しないことを確かめるた
め、ヒト心臓、腎及び脳の凍結切片を用いて間接免疫蛍光測定法を実施する（Ｄ
ａｌｅ，Ｊ．Ｂ．とＢｅａｃｈｅｙＥ．Ｈ．、「ヒト心臓の筋細胞膜蛋白と共
有される連鎖球菌Ｍ蛋白の防御抗原決定基」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５６：１
１６５−１１７６，１９８２）。剖検で採取した組織の薄切片（４μｍ）を顕微
鏡スライド上に調製し、密封した箱に入れて使用時まで−７０℃で保存する。試
験血清をＰＢＳ中で１：５に希釈し、組織切片上に滴下する。免疫前血清とＰＢ
Ｓで対照スライドを作製する。スライドを外界温度で３０分間インキュベートし
、その後スライドホルダーにおいてＰＢＳ中で３回洗浄する。蛍光標識ヤギ抗Ｉ
ｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡをＰＢＳ中で１：４０に希釈し、スライドに滴下して、そ
れを再び洗浄し、乾燥し、１％Ｇｅｌｖｅｔｏｌとカバーガラスで封入する。キ
セノン光源を備えたＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡を用いて蛍光を検出す
る。蛍光なしを０とし、ウサギにおいて５型Ｍ蛋白全体に対して惹起した標準的
な陽性抗血清で得られるものを４＋として、０−４＋のスケールを用いて免疫蛍
光を記録する（Ｄａｌｅ，Ｊ．Ｂ．とＢｅａｃｈｅｙ，Ｅ．Ｈ．、「連鎖球菌Ｍ
蛋白の多数の心臓交差反応性エピトープ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：１１
３−１２２，１９８５）。

【００５７】実施例６ミョウバン中とフロイントアジュバント中で供給送達した六価ワクチンの免疫
原性の比較各々３匹のウサギをミョウバン又はＣＦＡ中１００μｇ用量の六価ワクチンで
免疫した。４週目と８週目にそれぞれミョウバン又は生理食塩水中同用量のブー
スター注射を行った。精製六価蛋白を固相抗原として使用してＥＬＩＳＡ力価を
測定した（図３）。ミョウバン中の六価ワクチンを接種した動物からの血清は、
ＣＦＡ中の同用量を接種したウサギからの血清に等しい若しくはそれを上回る抗
体力価を有していた。それに続く実験では、同じスケジュールに従って食塩水単
独中１００μｇの六価ワクチンをＩ．Ｍ．投与して３匹のウサギを免疫した。こ
れらのウサギのいずれも、免疫原あるいはそれぞれのｐｅｐＭ蛋白に対して有
意の抗体力価を生じなかった（データは提示していない）。これらのデータは、
ミョウバンが多価ワクチンに適し且つ必要なアジュバントであり、六価蛋白と組
合わせたＣＦＡのアジュバント活性に等しいことを示している。

【００５８】実施例７六価ワクチンの成分サブユニットの防御免疫原性この試験の主要な目的のひとつは、各Ｍ蛋白サブユニットの免疫原性を保持す
る多価ハイブリッド蛋白を設計することであった。ミョウバン中の六価ワクチン
で免疫した３匹のウサギから採取した血清に関してＥＬＩＳＡを実施した（図４
）。各々のアッセイにおいて、ＥＬＩＳＡ抗原は精製ペプシン抽出Ｍ蛋白であっ
た。従って、アッセイは、天然Ｍ蛋白と反応する六価蛋白によって誘発される抗
体だけを測定し、天然Ｍ蛋白中には存在しない接続セグメントあるいはコンフォ
ーメーションに特異的であると考えられる抗体は測定しない。六価蛋白は、ワク
チン構築物中に含まれる各Ｍ蛋白に対して有意のレベルの抗体を誘発した（図４
）。重要な点として、いずれの抗血清も、間接免疫蛍光測定法で測定したように
、ヒト心臓組織あるいは腎組織と交差反応する抗体を含まなかった（データは提
示していない）。

【００５９】３匹全部のウサギからの血清が、ワクチン中に含まれるＡ群連鎖球菌の各血清
型に対して有意のレベルのオプソニン抗体を含んでいた（図５）。免疫血清のひ
とつを用いた間接殺菌アッセイによってこれらの結果を確認した（表２）。これ
らを合わせて考えると、結果は、六価ワクチンの個々の成分が、Ａ群連鎖球菌の
それぞれの血清型の表面上の天然Ｍ蛋白と反応する抗体を誘発するために必要な
コンフォーメーションと免疫原性を保持していることを示唆している。

【００６０】

【表２】

【００６１】本発明の特定実施形態を例示のためにここに述べたが、上記から、本発明の精
神と範囲から逸脱することなく様々な変更を行いうることが認識されるであろう
。従って、本発明は付属の特許請求の範囲によってのみ制限されるものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】各ｅｍｍ遺伝子断片の長さともとのＰＣＲプライマー中に合成した制限部位を
示す六価ワクチンの概要図である。ｅｍｍ遺伝子断片はそれぞれ、２１−７０コ
ドンを表すｅｍｍ３断片を除いて、成熟天然蛋白をコードする最初のコドンから
始まる。

【図２】クマシーブルーで染色した精製六価蛋白のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動である。染色蛋白バンドのコンピュータ援用画像分析は、六価蛋白（分子
量４５ｋＤａ）がサンプル中の総蛋白の９０．３％を占めることを示唆した。

【図３Ａ】ミョウバン中又はＣＦＡ中の六価ワクチンで免疫した３匹のウサギからの抗血
清のＥＬＩＳＡである。力価は＞０．１のＯ．Ｄ．を生じた血清の最終希釈の逆
数で表している。ＥＬＩＳＡ抗原は精製六価蛋白であった。各々の記号は１匹の
ウサギからの血清を表す。

【図３Ｂ】ミョウバン中又はＣＦＡ中の六価ワクチンで免疫した３匹のウサギからの抗血
清のＥＬＩＳＡである。力価は＞０．１のＯ．Ｄ．を生じた血清の最終希釈の逆
数で表している。ＥＬＩＳＡ抗原は精製六価蛋白であった。各々の記号は１匹の
ウサギからの血清を表す。

【図４Ａ】ミョウバン中の六価蛋白で免疫したウサギからの抗血清のＥＬＩＳＡである。
力価は、それぞれの血清型のＡ群連鎖球菌からの精製ペプシン抽出Ｍ蛋白（ｐｅ
ｐＭ）を用いて測定した。各々の記号は免疫した３匹のウサギの１匹を表す。

【図４Ｂ】ミョウバン中の六価蛋白で免疫したウサギからの抗血清のＥＬＩＳＡである。
力価は、それぞれの血清型のＡ群連鎖球菌からの精製ペプシン抽出Ｍ蛋白（ｐｅ
ｐＭ）を用いて測定した。各々の記号は免疫した３匹のウサギの１匹を表す。

【図４Ｃ】ミョウバン中の六価蛋白で免疫したウサギからの抗血清のＥＬＩＳＡである。
力価は、それぞれの血清型のＡ群連鎖球菌からの精製ペプシン抽出Ｍ蛋白（ｐｅ
ｐＭ）を用いて測定した。各々の記号は免疫した３匹のウサギの１匹を表す。

【図４Ｄ】ミョウバン中の六価蛋白で免疫したウサギからの抗血清のＥＬＩＳＡである。
力価は、それぞれの血清型のＡ群連鎖球菌からの精製ペプシン抽出Ｍ蛋白（ｐｅ
ｐＭ）を用いて測定した。各々の記号は免疫した３匹のウサギの１匹を表す。

【図４Ｅ】ミョウバン中の六価蛋白で免疫したウサギからの抗血清のＥＬＩＳＡである。
力価は、それぞれの血清型のＡ群連鎖球菌からの精製ペプシン抽出Ｍ蛋白（ｐｅ
ｐＭ）を用いて測定した。各々の記号は免疫した３匹のウサギの１匹を表す。

【図４Ｆ】ミョウバン中の六価蛋白で免疫したウサギからの抗血清のＥＬＩＳＡである。
力価は、それぞれの血清型のＡ群連鎖球菌からの精製ペプシン抽出Ｍ蛋白（ｐｅ
ｐＭ）を用いて測定した。各々の記号は免疫した３匹のウサギの１匹を表す。

【図５】ミョウバン中の六価蛋白で免疫したウサギからの抗血清のｉｎｖｉｔｒｏオ
プソニン作用アッセイを示す。回転混合物は、試験微生物、免疫血清０．１ｍｌ
、及び非免疫ヒト血液０．４ｍｌを含む。混合物を４５分間回転し、染色したス
ミアの顕微鏡計数により、連鎖球菌を取り込んだあるいは連鎖球菌と結合したＰ
ＭＮのパーセンテージを評価した。各アッセイにおいて、免疫前血清は＜１０％
のオプソニン作用パーセントを生じた。各々の異なる棒は免疫した３匹のウサギ
の１匹からの血清を表す。

【図６】六価ウサギ抗血清によって促進される、同じ血清型のＡ群連鎖球菌内の異なる
系統のオプソニン作用を示すグラフである。各々の記号は横軸に示された血清型
のＡ群連鎖球菌の系統を表す。オプソニン作用アッセイは実施例の中で述べたよ
うに実施した。

【図７Ａ】六価Ｍ蛋白ワクチンの配列である（配列番号：１５及び配列番号：１６）。

【図７Ｂ】六価Ｍ蛋白ワクチンの配列である（配列番号：１５及び配列番号：１６）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答を刺激することができ
る少なくとも１０個のアミノ酸の長さのＡ群連鎖球菌由来の少なくとも２個の免
疫原性ポリペプチド；及び（ｂ）免疫原性部分の免疫原性を保護するが、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答
を刺激する必要はない、免疫原性ポリペプチドのＣ末端ペプチドを含む、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答を刺激する免疫原性融合ポリペプチド。
【請求項２】上記免疫原性ポリペプチドのひとつが血清型５のＡ群連鎖球
菌から得られる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】上記免疫原性ポリペプチドのひとつが血清型６のＡ群連鎖球
菌から得られる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】上記免疫原性ポリペプチドのひとつが、１、１．１、２、３
、４、１１、１２、１３、１４、１８、１９、２２、２４、２８、３０、４８、
４９、５２及び５６から成る群から選択されるＡ群連鎖球菌血清型から得られる
、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】（ａ）Ａ群連鎖球菌に対する防御免疫応答を刺激することが
できる少なくとも１０個のアミノ酸の長さのＡ群連鎖球菌由来の少なくとも２個
の免疫原性ポリペプチド；及び（ｂ）免疫原性部分の免疫原性を保護するが、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答
を刺激する必要はない、免疫原性ポリペプチドのＣ末端ペプチドを含む、Ａ群連鎖球菌に対する免疫応答を促進するためのワクチン剤。
【請求項６】上記免疫原性ポリペプチドのひとつが血清型５のＡ群連鎖球
菌から得られる、請求項５に記載のワクチン剤。
【請求項７】上記免疫原性ポリペプチドのひとつが血清型６のＡ群連鎖球
菌から得られる、請求項５に記載のワクチン剤。
【請求項８】上記免疫原性ポリペプチドのひとつが、１、１．１、２、３
、４、１１、１２、１３、１４、１８、１９、２２、２４、２８、３０、４８、
４９、５２及び５６から成る群から選択されるＡ群連鎖球菌血清型から得られる
、請求項５に記載のワクチン剤。
【請求項９】アジュバントをさらに含む、請求項５に記載のワクチン剤。
【請求項１０】アジュバントがミョウバンあるいはフロイントアジュバン
トである、請求項９に記載のワクチン剤。
【請求項１１】請求項５から７のいずれか１項に記載のワクチン剤を投与
することを含む、Ａ群連鎖球菌感染に対して宿主を予防接種するための方法。