ES2280101T3 - Vacunas de estreptococos del grupo a. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido de fusión, que comprende: (a) una porción inmunogénica multivalente en la que la porción inmunogénica comprende al menos dos péptidos inmunogénicos, en el que cada péptido inmunogenico comprende al menos 10 aminoácidos, de un fragmento amino terminal de una proteína M de estrepcococos del grupo A, y en el que la porción inmunogénica multivalente es capaz de generar una respuesta inmune contra estreptococos del grupo A; y (b) un péptido carboxilo terminal que es una reiteración de un péptido de la región amino terminal de la porción multivalente.
Description
Vacunas de estreptocosos del grupo A.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
solicitud provisional estadounidense N°= 60/058.635, presentada el
12 de Septiembre de 1997, solicitud que está incorporada mediante
referencia en su totalidad.
El presente invento proporciona las
composiciones farmacéuticas y métodos, y en particular, vacunas para
su uso en la prevención de infecciones por estreptococos del Grupo
A.
Los estreptococos son un grupo de bacterias con
la capacidad para crecer en cadenas. Muchas variedades son en parte
de la flora bacteriana normal en humanos y no son especialmente
dañinas. Sin embargo, un grupo particular de bacterias de
estreptococos, llamadas grupo A y representadas por el
Streptococcus pyogenes, es un patógeno humano. Brevemente,
los estreptococos del grupo A causan una variedad de enfermedades
humanas, que oscilan desde la faringitis y pioderma sin
complicaciones hasta infecciones mortales asociadas con el síndrome
del shock tóxico, invasión de tejidos profundos y sepsis. En algunos
individuos, la faringitis por estreptococos sin tratar puede ser
seguida de una fiebre reumática aguda. En años recientes ha habido
un aumento dramático en la incidencia de infecciones graves por
estreptococos (Davies y otros, "Invasive group A streptococcal
infections in Ontario, Canada. Ontario group A Streptococcal study
group," N. Engl. J. Med. 335:547-554,
1996) y en la incidencia de fiebre reumática (Veasey y otros,
"Resurgence of acute rheumatic fever in the intermountain region
of the United States". N. Eng. J Med.
316:421-427, 1987).
Aunque las infecciones por estreptococos pueden
ser tratadas generalmente con antibióticos, en al menos un 4% de los
casos la infección lleva a una fiebre reumática aguda. Esta
enfermedad es particularmente prevalente en países en vías de
desarrollo tales como India, en la que millones de niños en edad
escolar están afectados.
El presente invento proporciona nuevas vacunas
para estreptococos del Grupo A con una inmunogenicidad potenciada, y
además proporciona otras ventajas relacionadas.
Expuesto brevemente, el presente invento
proporciona polipéptidos de fusión inmunogénicos sintéticos que
estimulan una respuesta inmune frente a los estreptococos del grupo
A. Dentro de un aspecto tales polipéptidos comprenden (a) al menos
dos polipéptidos inmunogénicos a partir del grupo A de al menos 10
aminoácidos de longitud que son capaces de estimular una respuesta
inmune frente a los estreptococos del Grupo A, y un péptido C
terminal al polipéptido inmunogénico que protege la inmunogenicidad
de la porción inmunogénica. Dentro de las realizaciones preferidas,
el péptido C terminal no se requiere para estimular una respuesta
inmune frente a los estreptococos del Grupo A y por tanto, puede ser
un péptido no inmunogénico sin consecuencias, o un polipéptido
inmunogénico reiterado. Dentro de ciertas realizaciones, el
polipéptido inmunogénico puede ser obtenido a partir de una gran
variedad de estreptococos del Grupo A (que oscilan desde "1"
hasta mas de "90"), incluyendo por ejemplo los tipos 1, 1.1,
2,3,4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 22, 24, 28, 30, 48, 49, 52, 55
y 56.
Dentro de otros aspectos del presente invento,
los agentes vacunantes son proporcionados para promover una
respuesta inmune frente a los estreptococos del Grupo A, que
comprenden (a) al menos dos polipéptidos inmunogénicos desde un
estreptococo del Grupo A hasta al menos 10 aminoácidos en longitud
que son capaces de estimular una respuesta inmune protectora en
respuesta frente a estreptococos del Grupo A, y (b) un péptido C
terminal al polipéptidos inmunogénico que protege la inmunogenicidad
de la porción inmunogénica, en la que el péptido C terminal no es
requerida para estimular una respuesta inmune frente a los
estreptococos del grupo A. Como antes se menciona, el polipéptido
puede ser seleccionado de una gran variedad de estreptococos del
Grupo A (que oscilan desde "1" hasta más de "90"),
incluyendo por ejemplo, tipos 1.1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14,
18, 19, 22, 24, 28, 30, 48 ,49 ,49, 52, 55 y 56. Dentro de ciertas
realizaciones adicionales, el agente vacunante puede comprender
además un adyuvante, tal como, por ejemplo, alúmina, adyuvante de
Freund, y/o un cofactor inmunomodulador (por ejemplo,
IL-4, IL-10,
INF-\gamma, o IL-2,
IL-12 o IL-15).
También se proporcionan métodos para vacunar a
un hospedante frente a infecciones de estreptococos de Grupo A, que
comprenden administrar un agente vacunante como se describe
anteriormente.
Estos y otros aspectos del presente invento
serán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción
detallada y los dibujos adjuntos. Además, diversas referencias son
expuestas aquí que describen en más detalle ciertos procedimientos o
composiciones (por ejemplo plásmidos, etc.), y son por lo tanto
incorporadas mediante referencia en su totalidad.
La Figura 1 es un esquema de la vacuna
hexavalente que indica la longitud de cada fragmento del gen emm y
los sitios de restricción que fueron sintetizados en los cebadores
de PCR originales. Cada uno de los fragmentos génicos emm comienza
en el primero codon que codifica la proteína nativa madura excepto
el fragmento emm3, que representa los codones
21-70.
La Figura 2 es una electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS de la proteína hexavalente
purificada teñida con azul de Coomassie. El análisis de imagen
asistida por ordenador de las bandas proteicas teñidas indica que la
proteína hexavalente (P.M. 45 KDa) cuenta el 90,3% de la proteína
total en la muestra.
Las Figuras 3A y 3B son ELISAs de antisueros de
tres ratones inmunizados con la vacuna hexavalente bien en alúmina o
en CFA. Los valores de concentración son expresados como la inversa
de la última dilución del suero que resultó en una D.O. de > 0,1.
El antígeno de ELISA fue la proteína hexavalente purificada. Cada
símbolo representa suero de un conejo.
Las Figuras 4A-4F son ELISAs de
antisueros de conejos inmunizados con la proteína hexavalente en
alúmina. Los valores de concentración fueron determinados usando las
pepsina purificadas -extracto de proteinas M (pep M) a partir de los
serotipos respectivos de estreptococos del grupo A. Cada símbolo
representa uno de tres conejos inmunizados.
La Figura 5 describe ensayos de opsonizaicón
in vitro de antisueros de conejos inmunizados con la proteína
hexavalente en alúmina. Las mezclas de rotación consistieron en el
organismo de ensayo, 0,1 ml de suero inmune, y 0,4 ml de sangre
humana no inmune. La mezcla fue hecha rotar durante 45 minutos y el
porcentaje de PMNs que habían ingerido o estuvieron asociados con
estreptococos fue estimado mediante cuentas microscópicas de frotis
teñidos. En cada ensayo, el suero preinmune resultó en un porcentaje
de < 10% de opsonización. Cada barra diferente representa sueros
de uno de los tres conejos inmunizados.
La Figura 6 es un gráfico que describe la
opsonización de diferentes cepas dentro del mismo serotipo de
estreptococos del grupo A promovido por el antisuero de conejo
hexavalente. Cada símbolo representa una cepa de estreptococos del
grupo A del serotipo indicado en el eje horizontal. Los ensayos de
opsonización fueron realizados como se describieron a continuación
en los Ejemplos.
La Figura 7 es una secuencia de la vacuna de
proteína M hexavalente (SEQ ID Nº: 15 y SEQ ID Nº: 16).
Previamente a exponer el invento, puede ser de
ayuda para entender el mismo exponer las definiciones de ciertos
términos que serán usados a partir de aquí.
"Agente vacunante" se refiere a una
composición que es capaz de estimular una respuesta inmune
protectora dentro del hospedante que recibe el agente vacunante. El
agente vacunante puede ser bien una proteína, o, un agente basado en
el ADN (como por ejemplo un vehículo de suministro génico). Dentro
de aspectos adicionales, se puede generar un hospedante procariótico
que sea un agente vacunante, y diseñarlo para que exprese un
polipéptido inmunogénico o una construcción multivalente del
presente invento (véase por ejemplo, la solicitud norteamericana Nº
07/540.586).
Un "vehículo de suministro génico" se
refiere a un vehículo recombinante, tal como un vector viral
recombinante, un vector de ácidos nucleidos (tal como un plásmido),
una molécula de ácidos nucleicos desnuda tal como genes, una
molécula de ácidos nucleicos acomplejada a una molécula
policatiónica capaz de neutralizar la carga negativa de la molécula
de ácidos nucleicos y condensar la molécula de ácidos nucleicos en
una molécula compacta, un ácido nucleido asociado con un liposoma
(Wang y otros, PNAS 84: 7851, 1987), una bacteria, y ciertas
células eucariótidcas tales como células productoras, que son
capaces de suministrar una molécula de ácidos nucleicos que tienen
uno o más propiedades deseables para las células hospedantes en un
organismo.
Como se observa anteriormente, el presente
invento proporciona agentes vacunantes adecuados para prevenir las
infecciones por estreptococos del Grupo A. Brevemente, como se
describe a continuación con más detalle, ha sido descubierto que,
para optimizar la inmunogenicidad de todos los aspectos de una
vacuna multivalente, dentro de un aspecto del invento, se
proporcionan los polipéptidos de fusión sintéticos inmunogénicos que
estimulan una respuesta inmune frente a los estreptococos del grupo
A. Tales polipéptidos comprenden generalmente (a) al menos dos
polipéptidos inmunogénicos de los estreptococos del grupo A de al
menos 10 aminoácidos de longitud que son capaces de estimular una
respuesta inmune frente a los estreptococos del grupo A, y (b) un
péptido C terminal al polipéptidos que protege la inmunogenicidad de
la porción inmunogénica, en la que el péptido C terminal no es
requerido para estimular una respuesta inmune frente a los
estreptococos del grupo A. Péptidos protectores particularmente
preferidos son generalmente de diez aminoácidos de longitud, y
pueden ser de 30 aminoácidos o más largos.
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Polipéptidos inmunogénicos adecuados para usar
dentro del presente invento puede ser fácilmente identificados y
generados dada la descripción de la presente solicitud (véase
también Dale y Beachey, J. Exp. Med. 163:
1191-1202; 1986: Beachey y otros, Nature 292:
457-459, 1981; Dale y otros J. Immunol
151:2188-2194; 1993; y patentes norteamericanas
Nºs: 4.454.121; 4.521.334; 4.597.967; 4.705.684; 4.919.930; y
5.124.153). Polipéptidos particularmente preferidos pueden ser
obtenidos dentro de los 50 residuos aminoacídicos del extremo
N-terminal de una proteína M.
Los serotipos de estreptococos del grupo A
pueden ser fácilmente obtenidos a partir de aislados clínicos, de
colecciones universitarias (por ejemplo, Colección de la universidad
Rockefeller, 1230 York Avenue, Nueva York, NY) o de depósitos tales
como la colección americana de cultivos tipo (10801 University
Boulevard, Manassas, Virginia). Además, las secuencias para los
serotipos de estreptococos del grupo A están disponibles a partir de
los centros para el control de enfermedades, Atlanta, Georgia.
Para demostrar directamente que los epítopos de
proteínas M opsonizantes podrían separarse de los epítopos
autoinmunes, los péptidos son copiados a partir de diversos
serotipos (por ejemplo, los 20-50 aminoácidos amino
terminal de M5 (Beachery y otros, "Purification and properties of
M protein extracted from gourp A streptococci with pepsin: Covalent
structure of the amino terminal region of the type 24 M antigen",
J. Exp. Med. 145: 1469-1483, 1977). SM5
(1-20) no pudo reaccionar con los anticuerpos
reactivos frente a pep M5 de corazón purificados mediante afinidad
(Beacher y otros, "Purification and properties of M proteins
extracted from group A streptococci with pepsin: Covalent structure
of the amino terminal region of the type 24 M antigen". J.
Exp. Med. 145: 1469-1483, 1977). Conejos
inmunizados con SM5 (1-20) acoplados al toxoide
tetánico desarrollaron anticuerpos a elevada concentración frente a
pep M5 que opsonizó los estreptococos de tipo 5 (Beachey y otros,
"Purification and properties of M protein extracted from group A
streptococci with pepsin: Covalent structure of the aminoterminal
region of the type 24 M antigen", J. Exp. Med. 145:
1469-1483, 1977). De modo más importante, ninguno de
los sueros inmunes reaccionó de modo entrecruzado con el miocardio
humano.
Las proteínas M evocan anticuerpos que
reaccionan de modo entrecruzado con una variedad de tejidos humanos
y antígenos dentro de esos tejidos (Baird y otros, "Epitopes of
group A streptococcal M protein shared with antigens of articular
cartilage and synovium", J. Immunol. 146:
3132-3137, 1991; Bronze, M. S. y Dale, J. B.,
"Epitopes of streptococcal M proteins that evoke antibodies that
cross-react with human brain", J. Immunol.
151:2820-2828., 1993; Dale. J.B. and Beachey
E.H., "Protective antigenic determinant of streptococcal M protein
shared with sarcolemmal membrana protein of human Heart", J.
Exp. Med. 156: 1165-1176, 1982). Para determinar
la reactividad cruzada, una serie de péptidos solapantes es
sintetizada que copia fragmentos seleccionados (por ejemplo M5), y
es usada para bien inhibir o evocar anticuerpos de reactividad
entrecruzada de tejidos. Por ejemplo, los anticuerpos de reacción
entrecruzada para miosina evocados por pep M5 en conejos fueron casi
totalmente inhibidos por el péptido 84-116 de pep
M5. Este péptido se extiende por la región entre las repeticiones A
y B de M5 e incluye la repetición A6 degenerada. Anticuerpos murinos
y humanos de reactividad entrecruzada para la miosina reaccionaron
con un epítopo del péptido 183-189, que está
localizado en la región entre las repeticiones B y C de la molécula
M5 intacta.
Los epítopos de reactividad entrecruzada para la
membrana del sarcolema adicionales están localizados en el péptido
164-197. Varios epítopos de M5 que evocan
anticuerpos que reacciona de modo entrecruzado con el cartílago
articular y sinovio pueden también encontrarse dentro de las
repeticiones B y la región que se extiende en las repeticiones A y B
de M5. Los epítopos de reactividad entrecruzada del cerebro de M6
que fueron compartidos con otras proteínas M están localizados en la
región de repetición B de la molécula.
Muchos de los epítopos de reactividad
entrecruzada con tejidos son compartidos entre las proteínas M de
tipo 5, 6, 18 y 19 (Bronze, M. S. y Dale, J. B., "Epitopes of
streptoccoccal M proteins that evoke antibodies that
cross-react with human brain", J. Immunol.
151:2820-2828. 1993). Los datos de estructura
primaria revelan que todas estas proteínas M contienen secuencias
similares dentro de sus repeticiones B (Dale y otros, "Recombinant
tetravalent group A streptococcal M protein vaccine", J.
Immunol. 151:2188-2194, 1993; Dale y otros.,
"Recombinant, octavalent group A streptococcal M protein
vaccine", Vaccine 14:944-948, 1996; Dale y
otros, "Type-specific immunogenicity of a
chemically synthesized peptide fragement of type 5 streptococcal M
protein", J.Exp. Med. 158: 1727-1732,
1983), que es con mucha probabilidad la localización de los epítopos
de reacción entrecruzada combinados de corazón, cerebro y
articulación.
Debería enfatizarse que no es necesario
localizar el epítopo específico de tejido, sino más bien, localizar
primero los epítopos protectores y asegurar que no hay tejidos
reactivos.
Una vez que un polipéptidos inmunogénico
adecuado para un serotipo seleccionado ha sido identificado, puede
ser, opcionalmente combinado con polipéptidos innmunogénicos a
partir de otros serotipos, para construir una vacuna multivalente. A
este respecto las vacunas preferidas incluyen vacunas desarrolladas
a partir de una combinación de serotipos tales como 1,1.1, 2, , 3,
4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 22, 24, 30, 48, 49, 52, 56 ( para
serotipo 30 véase Nakashima y otros, Clin Infec. Dis. 25:
260, 1997). Ejemplos representativos incluyen vacunas tales como 24,
5, 6, 19, 1, 3, X; y 1, 3, 5, 6, 18, 19, 22, 24, 28, 30, y X, en el
que X es el polipéptido protector C terminal.
Los agentes vacunantes del presente invento
pueden ser sintetizados químicamente (véase por ejemplo, Beachey
otros, Nature 292: 457-459, 1981), o
generados de modo recombinante. Para la producción recombinante, los
cebadores de PCR pueden ser sintetizados para amplificar las
secuencias 5' deseadas de cada gen emm, y cada cebador se extiende
para contener un sitio de enzima de restricción único usado para
ligar los productos de PCR individuales en tándem.
Como se observa anteriormente, la porción C
terminal del agente vacunante es construida a modo de contener una
porción selectiva que puede perderse o cortarse in vivo sin
afectar la eficacia de la vacuna. Esto puede lograrse mediante, por
ejemplo, la inclusión de una polipéptido no inmunogénico sin
consecuencias en el extremo, o, incluyendo un polipéptido
inmunogénico que no impacta de modo adverso en la eficacia de la
vacuna (por ejemplo, un polipéptido inmunogénico reiterado puede
estar incluido en el extremo de la vacuna). Además, los antígenos
protectores a partir de patógenos sin relacionar pueden también
combinarse en una polipéptido único, que pueden compensar la
necesidad de vehículos. Las vacunas frente a algunos patógenos
pueden incluir epítopos de células T y B originalmente derivados de
diferentes proteínas en la misma construcción híbrida.
Adicionalmente, las proteínas hibridas multivalentes pueden ser
conjugadas lo suficiente en vacunas de carbohidratos, tales como
aquellas para S. pneumoniae, H. influenza B o los
estreptotocos del grupo B.
Para la expresión de proteínas, los genes
multivalentes están ligados en cualquier plásmido de replicación que
se usa para transformar una cepa hopedadora procariota apropiada.
Los procariotas incluyen organismos gram negativo o gram positivo,
por ejemplo E. coli o bacilos. Células hospedantes
procariotas adecuadas para transformación incluyen, por ejemplo,
E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y
diversas otras especies dentro del género Pseudomonas,
Streptomyces, y Staphilococcus.
Los vectores de expresión transfectados en
células hospedantes procariotas comprenden generalmente uno o más
marcadores de selección fenotípicos tales como, por ejemplo, un gen
que codifica proteínas que confieren resistencia a antibióticos o
que suministran un requerimiento autotrófico, y un origen de
replicación reconocido por el hospedante que asegura la
amplificación dentro del hospedante. Otros vectores de expresión
para células hospedantes procariotas incluyen un marcador de
selección de origen bacteriano derivado de plásmidos disponibles
comercialmente. Este marcador de selección puede comprender
elementos genéticos del vector pBR322 de clonaje (ATCC 37017).
Brevemente, pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y
tetraciclina y así proporciona medios simples para identificar
células transformadas. Las secciones del "esqueleto" de pBR322
se combinan con un promotor apropiado y una secuencia génica
estructural ETF de mamífero. Otros vectores comercialmente
disponibles incluyen, por ejemplo, pKK223-3
(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), pQE30 y pGEM 1 (Promega
Biotec, Madison, WI, USA).
Las secuencias de promotores comunes para su uso
dentro de vectores de expresión procariotas incluyen la
\beta-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor
de lactosa (Chang y otros, Nature 275: 615, 1978; y Goeddel y
otros, Nature 281: 544, 1979), y el sistema promotor
triptófano (trp) (Goeddel y otros, Nucl. Acids Res. 8: 4057,
1980; y el documento de patente EPA 36.776) y promotor tac (Sambrook
y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, (1989)). Un sistema de expresión de células
hospedantes procariotas particularmente útil emplea un promotor
P_{L} de fago \lambda y una secuencia represora termolábil
cl857ts. Los vectores plasmídicos disponibles de la Colección
Americana de Cultivos Tipo que incorpora derivados del promotor
P_{L} de fago \lambda incluye el plásmido pHUB2 (residente in la
cepa E. coli JMB9 (ATCC 37092)) y pPLc28 (residente en E.
coli RR1 (ATCC 53082)).
La transformación de las cepas hospedantes de
E. coli es lograda mediante electroporación usando métodos
estándar (Dale y otros, "Recombinant tetravalente group A
streptococcal M protein vaccine", J. Immunol. 151:
2188-2194, 1993; Dale y otros, "Recombinant,
octavalent group A streptococcal M protein vaccine," Vaccine
14: 944-948, 1996). Transformantes con éxito son
identificados mediante trasferencia de colonias usando sueros de
conejo generados frente a una de las proteínas M nativas o una copia
peptídica sintética de amino terminal de una de las proteínas M
incluidas en la proteína multivalente.
El tamaño molecular y la antigenicidad de la
proteína recombinante expresada mediante clones seleccionados son
determinados realizando transferencias Western de extractos de E.
coli (Dale y otros, "Recombinant tetravalente group A
streptococcal M protein vaccine", J. Immunol. 151:
2188-2194, 1993) usando antisueros de conejo
generados frente a cada proteina M nativa purificada a partir de
extractos de pepsina de estreptococos vivos (Beachey y otros,
"Purification and properties of M protein extracted from group A
streptococci with peptin: Covalent structure of the amino terminal
region of the type 24 M antigen," J. Exp. Med. 145:
1469-1483, 1977). El gen multivalente es secuenciado
mediante el método de terminación de cadena por nucleótido didesoxi
para confirmar que cada fragmento génico es una copia exacta de la
secuencia emm nativa.
Se ha demostrado que la inyección de mamíferos
con vehículos de suministro génico (por ejemplo, ADN desnudo) que
codifican antígenos de diversos patógenos tiene como resultado
respuestas inmunes protectoras (Ulmer y otros, Science 259:
1745-9, 1993; Bourne y otros, J Infect. Dis.
173: 800-7, 1996; Hiffman y otros, Vaccine
12: 1529-33, 1994). Puesto que la descripción
original de la expresión in vivo de proteínas extrañas a
partir de ADN desnudo inyectado en tejido muscular (Wolf y otros,
Science 247: 1465-8, 1990), ha habido varios avances
en el diseño y suministro de ADN para propósitos de vacunación.
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Las vacunas de proteína M descritas
anteriormente se ajustan de modo ideal para el suministro vía ADN
desnudo ya que la inmunidad protectora está en última instancia
determinada por anticuerpos. Por ejemplo, dentro de una de las
realizaciones los genes multivalentes están ligados en plásmidos que
se modifican mediante ingeniería específicamente para la expresión
en células de mamífero (véase, por ejemplo, Hartikka y otros, Hum
Gene Ther 7: 1205-17, 1996, que contiene el
elemento promotor/potenciador del gen temprano de citomegalovirus,
el péptido señal del activador de plasminógeno tisular humano y un
elemento terminador a partir del gen de la hormona de crecimiento
bovino). Los genes híbridos de proteína M pueden ser clonados en el
plásmido que es usado para transfectar líneas celulares humanas para
asegurar la expresión de proteína recombinante. El plásmido es
propagado en E. coli y purificado en cantidades suficientes
para estudios de inmunización mediante centrifugación en gradiente
de cloruro de cesio. Los ratones son inmunizados con 50 \mug de
plásmido en 50 \mul de salino dado intramuscularmente en el rectus
femoris. Inyecciones de refuerzo de la misma dosis son dadas a tres
y seis semanas tras la inyección inicial.
Una amplia variedad de otros vehículos de
suministro génico puede igualmente ser utilizada dentro del contexto
del presente invento, incluyendo por ejemplo, virus,
retrotransposones y cósmidos. Ejemplos representativos incluyen
vectores adenovirales (por ejemplo, documentos de patentes WO
94/26914, WO 93/9191; Yei y otros, Gene Therapy
1:192-200, 1994; Kolls y otros, PNAS 91
(1): 215-219, 1994; Kass-Eisler
y otros, PNAS 90 (24): 11498-502, 1993;
Guzman y otros Circulation 88(6):
2838-48, 1993; Guzman y otros Cir. Res. 73
(6): 1202-1207, 1993; Zabner y otros Cell
75(2): 207-216, 1993; Li y otros, Hum
Gene Ther. 4(4): 403-409, 1993; Caillaud
y otros, Eur. J. Neurosci. 5(10):
1287-1291, 1993), vectores
adeno-asociados tipo 1
("AAV-1") o adeno-asociados
tipo 2 ("AAV-2") (véase el documento de patente
WO 95/13365; Flotte y otros, PNAS 90(22):
10613-10617, 1993), vectores de hepatitis delta,
virus delta vivos y atenuados y vectores virales de herpes (por
ejemplo, documento de patente norteamericana Nº 5.288.641), así como
vectores que están descritos dentro de la patente norteamericana Nº
5.166.320. otros vectores representativos incluyen vectores
retrovirales (por ejemplo, documento de patente EP 0 415 731;
documentos de patente WO 90/07936; WO 91/02805; WO 94/03622; WO
93/25698; WO 93/25234; documento de patente norteamericana Nº
5.219.740; WO 93/11230; WO 93/10218). Los métodos para usar tales
vectores en terapia génica son bien conocidos en la técnica, véase,
por ejemplo, Larrick, J. W. y Burck, K.L., Gene Therapy: Application
of Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co.. Inc., Nueva
York, Nueva York, 1991; y Dreigler, M., Gene Transfer and
expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, Nueva
York, 1990.
Vehículos de suministro génico pueden ser
introducidos en una célula hospedante utilizando un vehículo, o
mediante diversos métodos físicos. Los ejemplos representativos de
tales métodos incluyen la transformación usando precipitación por
fosfato cálcico (Dubensky y otros, PNAS 81:
7529-7533, 1984), microinyección directa de tales
moléculas de ácidos nucleicos en células diana intactas (Acsadi y
otros, Nature 352:815-818, 1991), y
electroporación mediante la cual las células suspendidas en una
disolución conductora son sometidas a un campo eléctrico intenso
para polarizar de modo transitorio la membrana, permitiendo entrar a
las moléculas de ácidos nucleicos. Otros procedimientos incluyen el
uso de moléculas de ácidos nucleicos unidas a un adenovirus inactivo
(Cotton y otros, PNAS 89:6094, 1990), lipofección (Felgner y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:7413-7417, 1989), bombardeo de
microproyectiles (Williams y otros, PNAS
88:2726-2730, 1991), compuestos policatiónicos
tales como polilisina, ligandos específicos de receptor, liposomas
que atrapan las moléculas de ácidos nucleicos, esferoplastos de
fusión a través de los cuales E. coli que contienen las moléculas de
ácidos nucleicos son desprovistas de las pared celular externa y
unidas a células animales usando polietilénglicol, transducción
viral, (Cline y otros., Pharmac. Ther. 29:69, 1985; y
Friedmann y otros, Science 244:1275, 1989), y ligando ADN (Wu
y otros, J. of Biol. Chem. 264:16985-16987,
1989), así como virus psoraleno inactivos tales como Sendai o
Adenovirus.
Suero a partir de ratones inmunizados con
vehículos de suministro génicos que contiene genes de proteínas M
multivalentes son ensayados en lo que se refiere a la concentración
de anticuerpo total mediante ELISA usando proteínas M nativas como
antígeno. Anticuerpos opsonizantes séricos son ensayados como se
describe anteriormente. La eficacia protectora de vacunas de ADN de
proteínas M es determinada mediante ensayos directos de protección
de ratón usando los serotipos de estreptococos de grupo A
representados en la vacuna.
Para el uso terapéutico, los agentes de
vacunación pueden ser administrados a un paciente por una variedad
de rutas, incluidos por ejemplo, por rutas intramusculares,
subcutáneas y mucosas. Los agentes de vacunación pueden ser
administrados como una dosis única o en múltiples unidades a lo
largo de un período prolongado de tiempo. Dentro de las
realizaciones preferidas, el agente de vacunación es administrado a
un humano en una concentración de 50-300 \mug por
inyección intramuscular de sitio único. Varias inyecciones pueden
ser administradas (por ejemplo, tres o cuatro) al menos una vez al
mes a parte para incrementar además la eficacia de la vacuna.
Típicamente, el agente de vacunación será
administrado en forma de una composición farmacéutica que comprende
un polipéptido purificado en conjunción con vehículos, excipientes o
diluyentes aceptables fisiológicamente. Dichos excipientes serán no
tóxicos para los pacientes en las dosis y concentraciones empleadas.
De modo ordinario, la preparación de dichos compuestos supone la
combinación del agente de vacunación con tampones, antioxidantes
tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular
(menos de alrededor de 10 residuos), proteínas, aminoácidos,
carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa o dextrano, agentes
quelantes como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y
excipientes. El salino tamponado neutro o salino mezclado con
albúmina de suero no específico son diluyentes apropiados
ejemplares.
Dentro de las realizaciones preferidas del
invento, el agente de vacunación es combinado con un adyuvante, tal
como, por ejemplo, el adyuvante de Freund, alúmina y los
semejantes.
Los siguientes ejemplos son ofrecidos a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Un gen emm hexavalente fue construido usando PCR
para amplificar las regiones 5' especificas de los seis genes emm
diferentes (24, 5, 6, 19, 1 y 3) esencialmente como se describe
previamente (Dale y otros, "Recombinant tetravalent group A
streptococcal M protein vaccine", J. Immunol.
151:2188-2194, 1993; Dale y otros,
"Recombinant octavalent group A streptococcal M protein
vaccine", Vaccine 14:944-948, 1996).
Brevemente, los genes multivalentes son
construidos usando PCR y los cebadores que especifican los
fragmentos de gen emm 5' específicos. Los fragmentos de gen pueden
tener un tamaño de intervalo de entre 30 bp a 300 bp. El ADN
cromosómico de cada serotipo de estreptococos del grupo A es usado
como molde para las reacciones PCR. Para el gen emm hexavalente
descrito en el ejemplo, los cebadores de PCR son como sigue:
La PCR es realizada en el molde cromosómico como
se describe previamente (Dale y otros, "Recombinant tetravalent
group A streptococcal M protein vaccine", J. Immunol.
151:2188-2194, 1993). Para asegurar la ligación
de los fragmentos en la orientación y marco de lectura correctos,
cada producto de PCR es purificado, unido y luego sometido de nuevo
a PCR usando el cebador directo del fragmento 5' y el cebador
inverso del fragmento 3'. Por ejemplo, para construir un gen emm
hexavalente que contiene secuencias de ADN de los tipos 24, 5, 6,
19, 1 y proteínas 3 M, los fragmentos de los genes M24 y M5 son
amplificados mediante PCR usando los cebadores descritos
anteriormente. Los productos de PCR son purificados de los geles de
agarosa, cortados con la enzima de restricción apropiada, y ligados
juntos (Dale y otros, "Recombinant tetravalent group A
streptococcal M protein vaccine", J. Immunol.
151:2188-2194, 1993; Dale y otros,
"Recombinant, octavalent group A streptococcal M protein
vaccine", Vacinne 14:944-948, 1996). La
mezcla de ligación es luego amplificada mediante PCR usando el
cebador M24 delantero y el cebador M5 inverso. El producto
resultante del tamaño apropiado es luego purificado y unido al
fragmento del gen M6 y M19 que fue construido similarmente. Después
de la reacción de ligación final, el gen entero es amplificado de
nuevo mediante PCR, cortado con las enzimas de restricción
apropiadas y unido en un vector de expresión adecuado. Para la
adición del reiterado fragmento del gen M24 en el sitio 3', el
plásmido fue purificado del hospedante E. coli y un nuevo
producto PCR del emm 24 fue clonado a la fuerza en el sitio de
restricción 3' Pstl.
El gen hexavalente fue secuenciado mediante el
método de terminación de la cadena por
didesoxi-nucleótido para confirmar que cada
fragmento del gen fue una copia exacta de la respectiva secuencia
emm nativa.
Los E. coli transformados se hicieron
crecer en un incubador con agitación hasta fase log en 1 l. de LB
que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de
kanamicina. El IPTG (2 mM) fue añadido al final de las cuatro horas
de crecimiento. La célula de precipitación fue suspendida en 30 ml
de PBS y lisada en una célula de presión francesa a 1000 psi. La
proteína hexavalente fue purificada del sobrenadante usando la
resina Ni-NTA según el protocolo proporcionado por
el fabricante (Qiagen). El tampón de elución que contenía la
proteína fue concentrado de 15 ml a 5 ml en un filtro de centrifuga
(Ultrafree-15, Millipore). La purificación final fue
llevada a cabo por la filtración del gel sobre Superdex 75 (de
calidad prep, Pharmacia Biotech). La fracción activa fue
identificada por transferencia Western (Dale, J.B. y Beachey, E.H.,
"Multiple Heart-cross-reactive
epitopes of streptococcal M proteins", J.Exp. Med.
161:113-122, 1985) usando el antisuero de conejo
contra el pep M24 (Beachey y otros, "Purification and properties
of M protein extracted from group A streptococci with pepsin:
Covalent structure of the amino Terminal region of the type 24 M
antigen", J. Exp. Med. 145:1469-1483,
1977). La concentración de la proteína total fue determinada por
métodos estándar y la muestra fue diluida en PBS para contener 200
\mug/ml de la proteína hexavalente. La pureza de las muestras fue
determinada mediante escaneado del gel (Photoshop digital image and
Collage image analysis).
La estructura del gen emm híbrido fue confirmada
por los métodos de secuenciación de la doble hebra después de la
ligación en el pQE30. La secuencia de cada subunidad fue idéntica a
la del respectivo gen emm nativo (Figura 1). Los fragmentos fueron
unidos sólo por los dos aminoácidos especificados por cada sitio de
restricción único usado para facilitar su unión (Figura 1).
La proteína hexavalente purificada migró en los
geles de poliacrilamida-SDS con un P.M. aparente de
45 kDa. (Figura 2). Los análisis de escaneado de gel revelaron que
la proteína hexavalente intacta daba cuenta del 90% aproximadamente
del total de la proteína susceptible a tinción en el gel. Las
transferencias Western que usan los antisueros frente al pep M24
mostraron que la mayoría de las bandas de proteínas restantes fueron
inmunoreactivas y las más parecidas fueron los fragmentos de la
proteína hexavalente (datos no mostrados).
Dos grupos, de tres conejos cada uno, fueron
inmunizados con 100 \mug de la vacuna hexavalente, o bien
precipitados con alúmina o emulsionados en un adyuvante completo de
Freund. Para la precipitación en alúmina, la proteína hexavalente
(200 \mug/ml) fue añadida en un volumen igual de hidróxido de
aluminio (2 mg/ml) (Rehydragel HPA, Reheis, Inc., Berkeley Heights,
NJ) y mezclado con cuidado a 40ºC durante toda la noche. La proteína
hexavalente fue también emulsionada en CFA a una concentración final
de 100 \mug/ml. A los conejos que recibieron la vacuna hexavalente
en alúmina se les dio 100 \mug I.M. como inyección inicial y la
misma dosis fue repetida en 4 y 8 semanas. El segundo grupo de
conejos recibió 100 \mug de la vacuna hexavalente en CFA
subcutáneamente como inyección inicial y luego se les dieron
inyecciones de refuerzo de la misma dosis en salino en 4 y 8
semanas. La sangre fue obtenida antes de la primera inyección y en
intervalos de 2 semanas a partir de entonces.
Ensayos de anticuerpos. Los ELISAs fueron
realizados usando las proteínas M extraídas de la pepsina nativa
purificada (Beachey y otros, "Purification and properties of M
protein extracted from group A streptococci with pepsin: Covalent
structure of the amino Terminal region of the type 24 M antigen",
J. Exp. Med. 145:1469-1483, 1977) o de la
proteína hexavalente purificada, como se describe anteriormente
(Dale y otros, "Heterogeneity of type-specific and
cross-reactive antigenic determinants within a
single M protein of group A streptococci", J. Exp. Med.
151:1026-1038, 1980). Los anticuerpos
opsónizantes fueron detectados por ensayos de opsonización in
Vitro y ensayos bactericidas indirectos (Beachey y otros,
"Human immune response to immunization with a structurally defined
polypeptide fragment of streptococcal M protein", J. Exp. Med.
150:862-877, 1979).
Los sueros de animales preinmunes e inmunes
fueron ensayados mediante ELISA usando la proteína vacuna y las
proteínas M extraídas- pepsina nativa como antígenos de fase sólida
(Dale y otros, "Heterogeneity of
type-specific and cross-reactive
antigenic determinants within a single M protein of group A
streptococci", J. Exp. Med. 151:1026-1038,
1980). Las concentraciones para ELISA son definidas como el inverso
de la ultima disolución de antisuero resultante en una D.O. de >
0,1 a 450 nm. Las concentraciones de suero inmune frente al antígeno
M nativo son más probables a la hora de predecir los niveles de
anticuerpos que son evocados por la proteína recombinante que
reaccionarán con la proteína M en la superficie del serotipo
respectivo del estreptococo (es decir, que promueve la
opzonización).
Los anticuerpos de la proteína M opsonizante se
correlacionan con la protección contra la infección con el mismo
serotipo del estreptococo A (Lancefield, R.C., "Current knowledge
of the type specific M antigens of group A streptococci", J.
Immunol. 89:307-313, 1962; Lancefield, R.C.,
"Persistence of type-specific antibodies in man
following infection with group A streptococci", J. Exp. Med.
110:271-282, 1959). Dos ensayos in vitro
relacionados son usados para detectar los anticuerpos opsonizantes
en el suero immune. El primero es un ensayo de muestreo que mide la
opsonización en mezclas de suero inmune, sangre humana no inmune
completa y el organismo de ensayo (Beachey y otros,
"Purification and properties of M protein extracted from group A
streptococci with pepsin: Covalent structure of the amino terminal
region of the type 24 M antigen", J. Exp. Med.
145:1469-1483, 1977). 0,1 ml de suero de ensayo
son añadidos a un número estándar de bacterias e incubados durante
15 minutos a temperatura ambiente. 0,4 ml de sangre humana
heparinizada ligeramente son añadidos y la mezcla entera es hecha
girar extremo sobre extremo a 370 durante 45 minutos. Al final de la
rotación, los frotis son preparados en el portaobjetos del
microscopio que son secados al aire y teñidos con tinción de Wright.
"El porcentaje de opsonizacion" es cuantificado al contar el
porcentaje de los leucocitos polimorfonucleares que son ingeridos o
están asociados a las bacterias. Un ensayo interpretable debe tener
un valor de control preinmune que es del 10% de opsonización o
menor.
La confirmación de la presencia de anticuerpos
opsonizantes es obtenida por ensayos de anticuerpo bactericidas
indirectos según la descripción original por Lancefield (Lancefield,
R.C., "Current knowledge of the type specific M antigens of group
A streptococci", J. Immunol. 89:307-313,
1962). Este ensayo es realizado usando mezclas de ensayo como se
describe anteriormente excepto que son añadidas menos bacterias y la
rotación se deja seguir durante 3 horas. Al final de la rotación,
las placas de vertido se hacen en agar de sangre de oveja y las
bacterias que sobreviven son cuantificadas después del crecimiento
durante toda la noche a 370. El porcentaje de muertes en presencia
del suero inmune es calculado por comparación con el crecimiento en
el suero no inmune.
La eficacia protectora de las vacunas de
proteína M es determinada bien mediante ensayos indirectos o bien
directos de protección de ratón (inmunización pasiva o activa). Los
ensayos indirectos son realizados dándole al ratón 1 ml de suero
inmune o preinmune por ruta intraperitoneal (i.p) 24 horas antes de
probar infecciones con el organismo de ensayo vía i.p. (Beachey y
otros, "Human immune response to immunization with a structurally
defined polypeptide fragment of streptococcal M protein", J.
Exp. Med. 150:862-877, 1979). Para cada
organismo de ensayo, los grupos de 25 ratones recibieron bien suero
preinmune o bien inmune. Los animales son luego divididos en 5
grupos de 5 ratones cada uno y se les dan a cada subgrupo las dosis
prueba incrementadas 10 veces de estreptococo virulento. Después de
7 días de observación, el LD50 es calculado para cada serotipo
ensayado.
Los ensayos de protección de ratón directo son
realizados similarmente excepto en que los ratones son inmunizados
activamente con la vacuna de la proteína M antes de las infecciones
de prueba. Cada ratón recibe 25-50 \mug de vacuna
en alúmina dada de formar intramuscular (i.m.) en un tiempo de 0,4
semanas y 8 semanas. Las infecciones desafiantes son realizadas diez
semanas después de la primera inyección. Los animales testigo son
falsamente inmunizados con alúmina solo. El LD50 es calculado y su
significado es determinado usando el ensayo exacto de Fisher.
Para mostrar directamente la eficacia protectora
de los anticuerpos opsonizantes evocada por la vacuna hexavalente,
los ratones fueron inmunizados con la vacuna adsorbida de ALÚMINA y
luego ensayado con dos de los seropipos representados en la vacuna.
Las hembras cruzadas con ratones suizos fueron inmunizadas por la
ruta I.M. en la pata trasera según el siguiente programa: tiempo 0,
25 \mug; 3 semanas, 25 \mug; 6 semanas, 50 \mug; y 13 semanas,
50 \mug. Los experimentos prueba fueron realizados en los 20
ratones inmunizados y en 20 testigos, ratones no inmunizados (Tabla
1). Las cepas de prueba fueron tipos 24 y 19, con el razonamiento de
que el péptido M24 es el fragmento más largo en la proteína
hexavalente y es reiterada y el fragmento M 19 es uno de los dos que
son sólo 35 aminoácidos de longitud. Estos dos fragmentos deberían
reflejar el intervalo de inmunogenicidad protectora de la proteína
hexavalente. La prueba intraperitoneal de los ratones con el
estreptococos virulento es el ensayo de laboratorio más severo para
los anticuerpos opsonizantes.
En este experimento, dos grupos de diez ratones
cada uno fueron tratados con un inóculo que se aproximó al
LD_{70}-LD_{100} para cada serotipo, que era de
2x10^{4} CFU. Los experimentos prueba comenzaron 15 semanas
después de que la primera dosis de vacuna fuera administrada y las
muertes fueron registradas durante 10 días. Los ratones que fueron
inmunizados con la vacuna hexavalente y tratados con el estreptococo
tipo 24 fueron protegidos significantemente de la muerte, comparado
con el grupo testigo (p=0001). Los ratones desafiados con el
estreptococo de tipo 19 fueron protegidos por la vacuna, pero el
nivel no fue estadísticamente significante (p=15). Si el tamaño del
grupo de prueba hubiera sido el doble, el mismo nivel de protección
habría dado como resultado una velocidad de supervivencia
estadísticamente significativa. Cuando la supervivencia del grupo
completo de los ratones inmunizados fue analizada, el nivel de
protección fue altamente significativo (p=0002).
Nº de Muertos/ Nº de Supervivientes de los
ratones desafiados (%supervivencia)
Para asegurar que ninguna de las vacunas de la
proteína M evoca los anticuerpos reactivos cruzados de tejido, los
ensayos de inmunofluorescencia indirecta fueron realizados usando
secciones congeladas de corazón riñón y cerebro humano, (Dale, J.B.
y Beachey E.H., "Protective antigenic determinant of streptococcal
M protein shared with sarcolemmal membrana protein of human
heart", J. Exp. Med. 156:1165-1176, 1982).
Las secciones finas de tejido obtenidas en la autopsia (4 \mum)
son preparadas en los portaobjetos del microscopio y almacenadas en
una caja sellada a -700°C hasta su uso. El suero de ensayo es
diluido 1:5 en PBS y depositado gota a gota en la sección del
tejido. Los portaobjetos testigo son hechos con suero preinmune y
PBS. Los portaobjetos son incubados a temperatura ambiente durante
30 minutos y luego lavados tres veces en PBS en un recipiente de
portaobjetos. La anticuerpo de cabra anti IgG/IgM/IgA marcado con
fluoresceína es diluida 1:40 en PBS y depositada gota a gota en los
portaobjetos que son lavados de nuevo, secados y montados con 1% de
Gelvetol y un cubreobjetos. La fluorescencia es detectada usando un
microscopio Zeiss Axiophot equipado con una fuente de luz de Xenón.
La inmunofluorescencia es grabada usando una escala de
0-4+, con 0 siendo no fluorescencia y 4+ siendo la
fluorescencia obtenida con un antisuero estándar, positivo generado
en ratones contra la proteína completa de tipo 5 M (Dale, J.B y
Beachey, E.H., "Multiple
heart-cross-reactive epitopes of
streptococcal M proteins", J. Exp. Med.
161:113-122, 1985).
Tres conejos fueron inmunizados cada uno con
dosis de 100 \mug de la vacuna hexavalente bien en alúmina o en
CFA. Inyecciones de refuerzo de la misma dosis fueron dadas en 4 y 8
semanas bien en alúmina o en salino, respectivamente. Las
concentraciones de ELISA fueron determinadas usando la proteína
hexavalente purificada como antígeno de fase sólida (Figura 3). El
suero de los animales que recibió la vacuna hexavalente en alúmina
tenía concentraciones de anticuerpo que eran igual o mayores que en
el suero de los conejos que recibieron la misma dosis en CFA. En un
experimento subsiguiente, tres conejos fueron inmunizados I.M. con
100 \mug de la vacuna hexavalente en salino solo según el mismo
programa. Ninguno de estos conejos desarrolló concentraciones
significativas de anticuerpos frente al inmunógeno o bien frente a
las proteínas pep M respectivas (datos no mostrados). Estos datos
indican que la alúmina es un adyuvante adecuado y necesario para la
vacuna multivalente y es igual a la actividad adyuvante del CFA en
combinación con la proteína hexavalente.
Uno de los principales objetivos de este estudio
fue el diseñar una proteína multivalente, híbrida que retuviera las
propiedades inmunogénicas de cada subunidad de la proteína M. Los
ELISAs fueron realizados en el suero obtenido de los tres conejos
inmunizados con la vacuna hexavalente en alúmina (Figura 4). En cada
caso el antígeno del ELISA fue la proteína M extraída- pepsina
purificada. De esta manera, el ensayo mide sólo los anticuerpos
evocados por la proteína hexavalente que reacciona con la proteína M
nativa y no los anticuerpos que pueden ser específicos para los
segmentos de unión o las conformaciones que no están presentes en
las proteínas M nativas. La proteína hexavalente evocó niveles
significativos de anticuerpos contra cada proteína M representada en
la construcción de la vacuna (Figura 4). En gran medida, ninguno de
los antisueros contenían anticuerpos que reacción cruzada con los
tejidos de corazón o tejidos de riñón humanos, como se determinó por
los ensayos de inmunofluorescencia indirecta (datos no
mostrados).
El suero de los tres conejos contenía niveles
significativos de anticuerpos opsonizantes contra cada serotipo del
estreptococo del grupo A representados en la vacuna (Figura 5).
Estos resultados fueron confirmados por ensayos bactericidas
indirectos usando uno de los sueros inmunes (Tabla 2). Cogidos
juntos, los resultados indican que los componentes individuales de
la vacuna hexavalente retienen la conformación y la inmunogenicidad
necesaria para obtener anticuerpos que reaccionen con las proteínas
M nativas en la superficie de cada serotipo respectivo del
estreptococo del grupo A.
CFU que sobrevivieron a 3h de rotación:
De lo anterior se aprecia que, aunque las
realizaciones del invento han sido descritas aquí con un propósito
de ilustración, diversas modificaciones pueden ser hechas sin
desviarse del espíritu y del alcance del invento. Por consiguiente,
el invento no está limitado excepto por las reivindicaciones
anexas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Dale. James B
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: VACUNAS DE ESTREPTOCOCOS DE GRUPO A
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: SEED and BERRY LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 98104
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: disquette
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patent In Release Nº 1.0. Versión Nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-SEPT-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: McMasters, David D.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.963
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 481112.410P1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (206) 622-4900
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (206) 682-6031
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGCAT CGGTCGCGAC TAGGTCTCAG ACAGAT
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCACGTAGTT TCTCTTTAGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGAT CCGCCGTGAC TAGGGGTACA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGTCG ACCTCAGTTT TTAACCCTTC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGTCG ACAGAGTGTT TCCTAGGGGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGCCAT GGTAACTTGT CATTATTAGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGCCAT GGAGAGTGCG TTATACCTAGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGCTGC AGAGATAACT TCTCATTCTG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGCTGC AGAACGGTGA TGGTAATCCT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGTA CCAGCTCTCT TAAAATCTCT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGTA CCTTGTTAGA TCAGGTTACA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGATCG ATATTTAACT CTTGTAACAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGATCG ATGTCGCGAC TAGGTCTCAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGAAGC TTTTACTTAC GTGCCTCTAATTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1158 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1149
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 383 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (35)
1. Un polipéptido de
fusión, que comprende: (a) una porción inmunogénica multivalente en
la que la porción inmunogénica comprende al menos dos péptidos
inmunogénicos, en el que cada péptido inmunogénico comprende al
menos 10 aminoácidos, de un fragmento amino terminal de una proteína
M de estrepcococos del grupo A, y en el que la porción inmunogénica
multivalente es capaz de generar una respuesta inmune contra
estreptococos del grupo A; y (b) un péptido carboxilo terminal que
es una reiteración de un péptido de la región amino terminal de la
porción multivalente.
2. El polipéptido de
fusión según la reivindicación 1, en el que sólo un péptido
inmunogénico es reiterado.
3. El polipéptido de
fusión según la reivindicación 1, en el que la respuesta inmune
contra estreptococos del grupo A comprende anticuerpos opsonizantes
que no reaccionan de modo entrecruzado con el tejido humano.
4. El polipéptido de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3
en el que el polipéptido de fusión tiene al menos un péptido
inmunogénico de un serotipo de estreptococos del grupo A
seleccionado del 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 22, 24,
28, 30, 48, 49, 52, 55, y 56.
5. El polipéptido de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
en el que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de
estreptococo del grupo A del serotipo 1.
6. El polipéptido de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
en el que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de
estreptococos del grupo A del serotipo 2.
7. El polipéptido de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
en el que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de
estreptococos del grupo A del serotipo 3.
8. El polipéptido de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3
en el que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de
estreptococos del grupo A del serotipo 5.
9. El polipéptido de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3
en el que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de
estreptococos del grupo A del serotipo 6.
10. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de estreptococos
del grupo A del serotipo 11.
11. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de estreptococos
del grupo A del serotipo 12.
12. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de estreptococos
del grupo A del serotipo 13.
13. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de estreptococos
del grupo A del serotipo 14.
14. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de estreptococos
del grupo A del serotipo 18.
15. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de estreptococos
del grupo A del serotipo 19.
16. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de estreptococos
del grupo A del serotipo 22.
17. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de estreptococos
del grupo A del serotipo 24.
18. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que al menos uno de los péptidos inmunogénicos es de estreptococos
del grupo A del serotipo 28.
19. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que la porción inmunogénica consiste en seis a diez péptidos
inmunogénicos.
20. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que la porción inmunogénica consiste de seis péptidos
inmunogénicos.
\newpage
21. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y
19-20, en el que cada péptido inmunogénico de la
porción inmunogénica es de un serotipo de estreptococos del grupo A
diferente.
22. El polipéptido de fusión
según la reivindicación 21, en el que los serotipos son 1, 3, 5, 6,
19, y 24.
23. El polipéptido de fusión
según la reivindicación 21, en el que los serotipos son 1, 3, 5, 6,
18, 19, 22, 24, 28 y 30.
24. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en el
que los polipéptidos inmunogénicos del polipéptido de fusión están
unidos por aminoácidos codificados por un sitio de enzima de
restricción.
25. El polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-24, que
comprende además un marcador.
26. El polipéptido de fusión
según la reivindicación 25, en el que el marcador es capaz de unirse
a una resina de níquel.
27. Una composición, que
comprende un polipéptido de fusión según cualquiera de las
reivindicaciones de 1-26, y un excipiente, vehículo,
estabilizador o diluyente farmacéuticamente aceptables.
28. La composición según la
reivindicación 27, que comprende además un adyuvante.
29. La composición según la
reivindicación 28 en la que el adyuvante es alúmina o adyuvante de
Freund.
30. La composición según
cualquiera de las reivindicaciones 27-29, que
comprende además un cofactor inmunomodulador.
31. La composición según la
reivindicación 30 en la que el cofactor inmunomodulador es
seleccionado del grupo que consiste de IL-4,
IL-10, Y-IFN, IL-2,
IL-12 e IL-15.
32. Un polipéptido de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1-26, o una
composición según cualquiera de las reivindicaciones
27-31, para uso terapéutico.
33. El uso de un polipéptido
de fusión según cualquiera de las reivindicaciones
1-26, o una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 27-31, para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de las infecciones de estreptococos
del grupo A.
34. El uso según la
reivindicación 33, en el que dicho polipéptido de fusión o
composición obtiene anticuerpos opsonizantes.
35. El uso según la
reivindicación 34 en el que dichos anticuerpos opsonizantes no
reaccionan de modo entrecruzado con el tejido hospedante.
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