KR101191591B1 - 돌연변이 뉴몰리신 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돌연변이 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질로서, 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소된 것인 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산의 결실을 포함하여, 상기 영역 내의 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 야생형 단백질과 다르다.

Description

돌연변이 뉴몰리신 단백질{MUTANT PNEUMOLYSIN PROTEINS}
본 발명은 돌연변이 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 뉴몰리신 단백질을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 단백질 및 이 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
스트렙토코커스 뉴모니아는 폐렴, 수막염 및 균혈증 등의 침습성 질환을 유발하는 중요한 병원체이다. 효과적인 항생제 요법을 자유롭게 이용할 수 있는 지역에서도, 입원 환자에 있어서 폐렴구균성 폐렴 사망률은 19%에 달한다. 개발도상국의 경우, 매년 5세 이하 아동 3 백만명 이상이 폐렴으로 사망하는데, 이 폐렴의 가장 보편적 원인균이 스트렙토코커스 뉴모니아이다. 스트렙토코커스 뉴모니아는 심각성은 덜하지만, 중이염 및 부비강염과 같은 유행성이 큰 감염을 유발기도하며, 이러한 감염은 선진국에서의 보건 비용에 막대한 영향을 미치고 있다. 중이염은 특히 어린이에게서 영향력이 큰 반면, 부비강염은 어린이와 성인 모두에게서 발병한다.
미국에서는 Prevnar(등록상표)로, 그 밖의 국가에서는 Prevenar(등록상표)로 시판되는 와이어쓰 제조의 7가 다당류 접합 백신이 현재로서는 스트렙토코커스 뉴모니아 감염 방어용으로서 시판되는 유일한 유효 접합 백신이다(Kyaw et al., 2002; Hausdorff et al., 2000). 이 백신은 가능한 90종 중에서(Kalin, 1998), 7종의 정제된 스트렙토코커스 캡슐형 다당류(혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)를 각각 캐리어 단백질에 접합된 채로 포함하고 있다. 이 백신의 제조 방법은 미국 특허 제4,673,574호(Anderson)에 기재되어 있다. 캡슐형 다당류의 접합에 사용되는 단백질은 디프테리아 변성 독소(toxoid) CRM197로서, 유아에게서 백신의 면역원성을 증가시키는 역할을 한다(Blum et al., 2000; Katkocin, 2000). 그러나 스트렙토코커스 뉴모니아의 각 혈청형은 구조적으로 상이한 캡슐형 다당류를 가지고 있어서, 1 가지 혈청형에 의한 면역화는 대부분의 다른 혈청형에 대한 방어 효과를 제공하지 못하며, 다만 백신 관련 혈청형에 대한 약간의 방어 효과가 있을 뿐이다(Whitney et al., 2003).
혈청형 특이적 면역화에 대한 보완 방법에 대한 연구가 현재 진행되고 있다. 가능한 한 방법은 스트렙토코커스 뉴모니아의 모든 침습성 균주에 의해 생성되는 53 kDa 독소인 뉴몰리신(PLY)과 같은 종 공통 병독성 인자 역시 사용하는 방법이다(Paton et al., 1993). PLY는 단독으로 또는 Prevnar(등록상표)로 다당류에 접합된 캐리어 단백질로서 사용되어 효능을 증가시킬 수 있다. Alexander 등의 문헌(1994)은 PLY 변성 독소에 의한 마우스의 면역화가 스트렙토코커스 뉴모니아의 9종의 상이한 혈청형에 의한 면역성 테스트에서 면역 방어 효과를 부여한다는 것을 입증하였다. PLY는 전형적 보체 경로를 활성화하고(Paton et al., 1984), 호중구와 대식세포의 아폽토시스를 유도함으로써(Cockeran et al., 2002; Kadioglu et al., 2000) 스트렙토코커스 뉴모니아 감염의 면역 반응과 유사한 면역 반응을 자극하는 것으로 확인되었다.
PLY는 숙주 세포막의 콜레스테롤에 결합한 후 용해 세공을 형성하는 30～50량체의 대형 고리 구조를 형성하는 콜레스테롤 결합성 세포 용해소(Cholesterol-binding Cytolysin; CBC)의 그룹에 속한다(Palmer, 2001; Jedrzejas, 2001). 세공 형성 메카니즘은 완전히 이해되지는 않았지만, 사건들의 순서에 대해서는 많은 논쟁이 이루어지고 있다(Bonev et al., 2000; Shepard et al., 1998). 그러나, 세공을 형성할 수 있다는 것은 천연 PLY가 독성이 크다는 것을 의미하며, 이는 면역원성 조성물의 개발이라는 측면에서 문제가 되고 있다.
제조에 이용되는 접합 방법이 PLY를 비독성으로 만들기는 하지만, 비독성 형태에서부터 출발하는 것이 더 바람직할 것이다. 또한, 독성 형태는 비접합 면역원성 조성물의 제조 시 사용하기에 곤란할 수 있다. PLY의 독성은 뉴몰라이소이드(pneumolysoid)로서 알려진 PLY 변성 독소를 생성하는 위치 지정 돌연변이 유발법에 의해 크게 약화시킬 수 있다(Paton, 1996).
이와 같은 변성 독소는 다양한 종류가 존재하며, 단독으로 사용되거나 다당류에 접합시켜 사용되든 간에, 병독성 2형 D39 스트렙토코커스 뉴모니아에 의한 면역성 테스트에 대하여 마우스에 면역 방어 효과를 제공하는 것으로 확인되었다(Paton et al., 1991; Alexander et al., 1994). 이전에는 대부분의 돌연변이가 C' 말단 부근에 위치하는 보존도가 높은 11개 아미노산 영역에서 발생되었다(Mitchell et al., 1992; Berry et al., 1995). 이 부위는 숙주 세포에 대한 결 합에 관여하는 것으로 확인되었다(de los Toyos et al., 1996). 이와 같은 PLY의 다수의 돌연변이 형태가 국제 특허 출원 WO 90/06951에 개시되어 있으며, 상기 공보에 개시된 각 돌연변이는 단백질의 C' 말단 쪽에 위치한다.
PLY와 관련된 또 다른 문제점은 PLY는 대규모 제조 시 응집된다는 점인데, 이 문제는 PLY를 면역원성 조성물에 사용하기 위해 해결해야 할 문제점이다. PLY의 응집은 세공 형성과 관련된 PLY의 올리고머화와 관련이 있는 것으로 생각된다. 따라서 본 발명은 PLY-PLY 상호작용(올리고머화)을 감소시키거나 없앰으로써, 대규모 제조 시 응집 기회가 감소되도록 하여 PLY의 정제형을 쉽게 제조하고자 한다.
Toyos 등의 문헌(1996)은 PLY의 다양한 영역에 대한 모노클로날 항체(mAb)의 생성 방법과 완전한 독소 및 "프로테이나제 K 절개(nicked)" 형의 프로빙 방법을 기술한다. 프로테이나제 K는 PLY를 37 kDa 단편 및 15 kDa 단편으로 절단한다. 항체 mAb PLY 4는 완전한 PLY만을 인식하였고, 상기 단편은 어느 것도 인식하지 않았으며, 이는 이 mAb에 대한 PLY 상의 에피토프가 절개된 영역 내에 존재함을 나타낸다. PLY를 mAb PLY 4와 예비 항온처리한 후에 리포솜에 첨가할 경우, 독소는 리포솜막에 더 이상 세공을 형성하지 않았다. 이것은 mAb PLY 4에 의해 차단된 부위(아스파라긴 N143 영역으로 생각됨)가 다른 PLY 단량체와 상호작용하여 올리고머형 세공을 형성하는 데 관여하는 부위임을 함축한다. 스트렙토코커스 종 유래의 스트렙토리신의 올리고머화는 Hugo 등의 문헌(1986)에 기술된 mAb로 차단할 수도 있다. 이 항체가 올리고머화 부위에 결합함으로써 올리고머화를 직접 방해하는지, 또는 독소 단량체의 상호작용을 공간적으로 방해하는 회합이 있는지는 알려져 있지 않다.
모노클로날 항체 PLY 4는 Suarez-Alvarez 등(2003)에 의해 추가로 규명되었으며, Suarez-Alvarez 등은 mAb PLY 4에 대한 에피토프가 1996년에 Toyos 등에 의해 최초로 제안된 N143 영역보다 더 하류에 위치함을 제시한다. 현재 인식 부위는 입체구조 의존적이며 N143 영역 내가 아니라 아미노산 E151 - Y247 내에 위치하는 것으로 생각된다.
이에 앞서서 본 발명자들은 상기 영역과 올리고머화에 있어서의 그 역할을 이해하기 위한 최초 단계로서 PLY 내의 N142N143 결실 및 N143D 치환을 유발하였다. 상기 양 돌연변이체의 분석 결과, 용혈 작용과 세공 형성에 있어서 천연 PLY와 동일한 거동이 확인되었으며(Search, 2002), 이것은 올리고머화가 차단되지 않았고 돌연변이체의 독성도 변화되지 않았음을 시사한다. 따라서, 이전에 생성한 돌연변이 PLY 형태는 감소된 독성 또는 감소된 올리고머화를 나타내지 않으며, 이것은 이러한 돌연변이가 면역원성 조성물의 제조 시 도움이 되지 않을 것임을 시사한다.
발명의 개요
본 발명은 대체로 돌연변이 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질을 포함하는 면역원성 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 단백질 및 이 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
따라서, 일 양태에서 본 발명은 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질에 관 한 것으로서, 상기 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소된 것이다. 이 돌연변이는 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 위치할 수 있다.
상기 돌연변이는 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내에 1개 이상의 아미노산이 결실 또는 치환된 것일 수 있다.
돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 1개 이상의 아미노산이 치환 또는 결실됨으로 인하여 야생형 단백질과는 다를 수 있다.
예를 들어, 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산, 예를 들어 144번 아미노산 발린과 145번 아미노산 프롤린, 146번 아미노산 알라닌과 147번 아미노산 아르기닌, 148번 아미노산 메티오닌과 149번 아미노산 글루타민, 또는 150번 아미노산 티로신과 151번 아미노산 글루탐산이 치환 또는 결실됨으로 인하여 야생형 단백질과 다를 수 있다.
전술한 돌연변이 PLY 단백질 중 어느 하나는 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 더 포함할 수 있다.
분리된 돌연변이 PLY 단백질은 포유동물에 대하여 감소된 독성을 나타낸다. 이는 일반적으로 세공 형성 활성이 감소된 결과로서, 세공 활성 감소는 야생형 PLY 단백질과 비교한 용혈 활성 감소 및/또는 올리고머화 활성 감소와 관련될 수 있다. 반드시는 아니지만, 돌연변이 PLY 단백질은 정제 및 후속 조작을 용이하게 하기 위 해 감소된 올리고머화 활성을 갖는 것이 바람직하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질; 및 (b) 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질(이 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소됨)을 포함하는 면역원성 접합체(conjugate)에 관한 것이다. 돌연변이는 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 위치할 수 있다.
돌연변이는 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내의 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실일 수 있다.
면역원성 접합체의 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실이 있음으로 인하여 야생형 단백질과 다를 수 있다.
예를 들어, 면역원성 접합체의 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산, 예를 들어 144번 아미노산 발린과 145번 아미노산 프롤린, 146번 아미노산 알라닌과 147번 아미노산 아르기닌, 148번 아미노산 메티오닌과 149번 아미노산 글루타민, 또는 150번 아미노산 티로신과 151번 아미노산 글루탐산이 치환 또는 결실됨으로 인하여 야생형 단백질과 다르다.
면역원성 접합체의 전술한 돌연변이 PLY 단백질 중 어느 하나는 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 더 포함할 수 있다.
면역원성 접합체의 당류, 올리고당류 또는 다당류는 스트렙토코커스 뉴모니아로부터 유래된 것일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질을 코딩하거나(상기 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소됨), 또는 상기 (a)에 기재된 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 분리 및 정제된 핵산 서열을 제공한다.
상기 돌연변이는 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 위치할 수 있다.
상기 돌연변이는 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내의 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실일 수 있다.
상기 핵산 서열은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실이 존재함으로 인하여 야생형 단백질과 다른 돌연변이 PLY 단백질을 코딩할 수 있다.
예를 들어, 상기 핵산 서열은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산, 예를 들어 144번 아미노산 발린과 145번 아미노산 프롤린, 146번 아미노산 알라닌과 147번 아미노산 아르기닌, 148번 아미노산 메티오닌과 149번 아미노산 글루타민, 또는 150번 아미노산 티로신과 151번 아미노산 글루탐산이 치환 또는 결실됨으로 인하여 야생형 단백질과 다른 돌연변이 PLY 단백질을 코딩할 수 있다.
상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 돌연변이 PLY 단백질은 전술한 것 중 어느 하나일 수 있으며, 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에 결실 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 돌연변이 PLY 단백질을 코딩하는 전술한 분리 및 정제된 핵산 서열 중 어느 하나를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이 재조합 발현 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염된 재조합 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과는 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소된 것인 본 발명의 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질을 제조하는 방법으로서, (a) 숙주 세포를 전술한 바와 같은 재조합 발현 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염시키고 상기 돌연변이 PLY 단백질이 숙주 세포에 의해 발현되도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 배양액으로부터 돌연변이 PLY 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 전술한 바와 같은 면역원성 접합체의 일부로서 또는 비접합 형태의, 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질(상기 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과는 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소됨); 및 (b) 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또 는 담체 1종 이상을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
상기 돌연변이는 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 위치할 수 있다.
상기 돌연변이는 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내의 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실일 수 있다.
상기 조성물의 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실이 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과는 다를 수 있다.
예를 들어, 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산, 예를 들어 144번 아미노산 발린과 145번 아미노산 프롤린, 146번 아미노산 알라닌과 147번 아미노산 아르기닌, 148번 아미노산 메티오닌과 149번 아미노산 글루타민, 또는 150번 아미노산 티로신과 151번 아미노산 글루탐산의 치환 또는 결실로 인하여 야생형 PLY 단백질과는 다를 수 있다.
상기 면역원성 조성물은 전술한 면역원성 접합체의 일부로서 또는 비접합 형태로 전술한 돌연변이 PLY 단백질 중 어느 것을 함유할 수 있으며, 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 상기 면역원성 조성물은 (a) (i) 스트렙토코커스(예, 스트렙토코커스 뉴모니아)로부터 유래된 당류, 올리고당류 또는 다당류; 및 (ii) 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질(상기 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144 ～161번 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과는 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성은 야생형 단백질의 독성에 비해 감소됨); 및 (b) 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체 1종 이상을 포함하는 면역원성 접합체를 포함할 수 있다. 이 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니아의 당류, 올리고당류 또는 다당류 아형을 복수 종 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질(상기 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～161번 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과는 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성은 야생형 단백질의 독성에 비해 감소됨); 및 (b) 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체 1종 이상을 포함하는 면역원성 조성물을 피험 포유동물 에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 예방 방법에 관한 것이다.
상기 면역원성 조성물은 (i) 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질; 및 (ii) 전술한 바와 같은 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 면역원성 조성물 제조 시 본 발명의 분리된 돌연변이 PLY 단백질 또는 면역원성 접합체 중 어느 하나를 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체와 본 발명의 돌연변이 단백질 또는 면역원성 접합체를 혼합하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 박테리아 감염의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 면역원성 조성물은 PLY와 면역학적으로 교차 반응성을 나타내는, 즉 PLY에 결합하는 항체에 의해 결합될 수 있는 콜레스테롤 결합성 세포 용해소를 포함하는 박테리아(참조: Palmer, 2001)에 의한 감염의 예방 또는 치료에 유용하다. 그러나 박테리아는 스트렙토코커스인 것이 바람직하고, 스트렙토코커스 뉴모니아인 것이 바람직하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 의학적 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 분리된 돌연변이 PLY 단백질 또는 면역원성 접합체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 분리된 돌연변이 PLY 단백질을 제공하는 단계 및 상기 돌연변이 단백질을 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 접합시키는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 전술한 방법에서 돌연변이 단백질은 스트렙토코커스 뉴모니아 다당류에 접합시킬 수 있다. 이 방법은 상기와 같이 얻은 접합체를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 돌연변이 PLY 단백질을 제공하는 단계; 상기 단백질을 용혈 활성에 대하여 테스트하는 단계; 상기 돌연변이 PLY 단백질을 올리고머화 활성에 대하여 테스트하는 단계 및 상기 돌연변이 PLY 단백질의 용혈 및 올리고머화 활성을 비돌연변이 단백질의 활성과 비교하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물에서의 사용 적합성에 대해 후보 돌연변이 PLY 단백질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 야생형 뉴몰리신의 아미노산 서열을 도시하고;
도 2는 mAb PLY4에 의해 검출되는 PLY 결실 돌연변이체의 웨스턴 블롯을 도시하고;
도 3은 WT PLY를 Δ6 PLY 돌연변이체와 비교하는 정량적 용혈성 분석의 결과를 도시하고;
도 4는 WT PLY를 Δ6 PLY 돌연변이체와 비교하는 세포독성 분석의 결과를 도시하고;
도 5는 WT PLY 처리된 적혈구막의 전자 현미경 사진을 도시하고;
도 6은 WT PLY 또는 Δ6 PLY로 처리 후 폐 조직 내 IL-6 수준을 도시하고;
도 7은 WT PLY 또는 Δ6 PLY로 처리 후 폐 세척액 내 IL-6 수준을 도시하고;
도 8은 WT PLY 또는 Δ6 PLY로 처리 후 기관지 폐포 세척액 내 총 단백질 수준을 도시하고;
도 9는 WT PLY 또는 Δ6 PLY에 의한 마우스 면역화에 반응하여 나타나는 항-PLY 항체 수준을 도시하고;
도 10은 WT PLY 또는 결실 돌연변이체 ΔA146 PLY로 처리한 SRBC(양 적혈구 세포) 내 독소 농도와 관련하여 나타낸 용혈도를 도시하며;
도 11은 WT PLY와 돌연변이체 PLY W433F, Δ6 PLY, Δ7 PLY, Δ8 PLY 및 ΔA146 PLY의 용혈 활성을 비교하여 보여주며;
도 12는 WT PLY와 돌연변이체 PLY W433F, Δ6 PLY, Δ7 PLY, Δ8 PLY 및 ΔA146 PLY의 쥐 L929 섬유아세포에 대한 세포독성을 보여주며;
도 13은 ΔA146 PLY는 RBL-2H3 비만 세포의 탈과립화를 유발하지 못하나 WT PLY는 유발한다는 것을 보여주며;
도 14는 야생형 PLY 또는 ΔA146 PLY로 처리한 후의 코어 바디 온도의 분석 결과를 도시한다.
PLY는 콜레스테롤 결합성 세포 용해소(CBC) 그룹의 일원이다. 야생형 뉴몰리신의 아미노산 서열은 도 1에 개시되어 있다. 도 1은 또한 2004년 4월 15일, NCBI-진뱅크 플랫 파일 공개판 141.0로부터 유래된, 이 서열의 진뱅크 확인 번호을 표시하고 있다.
본 발명은 용혈 활성 및/또는 올리고머화의 감소로 나타나는 바와 같이, 독성이 감소된 야생형 PLY 단백질의 아미노산 144～161번 아미노산 내에 돌연변이를 갖는 다수의 PLY 형태를 동정한 것에 기초한 것이다. 상기 영역의 공통(consensus) 서열은 다음과 같다: VPARMQYEKITAHSMEQL (도 1 참조).
한 양태에서, 본 발명은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 단백질과 다른 돌연변이 PLY 단백질에 관한 것이다. 상기 영역의 공통 서열은 다음과 같다: VPARMQYE (도 1 참조).
상기 돌연변이체는 아미노산 144～161번 영역, 예를 들어 144～151번 영역 내의 하나 이상의 아미노산에 치환 또는 결실을 보유할 수 있다.
따라서, 본 발명의 모든 양태에 있어서, 돌연변이 뉴몰리신은 야생형 서열의 아미노산 144번, 145번, 146번, 147번, 148번, 149번, 150번, 151번, 152번, 153번, 154번, 155번, 156번, 157번, 158번, 159번, 160번 또는 161번 중 하나 이상에, 돌연변이, 예를 들어 치환 또는 결실을 보유할 수 있다.
본 발명은 또한 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산이 치환 또는 결실됨으로 인하여 야생형 단백질과 다른 돌연변이 PLY 단백질에 관한 것이다. 이러한 이중 돌연변이체의 예로는 아미노산 144번 발린 및 145번 프롤린, 146번 알라닌 및 147번 아르기닌, 148번 메티오닌 및 149번 글루타민, 또는 150번 티로신 및 151번 글루탐산의 치환 또는 결실을 포함하는 것들을 들 수 있다.
이러한 돌연변이 PLY 단백질은 그 자체가, 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께, 면역원성 조성물에 사용될 수 있다.
또한, 이러한 돌연변이 PLY 단백질은 동종 또는 이종 유기체 유래의 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 접합되어 접합체를 형성하며, 이것은 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께, 면역원성 조성물에 사용된다. 따라서, 돌연변이 PLY를 접합시킬 수 있는 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 스트렙토코커스, 예를 들어 스트렙토코커스 뉴모니아로부터 유래된 것일 수 있다. 이것들은 박테리아 캡슐로부터 유래될 수 있다.
면역원성 조성물에 함유된 돌연변이 PLY 단백질은, 비접합형으로 또는 접합형으로, 예방법 또는 치료법에 이용된다.
돌연변이 PLY 단백질은, 비접합형으로 또는 접합형으로, 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 하나 이상에 하나 이상의 치환 또는 결실을 더 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 치환 또는 결실은 Paton 등의 국제 특허 출원 공개 공보 WO 90/06951에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본원에 기재된 분리된 돌연변이 PLY 단백질을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니아 면역원성 조성물이다.
돌연변이 PLY 단백질은 포유동물에서 면역원성 활성을 보유할 수 있다. "포유동물에서 면역원성이 있다"란 포유동물 면역계가 돌연변이 PLY 단백질에 대한 항체를 생산하고, 이들 항체는 또한 야생형 PLY 단백질을 인식한다는 것을 의미한다. 마찬가지로, 야생형 PLY 단백질에 대한 포유동물 항체 역시 돌연변이 PLY 단백질을 인식할 것이다. 바람직하게는, 돌연변이 단백질은 인간에게서 면역원성을 나타낸다. 바람직하게는 돌연변이 PLY 단백질은 포유동물 면역계가 야생형 VPARMQYEKITAHSMEQL 또는 VPARMQYE 서열에 결합하는 항체를 생산하도록 자극할 것이다.
한 구체예에서, 돌연변이는 야생형 단백질의 올리고머화에 관여하는 PLY 단백질의 영역 내에 있다.
이론에 구속되기를 원하지는 않지만, 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 PLY 단백질과 비교하여 감소된 세공 형성 활성으로 인하여 감소된 독성을 나타내는 것으로 생각된다. 이것은 감소된 올리고머화 및/또는 감소된 용혈 활성과 관련이 있는 것으로 생각된다. 독성은 직접 측정할 수 있다. 대안으로, 독성 가능성의 지표를 제공하기 위해 세공 형성, 올리고머화 및 용혈 활성 중 하나 이상을 측정할 수 있다.
결실 및 치환은 독성이 감소된 PLY 돌연변이 단백질을 제공하는 데 이용될 수 있는 돌연변이의 예이다. 비보존적 치환이 PLY 돌연변이체의 독성을 감소시키는 데 특히 적합한데, 그 이유는 비보존적 돌연변이를 갖는 돌연변이체가 보존적 치환을 갖는 돌연변이보다 야생형 수준의 기능을 유지할 가능성이 적기 때문이다.
보존적 치환은 아미노산 클래스 내의 치환 및/또는 하기에 제시된 BLOSUM62 매트릭스에서 양의 점수를 기록하는 치환으로서 정의할 수 있으며, 따라서 비보존적 치환은 아미노산 클래스 간의 치환 또는 BLOSUM62 매트릭스에서 양의 점수를 기록하지 않는 치환으로서 정의할 수 있다.
한 분류법에 따르면, 아미노산 클래스는 산성, 염기성, 비하전 극성 및 비극성으로 분류되며, 여기서, 산성 아미노산은 Asp 및 Glu이고; 염기성 아미노산 은 Arg, Lys 및 His이고; 비하전 극성 아미노산은 Asn, Gln, Ser, Thr 및 Tyr이고; 비극성 아미노산은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Trp 및 Cys이다.
또 다른 분류법에 따르면, 아미노산 클래스는 저친수성, 산성/산아미드계/친수성, 염기성, 저소수성 및 방향족으로 분류되며, 여기서, 저친수성 아미노산은 Ser, Thr, Pro, Ala 및 Gly이고; 산성/산아미드계/친수성 아미노산은 Asn, Asp, Glu 및 Gln이고; 염기성 아미노산은 His, Arg 및 Lys이고; 저소수성 아미노산은Met, Ile, Leu 및 Val이며; 방향족 아미노산은 Phe, Tyr 및 Trp이다.
BLOSUM62 매트릭스에서 양의 점수를 기록하는 보존적 치환은 다음과 같다:
Figure 112006090661811-pct00001
본 발명의 돌연변이 뉴몰리신 단백질은 도 1에 제시된 야생형 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 보유하는 것이 바람직하다. 이 돌연변이체는 야생형 서열과 85% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성, 또는 95% 이상의 동일성을 보유할 수 있다.
기준 서열에 대한 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성은, 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환은 고려하지 않고, 서열을 정렬하고 최적 퍼센트 서열 동일성을 얻기 위해 필요에 따라 갭을 도입한 후의, 기준 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. % 동일성 값은 WU-BLAST-2[Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)]에 의해 측정할 수 있다. WU-BLAST-2는 몇 가지의 검색 파라미터를 이용하며, 이들 파라미터의 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 조정 가능한 파라미터는 하기의 값으로 설정된다: 오버랩 범위 = 1, 오버랩 비율 = 0.125, 워드 역치(T) = 11. % 아미노산 서열 동일성 값은 WU-BLAST-2로 측정한, 일치하는 동일 잔기의 수를 기준 서열 잔기의 총수로 나누어 100을 곱한 값으로 결정한다(정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-BLAST-2에 의해 기준 서열로 도입한 갭은 무시한다).
퍼센트(%) 아미노산 유사성은 동일성과 동일한 방식으로 정의되며, 단, BLOSUM62 매트릭스에서 양의 값을 기록하는 잔기가 계산된다. 따라서, 동일하지는 않지만 유사한 특성을 보유하는(예를 들어, 보존적 치환으로 인하여) 잔기 역시 계산된다.
아미노산 144～161번, 예를 들어 144～151번 영역 내의 아미노산 삽입 역시 PLY 돌연변이체의 독성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개 또는 그 이상의 아미노산 삽입이 이용될 수 있다. 그러나, 결실 및 치환이 일반적으로 삽입에 비해 바람직한데, 그 이유는 결실 및 치환이 야생형 에피토프를 파괴할 가능성이 더 적기 때문이다. 이러한 파괴는 돌연변이 단백질의 면역원성을 감소시킬 수 있으며, 이는 면역원성 조성물에 있어서 바람직하지 않을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 돌연변이 PLY 단백질은 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 접합되어 면역원성 접합체를 형성한다. 이러한 양태에서, 상기 돌연변이 PLY 단백질은 그 면역원성을 보유할 수 있거나, 또는 상기 면역원성이 제거될 수 있다. 어느 경우에나, 돌연변이 PLY 단백질은 접합체의 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 면역원성을 증강시키는 역할을 한다.
상기 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 각각 돌연변이 PLY 단백질에, 예를 들어 (1) 단백질 작용기(예를 들어, 티올-티올 결합, 아민-카르복실 결합, 아민-알데히드 결합; 효소 직접 커플링)를 통한 직접 커플링; (2) 아민의 동종이작용성 커플링(예를 들어, 비스-알데히드를 사용함); (3) 티올의 동종이작용성 커플링(예를 들어, 비스-말레이미드를 사용함); (4) 광활성화 시약에 의한 동종이작용성 커플링; (5) 티올에 대한 아민의 이종이작용성 커플링(예를 들어, 말레이미드를 사용함); (6) 광활성화 시약(예를 들어, β-카르보닐디아조 계열)에 의한 이종이작용성 커플링; (7) 브롬화시안 활성화 또는 카르복시메틸화에 의한 아민 반응성기의 다당류 또는 올리고당류로의 도입; (8) 말레이미도-히드라지드와 같은 이종이작용성 화합물에 의한 티올 반응성 기의 다당류 또는 올리고당류로의 도입; (9) 소수성기의 단백질로의 도입에 의한 단백질-지질 접합; 및 (10) 반응성 기의 지질로의 도입에 의한 단백질-지질 접합(이에 국한되지 않음)을 비롯한 임의의 적절한 방식으로 접합시킨다. 또한, 비오틴-아비딘 상호작용 등의 이종이작용성 "비공유 커플링" 기법도 고려된다. 접합 기법에 대한 종합적 설명은, 본원에서 참고로 인용하는 Aslam 및 Dent의 문헌(1998)을 참조할 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 단백질에 접합시키는 또 다른 방법은 2003년 12월 17일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/530,480호 및 제60/530,481호에 기술되어 있으며, 상기 양 출원은 본원에서 참고 문헌으로 인용한다.
그 밖에도, Kuo 등의 미국 특허 제5,565,204호는 야생형 PLY 단백질에 상기 다당류를 접합시키는 방법을 기술하였으며, 이 방법 역시 본 발명의 돌연변이 PLY 단백질에 상기 다당류를 접합시키는 데 적합하다.
본 발명의 면역원성 조성물은 접합된 면역원성 조성물일 수 있다. 각 면역원성 조성물은 1종 이상의 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있으며, 이것들은 야생형 PLY 단백질의 유기체원(스트렙토코커스 뉴모니아)으로부터 유래된 것일 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 성분들은 유기체의 캡슐로부터 유래될 수 있다.
한 구체예에서, 당류, 올리고당류 또는 다당류는 스트렙토코커스 뉴모니아의 1 가지 이상의 혈청형으로부터 유래되며; 특정 혈청형은 면역원성 조성물에 의도된 용도 및 대상 집단에서의 이러한 혈청형의 분포도에 따라 달라진다.
또는, 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 이종 유기체(즉, 스트렙토코커스 뉴모니아 이외의 유기체)로부터 유래된다. 당류, 올리고당류 또는 다당류의 경우, 이에 한정되는 것은 아니지만, 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)(예를 들어 혈청형 A, C, Y 및 W135로부터 유래), 스태필로코커스 오리어스(Staphylococcus aureus) 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터 여러 종의 혈청형을 얻을 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 돌연변이 PLY 단백질은 스트렙토코커스 뉴모니아의 또 다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 접합된다. 대안으로, 상기 돌연변이 PLY 단백질은 인간을 비롯한 이종 유기체 유래의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 접합된다. 예를 들어, 상기 돌연변이 PLY 단백질은 (1) 병원성 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충으로부터 유래되거나, 또는 (2) 암 세포 또는 종양 세포로부터 유래되거나, 또는 (3) 알러지원에 대한 알러지 반응을 약화시키도록 IgE의 생산을 방해하기 위해 알러지원으로부터 유래되거나, 또는 (4) 척추동물 숙주에서의 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하기 위해 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 유래된 또 다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 접합된다.
돌연변이 PLY 단백질에 접합되는 APP의 부분은 β-아밀로이드 펩티드(Aβ 펩티드라고도 함)일 수 있으며, 이것은 β 및 γ 분비 효소에 의한 APP의 프로세싱에 의해 생성되는 (APP)의 내부 39～43 아미노산 단편이다. 이러한 펩티드의 예로는 Aβ1-42 펩티드가 있으며, 이것은 하기의 아미노산 서열을 갖는다: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala.
Aβ 성분은 또한 돌연변이 PLY 단백질에 접합된 단편의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 단편의 예로는 Aβ1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11, 1-10 및 1-12를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. PLY 이외의 단백질에 접합된 Aβ 및 이의 단편의 용도는 국제 특허 출원 공개 공보 WO 99/27944 및 WO 00/72880에 기재되어 있으며, 상기 공보는 본원에서 참고 문헌으로 인용한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 돌연변이를 갖는 분리된 PLY 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 피험 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 이 때 상기 돌연변이 PLY 단백질은 비접합되거나 또는 본원에 기재된 바와 같이 접합된 형태이다. 일반적으로 상기 방법은 야생형 뉴몰리신과 면역학적으로 교차 반응성인 콜레스테롤 결합성 세포 용해소를 갖는 1종 이상의 박테리아 종 또는 균주, 특히 스트렙토코커스, 특히 스트렙토코커스 뉴모니아에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위한 것이다. 그 밖의 종 및 이들의 세포 용해소로는 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)(퍼프링고리신 0), 스트렙토코커스 인터미디어스(Streptococcus intermedius)(인터미디리신), 바실러스 알베이(Bacillus alvei)(알베오리신), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)(안트로리신), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)(세레오리신), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii)(이바노리신 0), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi)(노빌리신), 아카노박테리움 파이오진스(Arcanobacterium pyogenes)(파이오리신), 리스테리아 젤리게리(Listeria seeligeri)(젤리게리오리신 0), 클로스트리듐 셉티컴(Clostridium septicum)(셉티코리신), 스트렙토코커스 파이오진스(S. pyogenes)(스트렙토리신 0), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(수일리신), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)(테타노리신), 리스테리아 모노사이토진스(Listeria monocytogenes)(리스테리오리신 0), 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis)(스트렙토리신 0), 스트렙토코커스 카니스(S. canis)(스트렙토리신 0), 바실러스 터링기엔시스(Bacillus thuringiensis)(터링기오리신 0), 바실러스 라테르스포러스(B. laterosporus)(라테르스포로리신 0), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)(보툴리노리신), 클로스트리듐 챠우보에이(C. chauvoei)(챠우베오리신), 클로스트리듐 비퍼멘탄스(C. bifermentans)(비퍼멘토리신), 클로스트리듐 소르델리(C. sordellii)(소르델리리신)(참조 문헌: Palmer 2001)를 들 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물의 투여 방법은, 돌연변이 PLY 단백질 단독이건 면역원성 접합체의 일부로서건 간에, 피험체에 면역보호량의 단백질을 전달하는 임의의 적합한 경로에 의할 수 있다. 그러한 경로의 한 예로서 비경구 경로, 예를 들어 근육내 또는 피하 투여에 의한 경로가 있다. 필요에 따라 점막 경로, 예를 들어 경구, 직장, 협측 또는 비내 투여와 같은 경로, 또는 다른 비경구 경로, 즉 피내 또는 정맥내 경로와 같은 다른 투여 방식 역시 이용될 수 있다.
일반적으로, 면역원성 조성물은 통상 인간에게 투여하기에 적합한, 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제, 예를 들어 멸균수 또는 멸균 등장 염수와, 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제를 포함하는 약학 제제로서 제공된다. 적절한 담체는 당업자가 숙지하고 있으며, 상당 부분 투여 경로에 좌우된다. 본 발명의 면역원성 조성물은 멸균수 또는 멸균 등장 염수와 같은 생리학적으로 허용되는 희석제 역시 함유할 수 있다. 상기 제제는 통상의 방법으로 제조될 수 있다.
그러나, 임의의 특정 포유동물 수용체에 대한 특정 용량 수준은 나이, 전신 건강 및 성별; 투여 시간; 투여 경로; 함께 투여되는 임의의 다른 약물과의 시너지 효과 및 원하는 보호 정도에 따라 달라지게 된다는 것을 이해할 것이다. 물론, 투여는 필요에 따라 적절한 간격을 두고 반복할 수 있다.
포유동물은 인간일 수 있거나 또는 인간이 아닌 포유동물일 수 있다. 면역원성 조성물은 임의의 편리한 방식으로, 예를 들어 전술한 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 보조제를 함유할 수 있다. 면역원 또는 항원과 함께 투여될 때 면역 반응을 증강시키는 물질은 면역 보조제라 한다. 다수의 사이토카인 또는 림포카인이 면역 조절 활성을 보유하는 것으로 확인되었으며, 따라서 인터루킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(예를 들어, 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제5,723,127호 참조), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이 형태), 인터페론-α, β 및 γ, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF; 예를 들어, 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제5,078,996호 및 ATCC 수탁 번호 39900 참조), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 및 종양 괴사 인자 α 및 β(이에 한정되지 않음)를 포함한 사이토카인 및 림포카인이 면역 보조제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 또 다른 면역 보조제로는 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES(이에 한정되지 않음)를 비롯한 케모카인을 포함한다. 유착 분자, 예컨대 셀렉틴, 예를 들어 L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴 역시 면역 보조제로서 유용하다. 그 밖의 다른 유용한 면역 보조제로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 뮤신 유사 분자, 예를 들어, CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1, 인테그린 패밀리의 일원, 예컨대 LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95, 면역글로불린 수퍼패밀리의 일원, 예컨대 PECAM, ICAM, 예를 들어, ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3, CD2 및 LFA-3, 보조 자극 분자, 예컨대 CD40 및 CD40L, 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 표피세포 성장 인자, B7.2, PDGF, BL-1, 및 혈관 내피세포 성장 인자를 비롯한 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, 및 DR6를 비롯한 수용체 분자를 포함한다. 또 다른 보조제 분자는 카스파제(ICE)를 포함한다. 본원에서 참고로 인용하는 국제 특허 출원 공개 공보 W0 98/17799 및 W0 99/43839 역시 참조할 수 있다.
면역 반응을 증강시키는 데 사용되는 적절한 면역 보조제는 본원에서 참고 문헌으로 인용하는 미국 특허 제4,912,094호에 기재된, MPLTM(3-0-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; 코릭사, 몬타나주 해밀턴)을 더 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP), 또는 이의 유도체 또는 유사체 역시 면역 보조제로서 적합하며, 이들은 코릭사(몬타나주 해밀턴)에서 시판되는 것들로서 본원에서 참고 문헌으로 인용하는 미국 특허 제6,113,918호에 기재되어 있다. 상기 AGP 중 한 가지는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-0-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-β-D-글루코피라노사이드[529라고도 함(이전 명칭은 RC529)]이다. 상기 529 면역 보조제는 수성 형태로서 또는 안정한 에멀션으로서 제제화된다.
그 밖의 다른 면역 보조제로는 광유와 물의 에멀션, 암모늄 염(명반), 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄 등, 암피젠(Amphigen), 아브리딘(Avridine), L121/스쿠알렌, D-락티드-폴리락티드/글리코사이드, 플루로닉 폴리올, 뮤라밀 디펩티드, 사멸 보르데텔라(Bordetella), 사포닌, 예컨대 스티뮬론(Stimulon)TM QS-21(안티제닉스, 매사추세츠주 프라밍엄)(본원에서 참고 문헌으로 인용하는 미국 특허 제5,057,540호에 기재되어 있음) 및 그로부터 생성된 입자, 예컨대 ISCOMS(면역자극 복합체), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 박테리아 리포폴리사카라이드, 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오티드(본원에서 참고 문헌으로 인용하는 미국 특허 제6,207,646호에 기재되어 있음), 백일해 독소(PT), 또는 이. 콜라이 열 불안정 독소(LT), 특히 LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129를 포함하며, 예를 들어, 본원에서 참고 문헌으로 인용하는 국제 특허 공개 공보 WO 93/13302 및 WO 92/19265를 참조할 수 있다.
콜레라 독소 및 그 돌연변이체, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 공보 WO 00/18434에 기재된 것(여기에서, 29번 위치의 아미노산 글루탐산은 다른 아미노산(아스파르트산 제외), 바람직하게는 히스티틴으로 치환됨)을 비롯한 것들 역시 면역 보조제로서 유용하다. 유사한 CT 독소 또는 돌연변이체가 국제 특허 출원 공개 공보 WO 02/098368에 기재되어 있다(여기에서는, 16번 위치의 아미노산 이소루신이 단독으로 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 이와 함께 68번 위치의 아미노산 세린이 다른 아미노산으로 치환됨; 및/또는 이 경우, 72번 위치의 아미노산 발린이 다른 아미노산으로 치환됨). 다른 CT 독소는 국제 특허 출원 공개 공보 WO 02/098369에 기재되어 있다(여기에서는, 25번 아미노산 위치의 아르기닌이 다른 아미노산으로 치환되고/되거나; 49번 아미노산 위치에 1개의 아미노산이 삽입되고/되거나; 35번과 36번 아미노산 위치에 2개의 아미노산이 삽입됨).
돌연변이 PLY 단백질의 용혈 활성은 임의의 적절한 방법으로 측정할 수 있다. 본 발명에 이용되는 한 가지 특정 프로토콜은 다음과 같다. 1.5 ml 1 x PBS (Oxoid)에서 연속 희석액으로 독소를 준비한다. 동량의 2%(부피/부피) SRBC(sheep red blood cell; 양 적혈구)를 각 희석액에 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 항온처리한다. 그 후 이 용액을 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 SRBC 막 또는 전체 세포를 펠릿으로 만든다. 상청액의 헤모글로빈 함량을 OD 540 nm에서 판독하여 독소 농도에 대한 그래프를 작도하여, 독소 농도와 관련된 용혈도를 구한다. OD 540 nm 0.5 = 50% 용해.
돌연변이 단백질은 1 ㎍/ml 초과의 농도에서 비용혈성인 것이 바람직하며; 5 ㎍/ml 초과의 농도에서 비용혈성인 것이 더 바람직하고; 10 ㎍/ml 초과의 농도, 25 ㎍/ml 초과의 농도, 또는 35 ㎍/ml 초과의 농도에서 비용혈성인 것이 더욱 더 바람직하고; 50 ㎍/ml 초과의 농도에서 비용혈성인 것이 가장 바람직하다. 용혈도의 측정은 전술한 바와 같이 수행할 수 있다.
세공 형성 활성의 측정은 임의의 적절한 방법으로 측정할 수 있다. 바람직한 프로토콜은 전자 현미경으로 SRBC 막을 시각적으로 조사하는 것에 기초한다. 이 방법에 의하면, 세공의 수를 가시화할 수 있다. 이 프로토콜에 대해서는 아래에서 보다 상세히 설명한다.
세공 형성 독소의 올리고머화 활성을 분석하기 위해 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 용액 중의 독소의 올리고머화를 분석하기 위해, 예를 들어 Morgan 등의 문헌(1993)에 기재된 분석형 한외여과법을 이용할 수 있다. 독소에 결합된 적혈구에 수크로스 밀도 구배를 적용할 수 있는데, 이 경우 올리고머가 고분자량 분획에서 다른 적혈구막 단백질로부터 분리된 상태로 관찰된다(Bhakdi et al., 1985; Saunders et al., 1989).
용액 중의 돌연변이 PLY의 올리고머화 활성과 야생형 PLY의 올리고머화 활성을 비교하는 한 가지 특정 방법은 Search의 문헌(2002)에 기재된 것과 유사한 방법으로 수행되는 형광 분석을 이용하는 방법이다. 간단히 설명하면, ANS(8-아닐리노-1-나프탈렌-설폰산)(코닥 리미티드)는 PLY에 외인 형광체로서 결합한다. 수용액 중에서 ANS는 490 nm에서 약한 형광을 나타내지만(JASCO FP-750 분광광도계로 판독), 소수성 환경에서 ANS 형광은 증가한다. 이러한 현상은 ANS에 결합된 PLY 단량체가 이동하여 용액 중에 트래킹(track)되게 한다. 뉴몰리신의 올리고머화를 유도하기 위해 나트륨 데옥시콜레이트(BDH 래보러토리 제품)를 사용할 수 있다. 형광의 증가는, 야생형 PLY와 ANS를 나트륨 데옥시콜레이트로 처리할 경우 독소 자체 회합물이 ANS를 소수성에서 친수성 환경으로 이동시킴에 따라 관찰된다. 유도체화된 PLY, 즉 단량체로 남아 있도록 디티오(비스)니트로벤조에이트에 의해 화학적으로 변성된 PLY는 나트륨 데옥시콜레이트로 처리하였을 때 490 nm에서 형광의 증가를 유도하지 않는다. 이 실험으로부터, 돌연변이 PLY는, 이것이 단량체 상태로 남아 있는다면, 유도체화된 PLY와 동일한 결과를 제공할 것임이 예측된다. 돌연변이 PLY가 야생형 PLY와 동일한 정도로 형광을 내는 것으로 확인된다면, 돌연변이 PLY가 올리고머화한다고 결론내릴 수 있다.
본 발명의 단백질 및 조성물의 독성은, 인간 이외의 테스트 포유동물(예, 설치류)에 돌연변이체를 투여함으로써 직접적으로 측정할 수 있다. 돌연이체의 독성은 야생형 단백질의 독성과 비교할 수 있다. 독성을 확인할 수 있는 적절한 지표로는 생존, 동물의 거동 및 염증(예를 들어, 기관지 폐포 세척액 중의 염증성 사이토카인 생산을 측정하여 결정할 수 있음)을 들 수 있다. 적합한 프로토콜은 하기 실시예 부분에 기재한다.
본 발명은 또한 전술한 돌연변이를 가지며 야생형 PLY 단백질과 비교하여 감소된 용혈 활성을 보유하는 분리된 돌연변이 PLY 단백질로서 포유동물에서 항원성을 보이는 단백질을 제공하는 단계; 및 상기 돌연변이 단백질을 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 접합시키는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 분리 및 정제된 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열이 제공되는데, 이때 상기 돌연변이 PLY는 야생형 서열의 아미노산 144～161번 위치의 영역 내에 돌연변이가 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과는 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성은 야생형 단백질의 독성에 비해 감소되며, 상기 돌연변이 단백질은 포유동물에서 면역원성을 보인다. 본 발명의 또 다른 양태는 상기 서열에 상보적인 핵산 서열을 제공한다.
핵산 서열은 유전자 코드의 축퇴성에 기초하여 단백질 서열로부터 추론할 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 추가적인 조절 서열, 예를 들어 프로모터 또는 리프레서를 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열은 발현 벡터, 예를 들어 플라스미드, 인공 염색체, 발현 카세트 등에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 전술한 돌연변이 PLY 단백질을 발현하는 분리 및 정제된 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염된 재조합 숙주 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 상기 세포는 원핵 세포이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 돌연변이 PLY 단백질을 제공하는 단계; 상기 돌연변이 단백질을 용혈 활성에 대해 테스트하는 단계; 상기 돌연변이 단백질을 올리고머화 활성에 대해 테스트하는 단계; 및 상기 돌연변이 단백질의 용혈 및 올리고머화 활성을 비돌연변이 단백질의 용혈 및 올리고머화 활성과 비교하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물에서의 사용 적합성에 대해 후보 돌연변이 PLY 단백질을 스크리닝하는 방법이 제공된다.
비돌연변이 형태의 단백질과 비교하여 감소된 용혈 및 올리고머화 활성을 보유하는 상기 돌연변이 단백질은 면역원성 조성물의 제조를 위한 좋은 후보가 될 가능성이 크다.
상기 방법은 또한 대상 포유동물에서 면역원성 활성에 대해 상기 돌연변이 단백질을 테스트하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 단계는 돌연변이 단백질을 비돌연변이 단백질에 대한 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 생체내에서 또는 시험관내에서 수행할 수 있다.
본원에 기재된 발명은 감소된 독성, 용혈 활성 및 세공 형성을 나타내는 뉴몰리신의 결실 돌연변이체에 관한 것이다. 이 데이터는 7 ㎍/용량의 Δ6 PLY가 2 ㎍/용량의 야생형 PLY에 비해 마우스에 유해하지 않음을 입증한다.
그러나, N143 잔기를 둘러싸며 본원에 기재된 본 발명자들이 생성한 다양한 돌연변이는 mAB PLY 4를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 여전히 인식되었으며, 이는 PLY 상의 상기 고항원성 부위가 변경되지 않았음을 암시한다. 돌연변이 부위는 에피토프 스캐닝에 의해 고항원성인 것으로 확인되었으며 인간 혈청과 토끼 과면역 혈청 둘 다에 의해 인식되는 것으로 확인되었다(Salo et al., 1993).
생성된 모든 돌연변이체는 뉴몰리신의 형태인 것으로 확인되었다. mAb PLY4가 돌연변이체를 인식한다는 사실은 에피토프가 상기 항체에 더 이상 특이적이지 않은 정도까지로는 변경되지 않았음을 나타낸다. 이 영역 내의 더 큰 결실은 mAb PLY4에 의해 인식되지 않는 돌연변이체를 생성하여야 한다. 이 영역이 고면역원성인 것으로 확인되었기 때문에(Salo et al., 1993), 그 부위는 면역원성 조성물에 사용한다는 측면에서 본 발명자들이 야기시킨 결실에서 온전한 상태로 남아 있는 것이 유용하다.
본원에 기재된 비독성 돌연변이체는 올리고머화에 관여하는 것으로 제안된 부위 내에 존재한다(de los Toyos et al., 1996). 정제된 변성 독소 Δ6 PLY의 시험관내 추가 규명에 의하면, 이것은 쥐의 섬유아세포 또는 적혈구에 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다. 이는, 올리고머화(세공 형성)가 예방되지 않았기 때문에 숙주 세포막이 Δ6 PLY에 의해 용해되지 않았음을 제시한다. 야생형 PLY로 처리한 SRBC 막의 세공은 쉽게 가시화할 수 있지만, Δ6 PLY로 처리한 막 상에는 세공이 관찰되지 않았다. EM에 의한 가시화를 위해 그리드에 Δ6 PLY 처리 막을 고정시키는 데에는 어려움이 있었다. 이것은 Δ6 PLY를 사용한 용혈성 분석에서 관찰되는 막의 응집화에 기인한 것일 수 있다. SRBC를 사용한 Δ6 PLY의 용혈성 분석에서 관찰되는 혈구응집 효과는 Δ6 PLY 단량체가 숙주 세포막에 여전히 결합한다는 것을 시사한다. 숙주 세포막에 대한 결합을 가시화하는 Δ6 PLY의 표지된 형태를 생성하였다. 결합 분석(데이터는 제시하지 않음)으로부터, Δ6 PLY가 숙주 세포막에 결합하였음이 확인되었다.
Δ6 PLY 단량체 간의 약한 친화력으로 인하여 단량체들의 가교는 가능하지만, 진정한 올리고머의 형성은 불가능할 수 있다. Δ6 PLY 단량체의 이와 같은 가교는 적혈구에 대한 단량체 결합 이외에도 96웰 플레이트에서 관찰되는 기질을 생성할 수 있다. Δ6 PLY 돌연변이체의 생성에 의해, 올리고머화 단계는 차단되었으나, 숙주 세포 결합/인식은 파괴되지 않았음이 제시된다.
이러한 가정은 Δ146 PLY가 돌연변이체의 eGFP 태깅 형태와 야생형 단백질을 사용하여 측정하였을 때 세포막과 여전히 회합할 수 있지만, Δ146 PLY는 세포막에 세공을 형성하지 않는다는 발견에 의해 지지된다. 대신, 장쇄 단백질이 세포 표면에서 관찰되며, 이것은 정확히 세공을 형성할 수 있도록 올리고머화할 수 없는 자체 회합형 단백질일 수 있다.
Δ6 PLY로의 생체내 처리는 처리 24 시간 후 염증성 사이토카인 IL-6의 증가로 이어지지 않았다. 야생형 PLY로 처리된 마우스는 염수 대조군 및 Δ6 PLY 처리군보다 IL-6를 10배 더 많이 생산하는 것으로 확인되었다. 이 데이터는 Δ6 PLY에 의한 처리가 천연 PLY와 연관된 염증성 부작용을 유도하지 않았음을 입증하였다. 야생형 PLY 처리는 투여 부위에 편재화된 염증 반응을 유발하였다. 기관지 폐포 세척액 중의 이와 같이 편재화된 IL-6 생산은 폐 조직의 표피 세포보다 더 많은 IL-6를 생산하는 동원된 호중구(Kadioglu, 2000)와 폐포 대식세포로부터 유래된 것일 수 있다(Kerr, personal communication 2003).
야생형 PLY는 폐의 온전성을 심각하게 손상시켰지만, Δ6 PLY로 처리된 폐는 건강한 상태로 유지되었다. 야생형 PLY로 처리한 마우스의 기도에서 관찰된 다량의 총 단백질은 숙주 단백질의 유입이 특징적으로 나타났다(Rubins & Janoff, 1998). PLY는 밀착 연접의 파괴에 관여하여(Rayner et al., 1995), 모세관/기도 장벽의 파괴를 통해 숙주 단백질을 기도로 "누출"시키는 것으로 이미 알려져 있다. Δ6 PLY에 의한 저 염증 반응 및 폐의 무손상은 Δ6 PLY가 숙주 세포막에 세공 형성 올리고머를 생성할 수 없는 것과 상관성이 있다.
또한, 야생형 PLY를 사용한 마우스의 처리는 Δ146 PLY로 처리된 동물에서 관찰되지 않는 지속적인 저체온 반응을 유발하는 것으로 입증되었다.
아래에서는 본 발명의 이와 같은 양태들을 하기의 비제한적인 실시예를 통해 첨부 도면을 참조하여 설명할 것이다.
실시예 1
뉴몰리신의 위치 지정 돌연변이 유발
Quikchange(등록상표) 위치 지정 돌연변이 유발 키트(스트라타진)를 사용하여 야생형 뉴몰리신으로부터 8개의 이중 아미노산 결실을 생성하였다. 주형 플라스미드는 PLY를 미리 삽입시킨 고발현 벡터 pKK233-3(클론텍 래보러토리즈)였다. 해당 아미노산을 결실시키기 위해 설계된 프라이머(하기 표 1 참조)는 시그마-제노시 스로부터 주문 제작하였다. 하기 결실은 PLY의 N143 영역에 걸쳐 위치하도록 생성하였다:
W134H135Q136D137Y138G139Q140V141N142N143V144P145A146R147M148Q149Y150E151; 여기서
(Δ1) W134H135, (Δ2) Q136D137, (Δ3) Y138G139, (Δ4) Q140V141, (Δ5) V144P145, (Δ6) A146R147, (Δ7) M148Q149, (Δ8) Y150E151, (표 2 참조).
N142N143은 이전에 생성된 결실이었으며[Search (2000)], 여기서 프로테이나제 K는 PLY를 2개의 단편으로 절단한다.
[표 1]: PLY 유전자 내의 이중 아미노산 결실을 생성하는 데 사용된 프라이머
Figure 112006090661811-pct00002
주 - 역방향 프라미어는 정방향 프라이머의 정확한 상보체 및 역방향 서열이며, 결실시키고자 하는 염기는 프라이머로부터 제거함.
[표 2]: PLY 유전자 내의 각 돌연변이에 대해 결실된 염기 및 결실된 아미노산
Figure 112006090661811-pct00003
실시예 2
단백질 발현 및 정제
야생형(WT) 및 돌연변이 PLY를 공지된 방법과 같이 에쉐리키아 콜라이에서 발현시켜서 회수하였다(Mitchell et al., 1989). 벤치탑 세포 파쇄기(콘스탄트 시스템스 리미티드)를 사용하여 세포를 파쇄하고 13,000 rpm으로 30 분 동안 원심분리하여 세포질 단백질을 얻었다. 페닐 에테르 매트릭스(PE20, 어플라이드 바이오시스템스)를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 BioCAD (RTM) 700E 관류 크로마토그래피 워크스테이션(어플라이드 바이오시스템스)을 사용하여 PLY를 정제하였다. 용출된 분획은 SDS-PAGE에서 전개하였고 표준 프로토콜을 이용하여 코마시 블루로 염색하고 순수한 PLY를 함유하는 분획을 모았다.
실시예 3
정량적 용혈성 분석
1 x 인산염 완충 염수(PBS)(옥소이드) 중의 2%(부피/부피)의 양 적혈구(SRBC)(E & O 래보러토리즈) 용액을 사용하고 Walker 등의 문헌(1987)에 보고된 방법에 기초한 분석법을 이용하여 정제된 단백질의 용혈 활성을 평가하였다. 수집한 분획들은 minicon B15 임상 샘플 농축기(밀리포어)를 이용하여 농축시켰다. 독소는 1.5 ml 1 x PBS(옥소이드) 중의 연속 희석액으로 제조하였다. 동량의 2%(부피/부피) SRBC를 각 희석액에 첨가하여 37℃에서 30 분 동안 항온처리하였다. 그 후, 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여, SRBC 막 또는 전체 세포를 펠릿으로 만들었다. OD 540 nm에서 상청액의 헤모글로빈 함량을 판독하고 독소 농도에 대하여 그래프를 작도하여 독소 농도와 관련된 용혈도를 구하였다. OD 540 nm 0.5 = 50% 용해.
미정제 용혈성 분석은 상기 돌연변이체 중 4개, 즉 결실 5～8이 비용혈성임을 나타내었다. 정량적 용혈성 분석에서의 정제된 Δ6 PLY(A146R147)의 추가 분석(도 3)에 의하면, 이것이 50 ㎍/ml의 농도에서 비용혈성인 반면, 1 ㎍/ml의 야생형 PLY는 SRBC에 대해 용혈성인 것으로 나타났다. Δ5 PLY 및 Δ6 PLY의 정제 제제는 96웰 미량 적정 플레이트에서 적혈구를 응집시키지만 세포를 용해시키지는 않는 것으로 관찰되었다. 이러한 효과는 농도 의존적이었다.
실시예 4
전자 현미경 관찰
2%(부피/부피) SRBC 용액 200 ㎕를 동량의 0.2 mg/ml의 야생형 PLY 또는 Δ6 PLY와 37℃에서 20 분 동안 항온처리한 후, 벤치탑 원심분리기로 원심분리하여 SRBC 막을 펠릿으로 만들었다. 막을 dH2O로 3회 세척하고 100 ㎕의 dH2O에 재현탁시켰다. 현탁액 5 ㎕를 탄소 코팅 그리드에 고정시키고 1% 포스포텅스테이트 산(pH 6.8)으로 음성 염색하였다. 확대 배율은 LEO 912 에너지 필터 투과 전자 현미경을 사용하여 25,000배로 하였다.
0.2 mg/ml의 야생형 PLY로 처리한 적혈구 막에 30～40 ㎛의 세공이 가시화되었다(도 5). 이와는 달리, 0.2 mg/ml의 Δ6 PLY로 처리한 막에는 세공이 보이지 않았다.
실시예 5
웨스턴 블로팅
위치 지정 돌연변이 유발법으로 생성한 PLY 돌연변이체는 표준 기법을 이용하여 웨스턴 블롯에서 검출하였다. 블롯은 토끼 유래의 폴리클로날 항-PLY 혈청 또는 마우스 유래의 모노클로날 PLY 항-PLY 혈청과 항온처리한 후(de los Toyos et al., 1996), 관련 HRP-결합형 항체(아머샴 라이프 사이언스)와 항온처리하고 발색시켰다.
생성된 8개의 이중 아미노산 결실이 모두 de los Toyos 등의 방법(1996)에 의해 제조된 폴리클로날 항-PLY 혈청(도시하지 않음) 및 mAb PLY 4(도 2)에 의해 인식되었다.
실시예 6
L929 사멸 분석
L929 쥐 섬유아세포(ECACC, no. 85011425)를 RPMI 1640 배지 + 10% 소 태아 혈청(FBS)(깁코)에서 배양한 후, 계대배양하여, 96-웰 플레이트로 옮겨서 37℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 0.05 mg/ml의 보존 농축액으로부터 RPMI 1640 중에서 정제된 WT PLY 및 돌연변이 Δ6 PLY 독소의 연속 희석액을 제조하여 L929 섬유아세포에 첨가하였다. PLY와 24 시간 동안 항온처리 후의 세포 생존능은, 미토콘드리아 작용에 의해 자주색 포르마잔 침전물로 분해되는 MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)(시그마)를 사용하여 평가하였다. 사멸 세포가 있는 웰 내의 MTT는 황색으로 남아 있다. MRX 플레이트 판독기(다이나테크 래보러토리즈)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 판독하였다.
L929 쥐 섬유아세포를 사용한 세포독성 분석은 야생형 PLY에 비교한 돌연변이 Δ6 PLY의 독성을 평가하여 수행하였다(도 4). 30 ㎍/ml의 농도에서 Δ6 PLY는 섬유아세포에 독성을 나타내지 않은 반면, < 500 pg/ml의 WT PLY는 세포 독성을 나타내었다.
실시예 7
생체내 사이토카인 분석
8 주령의 MF-1 마우스(할란)을 2% 할로세인/1.5% 산소(1.5 리터/분)(제네카)로 가볍게 마취하였다. LPS 무함유의 정제된 야생형 PLY는 2 ㎍/용량으로, Δ6 PLY 는 7 ㎍/용량(9.928 ng LPS/용량)으로 부피 50 ㎕로 비내 투여하였으며, 염수군을 대조군으로 하였다(각 처리군 n = 4). 정제된 독소의 리포폴리사카라이드(LPS) 함량은 혈구 추출 성분(Limulus Amebocyte Lysate; LAL) 키네틱-QCL 키트(바이오휘태커)를 사용하여 측정하고, 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 마우스는 24 시간의 종료점까지 모니터하였다. 혈청, 기관지 폐포 세척액 및 폐 조직 샘플을 회수하여 공지된 방법으로 처리하였다(Kerr, et al. 2002). 사이토카인 수준은 인터루킨(IL-6), 인터페론(IFN)-γ(파밍엔) 및 종양 괴사 인자(TNF)-α(R&D 시스템스, 영국)에 대한 시판되는 사이토카인 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 세척액 중의 총 단백질 수준은 표준 브래드포드 분석법을 이용하여 측정하였다.
맨-휘트니 U 검정에 의한 비모수 분석을 이용하여 사이토카인 및 총 단백질 수준을 측정하였으며, 여기서 p < 0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 값은 Statview(아바쿠스 컨셉)를 이용하여 값은 중간값 ± 1 중간값 절대 편차(MAD)로서 나타내었다.
생체내 독성 연구의 일부로서, 큰 증상이 확인되었다. 야생형 PLY 군 중 1 마리를 제외한 모든 마우스는 처리 24 시간 후 생존하였다. Δ6 PLY 및 염수로 처리한 마우스는 야생형 PLY를 처리한 마우스보다 마취에서 더 빨리 회복되었다. Δ6 PLY 처리 마우스의 거동은 염수 대조군 마우스의 거동과 유사하였으나, 야생형 PLY 처리 마우스는 입모(piloerection)를 나타났고 호흡이 곤란하였으며 6 시간 동안 구부린 자세를 취하였고 24 시간의 시간 내에 회복되었다.
그 후, 염증성 사이토카인 분석을 수행하였다. 숙주에 대한 PLY의 독성의 마 커로서 IL-6 생산을 측정하였다. 야생형 PLY 처리 마우스의 기관지 폐포 세척액 중의 IL-6 수준이 Δ6 PLY 처리(p < 0.05) 및 염수 처리(p < 0.05)에 비해 10배보다 많이 증가하였다(도 7). 야생형 PLY로의 처리는 숙주 기도에 염증을 유도한 반면, Δ6 PLY 처리는 그렇지 않았다. 야생형 처리 기관지 폐포 세척액 중의 IL-6 중간 수준은 416 pg/ml(335～2225 pg/ml의 범위)인 반면, 바탕값 IL-6 수준은 낮았고(59 pg/ml), Δ6 PLY(36 pg/ml) 처리 마우스에서는 증가하지 않았다(하기 표 3 참조). 염수 대조군에 비해 야생형 처리 마우스의 폐 조직에서 IL-6 수준의 증가(p < 0.05)가 관찰되었다(도 6). 염수 처리에 비해 Δ6 처리 마우스의 폐 조직에서는 유의적인 IL-6 증가가 관찰되지 않았다. IFN-γ 및 TNF-α의 측정값은 처리시와 투여 24 시간 후 간에 유의적인 차이가 없었다(데이터 제시하지 않음).
[표 3]: 처리 24 시간 후의 기관지 폐포 세척액 중의 IL-6 중간(min-max) 수준
처리
(i.n.)
 폐 조직
(pg/ml)
 폐 세척액
(pg/ml)
 P 값(* = 유의적)
폐 세척액
NaCl 117(103-139) 59(19-113) NaCl/Δ6 0.3865 0.7728
Δ6 147(73-209) 36(30-132) Δ6/WT 0.1573 0.0339*
야생형(WT) 171(168-448) 416(335-2225) NaCl/WT 0.0339* 0.0339*
폐의 온전성을 평가하기 위해 기관지 폐포 세척액 중의 총 단백질 수준(도 8)을 측정하였다. 건강한 마우스의 세척액 샘플에 비해 Δ6 PLY 처리 마우스의 경우 단백질 수준의 증가가 관찰되지 않았다. 염수 대조군의 경우 바탕값 총 단백질 수준이 0.23 mg/ml인데 반해, 야생형 PLY 처리 마우스의 기도는 다량의 단백 질(3.57 mg/ml)을 함유하였다(도 8).
실시예 8
마우스 면역원성 연구
Δ5, 6 및 7 돌연변이 단백질에 대한 야생형 PLY 단백질의 반응을 비교하기 위해 마우스 면역원성 연구를 수행하였다. 모든 면역원성 조성물은 면역 보조제 AlP04(0.2 mg) 및 MPL-SE(50 ㎍)의 조합물 존재 하에 5 ㎍ rPLY/용량으로 제조하였다. 인산염 완충 염수(PBS) 중의 AlP04(0.2 mg) 및 MPL-SE(50 ㎍)를 음성 대조군으로 사용하였다.
6～8 주령의 암컷 CD-1 마우스 5 마리의 그룹을 복강 주사로 면역화하고 2주 간격으로 2차례의 추가 접종을 실시하였다. 혈액은 0주, 2주, 4주 및 6주에 안와후방에서 수집하였다. 각각의 혈청을 분석하였으며 GMT는 종료시 0.3을 나타내었다. 0주 항체는 모두 < 50이었다. 표 4에 기재된 바와 같이, 3종의 PLY 돌연변이체가 마우스에서 야생형 PLY에 의해 생성되는 것과 유사한 항체를 생성하였다.
[표 4]: 마우스에서의 돌연변이 재조합 뉴몰리신(rPLY)에 대한 혈청 IgG 항체 반응
면역원
 rPL 용량(㎍)
 rPL에 대한 GMT 항체
주
2 4 6
PBS - 50 50 50
rPL(nlrPL 01-01) 5.0 16,456 806,776 3,104,055
rPL 야생형(PLY C73) 5.0 11,420 578,645 997,727
rPL Δ5 5.0 3,892 424,253 1,375,535
rPL Δ6 5.0 18,679 999,574 1,452,972
rPL Δ7 5.0 15,920 2,266,935 1,246,988
실시예 9
항-PLY 항체의 생성
야생형 PLY 또는 Δ6 PLY로 면역화한 마우스에서 생성된 항-PLY 항체의 수준은, 20 ㎍의 야생형 PLY 또는 Δ6 PLY를 각각 100 ㎍ 명반/100 ㎕ 용량으로 1차 피하 주사로 MF-1 마우스를 면역화함으로써 측정하였다. 그 후, 동일 용량으로 마우스를 2회 추가 면역화하였다. 면역화 프로토콜 47일째 혈청을 수집하여 항-PLY IgG 항체에 대해 분석하였다. 항체 희석 곡선은 혈청 희석액에 대한 그룹 평균 OD490 nm ± SEM으로서 도 9에 나타내었다. 더 농축된 샘플은 기질을 완전 포화시키기 때문에 1/1000의 최초 혈청 희석액을 사용하였다. 도 9는 Δ6 PLY + 명반과 야생형 PLY + 명반에 대한 반응으로 두 경우 다 고농도의 항체가 생성되었으나, 명반만을 사용한 대조군에서는 그렇지 않았음을 입증한다.
그 후, 용혈 활성을 중화시키는 항-PLY 항체의 능력을 평가하였다. Δ6 PLY 및 야생형 PLY 처리군에서의 항-PLY 항체는 용혈성 분석에서 2.5 용혈 단위(Haemolytic Unit; HU)의 PLY를 1000～2400의 역가까지 완전히 중화시키는 것으로 관찰되었다(이때, 중화 능력은 2.5 HU의 PLY를 완전히 중화시키는 항체 희석 배율의 역수로서 나타냄)(데이터는 제시하지 않음). 이는, PLY 상의 중화 부위가 Δ6 PLY + 명반과 야생형 PLY + 명반에 의한 면역화에 반응하여 생성된 항체에 의해 인식되어 결합되었음을 입증한다. Δ6 PLY는 비독성이고 야생형 PLY 처리에 의해 관찰되는 사이토카인의 생체내 수준의 생산을 유도하지 않기 때문에, Δ6 PLY는 면역 원성 캐리어 단백질로서 사용하기에는 야생형 PLY보다 더 바람직한 단백질이다.
실시예 10
단일 아미노산 결실의 효과
단일 아미노산 결실이 있는 돌연변이 PLY를 생성하였다. 146번 아미노산 알라닌이 결실되었다(ΔA146 PLY). 도 10에 도시된 바와 같이, 이러한 단일 결실(ΔA146 PLY) 역시 PLY의 비용혈 형태를 생성하였다. ΔA146 PLY는 > 1000 ㎍/ml 농도까지는 SRBC에 대해 비용혈성인 반면, 야생형 PLY는 < 1 ㎍/ml 농도에서 용혈성이었다. 상기 돌연변이체의 생성은 폴리클로날 항-PLY 혈청을 사용한 발현 단백질의 웨스턴 블롯 및 서열 분석으로 확인하였다(데이터는 제시하지 않음).
실시예 11
PLY W433F와 비교한 PLY 돌연변이체의 용혈 활성
인간 적혈구에 대한 결실 돌연변이체 Δ6, Δ7, Δ8 PLY 및 ΔA146 PLY의 용혈 활성을, 야생형 PLY의 용혈 활성의 단 1%만을 보유하는 것으로 이미 알려진 치환 W433F를 보유하는 PLY 돌연변이체 및 야생형 PLY의 용혈 활성과 비교하였다(WO 90/06951 참조).
도 11은, 예상했던 바와 같이, W433F 돌연변이체가 야생형 PLY의 용혈 활성의 ～1%를 나타낸다는 것을 보여준다. 그러나, 결실 돌연변이체는 인간 적혈구를 전혀 용해시키지 않는다.
실시예 12
적혈구 막에 대한 GFP 태그 PLY의 결합
야생형 PLY 및 Δ6 PLY의 eGFP 태그 형태로 처리된 적혈구를 가시화하기 위해 형광 현미경법을 이용하였다.
인체 혈액을 증류수로 반복 세척하여 적혈구 고스트를 준비하였다. 0.1 ml의 인체 혈액으로부터 얻은 적혈구 고스트를 1 x PBS 1 ml 중의 50 ㎍의 EGFP-PLY 또는 50 ㎍의 Δ6EGFP-PLY와 37℃에서 30 분 동안 항온처리하였다. 고스트 막을 펠릿화하고 PBS에서 3회 세척하여 제이스 액시오스콥(Zeiss Axioscop) 20을 사용하여 형광 현미경으로 가시화하였다.
그 결과(제시하지 않음)는 막에 대한 Δ6 PLY의 결합이 야생형 PLY의 결합과 실질적으로 동일함을 입증한다.
실시예 13
투과 전자 현미경을 사용한 세공 형성의 분석
0.2 mg/ml 야생형 뉴몰리신, 0.2 mg/ml W433F PLY 및 0.2 mg/ml ΔA146 PLY로 처리한 음성 염색한 말 적혈구막에 대해 전술한 바와 같이(실시예 4) 전자 현미경 관찰을 수행하였다(실시예 4).
야생형 PLY 및 W433F로 처리한 막에서는 세공이 관찰되었으나, ΔA146 PLY로 처리한 막에서는 세공이 관찰되지 않았다. 그 대신, ΔA146 PLY 처리는 장쇄의 형성을 유도하였는데, 이것은 올리고머화하여 세공을 형성할 수 없는 자체 회합형 독소를 함유하는 것으로 생각된다(데이터 제시하지 않음).
따라서, Δ6 PLY는 야생형 PLY의 막 결합 특성을 유지하지만, 세포막에 세공을 형성하지는 않는다.
실시예 14
쥐 L929 섬유아세포에 대한 뉴몰리신 돌연변이체의 세포독성
쥐 L929 섬유아세포에 대한 야생형 PLY, PLY W433F 및 결실 돌연변이체 Δ6, Δ7, Δ8 PLY 및 ΔA146 PLY의 세포독성은 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정하였다. 인간 적혈구는 야생형 PLY의 세포독성과 비교하였다.
W433F PLY 돌연변이체는 10 ㎍/ml 이상에서 세포독성을 나타내는 반면, 결실 돌연변이체는 상기 분석에서 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 12).
실시예 15
RBL-2H3 비만 세포에 대한 뉴몰리신 돌연변이체 ΔA146 PLY의 세포독성
래트 RBL-2H3 비만 세포에 대한 ΔA146 PLY의 세포독성은 탈과립화 분석을 이용하여 평가하였다.
이 분석은 웰당 104개 세포를 사용하여 Stassen 등의 문헌(2003)에 기재된 바와 같이 수행하고 야생형 PLY 또는 ΔA146 PLY와 함께 90 분 동안 항온처리하였다.
비만 세포 과립으로부터의 β-헥소사미니다제의 방출을 측정하였으며, 이것은 독소에 반응한 세포의 탈과립화의 직접적 척도가 된다. ΔA146 PLY는 비만 세포 탈과립화를 유발하지 않았다(도 13).
실시예 16
야생형 PLY 또는 ΔA146 PLY로 처리한 후 쥐 코어 바디 온도의 분석
코어 바디 온도(Tc)를 알 수 있도록 Balb/c 마우스에 원격 측정 칩을 이식하였다. 마우스를 1 ㎍ 야생형 PLY, 1 ㎍ ΔA146 PLY 또는 염수 용액만으로 처리하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, 야생형 PLY에 의한 처리는 Tc를 28℃로 떨어뜨리면서 심각한 체온 저하 반응을 일으켰다. 상기 Tc는 6 시간 동안 지속된 후, ～0.6℃/시간으로 증가되었으며, 24 시간 경에는 대조군의 Tc와 유사하였으나, 여전히 통계적 유의성은 있었다. ΔA146 PLY에 의한 처리는 저체온증을 유발하지는 않았으나, Tc 중간값은 염수 대조군과 유사하였다.
따라서, 야생형 PLY에 의한 마우스의 처리는 동량의 ΔA146 PLY로 처리한 후에 관찰되지 않는 지속적인 저체온 반응을 유발하였다.
본 발명은 전술한 대표적인 구체예와 관련하여 기술하였으나, 여러 가지의 균등한 변형 및 변경이 가능함을 당업자라면 알 것이다. 따라서, 전술한 본 발명의 대표적인 구체예는 예시적인 것이며 비제한적인 것으로 간주되어야 한다. 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않도록, 개시된 구체예에 다양한 변화가 이루어질 수 있다. 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 참고 문헌으로서 본원에 포함된다.
Figure 112006090661811-pct00004
Figure 112006090661811-pct00005
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Figure 112006090661811-pct00007
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SEQUENCE LISTING <110> Kirkham, Lea-Ann Mitchell, Timothy J <120> Mutant Pneumolysin Proteins <130> GRF/BP6299911 <140> PCT/GB2005/001792 <141> 2005-05-09 <150> GB 0410220.8 <151> 2004-05-07 <150> US 60/569,415 <151> 2004-05-07 <160> 21 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 471 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met Asn Tyr Asp 1 5 10 15 Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe 20 25 30 Ile Lys Glu Gly Asn Gln Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg 35 40 45 Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala 50 55 60 Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Glu 65 70 75 80 Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro 85 90 95 Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe 100 105 110 Leu Gln Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn 115 120 125 Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gln Val Asn Asn Val 130 135 140 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sequence <220> <223> Primer <400> 12 ggcatcaaga ttatggtaat aatgtcccag ctag 34 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 13 ctagctggga cattattacc ataatcttga tgcc 34 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 14 ggtcaggtca ataatgctag aatgcagtat g 31 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 15 catactgcat tctagcatta ttgacctgac c 31 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 16 ggtcaataat gtcccaatgc agtatgaaaa aataacggct c 41 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 17 gagccgttat tttttcatac tgcattggga cattattgac c 41 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 18 ggtcaataat gtcccagcta gatatgaaaa aataacggct c 41 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 19 gagccgttat tttttcatat ctagctggga cattattgac c 41 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 20 gtcccagcta gaatgcagaa aataacggct cacagc 36 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 21 gctgtgagcc gttattttct gcattctagc tgggac 36

Claims (68)

  1. 야생형 뉴몰리신(PLY) 단백질의 서열 중 아미노산 144～151번 영역 내에 결실이 존재함으로 인하여 야생형 뉴몰리신(PLY) 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소된 것인 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 146번 알라닌이 결실된 것인 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산의 결실로 인하여 야생형 단백질과 다른 것인 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 144번 아미노산 발린 및 145번 아미노산 프롤린이 결실된 것인 단백질.
  5. 제3항에 있어서, 146번 아미노산 알라닌 및 147번 아미노산 아르기닌이 결실된 것인 단백질.
  6. 제3항에 있어서, 148번 아미노산 메티오닌 및 149번 아미노산 글루타민이 결실된 것인 단백질.
  7. 제3항에 있어서, 150번 아미노산 티로신 및 151번 아미노산 글루탐산이 결실된 것인 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에서 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 더 포함하는 단백질.
  9. (a) 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질; 및
    (b) 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 결실이 존재함으로 인하여 야생형 뉴몰리신(PLY) 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소된 것인 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질
    을 포함하는 면역원성 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 146번 알라닌이 결실된 것인 면역원성 접합체.
  11. 제9항에 있어서, 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산의 결실로 인하여 야생형 단백질과 다른 것인 면역원성 접합체.
  12. 제11항에 있어서, PLY 단백질의 144번 아미노산 발린 및 145번 아미노산 프롤린이 결실된 것인 면역원성 접합체.
  13. 제11항에 있어서, PLY 단백질의 146번 아미노산 알라닌 및 147번 아미노산 아르기닌이 결실된 것인 면역원성 접합체.
  14. 제11항에 있어서, PLY 단백질의 148번 아미노산 메티오닌 및 149번 아미노산 글루타민이 결실된 것인 면역원성 접합체.
  15. 제11항에 있어서, PLY 단백질의 150번 아미노산 티로신 및 151번 아미노산 글루탐산이 결실된 것인 면역원성 접합체.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 당류, 올리고당류 또는 다당류는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된 것인 면역원성 접합체.
  17. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에서 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 더 포함하는 것인 면역원성 접합체.
  18. 제16항에 있어서, 단백질이 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에서 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 더 포함하는 것인 면역원성 접합체.
  19. (a) 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 결실이 존재함으로 인하여 야생형 뉴몰리신(PLY) 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소된 것인 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 또는 (b) 상기 (a)에 기재된 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 분리 및 정제된 핵산 서열.
  20. 제19항에 있어서, 146번 알라닌이 결실된 것인 분리 및 정제된 핵산 서열.
  21. 제19항에 있어서, 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산의 결실로 인하여 야생형 단백질과 다른 것인 분리 및 정제된 핵산 서열.
  22. 제21항에 있어서, 144번 아미노산 발린 및 145번 아미노산 프롤린이 결실된 것인 분리 및 정제된 핵산 서열.
  23. 제21항에 있어서, 146번 아미노산 알라닌 및 147번 아미노산 아르기닌이 결실된 것인 분리 및 정제된 핵산 서열.
  24. 제21항에 있어서, 148번 아미노산 메티오닌 및 149번 아미노산 글루타민이 결실된 것인 분리 및 정제된 핵산 서열.
  25. 제21항에 있어서, 150번 아미노산 티로신 및 151번 아미노산 글루탐산이 결실된 것인 분리 및 정제된 핵산 서열.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에서 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 더 포함하는 것인 분리 및 정제된 핵산 서열.
  27. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 분리 및 정제된 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  28. 제26항의 핵산 서열을 포함하는 분리 및 정제된 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  29. 제27항의 재조합 발현 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염된 재조합 숙주 세포.
  30. 제28항의 재조합 발현 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염된 재조합 숙주 세포.
  31. 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질의 제조 방법으로서, 상기 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 결실이 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소되며, 상기 방법은 (a) 제27항의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시키고, 숙주 세포가 상기 돌연변이 PLY 단백질을 발현할 수 있는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 배양액으로부터 상기 돌연변이 PLY 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질의 제조 방법으로서, 상기 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 결실이 존재함으로 인하여 야생형 PLY 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소되며, 상기 방법은 (a) 제28항의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시키고, 숙주 세포가 상기 돌연변이 PLY 단백질을 발현할 수 있는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 배양액으로부터 상기 돌연변이 PLY 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  33. (a) 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 결실이 존재함으로 인하여 야생형 뉴몰리신(PLY) 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소된 것인 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질; 및 (b) 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 146번 알라닌이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산의 결실로 인하여 야생형 단백질과 다른 것인 면역원성 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 144번 아미노산 발린 및 145번 아미노산 프롤린이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  37. 제35항에 있어서, 146번 아미노산 알라닌 및 147번 아미노산 아르기닌이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  38. 제35항에 있어서, 148번 아미노산 메티오닌 및 149번 아미노산 글루타민이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  39. 제35항에 있어서, 150번 아미노산 티로신 및 151번 아미노산 글루탐산이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에서 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 더 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  41. (a) (i) 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질; 및
    (ii) 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내에 결실이 존재함으로 인하여 야생형 뉴몰리신(PLY) 단백질과 다르며, 이로 인해 돌연변이체의 독성이 야생형 단백질의 독성에 비해 감소된 것인 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질
    을 포함하는 면역원성 접합체; 및
    (b) 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 146번 알라닌이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  43. 제41항에 있어서, 돌연변이 PLY 단백질은 야생형 서열의 아미노산 144～151번 영역 내의 2개의 인접 아미노산의 결실로 인하여 야생형 단백질과 다른 것인 면 역원성 조성물.
  44. 제43항에 있어서, PLY 단백질의 144번 아미노산 발린 및 145번 아미노산 프롤린이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  45. 제43항에 있어서, PLY 단백질의 146번 아미노산 알라닌 및 147번 아미노산 아르기닌이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  46. 제43항에 있어서, PLY 단백질의 148번 아미노산 메티오닌 및 149번 아미노산 글루타민이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  47. 제43항에 있어서, PLY 단백질의 150번 아미노산 티로신 및 151번 아미노산 글루탐산이 결실된 것인 면역원성 조성물.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 당류, 올리고당류 또는 다당류는 스트렙토코커스 뉴모니아로부터 유래되는 것인 면역원성 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 다수의 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형이 존재하는 것인 면역원성 조성물.
  50. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에서 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 더 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  51. 제48항에 있어서, 단백질이 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에서 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 더 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  52. 제49항에 있어서, 단백질이 야생형 서열의 아미노산 257～297번, 367～397번 또는 424～437번 영역 중 적어도 하나에서 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실을 더 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  53. 피험 비인간 포유동물에게 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 비인간 포유동물의 야생형 뉴몰리신과 면역학적으로 교차 반응성인 콜레스테롤 결합 시토라이신을 보유하는 박테리아에 의한 박테리아 감염의 예방 방법으로서, 상기 면역원성 조성물은 (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질; 및 (b) 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체를 포함하는 것인 예방 방법.
  54. 피험 비인간 포유동물에게 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 비인간 포유동물의 야생형 뉴몰리신과 면역학적으로 교차 반응성인 콜레스테롤 결합 시토라이신을 보유하는 박테리아에 의한 박테리아 감염의 예방 방법으로서, 상기 면역원성 조성물은
    (a) (i) 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질; 및
    (ii) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 분리된 돌연변이 뉴몰리신(PLY) 단백질
    을 포함하는 면역원성 접합체; 및
    (b) 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체
    를 포함하는 것인 예방 방법.
  55. 제53항에 있어서, 박테리아 감염이 스트렙토코커스 감염인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 박테리아 감염이 스트렙토코커스 감염인 방법.
  57. (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 분리된 돌연변이 뉴몰리신 (PLY) 단백질과
    (b) 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체를 혼합하는 단계를 포함하는, 야생형 뉴몰리신과 면역학적으로 교차 반응성인 콜레스테롤 결합 시토라이신을 보유하는 박테리아에 의한 박테리아 감염의 예방 또는 치료용 약학 제제의 제조 방법.
  58. (a) 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항의 면역원성 복합체와
    (b) 생리학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체를 혼합하는 단계를 포함하는, 야생형 뉴몰리신과 면역학적으로 교차 반응성인 콜레스테롤 결합 시토라이신을 보유하는 박테리아에 의한 박테리아 감염의 예방 또는 치료용 약학 제제의 제조 방법.
  59. 의학적 치료 방법에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 분리된 돌연변이 PLY 단백질.
  60. 의학적 치료 방법에 사용하기 위한 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항의 면역원성 복합체.
  61. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 분리된 돌연변이 PLY 단백질을 제공하는 단계; 및
    상기 돌연변이 단백질을 당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 접합시키는 단계
    를 포함하는, 면역원성 조성물의 제조 방법.
  62. 제61항에 있어서, 돌연변이 단백질을 스트렙토코커스 뉴모니아 다당류에 접합시키는 것인 방법.
  63. 면역원성 조성물에서의 사용 적합성에 대해 후보 돌연변이 PLY 단백질을 스크리닝하는 방법으로서,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 돌연변이 PLY 단백질을 제공하는 단계;
    용혈 활성에 대해 상기 돌연변이 단백질을 테스트하는 단계;
    올리고머화 활성에 대해 상기 돌연변이 PLY 단백질을 테스트하는 단계; 및
    상기 돌연변이 PLY 단백질의 용혈 활성 및 올리고머화 활성을 비돌연변이 단백질의 용혈 활성 및 올리고머화 활성과 비교하는 단계
    를 포함하는 방법.
  64. 제55항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 감염은 스트렙토코커스 뉴모니아 감염인 것인 방법.
  65. 제56항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 감염은 스트렙토코커스 뉴모니아 감염인 것인 방법.
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