JP4848552B2 - 変異型ニューモリシンタンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、変異型肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）ニューモリシンタンパク質を含む免疫原性組成物に関する。本発明はさらに、かかるタンパク質及びこれらのタンパク質をコードする核酸に関する。

肺炎連鎖球菌は、肺炎、髄膜炎及び菌血症のような侵襲性疾患を引き起こす重要な病原体である。有効な抗生物質療法を自由に利用できる地域でさえ、肺炎球菌性肺炎に起因する死亡率は入院患者において１９％にも達することがある。開発途上国では、毎年３００万人を超える年齢５歳未満の小児が肺炎で死亡し、そのうち肺炎連鎖球菌は最大の原因因子である。肺炎連鎖球菌はまた、あまり重症ではないが高度に蔓延している感染症、例えば中耳炎及び副鼻腔炎を引き起こし、これらの感染症は先進国において医療費に大きな影響を与える。中耳炎は低年齢小児で特に重要である一方、副鼻腔炎は小児及び成人の両方において生じる。

米国ではＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）として、他の世界ではＰｒｅｖｅｎａｒ（登録商標）としてWyeth から販売されている７価多糖複合ワクチン（conjugate vaccine）は、現在のところ肺炎連鎖球菌感染症に対する防御のために利用できる唯一の有効な複合ワクチンである（Kyaw et al, 2002；Hausdorff et al, 2000）。このワクチンは、可能性のある９０のうち７の精製された連鎖球菌莢膜多糖（血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ）を含み（Kalin, 1998）、それぞれはキャリアタンパク質と複合体形成している。かかるワクチンの製造は米国特許第４，６７３，５７４号（Anderson）に記載されている。莢膜多糖の複合体化に使用されるタンパク質は、幼児においてワクチンの免疫原性の増大を与えるジフテリアトキソイドＣＲＭ_１９７である（Blum et al, 2000；Katkocin, 2000）。しかしながら、肺炎連鎖球菌の各血清型は構造的に明確に異なる莢膜多糖を有し、従って１の血清型による免疫は他の血清型の多くに対して防御を与えないが、幾分の交叉防御がワクチン関連血清型に対して生じる（Whitney et al, 2003）。

血清型特異的免疫に対して補完的な手法が研究されている。種共通毒性因子、例えばニューモリシン（ＰＬＹ）、すなわち肺炎連鎖球菌の全ての感染性株により産生される５３ｋＤａトキシンを使用することにも可能性がある（Paton et al, 1993）。ＰＬＹは単独で又はＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）において多糖と複合体化したキャリアタンパク質として使用することができ、増大した効力を与えるものである。Alexander et al (1994) は、ＰＬＹトキソイドによるマウスの免疫が肺炎連鎖球菌の９の異なる血清型によるチャレンジにおいて免疫防御を与えることを示した。ＰＬＹは、肺炎連鎖球菌感染症と類似の免疫反応を古典的な補体経路の活性化（Paton et al, 1984）、並びに好中球及びマクロファージのアポトーシスの誘発（Cockeran et al, 2002；Kadioglu et al, 2000）によって刺激することが示されている。

ＰＬＹは、コレステロール結合細胞溶解素（ＣＢＣ）のグループに属し、これは溶解性細孔を生成する大きな３０〜５０量体環構造の形成の前に宿主細胞膜のコレステロールに結合する（Palmer, 2001；Jedrzejas, 2001）。この細孔形成の機序は十分に理解されていないので、事象の順序に関しては多くの議論がある（Bonev et al, 2000；Shepard et al, 1998）。しかしながら、細孔形成能は天然ＰＬＹが極めて毒性であることを意味し、これは免疫原性組成物を開発する点で問題である。

製造に使用される複合体化プロセスはＰＬＹを無毒性にしうるが、無毒性形態から出発することがいっそう好ましいだろう。さらに、毒性形態は、非複合体化免疫原性組成物の製造に使用するのが困難であろう。ＰＬＹの毒性は、ニューモリソイド（Pneumolysoid）として知られているＰＬＹトキソイドを生成する部位特異的突然変異誘発によって著しく低減することができる（Paton, 1996）。

種々のかかるトキソイドが存在し、独立して又は多糖に複合体化してのいずれかで、感染性２ Ｄ３９型肺炎連鎖球菌によるチャレンジに反応してマウスに免疫防御を与えることが示されている（Paton et al, 1991；Alexander et al, 1994）。大部分の突然変異は、以前にＣ’末端付近の高度に保存された１１アミノ酸領域に作製された（Mitchell et al, 1992；Berry et al, 1995）。この部位は、宿主細胞への結合に関与することが示されている（de los Toyos et al, 1996）。ＰＬＹの多数のかかる突然変異形態は、国際特許出願ＷＯ９０／０６９５１号に記載されており、この刊行物に記載された突然変異のそれぞれは、タンパク質のＣ’末端に対するものである。

ＰＬＹに関するもう一つの問題は、それが大規模生産において凝集すること、すなわち、ＰＬＹを免疫原性組成物に使用するために解決せねばならない問題である。ＰＬＹの凝集は細孔形成に関与するＰＬＹのオリゴマー化に関連があると考えられている。従って本発明は、ＰＬＹ−ＰＬＹ相互作用（オリゴマー化）を低減又は排除し、大規模生産中に凝集する可能性が減少し、それによって容易に精製された形態のＰＬＹを生成しようと試みるものである。

Toyos et al (1996) は、ＰＬＹの種々の領域に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成し、そしてトキシン全体及び「プロテイナーゼＫ切断（nicked）」形態を検出することを記載している。プロテイナーゼＫはＰＬＹを３７ｋＤａ及び１５０ｋＤａ断片に切断する。抗体ｍＡｂ ＰＬＹ ４は、ＰＬＹ全体だけを認識し、いずれの断片も認識しないため、このｍＡｂに対するＰＬＹ上のエピトープは切断領域内にあることを示している。ＰＬＹをｍＡｂ ＰＬＹ ４と共にプレインキュベートし、次いでリポソームに加えると、トキシンはその後リポソーム膜上に細孔を形成しない。これは、ｍＡｂ ＰＬＹ ４によりブロックされた部位（アスパラギンＮ_１４３領域にあると考えられる）が、他のＰＬＹモノマーと相互作用してオリゴマー細孔を形成する原因となる部位であることを意味する。ストレプトコッカス・エスピーに起因するストレプトリシンＯのオリゴマー化は、Hugo et al, 1986 により示されたようにｍＡｂによってもブロックすることができる。抗体がオリゴマー化部位に結合することによりオリゴマー化を直接防止するのかどうか、又はトキシンモノマーの相互作用を立体的に障害する会合があるのかどうかは不明である。

モノクローナル抗体ＰＬＹ ４は、Suarez-Alvarez et al (2003)によってさらに特性決定されており、彼らはｍＡｂ ＰＬＹ ４に対するエピトープがToyos et al, 1996によって最初に提案されたＮ_１４３領域よりもさらに下流にあることを示唆している。現在は、認識の部位は、構造依存性であり、かつアミノ酸Ｅ_１５１〜Ｙ_２４７内にあるがＮ_１４３領域内にはないと考えられている。

以前に、ＰＬＹ内のＮ_１４２Ｎ_１４３欠失及びＮ_１４３Ｄ置換は、この領域及びオリゴマー化におけるその役割を理解する初期の一歩として本発明者によって作製された。両方の変異型の特性決定により、溶血及び細孔形成に関して天然型ＰＬＹと同一の挙動が明らかとなり（Search, 2002）、このことは、オリゴマー化はブロックされず、変異型の毒性は不変のままであることを示唆している。このように、以前に作製された変異型ＰＬＹ形態は、低減した毒性又は低減したオリゴマー化を示さず、このことはこれらの突然変異が免疫原性組成物の製造に役立たないだろうことを示唆している。

本発明は、広範には、変異型肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）ニューモリシンタンパク質を含む免疫原性組成物に関する。本発明はさらに、かかるタンパク質及びこれらのタンパク質をコードする核酸に関する。

従って、一つの態様において、本発明は、単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質であって、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の突然変異の存在によって異なっており、変異型の毒性が野生型タンパク質と比べて低減している、単離されたニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質に関する。突然変異は、野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内に位置することができる。

突然変異は、野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の１又は複数のアミノ酸の欠失又は置換でありうる。

変異型ＰＬＹタンパク質は、野生型タンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の１又は複数のアミノ酸の置換又は欠失によって異なりうる。

例えば、変異型ＰＬＹタンパク質は、野生型タンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の２つの隣接するアミノ酸の置換又は欠失によって、例えばアミノ酸バリン１４４及びプロリン１４５、アラニン１４６及びアルギニン１４７、メチオニン１４８及びグルタミン１４９、又はチロシン１５０及びグルタミン酸１５１などの欠失によって異なりうる。

上記変異型ＰＬＹタンパク質のいずれも、野生型配列のアミノ酸２５７〜２９７、３６７〜３９７又は４２４〜４３７の少なくとも１つの領域内に少なくとも１つのアミノ酸の置換又は欠失をさらに含んでもよい。

単離された変異型ＰＬＹタンパク質は、哺乳動物に対し低減した毒性を有する。これは典型的には、野生型ＰＬＹタンパク質と比べて、低減した溶血活性及び／又は低減したオリゴマー化活性と関連しうる低減した細孔形成活性を有する結果である。変異型ＰＬＹタンパク質は低減したオリゴマー化活性を有し、精製及び後続の操作を容易にすることが望ましいが、必ずしもそうではない。

別の態様において、本発明は、（ａ）単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、及び（ｂ）単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質であって、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の突然変異の存在によって異なっており、変異型の毒性が野生型タンパク質と比べて低減している単離されたニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質、を含む免疫原性複合体に関する。突然変異は、野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内に位置することができる。

突然変異は、野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の１又は複数のアミノ酸の置換又は欠失でありうる。

免疫原性複合体の変異型ＰＬＹタンパク質は、野生型タンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の１又は複数のアミノ酸の置換又は欠失によって異なりうる。

例えば、免疫原性複合体の変異型ＰＬＹタンパク質は、野生型タンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の２つの隣接するアミノ酸の置換又は欠失によって、例えばアミノ酸バリン１４４及びプロリン１４５、アラニン１４６及びアルギニン１４７、メチオニン１４８及びグルタミン１４９、又はチロシン１５０及びグルタミン酸１５１などの欠失によって異なりうる。

免疫原性複合体の変異型ＰＬＹタンパク質のいずれも、野生型配列のアミノ酸２５７〜２９７、３６７〜３９７又は４２４〜４３７の少なくとも１つの領域内に少なくとも１つのアミノ酸の置換又は欠失をさらに含んでもよい。

免疫原性複合体の単糖、オリゴ糖又は多糖は、肺炎連鎖球菌に由来するものでありうる。

別の態様において、本発明は、ａ）変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質であって、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の突然変異の存在によって異なっており、変異型の毒性が野生型タンパク質と比べて低減している変異型ＰＬＹタンパク質をコードする核酸配列；又はｂ）ａ）に定義される核酸配列に対し相補的な核酸配列を含む、単離され精製された核酸配列を提供する。

突然変異は、野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内に位置することができる。

突然変異は、野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の１又は複数のアミノ酸の置換又は欠失でありうる。

核酸配列は、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の１又は複数のアミノ酸の置換又は欠失によって異なっている変異型ＰＬＹタンパク質をコードすることができる。

例えば、核酸配列は、野生型タンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の２つの隣接するアミノ酸の置換又は欠失によって、例えばアミノ酸バリン１４４及びプロリン１４５、アラニン１４６及びアルギニン１４７、メチオニン１４８及びグルタミン１４９、又はチロシン１５０及びグルタミン酸１５１などの置換又は欠失によって異なっている変異型ＰＬＹタンパク質をコードすることができる。

上記核酸配列によりコードされる変異型ＰＬＹタンパク質は、上記のいずれであってもよく、そして野生型配列のアミノ酸２５７〜２９７、３６７〜３９７又は４２４〜４３７の少なくとも１つの領域内に少なくとも１つのアミノ酸の置換又は欠失をさらに含んでもよい。

さらに別の態様において、本発明は、変異型ＰＬＹタンパク質をコードする上記単離され精製された核酸配列のいずれかを含む組換え発現ベクター、並びにかかる組換え発現ベクターが形質転換された、トランスフェクトされた、又は感染した組換え宿主細胞を提供する。

別の態様において、本発明は、本発明の単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質であって、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の突然変異の存在によって異なっており、変異型の毒性が野生型タンパク質と比べて低減している変異型ＰＬＹタンパク質を作製する方法であって、ａ）宿主細胞に上記組換え発現ベクターを形質転換し、トランスフェクトし又は感染させ、該宿主細胞を、該宿主細胞により該変異型ＰＬＹタンパク質の発現が可能な条件下にて培養するステップ、及びｂ）変異型ＰＬＹタンパク質を培養物から回収するステップを含む方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、ａ）上記の非複合体化形態での又は免疫原性複合体の一部としての、単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質であって、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の突然変異の存在によって異なっており、変異型の毒性が野生型タンパク質と比べて低減している変異型ＰＬＹタンパク質、及びｂ）１又は複数の生理学的に許容されるアジュバント、希釈剤又は担体、を含む免疫原性組成物を提供する。

突然変異は、野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内に位置することができる。

突然変異は、野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の１又は複数のアミノ酸の置換又は欠失でありうる。

組成物の単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質は、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の１又は複数のアミノ酸の置換又は欠失の存在によって異なりうる。

例えば、変異型ＰＬＹタンパク質は、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の２つの隣接するアミノ酸の置換又は欠失によって、例えばアミノ酸バリン１４４及びプロリン１４５、アラニン１４６及びアルギニン１４７、メチオニン１４８及びグルタミン１４９、又はチロシン１５０及びグルタミン酸１５１などの置換又は欠失によって異なりうる。

免疫原性組成物は、上記の非複合体化形態での又は免疫原性複合体の一部としての、上記変異型ＰＬＹタンパク質であって、野生型配列のアミノ酸２５７〜２９７、３６７〜３９７又は４２４〜４３７の少なくとも１つの領域内に少なくとも１つのアミノ酸の置換又は欠失をさらに含む変異型ＰＬＹタンパク質のいずれを含んでいてもよい。

従って、免疫原性組成物は、
ａ）（ｉ）連鎖球菌、例えば肺炎連鎖球菌に由来する単糖、オリゴ糖又は多糖；及び（ｉｉ）単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質であって、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の突然変異の存在によって異なっており、変異型の毒性が野生型タンパク質と比べて低減している変異型ＰＬＹタンパク質、を含む免疫原性複合体；並びに
ｂ）１又は複数の生理学的に許容されるアジュバント、希釈剤又は担体
を含みうる。組成物は、複数の肺炎連鎖球菌亜型の単糖、オリゴ糖又は多糖を含んでいてよい。

さらなる態様において、本発明は、対象哺乳動物に、ａ）単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質であって、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の突然変異の存在によって異なっており、変異型の毒性が野生型タンパク質と比べて低減している変異型ＰＬＹタンパク質；及びｂ）１又は複数の生理学的に許容されるアジュバント、希釈剤又は担体、を含む免疫原性組成物を投与するステップを含む、哺乳動物のための予防方法に関する。

免疫原性組成物は、ａ）（ｉ）単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質；及び（ｉｉ）上記の単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質、を含む免疫原性複合体を含有していてよい。

別の態様において、本発明は、免疫原性組成物の製造における本発明の単離された変異型ＰＬＹタンパク質又は免疫原性複合体のいずれかの使用に関する。本発明はまた、本発明の変異型タンパク質又は免疫原性複合体を製薬上許容される担体と混合するステップを含む、免疫原性組成物の製造方法を提供する。

本発明の免疫原性組成物は、細菌感染症の予防又は治療のために使用することができる。特に、それらは、免疫学的にＰＬＹと交叉反応性であり、すなわち、ＰＬＹに結合するであろう抗体によって結合され得る、コレステロール結合細胞溶解素（例えば、Palmer, 2001 参照）を有する細菌による感染症の予防又は治療のために有用である。しかし好ましくは、細菌は連鎖球菌、好ましくは肺炎連鎖球菌である。

別の態様において、本発明は、医療処置の方法に使用するための本発明の単離された変異型ＰＬＹタンパク質又は免疫原性複合体を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、免疫原性組成物の製造方法であって、本明細書に記載する単離された変異型ＰＬＹタンパク質を準備するステップ；及び変異型タンパク質を、単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と複合体化するステップを含む方法に関する。上記方法における変異型タンパク質は、肺炎連鎖球菌多糖と複合体化していてよい。本方法は、こうして得られた複合体を製薬上許容される担体と混合するステップをさらに含むことができる。

また別の態様において、本発明は、免疫原性組成物における使用に適した候補変異型ＰＬＹタンパク質をスクリーニングする方法であって、変異型ＰＬＹタンパク質を準備するステップ、変異型タンパク質を溶血活性について試験するステップ、変異型ＰＬＹタンパク質をオリゴマー化活性について試験するステップ、並びに変異型ＰＬＹタンパク質の溶血活性及びオリゴマー化活性を非変異型タンパク質と比較するステップを含む方法に関する。

ＰＬＹは、コレステロール結合細胞溶解素（ＣＢＣ）のグループに属する。野生型ニューモリシンのアミノ酸配列を図１に示す。図１は、NCBI-GenBank Flat File Release 141.0, April 15 2004 に由来する配列のＧｅｎＢａｎｋ同定番号も示している。

本発明は、溶血活性及び／又はオリゴマー化の低減の反映として低減した毒性を有する、野生型ＰＬＹタンパク質のアミノ酸１４４〜１６１の領域内に突然変異を有する多数のＰＬＹ形態の確認に基づいている。この領域のコンセンサス配列は、次のとおりである：ＶＰＡＲＭＱＹＥＫＩＴＡＨＳＭＥＱＬ（図１参照）。

一つの態様において、本発明は、野生型タンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の突然変異によって異なっている変異型ＰＬＹタンパク質に関する。この領域のコンセンサス配列は、次のとおりである：ＶＰＡＲＭＱＹＥ（図１参照）。

変異型はアミノ酸１４４〜１６１、例えば１４４〜１５１の領域内に１又は複数のアミノ酸の置換又は欠失を有しうる。

従って、本発明の全ての態様において、変異型ニューモリシンは、野生型配列のアミノ酸１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０又は１６１の１又は複数のアミノ酸において、突然変異、例えば置換又は欠失を有しうる。

本発明はさらに、野生型タンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の２つの隣接するアミノ酸の置換又は欠失によって異なっている変異型ＰＬＹタンパク質に関する。かかる二重変異体の例は、アミノ酸バリン１４４及びプロリン１４５、アラニン１４６及びアルギニン１４７、メチオニン１４８及びグルタミン１４９、又はチロシン１５０及びグルタミン酸１５１の置換又は欠失を含むものである。

これらの変異型ＰＬＹタンパク質は、それら自体で、１又は複数の生理学的に許容されるアジュバント、希釈剤又は担体とともに免疫学的組成物に使用される。

あるいは、これらの変異型ＰＬＹタンパク質は、同一又は異種生物に由来する単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と複合体化させて、１又は複数の生理学的に許容されるアジュバント、希釈剤又は担体とともに免疫学的組成物に使用される複合体を形成する。従って、変異型ＰＬＹが複合体化する単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、連鎖球菌、例えば肺炎連鎖球菌に由来するものとしうる。それらは細菌莢膜に由来するものであってよい。

非複合体化又は複合体化形態のいずれにおいても、免疫原性組成物に含まれる変異型ＰＬＹタンパク質は、予防又は治療において使用される。

非複合体化又は複合体化形態のいずれにおいても、変異型ＰＬＹタンパク質は、野生型配列のアミノ酸２５７〜２９７、３６７〜３９７又は４２４〜４３７の少なくとも１つの領域内に少なくとも１つのアミノ酸の置換又は欠失をさらに含んでいてよい。これらのさらなる置換又は欠失は、Paton et alの公開国際特許ＷＯ９０／０６９５１号に記載されている。

本発明の別の態様によれば、本明細書に記載した単離された変異型ＰＬＹタンパク質を含む免疫原性組成物が提供される。一つの実施形態において、免疫原性組成物は肺炎連鎖球菌免疫原性組成物である。

変異型ＰＬＹタンパク質は、哺乳動物における免疫原性活性を保持することができる。「哺乳動物における免疫原性」とは、哺乳動物の免疫系が変異型ＰＬＹタンパク質に対する抗体を産生し、そしてこれらの抗体が野生型ＰＬＹタンパク質も認識することを意味する。同様に、野生型ＰＬＹタンパク質に対する哺乳動物抗体は、変異型ＰＬＹタンパク質も認識するだろう。好ましくは、変異型タンパク質はヒトにおいて免疫原性である。好ましくは、変異型ＰＬＹタンパク質は、野生型ＶＰＡＲＭＱＹＥＫＩＴＡＨＳＭＥＱＬ又はＶＰＡＲＭＱＹＥ配列に結合する抗体を産生する哺乳動物免疫系を刺激しうる。

一つの実施形態において、突然変異は、野生型タンパク質のオリゴマー化に関与するＰＬＹタンパク質の領域内に存在する。

理論に拘束されるものではないが、変異型ＰＬＹタンパク質は、野生型ＰＬＹタンパク質と比べて低減した細孔形成活性の結果として、低減した毒性を有すると考えられる。これは、低減したオリゴマー化活性及び／又は低減した溶血活性に関連すると考えられる。毒性は直接測定することができる。あるいは、可能性ある毒性の指標を得るために細孔形成、オリゴマー化及び溶血の１又は複数を測定してもよい。

欠失及び置換は、低減した毒性を有するＰＬＹ変異型タンパク質を得るために使用できる突然変異の例である。非保存的置換は、非保存的突然変異を有する変異型が保存的置換を有するものよりも野生型レベルを保持する可能性が低いので、ＰＬＹ変異型の毒性を低減するために特に適することがある。

保存的置換は、アミノ酸クラス内の置換及び／又は以下に示すようにＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおいてポジティブスコアの置換と定義することができ、従って、非保存的置換は、アミノ酸クラス間の置換、又はＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおいてポジティブスコアではない置換と定義することができる。

１つの分類によれば、アミノ酸クラスは、酸性、塩基性、非荷電極性及び非極性であってよく、酸性アミノ酸はＡｓｐ及びＧｌｕであり、塩基性アミノ酸はＡｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓであり、非荷電極性アミノ酸はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒであり、そして非極性アミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ及びＣｙｓである。

別の分類によれば、アミノ酸クラスは、小さい親水性、酸／酸アミド／親水性、塩基性、小さい疎水性及び芳香族であり、小さい親水性アミノ酸はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ及びＧｌｙであり、酸／酸アミド／親水性アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ及びＧｌｎであり、塩基性アミノ酸はＨｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓであり、小さい疎水性アミノ酸はＭｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌであり、そして芳香族アミノ酸はＰｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐである。

ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおいてポジティブスコアの保存的置換は、下記のとおりである。

本発明の変異型ニューモリシンタンパク質は、図１に示すように、好ましくは野生型配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する。突然変異は、野生型配列と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性又は少なくとも９５％の同一性を有する。

参照配列に対するパーセント（％）アミノ酸配列同一性は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないで必要に応じて最大の％配列同一性を得るために配列をアライメントさせてギャップを挿入した後の、参照配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合（％）として定義される。％同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定することができる（Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２では幾つかの検索パラメーターが使用され、それらの大部分はデフォルト値に設定される。調節可能なパラメータは、次の値で設定される：重複スパン＝１、重複フラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。％アミノ酸配列同一性値は、参照配列の残基の総数（無視されるアライメントスコアを最大にするためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により参照配列に挿入されたギャップ）で除した、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定した一致同一残基の数に１００を乗じて決定される。

パーセント（％）アミノ酸類似性は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおいて正の値をスコアする残基が集計される以外は、同一性と同じように定義される。従って、同一ではないが類似の特性を有する残基（例えば保存的置換の結果として）も集計される。

アミノ酸１４４〜１６１、例えば１４４〜１５１の領域内のアミノ酸挿入も、ＰＬＹ変異型の毒性を低減するために使用することができる。例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれ以上のアミノ酸の挿入を使用することができる。しかしながら、欠失又は置換は一般的に挿入よりも好ましい。なぜならば、それらは野生型エピトープを破壊する可能性が少なく、かかる破壊は、免疫原性組成物において望ましくない変異型タンパク質の免疫原性を低減することがあるためである。

本発明の別の態様において、変異型ＰＬＹタンパク質は、単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と複合体化して免疫原性複合体を形成している。この態様において、変異型ＰＬＹタンパク質は、その免疫原性を保持していてもよいし、又はその免疫原性は除去されていてもよい。いずれの場合にも、変異型ＰＬＹタンパク質は、複合体における単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の免疫原性を向上するのに役立つ。

かかる単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、変異型ＰＬＹタンパク質と、任意の好適な方法でそれぞれ複合体化する。例えば、（１）タンパク質官能基による直接共役（例えば、チオール−チオール結合、アミン−カルボキシル結合、アミン−アルデヒド結合、酵素直接共役）；（２）アミンの同質二官能性共役（例えば、ビス−アルデヒドを用いる）：（３）チオールの同質二官能性共役（例えば、ビス−マレイミドを用いる）；（４）光活性化試薬による同質二官能性共役；（５）アミンのチオールへの異質二官能性共役（例えば、マレイミドを用いる）；（６）光活性化試薬（例えば、β−カルボニルジアゾファミリー）による異質二官能性共役；（７）臭化シアン活性化によるアミン反応基の多糖又はオリゴ糖への導入；（８）異質二官能性化合物、例えばマレイミド−ヒドラジドによるチオール反応基の多糖又はオリゴ糖への導入；（９）疎水性基のタンパク質への導入によるタンパク質−脂質複合体化、及び（１０）反応基の脂質への導入によるタンパク質−脂質複合体化が挙げられるが、これらに限定されない。また、異質二官能性「非共役結合」技術、例えばビオチン−アビジン相互作用も想定される。複合体化技術の包括的な概説については、Aslam and Dent (1998)を参照されたい（以下、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質とタンパク質との複合体化のさらなる方法は、米国仮出願第６０／５３０，４８０号及び第６０／５３０，４８１号に記載されており、両者とも２００３年１２月１７日出願であり、両者とも全体が参照により本明細書に組み込まれる。

さらに、Kuo et al.への米国特許第５，５６５，２０４号は、かかる多糖を野生型ＰＬＹタンパク質と複合体化する方法を記載しており、その方法は、かかる多糖を本発明の変異型ＰＬＹタンパク質と複合体化するためにも適している。

本発明の免疫原性組成物は、複合体化免疫原性組成物であってよい。各免疫原性組成物は、野生型ＰＬＹタンパク質の生物源（肺炎連鎖球菌）に由来するものであってよい１又は複数の単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含んでいてよい。非限定的な例において、かかる成分は生物の莢膜に由来するものでありうる。

一つの実施形態において、単糖、オリゴ糖又は多糖は、肺炎連鎖球菌の２以上の血清型に由来する。特定の血清型は、免疫原性組成物のために意図される使用及び標的集団におけるこれらの血清型の有病率に依存するだろう。

別法として、単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、異種生物（すなわち、肺炎連鎖球菌以外の生物）に由来する。単糖、オリゴ糖又は多糖の場合、複数の血清型は、限定するものではないが、髄膜炎菌（例えば血清型Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及びインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）から得ることができる。

本発明の一定の態様において、変異型ＰＬＹタンパク質は、肺炎連鎖球菌の別のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と複合体化している。あるいは、変異型ＰＬＹタンパク質は、異種生物、例えばヒトに由来するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と複合体化している。例えば、変異型ＰＬＹタンパク質は、病原性ウイルス、細菌、真菌若しくは寄生虫、又は（２）癌細胞若しくは腫瘍細胞、又は（３）アレルゲンに対するアレルギー反応を調節するためにＩｇＥの産生を妨害するためのアレルゲン、又は（４）脊椎動物宿主におけるアミロイド沈着を特徴とする疾患を予防若しくは治療するためのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、に由来する別のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と複合体化している。

変異型ＰＬＹタンパク質と複合体化しているＡＰＰの部分は、β−アミロイドペプチド（Ａβペプチドとも呼ばれる）であってよく、これはＡＰＰをβ及びγセクレターゼ酵素で処理することによって作り出される（ＡＰＰ）の内部３９〜４３アミノ酸の断片である。かかるペプチドの例は、Ａβ１−４２ペプチドであり、次のアミノ酸配列を有する：
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His
Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys
Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
Ａβ成分はさらに、変異型ＰＬＹタンパク質と複合体化した断片の形態で投与することができる。かかる断片の非限定的な例としては、Ａβ１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、３−７、３−８、３−９、３−１０、３−１１、１−１０及び１−１２が挙げられる。ＰＬＹ以外のタンパク質と複合体化したＡβ及びその断片の使用は、国際特許出願ＷＯ９９／２７９４４号及びＷＯ００／７２８８０号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の別の態様は、対象哺乳動物に、本明細書に記載した突然変異を有する単離されたＰＬＹタンパク質であって、本明細書に記載したように非複合体化又は複合体化されている変異型ＰＬＹタンパク質を含有する免疫原性組成物を投与するステップを含む、哺乳動物のための予防又は治療方法を提供する。典型的には、本方法は、野生型ニューモリシンと免疫学的に交叉反応するコレステロール結合サイトリシンを有する細菌の１又は複数の種又は株、特に連鎖球菌、とりわけ肺炎連鎖球菌による感染症の予防又は治療を意図している。他の種及びそれらのサイトリシンとしては、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（ペルフリンゴリシンＯ）、ストレプトコッカス・インターメジウス(インターメジリシン）、バチルス・アルベイ（アルベオリシン）、炭疽菌（Bacillus anthracis；アントロリシン）、セレウス菌（Bacillus cereus；セレオリシン）、リステリア・イバノビイ（イバノリシンＯ）、クロストリジウム・ノービ（ノービリシン）、アルカノバクテリウム・ピオゲネス（ピオリシン）、リステリア・シーリゲリ（シーリゲリオリシンＯ）、クロストリジウム・セプチカム（セプチコリシン）、化膿連鎖球菌（S. pyrogenes；ストレプトリシンＯ）、ストレプトコッカス・スーイス（スーイリシン）、破傷風菌（Clostridium tetani；テタノリシン）、リステリア・モノサイトゲネス（リステリオリシンＯ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（ストレプトリシンＯ）、ストレプトコッカス・カニス（ストレプトリシンＯ）、バチルス・チューリンギエンシス（チューリンギオリシン）、バチルス・ラテロスポルス（ラテロスポロリシンＯ）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum；ボツリノリシン）、クロストリジウム・ショウベイ（ショウベオリシン）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（ビファーメントリシン）、ソルデル菌（C. Sordellii；ソルデリリシン）が挙げられる（例えば Palmer 2001 参照）。

本発明の免疫原性組成物の投与方法は、変異型ＰＬＹタンパク質が単独で投与されるか又は免疫原性複合体の一部として投与されるかにかかわらず、免疫防御的量のタンパク質を被験体に送達する任意の好適な経路によることができる。かかる一つの経路は、非経口経路、例えば筋肉内又は皮下投与による経路である。所望により、他の投与方法、例えば、粘膜経路、例えば経口、直腸、口腔若しくは鼻腔内投与によって、又は他の非経口的経路、すなわち、皮内又は静脈内経路を採用することもできる。

一般的に、免疫原性組成物は、生理学的に許容される担体又は賦形剤、例えば、滅菌水又は滅菌等張生理食塩水、並びにヒトへの投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む医薬製剤として通常提供されうる。適切な担体は、当業者には明らかであり、そして大部分は投与経路に依存するだろう。本発明の免疫原性組成物は、生理学的に許容される希釈剤、例えば滅菌水又は滅菌等張生理食塩水を含むこともできる。製剤は従来法により製造することができる。

しかしながら、任意の特定のレシピエント哺乳動物について具体的な投与レベルは、種々の因子、例えば年齢、全体的健康状態及び性別；投与時期；投与経路；投与される他の薬剤との相乗効果；並びに求められる防御の程度に依存することが理解されるだろう。言うまでもないが、投与は必要に応じて好適な間隔で繰り返すことができる。

哺乳動物はヒトであってよく、又はヒト以外の哺乳動物であってもよい。免疫原性組成物は任意の便利な方法で、例えば上記のように投与することができる。

本発明の免疫原性組成物は、１又は複数の生理学的に許容されるアジュバントを含むことができる。免疫原又は抗原と一緒に投与したときに免疫反応を増強する物質は、アジュバントとして知られている。多数のサイトカイン又はリンホカインは免疫調節活性を有することが示されており、従ってアジュバントとして使用することができる。それらの例としては、１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）、１３、１４、１５、１６、１７及び１８（及びその変異型）、インターロイキン−α、β及びγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；例えば、米国特許第５，０７８，９９６号参照。これは参照により本明細書に組み込まれる、及びＡＴＣＣ受託番号３９９００）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、並びに腫瘍壊死因子α及びβが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用なさらに他のアジュバントとしては、ケモカインがあり、その例はＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳであるが、これらに限定されない。セレクチンのような接着分子、例えばＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＥ−セレクチンも、アジュバントとして有用であり得る。さらに他の有用なアジュバントとしては、ムチン様分子、例えばＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１及びＭａｄＣＡＭ−１、インテグリンファミリーのメンバー、例えばＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１及びｐ１５０．９５、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、例えばＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＩＣＡＭ−３、ＣＤ２及びＬＦＡ−３、副刺激分子、例えばＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ、成長因子、例えば血管成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１及び血管上皮成長因子、受容体分子、例えばＦａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２及びＤＲ６が挙げられるが、これらに限定されない。さらに他のアジュバント分子としては、カスパーゼ（ＩＣＥ）がある。国際特許公開ＷＯ９８／１７７９９号及びＷＯ９９／４３８３９号（これらは参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。

免疫反応を増強するために用いられる好適なアジュバントとしては、ＭＰＬ^ＴＭ（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；Corixa, Hamilton, MT）がさらに挙げられるが、これに限定されず、これは米国特許第４，９１２，０９４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。アジュバントとして使用するために同様に適するものは、合成脂質Ａ類似体、あるいはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）又はその誘導体若しくは類似体であり、これらはCorixa（Hamilton, MT）から入手でき、そして米国特許第６，１１３，９１８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一つのかかるＡＧＰは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−β−Ｄ−グルコピラノシドであり、これは５２９としても知られている（以前はＲＣ５２９として知られていた）。この５２９アジュバントは水溶液形態として又は安定なエマルジョンとして製剤される。

さらに他のアジュバントとしては、鉱油及び水エマルジョン、アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、死滅ボルデテラ属、サポニン、例えば米国特許第５，０５７，５４０号（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたＳｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭＱＳ−２１（Antigenics, Framingham, MA.)、及びそれから作り出される粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、細菌性リポ多糖、合成ポリヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号、これは参照により本明細書に組み込まれる）、百日咳トキシン（ＰＴ）、大腸菌易熱性トキシン（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、又はＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９が挙げられる。例えば、国際特許公開ＷＯ９３／１３３０２号及びＷＯ９２／１９２６５号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

アジュバントとして同様に有用なものは、コレラトキシン及びその変異型であり、例えば公開国際特許出願ＷＯ００／１８４３４号に記載されたものである（アミノ酸位置２９のグルタミン酸が他のアミノ酸（アスパラギン酸以外）、好ましくはヒスチジンで置換されている）。類似のＣＴトキシン又は変異型は、公開国際特許出願ＷＯ０２／０９８３６８号に記載されている（アミノ酸位置１６のイソロイシンが別のアミノ酸で置換されている、この置換単独であるか又はアミノ酸位置６８のセリンの別のアミノ酸での置換と組み合わせたもの；及び／又はアミノ酸の位置７２のバリンが別のアミノ酸で置換されている）。他のＣＴトキシンは、公開国際特許出願ＷＯ０２／０９８３６９号に記載されている（アミノ酸位置２５のアルギニンが別のアミノ酸で置換されている；及び／又は１つのアミノ酸がアミノ酸位置４９に挿入されている；及び／又は２つのアミノ酸がアミノ酸位置３５及び３６に挿入されている）。

変異型ＰＬＹタンパク質の溶血活性は、任意の好適な方法で決定することができる。本発明において使用される一つの特定のプロトコールは、次のとおりである。トキシンを、１．５ｍｌの１×ＰＢＳ（Oxoid）中の連続希釈物として調製した。等体積の２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）を各希釈物に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで溶液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離してＳＲＢＣ膜又は全細胞をペレットにした。上澄み液のヘモグロビン含有量をＯＤ５４０ｎｍで読み取り、トキシン濃度に対してプロットして、トキシン濃度に対する溶血度を得た。ＯＤ５４０ｎｍが０．５＝５０％溶解。

好ましくは、変異型タンパク質は１μｇ／ｍｌより高い濃度で、より好ましくは５μｇ／ｍｌより高い濃度で、よりいっそう好ましくは１０μｇ／ｍｌより高い、２５μｇ／ｍｌより高い、又は３５μｇ／ｍｌより高い濃度で、そして最も好ましくは５０μｇ／ｍｌより高い濃度で、非溶血性である。溶血の決定は、上記のように行うことができる。

細孔形成活性の決定は、任意の好適な方法で決定することができ、好ましいプロトコールは、電子顕微鏡法（これにより細孔の数を可視化することが可能となる）によるＳＲＢＣ膜の目視検査に基づく。このプロトコールをより詳細に以下に説明する。

幾つかの方法を使用して、細孔形成トキシンのオリゴマー化活性を分析することができる。例えば、Morgan et al (1993) に記載された分析超遠心を使用して、溶液中のトキシンのオリゴマー化を研究することができる。ショ糖密度勾配をトキシン結合赤血球に適用することができ、この場合、オリゴマーは高分子量画分中で観察され、そして他の赤血球膜タンパク質から分離される（Bhakdi et al, 1985；Saunders et al, 1989）。

溶液中の変異型ＰＬＹのオリゴマー化活性を野生型ＰＬＹと比較する一つの特定の方法は、Search (2002) により記載されたのと同様の方法で行われる蛍光アッセイを使用することである。簡単に説明すると、ＡＮＳ（８−アニリノ−１−ナフタレン−スルホン酸）（Kodak Ltd.）は、外部蛍光としてＰＬＹに結合する。水溶液中で、ＡＮＳは４９０ｎｍにおいて弱い蛍光（ＪＡＳＣＯ ＦＰ−７５０蛍光分光計で読み取る）を有するが、疎水性環境中では、ＡＮＳ蛍光は増大する。この現象は、ＡＮＳ結合ＰＬＹモノマーの移動を溶液中で追跡することを可能にする。デオキシコール酸ナトリウム（BDH Laboratory供給）を使用して、ニューモリシンのオリゴマー化を誘導することができる。蛍光の増大は、野生型ＰＬＹ及びＡＮＳがデオキシコール酸ナトリウムで処理されてトキシンが自己会合してＡＮＳを親水性環境から疎水性環境とした場合に観測される。誘導体化ＰＬＹ、すなわち、モノマーのままであるようにジチオ（ビス）ニトロベンゾエートで化学的に修飾されたＰＬＹは、デオキシコール酸ナトリウムで処理する場合に４９０ｎｍにおける蛍光の増大をもたらさない。この実験から、変異型ＰＬＹは、モノマーのままであるならば、誘導体化ＰＬＹと同じ結果を与えるだろうと予測される。変異型ＰＬＹがＷＴ ＰＬＹと同じ程度まで蛍光性であることがわかった場合には、変異型ＰＬＹはオリゴマー化すると結論付けることができる。

本発明のタンパク質及び組成物の毒性は、変異型をヒト以外の試験動物、例えばげっ歯動物に投与することにより、直接決定することができる。変異型の毒性は、野生型タンパク質の毒性と比較することができる。毒性の好適な指標は、例えば生存率、動物の行動及び炎症（これは、例えば気管支肺胞洗浄液中での炎症性サイトカイン産生により決定できる）である。好適なプロトコールは以下の実施例に記載される。

本発明はさらに、免疫原性組成物の製造方法であって、
本明細書に記載した突然変異を有し、かつ野生型ＰＬＹタンパク質と比べて低減した溶血活性を有する単離された変異型ＰＬＹタンパク質であって、哺乳動物において免疫原性である変異型ＰＬＹタンパク質を準備するステップ；及び
変異型タンパク質を、単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と複合体化するステップ
を含む方法を提供する。

本発明のもう一つの態様によれば、変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質であって、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１６１の領域内の突然変異の存在によって異なっており、変異型の毒性が野生型タンパク質と比べて低減している変異型ＰＬＹタンパク質をコードする核酸配列、又はかかる核酸配列に対し相補的な核酸配列であって、ここで変異型タンパク質が哺乳動物において免疫原性である、単離され精製された核酸配列が提供される。本発明のさらなる態様は、かかる配列と相補的な核酸配列を提供する。

核酸配列は、遺伝暗号の縮退に基づくタンパク質配列から誘導することができる。

本発明の核酸配列は、追加の調節配列、例えば、プロモーター又はリプレッサーを含むことができる。核酸配列は、発現ベクター、例えば、プラスミド、人工染色体、カセットなどに含めることができる。

本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載した変異型ＰＬＹタンパク質を発現する単離され精製された核酸配列を含む組換え発現ベクターが形質転換された、トランスフェクトされた、又は感染した組換え宿主細胞が提供される。一つの実施形態において、細胞は原核細胞である。

本発明のさらに別の態様によれば、免疫原性組成物における使用に適した候補変異型ＰＬＹタンパク質をスクリーニングする方法であって、
変異型タンパク質を準備するステップ；
変異型タンパク質を溶血活性について試験するステップ；
変異型タンパク質をオリゴマー化活性について試験するステップ；並びに
変異型タンパク質の溶血活性及びオリゴマー化活性を非変異型タンパク質と比較するステップ
を含む方法が提供される。

タンパク質の非変異型形態と比べて低減した溶血活性及びオリゴマー化活性を有する変異型タンパク質は、免疫原性組成物の製造のための良好な候補となりうる。

本方法は、変異型タンパク質を標的哺乳動物における免疫原性活性について試験するステップをさらに含むことができる。これは、変異型タンパク質を非変異型タンパク質に対する抗体と接触させるステップを含むことができる。これはｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。

本明細書に記載した発明は、低減した毒性、溶血及び細孔形成を示すニューモリシンの欠失変異型に関する。データは、Δ６ ＰＬＹが７μｇ／投与で、２μｇ／投与のＷＹ ＰＬＹと比べてマウスに対し悪影響を与えないことを示している。

それでもなお、本発明者により作製され本明細書に記載したＮ_１４３残基周辺の種々の突然変異は、ｍＡｂ ＰＬＹ ４を用いるウエスタンブロット法によって依然として認識され、このことはＰＬＹ上のこの高度に抗原性の部位が変化していないことを示している。突然変異の部位はエピトープ走査によって高度に抗原性であることが示されており、そしてヒト血清及びウサギ過免疫血清の両者によって認識される（Salo et al, 1993）。

作製された全ての変異型は、ニューモリシンの形態であることが確認された。ｍＡｂ ＰＬＹ４が変異型を認識するという事実は、エピトープがこの抗体にもはや特異性でないような程度には変化していないことを示している。この領域内のより大きな欠失は、ｍＡｂＰＬＹ４によって認識されない変異型を生成するだろう。この領域は高度に免疫原性であることが確認されているので（Salo et al, 1993）、本発明者が作製した欠失においてこの部位が無傷のままであることは、免疫原性組成物における使用に関して有用である。

本明細書に記載した無毒性変異型は、オリゴマー化に関与すると提唱された部位内にある（de los Toyos et al, 1996）。１つの精製されたトキソイド、Δ６ ＰＬＹのさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ特性決定によって、それがネズミ線維芽細胞又は赤血球に対して細胞毒性ではないことが明らかとなった。これは、オリゴマー化（細孔形成）が防止されているので、宿主細胞膜はΔ６ ＰＬＹによって溶解されないことを示唆している。ＷＴ ＰＬＹで処理したＳＲＢＣ膜上の細孔は容易に目に見えるが、Δ６ ＰＬＹで処理した膜上では細孔が観察されなかった。Δ６ ＰＬＹで処理した膜を可視化のためのグリッドにＥＭで固定化することは困難であった。これは、Δ６ ＰＬＹを用いた溶血アッセイで見られる膜の凝集のためであり得る。ＳＲＢＣを用いたΔ６ ＰＬＹの溶血アッセイで観察された血液凝集効果は、Δ６ ＰＬＹモノマーが宿主細胞膜に依然として結合することを示唆している。宿主細胞膜への結合の可視化を可能にするΔ６ ＰＬＹの標識された形態を作製した。結合アッセイ（データは示さず）から、Δ６ ＰＬＹが宿主細胞膜に結合しなかったことが確認された。Δ６ ＰＬＹモノマー間には弱いアフィニティがあるかもしれず、モノマーの架橋を可能にするが真のオリゴマーの形成を可能にしない。赤血球に結合するΔ６ ＰＬＹモノマーに加えてΔ６ ＰＬＹモノマーのこの架橋は、９６ウェルプレートで観察されるマトリックスを生成することができた。Δ６ ＰＬＹ変異型の作製によって、オリゴマー化段階はブロックされたが、宿主細胞結合／認識は無効とならなかったことが提案される。

この仮説は、変異型及び野生型タンパク質のｅＧＦＰ標識形態を用いて決定して、Δ１４６ ＰＬＹが細胞膜と依然として会合できるが、Δ１４６ ＰＬＹが細胞膜において細孔を形成しないという知見によって支持される。それどころか、長鎖のタンパク質が細胞表面において見られ、これは正しくオリゴマー化して細孔を形成できない自己会合タンパク質であり得る。

Δ６ ＰＬＹでのｉｎ ｖｉｖｏ処置によって、処置後２４時間で炎症性サイトカインＩＬ−６は増加しなかった。ＷＴ ＰＬＹで処置したマウスは、生理食塩水対照及びΔ６ ＰＬＹ処置よりも１０倍多いＩＬ−６を産生することが見出された。このデータは、Δ６ ＰＬＹによる処置が天然ＰＬＹに関する炎症性副作用を誘発しなかったことを確立した。ＷＴ ＰＬＹ処置により、投与部位において局在化炎症反応が生じた。気管支肺胞洗浄液におけるこの局在化ＩＬ−６産生は、リクルートされた好中球（Kadioglu, 2000）、及び肺組織の上皮細胞よりも多くのＩＬ−６を産生する肺胞マクロファージ（Kerr, personal communication 2003）に起因するようである。

野生型ＰＬＹは肺全体を激しく損傷したが、Δ６ ＰＬＹで処置した肺は健康なままであった。ＷＴ ＰＬＹで処置したマウスの気道で観察された大量の総タンパク質は、宿主タンパク質の流入を特徴としていた（Rubins & Janoff, 1998）。ＰＬＹは、以前は接着結合の破壊に関係があるとされ（Rayner et al, 1995）、宿主タンパク質が毛細管／気道障壁の破壊によって気道内に「漏洩」するのを可能にする。Δ６ ＰＬＹによる低い炎症反応及び肺の破壊がないことは、Δ６ ＰＬＹが宿主細胞膜において細孔形成オリゴマーを生成できないことと相関する。

ＷＴ ＰＬＹでのマウスの処置はまた、Δ１４６ ＰＬＹで処置した動物では見られない持続性低体温反応を引き起こすことが示された。

本発明のこれら及び他の態様を、下記の非限定的な実施例により添付の図面を参照して説明する。

ニューモリシンの部位特異的突然変異誘発
野生型ニューモリシンに由来する８つの二重アミノ酸欠失を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて作製した。鋳型プラスミドは、予めＰＬＹが挿入された高発現ベクターｐＫＫ２３３−３（Clontech Laboratories）とした。適切なアミノ酸を欠失するように設計されたプライマー（下記の表１参照）はSigma-Genosysに注文した。ＰＬＹのＮ_１４３領域に及ぶように下記の欠失を作製した：
Ｗ_１３４Ｈ_１３５Ｑ_１３６Ｄ_１３７Ｙ_１３８Ｇ_１３９Ｑ_１４０Ｖ_１４１Ｎ_１４２Ｎ_１４３Ｖ_１４４Ｐ_１４５Ａ_１４６Ｒ_１４７Ｍ_１４８Ｑ_１４９Ｙ_１５０Ｅ_１５１；
ここで、（Δ１）Ｗ_１３４Ｈ_１３５、（Δ２）Ｑ_１３６Ｄ_１３７、（Δ３）Ｙ_１３８Ｇ_１３９、（Δ４）Ｑ_１４０Ｖ_１４１、（Δ５）Ｖ_１４４Ｐ_１４５、（Δ６）Ａ_１４６Ｒ_１４７、（Δ７）Ｍ_１４８Ｑ_１４９、（Δ８）Ｙ_１５０Ｅ_１５１（表２参照）。Ｎ_１４２Ｎ_１４３は予め作製した欠失であり（Search (2000)）、プロテイナーゼＫはＰＬＹを２つの断片に切断する。

タンパク質の発現及び精製
野生型（ＷＴ）及び変異型ＰＬＹを以前に記載されたように大腸菌において発現させ、回収した（Mitchell et al, 1989）。細胞を、卓上細胞破砕器（Constant Systems Ltd）を用いて破砕し、細胞質タンパク質を１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより得た。フェニルエーテルマトリックスによる疎水性相互作用クロマトグラフィ（PE20, Applied Biosystems）を用いて、ＢｉｏＣＡＤ（ＲＴＭ）７００Ｅ還流クロマトグラフィワークステーション（Applied Biosystems）によりＰＬＹを精製した。溶離した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させ、標準的プロトコールを用いてクーマシー染色し、純粋なＰＬＹを含む画分をプールした。

定量的溶血アッセイ
精製タンパク質の溶血活性を、Walker at al.(1987)により報告されたアッセイに基づくアッセイを用い、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Oxoid）中の２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）（E & O laboratories）溶液を用いて評価した。プールした画分を、ｍｉｎｉｃｏｎ Ｂ１５臨床サンプル濃縮器（Millipore）を用いて濃縮した。トキシンを１．５ｍｌの１×ＰＢＳ（Oxoid）中の連続希釈物として調製した。等体積の２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＳＲＢＣを各希釈物に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで溶液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離してＳＲＢＣ膜又は全細胞をペレットにした。上澄み液のヘモグロビン含有量をＯＤ５４０ｎｍで読み取り、トキシン濃度に対してプロットして、トキシン濃度に対する溶血度を得た。ＯＤ５４０ｎｍが０．５＝５０％溶解。

大まかな溶血アッセイは、これらの変異型の４つ、すなわち欠失５〜８が、非溶血性であったことを明らかにした。定量的溶血アッセイにおける精製Δ６ ＰＬＹ（Ａ_１４６Ｒ_１４７）のさらなる分析（図３）によって、それが５０μｇ／ｍｌの濃度で非溶解性であるが、１μｇ／ｍｌ未満のＷＴ ＰＬＹはＳＲＢＣに対して溶血性であったことが明らかになった。Δ５ ＰＬＹ及びΔ６ ＰＬＹの精製調製物は、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて赤血球を凝集させるが細胞を溶解しないことが観察された。この効果は濃度依存性であった。

電子顕微鏡法
２００μｌの２％（ｖ／ｖ）ＳＲＢＣ溶液を等体積の０．２ｍｇ／ｍｌ ＷＹ ＰＬＹ又はΔ６ ＰＬＹとともに３７℃で２０分間インキュベートし、次いで卓上型遠心分離機で遠心分離してＳＲＢＣ膜をペレットにした。膜をｄＨ_２Ｏで３回洗浄し、１００μｌのｄＨ_２Ｏに再懸濁した。５μｌの懸濁液を炭素被覆グリッド上に固定し、１％リンタングステン酸、ｐＨ６．８でネガティブ染色した。倍率はＬＥＯ ９１２エネルギーフィルター透過電子顕微鏡を用いて×２５０００とした。

３０〜４０μｍの細孔が０．２ｍｇ／ｍｌのＷＴ ＰＬＹで処理した赤血球膜上で可視化された（図５）。これに対し、０．２ｍｇ／ｍｌのΔ６ ＰＬＹで処理した膜上では細孔は可視化されなかった。

ウエスタンブロット法
部位特異的突然変異誘発により作製したＰＬＹ変異型を、標準的技術を用いたウエスタンブロットで検出した。ブロットを、ウサギ由来のポリクローナル抗ＰＬＹ血清又はマウス由来のモノクローナルＰＬＹ ４抗ＰＬＹ血清（de los Toyos et al, 1996）とともにインキュベートし、次いで適切なＨＲＰ結合抗体（Amersham Life Sciences）とともにインキュベートし、現像した。

作製した８つの二重アミノ酸欠失のうち全てが、de los Toyos et al (1996) より作製されたポリクローナル抗ＰＬＹ血清（示さず）及びｍＡｂ ＰＬＹ（図２）を用いたウエスタンブロット法によって認識された。

Ｌ９２９死滅アッセイ
Ｌ９２９ネズミ線維芽細胞（ECACC, no.85011425）をＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Gibco）中で培養し、継代させて９６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。精製されたＷＴ ＰＬＹ及び変異型Δ６ ＰＬＹトキシンの連続希釈物を、０．０５ｍｇ／ｍｌのストック濃縮物からＲＰＩＭ１６４０培地中で調製し、Ｌ９２９線維芽細胞に加えた。ＰＬＹとの２４時間インキュベーションでの細胞生存を、ミトコンドリア活性により分解されて紫色ホルマザン沈殿物になるＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Sigma）を用いて評価した。ウェル中のＭＴＴは死滅細胞と一緒であれば、黄色のままとなる。光学密度はＭＲＸプレートリーダー（Dynatech Laboratories）により５４０ｎｍで読み取った。

Ｌ９２９ネズミ線維芽細胞を用いた細胞毒性アッセイを行って、変異型Δ６ ＰＬＹの毒性をＷＴ ＰＬＹと比べて評価した（図４）。３０μｇ／ｍｌの濃度で、Δ６ ＰＬＹは線維芽細胞に対して毒性でなかったが、５００ｐｇ／ｍｌ未満のＷＹ ＰＬＹは細胞毒性であった。

ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカイン分析
８週齢のＭＦ−１マウス（Harlan）を、２％ハロタン／１．５％酸素（１．５リットル／分）（Zeneca）で軽く麻酔した。ＬＰＳ不含の精製ＷＴ ＰＬＹを２μｇ／投与で、及びΔ６ ＰＬＹを７μｇ／投与（９．９２８ｎｇのＬＰＳ／投与）で５０μｌの体積として鼻腔内投与し、食塩水グループを対照とした（各処置のためにｎ＝４）。精製トキシンのリポ多糖（ＬＰＳ）の含有量を、カブトガニ変形細胞溶解物（ＬＡＬ）Ｋｉｎｅｔｉｃ−ＱＣＬキット（BioWhittaker）を用いて決定し、製造業者の指示に従って行った。マウスを２４時間終点までモニターした。血清、気管支肺胞洗浄液及び肺組織のサンプルを回収し、以前に記載されたように処理した（Kerr, et al. 2002）。サイトカインレベルを、市販のサイトカインＥＬＩＳＡキットを用いてインターロイキン（ＩＬ）−６、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ（Pharmigen）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α（R&D systems, UK）について測定した。洗浄液中の総タンパク質レベルを、標準的ブラッドフォードアッセイを用いて測定した。

マンホイットニーＵ検定によるノンパラメトリック分析を用いてサイトカインレベル及び総タンパク質レベルを測定し、ｐ＜０．０５は統計的に有意であると考えられた。値は、Ｓｔａｔｖｉｅｗ（Abacus Concepts）を用いた中央値±１中央値絶対偏差（ＭＡＤ）として表される。

ｉｎ ｖｉｖｏ毒性研究の一部として、全体的症状を確かめた。ＷＴ ＰＬＹグループ由来の１頭を除いて全てのマウスが処置後２４時間生存した。Δ６ ＰＬＹ及び生理食塩水で処置したマウスはＷＴ ＰＬＹを与えたマウスよりも速やかに麻酔から回復した。Δ６ ＰＬＹ処置マウスの行動は生理食塩水対照と類似していたが、ＷＴ ＰＬＹ処置マウスは６時間の期間にわたって立毛、呼吸困難及び猫背の姿勢を示し、２４時間の時間スケール内に回復した。

次に、炎症性サイトカイン分析を行った。ＩＬ−６産生を、宿主に対するＰＬＹの毒性マーカーとして測定した。ＷＴ ＰＬＹ処置マウスの気管支肺胞洗浄液には、Δ６ ＰＬＹ処置（ｐ＜０．０５）及び生理食塩水対照（ｐ＜０．０５）と比べて１０倍を超えるＩＬ−６の増加があった（図７）。ＷＴ ＰＬＹでの処置は宿主気道に炎症を誘発したが、Δ６ ＰＬＹでの処置は誘発しなかった。ＷＴ処置気管支肺胞洗浄液中の中央ＩＬ−６レベルは４１６ｐｇ／ｍｌ（３３５〜２２２５ｐｇ／ｍｌの範囲）であったが、バックグラウンドＩＬ−６レベルは低く（５９ｐｇ／ｍｌ）、Δ６ ＰＬＹで処置したマウスでは増加しなかった（３６ｐｇ／ｍｌ）（以下の表３参照）。ＩＬ−６レベルの増加は、生理食塩水対照と比べてＷＴ処置マウスの肺組織において観察された（ｐ＜０．０５）（図６）。Δ６処置マウスの肺組織には、生理食塩水対照と比べて有意なＩＬ−６増加はなかった。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの測定値は、投与後２４時間に処置間で有意性がなかった（データは示さず）。

総タンパク質レベル（図８）を気管支肺胞洗浄液中で測定して、肺の全体を評価した。タンパク質レベルの増加は、健康洗浄液サンプルと比較してΔ６ ＰＬＹ処置マウスについては観察されなかった。ＷＴ ＰＬＹ処置マウスの気道は、生理食塩水対照グループについての０．２３ｍｇ／ｍｌのバックグラウンド総タンパク質レベルと比べて多量のタンパク質（３．５７ｍｇ／ｍｌ）を有していた（図８）。

マウス免疫原性の研究
マウス免疫原性の研究を行って、野生型ＰＬＹタンパク質の反応をΔ５、Δ６及びΔ７変異型タンパク質と比較した。全ての免疫原性組成物は、アジュバント、ＡｌＰＯ_４（０．２ｍｇ）及びＭＰＬ−ＳＥ（５０μｇ）の組み合わせの存在下に５μｇのｒＰＬＹ／投与で調製した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＡｌＰＯ_４（０．２ｍｇ）及びＭＰＬ−ＳＥ（５０μｇ）を、陰性対照として用いた。

５頭の６〜８週齢雌ＣＤ−１マウスのグループを腹腔内免疫し、２週間の間隔で２回の追加免疫用量を与えた。血液を、０、２、４及び６週目に眼窩後部で採取した。個々の血清をアッセイし、ＧＭＴは０．３で終点を示した。０週目の抗体は全て＜５０であった。表４に示すように、３つのＰＬＹ変異型は、マウスにおいて野生型ＰＬＹによって誘発されたものに匹敵する抗体を誘発した。

抗ＰＬＹ抗体の生成
野生型ＰＬＹ又はΔ６ ＰＬＹで免疫したマウスにおいて生じさせた抗ＰＬＹ抗体のレベルを、２０μｇのＷＴ ＰＬＹ又はΔ６ ＰＬＹ、それぞれ１００μｇのミョウバン／１００μｌ用量の初回皮下注射でＭＦ−１マウスを免疫することによって決定した。次いでマウスを同じ投与量で２回追加免疫した。免疫プロトコールの４７日目に血清を採取し、抗ＰＬＹ ＩｇＧ抗体について分析した。抗体希釈曲線は、血清連続希釈に対するグループ平均ＯＤ４９０ｎｍ±ＳＥＭとして図９に示されている。より濃縮したサンプルとして１／１０００までの血清の初期希釈を用いて、基質の完全飽和を生じさせた。図９は、Δ６ ＰＬＹ＋ミョウバン及びＷＴ ＰＬＹ＋ミョウバンの両方に反応して高レベルの抗体が産生されたが、ミョウバン単独の対照グループには産生されなかったことを示している。

次に、溶血活性を中和する抗ＰＬＹ抗体の能力を評価した。Δ６ ＰＬＹ及び野生型ＰＬＹ処置グループにおける抗ＰＬＹ抗体は、溶血アッセイにおいてＰＬＹの２．５溶血単位（ＨＵ）を１０００〜２４００の力価まで完全に中和した（中和能は、ＰＬＹの２．５ＨＵを完全に中和する抗体希釈の逆数として表される）（データは示さず）。これは、ＰＬＹ上の中和部位が認識され、Δ６ ＰＬＹ＋ミョウバン及びＷＴ ＰＬＹ＋ミョウバンによる免疫に反応して産生された抗体によって結合されることを示している。Δ６ ＰＬＹは無毒性であり、野生型ＰＬＹ処置で観察されたｉｎ ｖｉｖｏレベルのサイトカイン産生を誘発しないので、Δ６ ＰＬＹは免疫原性キャリアタンパク質として使用するために野生型ＰＬＹよりも好ましいタンパク質である。

単一アミノ酸欠失の効果
単一アミノ酸欠失を有する変異型ＰＬＹを作製した。すなわち、アミノ酸１４６におけるアラニンを欠失した（ΔＡ１４６ ＰＬＹ）。図１０に示すように、この単一欠失（ΔＡ１４６）は、非溶血形態のＰＬＹも生じさせた。ΔＡ１４６ ＰＬＹは１００μｇ／ｍｌを超える濃度までＳＲＢＣに対して溶血性でなかったが、野生型ＰＬＹは１μｇ／ｍｌ未満の濃度で溶血性であった。この変異型の産生は、発現されたタンパク質の配列決定及びポリクローナル抗ＰＬＹ血清によるウエスタンブロット法によって確認された（データは示さず）。

ＰＬＹ Ｗ４３３Ｆと比べたＰＬＹ変異型の溶血活性
ヒト赤血球に対する欠失変異型Δ６、Δ７、Δ８ ＰＬＹ及びΔＡ１４６ ＰＬＹの溶血活性を、ＷＴ ＰＬＹ及び置換Ｗ４３３Ｆを有するＰＬＹ変異型（これはＷＴ ＰＬＹの溶血活性の僅か１％を有すると以前に記載されている（ＷＯ９０／０６９５号参照））と比較した。

図１１は、予期したとおり、Ｗ４３３Ｆ変異型が野生型ＰＬＹの約１％の溶血活性を示すことを示している。しかしながら、欠失変異型はヒト赤血球の溶解を全く引き起こさなかった。

ＧＦＰ標識ＰＬＹの赤血球膜への結合
蛍光顕微鏡法を用いて、ＷＴ ＰＬＹ及びΔ６ ＰＬＹのｅＧＦＰ標識形態で処理した赤血球を可視化した。

赤血球ゴーストを、ヒト血液から蒸留水での反復洗浄によって調製した。０．１ｍｌのヒト血液から生成した赤血球ゴーストを、５０μｇのＥＧＦＰ−ＰＬＹ又は５０μｇのΔ６ＥＧＦＰ−ＰＬＹとともに１ｍｌの１×ＰＢＳ中で３７℃で３０分間インキュベートした。ゴースト膜をペレットにし、ＰＢＳ中で３回洗浄し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｃｏｐ ２０を用いて蛍光顕微鏡法によって可視化した。

結果（示さず）は、Δ６ ＰＬＹの膜への結合がＷＴ ＰＬＹと実質的に同じであることを実証する。

透過電子顕微鏡法を用いた細孔形成の分析
電子顕微鏡法を、０．２ｍｇ／ｍｌの野生型ニューモリシン、０．２ｍｇ／ｍｌのＷ４３３Ｆ ＰＬＹ及び０．２ｍｇ／ｍｌ ΔＡ１４６ ＰＬＹで処理した、ネガティブ染色したウマ赤血球膜について上記（実施例４）のように行った。

細孔は、ｗｔ ＰＬＹ及びＷ４３３Ｆで処理した膜上で観察されたが、ΔＡ１４６ ＰＬＹで処理した膜上では観察されなかった。その代わりに、ΔＡ１４６ ＰＬＹ処理は長鎖の形成を生じさせたが、これは、オリゴマー化して細孔を形成できない自己会合トキシンを含有すると考えられる（データは示さず）。

従って、Δ６ ＰＬＹは野生型ＰＬＹの膜結合特性を保持するが、細胞膜に細孔を形成しない。

ネズミＬ９２９線維芽細胞に対するニューモリシン変異型の細胞毒性
ネズミＬ９２９線維芽細胞に対するＷＴ ＰＬＹ、ＰＬＹ Ｗ４３３Ｆ、並びに欠失変異型Δ６、Δ７、Δ８ ＰＬＹ及びΔＡ１４６ ＰＬＹの細胞毒性を、実施例６に記載したように決定した。ヒト赤血球をＷＴ ＰＬＹ及びと比べた。

Ｗ４３３Ｆ ＰＬＹ変異型は１０μｇ／ｍｌで細胞毒性であることが見出されたが、欠失変異型はこのアッセイにおいて無毒性であった（図１２）。

ＲＢＬ−２Ｈ３マスト細胞に対するニューモリシン変異型ΔＡ１４６ ＰＬＹの細胞毒性
ラットＲＢＬ−２Ｈ３マスト細胞に対するΔＡ１４６ ＰＬＹの細胞毒性を、脱顆粒アッセイを用いて評価した。

アッセイを、Stassen et al (2003) により記載されたように、１０^４細胞／ウェルを用い、野生型ＰＬＹ又はΔＡ１４６ ＰＬＹとともに９０分間インキュベートして行った。

トキシンに反応した細胞の脱顆粒の直接的尺度を与える、マスト細胞顆粒からのβ−ヘキソサミダーゼの放出を測定した。ΔＡ１４６ ＰＬＹはマスト細胞の脱顆粒を引き起こさなかった（図１３）。

ｗｔ ＰＬＹ又はΔＡ１４６ ＰＬＹで処置した後のネズミ中核温度の分析
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、中核体温（Ｔｃ）を得るのを可能にする遠隔計測チップを埋め込んだ。マウスを１μｇのｗｔ ＰＬＹ、１μｇのΔＡ１４６ ＰＬＹ、又は生理食塩水単独で処置した。

図１４に示すように、ＷＴ ＰＬＹでの処置は激しい低体温反応を生じさせ、Ｔｃは２８℃に低下した。このＴｃは６時間持続し、その後Ｔｃは約０．６℃／時ずつ上昇し、２４時間までにこれは対照グループのＴｃと同様であったが、依然として統計的に有意であった。ΔＡ１４６ ＰＬＹでの処置は低体温をもたらさず、中央値Ｔｃは生理食塩水対照グループと同等であった。

このように、ＷＴ ＰＬＹでのマウスの処置は、同量のΔＡ１４６ ＰＬＹでの処置後には観察されなかった持続性低体温反応を生じさせた。

本発明を上記の例示的実施形態と併せて説明してきたが、多くの同等の修飾及び変更は、この開示が与えられれば当業者には明らかであろう。従って、上記の本発明の例示的実施形態は説明のためであって限定するためではないとみなされる。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく記載した実施形態に種々の変更を行うことができる。本明細書で引用した全ての参考文献は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

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野生型ニューモリシンのアミノ酸配列を示す。 ｍＡｂ ＰＬＹ４により検出されたＰＬＹ欠失変異型のウエスタンブロットを示す。 ＷＴ ＰＬＹをΔ６ ＰＬＹと比較した定量溶血アッセイの結果を示す。 ＷＴ ＰＬＹをΔ６ ＰＬＹと比較した細胞毒性アッセイの結果を示す。 ＷＹ ＰＬＹで処理した赤血球膜の電子顕微鏡写真を示す。 ＷＴ ＰＬＹ又はΔ６ ＰＬＹで処置した後の肺組織中のＩＬ−６レベルを示す。 ＷＴ ＰＬＹ又はΔ６ ＰＬＹで処置した後の肺組織中のＩＬ−６レベルを示す。 ＷＴ ＰＬＹ又はΔ６ ＰＬＹで処置した後の気管支肺胞洗浄液中の総タンパク質レベルを示す。 ＷＴ ＰＬＹ又はΔ６ ＰＬＹによるマウスの免疫に反応した抗ＰＬＹ抗体レベルを示す。 ＷＴ ＰＬＹ又は欠失変異型ΔＡ１４６で処理したＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）中のトキシン濃度に対する溶血度を示す。 ＷＴ ＰＬＹ並びに変異型ＰＬＹ Ｗ４３３Ｆ、Δ６ ＰＬＹ、Δ７ ＰＬＹ、Δ８ ＰＬＹ及びΔＡ１４６ ＰＬＹの溶血活性を比較している。 ＷＴ ＰＬＹ並びに変異型ＰＬＹ Ｗ４３３Ｆ、Δ６ ＰＬＹ、Δ７ ＰＬＹ、Δ８ ＰＬＹ及びΔＡ１４６ ＰＬＹのネズミＬ９２９に対する細胞毒性を示す。 ΔＡ１４６ ＰＬＹがＲＢＬ−２Ｈ３マスト細胞の脱顆粒を引き起こさない一方、ＷＹ ＰＬＹは該脱顆粒を引き起こすことを示す。 野生型ＰＬＹ又はΔＡ１４６ ＰＬＹで処置した後の中核体温の分析を示す。

Claims (25)

1. 単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質であって、野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の１又は複数のアミノ酸の欠失の存在によって異なっており、変異型の毒性が野生型タンパク質と比べて低減している、単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質。
2. アラニン１４６が欠失されている、請求項１に記載のタンパク質。
3. 変異型ＰＬＹタンパク質が、野生型タンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の２つの隣接するアミノ酸の欠失によって異なっている、請求項１に記載のタンパク質。
4. アミノ酸バリン１４４及びプロリン１４５が欠失されている、請求項３に記載のタンパク質。
5. アミノ酸アラニン１４６及びアルギニン１４７が欠失されている、請求項３に記載のタンパク質。
6. アミノ酸メチオニン１４８及びグルタミン１４９が欠失されている、請求項３に記載のタンパク質。
7. アミノ酸チロシン１５０及びグルタミン酸１５１が欠失されている、請求項３に記載のタンパク質。
8. 野生型配列のアミノ酸２５７〜２９７、３６７〜３９７又は４２４〜４３７の少なくとも１つの領域内に少なくとも１つのアミノ酸置換又は欠失をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
9. 医療処置の方法に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された変異型ＰＬＹタンパク質。
10. （ａ）単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、及び
    （ｂ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質
    を含む免疫原性複合体。
11. 単糖、オリゴ糖又は多糖が肺炎連鎖球菌に由来する、請求項１０に記載の免疫原性複合体。
12. 医療処置の方法に使用するための、請求項１０又は１１に記載の免疫原性複合体。
13. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質をコードする核酸配列、又はｂ）ａ）に定義される核酸配列に対し相補的な核酸配列を含む、単離され精製された核酸。
14. 請求項１３に記載の核酸配列を含む単離され精製された核酸を含有する組換え発現ベクター。
15. 請求項１４に記載の組換え発現ベクターが形質転換された、トランスフェクトされた、又は感染した組換え宿主細胞。
16. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質を作製する方法であって、ａ）宿主細胞に請求項１４に記載の組換え発現ベクターを形質転換し、トランスフェクトし又は感染させ、該宿主細胞を、該宿主細胞により該変異型ＰＬＹタンパク質の発現が可能な条件下にて培養するステップ、及びｂ）変異型ＰＬＹタンパク質を培養物から回収するステップを含む方法。
17. ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された変異型ニューモリシン（ＰＬＹ）タンパク質、及び
    ｂ）１又は複数の生理学的に許容されるアジュバント、希釈剤又は担体
    を含む免疫原性組成物。
18. ａ）請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、及び
    ｂ）１又は複数の生理学的に許容されるアジュバント、希釈剤又は担体
    を含む免疫原性組成物。
19. 複数の肺炎連鎖球菌血清型由来の単糖、オリゴ糖又は多糖を含む免疫原性複合体が存在する、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
20. 細菌感染症の予防又は治療のための、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
21. 対象非ヒト哺乳動物に、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む、非ヒト哺乳動物のための予防方法。
22. 細菌感染症の予防又は治療のための免疫原性組成物の製造における請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異型ＰＬＹタンパク質又は請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性複合体の使用。
23. 免疫原性組成物の製造方法であって、
    請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された変異型ＰＬＹタンパク質を準備するステップ、及び
    変異型タンパク質を、単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と複合体化するステップ
    を含む方法。
24. 変異型タンパク質が肺炎連鎖球菌多糖と複合体化される、請求項２３に記載の方法。
25. 免疫原性組成物における使用に適した候補変異型ＰＬＹタンパク質をスクリーニングする方法であって、
    野生型ＰＬＹタンパク質とは野生型配列のアミノ酸１４４〜１５１の領域内の１又は複数のアミノ酸の欠失の存在によって異なっている変異型ＰＬＹタンパク質を準備するステップ、
    変異型タンパク質を溶血活性について試験するステップ、
    変異型ＰＬＹタンパク質をオリゴマー化活性について試験するステップ、並びに
    変異型ＰＬＹタンパク質の溶血活性及びオリゴマー化活性を非変異型タンパク質と比較するステップ
    を含む方法。

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