KR20190121713A - 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 그의 면역원성 접합체 - Google Patents

스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 그의 면역원성 접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 협막 다당류; 및 상기 각각의 협막 다당류에 접합된 하나 또는 2 이상의 운반 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다. 본 발명의 일 실시예를 통해 폐렴구균 감염 예방 또는 치료용 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.

Description

스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류 및 그의 면역원성 접합체{Capsular saccharide of Streptococcus pneumoniae and the immunogenic conjugates thereof}
본 출원은 2018년 4월 18일에 출원된 한국출원 제10-2018-0045245호, 2018년 4월 18일에 출원된 한국출원 제10-2018-0045246호, 2018년 4월 18일에 출원된 한국출원 제10-2018-0045247호, 및 2018년 4월 18일에 출원된 한국출원 제10-2018-0045248호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 면역원성 조성물 및 백신에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애의 협막 다당류-운반 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 및 백신에 관한 것이다.
스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 폐렴의 주요한 원인균이다. 뿐만 아니라 패혈증, 균혈증, 수막염 등의 침습성 질환을 유발한다. 통계청 [2014년 사망원인통계]에 의하면 2014년 폐렴으로 인한 사망률은 10만 명당 23.7 명으로 2013년 대비 11% 증가한 것으로 나타났으며 2015년 대비 2.8배 증가한 것으로 나타나, 폐렴으로 인산 사망률은 지속적으로 증가하는 추세를 보였다. 또한 2012년 WHO에 따르면 2008년도에 전세계적으로 HIV 음성인 5세 이하 영유아 476,000 명이 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염으로 사망하였으며, 이는 5세 이하 영유아 사망원인 중 5%를 차지하는 것이다. 폐렴구균은 그 외부(세포막)를 둘러싸고 있는 주요 병원성인자 (virulence factor)인 협막 다당류의 구조적, 면역학적 특성에 따라 약 90 가지가 넘는 혈청형 (serotype)으로 분류된다.
스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 질환을 예방하기 위해 1977년 Dr. Robert Austrian에 의해 14가 다당류 백신이 개발되었고 이후 23가 다당류 백신으로 발전하였다. 다가 폐렴구균 다당류 백신은 노인 및 고위험 환자에서 스트렙토코커스 뉴모니애 질환을 예방하는데 있어서 유용한 것으로 입증되었다. 그러나 유아 및 소아는 대부분의 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류에 대해 면역 반응이 잘 일어나지 않는데 이는 T-세포 비의존적 면역 반응 현상 때문이다. 따라서 T-세포 의존적 반응을 일으킬 수 있는 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류와 운반 단백질의 접합 백신이 개발되었다.
7가 스트렙토코커스 뉴모니애 접합체 백신(프리베나(Prevnar)®)은 가장 발생 빈도가 높은 7개 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F 유래의 협막 다당류를 포함한다. 2000년 미국에서 최초로 승인된 이후 유아 및 소아에서 침습성 폐렴구균 질환 및 중이염에 대해 면역원성이 높고 효과적인 것으로 입증되었다. 이후 6개의 혈청형 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A이 추가된 13가 접합체 백신인 프리베나 13(Prevnar 13®)과 3개의 혈청형 1, 5, 7F가 추가된 10가 접합체 백신인 신플로릭스가 차례로 개발되었으며 스트렙토코커스 뉴모니애로 인한 침습성 질환의 수를 추가로 감소시켰다. 그러나, 프리베나, 프리베나 13 및 신플로릭스의 도입으로 인한 혈청형 교체가 나타났으며 전반적으로 백신에 포함된 혈청형으로 인한 질환의 수가 감소하였기 때문에 상대적으로 중요도가 낮았던 비백신 혈청형의 중요성이 오히려 강조되고 있다.
특히, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20에 의해 야기되는 침습성 폐렴구균 질환의 발생률의 증가가 북미와 브라질에서 나타났다 (예를 들어 문헌 [Kendall B. et al., Vaccine. 34:474-478, 2016], [Yildirim I. et al., Pediatr Infect Dis J. 31(10): 1016-1021, 2012] 또는 [
Figure pat00001
J. et al., PLoS ONE 9(10): e111129, 2014] 참조). 또한 캐나다에서 실시된 CASPER 연구에서는 혈청형 19A 외에 혈청형 8, 12F의 incidence 증가가 관찰되기도 하였다(
Figure pat00002
. et al., J Clin Microbiol., 49(4): 1369-75, 2011). 최근 발표된 연구에서도 노르웨이 및 이스라엘에서 프레브나 13 도입 후 비백신 혈청형에 의한 질환이 증가되었다고 보고하였으며, 이러한 비백신 혈청형으로 23A, 23B, 12F, 15A/15B/15C, 31, 33F, 7C, 및 8을 들고 있다(Martin J., Pediatr Infect Dis J., 33(11):e286-90, 2014).
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2, 9N, 17F, 및/또는 20 에 의해 야기되는 폐렴구균 질환의 발생률이 꾸준히 증가하고 있음에도 혈청형 이들에 의한 감염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 연구가 부족한 실정이다.
따라서, 보다 넓은 보호범위를 제공할 수 있도록 다가 다당류 백신에는 포함되었으나 접합 백신에는 포함되지 않은 혈청형을 포함하여 비백신 혈청형에 대한 면역원성 접합체 및 면역원성 조성물에 대한 필요성이 증가하고 있다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 넓은 보호범위를 제공할 수 있는 다(多)가 백신을 제공하자 하는 것이다.
또한 기존에는 접합 백신에 포함되지 않은 새로운 혈청형을 포함하여 면역원성 조성물을 제공하고자 한다.
또한 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 우수한 항체 역가를 갖는 폐렴구균 접합 백신을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 일 구현예는 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 협막 다당류; 및 상기 각각의 협막 다당류에 접합된 운반 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
일 구현예에서 상기 면역원성 조성물이 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 다당류는 활성화되어 분자량 100 내지 400 kDa인 상태에서 상기 운반 단백질에 결합되어 접합체를 형성하거나,
상기 면역원성 조성물이 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 다당류는 활성화되어 분자량 400 내지 900 kDa인 상태에서 상기 담체 단백질에 결합되어 접합체를 형성하거나,
상기 면역원성 조성물이 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 다당류는 활성화되어 분자량 400 내지 800 kDa인 상태에서 상기 담체 단백질에 결합되어 접합체를 형성하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 상기 면역원성 조성물이 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체는 1,000 내지 16,000 kDa의 분자량이거나,
상기 면역원성 조성물이 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체는 300 내지 4,500 kDa의 분자량이거나,
상기 면역원성 조성물이 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체는 1,000 내지 4,000 kDa의 분자량인, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 상기 운반 단백질은 TT(Tetanus toxoid) 또는 CRM197인 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 바람직하게 혈청형 1개만을 포함하는 면역원성 조성물은 운반 단백질로 CRM197을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 상기 면역원성 조성물이 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 면역원성 접합체 내의 운반 단백질에 대한 혈청형 2 협막 다당류의 비(다당류/단백질, W/W)는 0.5 내지 2.0이거나,
상기 면역원성 조성물이 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 면역원성 접합체 내의 운반 단백질에 대한 혈청형 17F 협막 다당류의 비(다당류/단백질, W/W)는 0.5 내지 18이거나,
상기 면역원성 조성물이 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 면역원성 접합체 내의 운반 단백질에 대한 혈청형 20 유래의 협막 다당류의 비(다당류/단백질, W/W)는 1 내지 5인 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 전체 분자량의 20 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재하거나,
상기 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 전체 분자량의 15 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재하거나,
상기 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 전체 분자량의 70 내지 90%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 면역원성 조성물은
상기 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 상기 접합체에 접합된 다당류의 산화도가 2 내지 18이거나,
상기 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 상기 접합체에 접합된 다당류의 산화도가 1 내지 22이거나,
상기 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 상기 접합체에 접합된 다당류의 산화도가 4 내지 16인, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 면역원성 조성물은 15개의 서로 다른 혈청형으로부터 유래된 다당류가 각각의 운반 단백질에 접합되고,
상기 혈청형은 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 및 23F이며,
상기 혈청형은 CRM 197과 접합된, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 면역원성 조성물은 23개의 서로 다른 혈청형으로부터 유래된 다당류가 각각의 운반 단백질에 접합되고,
상기 혈청형은 1, 2, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F이며,
상기 혈청형 중에서 혈청형 3 및 5로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 TT에 접합되고, 혈청형 1, 2, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 CRM197과 접합된, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 면역원성 조성물은 24개의 서로 다른 혈청형으로부터 유래된 다당류가 각각의 운반 단백질에 접합되고,
상기 혈청형은 2, 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F이며,
상기 혈청형 1 및 5로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 TT에 접합되고, 혈청형 2, 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 CRM197과 접합된, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 면역원성 조성물은 생리학상 허용되는 비히클을 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 면역원성 조성물은 백신인 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 (a) 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈청형으로부터 유래된 협막 다당류를 생산하는 세균 세포를 발효하여 용해하는 단계;
(b) 상기 용해된 세포에서 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로부터 유래된 협막 다당류를 정제하는 단계;
(c) 상기 정제된 다당류를 산화제와 반응시켜 활성화시키는 단계; 및
(d) 상기 활성화된 다당류를 운반 단백질과 배합하여, 운반 단백질에 결합된 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 형성시키는 단계를 포함하는,
스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 제조 방법은 (C) 단계 전에 혈청형 2, 및 17F 유래의 협막 다당류의 경우에는, 상기 정제된 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 협막 다당류를 가수분해하여 다당류를 사이징하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 (d) 단계의 배합된 담체 단백질은 시아노보로하이드라이드, 보란-피리딘, 및 보로하이드라이드 교환 수지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 환원제와 반응시켜 상기 활성화된 다당류와 접합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 (c) 단계는 20 내지 25℃의 온도에서 15 내지 20시간 동안 다당류 1 ㎍당 퍼아이오데이트 0.01 ~ 0.22㎍을 반응시키는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 방법으로 수득된, 스트렙토코커스 뉴모니애 감염 예방 또는 치료용 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 협막 다당류; 및
상기 각각의 협막 다당류에 접합된 하나 또는 2 이상의 운반 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 개체에 유효량 투여하여
개체 내에서 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및/또는 33F의 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 및/또는 '및' 이거나 '또는'을 의미한다.
상기 방법은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 혈청형에 대해 감염을 예방 또는 치료할 수 있거나, 하나 이상일 수 있으며, 15개 혈청형에 대한 감염을 예방하거나, 23개 혈청형에 대한 감염을 예방하거나, 24개 혈청형에 대한 감염을 예방할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 협막 다당류; 및
상기 각각의 협막 다당류에 접합된 하나 또는 2 이상의 운반 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체의 폐렴구균 감염의 예방 또는 치료 용도를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에서 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 2의 협막 다당체; 및 상기 협막 다당체와 결합된 담체 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2의 면역원성 접합체를 제공한다.
상기 혈청형 2의 다당체는 활성화되어 분자량 100 내지 400 kDa인 상태에서 상기 담체 단백질에 결합되어 접합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 면역원성 접합체는 1,000 내지 16,000 kDa의 분자량을 가질 수 있으며, 예를 들어 상기 담체 단백질은 CRM197일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 면역원성 접합체 내의 담체 단백질에 대한 혈청형 2 협막 다당체의 비(W/W)는 0.5 내지 2.0일 수 있다.
상기 혈청형 2의 면역원성 접합체의 20 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 다른 실시예에서 산화도가 2 내지 18인 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2의 면역원성 접합체를 제공한다.
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2의 다당체는 당함량 1 ㎍당 퍼아이오데이트 0.02 내지 0.12 ㎍을 첨가하여 산화하여 단백질과 접합하였을 때 접합체의 분자량은 1,000 ~ 16,000 kDa, 분자량 분포는 20 ~ 60%(0.3kd 이하)이며, 그리고 다당체/단백질 비율은 0.5 내지 2.0 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 면역원성 접합체 및 생리학상 허용되는 비히클을 포함하는 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서 상기 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서 (a) 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2 피막 폴리사카라이드를 생산하는 세균 세포를 발효하여 용해하는 단계;
(b) 상기 용해된 세포에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2 협막 다당체를 정제하는 단계;
(c) 정제된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 2 협막 다당체를 가수분해하여 다당체를 사이징하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 사이징된 다당체를 산화제와 반응시켜 상기 다당체를 활성화시키는 단계; 및
(e) 상기 활성화된 다당체를 담체 단백질과 배합하여, 담체 단백질에 결합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2 협막 다당체의 접합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2의 면역원성 접합체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 (e) 단계의 배합된 담체 단백질은 환원제와 반응시켜 상기 활성화된 다당체와 접합체를 형성할 수 있다.
상기 (d) 단계는 20 내지 25℃의 온도에서 15 내지 20시간 동안 다당체 1 ㎍당 퍼아이오데이트 0.02 ~ 0.12 ㎍을 반응시키는 공정을 포함할 수 있다.
상기 (e) 단계의 담체 단백질과 배합되는 활성화된 다당체는 분자량이 100 내지 400 kDa일 수 있다.
상기 담체 단백질이 CRM197인, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2의 면역원성 접합체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 면역원성 접합체는 1,000 내지 16,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
일 실시예에서 상기 담체 단백질대 활성화된 혈청형 2 협막 다당체의 초기 투입비(담체 단백질:다당체)가 0.5 내지 2:1일 수 있다.
다른 실시예에서 면역원성 접합체의 적어도 20 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2의 면역원성 접합체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 방법에 의해 수득된 면역원성 접합체를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 방법에 의해 수득된 면역원성 접합체 및 생리학상 허용가능한 비히클을 포함하는 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.
다른 실시예에서 상기 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공할 수 있다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 9N의 협막 다당체; 및 상기 협막 다당체와 결합된 담체 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N의 면역원성 접합체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 혈청형 9N의 다당체는 활성화되어 분자량 200 내지 700 kDa인 상태에서 상기 담체 단백질에 결합되어 접합체를 형성할 수 있다.
상기 면역원성 접합체는 500 내지 4,000 kDa의 분자량을 가질 수 있으며, 상기 담체 단백질은 CRM197일 수 있다.
상기 면역원성 접합체 내의 담체 단백질에 대한 혈청형 9N 협막 다당체의 비(W/W)는 0.1 내지 5이며, 바람직하게 0.5 ~ 2.5 일 수 있다.
일 실시예에서 상기 면역원성 접합체의 15 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
일 실시예에서 상기 접합체는 산화도가 2 내지 19일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N의 다당체는 당함량 1 ㎍당 퍼아이오데이트 0.02 ~ 0.19 ㎍을 첨가하여 산화하여 단백질과 접합하였을 때 접합체의 분자량은 500 ~ 4,000 kDa, 분자량 분포는 15 ~ 60%(0.3kd 이하), 그리고 다당체/단백질 비율은 0.5 ~ 2.5 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 면역원성 접합체 및 생리학상 허용되는 비히클을 포함하는 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서 상기 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서 (a) 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N 피막 폴리사카라이드를 생산하는 세균 세포를 발효하여 용해하는 단계;
(b) 상기 용해된 세포에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 9N 협막 다당체를 정제하는 단계;
(c) 상기 다당체를 산화제와 반응시켜 활성화시키는 단계; 및
(d) 상기 활성화된 다당체를 담체 단백질과 배합하여, 담체 단백질에 결합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 9N 협막 다당체의 접합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 9N의 면역원성 접합체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 (d) 단계의 배합된 담체 단백질은 환원제와 반응시켜 상기 활성화된 다당체와 접합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 9N의 면역원성 접합체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 (c) 단계는 20 내지 25℃의 온도에서 15 내지 20시간 동안 다당체 1 ㎍당 퍼아이오데이트 0.02 ~ 0.19㎍을 반응하는 공정을 포함할 수 있다.
상기 (c) 단계의 산화제와 반응하는 다당체는 400 내지 900kDa의 분자량을 가질 수 있다.
상기 (d) 단계의 담체 단백질과 배합되는 활성화된 다당체는 200-700kDa의 분자량을 가질 수 있다.
상기 면역원성 접합체는 500 내지 4,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
담체 단백질대 활성화된 혈청형 9N 협막 다당체의 초기 투입비(담체 단백질:다당체)가 0.5 내지 2.5:1일 수 있다.
일 실시예에서 면역원성 접합체의 적어도 15 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 방법에 의해 수득된 면역원성 접합체를 제공할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 방법에 의해 수득된 면역원성 접합체 및 생리학상 허용가능한 비히클을 포함하는 면역원성 조성물을 제공할 수 있다. 다른 실시예에서 상기 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 17F의 협막 다당체; 및 상기 협막 다당체와 결합된 담체 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F의 면역원성 접합체를 제공한다.
상기 혈청형 17F의 다당체는 활성화되어 분자량 400 내지 900 kDa인 상태에서 상기 담체 단백질에 결합되어 접합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 면역원성 접합체는 300 내지 4,500 kDa의 분자량을 가질 수 있으며 예를 들어, 담체 단백질은 CRM197일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 면역원성 접합체 내의 담체 단백질에 대한 혈청형 17F 협막 다당체의 비(W/W)는 0.5 내지 18일 수 있다.
상기 혈청형 17F의 면역원성 접합체의 15 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 다른 실시예에서 산화도가 1 내지 22인 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F의 면역원성 접합체를 제공한다.
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F의 다당체 당함량 1 ㎍당 퍼아이오데이트 0.01 내지 0.22 ㎍을 첨가하여 산화하여 단백질과 접합하였을 때 접합체의 분자량은 300 내지 4,500 kDa, 분자량 분포는 15 ~ 60%(0.3kd 이하)이며, 다당체/단백질 비율은 0.5 내지 18 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 면역원성 접합체 및 생리학상 허용되는 비히클을 포함하는 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서 상기 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서 (a) 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F 피막 폴리사카라이드를 생산하는 세균 세포를 발효하여 용해하는 단계;
(b) 상기 용해된 세포에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 17F 협막 다당체를 정제하는 단계;
(c) 정제된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 17F 협막 다당체를 가수분해하여 다당체를 사이징하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 사이징된 다당체를 산화제와 반응시켜 상기 다당체를 활성화시키는 단계; 및
(e) 상기 활성화된 다당체를 담체 단백질과 배합하여, 담체 단백질에 결합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 17F 협막 다당체의 접합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 17F의 면역원성 접합체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 (e) 단계의 배합된 담체 단백질은 환원제와 반응시켜 상기 활성화된 다당체와 접합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 17F의 면역원성 접합체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 (d) 단계는 20 내지 25℃의 온도에서 15 내지 20시간 동안 다당체 1 ㎍당 퍼아이오데이트 0.01 ~ 0.22㎍을 반응시키는 공정을 포함할 수 있다.
상기 (e) 단계의 담체 단백질과 배합되는 활성화된 다당체는 분자량이 400 내지 900 kDa일 수 있다.
상기 면역원성 접합체는 300 내지 4,500kDa의 분자량을 가질 수 있다.
상기 담체 단백질대 활성화된 혈청형 17F 협막 다당체의 초기 투입비(담체 단백질:다당체)가 1:1일 수 있다.
일 실시예에서 면역원성 접합체 분자량의 적어도 15 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 방법에 의해 수득된 면역원성 접합체를 제공할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 방법에 의해 수득된 면역원성 접합체 및 생리학상 허용가능한 비히클을 포함하는 면역원성 조성물을 제공할 수 있다. 다른 실시예에서 상기 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 20의 협막 다당체; 및 상기 협막 다당체와 결합된 담체 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20의 면역원성 접합체를 제공한다.
상기 혈청형 20의 다당체는 활성화되어 분자량 400 내지 800 kDa인 상태에서 상기 담체 단백질에 결합되어 접합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 면역원성 접합체는 1,000 내지 4,000 kDa의 분자량을 가질 수 있으며, 예를 들어 상기 담체 단백질은 CRM197일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 면역원성 접합체 내의 담체 단백질에 대한 혈청형 20 협막 다당체의 비(W/W)는 1 내지 5일 수 있다.
상기 혈청형 20의 면역원성 접합체의 70 내지 90%는 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 다른 실시예에서 산화도가 4 내지 16인 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20의 면역원성 접합체를 제공한다.
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20 다당체 당함량 1㎍당 퍼아이오데이트 0.01 내지 0.04 ㎍을 첨가하여 산화하여 단백질과 접합하였을 때 접합체의 분자량은 1,000 ~ 4,000 kDa, 분자량 분포는 70 ~ 90%(0.3kd 이하)이며, 그리고 다당체/단백질 비율은 1 내지 5 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 면역원성 접합체 및 생리학상 허용되는 비히클을 포함하는 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서 상기 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서 (a) 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20 피막 폴리사카라이드를 생산하는 세균 세포를 발효하여 용해하는 단계;
(b) 상기 용해된 세포에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 20 협막 다당체를 정제하는 단계;
(c) 상기 다당체를 산화제와 반응시켜 활성화시키는 단계; 및
(d) 상기 활성화된 다당체를 담체 단백질과 배합하여, 담체 단백질에 결합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 20 협막 다당체의 접합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 20의 면역원성 접합체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 (d) 단계의 배합된 담체 단백질은 환원제와 반응시켜 상기 활성화된 다당체와 접합체를 형성할 수 있다.
상기 (c) 단계는 20 내지 25℃의 온도에서 15 내지 20시간 동안 다당체 1 ㎍당 퍼아이오데이트 0.01 ~ 0.04 ㎍을 반응시키는 공정을 포함할 수 있다.
일 실시예에서 상기 (d) 단계의 담체 단백질과 배합되는 활성화된 다당체는 분자량이 400 내지 800 kDa일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 방법으로 본 발명의 면역원성 접합체는 1,000 내지 4,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
일 실시예에서 담체 단백질대 활성화된 혈청형 20 협막 다당체의 초기 투입비(담체 단백질:다당체)가 1:1일 수 있다.
일 실시예에서 면역원성 접합체의 적어도 70 내지 90%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 방법에 의해 수득된 면역원성 접합체를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 방법에 의해 수득된 면역원성 접합체 및 생리학상 허용가능한 비히클을 포함하는 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.
다른 실시예에서 상기 면역원성 조성물을 포함하는 백신을 제공할 수 있다.
[용어의 정의]
본 명세서에서 사용된 용어 "다당류"는 스트렙토코커스 뉴모니애의 혈청형(serotype)으로부터 유래한 협막 다당류이며, 일 예로 상기 다당류는, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 중, 1종 내지 24종의 혈청형에서 유래하는 협막 다당류를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로 이루어진 군에서 선택된 1종 내지 24종 중 어느 하나인, 협막 다당류를 포함할 수 있다. 일 구현예에서 상기 협막 다당류는 혈청형 2, 9N, 17F, 및/또는 20에서 유래하는 협막 다당류를 포함하여, 1종 내지 24종 중 하나 이상의 협막 다당류일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "면역원성 접합체" 또는 "접합체"라는 용어는 운반 단백질에 공유결합으로 접합된 협막 다당류를 지칭한다. 또한 다당류-단백질 접합체로도 칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성화된 다당류"는 산화처리를 거친 협막 다당류를 일컫는 것으로 이해되며, 협막 다당류가 운반 단백질과 접합하기 전 상태의 다당류를 의미하는 것을 이해될 수 있다. 상기 산화처리를 거친 협막 다당류는 동결건조 단계를 추가로 거칠 수 있으며, 이 경우 동결건조 후 단백질과 접합하기 전 상태의 다당류를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 백분율 농도는 중량 대 부피(w/v) 또는 중량 대 중량(w/w)이다.
달리 특정되어 있지 않은 한, 협막 다당류 또는 협막 다당류-운반 단백질 접합체의 "분자량"은 다각도 레이저 광 산란 검출기 (MALLS)와 조합된 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 계산된 분자량을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
용어 "산화도" (DO)는 정제된 또는 사이징된 다당류가 산화제로 활성화되었을 때 생성된 알데히드기 당 다당류 반복 단위의 개수를 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 다당류의 산화도를 결정할 수 있다.
본 명세서 내에서 사용된 "%"는 달리 언급이 없는 한, 중량%를 나타낸다. 예를 들어 본 명세서에서 사용된 유리 다당류의 %는 투입된 다당류 전체 중량 대비 다당류-단백질 접합체를 형성하지 못한 다당류의 중량%를 의미하는 것으로 이해할 수 있다.
[발명의 구체적인 내용]
1. 면역원성 조성물
본 발명의 면역원성 조성물은 운반체(carrier), 바람직하게 운반 단백질(carrier protein)에 공유결합으로 접합된 협막 다당류 항원을 포함하는 면역원성 접합체를 포함할 수 있다.
상기 면역원성 접합체의 협막 다당류 항원은 스트렙토코커스 뉴모니애의 혈청형(들)으로부터 유래된다.
바람직하게, 본 발명의 일 구현예에서 상기 면역원성 조성물은 1개 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애의 협막 다당류를 가질 수 있다. 적어도 1가("v", 결합가)의 협막 사카라이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 2, 9N, 17F, 및/또는 20 혈청형이 존재할 수 있다. 면역원성 조성물에 포함되는 다당류는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로 이루어진 군에서 선택된 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 및/또는 24개의 상이한 혈청형이 존재한다. 상기 협막 사카라이드를 운반 단백질에 접합시켜 본 발명에서 하기에 개시하는 바와 같은 면역원성 접합체를 형성시킨다.
바람직한 실시양태에서, 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 사카라이드는 운반 단백질에 개별적으로 접합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 협막 사카라이드는 운반 단백질에 직접 결합될 수 있다.
1.1 운반 단백질
본 발명의 면역원성 접합체는 사카라이드가 공유결합으로 연결된 운반체(carrier)이며, 바람직하게 운반 단백질로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 운반 단백질은 carrier protein 또는 protein carrier로 이해될 수 있다.
상기 운반 단백질은 비독성 및 비-반응유발성이며, 충분한 양 및 순도로 수득가능한 단백질이 바람직하다. 운반 단백질은 표준 접합 방법에 따라 처리될 수 있어야 한다. 한 실시양태에서, 각 협막 다당류가 같은 운반 단백질에 접합될 수 있고, 다른 실시양태에서, 협막 다당류가 2개 이상의 운반 단백질에 접합될 수 있다.
하나의 실시양태에서, CRM197이 운반 단백질로서 사용될 수 있다. CRM197 단백질은 디프테리아 독소의 비독성 변이체로, 면역학적으로는 디프테리아 독소와 구별할 수 없다. CRM197은 카사미노산 및 효모 추출물 기재 배지에서 성장된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 생산된다. 전형적으로, CRM197은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피의 조합을 거쳐 정제될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 무독화된 파상풍 독소인 TT(Tetanus toxoid)가 운반 단백질로서 사용될 수 있다.
다른 적합한 운반 단백질로는 추가의 불활성화된 박테리아 독소, 예를 들어, DT (디프테리아 톡소이드), CRM176, CRM228, CRM45, CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 또는 CRM107 등이 사용될 수 있다.
바람직하게 상기 운반체 단백질은 CRM197 또는 TT(파상풍 독소) 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 운반체 단백질 CRM197 또는 TT(파상풍 독소)는 본 발명의 일 실시예에 따른 협막 사카라이드와 공유 결합으로 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 운반체 단백질은 면역원성 조성물에 2종 이상 혼합될 수 있다. 일 구현예에서, 혈청형 2, 9N, 17F, 또는 20으로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 CRM197에 접합될 수 있다.
일 구현예에서, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 및 23F로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 CRM197에 접합될 수 있다.
일 구현예에서, 혈청형 3 및 5로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 TT에 접합되고, 혈청형 1, 2, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 CRM197에 접합될 수 있다.
일 구현예에서, 혈청형 1 및 5로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 TT에 접합되고, 혈청형 2, 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 CRM197에 접합될 수 있다.
1.2 협막 다당류
본 명세서 전체를 통해 "다당류"란 용어는 대부분의 실시양태에서, 스트렙토코커스 뉴모니애의 협막 다당류이다.
본 발명의 협막 다당류는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 정제 절차를 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0286838, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, 및 미국 등록특허 US 5,847,112 참조). 또한, 합성 프로토콜을 사용하여 그를 생산할 수 있다.
본 발명에서, 협막 다당류를 예를 들어 스트렙토코커스 뉴모니애의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로부터 선택하여 제조할 수 있다. 상기 혈청형들 중 하나 이상의 혈청형을 이용하여 본 발명의 협막 다당류를 제조할 수 있다.
혈청형 1, 4, 6B, 7F 및 11A는 100 내지 2000 kDa; 200 내지 1700 kDa; 300 내지 1500 kDa; 400 내지 1400 kDa; 또는 600 내지 1300 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
혈청형 3, 10A, 및 19F는 10 내지 2000 kDa; 50 내지 1700 kDa; 200 내지 1500 kDa; 400 내지 1200 kDa; 또는 500 내지 1000 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
혈청형 5, 6A, 8, 18C, 및 23F는 100 내지 2000 kDa; 200 내지 1700 kDa; 300 내지 1500 kDa; 400 내지 1400 kDa; 또는 200 내지 1000 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
혈청형 9V 및 15B은 100 내지 4000 kDa; 200 내지 3500 kDa; 300 내지 3000 kDa; 400 내지 2800 kDa; 500 내지 2600 kDa; 또는 600 내지 2500 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
혈청형 12F는 100 내지 4000 kDa; 300 내지 3500 kDa; 500 내지 3000 kDa; 700 내지 2800 kDa; 800 내지 2600 kDa; 또는 1000 내지 2500 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
혈청형 14는 500 내지 4000 kDa; 800 내지 3800 kDa; 1000 내지 3500 kDa; 1200 내지 3200 kDa; 또는 1500 내지 3000 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
혈청형 19A는 10 내지 1500 kDa; 50 내지 1000 kDa; 70 내지 800 kDa; 80 내지 700 kDa; 90 내지 650 kDa; 또는 100 내지 600 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
혈청형 22F는 100 내지 4000 kDa; 200 내지 3900 kDa; 300 내지 3800 kDa; 400 내지 3700 kDa; 또는 500 내지 3500 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
혈청형 33F는 100 내지 4000 kDa; 200 내지 3500 kDa; 300 내지 3000 kDa; 400 내지 2500 kDa; 또는 500 내지 2000 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류는 통상적인 정제 과정 동안 크기가 약간 감소하게 될 수 있다. 협막 다당류는 각 혈청형에 따른 분자량 범위를 만족한다. 추가로, 본 발명에 개시되는 바와 같이, 기계적 또는 화학적 크기분류가 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 다당류를 아세트산, 염산 등과 같은 산을 이용한 화학적 가수분해 방법으로 접합 전에 크기분류(sizing)를 수행할 수 있다. 화학적 가수분해를 예를 들어, 아세트산을 사용하여 수행할 수 있다. 기계적 크기분류를 예를 들어, 고압 균질화 전단을 사용하여 수행할 수 있으나, 바람직하게는 화학적 가수분해를 이용할 수 있다. 상기 언급한 또는 하기 언급될 분자량 범위는 정제 후 활성화된, 접합 전의 다당류의 분자량을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
1.2.1 폐렴구균 다당류 혈청형 2
혈청형 2 사카라이드를 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 단리 과정을 사용하여 세균으로부터 직접 수득할 수 있다(상기 단리 방법은 업계에서 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다.). 또한, 상기 사카라이드를 합성 프로토콜을 사용하여 생성시킬 수 있다.
혈청형 2 스트렙토코커스 뉴모니애 균주를 확립된 배양 콜렉션(예를 들어, 스트렙토코커스 기준 실험실(미국 조지아주 아틀란타 소재의 질병통제예방 센터)) 또는 임상 시편으로부터 수득할 수 있다.
상기 세균 세포를 배지 중에서, 바람직하게는 대두 기재 배지에서 증식시킨다. 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2 협막 다당류를 생산하는 세균 세포의 발효에 이어서, 상기 세균 세포를 용해시켜 세포 용해물을 생성시킨다. 이어서 혈청형 2 다당류를 당해 분야에 공지된 정제 기법을 사용하여, 예를 들어 원심분리, 심층 여과, 침전, 한외여과, 활성탄에 의한 처리, 투석여과 및/또는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 상기 세포 용해물로부터 단리할 수 있다(상기 단리 방법은 업계에서 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다.). 이어서 정제된 혈청형 2 협막 다당류를 면역원성 접합체의 제조에 사용할 수 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애 용해물로부터 혈청형 2 다당류의 정제 및 임의로 상기 정제된 다당류의 크기분류에 의해 수득된 단리된 혈청형 2 협막 다당류를 상이한 매개변수, 예를 들어 상기 혈청형 2 협막 다당류의 분자량(MW)에 의해 특성화시킬 수 있다. 바람직하게, 유리한 여과성 특성 및/또는 수율을 갖는 접합체를 생성시키기 위해서, 상기 다당류의 표적 분자량 범위로의 크기 분류를 운반 단백질에의 접합 전에 수행한다. 유리하게, 상기 정제된 혈청형 2 다당류의 크기를 화학적 가수분해에 의해 감소시킨다. 상기 정제된 혈청형 2 협막 다당류를 염산과 반응시켜 가수분해된 혈청형 2 다당류를 생성시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 접합 전 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2로부터 정제된 다당류는 5 내지 5,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 50 내지 1,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 70 내지 900 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 100 내지 800 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서 50 내지 500 kDa; 60 내지 490 kDa; 70 내지 480 kDa; 80 내지 470 kDa; 90 내지 450 kDa; 100 내지 400 kDa; 110 내지 390 kDa; 120 내지 380 kDa; 130 내지 370 kDa; 140 내지 368 kDa의 분자량을 가질 수 있으며,
또는 100 내지 400 kDa; 110 내지 390 kDa; 120 내지 380 kDa; 130 내지 370 kDa; 140 내지 368 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또한, 유사한 목적하는 분자량 범위를 갖는다. 상기 범위들 중 임의의 범위내의 모든 정수는 실시양태로서 간주된다.
다당류는 통상적인 정제 과정 동안 크기가 약간 감소하게 될 수 있다. 추가로, 본 발명에 개시되는 바와 같이, 다당류에 접합 전에 크기분류 기법을 가할 수도 있다. 상기 언급한 분자량 범위는 접합 전(예를 들어, 정제 후, 가수분해 및 활성 후) 최종 크기분류 단계 후의 정제된 다당류를 지칭한다.
1.2.1 폐렴구균 다당류 혈청형 9N
혈청형 9N 사카라이드를 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 단리 과정을 사용하여 세균으로부터 직접 수득할 수 있다(상기 단리 방법은 업계에서 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다.). 또한, 상기 사카라이드를 합성 프로토콜을 사용하여 생성시킬 수 있다.
혈청형 9N 스트렙토코커스 뉴모니애 균주를 확립된 배양 콜렉션(예를 들어, 스트렙토코커스 기준 실험실(미국 조지아주 아틀란타 소재의 질병통제예방 센터)) 또는 임상 시편으로부터 수득할 수 있다.
상기 세균 세포를 배지 중에서, 바람직하게는 대두 기재 배지에서 증식시킨다. 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N 협막 다당류를 생산하는 세균 세포의 발효에 이어서, 상기 세균 세포를 용해시켜 세포 용해물을 생성시킨다. 이어서 혈청형 9N 다당류를 당해 분야에 공지된 정제 기법을 사용하여, 예를 들어 원심분리, 심층 여과, 침전, 한외여과, 활성탄에 의한 처리, 투석여과 및/또는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 상기 세포 용해물로부터 단리할 수 있다(상기 단리 방법은 업계에서 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다.). 이어서 정제된 혈청형 9N 협막 다당류를 면역원성 접합체의 제조에 사용할 수 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애 용해물로부터 혈청형 9N 다당류의 정제 및 임의로 상기 정제된 다당류의 크기분류에 의해 수득된 단리된 혈청형 9N 협막 다당류를 상이한 매개변수, 예를 들어 상기 혈청형 9N 협막 다당류의 분자량(MW)에 의해 특성화시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 접합 전 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N로부터 정제된 다당류는 5 내지 5,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 50 내지 1,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 70 내지 900 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 100 내지 800 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서 접합 전 정제된 혈청형 9N 협막 다당류는 활성화되어 50 내지 800 kDa; 80 내지 780 kDa; 100 내지 770 kDa; 120 내지 760 kDa; 140 내지 750 kDa; 150 내지 740 kDa; 160 내지 730 kDa; 170 내지 735 kDa; 180 내지 720 kDa; 190 내지 710 kDa; 또는 200 내지 700 kDa 의 분자량을 가질 수 있으며, 또는 200 내지 700 kDa; 220 내지 690 kDa; 240 내지 680 kDa; 260 내지 670kDa; 또는 270 내지 660 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또한, 유사한 목적하는 분자량 범위를 갖는다. 상기 범위들 중 임의의 범위내의 모든 정수는 실시양태로서 간주된다.
다당류는 통상적인 정제 과정 동안 크기가 약간 감소하게 될 수 있다. 추가로, 본 발명에 개시되는 바와 같이, 다당류에 접합 전에 크기분류 기법을 가할 수도 있다. 상기 언급한 분자량 범위는 접합 전(예를 들어 정제 후, 가수분해 및 활성 후) 최종 크기분류 단계 후의 정제된 다당류를 지칭한다.
1.2.1 폐렴구균 다당류 혈청형 17F
혈청형 17F 사카라이드를 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 단리 과정을 사용하여 세균으로부터 직접 수득할 수 있다(예를 들어, 미국특허 출원공개 2006/0228380 등에 개시된 방법들을 참조). 또한, 상기 사카라이드를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 합성 프로토콜을 사용하여 생성시킬 수 있다.
혈청형 17F 스트렙토코커스 뉴모니애 균주를 확립된 배양 콜렉션(예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재)(예를 들어, 기탁 균주 ATCC6317번) 또는 스트렙토코커스 기준 실험실 (미국 조지아주 아틀란타 소재의 질병통제예방 센터)) 또는 임상 시편으로부터 수득할 수 있다.
상기 세균 세포를 배지 중에서, 바람직하게는 대두 기재 배지에서 증식시킨다. 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F 협막 다당류를 생산하는 세균 세포의 발효에 이어서, 상기 세균 세포를 용해시켜 세포 용해물을 생성시킨다. 이어서 혈청형 17F 다당류를 당해 분야에 공지된 정제 기법을 사용하여, 예를 들어 원심분리, 심층 여과, 침전, 한외여과, 활성탄에 의한 처리, 투석여과 및/또는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 상기 세포 용해물로부터 단리할 수 있다(상기 단리 방법은 업계에서 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다.). 이어서 정제된 혈청형 17F 협막 다당류를 면역원성 접합체의 제조에 사용할 수 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애 용해물로부터 혈청형 17F 다당류의 정제 및 임의로 상기 정제된 다당류의 크기분류에 의해 수득된 단리된 혈청형 17F 협막 다당류를 상이한 매개변수, 예를 들어 상기 혈청형 17F 협막 다당류의 분자량(MW), 상기 혈청형 17F 협막 다당류 1 mM당 아세테이트의 mM 의해 특성화시킬 수 있다.
바람직하게, 유리한 여과성 특성 및/또는 수율을 갖는 17F 접합체를 생성시키기 위해서, 상기 다당류의 표적 분자량 범위로의 크기 분류를 운반 단백질에의 접합 전에 수행한다. 유리하게, 상기 정제된 혈청형 17F 다당류의 크기를, 상기 다당류 구조의 중요한 특징, 예를 들어 O-아세틸기의 존재를 보존하면서 감소시킨다. 바람직하게, 상기 정제된 혈청형 17F 다당류의 크기를 화학적 가수분해에 의해 감소시킨다.
바람직한 실시양태에서, 상기 정제된 혈청형 17F 협막 다당류를 염산과 반응시켜 가수분해된 혈청형 17F 다당류를 생성시킨다.
혈청형 17F 다당류는 O-아세틸화되며 O-아세틸화의 총량은 다당류 반복 단위당 약 0.8 O-아세틸기이다. 상기 다당류의 O-아세틸화 정도를 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 양성자 NMR에 의해 측정할 수 있다. 또 다른 통상적으로 사용되는 방법은 문헌에 개시되어 있다. 바람직하게, 상기 O-아세틸기의 존재는 이온-HPLC 분석에 의해 측정된다.
정제되거나, 단리되거나 활성화된 혈청형 17F 협막 다당류 또는 혈청형 17F 다당류-운반 단백질 접합체 중의 O-아세틸의 존재를 상기 다당류 1 mM당 아세테이트의 mM수로서 또는 다당류 반복 단위당 O-아세틸기의 수로서 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 혈청형 17F 협막 다당류는 상기 혈청형 17F 협막 다당류 1 mM 당 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8 mM의 아세테이트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 혈청형 17F 협막 다당류는 상기 혈청형 17F 협막 다당류 1 mM 당 적어도 0.4, 0.5, 0.6 또는 0.7 mM의 아세테이트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 혈청형 17F 협막 다당류는 상기 혈청형 17F 협막 다당류 1 mM 당 적어도 0.5 mM의 아세테이트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 혈청형 17F 협막 다당류는 상기 혈청형 17F 협막 다당류 1 mM 당 0.6 mM이상의 아세테이트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 접합 전 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F부터 정제된 다당류는 100 내지 5,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 200 내지 4,500 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 일 실시태양에서, 접합 전 정제된 혈청형 17F 협막 다당류는 활성화되어 500 내지 1400kDa; 490 내지 1,350 kDa; 480 내지 1,300kDa; 470 내지 1,250 kDa; 460 내지 1,200 kDa; 450 내지 1,150 kDa; 440 내지 1,100 kDa; 430 내지 1,050 kDa; 420 내지 1,000 kDa; 410 내지 950 kDa; 또는 400 내지 900 kDa의 분자량을 가질 수 있으며,
또는 400 내지 900 kDa; 420 내지 890kDa; 440 내지 880 kDa; 460 내지 870 kDa; 480 내지 860 kDa; 500 내지 850 kDa; 520 내지 840 kDa; 또는 540 내지 830 kDa 의 분자량을 가질 수 있다.
다당류는 통상적인 정제 과정 동안 크기가 약간 감소하게 될 수 있다. 추가로, 본 발명에 개시되는 바와 같이, 다당류에 접합 전에 크기분류 기법을 가할 수도 있다. 상기 언급한 분자량 범위는 접합 전(예를 들어, 정제 후, 가수분해 및 활성 후) 최종 크기분류 단계 후의 정제된 다당류를 지칭한다.
1.2.1 폐렴구균 다당류 혈청형 20
혈청형 20 사카라이드를 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 단리 과정을 사용하여 세균으로부터 직접 수득할 수 있다(예를 들어, 미국특허 출원공개 2006/0228380 등에 개시된 방법들을 참조). 또한, 상기 사카라이드를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 합성 프로토콜을 사용하여 생성시킬 수 있다.
혈청형 20 스트렙토코커스 뉴모니애 균주를 확립된 배양 콜렉션(예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재)(예를 들어, 기탁 균주 ATCC6320번) 또는 스트렙토코커스 기준 실험실 (미국 조지아주 아틀란타 소재의 질병통제예방 센터)) 또는 임상 시편으로부터 수득할 수 있다.
상기 세균 세포를 배지 중에서, 바람직하게는 대두 기재 배지에서 증식시킨다. 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20 협막 다당류를 생산하는 세균 세포의 발효에 이어서, 상기 세균 세포를 용해시켜 세포 용해물을 생성시킨다. 이어서 혈청형 20 다당류를 당해 분야에 공지된 정제 기법을 사용하여, 예를 들어 원심분리, 심층 여과, 침전, 한외여과, 활성탄에 의한 처리, 투석여과 및/또는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 상기 세포 용해물로부터 단리할 수 있다(상기 단리 방법은 업계에서 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다.). 이어서 정제된 혈청형 20 협막 다당류를 면역원성 접합체의 제조에 사용할 수 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애 용해물로부터 혈청형 20 다당류의 정제 및 임의로 상기 정제된 다당류의 크기분류에 의해 수득된 단리된 혈청형 20 협막 다당류를 상이한 매개변수, 예를 들어 상기 혈청형 20 협막 다당류의 분자량(MW), 상기 혈청형 20 협막 다당류 1 mM당 아세테이트의 mM및 의해 특성화시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 접합 전 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20으로부터 정제된 다당류는 5 내지 5,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 50 내지 1,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 70 내지 900 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 100 내지 800 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 200 내지 800 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 협막 다당류는 400 내지 800 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 일 실시태양에서, 접합 전 정제된 혈청형 20 협막 다당류는 500 내지 1400kDa; 490 내지 1,350 kDa; 480 내지 1,300kDa; 470 내지 1,250 kDa; 460 내지 1,200 kDa; 450 내지 1,150 kDa; 440 내지 1,100 kDa; 430 내지 1,050 kDa; 420 내지 1,000 kDa; 415 내지 950 kDa; 410 내지 900 kDa; 또는 410 내지 800 kDa의 분자량을 가질 수 있으며, 또는 400 내지 800 kDa; 410 내지 790kDa; 420 내지 780 kDa; 430 내지 770 kDa; 또는 440 내지 760 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 또한, 유사한 목적하는 분자량 범위를 갖는다. 상기 범위들 중 임의의 범위내의 모든 정수는 실시양태로서 간주된다.
다당류는 통상적인 정제 과정 동안 크기가 약간 감소하게 될 수 있다. 추가로, 본 발명에 개시되는 바와 같이, 다당류에 접합 전에 크기분류 기법을 가할 수도 있다. 상기 언급한 분자량 범위는 접합 전(예를 들어, 정제 후, 가수분해 및 활성 후) 최종 크기분류 단계 후의 정제된 다당류를 지칭한다.
혈청형 20 다당류는 O-아세틸화될 수 있고, O-아세틸화의 총량은 다당류 반복 단위당 약 2.0 내지 2.2 O-아세틸기이다. 상기 다당류의 O-아세틸화 정도를 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 양성자 NMR에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게, 상기 O-아세틸기의 존재는 이온-HPLC 분석에 의해 측정된다.
정제되거나, 단리되거나 활성화된 혈청형 20 협막 다당류 또는 혈청형 20 다당류-운반 단백질 접합체 중의 O-아세틸의 존재를 상기 다당류 1 mM당 아세테이트의 mM수로서 또는 다당류 반복 단위당 O-아세틸기의 수로서 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 혈청형 20 협막 다당류는 상기 혈청형 20 협막 다당류 1 mM 당 적어도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0 또는 2.2 mM의 아세테이트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 혈청형 20 협막 다당류는 상기 혈청형 20 협막 다당류 1 mM당 적어도 1.4, 1.6, 1.8 또는 2.0 mM의 아세테이트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 혈청형 20 협막 다당류는 상기 혈청형 20 협막 다당류 1 mM 당 적어도 1.6 mM의 아세테이트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 혈청형 20 협막 다당류는 상기 혈청형 20 협막 다당류 1 mM 당 1.8 mM 이상의 아세테이트를 포함한다.
1.3 협막 다당류-운반 단백질 접합체
정제된 다당류를 화학적으로 활성화시킴으로써 다당류가 운반 단백질과 반응할 수 있도록 만든다. 활성화된 사카라이드를 각각 운반 단백질에 접합시켜 다당류-단백질 접합체를 형성한다. 다당류의 화학적 활성화, 및 후속하여 운반 단백질에의 접합은 본 발명에 개시된 활성화 및 접합 방법에 의해 성취될 수 있다.
(1) 접합 방법 일반
한 실시양태에서, 접합 방법은 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)를 사용하여 사카라이드를 활성화시킴으로써 시아네이트 에스테르를 형성하는 것에 의존할 수 있다. 따라서, 활성화된 다당류는 운반 단백질 상의 아미노 기에 직접 커플링될 수 있거나, 또는 스페이서 (링커) 기를 통해 커플링될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 시스타민 또는 시스테아민일 수 있는데, 이를 통해 티올화된 다당류가 형성되며, 이는 (예를 들어, GMBS를 사용한) 말레이미드-활성화된 운반 단백질과의, 또는 (예를 들어, 아이오도아세트이미드 [예를 들어, 에틸 아이오도아세트이미드 HCl] 또는 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 또는 SIAB 또는 SIA 또는 SBAP를 사용한) 할로아세틸화된 운반 단백질과의 반응 후 수득되는 티오에테르 결합을 통해 운반체에 커플링될 수 있다. 바람직하게, (임의로 CDAP 화학물질에 의해 제조되는) 시아네이트 에스테르는 헥산 디아민 또는 아디프산 디히드라지드 (ADH)와 커플링되고, 아미노-유도체화된 사카라이드는 카르보디이미드 (예를 들어, EDAC 또는 EDC) 화학 물질을 사용하여 단백질 운반체 상의 카르복실 기를 통해 운반 단백질에 접합된다.
접합을 위한 다른 적합한 기법은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시 숙신이미드, S--NHS, EDC, TSTU를 사용한다. 국제 특허 출원 공개 공보 번호 WO 98/42721에 다수가 기술되어 있다. 접합은 사카라이드의 유리 히드록실 기와 CDI의 반응에 이어서, 단백질과의 반응에 의해 카르바메이트 결합을 형성하는 것에 의해 형성될 수 있는 카르보닐 링커를 포함할 수 있다. 이는 아노머 말단의 1차 히드록실 기로의 환원, 1차 히드록실 기의 임의적인 보호/탈보호, 1차 히드록실 기와 CDI와의 반응을 통한 CDI 카르바메이트 중간체 형성, 및 CDI 카르바메이트 중간체와 단백질 상의 아미노 기의 커플링을 포함할 수 있다.
(2) 환원성 아민화
바람직한 실시양태에서, 스트렙토코커스 뉴모니애의 협막 다당류는 환원성 아민화에 의해 운반 단백질에 접합된다. 환원성 아민화는 산화제와의 반응에 의해 다당류가 활성화되는 것 및 활성화된 다당류가 환원에 의해 운반 단백질에 접합되는 것을 수반한다.
환원적 아민화는 접합체를 형성시키기 위해서 2개 단계, (1) 산화제와의 반응에 의한 상기 다당류의 활성화, (2) 환원적 아민화에 의한, 활성화된 다당류 및 운반 단백질의 접합을 수반한다. 바람직하게 산화제와의 반응 전에, 상기 다당류를 아세트산 또는 염산을 사용한 화학적 가수분해를 통해 임의로 크기분류(sizing)를 수행할 수 있다.
(2-1) 산화제와의 반응에 의한 다당류의 활성화
바람직한 실시양태에서, 산화제는 퍼아이오데이트이다. 퍼아이오데이트는 무작위적으로 탄수화물의 인접한 히드록실 기를 산화시켜 반응성 알데히드 기를 형성시키고, C-C 결합의 절단을 야기한다. '퍼아이오데이트'라는 용어는 퍼아이오데이트 및 퍼아이오드산 둘 다를 포함한다. 이 용어는 메타퍼아이오데이트 (IO4 -) 및 오르토퍼아이오데이트 (IO6 5-) 둘 다를 또한 포함한다. '퍼아이오데이트'라는 용어는 나트륨 퍼아이오데이트 및 칼륨 퍼아이오데이트를 포함하는 퍼아이오데이트의 다양한 염을 또한 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 사카라이드를 나트륨 메타퍼아이오데이트의 존재 하에서 산화시킬 수 있다.
상기 퍼아이오데이트는 다당류 1 ㎍ 당 약 0.02 내지 0.3㎍, 바람직하게 0.015 내지 0.25㎍, 더 바람직하게 0.01 내지 0.22㎍ 포함할 수 있다.
상기 범위에서 다당류의 활성화가 우수하며, 상기 범위를 초과하면 투입량 대비 효율이 저하될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 활성화된 협막 사카라이드가 정제된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC), 투석 또는 한외여과/투석여과에 따라 활성화된 협막 사카라이드가 정제된다. 바람직하게는, 활성화된 사카라이드를 한외여과 장치를 사용하여 한외여과/투석여과에 의해 정제한다.
상기 활성화된 사카라이드를 산화도와 분자량으로 특성화할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 활성화된 혈청형 2의 다당류의 산화도는 0.5 내지 25, 0.6 내지 23, 0.8 내지 21, 1 내지 20.8, 1.1 내지 20.5, 1.2 내지 20.3, 1.3 내지 20, 1.4 내지 19.5, 1.5 내지 19.3, 1.6 내지 19.1, 1.7 내지 19, 1.8 내지 18.8, 1.9 내지 18.5, 또는 2 내지 18 일 수 있다.
상기 산화도 범위에서 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 활성화된 혈청형 9N의 다당류의 산화도는 0.5 내지 25, 0.6 내지 23, 0.8 내지 21, 1 내지 20.8, 1.1 내지 20.5, 1.2 내지 20.3, 1.3 내지 20, 1.4 내지 19.5, 1.5 내지 19.3, 1.6 내지 19.2, 1.7 내지 19.1, 또는 2 내지 19일 수 있다.
상기 산화도 범위에서 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 활성화된 혈청형 20의 다당류의 산화도는 8 내지 20, 7.5 내지 19.5, 7 내지 19, 6.5 내지 18.5, 6 내지 18, 5.5 내지 17.5, 5 내지 17, 4.5 내지 16.5, 또는 4 내지 16 일 수 있다. 바람직한 실시예에서 상기 활성화된 혈청형 20의 다당류의 산화도는 4 내지 16일 수 있다.
상기 산화도 범위에서 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 활성화된 혈청형 17F의 다당류의 산화도는 0.1 내지 25, 0.2 내지 24, 0.3 내지 23, 0.4 내지 22.5, 0.5 내지 22.4, 0.6 내지 22.3, 0.7 내지 22.2, 0.9 내지 22.1, 또는 1 내지 22일 수 있다. 바람직하게 1 내지 22일 수 있다.
상기 산화도 범위에서 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다.
상기 사카라이드의 산화 단계에 이어서, 활성화된 사카라이드 및 운반 단백질을 독립적으로(별도의 동결건조) 또는 함께(공-동결건조) 동결건조(냉동-건조)시킬 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 활성화된 사카라이드 및 운반 단백질을 공-동결건조시킨다. 또 다른 실시양태에서, 상기 활성화된 사카라이드 및 운반 단백질을 독립적으로 동결건조시킨다.
하나의 실시양태에서, 상기 동결건조는 동결보호제/건조보호제의 존재 하에서 수행된다. 한 실시양태에서, 상기 동결보호제/건조보호제는 사카라이드이다. 바람직한 실시양태에서, 사카라이드는 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 스타키오스, 멜레지토스, 덱스트란, 만니톨, 락티톨 및 팔라티니트로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 사카라이드는 수크로스이다.
(2-2) 환원제와의 반응에 의한 다당류-운반 단백질의 접합체 형성
환원
환원적 아민화를 통한 접합 과정의 두 번째 단계는 환원제를 사용하여 접합체를 형성시키는 상기 활성화된 다당류 및 운반 단백질의 환원이다. 적합한 환원제는 시아노보로하이드라이드, 예를 들어 시안화수소화붕소나트륨, 보란-피리딘, 또는 보로하이드라이드 교환 수지를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 환원제는 시안화수소화붕소나트륨이다. 하나의 실시양태에서, 상기 환원 반응을 수성 용매 중에서 수행하며, 또 다른 실시양태에서, 상기 반응을 비양성자성 용매 중에서 수행한다. 하나의 실시양태에서, 상기 환원반응을 DMSO (다이메틸설폭사이드) 중에서 또는 DMF(다이메틸폼아미드) 용매 중에서 수행한다. 상기 DMSO 또는 DMF 용매를 사용하여 상기 동결건조된 활성화된 다당류 및 운반 단백질을 재조성할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 환원제는 브론스테드 또는 루이스산 존재하에서의 나트륨 시아노보로하이드라이드, 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드, 나트륨 또는 아연 보로하이드라이드, 아민 보란, 예를 들어 피리딘 보란, 2-피콜린 보란, 2,6-다이보란-메탄올, 다이메틸아민-보란, t-BuMeiPrN-BH3, 벤질아민-BH3 또는 5-에틸-2-메틸피리딘 보란(PEMB)이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 환원제는 나트륨 시아노보로하이드라이드이다.
캡핑
환원 반응의 끝에서, 상기 접합체 중에 반응하지 않은 알데히드기가 남아있을 수도 있으며, 이들을 적합한 캡핑제를 사용하여 캡핑(?칭 단계)시킬 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 캡핑제는 수소화붕소나트륨(NaBH4)이다.
정제
사카라이드와 운반 단백질의 접합(환원 반응 및 임의로 캡핑)에 이어서, 협막 다당류-단백질 접합체를 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술에 의해 정제할 수 있다. 이들 기술은 한외여과/투석여과 공정, 접선 유동 여과 침전/용출, 이온 교환 크로마토그래피/크기 배제 크로마토그래피, 및 심층 여과를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 다당류-단백질 접합체를 한외여과/투석여과 및 이온 교환 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피의 조합에 의해 정제한다. 하나의 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체를 멸균 여과한다. 상기 다당류-단백질 접합체는 SEC-MALLS에 의한 분자량, 사카라이드 대 운반 단백질의 비(중량/중량), 유리 사카라이드의 함량, 유리 단백질 함량 및 분자 크기 분포(Kd)에 의해 특성화할 수 있다.
(3) 접합체의 특성화
혈청형 2 다당류-운반 단백질 접합체의 특성
일 실시양태에서, 접합체는 500 내지 20,000 kDa의 분자량을, 또는 600 내지 19,000kDa의 분자량을, 또는 700 내지 18,000kDa의 분자량을, 또는 800 내지 19,000kDa의 분자량을 분자량을, 또는 900 내지 18,000kDa의 분자량을, 또는 1,000 내지 16,000kDa의 분자량을 가질 수 있다. 상기 범위들 중 임의의 범위내의 모든 정수는 실시양태로서 간주된다.
상기 분자량 범위에서 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 분자량 범위에서 뛰어난 면역원성에 기여할 수 있다.
개별적인 다당류-단백질 접합체를 정제한 후에, 이들을 배합하여 본 발명의 면역원성 조성물을 제형화한다.
본 발명의 혈청형들의 다당류-단백질 접합체는 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(다당류의 양/단백질의 양)(중량/중량)에 의해 특성화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체 중의 각 혈청형의 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(w/w)는 0.3 내지 3.2, 0.4 내지 3.1, 0.5 내지 3.0 (예를 들어, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5이다.
다른 실시양태에서, 상기 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(w/w)는 0.5 내지 2, 0.51 내지 1.5, 0.52 내지 1.7일 수 있다.
바람직하게 상기 운반 단백질은 CRM197일 수 있다.
운반 단백질에 대한 사카라이드의 비율이 상기와 같을 때, 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다. 또한, 상기 범위일 때 면역원성이 우수할 뿐만 아니라, 다른 혈청형들의 간섭없이 안정적으로 접합체를 유지할 수 있다.
본 발명의 접합체 및 면역원성 조성물은, 상기 운반 단백질에 공유적으로 접합되지 않지만, 다당류-단백질 접합체 조성물 중에 존재하는 유리 사카라이드를 함유할 수 있다. 상기 유리 사카라이드는 상기 다당류-단백질 접합체와 비공유적으로 회합될 수 있다(즉 상기 다당류-단백질 접합체에 비공유적으로 결합되거나, 흡착되거나 상기 다당류-단백질 접합체 중에 또는 상기 다당류-단백질 접합체에 의해 포획될 수 있다).
바람직한 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총 중량에 대해 약 35%, 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만의 유리 각 혈청형의 다당류를 포함한다.
각 혈청형의 다당류-단백질 접합체를 또한 그의 분자 크기 분포(Kd)에 의해 특성화할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 매질(CL-4B, Cross-linked Agarose beads, 4%)을 사용하여 상기 접합체의 상대적인 분자 크기 분포를 측정할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 중력 공급 컬럼에 사용하여 접합체의 분자 크기 분포를 프로파일링한다. 상기 매질 중의 기공으로부터 배제되는 큰 분자는 작은 분자보다 더 빨리 용리된다. 분별 수집기를 사용하여 상기 컬럼 용출물을 수집한다. 상기 분획들을 사카라이드 분석에 의해 비색측정으로 시험한다. Kd의 측정을 위해서, 컬럼을 눈금화하여 분자가 완전히 배제되는 분획(V0), (Kd = 0), 및 최대 유지를 나타내는 분획(Vi), (Kd = 1)을 설정한다. 명시된 샘플 특성이 도달된 분획(Ve)을 식 Kd = (Ve - V0)/(Vi - V0)에 의해 Kd와 관련시킨다.
바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 20%는 CL-4B 컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체의 적어도 30%는 CL-4B 컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 60%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 50% 내지 80%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 65% 내지 80%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 20% 내지 60%는 CL-4B컬럼에서0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
혈청형 9N 다당류-운반 단백질 접합체의 특성
일 실시양태에서, 접합체는 100 내지 10,000 kDa의 분자량을, 또는 200 내지 9,000kDa의 분자량을, 또는 300 내지 8,000kDa의 분자량을, 또는 400 내지 7,000kDa의 분자량을, 또는 500 내지 6,000kDa의 분자량을, 또는 600 내지 5,000kDa의 분자량을, 또는 500 내지 4,000kDa의 분자량을 가질 수 있다. 상기 범위들 중 임의의 범위내의 모든 정수는 실시양태로서 간주된다.
상기 분자량 범위에서 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 분자량 범위에서 뛰어난 면역원성에 기여할 수 있다.
개별적인 다당류-단백질 접합체를 정제한 후에, 이들을 배합하여 본 발명의 면역원성 조성물을 제형화한다.
본 발명의 혈청형들의 다당류-단백질 접합체는 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(다당류의 양/단백질의 양) (중량/중량)에 의해 특성화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체 중의 각 혈청형의 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(w/w)는 0.5 내지 2.5, 0.4 내지 2.3, 0.3 내지 2.1, 0.24 내지 2, 0.2 내지 1.8, 0.18 내지 1.6, 0.16 내지 1.4, 0.14 내지 1.2, 0.12 내지 1, 또는 0.1 내지 1, (예를 들어, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 또는 약 2.5)이다.
바람직하게 상기 운반 단백질은 CRM197일 수 있다.
운반 단백질에 대한 사카라이드의 비율이 상기와 같을 때, 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다. 또한, 상기 범위일 때 면역원성이 우수할 뿐만 아니라, 다른 혈청형들의 간섭없이 안정적으로 접합체를 유지할 수 있다.
본 발명의 접합체 및 면역원성 조성물은, 상기 운반 단백질에 공유적으로 접합되지 않지만, 다당류-단백질 접합체 조성물 중에 존재하는 유리 사카라이드를 함유할 수 있다. 상기 유리 사카라이드는 상기 다당류-단백질 접합체와 비공유적으로 회합될 수 있다(즉 상기 다당류-단백질 접합체에 비공유적으로 결합되거나, 흡착되거나 상기 다당류-단백질 접합체 중에 또는 상기 다당류-단백질 접합체에 의해 포획될 수 있다).
바람직한 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 대해 약 60%, 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10%미만의 유리 각 혈청형의 다당류를 포함한다.
각 혈청형의 다당류-단백질 접합체를 또한 그의 분자 크기 분포(Kd)에 의해 특성화할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 매질(CL-4B, Cross-linked Agarose beads, 4%)을 사용하여 상기 접합체의 상대적인 분자 크기 분포를 측정할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 중력 공급 컬럼에 사용하여 접합체의 분자 크기 분포를 프로파일링한다. 상기 매질 중의 기공으로부터 배제되는 큰 분자는 작은 분자보다 더 빨리 용리된다. 분별 수집기를 사용하여 상기 컬럼 용출물을 수집한다. 상기 분획들을 사카라이드 분석에 의해 비색측정으로 시험한다. Kd의 측정을 위해서, 컬럼을 눈금화하여 분자가 완전히 배제되는 분획(V0), (Kd = 0), 및 최대 유지를 나타내는 분획(Vi), (Kd = 1)을 설정한다. 명시된 샘플 특성이 도달된 분획(Ve)을 식 Kd = (Ve - V0)/(Vi - V0)에 의해 Kd와 관련시킨다.
바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 15%는 CL-4B 컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체의 적어도 20%는 CL-4B 컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 60%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 50% 내지 80%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 65% 내지 80%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 15% 내지 60%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 15% 내지 60%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
혈청형 17F 다당류-운반 단백질 접합체의 특성
일 실시양태에서, 접합체는 800 내지 7,000 kDa의 분자량을, 또는 700 내지 6,500kDa의 분자량을, 또는 600 내지 6,000kDa의 분자량을, 또는 500 내지 5,500kDa의 분자량을, 또는 400 내지 5,000kDa의 분자량을, 또는 300 내지 4,500kDa의 분자량을, 또는 300 내지 4, 500kDa의 분자량을 가질 수 있다. 상기 범위들 중 임의의 범위내의 모든 정수는 실시양태로서 간주된다.
상기 분자량 범위에서 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 분자량 범위에서 뛰어난 면역원성에 기여할 수 있다.
개별적인 다당류-단백질 접합체를 정제한 후에, 이들을 배합하여 본 발명의 면역원성 조성물을 제형화한다.
본 발명의 혈청형들의 다당류-단백질 접합체는 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(다당류의 양/단백질의 양)(중량/중량)에 의해 특성화할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(w/w)는 0.1 내지 20, 0.2 내지 19.5, 0.3 내지 19.3, 0.4 내지 19, 0.45 내지 18.5, 또는 0.5 내지 18일 수 있다. 바람직하게, 상기 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(w/w)는 0.5 내지 18일 수 있다.
일부 상기와 같은 실시양태에서, 상기 운반 단백질은 CRM197이다.
운반 단백질에 대한 사카라이드의 비율이 상기와 같을 때, 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다. 또한, 상기 범위일 때 면역원성이 우수할 뿐만 아니라, 다른 혈청형들의 간섭없이 안정적으로 접합체를 유지할 수 있다.
본 발명의 접합체 및 면역원성 조성물은, 상기 운반 단백질에 공유적으로 접합되지 않지만, 다당류-단백질 접합체 조성물 중에 존재하는 유리 사카라이드를 함유할 수 있다. 상기 유리 사카라이드는 상기 다당류-단백질 접합체와 비공유적으로 회합될 수 있다(즉 상기 다당류-단백질 접합체에 비공유적으로 결합되거나, 흡착되거나 상기 다당류-단백질 접합체 중에 또는 상기 다당류-단백질 접합체에 의해 포획될 수 있다).
바람직한 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 대해 약 60%, 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% 또는 15% 미만의 유리 각 혈청형의 다당류를 포함할 수 있다.
각 혈청형의 다당류-단백질 접합체를 또한 그의 분자 크기 분포(Kd)에 의해 특성화할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 매질(CL-4B, Cross-linked Agarose beads, 4%)을 사용하여 상기 접합체의 상대적인 분자 크기 분포를 측정할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 중력 공급 컬럼에 사용하여 접합체의 분자 크기 분포를 프로파일링한다. 상기 매질 중의 기공으로부터 배제되는 큰 분자는 작은 분자보다 더 빨리 용리된다. 분별 수집기를 사용하여 상기 컬럼 용출물을 수집한다. 상기 분획들을 사카라이드 분석에 의해 비색측정으로 시험한다. Kd의 측정을 위해서, 컬럼을 눈금화하여 분자가 완전히 배제되는 분획(V0), (Kd = 0), 및 최대 유지를 나타내는 분획(Vi), (Kd = 1)을 설정한다. 명시된 샘플 특성이 도달된 분획(Ve)을 식 Kd = (Ve - V0)/(Vi - V0)에 의해 Kd와 관련시킨다.
바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 30%는 CL-4B 컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체의 적어도 40%는 CL-4B 컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 15%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 15% 내지 60%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
혈청형 20 다당류-운반 단백질 접합체의 특성
일 실시양태에서, 접합체는 1,300 내지 4,300 kDa의 분자량을 분자량을, 또는 1,250 내지 4,250kDa의 분자량을, 또는 1,200 내지 4,200kDa의 분자량을, 또는 1,150 내지 4,150kDa의 분자량을, 또는 1,100 내지 4,100kDa의 분자량을, 또는 1,000 내지 4,000kDa의 분자량을 가질 수 있다. 상기 범위들 중 임의의 범위내의 모든 정수는 실시양태로서 간주된다.
상기 분자량 범위에서 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 분자량 범위에서 뛰어난 면역원성에 기여할 수 있다.
개별적인 다당류-단백질 접합체를 정제한 후에, 이들을 배합하여 본 발명의 면역원성 조성물을 제형화한다.
본 발명의 혈청형들의 다당류-단백질 접합체는 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(다당류의 양/단백질의 양)(중량/중량)에 의해 특성화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체 중의 각 혈청형의 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(w/w)는 0.1 내지 7, 0.2 내지 7.5, 0.3 내지 7, 0.4 내지 6.5, 0.5 내지 6, 0.6 내지 6.5, 0.7 내지 6, 0.8 내지 5.8, 0.9 내지 5.6, 0.95 내지 5.3, 또는 1 내지 5 일 수 있다. 예를 들어, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5일 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 운반 단백질에 대한 사카라이드의 비(w/w)는 1 내지 5, 1.2 내지 4.5, 또는 1.3 내지 4 일 수 있다.
바람직하게 상기 운반 단백질은 CRM197일 수 있다.
운반 단백질에 대한 사카라이드의 비율이 상기와 같을 때, 접합체의 수율이 우수하고, 안정적으로 접합체를 형성할 수 있다. 또한 유리당의 비율을 줄일 수 있다. 또한, 상기 범위일 때 면역원성이 우수할 뿐만 아니라, 다른 혈청형들의 간섭없이 안정적으로 접합체를 유지할 수 있다.
본 발명의 접합체 및 면역원성 조성물은, 상기 운반 단백질에 공유적으로 접합되지 않지만, 다당류-단백질 접합체 조성물 중에 존재하는 유리 사카라이드를 함유할 수 있다. 상기 유리 사카라이드는 상기 다당류-단백질 접합체와 비공유적으로 회합될 수 있다(즉 상기 다당류-단백질 접합체에 비공유적으로 결합되거나, 흡착되거나 상기 다당류-단백질 접합체 중에 또는 상기 다당류-단백질 접합체에 의해 포획될 수 있다).
바람직한 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체는 각 혈청형의 다당류의 총량에 대해 약 70%, 약 60%, 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 10% 미만의 유리 각 혈청형의 다당류를 포함한다.
각 혈청형의 다당류-단백질 접합체를 또한 그의 분자 크기 분포(Kd)에 의해 특성화할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 매질(CL-4B, Cross-linked Agarose beads, 4%)을 사용하여 상기 접합체의 상대적인 분자 크기 분포를 측정할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 중력 공급 컬럼에 사용하여 접합체의 분자 크기 분포를 프로파일링한다. 상기 매질 중의 기공으로부터 배제되는 큰 분자는 작은 분자보다 더 빨리 용리된다. 분별 수집기를 사용하여 상기 컬럼 용출물을 수집한다. 상기 분획들을 사카라이드 분석에 의해 비색측정으로 시험한다. Kd의 측정을 위해서, 컬럼을 눈금화하여 분자가 완전히 배제되는 분획(V0), (Kd = 0), 및 최대 유지를 나타내는 분획(Vi), (Kd = 1)을 설정한다. 명시된 샘플 특성이 도달된 분획(Ve)을 식 Kd = (Ve - V0)/(Vi - V0)에 의해 Kd와 관련시킨다.
바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 30%는 CL-4B 컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 다당류-단백질 접합체의 적어도 95%는 CL-4B 컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 적어도 60%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 50% 내지 90%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 65% 내지 90%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 혈청형의 다당류-단백질 접합체의 70% 내지 90%는 CL-4B컬럼에서 0.3 Kd 이내에 존재할 수 있다.
1.4 협막 사카라이드 -운반 단백질 접합체의 조합
하나의 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2, 9N, 17F, 및 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 다당류와 단백질의 접합체를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물 중 어느 하나는 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 다당류는 1,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F로 이루어진 군에서 선택된 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 다당류가 운반 단백질에 추가로 접합된 접합체를 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물 중 어느 하나의 다당류-단백질 접합체는 CRM197 및/또는 TT에 개별적으로 접합된다. 바람직하게 23가 또는 24가 면역원성 조성물은 CRM197 및 TT를 운반 단백질로 모두 포함할 수 있고, 이 경우 바람직하게 혈청형 5는 운반 단백질로 TT가 포함될 수 있다. 일 실시예에서 23가 면역원성 조성물은 혈청형 3, 및 5 유래의 다당류가 TT에 접합되고, 혈청형 1, 2, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 유래의 다당류는 CRM197에 접합된다. 일 실시예에서 24가 면역원성 조성물은 혈청형 1, 및 5 유래의 다당류가 TT에 접합되고, 혈청형 2, 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F는 CRM197에 접합된다.
하나의 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개의 상이한 혈청형 유래의 다당류-단백질 접합체를 포함할 수 있다.
2. 면역원성 조성물의 투여량
각 용량 중의 협막 사카라이드-운반 단백질 접합체(들)의 양을 전형적인 백신 중에서 현저한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택한다. 상기와 같은 양은, 특이적인 면역원이 사용되고 어떻게 제공되는가에 따라 변할 것이다.
2.1 협막 다당류-운반 단백질 접합체의 양
면역원성 조성물 중의 특정한 협막 다당류-운반 단백질 접합체의 양은 상기 접합체에 대한(접합된 및 접합되지 않은) 전체 다당류를 기준으로 계산될 수 있다. 예를 들어, 20% 유리 다당류를 갖는 협막 다당류-운반 단백질 접합체는 100 ㎍ 다당류 용량 중에 약 80 ㎍의 접합된 다당류 및 약 20 ㎍의 접합되지 않은 다당류를 가지는 것을 의미할 수 있다. 상기 다당류-단백질 접합체의 양은 상기 폐렴구균 혈청형에 따라 변할 수 있다. 상기 다당류 농도는 안트론 또는 우론산 분석에 의해 측정될 수 있다.
상기 면역원성 조성물 중의 상이한 다당류 성분의 "면역원성 양"은 다양할 수 있으며 각각 약 1 ㎍, 약 2 ㎍, 약 3 ㎍, 약 4 ㎍, 약 5 ㎍, 약 6 ㎍, 약 7 ㎍, 약 8 ㎍, 약 9 ㎍, 약 10 ㎍, 약 15 ㎍, 약 20 ㎍, 약 30 ㎍, 약 40 ㎍, 약 50 ㎍, 약 60 ㎍, 약 70 ㎍, 약 80 ㎍, 약 90 ㎍, 또는 약 100 ㎍의 임의의 특정한 다당류 항원을 포함할 수 있다.
일반적으로, 각각의 용량은 주어진 혈청형에 대해 0.1 ㎍ 내지 100 ㎍, 보다 특히 0.5 ㎍ 내지 20 ㎍, 보다 특히 1.0 ㎍ 내지 10 ㎍, 및 더 특히 2.0 ㎍ 내지 5.0 ㎍의 다당류를 포함할 수 있다. 상기 범위 중 임의의 범위내의 모든 정수는 실시양태로서 간주된다.
하나의 실시양태에서, 각각의 용량은 각각의 특정한 협막 사카라이드-운반 단백질 접합체에 대해서 약 1.0 ㎍, 약 1.2 ㎍, 약 1.4 ㎍, 약 1.6 ㎍, 약 1.8 ㎍, 약 2.0 ㎍, 약 2.2 ㎍, 약 2.4 ㎍, 약 2.6 ㎍, 약 2.8 ㎍, 약 3.0 ㎍, 약 3.2 ㎍, 약 3.4㎍, 약 3.6 ㎍, 약 3.8 ㎍, 약 4.0 ㎍, 약 4.2 ㎍, 약 4.4 ㎍, 약 4.6 ㎍, 약 4.8 ㎍, 약 5.0 ㎍, 약 5.2 ㎍, 약 5.4 ㎍, 약 5.6 ㎍, 약 5.8 ㎍ 또는 약 6.0 ㎍의 다당류를 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 각각의 용량은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및/또는 33F 유래의 다당류-단백질 접합체에 대해서 1 내지 3㎍의 다당류를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약 1.1 ㎍, 약 1.2 ㎍, 약 1.3 ㎍, 약 1.4 ㎍, 약 1.5 ㎍, 약 1.6 ㎍, 약 1.7 ㎍, 약 1.8 ㎍, 약 1.9 ㎍, 약 2.0 ㎍, 약 2.1 ㎍, 약 2.2 ㎍, 약 2.3 ㎍, 약 2.4 ㎍, 약 2.5 ㎍, 약 2.6 ㎍, 약 2.7 ㎍, 약 2.8 ㎍, 약 2.9 ㎍, 또는 약 3.0 ㎍의 다당류를 포함할 수 있다.
일 구현예에서 추가로 혈청형 6B 유래의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 경우, 2 내지 6㎍의 다당류를 포함할 수 있다.
2.2 운반 단백질의 양
하나의 실시양태에서, 상기 운반 단백질은 CRM197 및/또는 TT 일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 운반 단백질이 CRM197이면, 면역원성 조성물에 포함되는 운반 단백질 각각의 용량은 10 ㎍ 내지 150 ㎍, 20 ㎍ 내지 100 ㎍, 25 ㎍ 내지 95㎍의 운반 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시 태양에 따른 24가 면역원성 조성물은 70 내지 90 ㎍의 운반 단백질을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 운반 단백질이 TT이면, 면역원성 조성물에 포함되는 운반 단백질 각각의 용량은 5 ㎍ 내지 15 ㎍, 8 ㎍ 내지 10 ㎍의 운반 단백질을 포함할 수 있다.
3. 항원보강제
일부 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물은 1개 이상의 항원보강제를 추가로 포함할 수 있다. "항원보강제(Adjuvant)"란 용어는 항원에 대한 면역반응을 증대시키는 화합물 또는 혼합물을 지칭한다. 항원보강제는 예를 들어, 없거나 또는 약한 항체 역가 또는 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것과 같이, 단독 투여시에는 약한 면역원성을 띠는 항원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있고/거나, 항원에 대한 항체 역가를 증가시킬 수 있고/거나, 개체에서 면역 반응을 달성하는 데 효과적인 항원의 용량을 감소시킬 수 있다. 따라서, 항원보강제는 대개 면역 반응을 증가시키는 역할을 하며, 이는 당업자에게 주지되어 있다. 조성물의 유효성을 증강시켜 주는 적합한 항원보강제로는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
일 실시예에서 항원보강제알루미늄 염 (명반), 예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원보강제는 알루미늄 염이다. 알루미늄 염 항원보강제는 명반-침전형 백신 또는 명반-흡착형 백신일 수 있다. 알루미늄 염 항원보강제는 당업계에 주지되어 있다. 알루미늄 염으로는 수화된 알루미나, 알루미나 수화물, 알루미나 3수화물 (ATH), 알루미늄 수화물, 알루미늄 3수화물, 알히드로겔(Alhydrogel), 슈퍼포스(Superfos), 암포젤 (Amphogel), 수산화알루미늄 (III), 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 (인산알루미늄 아주반트 (APA)), 무정형 알루미나, 3수화된 알루미나, 또는 트리히드록시알루미늄을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
APA는 알루미늄 히드록시포스페이트의 수성 현탁액이다. APA는 염화알루미늄 및 인산나트륨을 1:1의 부피비로 블렌딩하여 알루미늄 히드록시포스페이트를 침전시킴으로써 제조된다. 블렌딩 공정 후, 고전단 믹서를 사용하여 물질의 크기로 축소시킴으로써 크기가 2-8 ㎛ 범위인 표적 응집체 입자를 수득한다. 이어서, 생성물을 생리 식염수에 대해 투석여과시키고, 증기 멸균시킨다.
특정 실시양태에서, 상업적으로 입수가능한 Al(OH)3 (예를 들어, 덴마크/애큐레이트 케미털 앤드 사이언티픽 컴퍼니(Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co.: 미국 뉴욕주 웨스트버리)의 알히드로겔 또는 슈퍼포스)을 사용하여 50-200 g 단백질/mg 수산화알루미늄의 비율로 단백질을 흡착시킨다. 또 다른 실시양태에서, 단백질의 흡착은 단백질의 pI (등전성 pH) 및 매질의 pH에 따라 달라진다. pI가 더 낮은 단백질은 pI가 더 높은 단백질보다 더욱 강력하게 양전하로 하전된 알루미늄 이온에 흡착된다. 알루미늄 염은 2-3주간의 기간 동안에 걸쳐 느리게 방출되는 Ag 데포를 확립할 수 있고/거나, 대식세포의 비특이 활성화 및 보체 활성화에 관여할 수 있고/거나, (가능하게는 요산 자극을 통해) 선천성 면역 메카니즘을 자극할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 아주반트는 인산알루미늄, 황산알루미늄 및 수산화알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 알루미늄-기반 아주반트이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 인산알루미늄 아주반트를 포함한다.
4. 제형
본 발명의 면역원성 조성물을 액체 형태(즉 용액 또는 현탁액)로 또는 동결건조된 형태로 제형화할 수 있다. 액체 제형을 유리하게는 그의 패키징된 형태로 직접 투여할 수 있으며 따라서 상기 제형은 본 발명의 동결건조 된 조성물에 대해 요구되는 바와 같은 수성 매질 중에서의 재조성의 필요 없이 주사에 이상적이다.
본 발명의 면역원성 조성물의 제형화를 당해 분야에서 인정된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 개별적인 폐렴구균 접합체를 생리학적으로 허용 가능한 비히클로 제형화하여 상기 조성물을 제조할 수 있다. 상기와 같은 비히클의 예는 비제한적으로 물, 완충된 염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함한다.
본 발명은 개시된 다당류-단백질 접합체들의 조합 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 액체 형태, 바람직하게는 수성 액체 형태이다.
본 발명의 면역원성 조성물은 완충제, 염, 2가 양이온, 비-이온성 세제, 동결보호제, 예를 들어 당, 및 산화억제제, 예를 들어 유리 라디칼 제거제 및 킬레이트제, 및 이들 중 임의의 다수의 조합 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 완충제를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 완충제는 약 3.5 내지 약 7.5의 pKa를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 완충제는 포스페이트, 숙시네이트, 히스티딘 또는 시트레이트이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 완충제는 1 mM 내지 10 mM의 최종 농도의 숙시네이트이다. 하나의 특정한 실시양태에서, 상기 숙시네이트의 최종 농도는 약 5 mM이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 염은 염화 마그네슘, 염화 칼륨, 염화 나트륨 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 염은 염화 나트륨이다. 하나의 특정한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 150 mM의 염화 나트륨을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 계면활성제를 포함한다. 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리소르베이트-80 (트윈 80), 폴리소르베이트-60 (트윈 60), 폴리소르베이트-40 (트윈 40) 및 폴리소르베이트-20 (트윈 20), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (브리지(Brij) 58, 브리지 35을 포함하지만 이에 제한되지 않음), 뿐만 아니라 기타 물질 예컨대 트리톤 X-100; 트리톤 X- 114, NP40, 스판 85 및 플루로닉 시리즈의 비-이온성 계면활성제 (예를 들어, 플루로닉 121)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 1종 이상의 비-이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 폴리소르베이트-80 또는 폴리소르베이트-20, 바람직하게는 폴리소르베이트-20을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약 0.001% 내지 약 2% (약 0.005% 이하가 바람직함) 농도의 폴리소르베이트-20을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 용기는 유리, 금속(예를 들어, 강철, 스테인레스 강, 알루미늄 등), 및/또는 중합체(예를 들어, 열가소성 물질, 탄성중합체, 열가소성-탄성중합체)로 제조된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 용기는 유리로 제조된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 면역원성 조성물 중 어느 하나로 충전된 주사기를 제공한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 상기 주사기는 실리콘 처리되고/되거나 유리로 제조된다.
5. 용도
하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물은 약제로서 사용하기 위한 것이다. 조성물 내 접합체의 양은 유의적인 역효과 없이 면역보호적 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 그러한 양은 폐렴구균의 혈청형에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 대상에서 세균 감염, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선을 위해 다양한 치료학적 또는 예방학적 방법으로 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애 감염, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선을 위해 사용할 수 있다.
본 특허 명세서 내에 인용된 모든 참고문헌 또는 특허 출원은 본 발명에 참고로 인용된다.
본 발명을 첨부되는 실시예에 의해 예시한다. 하기의 실시예들을, 달리 상세히 개시되는 경우를 제외하고, 당해 분야의 숙련가들에게 주지되고 통상적인 표준 기법을 사용하여 수행한다. 이들 실시예는 예시적이나, 본 발명을 제한하지 않는다.
본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 대상에서 세균 감염, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선을 위해 다양한 치료학적 또는 예방학적 방법으로 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애 감염, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선을 위해 사용할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 대상에게 면역학적 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애 감염, 질병 또는 상태를 예방하거나 치료하거나 개선하는 방법을 제공한다.
일부 상기와 같은 실시양태에서, 상기 감염, 질병 또는 상태는 폐렴, 부비동염, 중이염, 급성 중이염, 뇌수막염, 세균혈증, 패혈증, 농흉, 결막염, 골수염, 패혈성 관절염, 심내막염, 복막염, 심낭염, 유양돌기염, 봉와직염, 연조직 감염 및 뇌농양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 대상에게 면역학적 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물은 백신으로서 사용하기 위한 것이다. 상기와 같은 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애 감염을 예방하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 대상에게 면역학적 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
일부 상기와 같은 실시양태에서, 상기 감염은 폐렴, 부비동염, 중이염, 급성 중이염, 뇌수막염, 세균혈증, 패혈증, 농흉, 결막염, 골수염, 패혈성 관절염, 심내막염, 복막염, 심낭염, 유양돌기염, 봉와직염, 연조직 감염 및 뇌농양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, 상기 백신화되는 대상은 포유동물, 예를 들어 인간, 고양이, 양, 돼지, 말, 소 또는 개이다.
하나의 양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물은 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애와 관련된 감염, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 상기와 같은 실시양태에서, 상기 감염, 질병 또는 상태는 폐렴, 부비동염, 중이염, 급성 중이염, 뇌수막염, 세균혈증, 패혈증, 농흉, 결막염, 골수염, 패혈성 관절염, 심내막염, 복막염, 심낭염, 유양돌기염, 봉와직염, 연조직 감염 및 뇌농양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물은 백신으로서 사용하기 위한 것이다. 상기와 같은 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애 감염을 예방하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물은 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염의 예방 방법에 사용하기 위한 것이다. 일부 상기와 같은 실시양태에서, 상기 감염은 폐렴, 부비동염, 중이염, 급성 중이염, 뇌수막염, 세균혈증, 패혈증, 농흉, 결막염, 골수염, 패혈성 관절염, 심내막염, 복막염, 심낭염, 유양돌기염, 봉와직염, 연조직 감염 및 뇌농양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, 상기 백신화되는 대상은 포유동물, 예를 들어 인간, 고양이, 양, 돼지, 말, 소 또는 개이다.
본 발명의 면역원성 조성물을, 전신 또는 점막 경로를 통해 상기 면역원성 조성물을 투여함으로써 폐렴구균 감염에 민감한 인간을 보호하거나 치료하는데 사용할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로에 의해 투여한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 주사에 의해 투여한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여한다.
상기 ELISA(효소-결합된 면역흡수 분석) 방법에서, 백신화된 대상의 혈청으로부터의 항체를 고체 지지체에 흡착된 다당류와 함께 배양한다. 상기 결합된 항체를 효소-접합된 2차 검출 항체를 사용하여 검출한다.
상기 ELISA는 인간 혈청 중에 존재하는 유형 특이성 IgG 항-스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류(PS) 항체를 측정한다. 인간 혈청의 희석물을 유형-특이성 캡슐 PS-코팅된 미세적정 플레이트에 가하는 경우, 상기 캡슐 PS에 특이적인 항체가 상기 미세적정 플레이트에 결합한다. 상기 플레이트에 결합된 항체를 염소 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제-표지된 항체에 이어서 p-나이트로페닐 포스페이트 기질을 사용하여 검출한다.
상기 착색된 최종 생성물의 광학 밀도는 상기 혈청 중에 존재하는 항캡슐 PS 항체의 양에 비례한다.
하나의 실시양태에서, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2, 9N, 17F 및 20으로부터 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물은 인간에서 ELISA 분석에 의해 측정되는 바와 같이 적어도 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.35, 0.4 또는 0.5 ㎍/㎖의 농도에서 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 15B 다당류에 결합할 수 있는 IgG 항체를 유도할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2, 9N, 17F 및 20으로부터 선택된 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물은 대상에게 투여시 본 발명에 개시된 바와 같은 옵소닌에 의해 개시된 식작용 분석에서 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2, 9N, 17F 및 20으로부터 선택된 하나 이상의 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니애를 식균작용할 수 있는 항체의 형성을 유도할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 혈청형 2, 9N, 17F 및 20으로부터 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물은 OPA 분석에서 시험시 접합되지 않은 천연 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류에 대해 획득된 OPA 역가보다 더 큰 OPA 역가를 갖는다.
기능성 항체 및 보체의 존재하에서 식작용 효과가 세포에 의한 스트렙토코커스 뉴모니애 세포의 살해를 측정하는 폐렴구균 옵소닌 개시된 식작용 분석(OPA)은 폐렴구균 백신의 유효성을 평가하는데 중요한 대용물인 것으로 간주된다.
옵소닌 개시된 식작용 분석(OPA)을, 스트렙토코커스 뉴모니애 세포, 시험하려는 열 불활성화된 인간 혈청, 분화된 HL-60 세포(식세포) 및 외인성 보체 공급원(예를 들어, 아기 토끼 보체)의 혼합물을 함께 배양함으로써 수행할 수 있다. 옵소닌 개시된 식작용은 배양 중에 진행되며 항체 및 보체로 코팅된 세균 세포는 옵소닌 개시된 식작용시 살해된다. 옵소닌 개시된 식작용으로부터 탈출한 생존 세균의 콜로니 형성 단위(cfu)를 상기 분석 혼합물을 도말하여 측정한다. 상기 OPA 역가는 시험 혈청 없이 대조용 웰상에서 50%의 세균수 감소를 생성시키는 상호 희석으로서 정의된다. 상기 OPA 역가를 상기 50% 살해 컷오프를 포함하는 2개의 희석물로부터 보간한다.
1:8 이상의 종점 역가는 상기 살해 유형 OPA에서 양의 결과로 간주된다.
하나의 실시양태에서, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 혈청형 2, 9N, 17F 및 20으로부터 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물은 옵소닌 개시된 식작용 살해 분석(OPA)에 의해 측정되는 바와 같이 대상의 적어도 50%에서 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2, 9N, 17F 및 20에서 선택된 하나 이상의 혈청형에 대해 적어도 1:8의 역가를 유도할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2, 9N, 17F 및 20으로부터 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물은 옵소닌 개시된 식작용 살해분석(OPA)에 의해 측정되는 바와 같이 대상의 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 적어도 93%에서 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2, 9N, 17F 및 20에 대해 적어도 1:8의 역가를 유도할 수 있다.
6. 본 발명의 면역원성 조성물로 치료되는 대상
본 발명에 개시되는 바와 같이, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 대상에서 세균 감염, 질병 또는 상태를 예방하거나, 치료하거나 개선시키기 위한 다양한 치료학적 또는 예방학적 방법에 사용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 대상은 인간이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 대상은 신생아(즉 3개월 이하), 유아(즉 3개월에서부터 1세까지), 또는 영아(즉 1세에서부터 4세까지)이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물은 백신으로서 사용하기 위한 것이다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 백신화되는 대상은 1세 미만일 수 있다. 예를 들어 상기 백신화되는 대상은 연령이 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11 또는 약 12개월일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 백신화되는 대상은 연령이 약 2, 약 4 또는 약 6개월이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 백신화되는 대상은 2세 미만이다. 예를 들어, 상기 백신화되는 대상은 연령이 약 12개월 내지 약 15개월일 수 있다. 일부의 경우에, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 1회 용량만큼 적게 필요하지만, 일부 상황하에서는 제2, 제3 또는 제4 용량이 제공될 수도 있다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 백신화되는 대상은 50세 이상의 성인, 보다 바람직하게는 55세 이상의 성인이다.
하나의 실시양태에서, 상기 백신화되는 대상은 65세 이상, 70세 이상, 75세 이상 또는 80세 이상의 성인이다.
하나의 실시양태에서, 상기 백신화되는 대상은 면역저하된 개인, 특히 인간이다. 면역저하된 개인을 일반적으로는, 감염인자에 의한 공격에 대해 정상적인 체액 또는 세포 방어를 개시하는 능력이 약화되거나 감소된 사람으로서 정의한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 백신화되는 면역저하된 대상은 면역계를 손상시키는 질병 또는 상태를 앓고 있으며 폐렴구균 질병에 대해 보호하거나 상기 질병을 치료하기에 불충분한 항체 반응을 생성시킨다.
하나의 실시양태에서, 상기 질병은 원발성 면역결핍 질환이다. 바람직하게, 상기 원발성 면역결핍 질환은 복합 T- 및 B-세포 면역결핍, 항체 결핍, 잘 정의된 증후군, 면역 조절장애 질병, 식세포 질환, 선천성 면역 결핍, 자가염증성 질환, 및 보체 결핍으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 상기 백신화되는 면역저하된 대상은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 질병을 앓고 있을 수 있다: HIV-감염, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 암, 만성 심장 또는 폐 질환, 울혈성 심부전, 당뇨병, 만성 간 질병, 알콜중독, 경변증, 척수액 누출, 심근병증, 만성 기관지염, 기종, 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 비장 기능장애(예를 들어, 낫세포 질병), 비장 기능 결손(무비증), 혈액암, 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨병, 림프종, 신부전, 신증후군 및 천식.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 백신화되는 면역저하된 대상은 영양실조를 앓고 있을 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 상기 백신화되는 면역저하된 대상은 감염에 대한 신체의 내성을 저하시키는 약물 또는 치료를 받고 있는 중일 수 있다
본 발명의 특정한 실시양태에서, 상기 백신화되는 면역저하된 대상은 흡연자일 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 상기 백신화되는 면역저하된 대상은 5 x 109세포/리터 이하, 또는 4 x 109 세포/리터 이하, 또는 3 x 109세포/리터 이하, 또는 2 x 109 세포/리터 이하, 또는 1 x 109 세포/리터 이하, 또는 0.5 x 109 세포/리터 이하, 또는 0.3 x 109 세포/리터 이하, 또는 0.1 x 109 세포/리터 이하의 백혈구세포 수(백혈구 수)를 갖는다.
백혈구세포 수(백혈구 수): 혈액 중 백혈구세포(WBC)의 수. 상기 WBC는 대개 CBC(완전 혈구수)의 부분으로서 측정된다. 백혈구 세포는 혈액 중 감염-투쟁 세포이며 적혈구로서 공지된 적(산소-운반)혈구 세포와 다르다.
상이한 유형의 백혈구세포, 예를 들어 호중구(다형핵 백혈구; PMN), 간상핵 세포(약간 미성숙한 호중구), T-형 림프구(T-세포), B-형 림프구(B-세포), 단핵세포, 호산구 및 호염기구가 존재한다. 상기 유형의 백혈구 세포들은 모두 백혈구세포 수에 반영된다. 상기 백혈구세포의 정상 범위는 대개 4,300 내지 10,800 세포/혈액의 입방밀리미터이다. 이를 또한 백혈구 수라 칭할 수 있으며 4.3 내지 10.8 x 109/리터로서 국제 단위로 나타낼 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 상기 백신화되는 면역저하된 대상은 호중구감소증을 앓고 있다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 상기 백신화되는 면역저하된 대상은 2 x 109 세포/리터 이하, 또는 1 x 109세포/리터 이하, 또는 0.5 x 109 세포/리터 이하, 또는 0.1 x 109 세포/리터 이하, 또는 0.05 x 109 세포/리터 이하의 호중구 수를 갖는다.
낮은 백혈구세포 수 또는 "호중구 감소증"은 순환하는 혈액 중 비정상적으로 낮은 수준의 호중구를 특징으로 하는 상태이다. 호중구는 감염을 예방하고 감염과 투쟁하는 것을 돕는 특이한 종류의 백혈구세포이다. 암 환자가 호중구 감소증을 겪는 가장 통상적인 이유는 화학요법의 부작용으로서이다. 화학요법-유발된 호중구 감소증은 환자의 감염 위험성을 증가시키고 암 치료를 중단시킨다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 상기 백신화되는 면역저하된 대상은 500/㎣ 이하의 CD4+ 세포수, 또는 300/㎣ 이하의 CD4+ 세포수, 또는 200/㎣ 이하의 CD4+ 세포수, 100/㎣ 이하의 CD4+ 세포수, 75/㎣ 이하의 CD4+ 세포수, 또는 50/㎣ 이하의 CD4+ 세포수를 갖는다.
CD4 세포 시험은 통상적으로 ㎣의 세포수로서 보고된다. 정상적인 CD4 수는 500 내지 1,600이며, CD8 수는 375 내지 1,100이다. CD4 수는 HIV가 있는 사람들에서 크게 떨어진다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명에 개시된 면역저하된 대상 중 임의의 대상은 인간 남성 또는 인간 여성이다.
7. 규정 식이법
일부의 경우에, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 1회 용량만큼 적게 필요하지만, 일부 상황, 예를 들어 보다 큰 면역결핍의 상태 하에서는 제2, 제3 또는 제4 용량이 제공될 수도 있다. 초기 백신화에 이어서, 대상은 1회 또는 수회의 추가 면역화를 적합한 간격으로 수령할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 백신화 스케줄은 단일 용량이다. 특정한 실시양태에서, 상기 단일 용량 스케줄은 적어도 2세의 건강한 사람에 대해서이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 백신화 스케줄은 수회 용량 스케줄이다. 특정한 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 약 1개월 내지 약 2개월의 간격으로 떨어진 일련의 2회 용량으로 이루어진다. 특정한 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 약 1개월의 간격으로 떨어진 일련의 2회 용량, 또는 약 2개월의 간격으로 떨어진 일련의 2회 용량으로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 약 1개월 내지 약 2개월의 간격으로 떨어진 일련의 3회 용량으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 약 1개월의 간격으로 떨어진 일련의 3회 용량, 또는 약 2개월의 간격으로 떨어진 일련의 3회 용량으로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 약 1개월 내지 약 2개월의 간격으로 떨어진 일련의 3회 용량 및 이어서 상기 첫 번째 용량 후 약 10개월 내지 약 13개월째의 네 번째 용량으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 약 1개월의 간격으로 떨어진 일련의 3회 용량 및 이어서 상기 첫 번째 용량 후 약 10개월 내지 약 13개월째의 네 번째 용량, 또는 약 2개월의 간격으로 떨어진 일련의 3회 용량 및 이어서 상기 첫 번째 용량 후 약 10개월 내지 약 13개월째의 네 번째 용량으로 이루어진다.
하나의 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 1세에 적어도 1회 용량(예를 들어, 1, 2 또는 3회 용량)에 이어서 적어도 1회의 토들러 용량으로 이루어진다.
하나의 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 2개월령에 출발하여 약 1개월 내지 약 2개월의 간격으로 떨어진 (예를 들어, 용량 사이에 28 내지 56일) 일련의 2회 또는 3회 용량, 및 이어서 12 내지 18개월령에 토들러 용량으로 이루어진다. 하나의 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 2개월령에 출발하여 약 1개월 내지 약 2개월의 간격으로 떨어진(예를 들어, 용량 사이에 28 내지 56일) 일련의 3회 용량, 및 이어서 12 내지 15개월령에 토들러 용량으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 2개월령에 출발하여 약 2개월의 간격으로 떨어진 일련의 2회 용량, 및 이어서 12 내지 18개월령에 토들러 용량으로 이루어진다.
하나의 실시양태에서, 상기 수회 용량 스케줄은 2, 4, 6 및 12 내지 15개월령에 일련의 4회 백신 용량으로 이루어진다.
하나의 실시양태에서, 초회 용량은 0일째에 제공되며 1회 이상의 추가 용량이 약 2 내지 약 24주 범위의 간격으로, 바람직하게는 4 내지 8주의 투여 간격으로 제공된다.
하나의 실시양태에서, 초회 용량은 0일째에 제공되고 추가 용량은 약 3개월 후에 제공된다.
본 발명은 종래 보호범위를 제공하지 않았던 혈청형 17F 등 새로운 혈청형에 대한 면역원성 접합체를 제공할 수 있다.
본 발명은 종래 보호범위를 제공하지 않았던 새로운 혈청형 접합체를 포함하여 넓은 보호범위를 제공할 수 있는 다(多)가 폐렴 구균 백신을 제공할 수 있다. 또한 특별한 간섭 현상 없이 다양한 폐렴 구균 혈청형에 대한 항체를 형성할 수 있어 폭넓은 면역 스펙트럼을 제공할 수 있다.
본 발명은 우수한 항체역가를 제공할 수 있다.
본 발명의 다가 폐렴 구균 백신은 부작용이 적게 나타난다.
본 발명의 백신은 영, 유아에게 접종이 가능하며, 노인에게 접종할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것이다.
실시예 1. 혈청형 2, 9N, 17F 또는 20 유래 다당류-단백질 접합체 백신의 제조
[1. 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2 유래 다당류-단백질 접합체]
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2로부터의 다당류-단백질 접합체 제조
마스터 및 제조용 세포 은행의 제조
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2를 수탁기관[American Type Culture Collection (ATCC)](균주 ATCC 6302)로부터 입수하였다. 균주를 증대시키고 동물성 기원의 성분을 제거하기 위하여 원종균(seed stock)을 여러 세대 배양하였다. 냉동보존제로서 합성 글리세롤과 함께 종균 바이알을 냉동보관 하였다(<-70℃). 세포 은행 제조를 위하여, 모든 배양물을 대두-기제 배지에서 증식시켰다. 냉동시키기 전에, 원심분리에 의해서 세포를 농축시키고, 사용된 배지를 제거한 후, 냉동보존제(예: 합성 글리세롤)를 함유하는 새로운 배지에 세포 펠릿을 재현탁시켰다.
발효
제조용 세포 은행 유래의 배양물을 사용하여 대두-기제 배지를 함유하는 종균병(seed bottle)에 접종하였다. 성장 요건이 충족될 때까지 교반하지 않으면서 일정한 온도에서 배양하였다. 종균병을 사용하여 대두 기제 배지를 함유하는 온도, pH 및 교반속도가 제어되는 종균 발효기에 접종하였다. 성장이 중단된 후 또는 발효기의 작업 용량에 도달했을 때 발효를 종결시켰다. 불활성화제를 첨가하여 발효 공정을 종결한 후, 연속 흐름 원심분리 및 여과의 조합을 사용하여 세포 잔해물을 제거하였다.
정제
폐렴구균 다당류의 정제는 다층 여과, 수회의 농축/투석여과 작업 및 침전/용출 단계로 이루어졌다.
활성화
계산된 양의 0.1N 염산 용액 및 WFI를 순차적으로 첨가함으로써 0.01N 염산 용액에서 최종 다당체 농도가 약 2.0 g/L이 되도록 조정하였다. 다당류의 가수분해를 위해 약 60℃에서 60 분간 가수분해 반응을 수행하였다. 상온으로 반응액의 온도를 낮춘 후, 0.1 M 인산일수소나트륨 용액을 첨가하여 반응 pH를 대략 6.0으로 조정하였다. pH 조정 후, 온도를 23 ℃로 조정하였다. 대략 당 1 mg 당 0.023~0.114 mg의 과요오드산 나트륨을 첨가함으로써 산화가 개시되었다. 18 시간 동안 23℃에서 산화 반응을 수행하였다.
활성화된 다당류의 농축 및 투석여과를 100 kDa MWCO 한외여과 멤브레인을 사용하여 수행하였다. 10배 투석 여과부피의 WFI에 대해 투석여과를 수행하였다. 그 후, 정제된 활성화된 다당류를 2 ~ 8℃에서 보관하였다. 정제된 활성화된 다당류를 특히 (i) 비색 검정에 의한 다당류 농도, (ii) 비색 검정에 의한 알데히드 농도, (iii) 산화도, 및 (iv) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특성화하였다.
SEC-MALLS가 다당류 및 다당류-단백질 접합체의 분자량을 결정하는데 사용된다. SEC가 다당류를 유체역학적 부피에 의해 분리하는데 사용된다. 굴절 지수 (RI) 및 다각도 레이저 광 산란 검출기(MALLS)가 분자량 결정에 사용된다. 빛이 물질과 상호작용할 때, 빛이 산란되고, 산란된 빛의 양이 농도, dn/dc의 제곱 (특이 굴절 지수 증가), 및 물질의 몰질량과 관련된다. MALLS 검출기로부터의 산란된 빛 신호 및 RI 검출기로부터의 농도 신호로부터의 판독값을 기초로 분자량 측정치가 계산된다.
활성화된 다당류의 산화도(DO)는 '당 반복 단위의 몰 ÷ 알데히드의 몰'로 결정하였다. 다양한 비색 방법에 의해, 예를 들어, 안트론(Anthrone) 방법을 사용함으로써 당 반복 단위의 몰을 결정한다. 또한 동시에 Park-Johnson 비색 방법을 사용하여 알데히드의 몰을 결정한다.
바람직하게는, 상기 방법에 의해 수득된 활성화된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2 협막 다당류는 2 내지 18의 산화도와 약 100 kDa 내지 400 kDa 의 분자량을 갖는다.
접합 공정
상기 활성화된 다당류를 슈크로스와, 활성화된 다당류 그램당 2 내지 8 g의 슈크로스의 비로 배합하였다. 이어서 배합된 혼합물의 병을 동결건조시켰다. 동결건조에 이어서, 동결건조된 활성화된 다당류를 함유하는 병을 -20 내지 -30 ℃에서 보관하였다. 계산된 양의 CRM197 단백질을 별도로 동결건조시켰다. 동결건조된 CRM197을 -20 내지 -30 ℃에서 보관하였다.
동결건조된 활성화된 다당류를 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 중에서 재조성하였다. 다당류의 용해 완료 시, 무수 DMSO를 재조성을 위해 동결건조된 CRM197에 가하였다. 반응 용기 중에서 재조성된 활성화된 다당류를 재조성된 CRM197과 배합(투입 비 0.5 내지 2:1)한 다음 철저히 혼합하였다. 접합 반응을, 1.0 몰당량의 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)를 반응 혼합물에 가함으로써 개시시켰다. 1% (v/v)의 목표 농도로 WFI를 반응 혼합물에 첨가하고 23 ℃에서 22 내지 26시간 동안 반응하였다. 접합 반응은 2.0 몰당량의 수소화붕소나트륨(NaBH4)를 첨가하고 5%(v/v)의 목표 농도로 WFI를 반응 혼합물에 첨가하여 반응하지 않은 알데히드를 캡핑시킴으로써 종료되었다. 상기 캡핑 반응을 23 ℃에서 4.5시간 동안 수행하였다.
상기 접합체 용액을 100kDa MWCO 멤브레인을 사용하는 농축 및 투석여과에 의한 정제를 위해 제조 중에 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석하였다. 상기 희석된 접합체 용액을 0.8 ㎛ 필터에 통과시키고 투석여과를 15배 내지 40배 투석여과부피의 0.9% 염화나트륨 용액을 사용하여 수행하였다. 상기 투석여과의 완료 후에, 잔류액을 0.2㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 접합체 용액을 대략 0.55 mg/mL 농도 미만이 되도록 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석시키고 멸균 여과하여 2 내지 8 ℃에서 저장하였다.
정제된 혈청형 2 접합체를 특히 (i) 비색 검정에 의한 다당체 농도, (ii) 비색 검정(Lowry)에 의한 단백질 농도, (iii) 단백질에 대한 당류의 비율, (iv) 크기 배제 크로마토그래피(CL-4B)에 의한 분자 크기 분포, (iv) 유리당의 함량 및 (v) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특성화하였다.
상기의 제조 방법을 기반으로 산화도(DO)를 조절하여 혈청형 2 접합체의 특성 변화를 관찰하였다. 결과를 표 1에 요약한다.
접합체 번호 1-1 1-2 1-3 1-4
활성화된 다당류 분자량, kDa 365 313 300 231
DO 14.2 8.6 6.7 2.7
투입비 (P:S) 1:1
% 접합체 수율 72 47 57 67
단백질에 대한 당류의 비 1.2 1.1 1.2 1.0
% 유리 다당류 27 13 8 1
% 분자량 분포 93 92 88 64
접합체 분자량, kDa 4,918 3,845 3,485 1,988
상기의 제조 방법을 기반으로 및 동결건조 시 활성화된 다당류와 CRM197의 배합 비율 조절하여 혈청형 2 접합체의 특성 변화를 관찰하였다. 결과를 표 2에 요약한다.
접합체 번호 1-5 1-6 1-7 1-8 1-9 1-10 1-11 1-12 1-13 1-14
활성화된 다당류 분자량, kDa 260 147
DO 9.4 3.0
투입비 (P:S) 2:1 1.5:1 1:1 0.7:1 0.5:1 2:1 1.5:1 1:1 0.7:1 0.5:1
% 접합체 수율 47 53 57 58 58 64 70 70 73 68
단백질에 대한 당류의 비 0.53 0.69 0.99 1.44 1.81 0.58 0.69 1.04 1.41 1.86
% 유리 다당류 14 15 18 26 27 1 0 1 9 14
% 분자량 분포 94 96 97 96 94 76 71 67 65 63
접합체 분자량, kDa 15,819 11,389 5,532 3,544 2,629 8,255 4,070 2,185 1,226 1,050
혈청형 2 다당류-단백질 접합체의 면역원성 연구
CRM197에 전부 개별적으로 접합된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2로부터의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 단가 접합체 조성물을 제형화하였다.
상기 표 1 및 표 2의 단가 면역원성 조성물의 면역원성을 ELISA를 사용하여 토끼에서 분석하여 혈청 중 혈청형-특이적인 IgG 농도를 측정하였다.
5마리의 2.5 ㎏ 내지 3.5 ㎏의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼 그룹을 제안된 인간 임상 용량(접합체 2.2 ㎍; + AlPO4로서 알루미늄 0.25 ㎎/㎖)으로 0주째에 근육내 경로를 통해 면역시켰다. 상기 토끼를 동일한 용량의 접합체 백신으로 2주째에 추가 면역시키고 이어서 4주째에 채혈하였다. 혈청형-특이적 ELISA를 0주 및 4주 혈청 샘플에서 수행하였다.
분석 결과를 표 3에 나타냈다. 단가 접합체 조성물(접합체 번호 1-6)로 면역시킨 토끼는 혈청형 2에 대한 총 IgG 역가의 현저한 증가를 나타내었다. 다른 접합체로 면역시킨 토끼에서도 현저한 총 IgG 역가의 증가를 나타냈다.
하기 표 3의 값은 상기 표 1의 접합체 번호 1-6으로 면역시킨 후 IgG 농도를 측정하여 나타낸 결과이다.
IgG 농도 (U/mL)
혈청형 Pre-immunization Post-immunization
2 130.0 62,164.7
[2. 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N 유래 다당류-단백질 접합체]
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N 유래 다당류-단백질 접합체 제조
마스터 및 제조용 세포 은행의 제조
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N을 수탁기관[American Type Culture Collection (ATCC)](균주 ATCC 6309)로부터 입수하였다. 혈청형 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
발효
혈청형 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
정제
혈청형 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
활성화
계산된 양의 WFI를 순차적으로 첨가함으로써 약 2.0 g/L의 최종 다당류 농도를 제공하였다. 필요하다면, 반응 pH를 대략 6.0으로 조정하였다. pH 조정 후, 반응 온도를 23 ℃로 조정하였다. 대략 당 1 mg 당 0.024~0.189 mg의 과요오드산 나트륨을 첨가함으로써 산화가 개시되었다. 18 시간 동안 23℃에서 산화 반응을 수행하였다.
활성화된 다당류의 농축 및 투석여과를 100 kDa MWCO 한외여과 멤브레인을 사용하여 수행하였다. 10배 투석 여과부피의 WFI에 대해 투석여과를 수행하였다. 그 후, 정제된 활성화된 다당류를 2 ~ 8 ℃에서 보관하였다. 정제된 활성화된 다당류를 특히 (i) 비색 검정에 의한 다당류 농도, (ii) 비색 검정에 의한 알데히드 농도, (iii) 산화도, 및 (iv) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특성화하였다.
SEC-MALLS가 다당류 및 다당류-단백질 접합체의 분자량을 결정하는데 사용된다. SEC가 다당류를 유체역학적 부피에 의해 분리하는데 사용된다. 굴절 지수 (RI) 및 다각도 레이저 광 산란 검출기(MALLS)가 분자량 결정에 사용된다. 빛이 물질과 상호작용할 때, 빛이 산란되고, 산란된 빛의 양이 농도, dn/dc의 제곱 (특이 굴절 지수 증가), 및 물질의 몰질량과 관련된다. MALLS 검출기로부터의 산란된 빛 신호 및 RI 검출기로부터의 농도 신호로부터의 판독값을 기초로 분자량 측정치가 계산된다.
활성화된 다당류의 산화도(DO)는 '당 반복 단위의 몰 ÷ 알데히드의 몰'로 결정하였다. 다양한 비색 방법에 의해, 예를 들어, 안트론(Anthrone) 방법을 사용함으로써 당 반복 단위의 몰을 결정한다. 또한 동시에 Park-Johnson 비색 방법을 사용하여 알데히드의 몰을 결정한다.
바람직하게는, 상기 방법에 의해 수득된 활성화된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N 협막 다당류는 2 내지 19의 산화도와 약 200 kDa 내지 700 kDa 의 분자량을 갖는다.
접합 공정
상기 활성화된 다당류를 담체 단백질, CRM197과, 활성화된 다당류 그램 당 0.5 내지 2 그램의 CRM197의 비로 배합하였다. 이어서 배합된 혼합물을 동결건조시켰다. 동결건조에 이어서, 동결건조된 활성화된 다당류와 CRM197의 혼합물을 -20℃에서 보관하였다.
동결건조된 활성화된 다당류와 CRM197의 혼합물을 0.1 M 인산나트륨 용액 중에서 재조성한 다음 충분히 혼합하였다. 반응 용액 중의 최종 다당류 농도는 약 10 내지 20 g/L이다. 접합을 1.2 몰당량의 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)를 반응 혼합물에 가함으로써 개시시키고 37 ℃에서 48시간 동안 반응하였다. 접합 반응은 접합 반응액과 동일한 부피의 0.9% 염화나트륨 용액 첨가 후 2.0 몰당량의 수소화붕소나트륨(NaBH4)를 첨가하여 반응하지 않은 알데히드를 캡핑시킴으로써 종료되었다. 상기 캡핑 반응을 23 ℃에서 4.5시간 동안 수행하였다.
상기 접합체 용액을 100kDa MWCO 멤브레인을 사용하는 농축 및 투석여과에 의한 정제를 위해 제조 중에 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석하였다. 상기 희석된 접합체 용액을 0.45 ㎛ 필터에 통과시키고 농축 및 투석여과에 의한 정제를 수행하였다. 100kDa MWCO 멤브레인을 사용하는 투석여과를 15배 내지 40배 투석여과부피의 0.9% 염화나트륨 용액을 사용하여 수행하였다. 상기 투석여과의 완료 후에, 잔류액을 0.2㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 접합체 용액을 대략 0.55 mg/mL 농도 미만이 되도록 희석시키고 멸균 여과하여 2 내지 8 ℃에서 저장하였다.
정제된 혈청형 9N 접합체를 특히 (i) 비색 검정에 의한 다당체 농도, (ii) 비색 검정(Lowry)에 의한 단백질 농도, (iii) 단백질에 대한 당류의 비율, (iv) 크기 배제 크로마토그래피(CL-4B)에 의한 분자 크기 분포, (iv) 유리당의 함량 및 (v) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특성화하였다.
상기의 제조 방법을 기반으로 산화도(Do)를 조절하여 혈청형 9N 접합체의 특성 변화를 관찰하였다. 결과는 표 4 에 요약한다.
접합체 번호 2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6
활성화된 다당류 분자량, kDa 582 619 459 563 490 427
DO 18.2 9.4 7.4 6.7 4.3 2.3
투입비 (P:S) 0.8:1
접합 반응 용액 중 다당류 농도, g/L 20.0
% 접합체 수율 53 43 39 32 33 39
단백질에 대한 당류의 비 2.1 1.5 1.3 1.1 1.0 0.78
% 유리 다당류 44 28 22 20 21 31
% 분자량 분포 52 49 50 55 44 31
접합체 분자량, kDa 860 1,110 1,912 1,168 1,189 1,160
상기의 제조 방법을 기반으로 동결건조 시 활성화된 다당류와 CRM197의 배합 비율을 조절하여 혈청형 9N 접합체의 특성 변화를 관찰하였다. 결과는 표 5에 요약한다.
접합체 번호 2-7 2-8 2-9 2-10 2-11
활성화된 다당류 분자량, kDa 287
DO 5.6
투입비 (P:S) 2:1 1.5:1 1:1 0.67:1 0.5:1
접합 반응 용액 중 다당류 농도, g/L 20.0
% 접합체 수율 25 50 43 41 66
단백질에 대한 당류의 비 0.71 0.85 1.0 1.2 1.8
% 유리 다당류 5 6 15 27 62
% 분자량 분포 52 58 50 40 22
접합체 분자량, kDa 3,720 3,713 1,327 1,016 545
상기의 제조 방법을 기반으로 접합 반응 용액 중의 다당류 농도를 조절하여 혈청형 9N 접합체의 특성 변화를 관찰하였다. 결과는 표 6에 요약한다.
접합체 번호 2-12 2-13 2-14 2-15 2-16
활성화된 다당류 분자량, kDa 560
DO 6.1
투입비 (P:S) 0.8:1
접합 반응 용액 중 다당류 농도, g/L 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
% 접합체 수율 20 31 28 40 42
단백질에 대한 당류의 비 1.0 1.0 0.93 0.99 0.97
% 유리 다당류 32 30 22 21 18
% 분자량 분포 17 27 40 47 54
접합체 분자량, kDa 560 546 845 932 1,438
혈청형 9N 다당류-단백질 접합체의 면역원성 연구
CRM197에 전부 개별적으로 접합된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 9N 다당류-단백질 접합체를 포함하는 단가 접합체 조성물을 제형화하였다.
상기 표 4 내지 6의 단가 면역원성 조성물의 면역원성을 ELISA를 사용하여 토끼에서 분석하여 혈청 중 혈청형-특이적인 IgG 농도를 측정하였다.
혈청형 2와 동일한 방식으로 암컷 뉴질랜드 백색 토끼 그룹에 근육내 경로를 통해 면역시켰다.
분석 결과를 표 7에 나타냈다. 단가 접합체 조성물(접합체 번호 2-8)로 면역시킨 토끼는 혈청형 9N에 대한 총 IgG 역가의 현저한 증가를 나타내었다. 다른 접합체로 면역시킨 토끼에서도 현저한 총 IgG 역가의 증가를 나타냈다.
하기 표 7의 값은 상기 표 5의 접합체 번호 2-8로 면역시킨 후 IgG 농도를 측정하여 나타낸 결과이다.
IgG 농도 (U/mL)
혈청형 Pre-immunization Post-immunization
9N 130.0 656,345.3
[3. 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F 유래 다당류-단백질 접합체]
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F 유래 다당류-단백질 접합체 제조
마스터 및 제조용 세포 은행의 제조
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F를 수탁기관[American Type Culture Collection (ATCC)](ATCC 6317)로부터 입수하였다. 균주를 증대시키고 동물성 기원의 성분을 제거하기 위하여 원종균(seed stock)을 여러 세대 배양하였다. 혈청형 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
발효
혈청형 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
정제
혈청형 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
활성화
계산된 양의 0.1N 염산 용액 및 WFI를 순차적으로 첨가함으로써 0.01N 염산 용액에서 최종 다당체 농도가 약 2.0 g/L이 되도록 조정하였다. 다당류의 가수분해를 위해 약 60 ℃에서 60 분간 가수분해 반응을 수행하였다. 상온으로 반응액의 온도를 낮춘 후, 0.1 M 인산일수소나트륨 용액을 첨가하여 반응 pH를 대략 6.0으로 조정하였다. pH 조정 후, 온도를 23 ℃로 조정하였다. 대략 당 1 mg 당 0.008~0.219 mg의 과요오드산 나트륨을 첨가함으로써 산화가 개시되었다. 18 시간 동안 23 ℃에서 산화 반응을 수행하였다.
활성화된 다당류의 농축 및 투석여과를 100 kDa MWCO 한외여과 멤브레인을 사용하여 수행하였다. 10배 투석 여과부피의 WFI에 대해 투석여과를 수행하였다. 그 후, 정제된 활성화된 다당류를 2 ~ 8 ℃에서 보관하였다. 정제된 활성화된 다당류를 특히 (i) 비색 검정에 의한 다당류 농도, (ii) 비색 검정에 의한 알데히드 농도, (iii) 산화도, 및 (iv) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특성화하였다.
SEC-MALLS가 다당류 및 다당류-단백질 접합체의 분자량을 결정하는데 사용된다. SEC가 다당류를 유체역학적 부피에 의해 분리하는데 사용된다. 굴절 지수 (RI) 및 다각도 레이저 광 산란 검출기(MALLS)가 분자량 결정에 사용된다. 빛이 물질과 상호작용할 때, 빛이 산란되고, 산란된 빛의 양이 농도, dn/dc의 제곱 (특이 굴절 지수 증가), 및 물질의 몰질량과 관련된다. MALLS 검출기로부터의 산란된 빛 신호 및 RI 검출기로부터의 농도 신호로부터의 판독값을 기초로 분자량 측정치가 계산된다.
활성화된 다당류의 산화도(DO)는 '당 반복 단위의 몰 ÷ 알데히드의 몰'로 결정하였다. 다양한 비색 방법에 의해, 예를 들어, 안트론(Anthrone) 방법을 사용함으로써 당 반복 단위의 몰을 결정한다. 또한 동시에 Park-Johnson 비색 방법을 사용하여 알데히드의 몰을 결정한다.
바람직하게는, 상기 방법에 의해 수득된 활성화된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F 협막 다당류는 1 내지 22의 산화도와 400 kDa 내지 900 kDa 의 분자량을 갖는다.
접합 공정
상기 활성화된 다당류를 담체 단백질, CRM197과, 활성화된 다당류 그램 당 1.0 그램의 CRM197의 비로 배합하였다. 이어서 배합된 혼합물을 동결건조시켰다. 동결건조에 이어서, 동결건조된 활성화된 다당류와 CRM197의 혼합물을 -20℃에서 보관하였다.
동결건조된 활성화된 다당류와 CRM197의 혼합물을 0.1M 인산나트륨 용액 (pH 7.2±0.1) 중에서 재조성하였다. 반응 용액 중의 최종 다당류 농도는 15.0 내지 25.0 g/L이다. 접합을, 1.2 몰당량의 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)를 반응 혼합물에 가함으로써 개시시키고 37 ℃에서 48시간 동안 반응하였다. 접합 반응은 접합 반응액과 동일한 부피의 0.9% 염화나트륨 용액과 2.0 몰당량의 수소화붕소나트륨(NaBH4)를 첨가하여 반응하지 않은 알데히드를 캡핑시킴으로써 종료되었다. 상기 캡핑 반응을 23 ℃에서 4.5시간 동안 수행하였다.
상기 접합체 용액을 100kDa MWCO 멤브레인을 사용하는 농축 및 투석여과에 의한 정제를 위해 제조 중에 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석하였다. 상기 희석된 접합체 용액을 0.45 ㎛ 필터에 통과시키고 2단계 농축 및 투석여과에 의한 정제를 수행하였다. 100kDa MWCO 멤브레인을 사용하는 투석여과를 20배 투석여과부피의 0.9% 염화나트륨 용액을 사용하여 수행하였다. 1차 투석여과의 완료 후에, 상기 접합체 잔류액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고 2 내지 8 ℃에서 저장하였다. 접합체 용액을 대략 0.55 mg/mL 농도 미만이 되도록 희석시키고 멸균 여과하여 2 내지 8 ℃에서 저장하였다.
정제된 혈청형 17F 접합체를 특히 (i) 비색 검정에 의한 다당체 농도, (ii) 비색 검정(Lowry)에 의한 단백질 농도, (iii) 단백질에 대한 당류의 비율, (iv) 크기 배제 크로마토그래피(CL-4B)에 의한 분자 크기 분포, (iv) 유리당의 함량 및 (v) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특성화하였다.
상기의 제조 방법을 기반으로 산화도(Do) 및 반응 용액 중 다당류의 농도를 조절하여 혈청형 17F 접합체의 특성 변화를 관찰하였다. 결과는 표 8에 요약한다.
접합체 번호 3-1 3-2 3-3 3-4 3-5 3-6 3-7 3-8 3-9
활성화된 다당류 분자량, kDa 551 560 577 628 801
DO 21.3 9.4 7.5 3.8 1.3
투입비 (P:S) 1:1
접합 반응 용액 중 다당류 농도, g/L 20.0 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0
% 접합체 수율 31 48 58 35 28 25 28 37 37
단백질에 대한 당류의 비 14.9 5.3 4.9 2.8 0.68 0.65 0.67 0.70 0.71
% 유리 다당류 84 82 78 60 8 4 4 6 4
% 분자량 분포 - 18 38 48 49 58
접합체 분자량, kDa 372 706 456 1,064 1,346 2,115 2,531 3,150 4,423
혈청형 17F 다당류-단백질 접합체의 면역원성 연구
CRM197에 전부 개별적으로 접합된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 17F 로부터의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 단가 접합체 조성물을 제형화하였다.
상기 표 8의 단가 면역원성 조성물의 면역원성을 ELISA를 사용하여 토끼에서 분석하여 혈청 중 혈청형-특이적인 IgG 농도를 측정하였다.
혈청형 2와 동일한 방식으로 암컷 뉴질랜드 백색 토끼 그룹에 근육내 경로를 통해 면역시켰다.
분석 결과를 표 9에 요약하였다. 단가 접합체 조성물(접합체 번호 3-8)로 면역시킨 토끼는 혈청형 17F에 대한 총 IgG 역가의 현저한 증가를 나타내었다. 다른 접합체로 면역시킨 토끼에서도 현저한 총 IgG 역가의 증가를 나타냈다.
하기 표 9의 값은 상기 표 8의 접합체 번호 3-8로 면역시킨 후 IgG 농도를 측정하여 나타낸 결과이다.
IgG 농도 (U/mL)
혈청형 Pre-immunization Post-immunization
17F 130.0 227,590.3
[4. 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20 유래 다당류-단백질 접합체]
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20 유래 다당류-단백질 접합체 제조
마스터 및 제조용 세포 은행의 제조
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20을 수탁기관[American Type Culture Collection (ATCC)](균주 ATCC 6320)로부터 입수하였다. 혈청형 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
발효
혈청형 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
정제
혈청형 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
활성화
계산된 양의 0.1N 염산 용액 및 WFI를 순차적으로 첨가함으로써 0.01N 염산 용액에서 최종 다당체 농도가 약 2.0 g/L이 되도록 조정하였다. 대략 당 1 mg 당 0.010~0.038 mg의 과요오드산 나트륨을 첨가함으로써 산화가 개시되었다. 18 시간 동안 23 ℃에서 산화 반응을 수행하였다.
활성화된 다당류의 농축 및 투석여과를 100 kDa MWCO 한외여과 멤브레인을 사용하여 수행하였다. 10배 투석 여과부피의 WFI에 대해 투석여과를 수행하였다. 그 후, 정제된 활성화된 다당류를 2 ~ 8 ℃에서 보관하였다. 정제된 활성화된 다당류를 특히 (i) 비색 검정에 의한 다당류 농도, (ii) 비색 검정에 의한 알데히드 농도, (iii) 산화도, 및 (iv) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특성화하였다.
SEC-MALLS가 다당류 및 다당류-단백질 접합체의 분자량을 결정하는데 사용된다. SEC가 다당류를 유체역학적 부피에 의해 분리하는데 사용된다. 굴절 지수 (RI) 및 다각도 레이저 광 산란 검출기(MALLS)가 분자량 결정에 사용된다. 빛이 물질과 상호작용할 때, 빛이 산란되고, 산란된 빛의 양이 농도, dn/dc의 제곱 (특이 굴절 지수 증가), 및 물질의 몰질량과 관련된다. MALLS 검출기로부터의 산란된 빛 신호 및 RI 검출기로부터의 농도 신호로부터의 판독값을 기초로 분자량 측정치가 계산된다.
활성화된 다당류의 산화도(DO)는 '당 반복 단위의 몰 ÷ 알데히드의 몰'로 결정하였다. 다양한 비색 방법에 의해, 예를 들어, 안트론(Anthrone) 방법을 사용함으로써 당 반복 단위의 몰을 결정한다. 또한 동시에 Park-Johnson 비색 방법을 사용하여 알데히드의 몰을 결정한다.
바람직하게는, 상기 방법에 의해 수득된 활성화된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20 협막 다당류는 4 내지 16의 산화도와 약 400 kDa 내지 800 kDa 의 분자량을 갖는다.
접합 공정
상기 활성화된 다당류를 담체 단백질, CRM197과, 활성화된 다당류 그램 당 1.0 그램의 CRM197의 비로 배합하였다. 이어서 배합된 혼합물을 동결건조시켰다. 동결건조에 이어서, 동결건조된 활성화된 다당류와 CRM197의 혼합물을 -20℃에서 보관하였다.
동결건조된 활성화된 다당류와 CRM197의 혼합물을 0.1M 인산나트륨 용액 (pH 7.2±0.1) 중에서 재조성하였다. 반응 용액 중의 최종 다당류 농도는 약 15.0 g/L이다. 접합을, 1.2 몰당량의 시안화수소화붕소나트륨(NaBH3CN)를 반응 혼합물에 가함으로써 개시시키고 37 ℃에서 48시간 동안 반응하였다. 접합 반응은 접합 반응액과 동일한 부피의 0.9% 염화나트륨 용액과 2.0 몰당량의 수소화붕소나트륨(NaBH4)를 첨가하여 반응하지 않은 알데히드를 캡핑시킴으로써 종료되었다. 상기 캡핑 반응을 23 ℃에서 4.5시간 동안 수행하였다.
상기 접합체 용액을 100kDa MWCO 멤브레인을 사용하는 농축 및 투석여과에 의한 정제를 위해 제조 중에 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석하였다. 상기 희석된 접합체 용액을 0.45 ㎛ 필터에 통과시키고 2단계 농축 및 투석여과에 의한 정제를 수행하였다. 100kDa MWCO 멤브레인을 사용하는 투석여과를 20배 투석여과부피의 0.9% 염화나트륨 용액을 사용하여 수행하였다. 1차 투석여과의 완료 후에, 상기 접합체 잔류액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고 2 내지 8 ℃에서 저장하였다. 접합체 용액을 대략 0.55 mg/mL 농도 미만이 되도록 희석시키고 멸균 여과하여 2 내지 8 ℃에서 저장하였다.
정제된 혈청형 20 접합체를 특히 (i) 비색 검정에 의한 다당체 농도, (ii) 비색 검정(Lowry)에 의한 단백질 농도, (iii) 단백질에 대한 당류의 비율, (iv) 크기 배제 크로마토그래피(CL-4B)에 의한 분자 크기 분포, (iv) 유리당의 함량 및 (v) SEC-MALLS에 의한 분자량에 의해 특성화하였다.
상기의 제조 방법을 기반으로 산화도(DO)를 조절하여 혈청형 20 접합체의 특성 변화를 관찰하였다. 결과는 표 10에 요약한다.
접합체 번호 4-1 4-2 4-3 4-4 4-5 4-6 4-7
활성화된 다당류 분자량, kDa 651 749 675 463 613 444 712
DO 15.7 15.4 8.9 7.3 6.7 4.8 4.6
투입비 (P:S) 1:1
% 접합체 수율 65 57 56 49 45 24 20
단백질에 대한 당류의 비 3.7 2.9 2.5 2.7 2.2 2.1 1.5
% 유리 다당류 29 28 16 15 16 11 8
% 분자량 분포 84 - 79 78 82 78 -
접합체 분자량, kDa 1,968 1,271 3,349 2,458 3,645 2,123 2,563
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20 유래 다당류-단백질 접합체의 면역원성 연구
CRM197에 전부 개별적으로 접합된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 20으로부터의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 단가 접합체 조성물을 제형화하였다.
상기 표 10의 단가 면역원성 조성물의 면역원성을 ELISA를 사용하여 토끼에서 분석하여 혈청 중 혈청형-특이적인 IgG 농도를 측정하였다.
혈청형 2와 동일한 방식으로 암컷 뉴질랜드 백색 토끼 그룹에 근육내 경로를 통해 면역시켰다.
분석 결과를 표 11에 요약하였다. 단가 접합체 조성물(접합체 번호 4-7)로 면역시킨 토끼는 혈청형 20에 대한 총 IgG 역가의 현저한 증가를 나타내었다. 다른 접합체로 면역시킨 토끼에서도 현저한 총 IgG 역가의 증가를 나타냈다.
하기 표 10의 값은 상기 표 10의 접합체 번호 4-7로 면역시킨 후 IgG 농도를 측정하여 나타낸 결과이다.
IgG 농도 (U/mL)
혈청형 Pre-immunization Post-immunization
20 166.2 277,210.1
실시예 2. 다가 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체 제조
[5. 스트렙토코커스 뉴모니애 15가 다당류-단백질 접합체]
스트렙토코커스 뉴모니애 15가 다당류-단백질 접합체 제조
CRM197에 전부 개별적으로 접합된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 및 23F 유래의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 15가 접합체 조성물(15vPnC)을 제형화하였다.
혈청형 2 및 9N은 상기 언급된 방법으로 접합체를 제조하였고, 나머지 혈청형은 국내특허출원 2012-0065893에 기재된 방법에 따라 접합체를 제조하였다.
배치 용적 및 벌크 당류 농도를 기준으로 하여 최종 벌크 농축액의 필요량을 계산하였다. 필요량의 0.85% 염화나트륨, 폴리솔베이트 80 및 석시네이트 완충액을 미리 라벨링한 제제화 용기에 첨가한 후에, 벌크 농축액을 첨가하였다. 충분히 혼합하고 0.22㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 벌크 알루미늄 포스페이트의 첨가 중 및 후에 제제화된 벌크액을 서서히 혼합하였다. pH를 체크하고 필요한 경우에 조절하였다. 제제화된 벌크 제품을 2 내지 8℃에서 보관하였다. 얻어진 백신 조성물은 총 0.5 mL 중에 2.2 ㎍의 각 당류, 단 6B는 4.4 ㎍; 약 32 ㎍의 CRM 197 운반 단백질; 0.125 mg의 알루미늄 원소(0.5 mg 알루미늄 포스페이트) 애주번트; 염화나트륨 약 4.25 mg; 석시네이트 완충액 약 295 ㎍; 및 폴리솔베이트 80 약 100 ㎍을 함유하였다.
스트렙토코커스 뉴모니애 15가 다당류-단백질 접합체의 면역원성 연구
IgG 농도 측정
상기 15가 면역원성 조성물의 면역원성을 ELISA를 사용하여 토끼에서 분석하여 혈청 중 혈청형-특이적인 IgG 농도를 측정하였다.
6마리의 2.5 ㎏ 내지 3.5 ㎏의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼 그룹을 제안된 인간 임상 용량(4.4 ㎍으로 정해진 혈청형 6B를 제외하고 접합체 2.2 ㎍; + AlPO4로서 알루미늄 0.25 ㎎/㎖)으로 0주째에 근육내 경로를 통해 면역시켰다. 상기 토끼를 동일한 용량의 접합체 백신으로 3주째에 추가 면역시키고 이어서 3주 간격으로 채혈하였다. 혈청형-특이적 ELISA를 각 주차의 혈청 샘플에서 수행하였다.
본 발명에 따른 백신 제제 및 비교예의 백신 제제에 대한 혈청형 특이적 면역 반응을 IgG ELISA로 평가하였다. 분석 결과를 표 12에 요약하였다. 접종 후 시간 경과에 따른 IgG 농도(U/mL)를 나타낸다. 상기 15vPnC로 면역시킨 토끼는 Prevnar13을 통해서 얻을 수 없었던 혈청형 2 및 9N에 대한 항체를 생성하였고, 특히 혈청형 추가로 인해 가수가 증가되었음에도 Prevnar13과 비교하여 동등하거나 우수한 혈청 IgG 역가를 유도할 수 있다는 것을 나타내었다.
ELISA Prevnar13 SK-15
Type Day0 Day21 Day42 Day63 Day0 Day21 Day42 Day63
1 0 8522 14187 10207 0 2053 17110 7752
2 -　 -　 -　 -　 134 47864 36482 23790
3 0 968 7229 5330 0 2084 11069 10947
4 0 3831 23100 16654 0 2592 15000 10179
5 97 5597 13083 14819 111 4866 19615 16062
6A 0 15810 28609 20581 0 3634 20313 10141
6B 0 12920 43575 34932 0 4296 29763 14204
7F 0 48129 26694 18014 0 43979 21590 10878
9N 　- -　 -　 -　 0 9197 17085 13021
9V 436 17281 35392 9442 373 15128 12143 12304
14 194 8365 10403 10786 416 7066 13160 16043
18C 0 19101 23989 24862 0 19385 14192 14565
19A 0 71160 136042 139273 0 24713 64138 59135
19F 0 40695 53165 56443 0 8382 38304 30852
23F 0 11171 62331 47522 0 7116 65352 67085
OPA 분석 결과
15가 다당류-단백질 접합체가 기능적 항체 반응을 유도하였는지 여부를 확인하기 위해, 옵소닌 식세포작용 사멸 검정(Multiplexed opsonophagocytic killing assay (MOPA))을 수행하였다.
각 개체 별로 동일한 양의 혈청을 취하여 같은 그룹끼리 혈청을 풀링(pooling)하였다. 스트렙토코커스 뉴모니애를 각 혈청형별로 THY 배지에서 배양하고 1000CFU/10uL가 되도록 희석하였다. Opsonization buffer 200uL, 희석한 혈청 10uL, 희석한 스트렙토코커스 뉴모니애 10uL를 혼합하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 미리 분화시킨 HL-60 세포와 보체의 혼합액을 첨가하고 CO2 배양기(37℃)에서 1시간 반응시켰다. 온도를 낮춰 식세포 작용을 중단시키고 반응액 5uL를 미리 30 내지 60분간 말린 한천 배지에 도말하였다. CO2 배양기(37℃)에서 12 내지 18시간 배양하고 군집의 개수를 세었다. OPA 역가는 50% 사멸이 관찰되는 희석배수로 표현하였다. 비교예로서 13가 백신(Prevnar13, 화이자)를 사용하여 동일하게 평가하였으며, 그 결과는 표 13에 요약하였다.
OPA Prevnar13 SK-15
Type Day21 Day42 Day63 Day21 Day42 Day63
1 16 64 64 4 64 64
2 　- -　 -　 128 512 512
3 1 2 4 1 4 4
4 128 1024 1024 128 1024 1024
5 64 256 512 32 256 512
6A 512 2048 2048 256 2048 2048
6B 256 2048 2048 128 2048 2048
7F 1024 2048 2048 1024 2048 2048
9N 　- -　 -　 512 2048 2048
9V 256 512 512 256 512 512
14 256 1024 1024 256 1024 1024
18C 1024 1024 2048 1024 512 2048
19A 512 1024 2048 256 1024 1024
19F 256 1024 1024 128 512 512
23F 256 2048 2048 256 2048 2048
[6. 스트렙토코커스 뉴모니애 23가 다당류-단백질 접합체]
스트렙토코커스 뉴모니애 23가 다당류-단백질 접합체 제조
CRM197에 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 2, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F 유래 다당류를 접합시킨 다당류-단백질 접합체 및 TT(Tenus toxoid)에 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 3 및 5를 접합시킨 다당류-단백질 접합체를 포함하는 23가 접합체 조성물(23vPnC)을 제형화하였다.
혈청형 2, 9N, 17F, 및 20은 상기 언급된 방법으로 접합체를 제조하였고, 나머지 혈청형은 국내특허출원 2012-0065893, 미국특허출원 62/371,529, 62/371,553 및 62/626,482에 기재된 방법에 따라 CRM197 또는 TT에 접합된 접합체를 제조하였다.
배치 용적 및 벌크 당류 농도를 기준으로 하여 최종 벌크 농축액의 필요량을 계산하였다. 필요량의 0.85% 염화나트륨, 폴리솔베이트 80 및 석시네이트 완충액을 미리 라벨링한 제제화 용기에 첨가한 후에, 벌크 농축액을 첨가하였다. 충분히 혼합하고 0.22㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 벌크 알루미늄 포스페이트의 첨가 중 및 후에 제제화된 벌크액을 서서히 혼합하였다. pH를 체크하고 필요한 경우에 조절하였다. 제제화된 벌크 제품을 2 내지 8℃에서 보관하였다. 얻어진 백신 조성물은 총 0.5 mL 중에 2.2 ㎍의 각 당류, 단 6B는 4.4 ㎍; 약 50 내지 85 ㎍의 CRM 197 운반 단백질; 실험양의 알루미늄 애주번트(예를 들어, 표 14의 Group 4의 경우, 0.125 mg의 알루미늄 원소, 즉 0.5 mg 알루미늄 포스페이트); 염화나트륨 약 4.25 mg; 석시네이트 완충액 약 295 ㎍; 및 폴리솔베이트 80 약 100 ㎍을 함유하였다.
스트렙토코커스 뉴모니애 23가 다당류-단백질 접합체의 면역원성 연구
IgG 농도 측정
상기 23가 면역원성 조성물의 면역원성을 ELISA를 사용하여 토끼에서 분석하여 혈청 중 혈청형-특이적인 IgG 농도를 측정하였다. 애쥬번트를 함유하는 23vPnC 백신이 백신 혈청형-특이적 면역 반응을 유도하는 능력을 조사하였다.
5마리의 2.5 ㎏ 내지 3.5 ㎏의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼 그룹을 제안된 인간 임상 용량(4.4 ㎍으로 정해진 혈청형 6B를 제외하고 접합체 2.2 ㎍)에 AlPO4로서 알루미늄을 각 0.0625 ㎎/㎖, 0.125 ㎎/㎖, 0.25 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖ 및 1 ㎎/㎖을 포함하여 0주째에 근육내 경로를 통해 면역시켰다. 상기 토끼를 동일한 용량의 접합체 백신으로 2주째에 추가 면역시키고 이어서 4주째에 채혈하였다. 혈청형-특이적 ELISA를 0주 및 4주 혈청 샘플에서 수행하였다.
비교예로서 13가 백신(Prevnar13, 화이자)를 사용하여 동일하게 평가하였으며, 분석 결과를 표 14에 요약하였다. 접종 후 4주차 경과에 따른 IgG 농도(U/mL)를 나타낸다.
23vPnC 백신과 Prevnar13을 2회 투여한 후, 풀링된(pooled) 혈청 샘플에서 측정된 기하 평균 역가(GMT; Geometric Mean Titer)가 제시되어 있다. 이 데이터는, 애쥬번트를 23vPnC 제형에 포함시키면 애쥬번트를 함유하지 않는 동일한 백신과 비교하여 더 높은 수준의 IgG 항체가 유도된다는 것을 증명한다. 특히, 혈청형 2, 9N, 17F 및 20을 모두 포함하는 23가 면역원성 백신을 얻을 수 있음을 확인하였다. 하기 결과에서 확인할 수 있듯이, 특히 Prevnar13을 통해서 얻을 수 없었던, 혈청형 2 등에 대한 항체를 생성할 수 있었다. 또한, 크게 증가된 가수에도 불구하고 다른 혈청형의 항원에 대한 항체 생성에도 크게 영향을 주지 않으면서 포함된 모든 혈청형에 대한 면역반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.
　 Group 1 : PCV24 I alum 0
Control group		 Group 2 : PCV24 I alum 62.5 Group 3 : PCV24 I alum 125 Group 4 : PCV24 I alum 250 Group 5 : PCV24 I alum 500 Group 6 : PCV24 I alum 1000 Group 7
(Prevnar®13)
Reference group
Type 1 4421 10951 11205 9595 12821.5 12038.5 9131.0
Type 2 4850.7 7347 7358.2 6833.1 9909.4 7875.3 -
Type 3 15552.6 17362.7 23574.8 11718 24425.5 18313.2 4265.9
Type 5 5676.1 11391.8 10274.5 10699.7 13622.7 15469 5930.1
Type 6A 15265.3 13034.2 30631.9 17203.6 21335.1 21011.1 5697.2
Type 6B 3566.3 8567.3 17964.5 8101.7 21985.6 19993.7 4136.6
Type 7F 10474.8 32904.5 36935.5 28650.3 45878.8 48559 31991.5
Type 8 18684.5 26486.5 39449.2 26369.3 43372.9 56812.6 -
Type 9N 29350.5 52915.1 61918.7 25465.9 73406.3 95465.2 -
Type 9V 9041 19108 24479.9 24602.9 30087.5 36732.8 23053.6
Type 10A 19833.3 38644.7 39959.5 73948.6 40524.8 60464.4 -
Type 11A 893.6 3845.9 4447.6 2474.3 5683.2 8358.5 -
Type 12F 4785.2 10497.8 7381.7 8444.8 8113.6 14211.8 -
Type 14 9177.7 17574 12811.4 15834.6 13543.4 23876.5 11178.8
Type 15B 4908.7 17293.7 18345.2 4936.3 19436.1 28797.9 -
Type 17F 7441.1 9373.4 14848.8 10186.3 14319.7 32906.8 -
Type 18C 16747.2 27864.6 44605.6 29416.3 37658 38860.5 34163.2
Type 19A 781.9 4088.9 5846.5 4114.6 8824.5 12216.5 14381.8
Type 19F 4501.9 32543.6 27502.3 28629.2 36290.5 68218.5 15315.5
Type 20 18252.8 32553.5 34663.5 21760.3 37978.2 44630 -
Type 22F 6790.8 24687.1 24800.1 19953 42634.5 55543.4 -
Type 23F 823.6 3859.8 7938 6634 9468.7 10348.8 9440.5
Type 33F 7261.6 23864.8 24843.6 20105.5 22586.9 28958 -
[7. 스트렙토코커스 뉴모니애 24가 다당류-단백질 접합체]
스트렙토코커스 뉴모니애 24가 다당류-단백질 접합체 제조
CRM197에 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 2, 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F 유래 다당류를 접합시킨 다당류-단백질 접합체 및 TT(Tenus toxoid)에 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1 및 5를 접합시킨 다당류-단백질 접합체를 포함하는 24가 접합체 조성물(24vPnC)을 제형화하였다. 혈청형 2, 9N, 17F, 및 20은 상기 언급된 방법으로 접합체를 제조하였고, 나머지 혈청형은 국내특허출원 2012-0065893, 미국특허출원 62/371,529, 62/371,553 및 62/626,482에 기재된 방법에 따라 CRM197 또는 TT에 접합된 접합체를 제조하였다.
배치 용적 및 벌크 당류 농도를 기준으로 하여 최종 벌크 농축액의 필요량을 계산하였다. 필요량의 0.85% 염화나트륨, 폴리솔베이트 80 및 석시네이트 완충액을 미리 라벨링한 제제화 용기에 첨가한 후에, 벌크 농축액을 첨가하였다. 충분히 혼합하고 0.22㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 벌크 알루미늄 포스페이트의 첨가 중 및 후에 제제화된 벌크액을 서서히 혼합하였다. pH를 체크하고 필요한 경우에 조절하였다. 제제화된 벌크 제품을 2 내지 8℃에서 보관하였다. 얻어진 백신 조성물은 총 0.5 mL 중에 2.2 ㎍의 각 당류, 단 6B는 4.4 ㎍; 약 50 to 90 ㎍의 CRM 197 운반 단백질; 0.125 mg의 알루미늄 원소(0.5 mg 알루미늄 포스페이트) 애주번트; 염화나트륨 약 4.25 mg; 석시네이트 완충액 약 295 ㎍; 및 폴리솔베이트 80 약 100 ㎍을 함유하였다.
스트렙토코커스 뉴모니애 24가다당류 -단백질 접합체의 면역원성 연구
OPA 분석 결과
24가 다당류-단백질 접합체가 기능적 항체 반응을 유도하였는지 여부를 확인하기 위해, 상기 15가 백신과 동일한 방법으로 3마리의 토끼에서 옵소닌 식세포작용 사멸 검정(Opsonophagocytic killing assay (OPA))을 수행하였다.
Serotype PCV24 Prevnar 13
1 309 54
2 490 -
3 407 393
4 1290 2072
5 1516 306
6A 1817 2355
6B 2888 1614
7F 1277 952
8 279 -
9N 653 52
9V 178 324
10A 658 -
11A 675 -
12F 471 -
14 959 539
15B 371 -
17F 348 -
18C 1357 1996
19A 642 1870
19F 1521 1516
20 306 -
22F 1703 -
23F 1531 928
33F 428 -
상기 결과를 통해 혈청형 2, 9N, 17F 및 20을 모두 포함하는 24가 백신을 얻을 수 있음을 확인하였다. 상기 결과에서 확인할 수 있듯이, 특히 Prevnar13을 통해서 얻을 수 없었던, 혈청형 2 등에 대한 항체를 생성할 수 있었다. 또한, Prevnar13에 11개나 되는 혈청형을 추가하였음에도 불구하고 다른 혈청형의 항원에 대한 항체 생성에도 크게 영향을 주지 않으면서도 포함된 모든 혈청형에 대한 면역반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예의 면역원성 조성물은 약제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예의 면역원성 조성물은 세균 감염, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선을 위해 다양한 치료학적 또는 예방학적 방법으로 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물을 개체에서 스트렙토코커스 뉴모니애 감염, 질병 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선을 위해 사용할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 개체에게 면역학적 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상에서 스트렙토코커스 뉴모니애에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공할 수 있다.

Claims (19)

  1. 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 협막 다당류; 및
    상기 각각의 협막 다당류에 접합된 하나 또는 2 이상의 운반 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 다당류는 활성화되어 분자량 100 내지 400 kDa인 상태에서 상기 운반 단백질에 결합되어 접합체를 형성하거나,
    상기 면역원성 조성물이 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 다당류는 활성화되어 분자량 400 내지 900 kDa인 상태에서 상기 담체 단백질에 결합되어 접합체를 형성하거나,
    상기 면역원성 조성물이 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 다당류는 활성화되어 분자량 400 내지 800 kDa인 상태에서 상기 담체 단백질에 결합되어 접합체를 형성하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체는 1,000 내지 16,000 kDa의 분자량이거나,
    상기 면역원성 조성물이 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체는 300 내지 4,500 kDa의 분자량이거나,
    상기 면역원성 조성물이 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체는 1,000 내지 4,000 kDa의 분자량인, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 운반 단백질은 TT(Tetanus toxoid) 또는 CRM197인 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 면역원성 접합체 내의 운반 단백질에 대한 혈청형 2 협막 다당류의 비(다당류/단백질, W/W)는 0.5 내지 2.0이거나,
    상기 면역원성 조성물이 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 면역원성 접합체 내의 운반 단백질에 대한 혈청형 2 협막 다당류의 비(다당류/단백질, W/W)는 0.5 내지 18이거나,
    상기 면역원성 조성물이 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 경우 상기 면역원성 접합체 내의 운반 단백질에 대한 혈청형 20 유래의 협막 다당류의 비(다당류/단백질, W/W)는 1 내지 5인 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은
    상기 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 전체 분자량의 20 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재하거나,
    상기 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 전체 분자량의 15 내지 60%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재하거나,
    상기 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 전체 분자량의 70 내지 90%가 CL-4B 칼럼에서 0.3 Kd 이내에 존재하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은
    상기 혈청형 2 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 상기 접합체에 접합된 다당류의 산화도가 2 내지 18이거나,
    상기 혈청형 17F 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 상기 접합체에 접합된 다당류의 산화도가 1 내지 22이거나,
    상기 혈청형 20 유래의 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 경우, 상기 접합체에 접합된 다당류의 산화도가 4 내지 16인, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 15개의 서로 다른 혈청형으로부터 유래된 다당류가 각각의 운반 단백질에 접합되고,
    상기 혈청형은 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 및 23F이며,
    상기 혈청형은 각각 CRM 197과 접합된, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 23개의 서로 다른 혈청형으로부터 유래된 다당류가 각각의 운반 단백질에 접합되고,
    상기 혈청형은 1, 2, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F이며,
    상기 혈청형 중에서 혈청형 3 및 5로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 TT에 접합되고, 혈청형 1, 2, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 CRM197에 각각 접합된, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 24개의 서로 다른 혈청형으로부터 유래된 다당류가 각각의 운반 단백질에 접합되고,
    상기 혈청형은 2, 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F이며,
    상기 혈청형 1 및 5로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 TT에 접합되고, 혈청형 2, 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로부터 유래된 협막 다당류는 운반체 단백질 CRM197에 각각 접합된, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 생리학상 허용되는 비히클을 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 백신인 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  13. (a) 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈청형으로부터 유래된 협막 다당류를 생산하는 세균 세포를 발효하여 용해하는 단계;
    (b) 상기 용해된 세포에서 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로부터 유래된 협막 다당류를 정제하는 단계;
    (c) 상기 정제된 다당류를 산화제와 반응시켜 활성화시키는 단계; 및
    (d) 상기 활성화된 다당류를 운반 단백질과 배합하여, 운반 단백질에 결합된 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 형성시키는 단계를 포함하는,
    스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제조 방법은 (C) 단계 전에 혈청형 2, 및 17F 유래의 협막 다당류의 경우에는, 상기 정제된 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 협막 다당류를 가수분해하여 다당류를 사이징하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 (d) 단계의 배합된 담체 단백질은 시아노보로하이드라이드, 보란-피리딘, 및 보로하이드라이드 교환 수지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 환원제와 반응시켜 상기 활성화된 다당류와 접합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 (c) 단계는 20 내지 25℃의 온도에서 15 내지 20시간 동안 다당류 1 ㎍당 퍼아이오데이트 0.01 ~ 0.22㎍을 반응시키는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 제조 방법에 의해 수득된, 스트렙토코커스 뉴모니애 감염 예방 또는 치료용 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체.
  18. 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 협막 다당류; 및
    상기 각각의 협막 다당류에 접합된 하나 또는 2 이상의 운반 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 개체에 유효량 투여하여
    개체 내에서 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및/또는 33F의 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
  19. 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F 로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 협막 다당류; 및
    상기 각각의 협막 다당류에 접합된 하나 또는 2 이상의 운반 단백질을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 다당류-단백질 접합체의 폐렴구균 감염의 예방 또는 치료 용도.
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