CN102257155B - 控制肺炎链球菌血清型19a多糖分子量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液的改良的方法。在某些方法中，发酵产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌的发酵培养物，发酵时间少于6小时，然后裂解细菌细胞并收获荚膜多糖。在其他的实施方式中，向发酵培养物提供CO2。向发酵培养物提供CO2包括在所述发酵培养物中加入碳酸氢根离子、在发酵培养物中加入碳酸根离子、在发酵培养物中加入碳酸氢根和碳酸根离子，以及用CO2覆盖该发酵培养物。

Description

控制肺炎链球菌血清型19A多糖分子量的方法
发明领域
本发明涉及通过控制收获时间来增加分离的肺炎链球菌(Strdptococcuspneumoniae)血清型19A荚膜多糖的分子量的方法。
背景
在制备预防由肺炎链球菌(也称作肺炎球菌)生物体导致的侵袭性疾病的多价缀合的肺炎球菌疫苗中，使选定的肺炎链球菌血清型生长以提供产生疫苗所需的多糖。细胞在发酵罐中生长，在发酵结束时通过加入脱氧胆酸钠或者另外的裂解剂诱导裂解。然后收获裂解物肉汤以进行下游的纯化并回收围绕细菌细胞的荚膜多糖。在与载体蛋白缀合后，所述多糖包含于最终的疫苗产物中，并赋予疫苗靶向群体对于选定的肺炎链球菌血清型的免疫力。
多糖大小是在每个批次制品中测定的质量属性，且必须适当控制。对于肺炎链球菌血清型19A多糖，多糖的大小受到例如发酵作用的pH、发酵温度和保持温度等参数的影响。此外，19A荚膜多糖在发酵/回收以及纯化过程中均可出现热降解，在扩大生产工艺以大规模制备19A荚膜多糖时，这对于成功处理和控制各种参数而言构成另一个挑战。
因此，需要从细胞肺炎链球菌裂解物中回收高分子量的血清型19A荚膜多糖的改良的方法。
发明简述
本发明提供了从肺炎链球菌细胞裂解物中回收高分子量的血清型19A荚膜多糖的改良的方法。在一种方法中，将产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物发酵，发酵时间少于6小时，然后裂解细菌细胞，并收获荚膜多糖。因此，在本发明的一个实施方式中，所述方法包括如下步骤：1)制备产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；2)发酵所述发酵培养物，发酵时间少于6小时；3)裂解发酵培养物中的细菌细胞；以及4)从发酵培养物中分离肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖，由此产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液。在一个具体的实施方式中，所述发酵培养物的发酵时间少于5小时。在另一个具体的实施方式中，所述发酵培养物的发酵时间少于4小时。在另一个具体的实施方式中，所述发酵培养物的发酵时间在3小时到6小时之间。在另一个具体的实施方式中，分离的肺炎链球菌荚膜多糖的分子量为至少480kDa。
在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括向产生肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的细菌细胞培养物提供CO2。因此，在一个实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：1)制备产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；2)向所述发酵培养物提供CO2；3)发酵所述发酵培养物，发酵时间少于6小时；4)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；以及5)从发酵培养物中分离肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖；由此产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液。在一具体的实施方式中，向发酵培养物提供CO2包括在发酵培养物中加入碳酸氢根离子(HCO3 -)，例如在发酵培养物中加入NaHCO3(碳酸氢钠)。在进一步的实施方式中，向发酵培养物提供CO2包括在发酵培养物中加入碳酸根离子(CO3 2-)，例如在发酵培养物中加入Na2CO3(碳酸钠)。在另一实施方式中，向发酵培养物提供CO2包括首先加入NaHCO3其次加入Na2CO3。在另一个实施方式中，向发酵培养物提供CO2包括用CO2覆盖发酵培养物。在另一实施方式中，分离的肺炎链球菌荚膜多糖的分子量为至少480kDa。
在另一实施方式中，本发明涉及含有高分子量的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液，其中所述溶液通过如上所述的任一方法制备。
附图简述
图1显示了来自3L规模实验室研究中的发酵期期间的光密度(OD)、碱和葡萄糖水平，其中使用Na2CO3作为滴定碱。为了绘图目的，以克数表示的碱除以10。
图2显示了来自3L规模实验室研究中的发酵期期间的光密度(OD)、碱和葡萄糖水平，其中使用NaOH作为滴定碱。为了绘图目的，以克数表示的碱除以10。
图3显示了对于交替Na2CO3或NaOH补料在不同pH调节下的总蛋白质和多糖结果。
图4显示了作为制备19A荚膜多糖过程中的发酵收获时间的函数的分子量。
图5显示了作为制备19A荚膜多糖过程中的收获时间的函数的单位时间单位光密度(OD)的碱消耗率(specificbaseconsumption)。为了绘图目的，以克数表示的碱除以10。
图6显示了作为制备19A荚膜多糖过程中的碱利用率(specificbaseutilization)的函数的分子量。
发明详述
肺炎链球菌是革兰氏阳性的矛头状(lancetshaped)球菌，其通常成对(双球菌)，但是也可见短链或者单细胞。其易于在血琼脂平板上生长，具有闪光菌落(glisteningcolonies)，并且除厌氧生长情况下之外，其均显示出α溶血作用，在厌氧生长中，其显示出β溶血作用。大多数肺炎球菌血清型的细胞具有荚膜，其是围绕每个细胞的多糖包膜(coating)。这个荚膜是在人体内毒力的决定因素，因为其通过阻止抗体附着于细菌细胞而干扰吞噬作用。目前存在经鉴别的90种以上的已知肺炎球菌荚膜血清型，其中23种最常见的血清型占全世界侵袭性疾病的大约90％。
作为疫苗，肺炎球菌多糖包膜在具有成熟的或者未损害的免疫系统的个体中可赋予适度的对肺炎链球菌的免疫力，但是与多糖缀合的蛋白质可在婴幼儿和同样处于肺炎球菌感染最大危险中的老年人中产生免疫应答。肺炎球菌细胞在发酵罐中生长，在发酵结束时诱导裂解。然后收获裂解物肉汤进行下游纯化，并回收荚膜多糖。
多糖大小是在每个制备批次中测定的品质属性，必须适当控制。血清型19A荚膜多糖的分子量受发酵过程中的参数的影响。本发明的方法可以从细胞肺炎链球菌裂解物中回收高分子量的血清型19A荚膜多糖。
在本发明方法的开发中，修改了HySoy的浓度及碱滴定剂的选择，以尝试修饰最终的多糖产量和分子量。检测了四种发酵方案。第一种方案使用具有28g/LHySoy的基线NaOH方法。第二种方案使用20％碳酸钠作为碱滴定剂及使用20g/LHySoy。第三种方案组合前两种方法的优势，通过分批加入碳酸氢钠而导入碳酸盐及使用混合的NaOH/碳酸盐碱滴定剂。第四种方案使用碳酸盐作为碱滴定剂，及加入10mM碳酸氢盐以支持生长。
在发酵期间使用NaOH作为碱滴定剂的优势在于能使脱氧胆酸盐裂解物降低至pH5.0而无泡沫形成，以除去蛋白质并改良过滤，但是产生较低分子量的多糖(＜450kDa)。Na2CO3提供较高分子量，但是如果脱氧胆酸盐裂解物的pH降低，则具有泡沫形成的问题。在保持pH6.6的较高pH下，使用Na2CO3进行发酵形成凝胶样材料，随后存在过滤问题。通过使用NaOH与Na2CO3的混合物作为pH滴定剂使Na2CO3的量最小化，提供了Na2CO3的分子量大小的益处，且由于大量CO2的突然释放而消除了泡沫形成及过滤问题。使用20％Na2CO3(w/v)作为碱滴定剂及加入10mMNaHCO3支持生长(第四种方法)，产生持续的高产量的高分子量多糖。
除了HySoy浓度和碱滴定剂之外，还研究了收获时间对肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖分子量的影响，发现使发酵培养物发酵少于6小时，然后裂解细菌细胞，这样从细胞肺炎链球菌裂解物产生了高分子量的血清型19A荚膜多糖。
本发明因此提供了改良的方法，用于从细胞肺炎链球菌裂解物中回收高分子量的血清型19A荚膜多糖。在一种方法中，提供了产生含有高分子量分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液的方法，所述方法包括如下步骤：1)制备产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；2)发酵所述发酵培养物，发酵时间少于6小时；3)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；及4)从所述发酵培养物中分离肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖；从而产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液。在某些实施方式中，所述发酵培养物发酵的时间少于大约7小时、少于大约6.5小时、少于大约6小时、少于大约5.5小时、少于大约5小时、少于大约4.5小时、少于大约4小时、或少于大约3.5小时。在另一个实施方式中，所述发酵培养物发酵的时间在3小时至7小时之间、3小时至6.5小时之间、3小时至6小时之间、3小时至5.5小时之间、3小时至5小时之间、3小时至4.5小时之间、3小时至4小时之间、或3小时至3.5小时之间。在另一实施方式中，本发明涉及含有高分子量分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液，其中所述溶液通过上述方法产生。
在另一个实施方式中，本发明的方法还包括向产生肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的细菌细胞发酵培养物提供CO2，这包括以下步骤：1)制备产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；2)向所述发酵培养物提供CO2；3)发酵所述发酵培养物，发酵时间少于6小时；4)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；以及5)从发酵培养物中分离肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖；由此产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液。在另一个实施方式中，本发明涉及含有高分子量的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液，其中所述溶液通过如上所述的方法制备。
本发明的方法产生高分子量的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖。如本文所用，“高分子量”是指分子量为至少大约480kDa、大约490kDa、大约500kDa、大约510kDa、大约520kDa、大约525kDa、大约550kDa、大约575kDa、大约600kDa、大约625kDa、大约650kDa、大约675kDa、大约700kDa、大约725kDa、大约750kDa、大约775kDa、大约800kDa、大约825kDa、大约850kDa、大约875kDa、大约900kDa、大约925kDa、大约950kDa、大约975kDa，或者大约1000kDa。
在某些方法中，向发酵培养物提供CO2包括在所述发酵培养物中加入碳酸氢根离子(HCO3 -)，例如在所述发酵培养物中加入NaHCO3。可以加入5-50mM的NaHCO3，如5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或者50mM。在其它方法中，向所述发酵培养物提供CO2包括在所述发酵培养物中加入碳酸根(CO3 2-)离子，例如在所述发酵培养物中加入Na2CO3。可以加入0.1M-2.0M的Na2CO3，如0.1M、0.2M、0.4M、0.6M、0.7M、0.9M、1.0M、1.5M、1.8M或者2.0M。也可以使用重量/体积(w/v)当量，如5％(w/v)Na2CO3、10％(w/v)Na2CO3或者20％(w/v)Na2CO3。在其它方法中，向发酵培养物提供CO2包括在所述发酵培养物中首先加入NaHCO3，其次加入Na2CO3。在进一步的方法中，向发酵培养物提供CO2包括用CO2覆盖所述发酵培养物。可以使用5％-100％的CO2覆盖，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者100％。
在本发明的方法中，细菌细胞可以通过使用任何裂解剂裂解。“裂解剂”是有助于细胞壁破裂并释放导致细胞裂解的自溶素的任何制剂，包括例如去污剂。如本文所用，术语“去污剂”是指能诱导细菌细胞裂解的任何阴离子或者阳离子去污剂。用于本发明方法中的这种去污剂的代表性实例包括脱氧胆酸钠(DOC)、N-十二烷基肌氨酸(NLS)、鹅去氧胆酸钠以及皂苷。
在本发明的一个实施方式中，用于裂解细菌细胞的裂解剂是DOC。DOC是胆汁酸脱氧胆酸的钠盐，其通常衍生自生物来源如母牛或者公牛。DOC激活LytA蛋白，LytA蛋白是在肺炎链球菌中参与细胞壁生长和分裂的自溶素。LytA在其C末端部分中具有胆碱结合结构域，且已知lytA基因的突变产生LytA突变体，其对于DOC裂解具有抗性。
尽管还没有迹象表明在肺炎链球菌多糖纯化期间使用DOC构成健康危险，但是使用这种生物衍生的制剂可以产生潜在的监管问题(regulatoryconcerns)。因此，在本发明的一个实施方式中，用于裂解细菌细胞的裂解剂是非动物衍生的裂解剂。用于本发明方法中的非动物衍生的裂解剂包括来自非动物来源的、作用模式与DOC相似(即影响LytA功能并导致肺炎链球菌细胞裂解)的制剂。这种非动物衍生的裂解剂包括但不限于DOC的类似物、表面活性剂、去污剂，以及胆碱的结构类似物，且可以使用如下文实验章节中描述的方法确定。在一个实施方式中，非动物衍生的裂解剂选自：癸烷磺酸(decanesulfonicacid)、叔-辛基苯氧基聚(氧乙烯)醇(例如IgepalCA-630，CAS#：9002-93-1，得自SigmaAldrich，St.Louis，MO)、辛基酚环氧乙烷缩合物(例如TritonX-100，得自SigmaAldrich，St.Louis，MO)、N-十二烷基肌氨酸钠(NLS)、N-十二烷基-亚氨基二丙酸钠、十二烷基硫酸钠、鹅去氧胆酸盐、猪去氧胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、牛磺去氧胆酸盐、牛磺鹅去氧胆酸盐，以及胆酸盐。在另一实施方式中，非动物衍生的裂解剂是NLS。
在本发明的方法中，使用本领域技术人员已知的标准技术分离肺炎链球菌荚膜多糖。例如，在使产生肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的细菌细胞发酵之后，裂解细菌细胞产生细胞裂解物。然后使用本领域已知纯化技术从细胞裂解物中分离荚膜多糖，包括使用离心、沉淀、超滤和柱层析技术(见例如美国专利申请20060228380、20060228381、20070184071、20070184072、20070231340和20080102498)。
上述方法中的改变使得可以从细胞肺炎链球菌裂解物中回收高分子量的血清型19A荚膜多糖。这强有力地改良了发酵/回收方法，可以极大地增强肺炎球菌多糖的产生。
如下实施例只是例证本发明，无限制本发明之意。
实施例
使产生血清型19A的肺炎链球菌细菌细胞生长以提供产生疫苗所需要的多糖，用以通过疫苗中包含的荚膜血清型对由肺炎链球菌导致的侵袭性疾病进行主动免疫。使细胞在发酵罐中生长，在发酵结束时诱导裂解。然后收获裂解物肉汤进行下游纯化，并回收荚膜多糖。由于多糖大小是在每批制备物中测定的品质属性，因此必须适当控制多糖大小。发现血清型19A荚膜多糖的分子量受发酵过程中的参数影响。如下实施例描述的研究涉及在肺炎链球菌血清型19A发酵期间的收获时间和提供CO2。
实施例1：提供二氧化碳对于多糖分子量的作用
发酵
在3LBraunBiostatB发酵罐(B.BraunBiotech，Allentown，PA)中进行实验室运行。用1.8L的HYS培养基填充该发酵罐(20g/LHySoy，2.5g/LNaCl，0.5g/LKH2PO4，0.013g/LCaCl2·2H2O，0.15g/L盐酸L-半胱氨酸HCl)。然后将该发酵罐在121℃高压蒸汽灭菌60分钟。冷却后，在每个装置中加入40或60mL/L的50％葡萄糖+1％硫酸镁(w/v)(DMS)溶液。如果需要，在接种之前加入碳酸氢钠。
将含有1L的HYS培养基的2L接种瓶用Type19A冻存种(frozenseedstock)接种，在36℃不振荡保温大约6-8小时。用从OD600在0.3-0.9之间和pH在4.75-5.60之间的瓶中等分取样的100mL(～5.2％v/v)体积接种所述发酵罐。发酵温度和pH控制在希望的选定点。使用36℃、1L/分钟空气覆盖(airoverlay)、pH控制为7及在75rpm搅拌的标准条件。将两个叶轮置于搅拌器轴的下面和中间位置。接通(hookedup)含有合适的碱滴定剂(3NNaOH，3NNaOH混合不同浓度的NaHCO3，3NNaOH混合不同浓度的Na2CO3和NaHCO3，以及20％Na2CO3)的培养瓶以自动控制pH。在不同时间点针对外部pH、OD600、葡萄糖、多糖和蛋白质从发酵罐中取样。当葡萄糖浓度接近耗竭时或者注意到OD不再随着时间而增加时，终止运行。
光密度(OD600)测量
发酵肉汤的细胞密度通过使用Shimadzu(Columbia，MD)UV-1601(2nm带宽)或者Spectronics(Westbury，NY)Genesys5分光光度计(5nm带宽)读取样品在600nm的吸光度而确定。所述装置的空白对照是HYS培养基，所述培养基用去离子(DI)水稀释以匹配样品要求的稀释度。稀释样品以保持读取的吸光度低于0.4，这完全在分光光度计的线性范围内。
葡萄糖浓度
葡萄糖水平通过离心细胞及使用直接的上清液或者用DI水3×稀释的上清液确定。在NovaBiomedical(Waltham，MA)BioProfile400上分析样品。
多糖分析
在最终发酵读数时取样品，用12％脱氧胆酸钠(DOC)处理为浓度为0.13％(w/v)并轻轻搅拌。将其在5℃保持8-24小时，然后用50％乙酸将pH调节为5.0，以沉淀大部分DOC和蛋白质。在5℃再次保持12-24小时之后，将样品离心(14000rpm，Sorvall(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)SS34rotor，在15℃离心10分钟)。将上清液的pH调节为6.0。然后将上清液通过0.45μmPall(EastHills，NY)HTTuffrynMembrane针头过滤器(其为低蛋白质结合的)过滤。过滤的产物通过高效尺寸排阻层析(HPLC-SEC)分析，使用本领域熟知的标准方法进行(见例如Aquilar，M.“HPLCofPeptidesandProteins：MethodsandProtocols”Totowa，NJ：HumanaPress(2004))。
蛋白质分析
通过本领域熟知的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分析蛋白质水平(见例如Walker，J.M.“TheProteinProtocolsHandbook”Totowa，NJ：HumanaPress(2002))。将如上所述制备的过滤的细胞裂解物(上清液)等份置于微离心管中，65μL/管。在每个样品中加入还原剂(10μL二硫苏糖醇(DTT))和NuPAGE(Invitrogen，Carlsbad，CA)4×十二烷基硫酸锂(LDS)样品缓冲液(25μL)。将样品涡旋及加热10分钟，之后以10μL/泳道加样于NuPAGE4-12％Bis-Tris12孔凝胶上。凝胶在NuPAGEMES-SDS缓冲液中于150V运行，进行大约60分钟，随后使用Zoion染色方案(ZoionBiotech，Worcester，MA)染色。使用UVPImager(UVPInc.，Upland，CA)及LabWorksTM(UVPInc.)V.3软件进行样品分析，获得感兴趣的特定蛋白质条带的适当浓度。牛血清白蛋白(BSA)级分V用于产生蛋白质标准曲线，以计算样品的适当蛋白质值(在裂解的细胞肉汤中)。
分子量分析
将1-2L发酵样品用12％DOC钠处理为浓度0.13％(w/v)，在200rpm搅拌。样品在5℃或者20℃保持8-24小时。然后用50％乙酸将样品调节为pH5.0或pH6.6，以沉淀出大部分DOC和蛋白质。在5℃再次保持12-24小时之后，将样品离心(11000rpm，Sorvall(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)SLA-3000rotor，在10℃离心15分钟)。用3NNaOH将上清液样品调节为pH6.0，及用0.45μmMillipore(Billerica，MA)MP60过滤器过滤。然后将样品进行修改的纯化方法，包括100K分子量截断值(MWCO)渗滤(5×浓缩随后用DI水7.5×渗滤)、0.1％HB沉淀以及碳过滤。然后将纯化的材料进行MultiAngleLaserLightScattering(MALLS)分析。
发酵方法研究
基于先前的研究，通过将Na2CO3转换为NaOH作为碱滴定剂而优化发酵方法。使用NaOH使得回收pH降低至5.0，导致显著的蛋白质沉淀。Na2CO3会在低pH(＜6.6)释放CO2，导致泡沫形成。检测碱滴定剂对于Type19A多糖和蛋白质水平的影响。建立两个3L发酵罐，其中一个发酵罐作为原始方法对照，使用20％Na2CO3溶液(w/v)作为碱补料。另一发酵罐使用3NNaOH作为碱补料。
在回收阶段期间，在发酵罐中用DOC(终浓度0.13％(w/v))以及将发酵罐在36℃保持30分钟使细胞裂解。在这个步骤之后，使裂解物保持在室温(22℃)搅拌过夜。在裂解物保持之后，从未调节至4.5的范围进行pH滴定，样品在不同pH选点取出(pull)。将这些样品在室温保持过夜，之后进行处理及分析多糖和蛋白质浓度。在发酵阶段期间的OD、碱和葡萄糖水平在图1和图2中示出。主要不同是碳酸盐运行的较高最终OD。
也检测了DOC后裂解物pH调节对于总蛋白质水平的作用，结果在图3中示出。在NaOH运行和Na2CO3运行中，较低的pH水平均降低无细胞肉汤中荷载的蛋白质。较低的pH(＜6.6)对于多糖产量无负面影响。发酵分析结果表明在发酵期间NaOH碱补料是可接受的替代Na2CO3碱补料，但是与用Na2CO3补料获得的产量相比产生较低的产量。
碱滴定剂对于19A分子量的作用
在3L规模进行一系列发酵，以确定碱滴定剂、HySoy浓度和pH保持步骤是否影响血清型19A分子量。在修改的纯化方法之后，使用MALLS测定进行分子量确定。结果在表1中示出。
表1：碱滴定剂对19A分子量的影响(L29331-94)
运行编号 pH/温度 HySoy pH保持 碱 MALLS(kDa)
D 7.0/36℃ 28g/L 5.0 3N NaOH 340
E 7.0/36℃ 20g/L 5.0 3N NaOH 350
F 7.0/36℃ 20g/L 5.0 20％Na2CO3 713
H 7.0/36℃ 20g/L 6.6 20％Na2CO3 713
碳酸氢盐与混合的碱pH滴定剂的作用
在第一项研究(运行L29331-122和L29331-139)中，在DOC保持步骤之后使用不同水平的最初的碳酸氢钠及氢氧化钠与碳酸钠的碱混合物联合pH5.0保持步骤。加入的最初的碳酸氢盐在10-50mM范围，碳酸钠加入3N氢氧化钠作为碱滴定剂在0.2-1.8M范围。一次运行含有50mM最初的碳酸氢盐及使用NaOH作为碱滴定剂。在这些发酵结束时碳酸盐水平在14-111mM范围。血清型19A分子量在520-713kDa范围。运行参数和结果在表2中示出。
表2：Na2CO3对混合碱作为pH滴定剂
第二项研究(L29331-159和L29331-185)使用最初加入15-30mM碳酸氢盐及使用0.4-1.0MNa2CO3碱混合物。在发酵结束时碳酸盐水平在24-62mM范围。血清型19A分子量在502-763kDa范围。运行参数和结果在表3中示出。
表3：NaHCO3与混合碱作为pH滴定剂
混合的及纯碳酸盐滴定碱发酵方法的对比
进行实验以对比碱混合方法(0.7MNa2CO3/3NNaOH)与碳酸盐滴定剂方法(20％Na2CO3溶液，w/v)。结果(表4)证实得自碳酸盐滴定剂方法的分子量与得自碱混合方法的分子量(561-671kDa)相比较高且更一致(778，781kDa)。使用Na2CO3方法，多糖产量也较高。
表4：运行L29399-1Na2CO3对混合碱
中试规模(pilotscale)运行
使用多种的碱滴定剂进行一些血清型19A中试规模(100L)运行。在完整的纯化过程之后使用MALLS测定进行分子量确定，并从最终纯化批次中获得报告。结果在表5中示出。
表5：在中试规模碱滴定剂对19A分子量的影响
碱滴定剂和覆盖物对于19A分子量的作用
在3L规模进行一系列发酵，以确定碱滴定剂和大气覆盖是否影响分子量。在修饰的纯化过程之后使用MALLS测定进行分子量确定。结果在表6中示出。
表6：碱滴定剂和覆盖物对于19A分子量的影响
收获时间对19A分子量的影响
还研究了收获时间对血清型19A荚膜多糖分子量的影响。表7总结了一次运行的结果，其显示了作为发酵OD值和收获时间的函数的MW的降低。
表1：作为发酵OD值和收获时间的函数的MW
OD(时间) MALLS
2.2(3小时) 1065
4.2(4小时) 845
5.5(5.5小时) 756
5.9(6.6小时) 653
通过几次实验运行进行的进一步研究也发现了作为发酵OD值和收获时间的函数的MW的降低。图4显示了作为制备19A荚膜多糖过程中的发酵光密度(OD)和收获时间的函数的分子量。图5显示了作为制备19A荚膜多糖过程中的收获时间的函数的单位时间单位光密度(OD)的碱消耗率。图6显示了作为制备19A荚膜多糖过程中的碱利用率的函数的分子量。
本文冠词“一(a和an)”是指符合语法的一或一个以上(即至少一个)物体。例如，“一元件”是指一或多个元件。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均表示在本发明所属领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请均以每个单独的出版物或者专利申请被具体及单独引用的相同程度援引并入本文。
尽管为了清晰理解之目的，在前文通过举例和实施例详细描述了本发明，但是在所附权利要求书的范围内可以对本发明进行一定的改变和修改。

Claims (14)

1.产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型19A荚膜多糖的溶液的方法，所述方法包括：
a)制备产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
b)发酵所述发酵培养物，发酵时间少于6.6小时且发酵OD值小于5.9；
c)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；以及
d)从所述发酵培养物中分离肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖，
其中所述高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的分子量为至少480kD。
2.权利要求1的方法，其中步骤c)包括发酵所述发酵培养物，发酵时间少于5小时。
3.权利要求1的方法，其中步骤c)包括发酵所述发酵培养物，发酵时间少于4小时。
4.权利要求1的方法，其中步骤c)包括发酵所述发酵培养物，发酵时间在3小时至6小时之间。
5.产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液的方法，所述方法包括：
a)制备产生血清型19A荚膜多糖的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
b)向所述发酵培养物提供CO2；
c)发酵所述发酵培养物，发酵时间少于6.6小时且发酵OD值小于5.9；
d)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；以及
e)从所述发酵培养物中分离肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖，
其中所述高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的分子量为至少480kD。
6.权利要求5的方法，其中步骤c)包括发酵所述发酵培养物，发酵时间少于5小时。
7.权利要求5的方法，其中步骤c)包括发酵所述发酵培养物，发酵时间少于4小时。
8.权利要求5的方法，其中步骤c)包括发酵所述发酵培养物，发酵时间在3小时至6小时之间。
9.权利要求5的方法，其中向所述发酵培养物提供CO2包括在所述发酵培养物中加入碳酸氢根离子(HCO3 -)。
10.权利要求9的方法，其中在所述发酵培养物中加入HCO3 -包括加入NaHCO3。
11.权利要求5的方法，其中向所述发酵培养物提供CO2包括在所述发酵培养物中加入碳酸根离子(CO3 2-)。
12.权利要求11的方法，其中在所述发酵培养物中加入CO3 2-包括加入Na2CO3。
13.权利要求5的方法，其中向所述发酵培养物提供CO2包括首先加入NaHCO3，其次加入Na2CO3。
14.权利要求5的方法，其中向所述发酵培养物提供CO2包括用CO2覆盖所述发酵培养物。
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