TWI545192B - 用於製備肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣的方法 - Google Patents

Description

用於製備肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣的方法 發明領域

本發明係關於用於製備肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣的方法。尤其，本發明係關於藉由從能夠製造肺炎球菌性多醣之肺炎鏈球菌[Streptococcus pneumoniae(S.pneumoniae)]血清型培養物移除諸如蛋白質與核酸之雜質製備肺炎球菌性血清型之莢膜多醣的方法。

發明背景

肺炎鏈球菌是屬於乳桿菌目鏈球菌屬的革蘭氏陽性菌並引致諸如肺炎、菌血症、中耳炎、和腦膜炎之人類疾病。肺炎鏈球菌血清型的細胞具有莢膜，其為包圍各細胞的多醣外殼。此莢膜藉著阻止抗體附著至細菌細胞而干擾吞噬作用。視免疫特性而定，已辨識約90或更多種血清型，據報導其中一些會引致侵襲性疾病。在1996與2008之間從侵襲性肺炎球菌性疾病辨識收集總共37種血清型，以血清型流行性依序為19F>23F>19A>6A>3>9V>6B。該等主要血清型佔了引致侵襲性肺炎球菌性疾病之血 清型的多數，達53.4%。已使用來自該等肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣發展疫苗，例如多醣疫苗與多醣-蛋白質結合型疫苗。

用於製造多醣疫苗與多醣-蛋白質結合型疫苗之莢膜多醣係獲自能夠製造各血清型多醣的肺炎球菌菌株培養物。各菌株以溫度、pH、與振盪之最佳條件培養，直到生長達到最大值。為獲得非分泌自細胞之肺炎鏈球菌莢膜多醣，細胞係經受使用去氧膽酸鈉(DOC)之細胞裂解方法。隨後，除莢膜多醣以外，眾多蛋白質與核酸從細胞釋放，該等眾多蛋白質與核酸應在培養之後的純化方法中移除。為了使接種後由主體抗原以外的其他物質所導致的不良事件減至最少，蛋白質含量與核酸含量必須符合嚴密規範。舉例來說，就沛兒七價(Prevenar 7^TM)而言，應符合以乾重計2-5%或更少蛋白質與1-2%或更少核酸之規範。

國際公開案WO2006/110352揭示了製備莢膜多醣之方法，其包含培養肺炎鏈球菌、裂解細胞、藉由酸化至pH 5.5或以下使蛋白質沉澱、培育而無振盪、並藉由離心及/或過濾純化。國際公開案WO2008/118752揭示了藉由超濾/透析過濾細胞裂解物並藉由酸化使蛋白質沉澱之製備莢膜多醣方法。習用製備方法基本上包含經由使用pH調整劑酸化讓蛋白質沉澱，其使得整體方法複雜化且亦導致莢膜多醣被修飾並產生有害物質。

發明詳細說明

發明人已進行研究，以改良製備肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣的方法。出乎意料地，發現在相同條件下進一步的培養，並無pH調整，會因其產物-尤其是乳酸-導致pH降至適用於蛋白質沉澱之範圍，即pH5.5或以下。換言之，發明人發現進一步的培養，並無pH調整，接著細胞裂解與蛋白質沉澱可移除使用pH調整劑經由酸化使蛋白質沉澱之步驟。

於是，本發明目的係提供用於製備肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣的改良方法。

在本發明態樣中，提供了用於製備肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣的方法，其包含下列步驟：(a)培養肺炎鏈球菌血清型，同時使培養液內的pH維持於7.0至9.4之範圍內；(b)在培養液吸光度達到持平時與吸光度開始下降時之間，終止步驟(a)中的培養；(c)進一步培養獲自步驟(b)之培養液，並無pH調整，直到培養液pH降至5.5或以下；(d)添加裂解劑至獲自步驟(c)之培養液，以裂解細胞，使蛋白質沉澱並移除沉澱蛋白質與細胞碎片；及(e)從獲自步驟(d)之溶液分離與純化莢膜多醣。

在本發明方法中，該肺炎鏈球菌血清型可為1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F。

在本發明方法中，步驟(a)中的培養可於34-38℃ 以50-150rpm之振盪進行。

在本發明一具體例中，步驟(b)可以培養液吸光度達到持平時起的1至3小時以內終止步驟(a)中的培養來進行。

步驟(c)中的進一步培養係於34-38℃以50-150rpm之振盪進行，並無pH調整。

步驟(d)中的裂解劑可為去氧膽酸鈉。

在本發明又一具體例中，步驟(d)可藉由下列進行：添加裂解劑至獲自步驟(c)之培養液，以裂解細胞，使所得溶液維持於10-20℃達3-24小時，並無振盪，以使蛋白質沉澱並藉由離心該溶液移除沉澱蛋白質與細胞碎片。

在本發明又一具體例中，步驟(e)中的分離與純化係包含下列步驟：(i)經由深度型過濾器過濾獲自步驟(d)之溶液，以獲得濾液；(ii)濃縮獲自步驟(i)之濾液，接著超濾與離心，以獲得上清液；(iii)添加陽離子型清潔劑至獲自步驟(ii)之上清液以供培育，並離心所得混合物，以獲得包含莢膜多醣的沉降粒或上清液；(iv)使獲自步驟(iii)之莢膜多醣和碘化鈉反應，隨後離心所得反應混合物，以獲得上清液；(v)添加活性碳至獲自步驟(iv)之溶液並過濾所得混合物，以獲得濾液；及 (vi)濃縮獲自步驟(v)之濾液並進行超濾與離心，以獲得莢膜多醣。

在該具體例中，步驟(ii)中的濃縮可使用100kDa膜進行且步驟(vi)中的濃縮係使用30kDa膜進行。此外，步驟(iii)中所用之陽離子型清潔劑可為溴化鯨蠟基三甲基銨，該溴化鯨蠟基三甲基銨係以0.5-3.0%之濃度使用。步驟(v)中的活性碳可以1-5%(w/v)之份量使用。

本發明方法不使用任何pH調整劑。本發明係基於發現到在相同條件下進一步培養血清型肺炎鏈球菌，並無任何pH調整，會因培養產物-尤其是乳酸-而導致pH降至適用於蛋白質沉澱之範圍，即pH 5.5或以下。於是，本發明方法不需使用任何供蛋白質沉澱之pH調整劑，藉此使莢膜多醣之任何修飾及有害物質之產生減至最少並簡化製備方法。本發明方法所獲之肺炎鏈球菌血清型莢膜多醣可有利地用作多醣疫苗與多醣-蛋白質結合型疫苗。

圖1展示肺炎鏈球菌血清型3培養之pH變化及其條件。

圖2展示肺炎鏈球菌血清型6B培養之pH變化及其條件。

圖3展示肺炎鏈球菌血清型7F培養之pH變化及其條件。

圖4展示肺炎鏈球菌血清型14培養之pH變化及 其條件。

圖5展示肺炎鏈球菌血清型19A培養之pH變化及其條件。

圖6展示肺炎鏈球菌血清型23F培養之pH變化及其條件。

發明模式

本發明係提供用於製備肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣的方法，其包含下列步驟：(a)培養肺炎鏈球菌血清型，同時使培養液內的pH維持於7.0至9.4之範圍內；(b)在培養液吸光度達到持平時與吸光度開始下降時之間，終止步驟(a)中的培養；(c)進一步培養獲自步驟(b)之培養液，並無pH調整，直到培養液pH降至5.5或以下；(d)添加裂解劑至獲自步驟(c)之培養液，以裂解細胞，使蛋白質沉澱並移除沉澱蛋白質與細胞碎片；及(e)從獲自步驟(d)之溶液分離與純化莢膜多醣。

在本發明方法步驟(a)中，肺炎鏈球菌血清型可為用於製備肺炎球菌性疫苗之任何血清型，其包括但不限於血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、33F及類似者。肺炎鏈球菌血清型菌株為本領域眾所周知且該類菌株可不受限地使用(舉例來說，參見WO2006/110381)。本發明方法步驟(a)中的培養係於一般培 養基中進行，例如以大豆為基質之培養基，同時使培養液內的pH維持於7.0至9.4之範圍內，較佳7.2至8.2，其係藉由使用pH調整劑，例如氫氧化鈉。該培養可於一般習知條件進行，例如於34-38℃之溫度，50-150rpm之振盪。可用於個別肺炎鏈球菌血清型種菌培養與主要培養的pH條件展示於下表1。

本發明方法不使用任何pH調整劑。出乎意料地，發明人已發現在相同條件下進一步的培養，並無pH調整，會因其產物-尤其是乳酸-而導致pH降至適用於蛋白 質沉澱之範圍，即pH 5.5或以下。是以，本發明方法係包含培養肺炎鏈球菌血清型，較佳直到生長達其最大值，並進一步培養，無任何pH調整，接著細胞裂解與蛋白質沉澱。於是，本發明方法不需使用任何供蛋白質沉澱之pH調整劑，藉此使莢膜多醣之任何修飾及有害物質之產生減至最少並簡化製備方法。

本發明方法係包含在培養液吸光度達到持平之時點與吸光度開始下降之時點之間，終止步驟(a)中的培養[即步驟(b)]並進一步包含獲自步驟(b)之培養液，直到pH降至5.5或以下[即步驟(c)]。

在本發明方法步驟(a)的培養中，隨著細胞生長，培養液的吸光度-舉例來說590nm之吸光度(OD₅₉₀)-會逐步增加至最大值(約於培養開始後7-24小時)，然後維持於該值。待一至三小時後，吸光度開始下降。於是，在本發明一具體例中，步驟(b)可以培養液吸光度達到持平時起的一至三小時以內終止步驟(a)中的培養來進行。步驟(c)中的進一步培養可以步驟(a)之同樣條件，即於34-38℃之溫度、以50-150rpm之振盪進行，並無pH調整。該進一步培養自然導致培養液pH降至5.5或以下，藉此提供適用於蛋白質沉澱之pH。

本發明方法係包含添加裂解劑至獲自步驟(c)之培養液，以裂解細胞，使蛋白質沉澱，並移除沉澱蛋白質與細胞碎片[即步驟(d)]。

細胞裂解可以本領域習知方法進行，例如該等揭 示於WO2006/110381與WO2008/118752者。舉例來說，細胞裂解可使用去氧膽酸鈉作為裂解劑進行。去氧膽酸鈉可以0.10-0.15%(去氧膽酸鈉添加時的濃度)之濃度使用，但不限於此。隨著細胞裂解，肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣從細胞質釋出。此外，蛋白質之沉澱可以使反應混合物保持在10-20℃之溫度來進行且沉澱蛋白質與細胞碎片可藉由一般方法移除，例如離心。在本發明一具體例中，步驟(d)可藉由下列進行：添加裂解劑至獲自步驟(c)之培養液，使所得溶液保持在10-20℃達3-24小時，並無振盪，以使蛋白質沉澱且藉由離心移除沉澱蛋白質與細胞碎片。

本發明方法係包含從步驟(d)所獲溶液移除雜質-例如存在於細胞中的蛋白質與核酸-來分離與純化莢膜多醣[即步驟(e)]。莢膜多醣之分離與純化可以習知純化法進行，例如該等揭示於WO2006/110381與WO2008/118752者。

在一具體例中，步驟(e)之分離與純化係包含下列步驟：(i)經由深度型過濾器過濾獲自步驟(d)之溶液，以獲得濾液；(ii)濃縮獲自步驟(i)之濾液，接著超濾與離心，以獲得上清液；(iii)添加陽離子型清潔劑至獲自步驟(ii)之上清液以供培育，並離心所得混合物，以獲得包含莢膜多醣的沉降粒或上清液； (iv)使獲自步驟(iii)之莢膜多醣和碘化鈉反應，隨後離心所得反應混合物，以獲得上清液；(v)添加活性碳至獲自步驟(iv)之溶液並過濾所得混合物，以獲得濾液；及(vi)濃縮獲自步驟(v)之濾液並進行超濾與離心，以獲得莢膜多醣。

在該具體例中，在離心移除沉澱蛋白質與細胞碎片後殘留的裂解物係使用深度型過濾器過濾移除。

此外，可進行兩回濃縮/超濾，以移除蛋白質與核酸。在一具體例中，步驟(ii)中的濃縮可使用100kDa膜進行且步驟(iv)中的濃縮可使用30kDa膜進行。本案所用超濾亦稱作“透析過濾”。

步驟(iii)中所用陽離子型清潔劑可為溴化鯨蠟基三甲基銨。溴化鯨蠟基三甲基銨[溴化鯨蠟基三甲銨，溴化十六烷基-三甲基銨(HB)]可以0.5-3%(溴化鯨蠟基三甲基銨添加時的濃度)之濃度使用。陽離子型清潔劑，例如HB，可藉由使用碘化鈉沉澱移除。若於步驟(iii)中進行離心，莢膜多醣可能以沉降粒(舉例來說，血清型1、2、3、4、5、6A、6B、9N、9V、18C、19A、19F、22F、與23F)、或上清液(舉例來說，7F、14、與33F)之形式存在。以沉降粒形式獲得的莢膜多醣可溶於適宜溶劑(例如氯化鈉水溶液)，以用於後續步驟(即和碘化鈉之反應)。存在於上清液內的莢膜多醣可用於後續步驟(即和碘化鈉之反應)，而無進一步單離。

此外，步驟(v)中的活性碳可較佳以1-5%(w/v) 之份量使用。

在下文中，本發明係參照下列實施例進一步例示。然而，所提供之實施例僅供例示目的，於是不應以任何方式解讀為限制本發明之範疇。

實施例

下列實施例所用以大豆為基質之培養基之組成物展示於表2。

實施例1.製備肺炎鏈球菌莢膜多醣血清型3、6B、與19A

製備細胞庫

肺炎鏈球菌血清型3、6B、與19A的保存菌種係獲自美國菌種中心(ATCC)。種菌培養與主要培養所用菌株展示於表3。

創建保存菌種的數個世代(F1、F2、與F3世代)。製造保存菌種的兩個額外世代。第一額外世代係由F3小瓶製成，繼代則由第一額外世代小瓶製成。菌種小瓶係以合成甘油作為冷凍保護劑冷凍(<-70℃)儲存。為製備細胞庫，使所有培養物生長於以大豆為基質之培養基中。冷凍前，先離心濃縮細胞，移去用過的培養基，並使細胞沉降粒再次懸浮於含冷凍保護劑-例如合成甘油-之新鮮培養基。

培養與採集

使用來自工作細胞庫之培養物接種含以大豆為基質之培養基之菌種瓶並培育該瓶。待達到目標光學密度(吸光度)後，使用菌種瓶接種含以大豆為基質之培養基之菌種發酵槽。於34-38℃以120rpm振盪培育發酵槽，同時以3N NaOH使pH維持約7.2或以上。每2-3小時取樣，並量測其光學密度。當光學密度開始大幅成長時，每30分至1小時進行採樣，以量測其光學密度。在光學密度量測達到某值並維持恒定的1小時後，終止培養。然後，並無任何pH調整，以同樣溫度、同樣rpm振盪繼續進一步培養，直到pH達到5.5或更少。在進一步培養終止後，將0.12%濃度之去氧膽酸鈉加至該培養物，以裂解細菌細胞。使所得發酵槽內容物冷卻至10-15℃並維持於此溫度，並無振盪，達約3小時，以誘發蛋白質沉澱。然後，將混合物離心，以移除沉澱蛋白質與細胞碎片。

純化

將獲自離心之溶液以深度型過濾器過濾，以移除 未於離心期間沉澱之蛋白質與細胞碎片。該濾液於100kDa MW膜上濃縮，濃縮物以25mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)透析過濾。透析過濾係進行直至濾液導電率達到約3-4mS/cm為止，TMP設定為0.5-1.5巴或以下。從樣本移除雜質後，添加來自庫存溶液以提供約1.0% HB(w/v)最終濃度之溴化鯨蠟基三甲基銨[溴化鯨蠟基三甲銨，溴化十六烷基-三甲基銨(HB)]使多醣從該濃縮透析過濾溶液沉澱，同時振盪約1小時，接著離心。將所得多醣沉降粒溶於約0.25M氯化鈉水溶液並將來自庫存NaI溶液以提供約0.5%(w/v)最終濃度之碘化鈉(NaI)加至多醣溶液。將該溶液離心，以獲得上清液並將活性碳慢慢加至所獲溶液，至約2.0w/v%，同時振盪約1小時，然後過濾溶液。濾液於30kDa膜上濃縮並使用約10倍體積三次蒸餾水透析過濾該濃縮物。透析過濾係進行直至濾液導電率達到約10μS/cm為止，TMP設定為0.5-1.5巴或以下。濃縮物係經無菌過濾並儲存於-20℃。

各純化步驟所獲蛋白質、核酸與多醣總量及其純化產量展示於表4至6。

如表4-6所示，本發明方法所獲莢膜多醣係符合殘留蛋白質含量之規範，並無運用任何個別酸化方法，其回收產量分別為49%或更多(血清型3莢膜多醣)、65%或更多(血清型6B莢膜多醣)、及60%或更多(血清型19A莢膜多醣)。於是，根據本發明之方法可有效地以簡化方法製造莢膜多醣。

實施例2.製備肺炎鏈球菌莢膜多醣血清型7F與14製備細胞庫

肺炎鏈球菌血清型7F與14的保存菌種係獲自美國菌種中心(ATCC)。種菌培養與主要培養所用菌株展示於表7。

創建保存菌種的數個世代(F1、F2、與F3世代)。製造保存菌種的兩個額外世代。第一額外世代係由F3小瓶製成，繼代則由第一額外世代小瓶製成。菌種小瓶係以合成甘油作為冷凍保護劑冷凍(<-70℃)儲存。為製備細胞庫，使所有培養物生長於以大豆為基質之培養基中。冷凍前，先離心濃縮細胞，移去用過的培養基，並使細胞沉降粒再次懸浮於含冷凍保護劑-例如合成甘油-之新鮮培養基。

培養與採集

使用來自工作細胞庫之培養物接種含以大豆為基質之培養基之菌種瓶並培育該瓶。待達到目標光學密度(吸光度)後，使用菌種瓶接種含以大豆為基質之培養基之菌種發酵槽。於34-38℃以120rpm振盪培育發酵槽，同時以3N NaOH使pH維持約7.2或以上。每2-3小時取樣，並量測其光學密度。當光學密度開始大幅成長時，每30分至1小時進行採樣，以量測其光學密度。在光學密度量測達到某值並維持恒定的1小時後，終止培養。然後，並無任何pH調整，以同樣溫度、同樣rpm振盪繼續進一步培養，直到pH達到5.5或更少。在進一步培養終止後，將0.12%濃度之去氧膽酸鈉加至該培養物，以裂解細菌細胞。使所得發酵槽內容物冷卻至10-15℃並維持於此溫度，並無振盪，達約3小時，以誘發蛋白質沉澱。然後，將混合物離心，移除沉澱蛋白質與細胞碎片。

純化

將獲自離心之溶液以深度型過濾器過濾，以移除 未於離心期間沉澱之蛋白質與細胞碎片。濃縮物以25mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)透析過濾。透析過濾係進行直至濾液導電率達到約3-4mS/cm為止，TMP設定為0.5-1.5巴或以下。從樣本移除雜質後，添加來自庫存溶液以提供約1.0% HB(w/v)最終濃度之溴化鯨蠟基三甲基銨[溴化鯨蠟基三甲銨，溴化十六烷基-三甲基銨(HB)]至該濃縮透析過濾溶液，同時振盪約1小時，接著離心，以獲得上清液。將來自庫存NaI溶液以達到約0.5%(w/v)最終濃度之碘化鈉(NaI)加至所得上清液。將該溶液離心，以獲得上清液並將活性碳慢慢加至所獲溶液，至約2.0w/v%，同時振盪約1小時，然後過濾溶液。濾液於30kDa膜上濃縮並使用約10倍體積三次蒸餾水透析過濾該濃縮物。透析過濾係進行直至濾液導電率達到約10μS/cm為止，TMP設定為0.5-1.5巴或以下。濃縮物係經無菌過濾並儲存於-20℃。

各純化步驟所獲蛋白質、核酸與多醣總量及其純化產量展示於表8與9。

如表8與9所示，本發明方法所獲莢膜多醣係符合殘留蛋白質含量之規範，並無運用任何個別酸化方法，其回收產量分別為60%或更多(血清型7F莢膜多醣)與55%或更多(血清型14莢膜多醣)。於是，根據本發明之方法可有效地以簡化方法製造莢膜多醣。

實施例3.製備肺炎鏈球菌莢膜多醣血清型23F

製備細胞庫

肺炎鏈球菌血清型23F的保存菌種係獲自美國菌種中心，ATCC No.6323。

創建保存菌種的數個世代(F1、F2、與F3世代)。製造保存菌種的兩個額外世代。第一額外世代係由F3小瓶製成，繼代則由第一額外世代小瓶製成。菌種小瓶係以合成甘油作為冷凍保護劑冷凍(<-70℃)儲存。為製備細胞庫，使所有培養物生長於以大豆為基質之培養基中。冷凍前，先離心濃縮細胞，移去用過的培養基，並使細胞沉降粒再次懸浮於含冷凍保護劑-例如合成甘油-之新鮮培養基。

培養與採集

使用來自工作細胞庫之培養物接種含以大豆為基質之培養基之菌種瓶並培育該瓶。待達到目標光學密度(吸光度)後，使用菌種瓶接種含以大豆為基質之培養基之菌種發酵槽。於34-38℃以120rpm振盪培育發酵槽，同時以3N NaOH使pH維持約7.2或以上。每2-3小時取樣，並量測其光學密度。當光學密度開始大幅成長時，每30分至1小時進行採樣，以量測其光學密度。在光學密度量測達到某值並維持恒定的1小時後，終止培養。然後，並無任何pH調整，以同樣溫度、同樣rpm振盪繼續進一步培養，直到pH達到5.5或更少。在進一步培養終止後，將0.12%濃度之去氧膽酸鈉加至該培養物，以裂解細菌細胞。使所得發酵槽內容物冷卻至10-15℃並維持於此溫度，並無振盪，達約3小時，以誘發蛋白質沉澱。然後，將混合物離心，以移除沉澱蛋白 質與細胞碎片。

純化

將獲自離心之溶液以深度型過濾器過濾，以移除未於離心期間沉澱之蛋白質與細胞碎片。該濾液於100kDa MW膜上濃縮，濃縮物以25mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)透析過濾。透析過濾係進行直至濾液導電率達到約3-4mS/cm為止，TMP設定為0.5-1.5巴或以下。從樣本移除雜質後，添加來自庫存溶液以提供約2.5% HB(w/v)最終濃度之溴化鯨蠟基三甲基銨[溴化鯨蠟基三甲銨，溴化十六烷基-三甲基銨(HB)]使多醣從該濃縮透析過濾溶液沉澱，同時振盪約1小時，接著離心。將所得多醣沉降粒溶於約0.25M氯化鈉水溶液並將來自庫存NaI溶液以提供約0.5%(w/v)最終濃度之碘化鈉(NaI)加至多醣溶液。將該溶液離心，以獲得上清液並將活性碳慢慢加至上清液，至約2.0w/v%，同時振盪約1小時，然後過濾溶液。濾液於30kDa膜上濃縮並使用約10倍體積三次蒸餾水透析過濾該濃縮物。透析過濾係進行直至濾液導電率達到約10μS/cm為止，TMP設定為0.5-1.5巴或以下。濃縮物係經無菌過濾並儲存於-20℃。

各純化步驟所獲蛋白質、核酸與多醣總量及其純化產量展示於表10。

如表10所示，本發明方法所獲莢膜多醣血清型23F係符合殘留蛋白質含量之規範，並無運用任何個別酸化方法，其回收產量為60%或更多。於是，根據本發明之方法可有效地以簡化方法製造莢膜多醣。

Claims (12)

1. 一種用於製備肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣的方法，其包含：(a)培養肺炎鏈球菌血清型，同時使培養液內的pH維持於7.0至9.4之範圍內；(b)在培養液吸光度達到持平時與吸光度開始下降時之間，終止步驟(a)中的培養；(c)進一步培養獲自步驟(b)之培養液，並無pH調整，直到培養液pH降至5.5或以下；(d)添加裂解劑至獲自步驟(c)之培養液，以裂解細胞，使蛋白質沉澱並移除沉澱蛋白質與細胞碎片；及(e)從獲自步驟(d)之溶液分離與純化莢膜多醣。
2. 如請求項1之方法，其中該肺炎鏈球菌血清型為1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F。
3. 如請求項1之方法，其中步驟(a)中的培養係於34-38℃以50-150rpm之振盪進行。
4. 如請求項1之方法，其中步驟(b)係以培養液吸光度達到持平時起的1至3小時以內終止步驟(a)中的培養來進行。
5. 如請求項1之方法，其中步驟(c)中的進一步培養係於34-38℃以50-150rpm之振盪進行，並無pH調整。
6. 如請求項1之方法，其中步驟(d)中的裂解劑為去氧膽酸鈉。
7. 如請求項1之方法，其中步驟(d)係藉由下列進行：添加裂解劑至獲自步驟(c)之培養液，以裂解細胞，使所得溶液維持於10-20℃達3-24小時，並無振盪，以使蛋白質沉澱且藉由離心該所得溶液移除沉澱蛋白質與細胞碎片。
8. 如請求項1之方法，其中步驟(e)中的分離與純化係包含下列步驟：(i)經由深度型過濾器(Depth filter)過濾獲自步驟(d)之溶液，以獲得濾液；(ii)濃縮獲自步驟(i)之濾液，接著超濾與離心，以獲得上清液；(iii)添加陽離子型清潔劑至獲自步驟(ii)之上清液以供培育，並離心所得混合物，以獲得包含莢膜多醣的沉降粒或上清液；(iv)使獲自步驟(iii)之莢膜多醣和碘化鈉反應，隨後離心所得反應混合物，以獲得上清液；(v)添加活性碳至獲自步驟(iv)之溶液並過濾所得混合物，以獲得濾液；及(vi)濃縮獲自步驟(v)之濾液並進行超濾與離心，以獲得莢膜多醣。
9. 如請求項8之方法，其中步驟(ii)中的濃縮係使用100kDa膜進行。
10. 如請求項8之方法，其中步驟(vi)中的濃縮係使用30kDa膜進行。
11. 如請求項8之方法，其中步驟(iii)中使用的陽離子型清潔劑為溴化鯨蠟基三甲基銨(cetyltrimethylammonium bromide)。
12. 如請求項8之方法，其中步驟(v)中的活性碳係以1-5%(w/v)之份量使用。