CN107936128B

CN107936128B - 一种简便有效的细菌疫苗纯化方法

Info

Publication number: CN107936128B
Application number: CN201711175681.5A
Authority: CN
Inventors: 陈元芬; 陈道远; 吴强; 张熠; 雷宇; 王文; 王宇
Original assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2017-11-22
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2037-11-22
Also published as: CN107936128A

Abstract

本发明在保证肺炎多糖免疫原性和符合欧洲药典各指标要求的前提下，提供了一套快速的、简化的肺炎链球菌发酵液纯化方法，用于制备精制的荚膜多糖。该方法通过改进裂解剂作用环境，控制发酵液的细菌密度、裂解剂浓度、添加裂解剂后的裂解时间，并调节pH到一定范围，可直接经离心、超滤等步骤后用乙醇沉淀多糖，即为精制多糖，取消了微滤、层析等步骤，去掉了CTAB、酶、苯酚等物料的添加，具有多糖收率高、过程简单快速、减少时间成本、人力成本和物料成本等优点。

Description

一种简便有效的细菌疫苗纯化方法

技术领域

本发明涉及一种细菌疫苗的纯化方法，具体涉及一种细菌荚膜多糖的纯化方法。

背景技术

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)是环境中常见的致病菌，5％～10％正常人上呼吸道中携带此菌。引起的疾病根据感染部位可分为侵袭性肺炎球菌疾病(Invasive Pneumococ-cal Disease，IPD)和非IPD(NIPD)。IPD包括脑膜炎、菌血症、脓毒症以及积脓症、心包炎、心内膜炎、腹膜炎和化脓性骨关节炎等；NIPD则主要包括：扁桃体咽炎、中耳炎、鼻窦炎等。

肺炎链球菌感染是在全球范围内引起死亡的重要原因之一，婴幼儿和65岁以上老年人发病率明显高于其他年龄组。全球每年有1200万的儿童因感染肺炎链球菌住院，160万幼儿死亡，在用疫苗可预防儿童死亡的疾病中，肺炎链球菌引起的疾病排名第一，随着抗菌素的大量使用，耐药菌株与日俱增，医学界肺炎疫苗的研发关注度逐渐提高。

1977年美国食品药品管理局批准了默沙东的14价肺炎球菌多糖疫苗上市，自此第一个正式的肺炎疫苗诞生，此后该类疫苗的生产改进和研发一直在多国进行，目前市场上常见且效果较好的是23价肺炎多糖疫苗和13价肺炎结合疫苗。肺炎链球菌的荚膜多糖是肺炎链球菌最重要的毒力因子，是血清学分型的依据，同时也是重要的保护性抗原，现有疫苗均是提取其荚膜多糖为原料制得。

荚膜多糖制备的一般工艺为：菌种制备、发酵培养、荚膜多糖纯化后制得精制多糖，目前肺炎菌体的培养大都能达到较高的菌体密度，而多糖纯化工艺，一直在研发、改进和提升中。

现有专利和文献所述的荚膜多糖纯化方式多种多样，且相同纯化方法也有处理顺序的不同，目前常见的关键处理步骤包括：直接(或加裂解剂后)离心或微滤去固体杂质，调pH(文献和专利出现最低pH为3.0)或用蛋白酶、核酸酶等处理去蛋白和核酸，加活性炭或者碘化钠进一步去除杂质，用CTAB或(一次或二次)乙醇沉淀荚膜多糖，再用苯酚抽提或层析法精制多糖等。我们在前人研究的基础上，通过反复的摸索，惊喜地发现了一套快速、简单、无人员毒害和环境污染的荚膜多糖纯化工艺技术，并且多糖经检验均符合欧洲药典标准。该方法能提高多糖收率以及生产效率、显著降低生产成本，有实际的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，在保证肺炎多糖免疫原性和符合欧洲药典各指标要求的前提下，提供一套快速的、简化的肺炎链球菌发酵液纯化方法，用于制备精制的荚膜多糖。该方法通过改进裂解剂作用环境，控制发酵液的细菌密度、裂解剂浓度、添加裂解剂后的裂解时间，并调节pH到一定范围，可直接经离心、超滤等步骤后用乙醇沉淀多糖，即为精制多糖，取消了微滤、层析等步骤，去掉了CTAB、酶、苯酚等物料的添加，具有多糖收率高、过程简单快速、减少时间成本、人力成本和物料成本等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种简便有效的细菌疫苗纯化方法，其特征在于：

S1、生产荚膜多糖的细菌发酵液，培养至吸光度保持恒定并开始下降时，终止培养；

S2、用组氨酸缓冲液稀释发酵液OD₆₀₀至6.0以下，加裂解剂至终浓度为 0.08～0.15％(w/v)，控温14～18℃，持续搅拌24～48小时；

S3、将S2步骤处理后的发酵液调pH至2.0～3.0，然后静置沉淀；

S4、将S3步骤处理后的发酵液连续流离心，收集上清，再澄清过滤、超滤；

S5、加入活性炭、澄清过滤、超滤；

S6、用一定浓度的乙醇沉淀S5步骤所得超滤液，得多糖沉淀；

S7、离心S6步骤所得沉淀，用无水乙醇和丙酮洗糖、吹干，得精制荚膜多糖，-20℃保存。

优选的，所述组氨酸缓冲溶液由组氨酸、KCl、MgCl₂通过注射用水配制而成。

优选的，所述组氨酸缓冲溶液中组氨酸含量为90-120mmol/L，KCl含量为 240-275mmol/L，MgCl₂含量为10mmol/L。

优选的，步骤S3中调pH以后，在常温下静置沉淀1～12小时。

优选的，步骤S3中调pH以后，在2～8℃静置2～72小时。

优选的，步骤S2中所述裂解剂为非动物源型溶解剂或动物源型溶解剂。

优选的，步骤S2中所述裂解剂为脱氧胆酸钠。

优选的，步骤S4中仅需要将调pH处理后的发酵液进行一次离心即可完成有效的固液分离。

优选的，步骤S3中所用的调pH所用酸为乙酸、磷酸、盐酸和硫酸的任意一种。

优选的，步骤S6中所述乙醇的浓度为80％。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过改进裂解剂作用环境，使用组氨酸缓冲液稀释发酵液到一定菌体浓度以后再加入裂解剂使荚膜从菌体上剥，裂解剂在上述缓冲溶液中能够更大程度地发挥裂解作用进而有效提高多糖收率，并且后续的调pH步骤中在pH 降低将蛋白质等杂质沉淀出来时，能够减轻酸性环境对于多糖产率的影响；

2、本发明通过组合设定裂解的菌体浓度、裂解剂浓度和裂解时间以上三个工艺参数，有效调控荚膜从菌体上剥离的程度，进而控制多糖的收率；

3、本发明通过改进裂解剂作用环境、控制发酵液的细菌密度、控制添加裂解剂后的裂解时间，并加酸调pH值有效沉淀裂解后菌液中绝大部分蛋白、核酸及其他杂质，可直接经离心、超滤等步骤后用乙醇沉淀多糖，即为精制多糖，取消了微滤、层析等步骤，去掉了CTAB、酶、苯酚等物料的添加，并且在调节pH 后只需要进行一次离心即能达到很好的分离效果，具有过程简单快速、减少时间成本、人力成本和物料成本等优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

本发明所述的荚膜多糖纯化方法，皆适用于肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、 6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、 23F共24个血清型，也适用于b型流感嗜血杆菌、流行性脑膜炎球菌等菌的荚膜多糖纯化。此处只是举例，而不限于这些细菌。

实施例1：一种细菌疫苗的纯化方法，它包括以下步骤：

S1、肺炎1型发酵液，培养至吸光度保持恒定并开始下降时，终止培养。

S2、用组氨酸缓冲液稀释发酵液OD₆₀₀至4.9，加裂解剂至终浓度为0.10％(w/v)，控温14℃，持续搅拌35小时。

S3、将S2步骤处理后的发酵液调pH至2.5，2～8℃静置40小时。

S4、将S3步骤处理后的发酵液连续流离心，收集上清。再过滤、超滤。

S5、加入活性炭、澄清过滤、超滤。

S6、用80％乙醇沉淀S5步骤所得超滤液，得多糖沉淀。

S7、离心S6步骤所得沉淀，用无水乙醇和丙酮洗糖、吹干，得精制荚膜多糖，于-20℃保存。

实施例2：一种细菌疫苗的纯化方法，它包括以下步骤：

S2、用组氨酸缓冲液稀释发酵液OD600至5.2，加裂解剂至终浓度为0.09％ (w/v)，控温15℃，持续搅拌29小时。

S3、将S2步骤处理后的发酵液调pH至3.0，常温静置沉淀6小时。

S5、加入活性炭、澄清过滤、超滤。

S6、用80％乙醇沉淀S5步骤所得超滤液，得多糖沉淀。

实施例3：一种细菌疫苗的纯化方法，它包括以下步骤：

S1、肺炎2型发酵液，培养至吸光度保持恒定并开始下降时，终止培养。

S2、用组氨酸缓冲液稀释发酵液OD₆₀₀至5.5，加裂解剂至终浓度为0.12％ (w/v)，控温16℃，持续搅拌24小时。

S3、将S2步骤处理后的发酵液调pH至3.0，常温静置沉淀3小时。

S5、加入活性炭、澄清过滤、超滤。

S6、用80％乙醇沉淀S5步骤所得超滤液，得多糖沉淀。

实施例4：一种细菌疫苗的纯化方法，它包括以下步骤：

S2、用组氨酸缓冲液稀释发酵液OD₆₀₀至4.8，加裂解剂至终浓度为0.15％ (w/v)，控温18℃，持续搅拌27小时。

S3、将S2步骤处理后的发酵液调pH至3.0，2～8℃静置沉淀25小时。

S5、加入活性炭、澄清过滤、超滤。

S6、用80％乙醇沉淀S5步骤所得超滤液，得多糖沉淀。

实施例5：一种细菌疫苗的纯化方法，它包括以下步骤：

S1、肺炎3发酵液，培养至吸光度保持恒定并开始下降时，终止培养。

S2、用组氨酸缓冲液稀释发酵液OD₆₀₀至5.8，加裂解剂至终浓度为0.13％ (w/v)，控温17℃，持续搅拌45小时。

S3、将S2步骤处理后的发酵液调pH至2.0，2～8℃静置48小时。

S5、加入活性炭、澄清过滤、超滤。

S6、用80％乙醇沉淀S5步骤所得超滤液，得多糖沉淀。

实施例6：一种细菌疫苗的纯化方法，它包括以下步骤：

S1、肺炎4型发酵液，培养至吸光度保持恒定并开始下降时，终止培养。

S2、用组氨酸缓冲液稀释发酵液OD₆₀₀至4.5，加裂解剂至终浓度为0.11％ (w/v)，控温16℃，持续搅拌40小时。

S3、将S2步骤处理后的发酵液调pH至3.0，常温静置沉淀7小时。

S5、加入活性炭、澄清过滤、超滤。

S6、用80％乙醇沉淀S5步骤所得超滤液，得多糖沉淀。

以下通过实验结果说明本发明的有益效果：

本发明实例的实验结果：多糖收率、各指标合格情况如表1所示。

表1纯化肺炎荚膜多糖后的实验结果

由表1可知：采用本发明纯化的肺炎荚膜多糖，收率较高，且各指标均符合欧洲药典标准。

表2使用不同缓冲液的多糖收率考察

通过实施例1中方法制备肺炎1型发酵液，分别将步骤(2)中稀释发酵液的缓冲液替换为注射用水、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液；通过实施例3中方法制备肺炎2型发酵液，分别将步骤(2)中稀释发酵液的缓冲液替换为注射用水、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液；通过实施例5中方法制备肺炎3型发酵液，分别将步骤(2)中稀释发酵液的缓冲液替换为注射用水、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液；通过实施例6中方法制备肺炎4型发酵液，分别将步骤(2)中稀释发酵液的缓冲液替换为注射用水、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液，分别考察上述不同类型细菌发酵液应用不同缓冲液情况下的多糖收率。

通过实验发现，当使用组氨酸缓冲液稀释发酵液到一定菌体浓度以后再加入裂解剂使荚膜从菌体上剥离，将菌体悬浮在组氨酸缓冲溶液中，裂解剂在上述缓冲溶液中能够更大程度地发挥裂解作用进而有效提高多糖收率，并且后续的调 pH步骤中在pH降低将蛋白质沉淀出来时，能够减轻酸性环境对于多糖产率的影响，通过组氨酸缓冲液来稀释发酵液进而制备荚膜多糖得到的多糖产率明显高于不使用缓冲液和使用其它缓冲液。

将本发明应用于规模化生产，较现有荚膜多糖纯化技术的优点见表3。

表3本发明与现有荚膜多糖纯化技术的比较

注：人员和时间的计算，按每周1批连续生产，每批40～100L发酵液处理

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种简便有效的细菌疫苗纯化方法，其特征在于：

S2、用组氨酸缓冲液稀释发酵液OD₆₀₀至6.0以下，加裂解剂至终浓度为0.08~0.15%（w/v），控温14~17℃，持续搅拌24~48小时；所述组氨酸缓冲溶液由组氨酸、KCl、MgCl₂通过注射用水配制而成；且所述组氨酸缓冲溶液中组氨酸含量为90-120mmol/L，KCl含量为240-275mmol/L，MgCl₂含量为10mmol/L；

S3、将S2步骤处理后的发酵液调pH至2.0~3.0，然后静置沉淀；

S5、加入活性炭、澄清过滤、超滤；

S6、用一定浓度的乙醇沉淀S5步骤所得超滤液，得多糖沉淀；

2.一种根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤S3中调pH以后，在常温下静置沉淀1~12小时。

3.一种根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤S3中调pH以后，在2~8℃静置2~72小时。

4.一种根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤S2中所述裂解剂为非动物源型溶解剂或动物源型溶解剂。

5.一种根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤S2中所述裂解剂为脱氧胆酸钠。

6.一种根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤S4中仅需要将调pH处理后的发酵液进行一次离心即可完成有效的固液分离。

7.一种根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤S3中所用的调pH所用酸为乙酸、磷酸、盐酸和硫酸的任意一种。

8.一种根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤S6中所述乙醇的浓度为80%。