KR20200021933A

KR20200021933A - 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 x 캡슐 다당류의 급속 고수율 정제 방법

Info

Publication number: KR20200021933A
Application number: KR1020197037325A
Authority: KR
Inventors: 산딮 샤르마; 산? 샤르마; 니틴 쿠마르; 사르마드 하니프; 다빈더 길
Original assignee: 엠에스디 웰컴 트러스트 힐레맨 랩스 피브이티. 리미티드
Priority date: 2017-06-27
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2020-03-02
Also published as: AR112366A1; ZA201908281B; BR112019027638A2; RU2019142860A; RU2019142860A3; CN110892076A; WO2019003239A1

Abstract

본 발명은 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 캡슐 다당류의 급속 고수율 정제 방법을 개시한다. 본 발명의 캡슐 다당류는 경제적인 1가 캡슐 다당류 또는 다당류 단백질 접합체 백신 또는 다가 조합 백신 뿐만 아니라 수막구균성 혈청군 X 감염에 대한 진단 도구를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 간단한 염과 적은 양의 에탄올을 사용한다. 상기 방법은 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X의 정제된 다당류의 높은 수율과 더불어 빠르고, 경제적이며, 규모확대가능하다.

Description

나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 캡슐 다당류의 급속 고수율 정제 방법

본 발명은 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 혈청군 X 캡슐 다당류의 급속 고수율 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 N. 메닌지티디스 혈청군 X 세균성 캡슐 다당류는 경제적인 1가 캡슐 다당류 또는 다당류 단백질 접합체 백신 또는 다가 조합 백신 뿐만 아니라 수막구균성 혈청군 X 감염에 대한 진단 도구의 생산에 사용될 수 있다.

N. 메닌지티디스(수막구균(meningococcus) 또는 Men)은 주로 13개의 혈청군 A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y 및 Z로 혈청학적으로 분류된 호기성 그램-음성 세균이다. 그룹화 시스템은 유기체의 캡슐 다당류를 기반으로 한다.

WHO의 공식 웹사이트는 N. 메닌지티디스가 전세계에서 가장 흔한 세균성 수막염의 원인 중 하나이고, 수막염의 큰 전염병을 일으킬 수 있는 유일한 세균이다는 것을 언급한다. 특히, 사하라 사막 이남의 아프리카에서 주민 100,000명당 최대 1000건의 발병률을 갖는 전염병이 보고되었다.

N. 메닌지티디스는 에어로졸 또는 환자 또는 건강한 인간 담체의 호흡기 분비물과의 직접 접촉에 의해 전송된다. 일반적으로, 풍토병은 주로 어린이 및 청소년에서 일어나고 3 내지 12개월 영아에서 가장 높은 공격률을 보이는 반면, 전염병이 있는 나이 많은 어린이 및 젊은 성인이 더 많이 관련될 수 있다. 그러나, 수막구균성 질환의 급속한 진행은 발병 후 1 내지 2일 이내에 빈번하게 사망에 이른다. N. 메닌지티디스 감염은 예방 접종에 의해 예방될 수 있다.

MenA는 아프리카와 아시아에서 가장 널리 알려진 혈청군이었지만, 북미에서는 드물고/실제로 존재하지 않는다. 유럽 및 미국에서, 혈청군 B(MenB)는 질환 및 사망의 주요 원인이며, 혈청군 MenC 및 MenW가 뒤따른다. 최근에, MenX 발생은 사하라 사막 이남의 아프리카에서 나타나기 시작했다. 문헌[참조: Xie O et al, "Emergence of serogroup X meningococcal disease in Africa: need for a vaccine", Vaccine. 2013 Jun 12;31(27):2852-6]에 따라서, 혈청군 X는 수막구균은 이전에는 산발성 수막염의 드문 원인으로 간주되었지만, 2006-2010년 동안, 혈청군 X 수막염의 대유행이 니제르, 우간다, 케냐, 토고 및 브루키나 파소에서 발생되었고, 후자에는 6732건의 보고된 사례 중 적어도 1300건의 혈청군 X 수막염에 대한 사례가 있었다.

또 다른 NCBI 공보에 따라서 2006-2009년 동안 토고에서 혈청군 X 수막구균은 702건의 확인된 세균성 수막염 사례의 16%를 차지했다. 코자흐 지구는 2007년 3월에 혈청군 X 수막구균 계절적 누적 발생률이 33/100,000인 혈청군 X 수막구균 발생을 경험했다. 2007-2010년 동안 부르키나 파소에서, 혈청군 X 수막구균이 778건의 확인된 세균성 수막염 사례의 7%를 차지하고, 2009년부터 2010년까지 증가했다(각각, 확인된 모든 사례의 4% 내지 35%). 2010년에, 혈청군 X 수막구균 전염병은 부르키나 파소의 북부 및 중부 지역에서 발생했고; 혈청군 X 수막구균의 지구 누적 최고 발병률은 3월-4월 동안 130/100,000으로 추정되었다.

다수의 혈청군은 수막구균성 질환에 대한 범용 백신의 개발을 방해했다. 최초의 수막구균 다당류 백신의 생산은 이 치명적인 질환에 대항할 긴급한 필요성이 존재했기 때문에 1978년에 달성되었다. 이후, 일반적인 다당류 백신은 2세 미만의 어린이에게는 매우 효과적이지 않은 것으로 관찰되었다. 이러한 관찰은 영아가 미성숙 면역계를 가지고 있고, 일반적인 다당류에 대한 면역 반응을 이끌어 낼 수 없음을 나타내는 추가 연구를 유도했다.

면역 반응은 T-세포 의존성(TD) 면역 반응 및 T-세포 독립적(TI) 면역 반응으로서 특징지워질 수 있다. 단백질 및 펩타이드는 헬퍼 T 림프구를 자극하고 기억 세포를 생성함으로써 TD 항원을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 대조적으로, 다당류는 T-세포 활성화를 유도하지 않고 임의의 기억 B 세포를 형성하지 않는 TI 항원에 속하며, 이는 미성숙 면역계를 갖기 때문에 영아를 다루는 동안 주요 단점이다.

따라서, 영아들 사이에서 증가된 면역원성, 연장된 보호 기간 및 수막구균의 비인두 캐리지의 감소를 특징으로 하는 T-세포 의존성 면역 반응을 유도하는 단백질 담체에 세균성 다당류를 접합시킬 필요가 있었다. 이러한 요구는 다당류-단백질 접합체 백신의 생산을 초래하는 독창적인 연구에 의해 충족되었고, 최초의 수막구균성 접합체 백신이 1999년 영국에서 허가되었다.

백신의 제조에 사용되는 다당류, 특히 항원성 캡슐 다당류는 각각 1개, 2개 또는 더 많은 다당류를 함유하는 1가, 2가 및 다가 (다중) 백신일 수 있다. 이들은 다양한 미생물에 의해 유발된 특정 질환 또는 감염의 예방을 위해 시장에서 쉽게 구입할 수 있다. 1가 또는 다가 다당류 기반 백신은 수년 동안 사용되어 왔으며, 폐렴구균성, 수막구균성 또는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 질환과 같은 질환을 예방하는 데 유용한 것으로 입증되었다. 그러나, 수막구균성 혈청군 X 접합체를 함유하는 허가된 백신은 없다.

정제된 N. 메닌지티디스 캡슐 다당류의 생산은 담체 단백질과의 효과적인 접합 및 접합체 백신으로서의 이의 개발을 위한 가장 중요한 요건이다. N. 메닌지티디스의 배양 및 다당류의 정제 비용은 일반적으로 높고, 일련의 생산 및 정제 단계를 포함하기 때문에 작업 시간이 오래 걸린다.

생산 및 정제 단계에서의 개선은 효과적이고 경제적으로 실행 가능한 접합체 백신의 제형을 유도할 것이다.

다당류의 생산 및 정제 방법을 기재하는 다수의 특허 및 비특허 개시 내용이 있다. 하나의 비특허 문헌[참조: David Bundle et al, "Studies on the Group-specific Polysaccharide of Neisseria meningitidis Serogroup X and an improved Procedure for its isolation" Journal of Biological Chemistry, 1974]에서, N. 메닌지티디스 균주 247 X로부터 Men X 다당류의 제조 및 단리를 논의하고, 여기서 상기 균주는 18시간 동안 화학적으로 정의된 배지(NCDM) 상에서 성장되었고, 약 20㎎/ℓ를 산출한다. 또 다른 개시 내용은 새로운 발효 배지, 첨가 전략을 포함하는 최적의 공급 용액 및 임의의 크로마토그래피 방법이 없는 향상된 정제 방법을 사용하는 Men X의 정제에 관한 US2015/0299750(Pisal Sambhaji Shankar et al)이다. 개시된 특허 출원은 미정제 다당류의 정제를 위해 다수의 단계 및 정제 공정을 위해 장시간을 사용한다.

현재, N. 메닌지티디스 혈청군 X의 정제에 사용되는 다양한 방법은 비교적 긴 시간이 소요되어 생산 비용을 증가시키고, 비용 효과적이고 시기 적절한 방식으로 확장할 수 없기 때문에 방법을 상업적으로 덜 실현 가능하게 한다. 또한, 그들은 다수 단계로 인화성 용매를 포함한다.

본 발명의 목적은 삼나트륨 시트레이트 및 황산나트륨과 같은 간단한 염을 사용하여 감소된 시간 및 높은 수율로 N. 메닌지티디스 혈청군 X 세균성 다당류의 개선된 정제 방법을 제공하고, 더 적은 양의 인화성 용매를 필요로 하는 것이다. 본 발명의 상기 개선된 정제 방법은 보다 저렴한 가격으로 다당류 단백질 접합체 백신을 제조할 것이고, 이어서 백신을 특히 개발 도상국 어린이들이 알맞은 가격으로 이용할 수 있게 할 수 있다.

본 발명의 주요 목적은 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 캡슐 다당류의 급속 고수율 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 불순물을 침전시키기 위해 간단한 염을 효율적으로 사용하는 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 다당류의 급속 고수율 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 감소된 양의 인화성 용매를 효율적으로 사용하는 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 다당류의 급속 고수율 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 간단하고 비용 효과적이며 시간 효율적이고 상업적으로 확장 가능한 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 다당류의 급속 고수율 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 경제적인 캡슐 다당류 또는 다당류 단백질 접합체 1가 백신 또는 다가 조합 백신 뿐만 아니라 수막구균성 혈청군 X 감염에 대한 진단 도구를 생산하는데 사용될 수 있는 정제된 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 다당류를 수득하기 위한 급속 고수율 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 관련 품질 사양을 만족시키는 고품질 생성물을 더 나은 수율로 생산하는 것이다.

따라서, 본 발명은 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 캡슐 다당류의 급속 고수율 정제 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법으로부터 수득된 정제된 N. 메닌지티디스 혈청군 X 캡슐 다당류는 경제적인 1가 캡슐 다당류 또는 다당류 단백질 접합체 백신 또는 다가 조합 백신 뿐만 아니라 수막구균성 혈청군 X 감염에 대한 진단 도구를 생산하는데 사용될 수 있다.

상기 정제 방법은 상당히 감소된 시간에 정제된 N. 메닌지티디스 혈청군 X(MenX로 지칭되기도 함) 다당류를 제공한다. 상기 정제 방법은 임의의 크로마토그래피 단계를 필요로 하지 않는다.

본 발명의 정제 방법은 삼나트륨 시트레이트 및 황산나트륨과 같은 간단한 염을 최적 농도로 효율적으로 사용한다. 발효액의 미정제 다당류를 간단한 염과 혼합하고, 유기 용매를 첨가하고, 100KDa MWCO 폴리에테르 설폰 막을 사용하여 원심분리 및 정용여과하여 불순물이 감소된 용액을 형성한다. 불순물이 감소된 상기 용액을 양이온성 시약, 바람직하게는 4차 암모늄 계면활성제(CTAB)로 처리하고, 실온에서 혼합시킨다.

혼합 후 생성된 용액을 원심분리시켜 펠렛을 수득한다. 펠렛을 염 및 에탄올에 용해시키고, 배양한다. 생성된 배양 용액을 다시 원심분리하여 염, 세제 및 에탄올과 함께 MQW에 용해된 펠렛을 수득한 다음, 혼합시킨다. 생성된 용액을 다시 원심분리시키고, 상청액을 수집한다.

수집된 상청액을 탄소 여과한 후, MQW(Milli Q Water)로 농축 및 정용여과한 후, 최종적으로 멸균 여과시키고, 정제된 세균성 다당류는 저장한다.

따라서, 정제된 다당류는 확장 가능한 비용 효과적이고 효율적인 방법을 사용하여 상당히 감소된 시간에 회수된다.

상기 방법은 보나 나은 수율로 목적하는 사양을 충족시키는 정제된 다당류를 생성하는 강력하고 빠른 방법을 제공하고, 인화성 용매의 최소 사용과 같은 종래 기술에 비해 다수의 이점을 나타낸다. 추가의 이점은 이 방법이 완전히 확장 가능하다는 것이다.

본 발명의 정제된 세균성 다당류는 경제적인 1가 캡슐 다당류 또는 다당류 단백질 접합체 백신 또는 다가 조합 백신 뿐만 아니라 수막구균성 혈청군 X 감염에 대한 진단 도구를 생산하는데 사용될 수 있다.

도 1은 MenX-PS 정제를 위한 공정 흐름도를 도시한다.
도 2는 RI 검출기를 사용하는 정제된 MenX PS의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 3은 정제된 MenX PS의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다.

본 발명은 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 캡슐 다당류의 급속 고수율 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 방법으로부터 수득된 정제된 N. 메닌지티디스 혈청군 X 캡슐 다당류는 경제적인 1가 캡슐 다당류 또는 다당류 단백질 접합체 백신 또는 다가 조합 백신 뿐만 아니라 수막구균성 혈청군 X 감염에 대한 진단 도구를 생산하는데 사용될 수 있다.

상기 정제 방법은 상당히 감소된 시간에 정제된 N. 메닌지티디스 혈청군 X(MenX로서 지칭되기도 함) 다당류를 제공한다. 상기 정제 방법은 임의의 크로마토그래피 단계를 필요로 하지 않는다.

본 발명의 정제 방법은 삼나트륨 시트레이트 및 황산나트륨과 같은 간단한 염을 최적 농도로 효율적으로 사용한다. 발효액의 미정제 다당류를 간단한 염과 혼합하고, 유기 용매를 첨가하고, 100 KDa MWCO 폴리에테르 설폰(PES) 막을 사용하여 원심분리 및 정용여과시켜 불순물이 감소된 용액을 형성한다. 불순물이 감소된 상기 용액을 양이온성 시약, 바람직하게는 4차 암모늄 계면활성제(CTAB)로 처리하고 혼합시킨다.

생성된 혼합물을 원심분리시켜 펠렛을 수득한다. 펠렛을 염 및 에탄올에 용해시키고, 배양한다. 생성된 배양 용액을 다시 원심분리하여 염, 세제 및 에탄올과 함께 MQW에 용해된 펠렛을 수득한 다음 혼합시킨다. 생성된 용액을 다시 원심분리시키고, 상청액을 수집한다.

수집된 상청액을 탄소 여과한 후, MQW로 농축 및 정용여과한 후, 최종적으로 멸균 여과시키고, 정제된 세균성 다당류는 저장한다.

도 1은 MenX 정제 공정 흐름도를 도시한다. 본 발명의 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X 세균성 다당류의 급속 고수율 정제 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 미리결정된 간단한 염 용액 및 특정 농도의 건조 염 분말을 첨가하여 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X의 발효액을 처리하는 단계;

(b) 단계 (a)의 염 처리된 용액에 특정 부피의 유기 용매를 첨가하는 단계;

(c) 단계 (b)의 용액을 실온에서 특정 기간 동안 혼합하는 단계;

(d) 특정 rpm에서 미리결정된 기간 동안 단계 (c)의 용액의 원심분리를 수행하는 단계;

(e) 단계 (d)의 원심분리된 용액으로부터 상청액을 수집하는 단계;

(f) 상기 단계 (e)의 상청액을 분자량 컷 오프 막을 사용하여 농축 및 정용여과(diafiltration)시켜 부분 정제된 세균성 다당류를 수득하는 단계;

(g) 상기 단계 (f)의 부분 정제된 세균성 다당류를 특정 조건하에 적어도 하나의 양이온성 세제로 침전시킨 후, 이어서 특정 rpm에서 미리결정된 기간 동안 원심분리하여 제1 펠렛을 수득하는 단계;

(h) 상기 제1 펠렛을 무기 침전제에 용해시키는 단계;

(i) 상기 단계 (h)의 용해된 제1 펠렛을 침전을 향상시키기 위한 미리결정된 배양 조건에서 적어도 하나의 유기 용매에서 혼합하는 단계;

(j) 상기 단계 (i)의 용액을 특정 조건하에 원심분리시킨 후, 이어서 제2 펠렛을 수집하는 단계;

(k) 상기 제2 펠렛을 MQW에 용해시키고, 특정 화학적 시약, 특정 유기 용매로 처리한 후, 이어서 특정 조건에서 배양하는 단계;

(l) 상기 단계 (k)의 배양 용액을 특정 원심분리 조건하에 원심분리시킨 후, 이어서 상청액을 수집하는 단계;

(m) 원하는 광학 밀도가 달성될 때까지 상기 단계 (l)의 상청액을 탄소 여과시켜 여액을 수득하는 단계;

(n) 상기 단계 (m)의 탄소 여액을 PES 여과 어셈블리를 사용하여 여과시킨 후, 이어서 특정 조건하에 농축 및 정용여과하는 단계;

(o) 상기 단계 (n)의 정용여과된 상청액을 특정 PES 여과 어셈블리를 사용하여 여과하여 정제된 다당류를 수득하는 단계;

(p) 상기 단계 (o)의 정제된 다당류를 특정 조건하에 저장하는 단계.

본 방법은 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X의 정제된 다당류를 147 내지 323 ㎎/ℓ 범위로 산출한다. 평균 수율은 200 ㎎/ℓ이다. 정제 방법은 24±2시간 내에 완료된다.

최선의 실시형태 중 하나에서, 발효액은 0.25M 삼나트륨 시트레이트, 2M 스톡 용액으로부터 25 %(v/v) 황산나트륨 용액을 첨가한 후 25 %(v/v)의 무수(absolute) 에탄올을 첨가하여 처리했다. 용액을 실온(RT, 25±2℃)에서 2시간 동안 연속 혼합했다. 용액을 10550 x g에서 30분 동안 원심 분리하고 상청액을 수집했다. 상청액을 농축시키고 10 내지 12 부피의 MQW를 갖는 0.1 m² 100 kDa 폴리에테르 설폰(PES) 막으로 정용 여과시켰다.

농축 및 정용여과된 물질을 실온에서 4시간 동안 연속 혼합하면서 15 %(v/v)의 10 % 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 스톡 용액으로 처리하였다. 40분 동안 10550 x g에서 원심분리를 수행하고, 수집된 펠렛을 0.15M 염화칼슘 용액에 용해시켰다. 용해 후, 90 %(v/v)의 무수 에탄올을 첨가하고, 2 내지 8 ℃에서 밤새 배양했다. 40분 동안 10550 x g에서 원심분리를 수행하고, 수집된 펠렛을 MQW에 적절하게 용해시키고, 2 내지 8 ℃에서 2시간 동안 배양하면서 10 %(w/v) 나트륨 아세테이트, 1.1 %(w/v) 나트륨 데옥시콜레이트(DOC) 및 30% v/v의 무수 에탄올물로 추가로 처리했다. 10550 x g에서 30분 동안 원심분리를 수행하고, 수집된 상청액은 광학 밀도 260 ㎚가 ≤ 0.2에 도달할 때까지 에탄올 프라이밍된 밀리스택 포드 탄소 필터를 사용하여 탄소 여과시켰다. 상기 물질은 0.2 μ PES 여과 어셈블리를 사용하여 여과시켰다. 이후, 여액을 농축시키고 15 내지 20 부피의 MQW를 갖는 0.1 m² 100 kDa PES 막으로 정용여과한 다음, 0.2 μ PES 여과 어셈블리를 사용하여 여과했다. 정제된 MenX PS는 -20±2℃에서 저장한다.

2.5 ℓ 발효 스케일에서 본 발명의 정제 방법의 수율은 대략 147-323 ㎎/ℓ의 정제된 MenX PS이다.

따라서, 정제된 다당류는 확장 가능하고 비용 효과적이며 효율적인 방법을 사용하여 상당히 감소된 시간에 회수된다.

상기 방법은 더 나은 수율 및 인화성 용매의 최소 사용으로 목적하는 사양을 만족시키는 정제된 다당류를 생성하는 강력하고 빠른 방법을 제공하는 것과 같이 종래 기술에 비해 다수의 이점을 나타낸다. 추가 이점은 이 방법이 완전히 확장 가능하다는 것이다.

본 발명의 정제된 세균성 다당류는 경제적인 1가 캡슐 다당류 또는 다당류 단백질 접합체 백신 또는 다가 조합 백신뿐만 아니라 수막구균성 혈청군 X 감염에 대한 진단 도구의 생산에 사용될 수 있다.

정제된 다당류는 다당류의 품질을 조절하기 위해 공지된 분석 시험의 배터리를 사용하여 시험되었다. 각각의 다당류 배치 상에서 수행된 상이한 검정은 대표적인 정제된 MenX 다당류 배치의 결과와 함께 표 1에 열거되어 있다.

정제된 MenX 분석

파라미터	배치 1	배치 2	배치 3	배치 4	평균	SD
인 (%)	10.3	9.73	10.3	10.1	10.1	0.3
분자량 (kD)	456	569	661	554	560.0	83.9
PS 함량 (mg/ml)	1.97	0.9	0.67	0.83	1.1	0.6
핵산 함량 (%)	1.34	0.9	0.8	0.7	0.9	0.3
단백질 함량 (%)	0.44	0.44	0.42	0.47	0.4	0.0
내독소 (EU/μg)	7.8	7.8	7.8	7.8	7.8	0.0
분자 크기 분포 (%)	93.38	99.77	99.23	98.38	97.7	2.9
PS 수율 (㎎/ℓ 발효액)	323	152	147	179	200	83

EU: 내독소 단위; SD: 표준편차

도 2는 RI 검출기를 사용한 대표적인 정제된 MenX 다당류의 HPLC-SEC 크로마토그램을 도시한다. 정제된 다당류의 HPLC-SEC 분석은 TSK 4000 내지 5000 PWXL HPLC 컬럼을 연속 사용하여 수행되며, 작동 완충제로서 질산나트륨을 사용하여 UV 검출기로 모니터링한다. HPLC-SEC 크로마토그램 및 기타 물리-화학적 분석(표 1)에서 단일 주요 피크는 MenX 다당류의 순도를 목적하는 수준으로 확인한다.

도 3은 대표적인 정제된 MenX 다당류의 1H-NMR 스펙트럼을 도시한다. 정제된 MenX 다당류에 대한 ¹H-NMR은 중수소 산화물(D₂O)을 용매로 사용하여 Bruker Avance 500 MHz 기기에서 기록된다. 스펙트럼 피크는 MenX 다당류의 동일성을 확인시킨다. 스펙트럼에서 2 ppm에서의 피크는 다당류 단량체 구조에 존재하는 N-아세틸 그룹(NH-Ac)으로부터의 CH₃ 그룹의 3개의 양성자에 상응한다. 5.5 ppm에서의 피크는 아노머 알파 H-1 양성자를 나타낸다. 4.5 내지 3.6 ppm의 넓은 다중선은 글루코사민 환 상의 다른 모든 양성자에 상응한다. 스펙트럼은 다당류의 순도를 나타내는 주요 불순물 피크가 없음을 보여준다.

Claims

나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 혈청군 X 캡슐 다당류의 급속 고수율 정제 방법으로서, 상기 방법이
(a) 미리결정된 간단한 염 용액 및 특정 농도의 건조 염 분말을 첨가하여 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X의 발효액을 처리하는 단계;
(b) 단계 (a)의 염 처리된 용액에 특정 부피의 유기 용매를 첨가하는 단계;
(c) 단계 (b)의 용액을 실온에서 특정 기간 동안 혼합하는 단계;
(d) 특정 rpm에서 미리결정된 기간 동안 단계 (c)의 용액의 원심분리를 수행하는 단계;
(e) 단계 (d)의 원심분리된 용액으로부터 수득된 상청액을 수집하는 단계;
(f) 상기 단계 (e)의 상청액을 분자량 컷 오프 막을 사용하여 농축 및 정용여과시켜 부분 정제된 세균성 다당류를 수득하는 단계;
(g) 상기 단계 (f)의 부분 정제된 다당류를 특정 조건하에 적어도 하나의 양이온성 세제로 침전시킨 후, 이어서 특정 rpm에서 미리결정된 기간 동안 원심분리하여 제1 펠렛을 수득하는 단계;
(h) 상기 제1 펠렛을 무기 침전제에 용해시키는 단계;
(i) 상기 단계 (h)의 용해된 제1 펠렛에 적어도 하나의 유기 용매를 첨가한 후, 이어서 미리결정된 조건에서 배양하는 단계;
(j) 상기 단계 (i)의 용액을 특정 조건하에 원심분리시킨 후, 이어서 제2 펠렛을 수집하는 단계;
(k) 상기 제2 펠렛을 MQW에 용해시키고, 특정 화학적 시약 및 특정 유기 용매로 처리한 후, 이어서 특정 조건에서 배양하는 단계;
(l) 상기 단계 (k)의 배양 용액을 특정 원심분리 조건하에 원심분리시킨 후, 상청액을 수집하는 단계;
(m) 원하는 광학 밀도가 달성될 때까지 상기 단계 (l)의 상청액을 탄소 여과시켜 탄소 여액을 수득하는 단계;
(n) 상기 단계 (m)의 탄소 여액을 PES 여과 어셈블리를 사용하여 여과시킨 후, 이어서 특정 조건하에 농축 및 정용여과하는 단계;
(o) 상기 단계 (n)의 정용여과된 상청액을 특정 PES 여과 어셈블리를 사용하여 여과하여 정제된 다당류를 수득하는 단계;
(p) 상기 단계 (o)의 정제된 다당류를 특정 조건하에 저장하는 단계를 포함하고,
상기 방법이 경제적이고 규모확대가능하며, 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X의 정제된 다당류를 147 내지 323 ㎎/ℓ의 발효액의 범위로 산출하는, 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 미리결정된 간단한 염 용액 및 특정 농도의 건조 염 분말이 0.25±0.1M 삼나트륨 시트레이트 및 2M 스톡 용액으로부터의 25±5 %(v/v) 황산나트륨 용액인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 유기 용매가 25±5 %(v/v)의 무수 알콜인, 방법.
제1항에 있어서, 혼합을 위한 상기 단계 (c)의 특정 기간이 2±0.5시간인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (d)의 원심분리가 10000 내지 11000 x g에서 30±5분 동안 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (f)의 정용여과가 10 내지 12 부피의 MQW와 함께 100 kDa PES 막으로 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (g)의 양이온성 세제가 15±2 %(v/v)의 10% CTAB 스톡 용액인, 방법.
제1항에 있어서, 양이온성 세제로의 침전을 위한 상기 단계 (g)의 특정 조건이 실온에서 4±1시간인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (g)의 원심분리가 10000 내지 11000 x g에서 40±10분 동안 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 무기 침전제가 0.15±0.03M 염화칼슘 용액인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (i)의 적어도 하나의 유기 용매가 90±5 %(v/v)의 무수 에탄올인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (i)의 미리결정된 배양 조건이 2 내지 8 ℃에서 밤새 배양인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 원심분리의 특정 조건이 40±10분 동안 10000 내지 11000 x g인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (k)의 특정 화학적 시약이 10±2 %(w/v) 나트륨 아세테이트 및 1.1±0.1 %(w/v) 데옥시콜레이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (k)의 특정 유기 용매가 30±5 %(v/v)의 무수 에탄올인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (k)의 배양을 위한 특정 조건이 2±0.5시간 동안 2 내지 8℃인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (l)의 원심분리의 특정 조건이 30±5분 동안 10000-11000 x g인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (m)의 탄소 여과가 에탄올 프라이밍된 밀리스택 포드 탄소 필터로 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (m)의 원하는 광학 밀도가 OD260 ㎚ 0.2 이하인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (n)의 농축 및 정용여과를 위한 특정 조건이 10 내지 20 부피의 MQW와 함께 100 kDa 컷오프 PES 막인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (o)의 특정 PES 여과 어셈블리가 0.2 μ PES 여과 어셈블리인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 정제된 다당류를 저장하기 위한 상기 특정 조건이 -20±2 ℃인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법이 다당류 특정 품질 표준을 따르는, 방법.
제1항에 있어서, 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X의 정제된 다당류의 수율이 최대 323 ㎎/ℓ인, 방법.
제1항에 있어서, 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 X의 상기 정제된 다당류를 수득하기 위한 상기 방법이 정제된 다당류를 24±2시간 내에 완료하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 정제된 세균성 다당류가 경제적인 1가 캡슐 다당류 또는 다당류 단백질 접합체 백신 또는 다가 조합 백신뿐만 아니라, 수막구균성 혈청군 X 감염에 대한 진단 도구를 생산하는데 사용될 수 있는, 방법.