CN1209163C - 脑膜炎球菌疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脑膜炎球菌疫苗及其制备方法。将纯化的A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白进行化学偶联而形成单价结合物，再将单价结合物混合配制而成。这种疫苗可以用于预防婴幼儿由A、C群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎及败血症疾病。

Description

脑膜炎球菌疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种脑膜炎球菌疫苗。具体而言，本发明涉及一种脑膜炎球菌结合疫苗。更具体而言，本发明涉及一种含有A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖与B群脑膜炎球菌外膜蛋白偶联的结合疫苗。本发明还涉及这种疫苗的制备方法。
背景技术
脑膜炎奈瑟氏球菌所致疾病是世界范围内引起严重疾病和高死亡率的一个重要因素。在磺胺和抗菌素发明以前，脑膜炎球菌疾病病死率约为70％。今天，尽管有良好的治疗措施，即使在发达国家中该病的病死率仍可高达10％，并且其引发的败血症病死率更可超过50％。奈瑟氏脑膜炎球菌每年在全球引起了500,000病例和50,000例死亡。
脑膜炎奈瑟氏球菌俗名为脑膜炎球菌，学名为Neisseriameningitidis，有时也称为奈瑟氏脑膜炎球菌。脑膜炎奈瑟氏球菌为需氧菌，革兰氏阴性有荚膜常成双排列，故又称为双球菌。由于无荚膜菌株几乎不引起临床疾病，因此荚膜在细菌毒力方面扮演了重要作用。根据荚膜多糖特性的不同至少可分为13个血清群：A、B、C、D、E29、H、I、K、L、W135、X、Y、Z。但只有属于A，B，C，Y和W135这5个群中的任一群才会致病，90％的脑膜炎球菌疾病是由A、B、C三群引起的。
脑膜炎奈瑟氏球菌是全世界细菌性脑膜炎中主要的病原体。世界唯一能引起脑膜炎大规模爆发流行细菌。即使有良好的医疗条件，急性脑膜炎球菌经常可于发病后一二天内产生死亡或留下严重后遗症。化学药品对于控制疾病爆发流行几乎没有价值。更为重要的是，随着抗菌素大量使用和/或滥用，在世界许多地方包括中国在内的脑膜炎球菌对抗菌素的耐药性大量增加，就使得通过免疫接种疫苗来预防和控制该病成为紧迫的任务。
当前已有2类疫苗在大规模应用。第一类是多糖疫苗：国际市场上有单价、两价和四价脑膜炎球菌多糖疫苗，即A、A+C和A+C+Y+W135。该类疫苗是经纯化的荚膜多糖制备而成。第二类是脑膜炎球菌结合疫苗：即C群特异性荚膜多糖与一蛋白载体经偶联后的结合疫苗。
第一类多糖疫苗非常安全，明显的全身性反应极少见。最常见的副反应为注射部位持续1至2天的发红和轻微的疼痛。超过38.5℃的发热比率为1％-4％。单价疫苗、二价疫苗和四价疫苗在安全性或反应原性方面没有显著性差异。但是，A群多糖在两岁以下年龄组中表现很弱的免疫原性和短暂的保护期，而C群多糖在两岁以下年龄组中根本就没有免疫原性。脑膜炎球菌多糖抗原与其他类多糖抗原一样属于T细胞非依赖性抗原，不能诱导出免疫记忆反应，再次免疫接种不能起到加免疫的效应，故对婴幼儿免疫效果差。因此A群和C群多糖疫苗不宜用于婴幼儿和常规免疫接种程序中。
第二类是脑膜炎球菌结合疫苗，多糖和蛋白载体偶联后，T细胞能识别载体，刺激B细胞对多糖产生抗体应答，并能诱导T细胞免疫记忆反应。目前已有3种C群脑膜炎结合疫苗(MCC)获得在国际上上市，其中两种是将多糖连结到突变无毒白喉毒素(CRM197)上，另一个是将破伤风类毒素作为载体蛋白。上述结合疫苗均能产生足够高水平的抗荚膜IgG抗体和有免疫记忆的B细胞。英国于1999年将C群多糖结合疫苗纳入预防C群脑膜炎的国家免疫程序中。A群脑膜炎结合疫苗正在开发中，而A群脑膜炎球菌在引起大规模流行的各群脑膜炎球菌中占主导地位。
免疫实践证明，细菌荚膜多糖属于T细胞非依赖性抗原，其免疫效果与接种对象的年龄明显相关，婴幼儿的免疫系统发育尚不完善，接种多糖疫苗后不能有效激活T辅助细胞和T记忆细胞，不能诱导产生免疫回忆反应，因而，免疫保护时间短暂，再次免疫接种也不能产生加强免疫效应。同时，脑膜炎球菌多糖抗原虽能诱导产生IgM和IgG抗体，但人类所产生的IgG主要是：IgG2亚类，而人血清IgG2亚类抗体出现较迟，一般要到8-12岁才能上升至成人水平。这可能与分泌IgG2亚类抗体的B淋巴细胞发育迟缓有关。故此，婴幼儿接种多糖疫苗后，产生只有短暂作用的IgM抗体为主。为提高多糖疫苗的免疫效果，主要办法是将多糖抗原与蛋白载体结合，使其转变为T细胞依赖性抗原。研究表明，多糖与蛋白载体结合后，T细胞能识别载体，刺激B细胞对多糖产生应答，并能诱导T细胞的免疫回忆反应使更多的B细胞产生特异性抗体。
已经发现，多糖和蛋白载体偶联后的效果在Hib(b型流感嗜血杆菌)结合疫苗和C群脑膜炎球菌结合疫苗中得到了验证。B群脑膜炎球菌外膜蛋白作为一种载体蛋白的功能也在Hib结合疫苗中被证实。目前，国际上Hib结合疫苗所用的4种载体分别为；破伤风类毒素、白喉类毒素、无毒性白喉变异株(CRM197)毒素和B群脑膜炎球菌外膜蛋白。卢锦汉，医学生物制品学，人民卫生出版社，1995年，380页中公开了B群脑膜炎球菌外膜蛋白的一种制备方法。该制备方法依据蔗糖密度梯度离心从破碎的B群脑膜炎球菌菌体的混合匀浆中分离B群脑膜炎球菌外膜蛋白，包括的主要步骤有培养菌体、分离菌体细胞、低渗破碎细胞、超速离心获得外膜沉淀物、采用密度梯度离心纯化外膜蛋白(反复两次)、溶解、增溶、除菌过滤、沉淀等步骤。由于需要的离心速度高，并且需要反复两次的密度梯度离心和溶解，所以对设备投资要求较高，十分繁琐，步骤繁多复杂。所得产物为各种B群脑膜炎球菌外膜蛋白的混合物，没有进一步分离。
基于现有脑膜炎疫苗的上述问题，WHO和比尔盖茨基金合作加速在短期内开发出较低价格的脑膜炎球菌A+C群结合疫苗。WHO将开发有效、安全和适宜价格的多价脑膜炎球菌结合疫苗作为最优先考虑的事。
鉴于上述原因，需要对脑膜炎球菌疫苗进行革命性地改造，开发出较低价格用于两岁以下年龄的儿童和婴幼儿的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗。
发明内容
本发明提供了将A，C群脑膜炎球菌多糖纯化后分别与作载体的B群脑膜炎球菌外膜蛋白进行化学偶联而形成单价结合物，再将单价结合物混合配制成一种新疫苗的方法。本发明还提供了一种以B群脑膜炎球菌外膜蛋白为载体的并分别与A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖形成共价偶联的双价结合疫苗，用以预防婴幼儿A、C群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎及败血症疾病。
本发明所用脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)菌株购买于中国医学细菌保藏中心(CMCC)，其菌株号为；
                  CMCC(B)29201  A4株
                  CMCC(B)29205  C11株
                  CMCC(B)29356  B4株
                  CMCC(B)29361  B15株
中国医学细菌保藏中心的全称为医学微生物菌种保藏管理中心，上述菌株保藏在该中心所属单位：中国药品生物制品检定所，北京(NICPBP)。该机构生产、销售这些菌株，公众可以购买。
在本发明的一个实施方案中，A群脑膜炎球菌多糖制备时可采用的菌株为CMCC(B)29201，C群脑膜炎球菌多糖制备时可采用的菌株为CMCC(B)29205，而B群脑膜炎球菌外膜蛋白制备时可采用的菌株为CMCC(B)29356和/或CMCC(B)29361。如果满足需要，也可采用其它合适的菌株，这里给出的菌株仅仅是为了例示性说明本发明。
本发明分别采用罐液体培养A、C群脑膜炎球菌，甲醛杀菌，连续流离心收集上清液，加Cetavlon沉淀多糖，连续离心收集多糖复合物，再经CaCl2解聚而获得粗多糖，用醋酸钠溶液溶解粗多糖，并经冷酚抽提，透析，超滤而分别获得A、C群精制纯化多糖。A、C群脑膜炎球菌多糖的层析分析参见图1和图2。关于A群脑膜炎球菌多糖的制备方法的细节，参考中国生物制品规程2000年版。C群脑膜炎球菌多糖的制备细节与A群脑膜炎球菌多糖的制备方法相同。
本发明所用B群脑膜炎外膜蛋白可以使用已知方法制备，例如卢锦汉，医学生物制品学，人民卫生出版社，1995年，380页中公开的方法。
进一步而言，可以对B群脑膜炎外膜蛋白进行进一步分离，使用含1类、2类或者1类、3类外膜蛋白作为载体。
所以，本发明的一个方面是提供了一种新颖的B群脑膜炎外膜蛋白制备方法。该方法采用罐液体培养，连续离心而获得B群菌体再采用LiCl抽提获得B群脑膜炎外膜蛋白，经乙醇沉淀，离心超滤，柱层析而获得B群外膜蛋白。此处公开的B群脑膜炎外膜蛋白的制备方法与卢锦汉公开的方法截然不同(参考，卢锦汉，医学生物制品学，人民卫生出版社，1995年，380页)。
本发明所提供的B群脑膜炎外膜蛋白的制备方法的特点在于离心速度低，步骤相对简单，并且对于B群脑膜炎外膜蛋白进行了分离。B群脑膜炎球菌外膜蛋白包括5种，分别是1类、2类、3类、4类和5类外膜蛋白。其中1类外膜蛋白是B群脑膜炎球菌亚型分类的基础，是一种44,000-47,000 Dolton的热稳定蛋白。2类或3类外膜蛋白是不能同时存在于同一菌株，分子量均为37,000-42,000 Dolton的热稳定蛋白，常以三聚体形式存在，可诱导特异性抗体产生。4类和5类外膜蛋白对于诱导特异性抗体的产生作用不大。所以本发明的一个特点在于对B群脑膜炎外膜蛋白进行分离。图3是B群脑膜炎球菌外膜蛋白的柱层析图，可以看到主要有三个峰。在本发明中，可以使用三个峰中的洗脱溶液中群脑膜炎球菌外膜蛋白的作为载体。优选实施方案中，采用峰1和峰2的洗脱物作为载体，也即优选使用1类、2类或者1类、3类外膜蛋白作为载体。
本发明采用溴化氰(CNBr)活化A、C群多糖，以已二酰肼(ADH)为双功能亲核间隔基，使之形成多糖已二酰肼衍生物，再通过碳二亚胺(EDAC)介导的缩合作用与B群外膜蛋白共价结合，分别获得A、C群多糖-B群外膜蛋白结合物，再经超滤浓缩，柱层析而获得高分子量偶联物，稀释分装而成结合疫苗。
本发明提供的组合疫苗包括A群脑膜炎球菌荚膜多糖和C群脑膜炎球菌荚膜多糖，它们分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白共价结合。虽然B群脑膜炎球菌外膜蛋白在本发明中主要作为载体发挥作用，但是它的作用也许超出了普通载体的作用，因为它本身是来源于B群脑膜炎球的高分子物质，具有一定的免疫原性，可能会对逐年增加的B群脑膜炎球菌疾病产生预防作用。因此，B群脑膜炎球菌外膜蛋白在本发明的疫苗中的作用不应该等同于已有技术的公开。进而言之，可以理解的是，本发明的疫苗包括A群脑膜炎球菌荚膜多糖、C群脑膜炎球菌荚膜多糖和B群脑膜炎球菌外膜蛋白，其中A群脑膜炎球菌荚膜多糖和C群脑膜炎球菌荚膜多糖分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合。
优选地，本发明提供的组合疫苗包括A群脑膜炎球菌荚膜多糖和C群脑膜炎球菌荚膜多糖，它们分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白中的1类和2类或者1类和3类外膜蛋白共价结合。应该理解的是，在本实施方案中，组合疫苗中作为载体的B群脑膜炎球菌外膜蛋白主要成份是含有1类和2类或1类和3类的外膜蛋白。
如上所述，在多糖和蛋白形成偶联物的过程中，可以由单个A群多糖或C群多糖经活化后可能有多个位点同时结合多个B群脑膜炎球菌外膜蛋白。同样也可以由活化后的单个B群脑膜炎球菌外膜蛋白的多个位点同时结合多个A或C群多糖。多糖和蛋白的结合并不限定于1∶1，也就是一个多糖分子上可以偶联上1个或者多个蛋白；同样地，一个蛋白分子上可以偶联上1个或者多个多糖分子。在多糖和蛋白的偶联中，优选发生多糖和蛋白的一一对应的结合。但是如上所述，多糖和蛋白的各种结合只要并不影响本发明的结合疫苗所能达到的效果，那么所有这些偶联中的细节变化均应包括在本发明范围之内。
多糖与蛋白的偶联有多种已知的方法，在此所述的偶联方法仅仅是用于说明。所以，可以采用各种等同的方法实现本发明所述的偶联过程，因此任何用于分子偶联的方法和工艺或者过程都有可能用于实施本发明。
在本发明的疫苗中，A群、C群脑膜炎球菌结合疫苗的动物试验每剂免疫剂量为含有A和C群脑膜炎球菌荚膜多糖各1.25-2.5μg，优选地所述A和C群脑膜炎球菌荚膜多糖在所述结合疫苗的每剂人用免疫剂量中各有5-20μg。当然，根据免疫对象的体质状况可以有所变化。至于用量的上限，本领域的技术人员可以根据疫苗使用的常规实践灵活掌握。
并且，在本发明的疫苗中可以进一步添加吸附剂，例如氢氧化铝和/或磷酸铝等铝佐剂。使用时，可以对本发明的结合疫苗进行稀释，合适的稀释液的不限定的实例有缓冲生理盐水稀释液。
本发明的疫苗可以采用常规接种方式，例如腹腔接种、肌肉或皮下接种等。腹腔接种较麻烦，安全性较差，故优选肌肉或皮下接种方式。免疫接种推荐使用三针。
本发明对现有商业化多糖疫苗在下列方面进行了改进：
1、更少的反应原性：本发明的疫苗中没有掺入蔗糖或明胶等稳定剂，从而减少了现有疫苗的反应原性。
2、本方法选择适宜的超滤膜超滤抗原，并采用柱层析法纯化获得的高分子量偶联物，从而提高了抗原的免疫原性。
3、提高了免疫效力：本发明由于将脑膜炎球菌多糖抗原转变为T细胞依赖性抗原，能诱导出免疫记忆反应，再次免疫接种能起到加强免疫的效应。
4、将疫苗接种人群扩展到两岁以下的儿童和婴幼儿：本发明的疫苗对两岁以下的儿童和婴幼儿能提供良好的免疫保护力，诱导免疫记忆反应，并可维持长期的免疫保护作用。
5、对现有免疫程序中的疫苗无干扰性：本发明的疫苗没有选破伤风类毒素、白喉类毒素和/或突变的无毒白喉毒素(CRM197)作为载体蛋白载体，就避免了对现有免疫程序中的疫苗效果(例如百白破疫苗)的干扰性。
6、选择B群脑膜炎球菌外膜蛋白作为载体蛋白，也是基于在世界范围内B群脑膜炎球菌发病率逐年升高，且截止目前尚无相应的有效疫苗。B群脑膜炎球菌外膜蛋白除具有载体蛋白功能外，还可产生足够的抗B群脑膜炎球菌抗体，对B群脑膜炎球菌的感染能起到一定的预防作用。
7、本发明的B群脑膜炎球菌外膜蛋白制备、纯化工艺方面有了显著的改进，制备所需设备，人力和物力消耗降低，过程简单，节约时间，并且可以进一步对B群脑膜炎球菌外膜蛋白进行分离。
总之，至今还没有一种新的脑膜炎球菌A+C群结合疫苗能满足上述优点。而且，本发明所述疫苗的制备方法也有独到之处，克服了已有技术存在的有些问题。
附图说明
图1、A群脑膜炎球菌荚膜多糖柱层析图，表明其分子量不均一。
图2、C群脑膜炎球菌荚膜多糖柱层析图，表明其分子量不均一。
图3、B群脑膜炎球菌外膜蛋白柱层析图，其中图中的3个峰，从左到右分别代表：1类外膜蛋白、2/3类外膜蛋白和4/5类外膜蛋白。
图4、A群脑膜炎球菌荚膜多糖与B群脑膜炎球菌外膜蛋白共价结合物柱层析图。图中的上层峰：A群脑膜炎球菌荚膜多糖峰，结合后，分子量增大，以V0附近高分子量化合物为主；下层峰：B群脑膜炎球菌外膜蛋白峰，与多糖结合后，分子量随之增大，以V0附近高分子量化合物为主。
图5、C群脑膜炎球菌荚膜多糖与B群脑膜炎球菌外膜蛋白共价结合物柱层析图。图中的上层峰：C群脑膜炎球菌荚膜多糖峰，结合后，分子量增大，以V0附近高分子量化合物为主；下层峰：B群脑膜炎球菌外膜蛋白峰，与多糖结合后，分子量随之增大，以V0附近高分子量化合物为主。
具体实施方式
下面结合附图和实施例描述本发明以B群脑膜炎球菌外膜蛋白为载体分别结合A、C群脑膜炎球菌多糖而制备A、C群脑膜炎球菌结合疫苗，并经动物实验证实该结合疫苗可靠的安全性和良好的免疫原性。
实施例1
B群脑膜炎球菌外膜蛋白的制备
启开B群脑膜炎球菌菌株接种于半综合斜面，扩菌传至第五代液体罐培养，连续离心收集菌体，用0.3-0.6M LiCl和0.2-0.5MCH3COONa混合物提取外膜蛋白。35-45℃振荡1-3小时。离心4000-8000转/分×1小时，收集上清，继而加乙醇浓度至60-80％沉淀外膜蛋白。用注射溶液复溶后，通过超滤收集400KD过滤液，再经30KD超滤膜浓缩。用SDS-PAGE检测所需1、2类或1、3类外膜蛋白含量。Sephacryl S 200-400层析，收集所需1、2类或1、3类外膜蛋白。检测蛋白含量(Lowry法)、主要成份及1、2类或1、3类外膜蛋白的纯度(SDS-PAGE法)和内毒素含量(鲎试剂法)、无菌试验(见中国生物制品规程2000年版)。
实施例2
A群脑膜炎荚膜球菌多糖偶联
A群脑膜炎荚膜球菌多糖稀释至4mg/ml加溴化氰活化多糖，23±3℃下作用1-1.5小时，调PH并维持pH9-11，继后加己二酰肼2.5～5mg/mgps，维持pH8-10作用10-30分钟，在2-8℃搅拌10-20小时，透析去除小分子物质，取样测溴化氰残余量，己二酰肼衍化率。加等量B群脑膜炎球菌外膜蛋白与多糖混合，加碳二亚胺：15-25mg/ml混合物，5-15℃作用1-1.5小时，调整PH5-7。偶联原液透析去除小分子物质。300KD膜包超滤浓缩，经Sepharose CL-4B柱层析，收集高分子量的偶联化合物(参见图4)，除菌过滤检测磷含量，蛋白含量，计算多糖，蛋白比值，分子量测定及KD0.3回收率，多糖蛋白鉴别试验、内毒素含量、无菌试验(见中国生物制品规程2000年版)。各项检验合格后，待稀释合并、分装。
实施例3
C群脑膜炎球菌荚膜多糖偶联
C群脑膜炎荚膜球菌多糖稀释至4mg/ml，加溴化氰(CNBr)活化多糖，20～30℃下作用1-1.5小时，调PH并维持PH9-11，继后加已二酰肼(ADH)2.5～5mg/mg多糖，维持PH8-10，反应30分钟，在2-8℃搅拌10-20小时，透析去除小分子物质。取样测CNBr残余量，ADH衍化率。加等量B群脑膜炎球菌外膜蛋白与多糖混合，加碳二亚胺(EDAC)：15～25mg/ml混合物，5-15℃反应1-1.5小时，调PH5-7。偶联原液透析去除小分子物质，300KD膜包超滤浓缩，经SepharoseCL-4B柱层析，收集高分子量的偶联化合物(参见图5)，除菌过滤，检测唾液酸含量，蛋白含量计算多糖，蛋白比值，分子量测定及KD0.3回收率，多糖、蛋白鉴别试验、内毒素含量、无菌试验(见中国生物制品规程2000年版)，各项检定合格后，待稀释，合并、分装。
实施例4
不含有佐剂的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗
根据A、C群多糖偶联原液测定结果，稀释分装，使每支结合疫苗：0.5ml装量，含有A、C群多糖各10μg，并分别测定PH值，NaCl含量，A、C群多糖含量硫柳汞含量，高分子结合物含量，鉴别试验，急性毒性安全试验，鉴别试验，无菌试验，热原质试验，免疫原性试验，合格制品存放于2-8℃存。
实施例5
氢氧化铝(佐剂)吸附A、C群脑膜炎球菌结合疫苗稀释、分装
根据A、C群脑膜炎球菌偶联物半成品原液多糖测定的含量，以灭菌、无热原的氢氧化铝稀释液稀释疫苗原液。使每剂量含有A、C群多糖各8-14μg，氢氧化铝0.6-1.4mg，NaCl 0.75-1.0％，PH 5.4-7.0。在疫苗稀释过程中缓慢加入氢氧化铝稀释液，并充分混匀，使之形成均匀分布的悬浊液。无菌、无热原分装结合疫苗，使每剂量≥0.5ml。
实施例6
缓冲生理盐水稀释、分装A、C群脑膜炎球菌结合疫苗
根据A、C群脑膜炎球菌偶联物半成品原液多糖测定的含量，以灭菌、无热原的缓冲生理盐水稀释液稀释疫苗原液。使每剂量含有A、C群多糖各8-14μg，NaCl0.75-1.0％，PH5.4-7.0。在疫苗稀释过程中缓慢加入缓冲生理盐水稀释液，并充分混匀，使之形成均匀分布的清亮悬液。无菌、无热原分装结合疫苗，使每剂量≥0.5ml。
实施例7
A、C群脑膜炎球菌结合疫苗检测
根据A、C群脑膜炎球菌多糖偶联原液测定结果，稀释分装，使每支结合疫苗：≥0.5ml装量，含有A、C群多糖各8-14μg，并分别测定高分子结合物含量、PH值，NaCl含量、A、C群多糖含量、硫柳汞含量、鉴别试验、急性毒性安全试验、鉴别试验、无菌试验、热原质试验、免疫原性试验(见《中国生物制品规程》2000年版)，合格制品存放于2-8℃存。
实施例8
A、C群脑膜炎球菌结合疫苗接种剂量比较
分别选用SPF级，Balb/c小鼠每组20只，每组小鼠分别皮下接种各含A、C群多糖各5μg、2.5μg，1.25μg，0.625μg的结合疫苗于0、14天各免疫一剂，第21天采血分离血清，用ELISA测定每只小鼠血清的IgG抗体滴度，计算GMT统计学处理，分析接种剂量的影响因素，两次试验结果列于表1。
表1.A、C群脑膜炎球菌结合疫苗接种剂量比较
接种剂量   第一次  IgG GMT     第二次  IgG GMT
 A  C  A  C
 5μg  83.47  183.90  78.95  205.30
 2.5μg  79.12  212.3  79.52  221.30
 1.25μg  43.00  73.4  56.31  94.65
 0.6125μg  35.4  81.6  40.12  83.15
两次动物试验结果证实，2.5μg免疫剂量效果较为理想，既节省了抗原量，又达到了较高的抗体滴度。
实施例9
A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫途径比较试验
分别选用SPF级Balb/C小鼠，每组20只，各接种A、C群多糖各2.5μg的结合疫苗分别于0、14天各接种一针，第21天采血，分离血清，ELISA测定抗体浓度计算GMT，其免疫途径分别采用皮下，肌肉，腹腔注射。现将两次实验结果列于表2。
表2.A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫途径比较
免疫途径   第一次  IgG GMT    第二次  IgG GMT
A  C  A  C
皮下 75.69  235.1  63.20  253.43
肌肉 80.13  244.91  75.93  276.38
腹腔 82.34  213.45  64.30  231.15
以上三种免疫途径两次实验比较说明，其IgG GMT结果相似，统计学处理无显著性差异P＜0.05。但腹腔接种较麻烦，安全性较差，故可选择肌肉或皮下接种。
实施例10
A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫免疫针次比较试验
分别选用SPF级Balb/c小鼠，每组20只，分别皮下接种含A、C群多糖各2.5μg的结合疫苗，免疫程序为0、14、28天各接种1针，末次免后2周采血，分离血清，测定每只小鼠血清的IgG抗体浓度，计算每组小鼠的GMT，实验结果统计如表3。
表3.A、C群脑膜炎球菌结合疫菌免疫针次比较试验
免疫针次        IgG GMT
 A  C
 1  11.34  45.61
 2  83.41  251.63
 3  195.43  1258.34
以上结果表明，结合疫苗具有明显的免疫回忆反应，三针免疫后，抗体增长明显，因此，免疫接种推荐使用三针。
实施例11
A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性研究
在以上实验工作的基础上进行了A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性研究，选用SPF Balb/c小鼠，每组20只，分别皮下接种含A、C群多糖各2.5μg的结合疫苗于0、14、28天各免疫一针，第42天采血，分离血清，采用ELISA分别测定每只小鼠血清的抗体滴度，并计算GMT，实验结果统计如表4。
表4.A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性研究
疫苗批号         IgG GMT
 A  C
 20030101  273.56  1259.41
 20030102  215.89  1315.12
 20030103  258.31  1198.35
实验结果表明A.C群脑膜炎球菌结合疫苗具有较好的免疫原性。
实施例12
用氢氧化铝吸附剂和缓冲生理盐水两种稀释液配制的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性比较研究
选用SPF Balb/c小鼠，每组20只，分别皮下接种两种稀释液配制的含A、C群多糖各2.5μg的结合疫苗于0、14、28天各免疫一针，于免后1、2周分别采血，分离血清，采用ELISA分别测定每只小鼠血清的抗体滴度，并计算GMT，实验结果统计如表5。
表5.两种稀释液配制的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性比较
免疫针次  采血时间(周)        C群  IgG GMT      A群  IgG GMT
 Al(OH)3  缓冲生理盐水  Al(OH)3  缓冲生理盐水
1  1  4.58  18.37  6.38  25.33
 2  10.39  38.05  9.12  21.51
2  1  139.80  98.12  43.10  52.35
 2  98.37  101.53  37.52  49.75
3  1  1350.42  637.50  225.31  183.13
 2  1735.61  943.52  273.80  215.75
动物试验证明，两种稀释液配制的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗均能产生明显的抗体应答和免疫回忆反应。但两者在刺激机体快速产生抗体应答、加强免疫后的回忆反应、抗体滴度及免疫持久性方面有明显差异。
实施例13
A.C群脑膜炎球菌结合疫苗的安全性
对A.C群脑膜炎球菌结合疫苗的安全性进行考核，分别采用小鼠、豚鼠异常毒性试验法，考核其安全性。
选用豚鼠、腹腔接种10个人用剂量A.C群脑膜炎球菌结合疫苗，分别于免前、免后10天称体重，并随时观察接种反应。
选用SPF级Balb/C小鼠，腹腔接种2个人用剂量A.C群脑膜炎球菌结合疫苗，分别于免前、免后10天称体重，并随时观察接种反应。
实验结果列于表6、表7。
表6.A.C群脑膜炎球菌结合疫苗豚鼠安全性试验
疫苗批号  接种前体重(克) 观察期接种反应  接种后10天体重(克) 结论
20030101  348312 行动自如，无任何异常情况  389375 合格
20030102  323308 行动自如，无任何异常情况  359350 合格
20030103  329335 行动自如，无任何异常情况  389383 合格
表7.A.C群脑膜炎球菌结合疫苗小鼠安全性试验
疫苗批号  接种前体重(克) 观察期接种反应  接种后10天体重(克) 结论
20030101  18.319.519.018.619.5 行动自如进食正常无异常反应  21.323.522.523.124.5 合格
20030102  18.019.319.520.321.0 行动自如进食正常无异常反应  23.125.024.826.025.9 合格
20030103  20.518.319.019.518.9 行动自如进食正常无异常反应  24.823.123.024.525.1 合格
急性毒性试验表明A.C群脑膜炎球菌结合疫苗具有可靠的安全性。

Claims (9)

1.一种结合疫苗，其特征在于所述的疫苗是由A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖与B群脑膜炎球菌外膜蛋白偶联而成的。
2.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于所述A群脑膜炎球菌多糖来自菌株CMCC(B)29201，所述C群脑膜炎球菌多糖来自菌株CMCC(B)29205，以及所述B群脑膜炎球菌外膜蛋白来自菌株CMCC(B)29356和/或CMCC(B)29361。
3.根据权利要求1或2所述的结合疫苗，其特征在于所述的B群脑膜炎球菌外膜蛋白的成份是含有1类和2类或1类和3类的外膜蛋白。
4.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于所述偶联由单个A群或C群脑膜炎球菌多糖经活化后的多个位点同时结合多个B群脑膜炎球菌外膜蛋白实现。
5.根据权利要求1所述的结合疫苗，其特征在于所述偶联由活化后的单个B群脑膜炎球菌外膜蛋白的多个位点同时结合多个A群或C群脑膜炎球菌多糖实现。
6.根据权利要求1，2，4和5中任一项所述的结合疫苗，其特征在于所述A和C群脑膜炎球菌荚膜多糖在所述结合疫苗的每剂免疫剂量中各有1.25-2.5μg。
7.根据权利要求1，2，4和5中任一项所述的结合疫苗，其特征在于所述A和C群脑膜炎球菌荚膜多糖在所述结合疫苗的每剂人用免疫剂量中各有5-20μg。
8、根据权利要求1，2，4和5中任一项所述的结合疫苗，其特征在于该结合疫苗使用铝佐剂和/或缓冲生理盐水稀释液。
9.一种制备如权利要求1所述的结合疫苗的方法，其特征在于所述的B群脑膜炎球菌外膜蛋白的制备方法包括以下步骤：
(1)在收集的培养菌体中加入适量由0.3-0.6M LiCl和0.2-0.5M CH3COONa组成的混合物，离心收集上清；
(2)向步骤(1)所得上清中加乙醇至60-80％，沉淀外膜蛋白；
(3)收集步骤(2)的沉淀物，再次溶解进行超滤；
(4)收集400KD超滤液，用30KD超滤膜浓缩；
(5)柱层析收集外膜蛋白组分。
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