CN104001166B - Abc群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，其由A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖分别与B群血清型4型(CMCC29356)脑膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)共价结合的多糖‑蛋白偶联物，以及B群ST‑4821基因型(xrsw341215)脑膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)组成。该疫苗可同时预防A、B、C群脑膜炎球菌侵袭性疾病，尤其针对2岁以下流脑高危人群预防，具有更好的保护效果，并且针对自然界A、B、C群脑膜炎球菌侵袭具有更好的特异性，更好的保护作用。

Description

ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及多个血清群脑膜炎球菌疫苗组成的多价联合疫苗及其制备工艺，具体地说，涉及一种由ABC群脑膜炎球菌多糖偶联物和蛋白抗原成分组成的联合疫苗及其制备方法。

背景技术

脑膜炎球菌感染所致的侵袭性败血症、脑膜炎、肺炎等疾病在世界各地均有发生，并引起很高的病死率和致残率，严重地威胁着人类健康。根据脑膜炎球菌荚膜多糖组成的差异，可将其分成13个血清群，且所有血清群均致病。其中尤以A、B、C群病例最多，占脑膜炎球菌病例的90％以上。

目前，国内外已有多种不同种类和不同组合的脑膜炎球菌疫苗上市，其中荚膜多糖疫苗包括A群、C群、AC群和ACYW135群；多糖-蛋白结合疫苗包括A群、C群、AC群、ACYW135群。

脑膜炎球菌疾病的高危人群主要是婴幼儿，在早期研发的各血清群多糖疫苗中其细菌荚膜多糖是一种T细胞非依赖性抗原，也是一种半抗原，因婴幼儿免疫系统发育尚不完善，故而不能有效识别荚膜多糖抗原而产生有效抗体，故而预防效果不理想。在Hib结合疫苗成功上市的启迪下，脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗也相继研发成功并上市，但目前国内外的各种组合的脑膜炎球菌结合疫苗，所用蛋白载体均为破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)或白喉无毒变异株蛋白(CRM197)。这些蛋白载体虽也能刺激机体产生相应抗体，但这种抗体与脑膜炎球菌疾病的预防无关。并且尤其是TT和DT，是由各自细菌毒素经甲醛或戊二醛脱毒而来的，在百白破三联疫苗中为了维持其脱毒效果的稳定，避免出现毒性逆转现象，需要加入微量的甲醛或戊二醛。而在以TT或DT为蛋白载体的结合疫苗中是不加微量甲醛或戊二醛的，因而存在着蛋白载体毒性逆转的风险。并且破伤风毒素是高致敏原性物质，虽经脱毒后的破伤风类毒素(TT)也存在着导致过敏发生的高风险。这些因素，均构成了疫苗接种的安全隐患。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对ABC群脑膜炎球菌感染性疾病均有效的预防用疫苗，并能有效规避由TT或DT为蛋白载体而引起的毒性逆转、过敏反应等不安全风险。

为了实现本发明目的，本发明的一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，其由A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖(CPS)分别与B群血清型4型脑膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)共价结合的多糖-蛋白偶联物，以及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)组成。

前述的联合疫苗，所述A群脑膜炎球菌荚膜多糖分离自菌株编号为CMCC29201的A群脑膜炎球菌，所述C群脑膜炎球菌荚膜多糖分离自菌株编号为CMCC29205的C群脑膜炎球菌，所述B群血清型4型脑膜炎球菌OMV分离自菌株编号为CMCC29356的B群脑膜炎球菌，所述B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV分离自保藏编号为CGMCC No.8982的B群脑膜炎球菌。

前述的联合疫苗，其所用A、B、C群脑膜炎球菌菌株包括但不限于其他来源的不同血清型和基因型、克隆群的筛选株。

前述的联合疫苗，所述疫苗中游离多糖的含量≤15％，游离蛋白的含量≤3％。

前述的联合疫苗，用所述疫苗免疫动物后，血清抗体阳转率≥90％。

前述的联合疫苗，每毫升疫苗中含有A群脑膜炎球菌荚膜多糖8-40μg，C群脑膜炎球菌荚膜多糖8-40μg，B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV10-80μg。将疫苗分装于西林瓶或预充式注射器内密封保存。例如，每剂分装量为0.5ml。

前述的联合疫苗，所述疫苗为液体剂型或冻干剂型。

当所述疫苗为液体剂型时，任选含有铝佐剂，所述铝佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝等。

当所述疫苗为冻干剂型时，任选含有赋形剂，所述赋形剂包括但不限于乳糖、蔗糖、明胶、山梨醇或人血白蛋白等。用于冻干剂型疫苗的稀释液时，其稀释液可以是磷酸盐缓冲生理盐水或生理盐水，也可以采用含铝佐剂的缓冲液或生理盐水，其中，每毫升稀释液中铝含量为0.05-0.80mg。

本发明还提供所述联合疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖的制备：分别向A、C群脑膜炎球菌液体培养上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵沉淀多糖，离心获得荚膜多糖复合物，再向复合物中加入氯化钙或氯化钠解聚，然后用乙醇分步沉淀，获得粗制多糖，经脱氧胆酸钠处理，用CaptoAdhere和Capto DEAE凝胶层析，收集流穿液，再经G25凝胶脱盐，或用苯酚抽提，超滤，除菌过滤后即得纯化的荚膜多糖，置-20℃以下或冻干后保存。

2)B群血清型4型及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV的制备：分别对B群血清型4型及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌的液体培养液进行连续流离心，收获菌体，菌体经抽提分离出OMV复合物，经脱氧胆酸钠处理后，再依次经硫酸铵分步沉淀，乙醇分步沉淀，三氯醋酸沉淀，等电点沉淀，离子交换凝胶层析和疏水凝胶层析，G25凝胶层析，分子筛层析等，超滤，除菌过滤后即得纯化的OMV，置2-8℃避光保存。

3)荚膜多糖-蛋白偶联物的制备：将步骤1)中制备的A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖，分别经溴化氰活化后，在活化的糖链上连接已二酰肼，超滤去除游离的溴化氰、已二酰肼，然后加入步骤2)中制备的B群血清型4型脑膜炎球菌OMV作为蛋白载体，在ADH的桥联作用下分别形成A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物，经分子筛凝胶层析收集所述偶联物，除菌过滤后，置2-8℃避光保存。

4)疫苗配制：根据A群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物的磷含量计算A群脑膜炎球菌荚膜多糖含量，根据C群群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物的唾液酸含量计算C群脑膜炎球菌荚膜多糖含量，根据B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV的含量，配制ABC群脑膜炎球菌联合疫苗毫升。

在A、C群CPS与B群血清型4型OMV共价偶联物的制备中，A、C群CPS可分别经酸水解，形成分子量较均一的1×10³-1×10⁶道尔顿的CPS，经高碘酸氧化，硼氢化合物作用而形成。

本发明还提供一株新分离的B群ST-4821基因型脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningococcus)xrsw341215(即B群ST-4821基因型脑膜炎球菌)，来源于国内B群流行性脑脊髓膜炎患者血液标本分离株，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.8982，保藏日期2014年4月1日。

本发明涉及ABC群脑膜炎球菌联合疫苗的研发、质量标准建立和规模化生产，用于适龄人群接种，预防疫苗型血清群脑膜炎球菌感染所致的侵袭性疾病。

本疫苗由三种抗原成分经疫苗相融性研究等确定配伍，组合而成。三种抗原成分别为：A群脑膜炎球菌CPS与B群脑膜炎球菌(CMCC29356株)OMV共价结合的A群偶联物；C群脑膜炎球菌CPS与B群脑膜炎球菌(CMCC29356)OMV共价结合的C群偶联物；B群脑膜炎球菌(xrsw341215株，保藏编号CGMCC No.8982)OMV。疫苗分装于2ml西林瓶或预充式注射器中，每剂疫苗0.5ml，含分别结合到载体蛋白上的A群CPS：4-20μg，C群多糖4-20μg和xrsw341215株B群OMV5-40μg，铝佐剂0.025-0.4mg。检定合格后，于2-8℃避光保存，效期为24个月。

本发明提供一种以ABC群脑膜炎球菌抗原成分所组成的联合疫苗，其中，A、C群荚膜多糖分别与B群血清型4型菌体OMV载体偶联，用国内优势致病的另一株B群ST-4821基因型脑膜炎球菌菌株OMV，组成由A、C荚膜多糖-蛋白偶联物和B群OMV的三价联合疫苗。该疫苗可同时预防A、B、C群脑膜炎球菌侵袭性疾病，尤其针对2岁以下流脑高危人群预防，具有更好的保护效果，并且针对自然界A、B、C群脑膜炎球菌侵袭具有更好的特异性，更好的保护作用。

本发明具有以下优点：

(一)采用同一致病菌、不同血清群的B群脑膜炎球菌OMV为蛋白载体，分别与A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖共价结合，是多糖-蛋白结合疫苗、载体蛋白应用的最佳组合。

(二)B群脑膜炎球菌CMCC29356株OMV是血清型4型，而A群流脑的蛋白分型也均为血清型4型，因而，该B群脑膜炎球菌OMV产生的抗体具有辅助、增强针对A群预防效果。

(三)有效规避了TT、DT为载体蛋白的毒性逆转、过敏反应等不安全风险。

(四)筛选国内优势致病的B群脑膜炎球菌菌株xrsw341215，纯化的OMV抗原，针对国内B群流脑疾病的预防，具有更好的专一性、针对性和较广泛的保护范围。

(五)B群脑膜炎球菌(OMV)制备工艺具有独创性、新颖性，因而，有效保持了菌体OMV的天然构象，所产生的抗体针对自然界致病菌的侵袭具有更好的特异性。

(六)本疫苗含有针对优势致病的A、B、C群脑膜炎球菌抗原成分，可同时预防ABC群脑膜炎球菌侵袭。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备工艺

本实施例由来自于四株脑膜炎球菌的纯化组分抗原组成，具体的血清群及抗原成分如下：

A群脑膜炎球菌菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号CMCC29201，组分抗原是荚膜多糖(CPS)。

C群脑膜炎球菌菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号CMCC29205，组分抗原是荚膜多糖(CPS)。

B群脑膜炎球菌菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号CMCC29356，组分抗原是外膜蛋白囊(OMV)。

B群脑膜炎球菌菌株来源于国内B群流行性脑脊髓膜炎患者血液标本分离菌株xrsw341215，保藏编号为CGMCC No.8982，组分抗原是外膜蛋白囊(OMV)。

生产工艺包括以下步骤：

1、A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖的制备

分别向A、C群脑膜炎球菌液体培养上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵而沉淀多糖，经离心获得荚膜多糖(CPS)复合物，再经加入氯化钙或氯化钠解聚，乙醇分步沉淀，获得粗制多糖，经脱氧胆酸钠处理，用Capto Adhere和Capto DEAE凝胶层析，收集流穿液，再经G25凝胶脱盐，或苯酚抽提，超滤，去除杂质成分，除菌过滤，而获得纯化的CPS，检定合格，储存于-20℃以下保存，有效期5年。

2、B群血清型4型及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌(OMV)的制备

分别将二株B群脑膜炎球菌液体培养液经连续流离心，收获菌体，从菌体经抽提液溶出膜蛋白复合物，再依次经脱氧胆酸钠处理，硫酸胺分步沉淀，乙醇分步沉淀，三氯醋酸沉淀，等电点沉淀，离子交换凝胶层析，疏水凝胶层析，分子筛凝胶层析，G25凝胶层析，超滤，除菌过滤，而获得纯化的OMV，经检定合格，储存于2-8℃避光保存，有效期1年。

3、荚膜多糖-蛋白偶联物的制备

A、C群脑膜炎球菌CPS，分别经溴化氰(CNBr)活化后，再在活化糖链连接上已二酰肼(ADH)，经超滤去除游离的CNBr、ADH，加入CMCC29356株B群脑膜炎球菌OMV为蛋白载体，经加入的碳二亚胺(EDAC)缩合作用，在ADH的桥联作用下形成多糖-蛋白间的共价结合键，制备得到荚膜多糖-蛋白偶联物。在此偶联物中含有四种不同成分，分别是大分子量的荚膜多糖-蛋白偶联物，小分子量多糖-蛋白偶联物，未结合到蛋白载体的游离多糖，未结合到多糖的游离蛋白。经分子筛凝胶层析，收集大分子量荚膜多糖-蛋白偶联物，收获除菌过滤原液，经检测合格，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。

4、疫苗配制：根据测定A群偶联物的磷含量计算A多糖含量，C群偶联物的唾液酸含量计算C多糖含量，B群ST-4821基因型OMV的蛋白含量，配制ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，使每1ml疫苗中含有A群多糖8-40μg，C群多糖8-40μg，B群OMV蛋白10-80μg。再分装至西林瓶或预充式注射器内，每剂分装量为0.5ml。经检定合格，于2-8℃避光保存，有效期为2年。

生产工艺特点：

(1)采用流脑半综合液体培养基进行B群脑膜炎球菌大罐液体培养，细菌繁殖快，产率高，通常只需4.5-6h，每升培养基收获菌体12-18克。

(2)蛋白产率高：从菌体纯化获得的蛋白产率达1.0-1.6％。

(3)交叉保护率高，对AC群有显示辅助增强效应

a.B群CMCC29356株OMV抗原为血清型4型，与A群蛋白抗原的血清型同为血清型4型。根据至今的研究结果证实，A群菌蛋白抗原为单一的血清型4型，因此B群CMCC29356株OMV抗原所产生的针对血清型4型的特异性抗体，对所有A群菌具有广泛的交叉保护性；

b.从国内筛选的B群优势致病株xrsw341215，是我国独有的基因型(ST-4821)菌株，且与国内2003年春季流行的C群脑膜炎球菌菌株是同一基因型(ST-4821)，因此，其抗体针对C群保护也有效；

c.ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，各自针对A、C的抗体效价，显著高于单价A、C偶联物免后抗体，说明B群菌株编号为CMCC29356的脑膜炎球菌载体蛋白、xrsw341215株OMV抗原具有辅助增强效应。

实施例2不同生产厂家AC群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性比较研究

实验方案：

1、四种来源的疫苗分别是国产1AC疫苗、国产2AC疫苗、祥瑞生物AC疫苗以及实施例1中制备的ABC群脑膜炎球菌联合疫苗。

2、实验动物：BALB/C小鼠，12～14克/只体重。

3、分组：每组10只，雌、雄各半，每罐饲养5只同性小鼠。

4、免疫方式：皮下注射；免疫剂量：2.5μg多糖/A、C各群。

5、免疫程序：全程免疫三针次，即0、14、21天，各免疫一针。

6、血清分离及检测：每次免后二周采血，分离血清，ELISA测定单只小鼠抗体效价，计算每组几何平均滴度(GMT)，比较四种疫苗免疫原性。结果如表1所示。

7、实验结果分析

7.1AC群脑膜炎球菌结合疫苗国产1、国产2，由于载体蛋白是TT，因而免疫血清测不到B群脑膜炎球菌B4、B.ST-4821血清效价；祥瑞生物AC疫苗是以B群Nm血清型4型OMV为载体蛋白，免疫血清显示较高的血清效价，ABC群Nm疫苗中含有A、C、B.4、B.ST-4821抗原成分，并均能测到较高的抗体效价。

7.2四种来源的疫苗，不同免疫针次的血清抗体效价测定显示，有明显的免疫针次效应，免疫回忆应答明显，血清抗体效价分别三针次＞二针次＞一针次。

7.3四种来源的疫苗中，各自A、C群抗体效价测定数据显示，以B群血清型4型OMV为载体蛋白的结合疫苗的A、C群抗体效价显然高于以TT为载体的结合疫苗。这说明B群OMV有增强A、C群抗体效价的辅助效应。

7.4ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，不但产生了B.ST-4821的较高的抗体效价，而且各针次的A、C、B.4免疫血清GMT均高于国产1、国产2、祥瑞生物的AC群脑膜炎球菌结合疫苗，说明B.ST-4821OMV抗原成分可能存在较广泛的辅助增强效应。

实施例3国内B群流脑患者分离株xrsw341215免疫血清与国内、国外不同来源的优势致病B群流脑菌株的交叉抗体测定

1、国内菌株：从167株国内收集的B群流脑患者、携带者中筛选，确定的患者分离优势致菌株，共8株(表2)。

表2国内B群患者分离株

2、国外菌株：分别来自于美国FDA、荷兰国立公共卫生和环境保护研究所、中国食品药品检定研究院。(表3)

表3国外收集菌株

3、xrsw341215株免疫血清制备

动物：SPF级N1H小鼠，10只/组，12-14克。

免疫原液制备：启开工作种子批菌种1支，接种于流脑半综合固体羊血培养基，置37℃，8％CO₂培养，传至第3代，收集菌体，1％甲醛灭活30分钟，用生理盐水洗涤去甲醛，比浊测定细菌浓度。

小鼠免疫血清制备：用生理盐水稀释菌液浓度至3亿/ml，皮下免疫0.5ml/次，间隔二周，连续免疫3针，第三针免后二周采血，分离血清，置2-8℃保存。

4、各检测菌株菌液的制备

启开各菌工作种子批菌种1支，接种于流脑半综合固体羊血培养基，置37℃，8％CO₂培养，传至第2代，收集菌体于1％甲醛灭活30分钟，用生理盐水洗涤去除甲醛，比浊测定细菌浓度，稀释至3亿/ml，2-8℃保存备用。

5、ELISA法测定xrsw341215株免疫小鼠血清效价和对国内、国外来源的14株菌的交叉抗体效价

各菌体包被菌体浓度3亿/ml，每孔50μl，分别测定10只小鼠血清各自对本菌的抗体效价和对每株菌的交叉抗体效价，再计算GMT。结果见表4和表5。

表4xrsw341215株免疫血清效价及对国内分离菌株的交叉抗体效价

表5xrsw341215株免疫血清对国外来源菌株的交叉抗体效价

6、结果分析

实验结果显示，xrsw341215株免疫血清的本菌抗体效价最高，GMT为47771.29；对其他14株不同血清型及基因型的国内、国外优势致病株均测得了较高的交叉抗体效价，说明该菌株具有良好、广泛的交叉保护覆盖率，是疫苗理想的候选株。

实施例4ABC群脑膜炎球菌联合疫苗的安全性检测试验

急性毒性和异常毒性：

检查制品中含有的毒性物质的毒副作用和是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。

原理：本检查方法利用不同剂量的药物急性毒性反应，将一定剂量的供试品溶液注入受试动物(小鼠、豚鼠)体内，在规定时间内观察动物出现的毒性反应症状和死亡情况，判定供试品是否符合规定的质量要求及其安全性程度。

实验方法：

1.实验动物

1.1小鼠：NIH小鼠，体重：18-22克/只，每组5只。

1.2豚鼠：体重：250-350克/只，每组2只。

2.注射剂量分组

2.1按2010版《中国药典》第三部，附录XIIF异常毒性检查法规定的接种剂量：小鼠，腹腔注射0.5ml实施例1中制备的ABC群脑膜炎球菌联合疫苗(个人用剂量)，豚鼠：腹腔注射5ml(10个人用剂量)。

2.2重复给药试验：按2.1项给药后，观察受试动物三天内未出现异常症状，且体重增加，继续饲养至第七天，再次给予2.1项剂量接种。

2.3按2010版《中国药典》第三部，附录XIIF异常毒性检查法规定的接种剂量的5倍量给药，分别用ABC原液配制浓缩疫苗，给药剂量为：小鼠，腹腔注射0.5ml(5个人用剂量)，豚鼠，腹腔注射5ml(50个人用剂量)。

3.结果判定

小鼠、豚鼠接种供试品后，连续观察7天，观察期内，动物应全部健存，且无异常反应，到期时动物体重增加，判定供试品合格。

4.实验结果见表6。

表6ABC群脑膜炎球菌联合疫苗急性毒性异常毒性试验

5.结果分析

无论是常规剂量组(2010版《中国药典》第三部附录XIIF)、重复给药组及5倍常规剂量组，接种后，各组动物均未出现异常反应情况，除5倍常规剂量组1号豚鼠在注射第2天眼角有分泌物，第4天恢复正常，且无其他异常情况，其余动物活动、进食均正常，无异常反应。至第7天观察期，各实验动物称体重，较实验前体重均有增加。实验表明供试品具有可靠、良好的安全性。

6.结论

本发明的ABC群脑膜炎球菌联合疫苗急性毒性和异常毒性合格。

实施例5过敏原性试验

检查制品中是否含有过敏原性物质，及引起过敏反应的严重程度，以制定制品的安全性。

原理：当药物作为抗原或半抗原初次进入动物体内，刺激机体产生相应的抗体(IgE)。当同一药物再次进入机体，抗原与抗体结合形成的抗原抗体复合物，刺激肥大细胞及嗜碱性粒细胞释放活性介质，从而引起喉头局部水肿、抓鼻、竖毛、咳嗽、呼吸困难、窒息、痉挛，甚至休克、死亡，属即发型变态反应——过敏反应。

1.实验设计：将一定量(1个人用剂量)供试品溶液(实施例1中制备的ABC群脑膜炎球菌联合疫苗)注入豚鼠体内，间隔1日，连续注射3次，以致敏动物，然后再适时用2位剂量经静脉注射供试品进行激发，观察动物出现过敏反应原情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。

2.实验方法：

2.1分组：共设6组，分别为：

供试品3组：ABC群脑膜炎球菌联合疫苗20140301批、20140302批以及20140303批

阴性对照组：破伤风毒素

阴性对照2组：疫苗稀释液

注射用生理盐水

2.2实验动物

健康、无孕豚鼠，体重250-350克/只，每组6只。

2.3实验过程

每组6只豚鼠，隔日每只每次分别腹腔注射，供试品、阳性对照品、阴性对照品各0.5ml，共3次，进行致敏，然后将其分成2分组，每分组3只豚鼠，分别在首次注射后第14天和第21天，由静脉注射各组对应的供试品、阳性对照品、阴性对照品各1ml进行激发，观察激发后30分钟内每只动物的行为和体征，有无喷嚏、呼吸困难、抽搐、休克及至死亡等过敏反应症状。

3.结果判定

静脉注射各组分供试品、阴性对照激发后30分钟内，不得出现过敏反应，如有竖毛、喷嚏、干呕、连续咳嗽3声和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现抽搐、休克、死亡现象之一者，判定供试品不合格。

阳性对照组动物出现过敏反应及阴性对照组均无过敏反应，判断试验成立。

4.试验结果见表7。

表7ABC群脑膜炎球菌联合疫苗过敏原性试验

5.结果分析

5.1实验中的阳性对照、阴性对照分别成立，证明实验结果有效。

5.2供试品的三批ABC群脑膜炎球菌疫苗组，致敏动物的首次激发和第二次激发，所有实验动物均未发生过敏反应症状，说明符合质量标准要求且结果稳定。

6.结论

20140301批、20140302批以及20140303批ABC群脑膜炎球菌联合疫苗过敏原性试验合格。

实施例6家兔热原试验

一般认为热原是能够导致机体发热的物质，其可能通过刺激哺乳动物使之体内产生内原性致热原(如IL-1、IL-6、TNF和干扰素等)从而引起机体发热。检测热原的目的是将能导致机体发热的所有(外源性、内源性)物质控制在一定限度内，从而确保临床用药的安全性。

目前研究较多、较深入细菌来源的热原物质主要有两类，即革兰氏阳性菌的内毒素[(endotoxin)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是主要的致热组分]和革兰氏阳性菌的脂磷壁酸(Lipoteichoic acid，LTA)。

Greisman和Hornick于1969年的研究比较了三种纯化内毒素对家兔和健康男性志愿者的反应，结果表明：人和家兔产生热原反应所需细菌内毒素重量大约相同，但当热原剂量增加时，人体反应较家兔更为强烈。基于此，应用家兔热原试验来预评估供试品的人用安全性。

1.实验方法和判断标准：2010版《中国药典》第三部附录XIID

2.实验结果见表8。

表8ABC群脑膜炎球菌联合疫苗家兔热原试验

3.结果分析和结论

3.1分析：三批疫苗各三只家兔升温均在0.7范围内，结果较稳定，符合质量标准要求。

3.2结论：三批疫苗家兔热原试验均合格。

实施例7无菌试验

检测供试品在敏感培养基中是否有微生物生长，来判断供试品的无菌性。由于供试品检验样本数的局限性，从理论上讲，污染的检出率要比实际产品的污染率低得多。供试品无菌试验合格，表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染，作为供试品来源的批产品符合无菌要求的质量标准。

1.实验条件和方法

2010版《中国药典》第三部附录XIIA。

2.实验结果见表9。

表9ABC群脑膜炎球菌联合疫苗无菌试验

3.结果判定

3.1阳性对照：有菌生长；阴性对照：无菌生长。结果成立。

3.2三批疫苗供试品：均无菌生长，无菌试验合格。

实施例8疫苗免疫原性试验

疫苗的抗原成分是一种外源性物质，当接种而进入机体后，机体免疫系统产生应答，包括体液免疫(产生特异性抗体)、细胞免疫和免疫辅助系统的协同作用，达到预防疾病的功能。

产生有效的免疫应答，除机体自身的免疫系统保持正常，系统协同的免疫功能状态外，作为激活机体免疫功能的外源性物质—抗原的性质和功效至关重要。

免疫原性试验，就是检测这种外源性物质—抗原进入机体后激活机体体液免疫，产生特异性抗体强度的一种检测手段。

1.实验方法

选用6周龄BALB/C或N1H小鼠，每组20只，每只小鼠皮下注射0.5ml ABC群脑膜炎球菌联合疫苗(以结合到OMV上的多糖偶联物计为2.5μg)，另注射0.85％NaCl溶液为对照，分别于0、14、21天各免疫一针，末次免疫后7天采血，分离血清，采用间接ELISA法测定小鼠血清抗体滴度。

2.判断标准

以0.85％NaCl溶液对照组小鼠血清的A值求出Cutoff值，疫苗组小鼠血清高于Cutoff值判为阳转，供试品(疫苗)组应有90％以上小鼠血清抗体效价高于Cutoff值，即90％以上阳转，判为合格。

3.实验结果见表10。

表10ABC群脑膜炎球菌联合疫苗免疫原性

0.85％NaCl溶液组血清Cutoff值为0.231。

4.结果分析及判定

4.1结果分析

4.1.1ELISA测定效价的对照组(0.85％NaCl溶液)小鼠血清Cutoff值为0.231，三批疫苗组小鼠血清，分别测定所含抗原成份[A、C、B(29356)、B(341215)]各自的ELISA效价GMT在1.751-2.305之间，均高于Cutoff值，判为阳转。

4.1.2三批疫苗组小鼠血清每组各20份，分别测定的每只小鼠的A、C、B(29356)、B(341215)抗体效价在1.358-2.500间，均高于Cutoff值，其阳转率为100％。

4.2结果判定

三批疫苗组免疫原性测定各抗原成份的阳转率均达到了100％，符合质量标准要求。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于，其由A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖分别与B群血清型4型脑膜炎球菌OMV共价结合的多糖-蛋白偶联物，以及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV组成；

所述A群脑膜炎球菌荚膜多糖分离自菌株编号为CMCC29201的A群脑膜炎球菌，所述C群脑膜炎球菌荚膜多糖分离自菌株编号为CMCC29205的C群脑膜炎球菌，所述B群血清型4型脑膜炎球菌OMV分离自菌株编号为CMCC29356的B群脑膜炎球菌，所述B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV分离自保藏编号为CGMCC No.8982的B群脑膜炎球菌。

2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，每毫升疫苗中含有A群脑膜炎球菌荚膜多糖8-40μg，C群脑膜炎球菌荚膜多糖8-40μg，B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV 10-80μg。

3.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，疫苗分装于西林瓶或预充式注射器内密封保存。

4.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述疫苗为液体剂型或冻干剂型。

5.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，所述疫苗为液体剂型，任选含有铝佐剂。

6.根据权利要求5所述的联合疫苗，其特征在于，所述铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。

7.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，所述疫苗为冻干剂型，任选含有赋形剂。

8.根据权利要求7所述的联合疫苗，其特征在于，所述赋形剂选自乳糖、蔗糖、明胶、山梨醇或人血白蛋白。

9.根据权利要求7所述的联合疫苗，其特征在于，所述冻干剂型的疫苗，其稀释液是磷酸盐缓冲生理盐水、生理盐水，或含有铝佐剂的缓冲液或生理盐水，其中，每毫升稀释液中铝含量为0.05-0.80mg。

10.权利要求1-9任一项所述联合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖的制备：分别向A、C群脑膜炎球菌液体培养上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵沉淀多糖，离心获得荚膜多糖复合物，再向复合物中加入氯化钙或氯化钠解聚，然后用乙醇分步沉淀，获得粗制多糖，经脱氧胆酸钠处理，用Capto Adhere和Capto DEAE凝胶层析，收集流穿液，再经G25凝胶脱盐，或用苯酚抽提，超滤，除菌过滤后即得纯化的荚膜多糖，置-20℃以下或冻干后保存；

2)B群血清型4型及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV的制备：分别对B群血清型4型及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌的液体培养液进行连续流离心，收获菌体，菌体经抽提分离出OMV复合物，经脱氧胆酸钠处理后，再依次经硫酸铵分步沉淀，乙醇分步沉淀，三氯醋酸沉淀，等电点沉淀，离子交换凝胶层析和疏水凝胶层析，G25凝胶层析，分子筛层析，超滤，除菌过滤后即得纯化的OMV，置2-8℃避光保存；

3)荚膜多糖-蛋白偶联物的制备：将步骤1)中制备的A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖，分别经溴化氰活化后，在活化的糖链上连接已二酰肼，超滤去除游离的溴化氰、已二酰肼，然后加入步骤2)中制备的B群血清型4型脑膜炎球菌OMV作为蛋白载体，在ADH的桥联作用下分别形成A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物，经分子筛凝胶层析收集所述偶联物，除菌过滤后，置2-8℃避光保存；

4)疫苗配制：根据A群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物的磷含量计算A群脑膜炎球菌荚膜多糖含量，根据C群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物的唾液酸含量计算C群脑膜炎球菌荚膜多糖含量，根据B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV的含量，配制ABC群脑膜炎球菌联合疫苗。