CN107674118A - 重组蛋白PspA1、PspA2和PspA3以及包含其的多糖结合疫苗 - Google Patents

重组蛋白PspA1、PspA2和PspA3以及包含其的多糖结合疫苗 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种核苷酸分子，序列为SEQ ID NO.:2、4或6。本申请还提供了由本申请的核苷酸分子编码的重组蛋白PspA1、PspA2或PspA3。本申请还提供了一种多糖结合疫苗，包括脑膜炎球菌多糖及与其结合的载体蛋白，所述载体蛋白是由本申请的核苷酸分子编码的重组蛋白PspA1、PspA2或PspA3。本申请还提供了由本申请的核苷酸分子编码的重组蛋白PspA1、PspA2和PspA3作为多糖结合疫苗的载体蛋白的用途。本申请还提供了一种表达载体，包含本申请的核苷酸分子。

Description

重组蛋白PspA1、PspA2和PspA3以及包含其的多糖结合疫苗
技术领域
本申请涉及一种利用人工合成基因序列的方式合成多糖结合疫苗载体蛋白的方法，更具体地说涉及一种利用人工合成基因序列的方式合成肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A，PspA)，并将其与脑膜炎球多糖结合的方法，和所述多糖结合疫苗载体蛋白的临床用途。
背景技术
带有荚膜多糖的细菌如流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌等，是严重威胁人类健康的几种侵袭性呼吸道细菌，儿童和老年人是感染的高危人群，在5岁以下儿童尤其是2岁以下婴幼儿中是主要的致命性病原菌。疫苗接种是预防和控制相应疾病的重要手段。细菌多糖存在于细菌表面，在细菌感染过程中起到关键作用，多糖提取后即可作为疫苗预防细菌感染。细菌多糖疫苗对肺炎链球菌、流行性脑膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌等多种细菌引起的传染病具有显著的预防效果。但是多糖疫苗也有其自身的一些缺点，如多糖抗原为T细胞非依赖型，婴幼儿免疫系统发育尚未完全，这种仅含细菌多糖的疫苗用于两岁以下儿童免疫效果极不理想，对于免疫缺陷人群及65岁以上老年人的保护性也比较差[1,2]。
目前通用的解决方案是使用化学方法将细菌多糖与某个能够引起T细胞免疫反应的载体蛋白偶联制备多糖蛋白结合疫苗，从而实现抗原类型从T细胞非依赖型(TI)到T细胞依赖型(TD)的转化，解决婴幼儿接种多糖疫苗无免疫应答、低免疫应答和不能产生长期保护的问题。因此载体蛋白的选择对结合疫苗的制备尤其重要。
目前常用的载体种类有限，常用载体包括白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)以及白喉毒素突变体CRM197等。随着多糖结合疫苗种类的增多，载体蛋白的开发跟不上多糖结合疫苗的发展，势必出现相同载体蛋白同时应用于几个多糖结合疫苗的情况，如果所有的多糖结合苗都使用这几种蛋白作为载体，必将会引起争夺体内有限的载体蛋白特异性T淋巴细胞的现象，从而影响免疫效果。此外，破伤风疫苗的成分就是破伤风类毒素，与百日咳、白喉疫苗组成百白破联合疫苗，已经在EPI规定的范围内，重复接种势必增加破伤风类毒素的接种量，而且目前结合疫苗使用的载体蛋白含量较大，TT又作为主要的载体蛋白，很可能会引起超负荷或免疫抑制等问题[3,4]。因此进一步开展对载体蛋白的研究和开发一系列有效的载体蛋白势在必行。
肺炎球菌表面蛋白A(PspA)是肺炎链球菌的重要毒力因子之一，在所有肺炎链球菌表面都有表达，可通过补体活化的经典途径和旁路途径抑制补体活化，进而阻止补体与细菌表面结合，降低补体介导的清除和调理吞噬作用[5,6]。PspA也是目前研究比较充分的肺炎球菌蛋白疫苗候选成分之一。国外研究报道，重组PspA已经安全的进行了人体Ⅰ期临床试验，且发现有较高的免疫原性。免疫后的人体血清能够被动保护小鼠免受肺炎球菌脓血症的感染[7]。虽然几乎所有的肺炎链球菌表面都有PspA的表达，但由于PspA抗原的多样性，单独应用一种类型的PspA并不能激发机体产生足够的针对异种类型PspA的抗体保护性，所以作为疫苗的候选蛋白，最好是几种不同类型PspA的组合才能更好的预防更广范围的肺炎球菌感染[8]。
发明内容
本申请提供了一种核苷酸分子，序列为SEQ ID NO.:2、4或6。
本申请还提供了由本申请的核苷酸分子编码的重组蛋白PspA1、PspA2或PspA3。
本申请还提供了一种多糖结合疫苗，包括脑膜炎球菌多糖及与其结合的载体蛋白，所述载体蛋白是由本申请的核苷酸分子编码的重组蛋白PspA1、PspA2或PspA3。在优选的实施方案中，所述脑膜炎球菌多糖可为A群脑膜炎球菌多糖(Group A Neisseriameningococcus capsular polysaccharide,GAMP)或C群脑膜炎球菌多糖(Group CNeisseria meningococcus capsular polysaccharide,GCMP)。
本申请还提供了由本申请的核苷酸分子编码的重组蛋白PspA1、PspA2和PspA3作为多糖结合疫苗的载体蛋白的用途。在优选的实施方案中，所述多糖结合疫苗可以是A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗或C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。
本申请还提供了一种表达载体，包含本申请的核苷酸分子。
本申请的目的在于通过人工合成基因序列的方式表达肺炎球菌表面蛋白A(PspA)来增加多糖结合疫苗载体蛋白的种类，将PspA与多糖结合，既能提高多糖的免疫原性，增强其杀菌力效果，又能通过产生的抗-PspA特异性抗体预防肺炎球菌的感染，在将来制备结合苗时能够扩大对肺炎链球菌的免疫预防范围。
为了达到本申请目的，本申请提供了一种方法，选取两个家族不同分支的PspA作为脑膜炎球菌多糖疫苗载体蛋白，通过人工合成基因序列的方式进行表达。
发明人之所以采用密码子优化的方式，主要目的是为了增加重组蛋白的表达量，提高其作为载体应用的可行性，同时降低其制备成本。
实验证明，三种重组PspA1、PspA2或PspA3蛋白均可溶性高效表达，表达量分别占菌体总蛋白的30％到40％之间，具备良好的免疫原性和抗原特异性。
从我们目前的研究成果来看，重组PspA1、PspA2或PspA3作为A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗载体蛋白的效果并不次于TT。所述重组蛋白首次作为脑膜炎球菌多糖的蛋白载体应用，经过体液免疫、细胞免疫、以及杀菌力检测，显示重组肺炎球菌表面蛋白不仅能增强多糖的体液免疫反应，还能激活细胞免疫，提高杀菌能力，具备作为多糖疫苗蛋白载体的潜力，可作为多糖结合疫苗的新型候选载体蛋白。
此外，我们的研究目标并不仅限于跟现有蛋白载体比较应用效果，我们希望所研制的重组蛋白不仅能够发挥载体的作用，增加现有载体蛋白的种类以避免重复使用同种载体的不良反应；还希望此重组蛋白的使用能够达到一苗防两病的目的。
本申请的结合疫苗为多糖-蛋白结合苗，重组蛋白作为多糖的蛋白载体通过溴化氰活化法与多糖连接，以提高多糖的免疫原性。研究结果显示，与多糖组比较，蛋白与多糖结合后能显著增强抗多糖抗体特异性IgG、IgG1水平，GAMP蛋白结合疫苗还能刺激产生IgG2a。多糖蛋白结合组能显著延长多糖蛋白结合物的免疫持久性。ELISPOT、FCM检测结果显示结合苗能诱导产生细胞免疫反应。杀菌力结果显示3种蛋白PspA1、PspA2和PspA3与A群多糖结合诱导产生的血清抗体杀菌力均显著高于单独A群多糖疫苗，效果与GAMP-破伤风类毒素疫苗相比没有统计学差异。
除了脑膜炎球菌多糖以外，本申请的重组蛋白还可以与Y群、W135群脑膜炎球菌多糖、肺炎链球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖等多种种类结合制备多糖结合疫苗。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1为PspA 3种蛋白表达质粒的PCR(A图)及酶切鉴定(B图)结果。在两个图中，M为DNA Marker，条带1为PspA1蛋白，条带2为PspA3蛋白，条带3为PspA2蛋白。
图2为重组蛋白PspA1、PspA2和PspA3诱导表达、表达形式及纯化后SDS-PAGE分析。M：蛋白分子量Marker；条带1：诱导表达空载体对照；条带2：重组蛋白加IPTG诱导4小时的全菌体；条带3：重组蛋白经超声破菌后的上清；条带4：重组蛋白经超声破菌后的沉淀；条带5：重组蛋白表达上清最终纯化结果。
图3为重组蛋白的Western-Blot鉴定。M：蛋白预染Marker；条带1：重组蛋白PspA1；条带2：重组蛋白PspA3；条带3：重组蛋白PspA2。
图4为蛋白与A群多糖结合物、混合物每次免后及首免后180天抗-GAMP抗体产生情况检测。
图5为蛋白与C群多糖结合物、混合物每次免后及首免后180天抗-GCMP抗体产生情况检测。
图6为各GAMP-蛋白结合物与混合物分别接受不同成分刺激后的细胞因子检测。
图7为GCMP-蛋白结合物与混合物分别接受不同成分刺激后的细胞因子检测。
图8为蛋白与A群多糖结合物、混合物第三次免后小鼠脾淋巴细胞体外Th1/Th2细胞亚群比值结果。
图9为蛋白与C群多糖结合物、混合物第三次免后小鼠脾淋巴细胞体外Th1/Th2细胞亚群比值结果。
图10为蛋白与A群多糖结合或混合组产生的抗-GAMP抗体杀菌力检测。
图11为各蛋白与C群多糖结合或混合组产生的抗-GCMP抗体杀菌力检测。
具体实施方式
下面通过实施例对本申请进行进一步详细地说明，但本申请不仅限于这些实施例。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本申请的范围仅由所附权利要求界定。
以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。
下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。
实验材料
大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)由中国食品药品检定研究院血清室保存。脑膜炎球菌菌株29019和C11来自美国UAB实验室。Balb/c小鼠，雌性，16-18g，SPF级，由中国食品药品检定研究院实验动物中心提供。
表达质粒pET30a为美国Novagen公司产品。Taq DNA聚合酶、EX buffer、dNTPs、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA连接酶、连接Buffer、DNA分子量标准DL2000、DL15000，6×loading buffer、中分子蛋白Marker均为日本Takara公司产品；卡那霉素，IPTG，考马斯亮蓝G-250为北京欣经科生物公司产品；Glod ViewTM为北京赛百盛公司产品；质粒提取试剂盒为OMEGA公司产品；TEMED为ACROS ORGANICS公司产品；NaCl，NaOH，CaCl2，MgCl2，硫酸铵等均为北京化学试剂公司产品；PVDF膜、DAB显色试剂购自北京欣经科生物公司；蛋白胨，酵母粉，琼脂，琼脂糖为Oxiod公司产品；蛋白纯化用层析柱HiTrap DEAE FF(1ml)，HiTrap SPFF(1ml)，HiTrap Phenyl HP(1ml，5ml)，HiTrap Butyl HP(1ml，5ml)，HiPrep DEAE FF 16/10，HiPrep SP FF 16/10，HiLoad 16/60Superdex 75prep grade，脱盐柱HiTrapDesalting均为GE公司产品。A群、C群脑膜炎球菌多糖由北京绿竹生物有限公司提供；辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗鼠IgG，IgG1和IgG2a为美国Santa Cruz公司产品；透析袋为北京欣经科公司；圆形底组织培养微量滴定板，ELISA酶标板为Costar公司产品；圆形、方形培养皿为Nunc公司产品；小鼠淋巴细胞分离液，无血清细胞培养液，细胞因子检测试剂盒为深圳达科为公司产品；RPMI 1640培养液为Hyclone公司产品；OPD显色试剂为Ameresco公司产品；PMA,Ionomycin，FHA，DMF，TTC，DMSO为Sigma公司产品；Mouse CD3PerCP，Mouse CD4FITC，Mouse IFN-γPE，Mouse IL-4APC，Brefeldin A为Biolegend公司产品；Sephacryl S-400凝胶层析柱为GE公司产品；Todd Hewitt Broth，Bacto Agar，酵母提取物为Becton-Dickinson产品；无菌过滤器为美国Millipore公司产品；其它试剂均为国产分析纯。
实施例1.肺炎链球菌表面蛋白A基因序列的密码子优化及基因合成
由中美泰和生物技术公司进行基因序列合成、与表达质粒pET30a连接且转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。基因序列长度PspA1为1143bp，PspA2为1122bp，PspA3为1431bp。根据基因序列、氨基酸序列，通过密码子优化的方式进行人工合成肺炎链球菌表面蛋白A。合成的3个分支分别来自菌株DBL6A、RX1和EF3296(GenBank，序列号分别为：AF071805.1，M74122.1和AF071816)，将其分别命名为PspA1，PspA2和PspA3，去掉其信号肽部分，使用GENE designer软件对所选基因序列进行密码子优化，将稀有密码子优化成适合大肠杆菌表达系统表达的密码子以提高蛋白表达量；RNA structure分析优化后的RNA结构，选取适宜的优化后序列进行基因合成，基因序列长度PspA1为1143bp，PspA2为1122bp，PspA3为1431bp(分别为SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:6)。目的基因片段的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:5)与GenBank中的相应序列一致，没有突变。
实施例2.获得重组质粒pET30a-PspA1、pET30a-PspA2和pET30a-PspA3
由中美泰和生物技术公司进行基因序列合成、将PspA 3种不同分支蛋白的目的片段克隆到pET-30a(+)表达载体上且转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。将转化完成后的菌液接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12小时后提取质粒。
为了提取质粒，收集1.5-3ml菌液的沉淀于1.5ml Eppendorf离心管中，加入100μL溶液1，振荡至充分悬浮。加入150μL溶液2，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体悬液变得清亮。随后将离心管放置冰上1-2分钟。加入150μL溶液3，立即轻柔颠倒离心管数次，室温放置5分钟，12000rpm离心12分钟。将420μL结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤3中的上清加入离心吸附柱中，混匀，12000rpm离心30秒钟。倒掉废液收集管中的废液。加入750μL漂洗液于离心吸附柱中，静置1分钟后，12000rpm离心15秒钟。倒掉废液收集管中的废液，重复一次。倒掉废液后，再次于12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗缓冲液。小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml Eppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲液，室温放置2-5分钟后，12000rpm离心1分钟。
为了进行PCR鉴定，采用pET30a质粒的通用引物作为PCR引物，由北京诺赛基因公司合成。PCR反应体系50μL，以提取的质粒DNA为模板，加入PCR缓冲液，dNTPs,上下游引物，ddH2O与EX Taq酶，在PCR扩增仪(ASTEC，日本)上进行扩增。扩增条件：95℃预变性5min，94℃1min，57℃50s，72℃1min，运行30个循环后，以72℃延伸10min，4℃保存。取5μL反应物置1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
引物序列如下：
上游引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGG 3’(SEQ ID NO.:7)
下游引物：5’GCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTC 3’(SEQ ID NO.:8)
为了进行酶切鉴定，将以下酶切鉴定体系加入至0.5ml EP管内，瞬时低速离心，37℃水浴2.5h后取5μL反应产物置1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
酶切鉴定体系：
分别以3种蛋白表达质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增片段长度均在1000bp-2500bp之间，与预期大小一致；表达质粒经酶切后同样成功切出目的基因条带，结果见图1。鉴定为阳性的克隆由北京诺赛基因公司测序以进一步确定连接的正确性。
实施例3.重组PspA1，PspA2和PspA3蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达
取鉴定后正确的大肠杆菌BL21(DE3)菌液50μL，接种于5ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。按1:50转接于含卡那霉素(50μg/ml)的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡(200rpm)培养至550nm OD值达0.5-1.0。加入IPTG至终浓度1mM，37℃诱导表达4hs。取1ml菌液，4℃，5000rpm离心5min,收集菌体。菌体沉淀悬于100μL 1xSDS加样缓冲液(50mM Tris-Cl PH6.8，100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚兰，10％甘油)中，进行SDS-PAGE电泳分析。
按《分子克隆》，配制12％分离胶和5％浓缩胶，灌制凝胶，另配制电泳缓冲液待用(25mM Tris-Cl,250mM甘氨酸，0.1％SDS)。将样品悬于SDS-PAGE加样缓冲液，煮沸3-5min,12000rpm离心1min后取上清上样，上样体积为20μl/孔。电泳时，样品位于浓缩胶时电压设为60V，样品进入分离胶后电压设为80V，待溴酚兰到达分离胶底部时停止电泳。将凝胶浸泡于考马斯亮蓝R-250染液中染色2-3小时后，用含20％乙醇和10％冰醋酸的脱色液脱色直至背景无色后观察。
为鉴定表达水平，对诱导的重组蛋白样品按上述步骤进行SDS-PAGE电泳、染色、脱色后，在凝胶成像系统上进行扫描，ImageMaster TotalLab软件分析测定蛋白表达水平。
为鉴定表达形式，诱导表达含目的基因的工程菌100ml，4℃，6000rpm离心15min收集菌体，用PH7.4的PBS重悬、洗涤菌体3次，最后混悬于5ml PBS+0.5％TritonX-100中，冰浴中超声破碎菌体。4℃，12000rpm，离心30min，分别对沉淀和上清取样进行SDS-PAGE电泳分析。
实施例4.重组PspA1，PspA2和PspA3蛋白表达条件的优化
将菌液按1：100接种于含有卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养至550nm OD值达0.5，加入IPTG至终浓度0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mM，37℃和30℃分别诱导表达1，2，3，4，5，6h，收获细菌悬液，取样进行SDS-PAGE电泳分析。经诱导表达条件的摸索，3种蛋白在IPTG终浓度1mmol/L，37℃诱导4小时的条件下表达比较稳定，占总表达量的30％左右，成功表达出3种目的蛋白。超声破菌后收集的上清和沉淀经SDS-PAGE分析可见3种蛋白均以可溶形式表达。图2中，条带3和4分别是表达蛋白超声破菌后的上清和沉淀。
实施例5.重组PspA1，PspA2和PspA3蛋白的纯化
实施例5-1.PspA1蛋白的纯化
为了进行Phenyl HP疏水层析，表达的蛋白超声后取上清，按上清体积逐渐加入硫酸铵至终浓度1.5M，边加边搅拌均匀。10000rpm离心15min后，取上清，0.45um滤器过滤后上样，目的蛋白在50％B洗脱液(20mM PB+1.5M硫酸铵，PH7.0)洗脱。
为了进行SP FF阳离子交换层析，将疏水层析后收集的50％B洗脱液，脱盐柱脱盐，缓冲液为20mM的柠檬酸，PH3.0。目的蛋白在90％洗脱液(20mM柠檬酸+1M Nacl，PH3.0)中洗脱。
将离子交换层析后90％B的洗脱液经浓缩，使用缓冲液(50mM PB+0.15M Nacl，PH7.2)进行分子排阻色谱纯化，所用色谱柱为HiLoad 16/60Superdex 75prep grade。收集洗脱液。
实施例5-2.PspA2蛋白的纯化
为了进行Butyl HP疏水层析，表达的蛋白超声后取上清，按上清体积逐渐加入硫酸铵至终浓度1.5M，边加边搅拌均匀。10000rpm离心15min后，取上清，0.45um滤器过滤后上样，目的蛋白在55％洗脱液(20mM PB+1.5M硫酸铵，PH7.0)中洗脱。
为了进行SP FF阳离子交换层析，将疏水层析后收集的55％洗脱液在脱盐柱脱盐，缓冲液为20mM柠檬酸，PH3.2。目的蛋白在85％B洗脱液(20mM柠檬酸+1M Nacl，PH3.2)中洗脱。
将SP FF阳离子交换层析后的85％洗脱液浓缩后进行分子排阻色谱纯化，所用色谱柱同实施例5-1，所用缓冲液为50mM PB+0.15M Nacl，PH7.2，收集洗脱液。
实施例5-3.PspA3蛋白的纯化
为了DEAE FF阴离子交换层析，表达的蛋白超声后取上清，10000rpm离心15min后，取上清，0.45um滤器过滤后上样，目的蛋白在23％洗脱液(20mM PB+1M Nacl，PH7.5)中洗脱。
为了Butyl HP疏水层析，将阴离子交换层析后收集的23％的洗脱液，按体积逐渐加入硫酸铵至终浓度1.5M，边加边搅拌均匀。10000rpm离心15min后，取上清，0.45um滤器过滤后上样，目的蛋白在50％洗脱液(20mM PB+1.5M硫酸铵，PH7.0)中洗脱。
将疏水层析后50％的洗脱液浓缩后进行分子排阻色谱纯化，所用色谱柱同实施例5-1、5-2。缓冲液为50mM PB+0.15M Nacl，PH7.2，收集洗脱液。
实施例5-4.SDS-PAGE分析和浓度测定
3种蛋白经过不同纯化方法及不同纯化条件的摸索，最终确定其各自的纯化方案；经过三步纯化后，SDS-PAGE分析，各蛋白纯度均达到90％以上。3种蛋白表达量、表达形式及纯化后效果见图2。
采用Lowry法对蛋白进行浓度测定。碱性铜液配制如下：临用前取4％Na2CO3，0.2MNaOH各25ml,0.04M CuSO4和0.1M酒石酸钾各0.5ml混匀配制而成。配制标准蛋白质溶液(100μg/ml)。将待测蛋白在试管中做适当稀释，加5ml碱性铜溶液，混匀，于室温放置10min，快速加入0.5ml酚试剂，摇匀，于室温放置30min，用650nm波长或红色滤光片比色(如发现混浊，经3000rpm/min离心15min后再比色)。绘制标准曲线：精确量取标准蛋白质溶液(100μg/ml)0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1ml，分别置于试管中，加蒸馏水补至1ml，其余同上。根据比色结果绘制标准曲线。直线回归计算结果。Lowry法测定经纯化浓缩后的3种蛋白，其浓度分别为PspA1 5.5mg/ml，PspA2 5.0mg/ml，PspA3 5.5mg/ml。
实施例6.重组PspA1，PspA2和PspA3蛋白的免疫反应性与抗原特异性
待检样品进行SDS-PAGE电泳。配制转移液、封闭液、PBST、底物。电泳转移：将相同大小的胶、6张滤纸及1张硝酸纤维素滤膜在转移缓冲液中浸泡15-20min，按照Bio-Rad半干胶电泳转移使用说明将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，15V，45-60min完成电泳转印。将完成电泳转印的滤膜放入封闭液，置摇床平台，室温封闭2hs。弃去封闭液，加1:2000稀释的经临床鉴定为肺炎链球菌肺炎感染病人的血清，置摇床平台，室温孵育2hs或过夜。100mlPBST洗膜5次，每次15min。加入以1:3000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，室温孵育2hs。100ml PBST洗膜3次，每次15min。加底物反应液DAB显色，10min内用蒸馏水冲洗终止反应。用滤纸吸干膜上残余液体，拍摄图片留存。结果显示3种肺炎链球菌重组蛋白都与肺炎病人血清发生特异性的抗原抗体反应，表明重组蛋白具有与天然蛋白相当的较好免疫反应性与抗原特异性。结果见图3。
实施例7.肺炎链球菌表面蛋白A作为载体蛋白与A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖的结合
实施例7-1.重组PspA1、PspA2和PspA3蛋白与A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP,GCMP)结合物的制备
本实施例主要是在北京绿竹生物有限公司的协助下完成，结合方法为溴化氰(CNBr)活化法。3种PspA蛋白分别与GAMP和GCMP结合，结合方法相同，主要步骤如下：
1)脑膜炎球菌荚膜多糖的活化：将脑膜炎球菌荚膜多糖稀释至5mg/ml，加入溴化氰(CNBr)至多糖终浓度为1mg/ml以活化多糖。用NaOH调节PH并维持PH 10.5，于20～26℃搅拌10min，再加入已二酰肼(ADH)至终浓度0.25M，调节并维持PH 8.6，保持30min，移至2～8℃冰箱搅拌过夜，形成多糖－已二酰肼衍生物。衍生物超滤去除小分子物质，0.45μm滤器除菌过滤后保存。
2)多糖衍生物与载体蛋白的结合：多糖衍生物与蛋白按1:1比例反应，反应浓度2mg/ml。调节并维持PH 5.6，加入碳二亚胺(EDAC)至终浓度0.02M，调节并维持PH 5.6，维持90min，超滤去除小分子物质，获得未纯化结合物。应注意，如本领域技术人员已知的，多糖蛋白的结合方法有多种，如胺还原反应、酰胺化反应、二硫键连接反应、异脲键连接反应等，每种方法都有各自的优缺点。具体在试验中可以根据多糖性质、蛋白载体的性质进行选择。
3)结合物的纯化：用SephacrylS-400凝胶层析柱纯化结合物，收集V0附近洗脱峰，经0.22μm滤器除菌过滤，获得结合物，2～8℃储存备用。
实施例7-2.荚膜多糖-蛋白结合理化性质检测
采用磷测定法测定GAMP含量。结合物中蛋白质含量采用改良lowry法测定,方法如实施例5-4所述。精密量取供试品适量(约含磷4-20μg)置试管中，加4滴硫酸(约0.08ml)加热至炭化，再加2滴高氯酸(约0.06ml)消化至无色澄清；消化完全后稍置片刻，立即加水2ml，加0.04mol/L钼酸铵溶液0.4ml，混匀；加还原剂(称取亚硫酸氢钠6g，亚硫酸钠1.2g，1-氨基-2-萘酚-4-磺酸0.1g，置棕色瓶中，加水至50ml，1周内使用)0.2ml，混匀；加水至6ml，15-20min后，在紫外分光光度计波长820nm处测定吸光度；精密量取标准磷溶液0.2ml、0.40ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置试管中，各补加水至1ml，自“加4滴硫酸起”，操作方法与上相同，测定各管的吸光度。以标准磷溶液的系列浓度对其相应的吸光度作直线回归，然后将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程，求出其相应体积(ml)。
磷含量(μg/ml)＝V×cR/Vx
式中V为供试品溶液吸光度相对于标准磷溶液的体积，ml；
cR为标准磷溶液的浓度，μg/ml；
Vx为供试品的体积，ml。
根据以下比例，A群多糖含量：磷含量为1000：75，计算出A多糖含量。
采用唾液酸测定法测定GCMP含量。唾液酸对照品溶液(200μg/ml)的制备：精密称取唾液酸对照品10.52mg(1μg唾液酸相当于3.24nmol)，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，即为唾液酸贮备液(1mg/ml)，按一次使用量分装，-70℃贮存，有效期1年，仅可冻融1次。4℃保存使用期为2周。精密量取唾液酸贮备液1ml，置5ml量瓶，加水至刻度，即为每1ml含200μg的唾液酸对照品溶液，用前配制。间苯二酚-盐酸溶液的配制：分别量取2％间苯二酚溶液2.5ml，0.1mol/L硫酸铜溶液62.5μL，25％盐酸溶液20ml，加水稀释至25ml，混匀。试验前4小时内配制。取供试品适量，加水稀释至蛋白质浓度约为每1ml含0.2-0.4mg，作为供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试管中，混匀；
每管中加入间苯二酚-盐酸溶液1ml，加盖，沸水煮沸30min，水浴面于液面约2cm；取出置冰浴中3min后(同时振摇)，每管加乙酸丁酯-丁醇液(取4体积乙酸丁酯与1体积丁醇混匀，室温下保存，12小时内使用)2ml，充分混匀，室温放置10min，在紫外分光光度计波长580nm处测定吸光度；以唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归(相关系数应不低于0.99)，由直线回归方程求出5μg唾液酸的吸光度，再按下式计算：
式中A1为5μg唾液酸的吸光度；
A2为供试品的吸光度；
n为供试品的稀释倍数；
P为供试品蛋白质含量，μg/μL；
W为1nmol促红素的量(不包括糖成分量)，相当于30.6μg；
根据以下比例，C群多糖含量：磷含量为1000：750，计算出C多糖含量。
通过溴化氰活化法，共获得6种多糖-蛋白结合物，分别为GAMP-PspA1，GAMP-PspA2，GAMP-PspA3，GCMP-PspA1，GCMP-PspA2和GCMP-PspA3。通过检测纯化后结合物的多糖、蛋白含量，计算多糖/蛋白比，具体结果见下表。
表1.多糖-蛋白结合物理化性质检测结果
实施例8.荚膜多糖-蛋白结合物的特异性体液免疫应答检测
实施例8-1.GAMP和GCMP与蛋白结合物与混合物的动物免疫
将276只体重16-18g雌性Balb/c小鼠随机分为23组，每组12只，分别为：A群脑膜炎球菌多糖组(GAMP)、GAMP-PspA1结合物组、GAMP-PspA2结合物组、GAMP-PspA3结合物组、GAMP-TT结合物组、GAMP+PspA1混合物组、GAMP+PspA2混合物组、GAMP+PspA3混合物组、GAMP+TT混合物组、C群脑膜炎球菌多糖组(GCMP)、GCMP-PspA1结合物组、GCMP-PspA2结合物组、GCMP-PspA3结合物组、GCMP-TT结合物组、GCMP+PspA1混合物组、GCMP+PspA2混合物组、GCMP+PspA3混合物组、GCMP+TT混合物组、PspA1组、PspA2组、PspA3组、TT组以及阴性对照组(生理盐水组)。GAMP-TT和GCMP-TT为疫苗原液。
免疫接种方式、剂量与免疫针次如下：腹部皮下接种，单独多糖组按多糖含量5μg/ml免疫，单独蛋白组按蛋白含量10μg/ml免疫，多糖-蛋白结合物组按多糖含量5μg/ml免疫，多糖+蛋白混合物组按多糖含量5μg/ml加上结合物稀释至多糖5μg/ml时的蛋白量免疫，生理盐水作为阴性对照，免疫剂量为0.5ml/只。一共免疫3次，第1、14、28日免疫，分别于第13、27、35和第180天眼眶采血，分离血清，-20℃保存备用。
实施例8-2.免疫后小鼠血清中抗多糖特异性IgG、IgG1与IgG2a抗体的检测
为了进行ELISA方法步骤，包被96孔板：取96孔板，每孔加入100μl包被液，A群和C群脑膜炎多糖的包被浓度为5μg/ml，用铝箔纸封好，4℃过夜。弃掉包被液，ELISA洗液清洗6次，拍干孔中残留液体。每孔中加入200μl封闭液，铝箔纸封好，于37℃孵育1h。弃去封闭液，用ELISA洗液清洗3次，拍干孔中残留液体。按预先设定的稀释倍数稀释血清样本，包括阴性对照组血清。每板1-11孔为实验组血清，第12孔为PBS阴性对照组血清。100μL体系，用排枪混匀后倍比稀释，直至第八排，弃掉100μL液体。用铝箔纸封好，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用ELISA洗液清洗6次，拍干孔中残留的液体。每孔中加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgG稀释液(1：3000稀释)，用铝箔纸封好，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用ELISA洗液清洗6次，拍干孔中残留的液体。显色与终止，显色试剂为OPD，现配现用，每孔加入100μl，避光，37℃孵育15-20min后，每孔加入50μl 2M H2SO4溶液终止反应。酶标仪A490nm读取检测数据。以上EILSA实验流程同样适用于小鼠血清中多糖抗体IgG1与IgG2a亚类的检测；唯一不同之处在于所加酶标抗体分别为HRP标记羊抗鼠IgG1和IgG2a，稀释倍数分别是1:10000和1:5000。
为了检测抗-GAMP抗体及其亚类，采用ELISA法检测了A群多糖与不同蛋白的结合物与混合物经不同针次免疫后及首次免疫180天后小鼠血清抗-GAMP IgG抗体滴度的变化。试验中抗体滴度的确定是以实验组OD值≥PBS对照组OD值的2.1倍确认。根据每组小鼠的抗体滴度，计算其几何平均滴度。图4是以每组小鼠产生的抗-GAMP抗体几何平均滴度作图。在做统计分析之前，将各组数据转换为对数后进行方差分析，结果如下：GAMP与各蛋白的结合组，与单独GAMP组、GAMP蛋白多糖混合组相比，产生的抗体滴度均有显著性增高,P<0.05；GAMP与各蛋白的混合组产生的抗体滴度与单独GAMP组相比没有显著性差异,P>0.05；且每针次之间也没有显著增高,P>0.05；GAMP与各蛋白结合组，第一针、第二针及第三针免后产生的抗体滴度都有递增，除GAMP-PspA3组二、三针之间增加不显著以外，其它各组每针次之间均有统计学差异，P>0.05；GAMP-PspA1组、GAMP-PspA2组、GAMP-PspA3与GAMP-TT组比较，其产生的抗-GAMP抗体滴度没有统计学差异，且各组之间也没有统计学差异,P>0.05；各组小鼠在免疫180天后检测抗-GAMP抗体水平，其滴度都有所下降，但是多糖-蛋白结合组的抗体滴度仍然显著性高于多糖蛋白混合组及单独多糖组,P<0.05。
本实施例中除了检测各组免疫后抗-GAMP IgG抗体外，还对第三次免疫后血清进行了IgG1和IgG2a的检测。各结合组IgG1亚类的抗体水平都很高，与IgG相比没有统计学差异，P>0.05；但IgG2a的水平较低。在多糖蛋白混合组及单独GAMP组，其血清在与结合组同样稀释倍数的条件下，其IgG1和IgG2a的OD值低于PBS对照鼠OD值的2.1倍，故在此没有列在表格中，提示这两组诱导抗体类型转换能力较差。IgG1与IgG2a的比值在GAMP-PspA1组、GAMP-PspA2组、GAMP-PspA3和GAMP-TT组之间也没有统计学差异，P>0.05，具体检测结果见表2。对以上检测结果的综合分析提示，PspA蛋白及TT，只有在与GAMP通过化学方式结合以后，才能显著增强A群多糖的体液免疫反应；与GAMP-TT疫苗原液组相比，3种PspA蛋白对A多糖的免疫增强效应并没有显著性差异，说明其作为多糖载体的可行性；各蛋白与GAMP结合后，能够产生免疫记忆，表现在第二次、第三次免疫后抗-GAMP抗体滴度的显著增加，同时也能延长体内抗体存在的时间，体现在免疫180天后仍能检测到较高滴度的抗-GAMP抗体。此外，各蛋白与多糖结合后还能显著增强IgG2a抗体亚类的产生，且各组之间没有差异，而蛋白多糖混合组及单独多糖组血清在同样稀释度条件下几乎检测不到IgG1与IgG2a，说明二者结合后可产生抗体类型转换。
表2.蛋白与A群多糖结合物第三次免疫后血清抗-GAMP IgG及其亚类检测
为了检测抗-GCMP抗体及其亚类，与A群多糖一样，我们也对C群多糖与各蛋白的结合物组、混合物组及单独GCMP组各针次免后及首次免疫后180天小鼠血清中抗-GCMP IgG抗体水平进行了检测。抗体滴度的确定方法、作图方法及统计分析方法与A群多糖相同。检测结果如图5所示。对以上数据的统计分析结果如下：GCMP与各蛋白的结合组，与单独GCMP组、GCMP蛋白多糖混合组相比，产生的抗体滴度均有显著性增高，P<0.05；GCMP与不同蛋白的混合组产生的抗体滴度与单独GCMP组相比没有显著性差异，P>0.05；且每针次之间也没有显著增高,P>0.05；GCMP与各蛋白的结合组，第一针、第二针及第三针免后产生的抗体滴度都有递增，除GCMP-PspA1组、GCMP-PspA2组第一、二针之间增加不显著以外，其它各组每针次之间均有显著性增加；GCMP-PspA1组、GCMP-PspA2组、GCMP-PspA3与GCMP-TT组比较，其产生的抗-GCMP抗体滴度显著性低于GCMP-TT组，P<0.05；PspA各组蛋白之间没有统计学差异，P>0.05；各组小鼠在免疫180天后检测抗-GCMP抗体水平，其滴度都有所下降，但是多糖-蛋白结合组的抗体滴度仍然显著性高于多糖蛋白混合组及单独多糖组,P<0.05。对第三次免疫后小鼠血清IgG1和IgG2a抗体亚类的检测结果显示，各结合组IgG1亚类的抗体水平与IgG相比没有统计学差异，P>0.05；而IgG2a的水平较低。在多糖蛋白混合组及单独GCMP组，其血清在与结合组同样稀释倍数的条件下，其IgG1和IgG2a的OD值低于PBS对照鼠OD值的2.1倍，故在此没有列在表格中，提示这两组诱导抗体类型转换能力较差。只有GCMP-TT组检测到IgG2a的产生，其他组在血清1：50稀释的条件下均没有检测到IgG2a抗体。具体检测结果见表3。对以上检测结果的综合分析提示，PspA蛋白及TT，只有在与GCMP通过化学方式结合以后，才能显著增强C群多糖的体液免疫反应；与GCMP-TT疫苗原液组相比，3种PspA蛋白对GCMP的免疫增强效应均有显著性降低，但各PspA之间没有显著性差异，说明在体液免疫方面其作为GCMP载体蛋白的效果不如TT好；各蛋白与多糖结合后，能够产生免疫记忆，表现在第三次免疫后抗-GCMP抗体滴度的显著增加，同时也能增强免疫持久性，因为在免疫180天后仍能检测到相对较高滴度的抗-GCMP抗体。对于IgG2a抗体亚类的检测，只有GCMP-TT组有IgG2a的产生，其余各组几乎检测不到IgG2a。蛋白多糖混合组及单独多糖组血清在同样稀释度条件下同样检测不到IgG1。与PspA-GAMP的各结合组相比，PspA-GCMP的结合效果并理想，不仅表现在产生抗-GCMP抗体滴度的低下，还表现为不能诱导产生IgG2a抗体亚类，其原因有可能是诱导产生的抗-GCMP抗体浓度偏低，提示只有当多糖抗体浓度达到一定程度之后才能检测到IgG2a。
表3.蛋白与C群多糖结合物第三次免疫后血清抗-GCMP IgG及其亚类检测
实施例8-3.免疫后小鼠血清中抗蛋白特异性IgG、IgG1与IgG2a抗体的检测
采用间接ELISA法检测血清中载体蛋白特异性IgG，IgG1，IgG2a抗体的滴度。包被蛋白PspA1，PspA2和PspA3，包被浓度为5μg/ml。本部分试验分别检测了小鼠免疫一针、两针和三针后血清中抗蛋白特异性IgG抗体；并对第三次免疫后小鼠血清进行了IgG1与IgG2a抗体亚类的检测。ELISA检测方法与酶标抗体的稀释倍数与实施例8-2所述一致。
在本实施例中，为了进一步研究蛋白与多糖结合后二者之间在免疫原性方面是否有相互促进或相互拮抗的影响，我们还对实验各组每次免后小鼠血清相应蛋白抗体做了检测，并对第三次免疫后血清抗蛋白抗体IgG1与IgG2a进行检测。检测结果分别以不同蛋白与A群、C群多糖结合和混合组的方式列出。为了符合统计学要求，将各组的抗体滴度转换为对数后进行方差分析。
表4是对PspA1蛋白各组结合物与混合物每次免疫后抗-PspA1特异性IgG、IgG1与IgG2a的检测。通过统计学分析得出如下结论：PspA1与A、C群多糖结合组、混合组及单独蛋白组，初免、二免及三免之后产生的抗PspA1蛋白IgG抗体滴度都有显著性增加，P<0.05，尤其是第三次免疫后，抗体滴度升高很快；PspA1与A、C群结合、混合组产生的抗-蛋白抗体之间相互比较，从数据上看，第二次免疫后，结合组的蛋白抗体滴度显著高于混合组，但第三针免后，结合组的蛋白抗体滴度不如混合组升高明显。经统计分析后，PspA1组和GCMP-PspA1组产生的抗体滴度显著性低于GAMP+PspA1组，P<0.05，其它各组之间没有统计学差异，P>0.05，提示蛋白与多糖的结合或混合不影响蛋白的免疫效果。对于IgG1与IgG2a抗体亚类的检测，IgG1水平显著高于IgG2a，P<0.05，但对于二者的比值分析结果显示，只有GAMP-PspA1组IgG1/IgG2a比值显著性低于其它各组，P<0.05，提示其IgG2a抗体产生量相对较高。
表4.PspA1蛋白多糖结合物与混合物每次免后抗蛋白IgG及第三次免后IgG1与IgG2a的检测(GMT)
表5是对PspA2蛋白各组结合物与混合物中抗-PspA2特异性IgG、IgG1与IgG2a的检测。结果分析如下：PspA2与A、C群多糖结合组、混合组及单独蛋白组，在初免、二免及三免之后产生的抗-PspA2蛋白抗体滴度都有显著性增加，P<0.05，尤其是第三次免疫后，抗体滴度升高很快；PspA2与A、C群结合与混合组蛋白抗体之间的方差分析结果显示，除PspA2组产生的抗-PspA2蛋白抗体滴度显著性低于其它各组外，P<0.05，其余各组之间没有显著性差异，P>0.05；提示蛋白与多糖无论哪种形式结合或混合均增强PspA2蛋白的免疫原性；IgG1与IgG2a抗体亚类的检测结果为IgG1水平显著高于IgG2a，P<0.05，二者的比值分析结果显示，PspA2与C多糖的结合与混合组，IgG1/IgG2a的比值显著性高于其它各组，说明PspA2与C多糖的结合或混合后产生的IgG2a抗体相对较低。
表5.PspA2蛋白多糖结合物与混合物每次免后抗蛋白IgG及第三次免后IgG1与IgG2a检测(GMT)
表6是对PspA3蛋白各组结合物与混合物中抗-PspA3特异性IgG、IgG1与IgG2a的检测。结果分析如下：PspA3与A、C群多糖结合组、混合组及单独蛋白组，在初免、二免及三免之后产生的抗-PspA3蛋白抗体滴度都有显著性增加，P<0.05，尤其是第三次免疫后，抗体滴度升高很快；PspA3各组蛋白抗体之间的方差分析结果显示，除GAMP-PspA3组产生的蛋白抗体滴度显著性低于其它各组外，P<0.05，其余各组之间比较没有统计学差异，P>0.05；提示GAMP与PspA3结合后对PspA3蛋白的免疫原性产生了抑制。IgG1与IgG2a抗体亚类的检测结果为IgG1水平显著高于IgG2a，P<0.05，二者的比值分析结果显示，各组之间没有显著性差异，P>0.05。
表6.PspA3蛋白多糖结合物与混合物每次免后抗蛋白IgG及第三次免后IgG1与IgG2a的检测(GMT)
表7是对TT蛋白各组结合物与混合物中抗-TT蛋白特异性IgG、IgG1与IgG2a的检测。结果分析如下：TT与A、C群多糖结合组、混合组及单独蛋白组，在初免、二免及三免之后产生的抗-TT蛋白抗体滴度都有显著性增加，P<0.05，尤其是第三次免疫后，抗体滴度升高较快；TT各组之间的比较结果显示，GAMP-TT组产生的抗-TT抗体滴度极显著性低于其它各组，P<0.05，GCMP-TT组抗-TT抗体滴度也显著性低于单独TT组和GCMP+TT组，P<0.05，说明TT蛋白与A群、C群多糖结合后都在不同程度上抑制了TT抗体的产生，与A群多糖结合后更加明显；IgG1与IgG2a抗体亚类的检测结果为IgG1水平高于IgG2a，P<0.05，二者的比值分析结果显示单独TT组IgG1/IgG2a的比值显著性高于其它各组；提示TT与多糖结合后IgG2a的产生增加更明显。
表7.TT多糖结合物与混合物每次免后抗蛋白IgG及第三次免后IgG1与IgG2a抗体水平的检测(GMT)
对以上四种蛋白的综合分析比较可得出以下结论：各蛋白单独免疫组之间的比较分析结果显示，PspA1和PspA2蛋白产生的相应抗体滴度显著性低于PspA3和TT组，P<0.05；后两者之间没有显著性差异，P>0.05；提示在没有铝佐剂的情况下，后两者蛋白的免疫原性优于前两者。跟TT与A、C群结合与混合组的IgG1/IgG2a比值相比，3种PspA蛋白各结合组与混合组的比值均显著性增高，P>0.05，说明其产生的IgG2a相对低于TT各组，提示可能TT激发细胞免疫反应的能力更强一些。对某些蛋白来说，与多糖结合后会抑制蛋白的免疫原性，比如GAMP-TT、GCMP-TT及GAMP-PspA3的结合，产生的抗蛋白抗体显著低于其单独蛋白组及蛋白与多糖的混合组，P<0.05。
实施例9.荚膜多糖蛋白结合物的免疫后小鼠细胞免疫检测
实施例9-1.ELISPOT检测细胞因子IFN-γ和IL-4
为了制备脾淋巴细胞，断颈处死小鼠，浸泡于75％的酒精中。无菌操作于超净台取出小鼠脾脏，放置到200目筛网。在35mm培养皿中加入小鼠淋巴细胞分离液4-5ml，盛有脾脏的筛网置于培养皿中，用5ml无菌注射器针栓进行研磨。把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15ml离心管中，覆盖200-500μL RPMI-1640培养液，注意保持液面分界明显。室温800g离心30min，设置较慢的加速度和减速度。吸出淋巴细胞层，再加入10ml RPMI-1640培养液，颠倒洗涤，室温250g离心10min，收集细胞。倾倒上清，用无血清培养基重悬细胞。细胞计数仪计算淋巴细胞浓度，并将其稀释至4×106个/ml，待用。
为了进行ELISPOT检测，将预包被板活化。200μL/孔加入RPMI-1640培养液，室温静置5-10min后将其扣出。加入细胞悬液：将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，100μL/孔，即4×105个/孔，每只小鼠均做复孔。加入刺激物：多糖蛋白结合组和多糖蛋白混合组分别用单独蛋白、单独多糖及多糖与蛋白的混合物进行刺激；单独多糖组只用相应多糖进行刺激；单独蛋白组只用相应蛋白进行刺激；3种PspA蛋白、TT及GAMP和GCMP刺激的终浓度30μg/ml/孔,多糖与蛋白的混合刺激为以上两者刺激物浓度的混合。同时设置每板的阳性对照孔、培养液对照孔和每只小鼠不加刺激物的对照孔，阳性刺激物ConA终浓度为100ng/ml，阴性对照孔为PBS。孵育：所有样品和刺激物加完后，盖好板盖，放入37℃，5％CO2培养箱培养。裂解细胞：培养完毕后倾倒孔内细胞及培养液，加冰冷的去离子水，200μL/孔，4℃冰箱放置10min低渗裂解细胞。洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μL/孔，洗涤5次，每次停留30-60s。最后一次在吸水纸上扣干。检测抗体孵育：将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μL/孔，洗涤5次，每次停留30-60s。最后一次在吸水纸上扣干。酶联亲和素孵育：将稀释好的酶标亲和素工作液加入各实验孔，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板：倾倒孔内液体，1×Washingbuffer，200μL/孔，洗涤5次，每次停留30-60s。最后一次在吸水纸上扣干。显色：将现配的AEC显色工作液加入各实验孔，100μL/孔，室温避光静置15-45min。待阳性对照孔出现较明显的显色斑点时终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤各实验孔正反面及底座3-5次，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。ELISPOT板斑点计数，并记录各种参数，统计分析。
ELISPOT的实验设计中，每只小鼠均设复孔，同时设置了每只小鼠不加刺激物的对照孔，在实施例结果的处理中，实验孔的最终斑点形成细胞(SFC)数量为实验孔的SFC减去未加刺激物的对照孔SFC，同时对复孔取平均值。对于同一组多糖-蛋白结合组或混合组小鼠，我们分别给予了不同免疫成分的刺激，分别用相应蛋白、多糖及蛋白多糖的混合物进行刺激，便于更加直观的观察每组实验小鼠在接受不同成分刺激物刺激时产生细胞因子的变化情
况。图6将分别分析GAMP、GCMP与各蛋白结合或混合免疫小鼠后体外ELISPOT的检测结果。对图6数据的分析结果如下：从图中可清晰看出单独多糖组免疫后体外几乎检测不到细胞因子的产生，也正如文献报道，多糖为TI抗原，不能激发细胞免疫反应。各单独蛋白组两种细胞因子都有产生，且都显著高于单独多糖组；各蛋白组IL-4SFC数量没有显著差异；对于IFN-γSFC的数量，PspA1蛋白组显著高于其它蛋白组；与单独GAMP组相比，无论是蛋白多糖结合组还是混合组，3种刺激物刺激后生成的IL-4SFC和IFN-γ的SFC，在数量上都有增加，IL-4尤为明显；各组接受相应蛋白刺激后，与相对应的单独蛋白免疫组相比，生成的IL-4SFC数量均有降低，而生成IFN-γSFC的数量除GAMP-TT组有增加外，其余各组也较的单独蛋白组低；各组接受单独GAMP刺激后产生的IL-4SFC和IFN-γSFC数量普遍都较其它两种刺激物刺激后的数量低；PspA各蛋白与多糖的结合组、混合组，与TT的结合组、混合组相比，无论是IL-4还是IFN-γ，其SFC数量都普遍较低，但有个别组例外。
图7为GCMP与各蛋白结合物、混合物的ELISPOT检测结果。数据分析结果如下：各单独蛋白组IL-4和IFN-γ两种细胞因子都有产生，且显著高于单独多糖组；无论是蛋白多糖的结合组还是混合组，3种刺激物刺激后生成的IL-4SFC和IFN-γ的SFC，虽然有高有低，但在数量上与单独GCMP组相比，普遍增加；各组接受相应蛋白刺激后，与相对应的单独蛋白免疫组相比，除GCMP-TT,GCMP+TT组IFN-γSFC数量增加外，其它组生成的IL-4SFC和IFN-γSFC数量均普遍降低；PspA各蛋白与多糖的结合组、混合组，与TT结合组、混合组相比，无论是IL-4还是IFN-γ，其SFC数量大部分都是降低的。
综上所述，各蛋白与GAMP、GCMP结合或混合后，相对于单独多糖免疫组来说，都不同程度的激发了机体的细胞免疫反应，表现在IFN-γSFC数量的增加，提示载体蛋白的加入不仅增加了机体体液免疫反应，也增加了细胞免疫反应，这一点是单独多糖疫苗不可比拟的。但是相对于单独蛋白免疫组来说，蛋白与多糖结合或混合后都在不同程度上抑制了细胞因子的产生，说明多糖对蛋白激发细胞免疫有一定负面影响，但也并非绝对，分蛋白而异。各组的细胞免疫反应相对弱于GAMP-TT疫苗组。
实施例9-2.免疫后小鼠淋巴细胞流式细胞术检测Th1和Th2细胞亚群
如实施例9-1中描述的制备脾淋巴细胞，取各组小鼠脾淋巴细胞1ml加入到24孔培养板中，浓度为2×106个/ml。每孔加入终浓度为50ng/ml PMA+1μg/ml Ionomycin+10μg/mlBFA的刺激剂，不刺激对照孔加入终浓度为10μg/ml BFA工作液，加后均匀混合。盖好板盖，放入37℃，5％CO2培养箱培养4-6h。收集每孔细胞到流式上样管中，加入2mlCell StainingBuffer 300g离心5min，弃上清。将管底细胞重悬于100μL Cell Staining Buffer中，加入小鼠CD3-PerCP、CD4-FITC标记抗体进行细胞表面染色步骤，常温避光反应20min。加入2mlCell Staining Buffer 300g离心5min，弃上清。加入0.5ml Fixation Buffer，常温避光放置20min，300g离心5min，弃上清。加入2mlCell Staining Buffer 300g离心5min，弃上清。加入2ml 1×Permeabilization Wash Buffer 300g离心5min，弃上清。将试管底部细胞重悬于100μL1×Permeabilization Wash Buffer中，加入小鼠细IFN-γPE和IL-4APC标记抗体，混合均匀后，常温避光反应30min。加入2ml 1×Permeabilization Wash Buffer300g离心5min，弃上清。加入0.5mlCell Staining Buffer重悬细胞，待上机分析。
图8为蛋白与A群多糖结合物、混合物第三次免后小鼠脾淋巴细胞体外Th1/Th2细胞亚群比值结果。以上数据的结果分析如下：与空白对照组相比，除单独GAMP组外，其余各组Th1/Th2细胞亚群的比值都有显著性增高，P<0.05；各蛋白与GAMP的结合免疫组与单独GAMP组相比，只有GAMP-TT组免后Th1/Th2细胞亚群的比值没有显著性差异，其余各组与之相比均有显著性增高，P<0.05，说明Th1亚群细胞在Th细胞中的占比较Th2亚群有所增加，相比A群多糖能产生相对较强的细胞免疫；各蛋白GAMP混合免疫组与单独GAMP组相比，GAMP+PspA3组和GAMP+TT组Th1/Th2比值没有显著性差异，GAMP+PspA1和GAMP+PspA2组Th1/Th2比值有显著增高P<0.05；与GAMP-TT疫苗原液组相比，除GAMP-PspA1组、GAMP-PspA3组和GAMP+PspA2组Th1/Th2比值有显著性增高，P<0.05，其余各组(除外单独蛋白组)与之相比均没有统计学差异，说明PspA1、PspA3蛋白与GAMP结合后可激发较强的细胞免疫应答；将单独蛋白组(图中深色柱体)的Th1/Th2比值，分别与相应的蛋白-GAMP结合组与混合组相比，除单独PspA3蛋白组较GAMP+PspA3组Th1/Th2比值显著性增加以外，其余各组之间相比都没有显著性差异，P>0.05，说明A群多糖的加入并没有影响蛋白的细胞免疫效果，这一点不能与ELISPOT结果对应。综上所述，3种PspA蛋白与GAMP结合或混合后免疫，与单独GAMP组相比，均能激发机体的细胞免疫反应；与GAMP-TT疫苗原液组相比，GAMP-PspA1组、GAMP-PspA3组能激发更强的细胞免疫反应；蛋白引起的细胞免疫反应并没有因为不能激发细胞免疫的GAMP的加入而受影响；说明PspA蛋白作为多糖载体具有可行性。
图9为蛋白与C群多糖结合物、混合物第三次免后小鼠脾淋巴细胞体外Th1/Th2细胞亚群比值结果。对蛋白与C群多糖的结合组与混合组的统计学分析结果为：与空白对照组相比，除单独GCMP组、PspA1与GCMP的结合与混合组、以及PspA3与GCMP的结合与混合组外，其余各组Th1/Th2细胞亚群的比值都有显著性增高,P<0.05；各蛋白与GCMP的结合组与单独GCMP组相比，只有GCMP-PspA2和GAMP-TT组免后Th1/Th2细胞亚群的比值有显著性增高，P<0.05，其余各组与之相比没有显著性差异，P>0.05；各蛋白与GCMP混合组与单独GCMP组相比，除GCMP+PspA3Th1/Th2比值有显著性降低以外，其余各组与之相比没有显著性差异，P>0.05；与GCMP-TT疫苗原液组相比，除GCMP-PspA1组、GCMP-PspA3组和GCMP+PspA3组Th1/Th2比值有显著性降低，其余各组与之相比没有显著性差异,P>0.05；说明只有PspA2蛋白与C群多糖结合后激发的细胞免疫效果与GCMP-TT组相当；将单独蛋白(图中深色柱体)的Th1/Th2比值，分别与相应的蛋白-GCMP结合组与混合组相比，除单独PspA3蛋白组较GCMP-PspA3和GCMP+PspA3组Th1/Th2比值显著性增加以外，P<0.05，其余各组之间相比都没有显著性差异,P>0.05。提示对大部分蛋白来说，C群多糖的加入并没有影响其细胞免疫的效果。综上所述，提示3种PspA蛋白中只有PspA2蛋白与GCMP结合或混合后免疫，与单独GCMP组相比，可激发机体更强的细胞免疫反应；与GCMP-TT疫苗原液组相比，也只有GCMP-PspA2组激发的细胞免疫反应与之相当。与PspA各蛋白与GAMP的结合或混合组相比，整体来说PspA与C群多糖结合的效果不理想，虽然GCMP-PspA2组激发的细胞免疫反应与GCMP-TT疫苗原液组相比没有差异，但是也不如GAMP-PspA2组强。
实施例10.荚膜多糖蛋白结合物的免疫后小鼠血清杀菌力检测
血清杀菌力检测(serum bactericidal assay,SBA)是目前评价A群、C群脑膜炎球菌疫苗产生的功能性抗体活性的主要方法。SBA实验的原理是血清中的抗体与相应抗原结合，形成抗原抗体复合物后，激活补体系统，借助活化的补体成分清除病原体。每个实验组取6只经第三针免后7天的小鼠血清进行检测。实验前需要进行工作菌种库的制备、幼兔血清补体的筛选。SBA操作步骤如下：干燥事先配置的THYA平板，在通风工作台打开盖子，放置30-60min。干燥后盖上盖子，防止过于干燥。待检血清样品的灭活，56℃水浴30min。于96孔U形底组织培养板上稀释待检血清及质控血清，始于4倍稀释，做8个3倍系列稀释。37℃水浴快速解冻冻存菌种，12000g离心2min，弃掉上清，加入1mlOBB，混匀，再次12000g离心2min，弃掉上清后0.5mlOBB重溶，混匀待用。将菌液稀释至5×104/ml，每孔加入10μL，置小型振荡器上室温震荡30min。冰箱中取出灭活和未灭活补体，室温下融化，融化后立即置冰上待用。96孔板30min反应完成后，每孔加入10μL补体；同时设立灭活补体对照孔。将96孔培养板放在小型振荡器上，于37℃，5％CO2培养箱培养1h。培养完毕后，从H行开始，用排枪混匀，从该行12孔中，每孔取10μL在THYA平板第一行(底部)点种菌液，立即倾斜平板，使液体流成一条，约2-3cm。其它行样品类推。完成点种菌液后，在室温孵育10-20min，待菌液吸收后置37℃，5％CO2培养箱培养过夜。将培养过夜的THYA平板，覆盖含TTC的上层琼脂，待琼脂凝固后使用自动菌落计数仪计数菌落数目。根据对照板的菌落数计算实验组50％的杀菌滴度。
脑膜炎球菌多糖抗体的杀菌力检测目前是世界范围内评价脑膜炎多糖疫苗效力的最好方法，也是最直接的方法。实验中每组取6只第三次免疫后7天小鼠血清进行SBA检测，对其杀菌抗体滴度取几何平均数后作图，与A群多糖结合、混合组结果见图10，与C群多糖结合、混合组结果见图11。杀菌抗体滴度转换为对数后进行各组之间的统计学分析比较。
对各组的统计学分析结果如下：与单独GAMP组比较，PspA 3种蛋白及TT与GAMP结合组的杀菌抗体滴度有显著性增高，P<0.05，尤其是GAMP-PspA1组，其杀菌抗体滴度达到3897，显著性高于其它蛋白-多糖结合组；但各蛋白多糖混合组与GAMP组相比没有显著性差异，P>0.05；与GAMP-TT疫苗原液组相比，只有GAMP-PspA1组，其杀菌抗体滴度显著性增高，P<0.05，其它各结合组与之相比没有统计学差异，P>0.05；各蛋白-多糖结合组的杀菌抗体滴度显著高于各多糖蛋白混合组，P<0.05。图11为C群多糖与各蛋白结合、混合组免后产生的抗-GCMP的杀菌抗体滴度。
对各组的统计学分析结果如下：与单独GCMP组比较，PspA 3种蛋白与GCMP的结合组产生的抗-GCMP的杀菌效果没有显著性差异，P>0.05，但是GCMP-TT组,其杀菌抗体滴度达到14046,显著性高于其它各组，P<0.05，提示3种PspA蛋白与GCMP的结合效果均不如GCMP-TT好；PspA 3种蛋白及TT与GCMP的混合组之间产生的多糖抗体杀菌力效果有较大差异，GCMP+PspA1组和GCMP+PspA3组的杀菌抗体滴度显著降低，P<0.05，但是这两组产生的抗-GCMP抗体并没有显著性低于其它各组，提示可能其产生的功能性抗体活性较弱；蛋白-多糖结合组的杀菌抗体滴度与各多糖蛋白混合组比较时发现，GCMP+PspA2组和GCMP+TT组的杀菌效果与除GCMP-TT组外的其它结合组相比，没有显著性差异，P>0.05。
从以上对各蛋白与A群多糖、C群多糖结合组与混合组的分析结果来看，3种PspA蛋白与A群多糖结合的免疫效果较好，杀菌力较强；与C群多糖的结合效果较差，几乎没能增强GCMP抗体的杀菌效果，这也与前面检测的抗-GCMP抗体滴度较低相吻合，说明杀菌力的强弱与多糖抗体浓度呈正相关。
虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
3种重组PspA蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列
重组蛋白PspA1：375个氨基酸(SEQ ID NO.:1)
EEAPVASQSKAEKDYDTAKRDAENAKKALEEAKRAQEKYADYQRRIEEKAAKETHASLEQQEANKDYQLKLKKYLDGRNLSNSSVLKKEMEEAEKKDKEKQAEFNKIRREIVVPNPQELEMARRKSEVAKPKESGLVKRVEEAEKKVTEARPKLDAERAKEVVLQAQIAELENEVHKLEPKLKEIDESDSEDYVKEGFRAPLQSELDAKQAKLSKLEELSDKIDELDAEIAKLEKDVEDFKNSDGEQAGQYLAAAEEDLIAKKAELEQTEADLKKAVNEPEKPAPAPAPETPAPEAPAEQPKPAPETPAPAPKPEKPAEQPKPEKPADQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPAPAPKPEQPAKPEKPAEEPTQPEK
编码重组蛋白PspA1的核苷酸序列(SEQ ID NO.:2)：
重组蛋白PspA2：369个氨基酸(SEQ ID NO.:3)
EESPVASQSKAEKDYDAAKKDAKNAKKAVEDAQKALDDAKAAQKKYDEDQKKTEEKAALEKAASEEMDKAVAAVQQAYLAYQQATDKAAKDAADKMIDEAKKREEEAKTKFNTVRAMVVPEPEQLAETKKKSEEAKQKAPELTKKLEEAKAKLEEAEKKATEAKQKVDAEEVAPQAKIAELENQVHRLEQELKEIDESESEDYAKEGFRAPLQSKLDAKKAKLSKLEELSDKIDELDAEIAKLEDQLKAAEENNNVEDYFKEGLEKTIAAKKAELEKTEADLKKAVNEPEKPAPAPETPAPEAPAEQPKPAPAPQPAPAPKPEKPAEQPKPEKTDDQQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQPPKAEKPAPAP
编码重组蛋白PspA2的核苷酸序列(SEQ ID NO.:4)：
重组蛋白PspA3：471个氨基酸(SEQ ID NO.:5)
EESPQVVEKSSLEKKYEEAKAKADTAKKDYETAKKKAEDAQKKYEDDQKRTEEKARKEAEASQKLNDVALVVQNAYKEYREVQNQRSKYKSDAEYQKKLTEVDSKIEKARKEQQDLQNKFNEVRAVVVPEPNALAETKKKAEEAKAEEKVAKRKYDYATLKVALAKKEVEAKELEIEKLQYEISTLEQEVATAQHQVDNLKKLLAGADPDDGTEVIEAKLKKGEAELNAKQAELAKKQTELEKLLDSLDPEGKTQDELDKEAEEAELDKKADELQNKVADLEKEISNLEILLGGADPEDDTAALQNKLAAKKAELAKKQTELEKLLDSLDPEGKTQDELDKEAEEAELDKKADELQNKVADLEKEISNLEILLGGADSEDDTAALQNKLATKKAELEKTQKELDAALNELGPDGDEEETPAPAPQPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAPAPKPEQPAPAPKP
编码重组蛋白PspA3的核苷酸序列(SEQ ID NO.:6)：
参考文献
[1]Weintraub A.Immunology of bacterial polysaccharideantigens.Carbohydr Res,2003；338(23):2539-2547.
[2]Girard M.P.,Preziosi M.P.,Aguako M.T.,et al.A review of vaccineresearch and development:Meningoccal disease.Vaccine,2006,24(22):4692-4700.
[3]Fatme Mawas,Robert Dickinson,Alexandra Douglas-Bardsley,etal.Immune interaction between components of acellular pertussis-diphtheria-tetanus(DTaP)vaccine and Haemophilus influenzae b(Hib)conjugate vaccine in arat model.Vaccine,2006,24(17):3505-3512.
[4]Eva Maria Pollabauer,Robert Petermann,Hartmut J.Ehrlich.et al.Theinfluence of carrier protein on the immunogenicity of simultaneouslyadministered conjugate vaccines in infants.Vaccine,2009,27(11):1674–1679.
[5]Briles DE,Tart RC,Swiatlo E,et al.Pneumococcal diversity:considerations for new vaccine strategies with emphasis on pneumococcalsurface protein A(PspA).Clin Microbiol Rev JT-Clinical microbiology reviews,1998,11(4):645-57.
[6]Pneumococcal surface protein A inhibits complement activation byStreptococcus pneumoniae.Infect Immun JT-Infection and immunity,1999,67(9):4720-4.
[7]Briles DE,Hollingshead SK,King J.etc.Immunization of humans withrecombinant pneumococcal surface protein A(rPspA)elicits antibodies thatpassively protect mice from fatal infection with Streptococcus pneumoniaebearing heterologous PspA.J Infect Dis.2000；182(6):1694-1701.
[8]Miyaji EN,Ferreira DM,Lopes AP,et al.Analysis of serum cross-reactivity and cross-protection elicited by immunization with DNA vaccinesagainst streptococcus pneumoniae expressing PspA fragments from differentclades.Infect Immun.2002；70(9):5086-5090.

Claims (7)

1.一种核苷酸分子，序列为SEQ ID NO.:2、4或6。
2.由根据权利要求1所述的核苷酸分子编码的重组蛋白PspA1、PspA2或PspA3。
3.一种多糖结合疫苗，包括脑膜炎球菌多糖及与其结合的载体蛋白，所述载体蛋白是由根据权利要求1所述的核苷酸分子编码的重组蛋白PspA1、PspA2或PspA3。
4.如权利要求3所述的多糖结合疫苗，其中所述脑膜炎球菌多糖为A群脑膜炎球菌多糖(Group A Neisseria meningococcus capsular polysaccharide,GAMP)或C群脑膜炎球菌多糖(Group C Neisseria meningococcus capsular polysaccharide,GCMP)。
5.由根据权利要求1所述的核苷酸分子编码的重组蛋白PspA1、PspA2和PspA3作为多糖结合疫苗的载体蛋白的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述多糖结合疫苗是A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗或C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。
7.一种表达载体，包含根据权利要求1所述的核苷酸分子。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019167008A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-06 Biological E Limited Expression of pneumococcal surface protein a (pspa)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1401328A (zh) * 2002-10-18 2003-03-12 北京绿竹生物技术有限责任公司 流行性脑脊髓膜炎多糖－蛋白结合疫苗
CN1819843A (zh) * 2003-05-07 2006-08-16 安万特巴斯德公司 增强脑膜炎球菌疫苗接种免疫原性的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1401328A (zh) * 2002-10-18 2003-03-12 北京绿竹生物技术有限责任公司 流行性脑脊髓膜炎多糖－蛋白结合疫苗
CN1819843A (zh) * 2003-05-07 2006-08-16 安万特巴斯德公司 增强脑膜炎球菌疫苗接种免疫原性的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
国家药典委员会: "《中华人民共和国药典 2015年版 三部》", 31 July 2015 *
国家药典委员会: "《中华人民共和国药典 三部 注释》", 31 March 2016 *
李启明等: "肺炎球菌表明蛋白A的原核表达及其作为多糖结合疫苗载体的可行性", 《中国生物制品学杂志》 *
王丽婵等: "肺炎链球菌表面蛋白A的制备与鉴定", 《中国医药生物技术》 *
陈宁庆: "《实用生物毒素学》", 31 December 2001 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019167008A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-06 Biological E Limited Expression of pneumococcal surface protein a (pspa)
CN112118865A (zh) * 2018-03-01 2020-12-22 生物E有限公司 肺炎球菌表面蛋白a(pspa)的表达
JP2021516050A (ja) * 2018-03-01 2021-07-01 バイオロジカル イー リミテッド 肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）の発現
US11725029B2 (en) 2018-03-01 2023-08-15 Biological E Limited Expression of pneumococcal surface protein a (PSPA)
JP7334176B2 (ja) 2018-03-01 2023-08-28 バイオロジカル イー リミテッド 肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）の発現

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