CN105682680A - 增强对结核病的免疫 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于产生或增强患者免疫系统以对抗病原体（并且特别是MTB）感染的组合物和方法。本发明的组合物含有一种或多种非天然存在的抗原和/或抗体，所述抗原产生针对MTB的有效的细胞或体液免疫应答，所述抗体对分枝菌酸或对MTB表面具有特异性反应。由本发明的疫苗所产生的免疫系统的更大的活性涉及肽的结合以增加记忆T细胞的产生，其提供了更大的和/或存在时间更长的或延长的对MTB感染的应答。优选地，应答涉及抗体产生的增加，所述抗体增强对MTB感染的免疫并促进增强的吞噬反应。

Description

增强对结核病的免疫

相关申请的引用

本申请要求享有于2013年8月30日提交的、名称为“增强对结核病的免疫”的美国临时专利申请No.61/872,391的优先权，其全文通过引用并入本文。

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表并以其整体通过引用并入本文。所述ASCII拷贝创建于2014年8月28日，名称为3022.023.PCT_SL.txt，大小为3,682字节。

背景技术

1.发明领域

本发明涉及用于治疗疾病或病症和/或增强患者免疫系统的组合物和方法，并且特别是非天然存在的物质的疫苗和用于治疗和/或增强免疫系统以对抗结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）感染的疫苗接种方法。

2.背景技术

结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）是分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）中的病原菌种，并且是大多数结核病（TB）病例的致病物。该属的另一物种是麻风分枝杆菌（M.leprae），麻风病的病原物。MTB于1882年由RobertKoch首次发现，结核分枝杆菌具有不寻常的、复杂的、富含脂质的细胞壁，这使得该细胞不能被革兰氏染色。作为替代，抗酸检测技术被用于做出诊断。结核分枝杆菌在生理学上是高度好氧的并且需要显著水平的氧气以保持活力。主要作为哺乳动物呼吸系统的病原体，MTB一般经吸入并在百分之五到十的个体中将会发展成急性肺部感染。其余的个体将彻底清除感染或者此感染可能潜伏下来。尚不清楚免疫系统是如何控制MTB，但是据信细胞介导的免疫起到了关键的作用（Svenson等人，HumanVaccines,6-4:309-17,2010）。常用的TB诊断方法有结核菌素皮试、抗酸染色和胸片。

结核分枝杆菌需要氧气以增殖，并且由于其细胞壁的高脂质含量，所以其不会保留典型的细菌学色斑。虽然从经验的观点来看，分枝杆菌不符合革兰氏阳性菌的类别（即，其不会保留结晶紫色斑），但由于其缺乏外层细胞膜，所以仍将其归为抗酸的革兰氏阳性菌。

结核分枝杆菌具有超过一百种菌株变化，并且每15-20小时分裂一次，这相对于其它类型的具有以分钟计的分裂时间的细菌（大肠杆菌可以大约每20分钟分裂一次）而言是极为缓慢的。此微生物是小型的芽孢杆菌，其可抵抗弱消毒剂并在干燥状态下存活数周。MTB的细胞壁含有多种组分如肽聚糖、分枝菌酸和糖脂脂阿拉伯甘露聚糖。这些部分在发病机制和免疫中的作用仍存在争议。（Svenson等人，HumanVaccines,6-4:309-17,2010）。

当处于肺部时，结核分枝杆菌被肺泡巨噬细胞摄取，但因为细菌的细胞壁会防止吞噬体与溶酶体的融合，所以这些巨噬细胞不能消化细菌。具体来说，结核分枝杆菌阻断了桥联分子，早期内体自身抗原1（EEA1）；然而，此阻断不会防止充满营养物质的囊泡的融合。因此，细菌在巨噬细胞内不受约束地倍增。此细菌还携带UreC基因，其会防止吞噬体的酸化并且还会通过中和活性氮介质而逃脱巨噬细胞杀伤。

针对结核病的BCG疫苗（BacilledeCalmetteetGuérin）是由经减毒但活的牛结核杆菌（牛分枝杆菌，Mycobacteriumbovis）菌株制备的。此菌株经过在Middlebrook7H9培养基中的体外继代培养而失去了其对人的毒性。随着细菌调整以适应继代培养的条件（包括选用的培养基、生物体适应），从而失去了其在人类血液中的天然生长特性。因此，当被引入人类宿主体内时，此细菌不再能够诱导疾病。然而，经减毒且有毒性的细菌保持了足够的相似性以提供针对人类结核病感染的免疫。BCG疫苗的有效性千差万别，其在十五年的期限内对结核病的预防功效为零到百分之八十，但是其保护似乎根据地理位置和生长疫苗菌株的实验室而波动极大。这种似乎取决于地理位置的波动已经在许多不同的临床试验中被观测到，这对BCG疫苗的使用产生了很大的争议，例如，在英国进行的试验始终显示出百分之六十到八十的保护作用，但在其它地方进行的试验没有或几乎没有显示出保护作用。不管出于什么原因，这些试验均显示，在靠近赤道附近进行的那些临床试验中，功效降低。此外，尽管由于其在儿童中针对播散性TB和TB脑膜炎的保护作用而被广泛使用，但BCG疫苗对于成人肺TB（最具传染性的TB形式）在很大程度上无效。

一篇1994年的系统性综述发现BCG会使染上TB的风险降低约百分之五十。由于一些因素如种群的遗传差异、环境变化、暴露于其它细菌感染以及生长疫苗的实验室条件（包括所培养菌株间的遗传差异以及生长培养基的选择），导致有效性在地区上存在差异。

BCG的保护期限尚不明确。在那些显示出保护作用的研究中，数据是不一致的。MRC研究显示出，保护在15年后衰减至59%而在20年后衰减至零；然而，一项针对在1930年代接受免疫的美洲原住民的研究发现了证据表明，保护甚至在免疫60年后仍然存在且在功效上仅有轻微的衰减。对结果的严密分析证实，BCG对于成人肺部疾病的防范不力，但确实针对儿童中的播散性疾病和TB脑膜炎提供了有力的保护。因此，需要能针对MTB提供稳固且长期的免疫的新的疫苗和疫苗抗原。

抗体在发展针对MTB的免疫中的作用存在争议。目前的数据认为T细胞，特别是CD4⁺和CD8⁺T细胞，对于使巨噬细胞针对MTB的活性最大化并促进对感染的最佳防治而言是重要的（Slight等人，JCI123(2):712,Feb.2013）。然而，同样的这些作者也证实了，相比B细胞完整的小鼠，B细胞缺陷的小鼠并不会更易受到MTB感染的影响，指出了体液免疫并不是关键的。对MTB的吞噬作用可通过表面调理素（如C3）或非调理的MTB表面甘露糖部分进行。对于由IgG促进的吞噬作用而言很重要的Fcγ受体似乎未在MTB免疫中起重要作用（Crevel等人，ClinMicroRev.15(2),2002年4月;Armstrong等人，JExpMed.1975年7月1日;142(1):1–16）。因为IgA是粘膜抗体，所以已经考虑将其用于预防和治疗TB。在鼻内施用针对MTB热休克蛋白HSPX（HSPX）的人类IgA单克隆抗体在小鼠模型中提供了保护（Balu等人，JofImmun.186:3113,2011）。经IgA治疗的小鼠，相比未经治疗的小鼠，具有更不明显的MTB肺炎浸润。虽然抗体预防和疗法可能充满希望，但是尚未确立有效的MTB抗原靶标以及有效的抗体类别与子类别（Acosta等人，Intech,2013）。

MTB的细胞壁成分已经被划定并分析了很多年。脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）已经被证实为毒性因子，并且针对LAM的单克隆抗体已经在小鼠中增强了对MTB的防护（Teitelbaum,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.95:15688-15693,1998,Svenson等人，HumanVaccines,6-4:309-17,2010）。通过MAB增强保护的机制尚不确定，且MAB并未降低细菌负荷。据推测MAB可能阻断了由LAM诱导的细胞因子的作用。分枝菌酸在疫苗和免疫疗法中的作用尚不清楚。已将其用于诊断目的，但尚未证实其在疫苗或其它免疫治疗措施中有功用。尽管MTB感染的个体可能产生针对分枝菌酸的抗体，但是没有证据表明普通抗体或特别是分枝菌酸抗体在对MTB的免疫中起作用。

抗生素抗性正在成为治疗MTB感染中越来越严重的问题。针对TB的BCG疫苗在很大程度上不提供对感染TB的防护。因此，对于提供或改善预防和治疗MTB的产品和方法有着强烈的需求。

发明概述

本发明克服了与现行策略和设计相关的问题和缺点，并且提供了用于增强免疫系统的新的工具和方法。

本发明的一个实施方案涉及用于在哺乳动物中治疗或预防结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染的疫苗，所述疫苗包含一种或多种非天然存在的可通过重组技术产生的抗原，并优选地包含药学上可接受的载体。优选地，所述抗原包含MTB表面分泌的或细胞内抗原。优选地，抗原包含合成的MTB肽、合成的MTB/流感肽复合物、疟疾、MTB表面抗原复合物中的一种或多种。第二种方法利用了酒精灭活的MTB（如经乙醇、加热灭活的MTB）或戊二醛灭活的MTB所产生的非天然部分，其产生针对一种或多种疫苗靶标（如分枝菌酸）的免疫应答。酒精例如使蛋白质变性并解离细胞壁中的脂质结构，产生新的且经过改变的（非天然的）分子。优选地，药学上可接受的载体包括水、油、脂肪酸、碳水化合物、脂质、纤维素或其组合。优选地，肽和抗原靶标可与蛋白质及其它部分结合并使用佐剂（如明矾、角鲨烯水包油乳液、氨基酸、蛋白质、碳水化合物和/或其它佐剂）递送。

本发明的另一个实施方案涉及用于治疗或预防MTB感染的方法，其包括向哺乳动物施用本发明的疫苗。优选地，通过口服、肌内注射、静脉内注射或皮下注射向病患施用疫苗并在哺乳动物体内产生体液应答，所述体液应答包括产生对会阻碍宿主免疫的MTB部分有特异性反应的抗体，或诱导增强宿主免疫的抗体。

本发明的另一个实施方案涉及用于在哺乳动物中治疗或预防结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染的方法，所述方法包括向哺乳动物施用对MTB部分（如分枝菌酸）有特异性反应的多克隆或单克隆抗体，从而刺激细胞吞噬活性并通过吞噬细胞破坏MTB，增强对MTB的细胞因子诱导的免疫或中和毒性MTB物质，和/或混合两种或更多种增强对MTB的免疫的单克隆抗体（MAB）。优选地，抗MTB抗体为多克隆抗体或单克隆抗体并对一种或多种MTB部分反应。

本发明的另一个实施方案涉及对MTB的分枝菌酸有特异性反应的单克隆抗体。优选地，单克隆抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，并且可来源于大多数任何哺乳动物如，例如，兔子、豚鼠、小鼠、人、全部或部分人源化的、以上任意项的单链或嵌合的。编码抗体的DNA可被用于任何合适的细胞系以产生所编码的MAB。另一个实施方案包括产生单克隆抗体的杂交瘤培养。本发明的另一个实施方案包括对MTB的分枝菌酸有特异性反应的非天然存在的多克隆抗体。

本发明的另一个实施方案涉及通过施用对MTB的分枝菌酸有特异性反应的单克隆或多克隆抗体以治疗或预防MTB感染的方法。

本发明的另一个实施方案涉及通过向患者施用有效量的BCG疫苗以治疗或预防MTB感染，并且通过还施用有效量的本发明的疫苗以进一步增强有效性和/或延长保护期限的方法，所述本发明的疫苗诱导体液免疫并提供增强的吞噬功能。由疫苗或抗体导致的增强的吞噬功能被定义为经刺激的细胞吞噬活性和在吞噬细胞内部增强的MTB芽孢杆菌的破坏。

本发明的另一个实施方案涉及识别一种或多种能活化吞噬细胞的抗体的方法，所述方法包括：提供微生物；生成对所述微生物有特异性应答的抗体；将所生成的抗体与吞噬细胞一起温育；在与抗体温育后确定吞噬细胞的活性；和选择一种或多种相比对照增加吞噬细胞活性的抗体。优选地，微生物是活的或经杀伤的MTB，且任选地，可以用一种或多种化学和/或物理试剂处理微生物。优选地，化学试剂为乙醇或戊二醛。还优选地，抗体由小鼠产生并且优选地为单克隆抗体。吞噬细胞包括但不限于巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、白细胞、树突状细胞、吞噬细胞系、HL-60细胞、U-937细胞、经PMA处理过的细胞、经PMA处理过的U-937细胞及其组合。可例如通过目测、通过吞噬细胞的抗原摄取或基于荧光的显微测定来确定细胞活性。优选地，吞噬细胞仅在与一种或多种选定的抗体温育时显示出活性。合适的对照包括，例如，尚未经任何抗体处理过的细胞的吞噬活性、与针对未经处理的抗原所提供的抗体温育后的细胞的吞噬活性或经过不产生吞噬活性的试剂处理后的细胞的吞噬活性。优选地，选择的一种或多种抗体治疗或预防哺乳动物的微生物感染。还优选地，选择的一种或多种抗体为小鼠抗体，其已经过人源化而用于预防和/或治疗疾病或病症。

本发明的其它实施方案和优点部分地示于以下的说明书中，并在某种程度上，可能从本说明书中是显而易见的，或可以从本发明的实践中习得。

附图简述

图1在EtOH-kTB包衣上的M31319-1324的抗血清效价（使用在EtOH-kTB的经改变的表面上的MTB非天然表面抗原进行免疫）1:1000。

图2在EtOH-kTB包衣上的M31325-1330的抗血清效价（使用在Glut-kTB的表面上的MTB非天然表面抗原进行免疫）1:1000。

图3在EtOH-kTB包衣上的M31331-1336的抗血清效价（使用来自Son.Glut-kTB的MTB非天然表面抗原进行免疫）1:1000。

图4在EtOH-kTB包衣上的M31337-1342的抗血清效价（使用来自Son.Glut-kTB的MTB非天然表面抗原+佐剂进行免疫）1:1000。

图5分离的TBPep01（SEQIDNO1）以1μg/ml和10μg/ml与42天、112天和预融合时的MS1124血清的高水平结合。

图6在全MTB（经乙醇杀伤的）和分枝菌酸上测量的MS1143与1147融合体的杂交瘤生产率。

图7经纯化的M1438FE11IIB3（α-TBPep02）与各种抗原（SEQIDNO.7）的结合概况。

发明内容

结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染了大约三分之一的世界人口。目前的治疗包括长疗程的抗生素并经常需要对患者进行隔离。抗性是常见并不断增加的问题，这涉及到保持对受感染患者的隔离的能力。现有的疫苗包括由经减毒的（毒性降低的）活的牛结核杆菌（Mycobacteriumbovis）菌株以及活的非MTB生物体制备的BCG。BCG具有相当大的相关风险，尤其是在免疫受损的个体中，并且已被证明仅在有限的时间内有轻微效果。通常认为，对MTB感染的体液应答是无效的，并且对感染的最佳防治势必涉及T细胞和巨噬细胞的活化。

已经令人惊奇地发现，当MTB的某些区域从其天然状态在化学或物理上被改变时，会在哺乳动物中产生针对MTB的增强的免疫应答。当用化学品（如，例如，乙醇、戊二醛或使生物体失活或将其杀死的另一种化学物质）处理MTB时，会产生优选的改变。相比之下，在无改变的情况下，这些区域的抗原或针对这些区域所产生的抗体（例如BCG疫苗）即使在具有强健免疫系统的成人中也不会产生保护性应答。这些在处理后所产生的区域或表位被称为免疫增强抗原（IEA）。当施用这些IEA以治疗或预防感染时，其通过产生对感染的细胞和/或体液免疫应答而为宿主免疫系统所识别。在不限制本发明的前提下，据信，由于抗原化学结构产生的物理变化，和/或通过移除一个或多个原本可能阻断对完整的未经改变的MTB的表位或对甚至MTB生物体的降解产物的识别的化学部分，使得本发明的非天然存在的IEA不会被哺乳动物免疫系统所识别。当分离IEA时，在一个或多个新表位上的物理或化学改变被暴露于宿主免疫系统中，产生针对感染的保护性应答，而这在使用完整或部分的未经处理过的生物体的疫苗中是不存在的。优选地，本发明的IEA是从经化学方式杀伤的生物体（如经乙醇杀伤，或经乙醇杀伤的生物体的降解产物）中产生。MTB的IEA包括但不限于MTB表面的表位区域以及MTB成分（包括但不限于MTB热休克蛋白、肽聚糖、分枝菌酸和脂阿拉伯甘露聚糖（LAM））的各种选定的区域和序列。本发明的优选的氨基酸和核酸序列包含或编码MTB的IEA的一个或多个表位，和/或对其它感染如，例如，病毒感染（例如流感）有特异性的另外的表位。本发明的优选的IEA包括肽聚糖、分枝菌酸和LAM的经改变的部分，其可用作肽疫苗和/或肽佐剂。本发明的核酸序列优选地为重组产生的和/或合成制造的。还优选的是核酸适体和肽适体以及模仿本发明的非天然抗原或抗体的结构和/或功能的其它分子。还优选的是包含或编码另一种病原体的IEA抗原的一个或多个表位的肽和/或核酸序列，所述另一种病原体为如，例如，病毒性（DNA或RNA）、细菌性、真菌性或寄生性病原体，其为疾病（例如，流感、HIV/AIDS、肝炎、下呼吸道感染、麻疹、破伤风、霍乱、疟疾、病毒性和/或细菌性脑膜炎、消化道感染、百日咳、梅毒）的致病因子。来自MTB与其他病原体两者的表位的组合包括，例如，MTB与流感或另一种病毒表位的肽缀合物；MTB与白喉毒素（例如CRM）、破伤风梭菌（Clostridiumtetani）毒素以及肽和蛋白质、或另一种细菌表位的肽缀合物；或MTB与恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum）或另一种寄生表位的肽缀合物。优选地，本发明的肽序列（例如参见表3，其包括了MTB的肽复合物、流感的肽复合物和MTB-流感组合的复合物肽）为合成肽疫苗，其产生和/或增强对病原性感染（如，例如，MTB、流感病毒、或是霍乱、疟疾、麻风病、AIDS的病原体、和/或另一种传染病）的免疫应答，并预防和/或治疗疾病和感染。还优选地，所产生的免疫应答会预防感染，其在（例如，与现行使用的各种BCG疫苗相关的）保护作用的地理范围或时间期限之外保护个体免受感染。优选地，本发明的疫苗为患者提供的保护大于约一年、更优选地大于约两年、更优选地大于约三年、更优选地大于约五年、更优选地大于约七年、更优选地大于约十年并且更优选地大于约十五或二十年。

优选地，当施用本发明的疫苗时所产生的免疫应答会预防TB或另一种感染，并且会增强和/或激发患者的免疫系统以对感染产生免疫反应（如通过促进对病原体的识别、对感染更强和/或更快的免疫应答、吞噬病原体或杀死被病原体感染的细胞），从而促进对感染的总体上的免疫清除。优选地，使用本发明的IEA为受感染的哺乳动物进行疫苗接种会促进该哺乳动物免疫系统的体液和/或细胞应答的活化。例如，向受感染的哺乳动物施用本发明的IEA促进了对感染的感测并随后通过诱导或提高吞噬活性而从该哺乳动物系统中清除感染。优选地，感测和清除活动能有效地清理了活性生物体以及潜伏或休眠的生物体两者，并从而预防感染在稍后再度爆发。

本发明的一个实施方案涉及疫苗，当向患者施用时，其提供了对病原体感染的预防。含有IEA的疫苗能在患者体内有效地激发细胞和/或体液应答。可选地，疫苗可激发这样的体液应答，其将会激发针对任何入侵病原体（如MTB）的增强的细胞或吞噬细胞应答。优选地，本发明的疫苗含有MTBEIA如，例如，经改变的肽聚糖、分枝菌酸、脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）的一个或多个表位，或一个或多个这些经改变的表位的组合。优选的MTB表位包括MTB序列以及MTB序列加上其它表位序列的复合物，如列于表3中的那些。

本发明的疫苗可含有来源于相同或不同源材料或生物体的一个或多个序列和/或部分。源材料包括，例如，蛋白质、肽、毒素、细胞壁组分、膜组分、聚合物、碳水化合物、核酸（包括DNA和RNA）、脂质、脂肪酸及其组合。具有来自不同来源的多个部分的疫苗在本文中被称为结合疫苗，并可包括来源于，例如，蛋白质和脂质、肽和脂肪酸、以及脂质和核酸的部分。疫苗缀合物可含有来源于不同的生物体的部分，如，例如，细菌（例如MTB）、病毒（优选流感、HIV、RSV）、真菌或霉菌以及寄生物（例如疟疾）的任意组合。这些缀合物可由例如，MTB的分枝菌酸的一部分与血清白蛋白（例如牛血清白蛋白或BSA）偶联所构成。示例性的结合疫苗包括但不限于MTB的表面蛋白、肽聚糖、分枝菌酸或LAM与蛋白质（如破伤风毒素或白喉毒素）的缀合物。

还优选的是包括一种或多种以下物质的本发明的疫苗：药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或本领域技术人员已知的其它医用或药用试剂或制备物。优选的药学上的载体包括一种或多种以下物质：水、脂肪酸、脂质、聚合物、碳水化合物、明胶、溶剂、糖、缓冲液、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、避光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、加香剂、矫味剂或免疫惰性物质，并且尤其优选的是被U.S.FoodandDrugAdministration或另一有关部门指定为公认安全（generallyrecognizedassafe）（GRAS）的载体。

尽管本发明的肽自身可以是针对感染的完整的疫苗，但是还已经发现，当其与其它针对相同或相似感染的疫苗（例如，针对TB感染的BCG）结合施用时，本发明的肽疫苗会增强免疫应答。作为二级疫苗或结合现有一级疫苗治疗的辅助治疗，本发明的二级疫苗（其可以是抗体或抗原）提供了针对感染的双重防御，这对于预防或延长得自常规一级疫苗的保护期限有着出人意料的效果。一级疫苗（即，常规疫苗）和二级疫苗（本发明的疫苗）可以差不多同时施用，或依照凭经验或由本领域技术人员确定的顺序以交错的方式施用。优选地，肽疫苗在经减毒的或杀伤的全细胞疫苗之前施用，但也可以在其之后或与其同时施用（例如，共同作为单次疫苗接种或作为单独的疫苗接种组成部分）。优选地，在施用全细胞疫苗之前或之后的约两天到约三十天之间施用肽疫苗，并且更优选地在之前或之后的约四天到约十四天之间。在不被理论所限制的前提下，现在据信，第一种疫苗会激发个体的免疫系统而第二种疫苗则提供对免疫系统的加强，在患者体内产生保护性免疫应答。

本发明的另一个实施方案包括一种或多种抗体，其结合一种或多种特异性靶标或病原体，优选为一种或多种MTB表位（即本发明的IEA，任选地包括一种或多种之前已知的表位）。这些抗体（可以是单克隆或多克隆）已经令人惊奇地在ELISA中展现出对非天然靶标MTB抗原（如经乙醇改变的MTB）的抗原结合，并展现出增强的对MTB的免疫应答以及促进或增强对MTB的吞噬清除。激发吞噬功能的本发明的抗体能促进吞噬细胞活性以识别MTB、吞噬生物体并随后杀死MTB芽孢杆菌。抗体能增强治疗，例如，通过促进细菌的吞噬作用、激发T细胞对外来抗原的识别（例如记忆T细胞）然后通过对受感染细胞的细胞杀伤以及从总体上对感染的免疫系统清除。已经针对多种抗原靶标开发出了本发明的抗体，这些抗原靶标包括但不限于MTB表面的分枝菌酸、热休克蛋白以及其它MTB抗原（例如，SEQIDNO1的16KDMTB热休克蛋白）。

本发明的另一个实施方案涉及本发明的多种抗体（多克隆、单克隆或级分如Fab片段、单链等），这些抗体被组合或与常规抗体（多克隆、单克隆或级分如Fab片段、单链等）一起被组合至抗体混合物中用于治疗和／或预防感染。组合可包括二、三、四、五或更多种不同抗体组合，其中每一种涉及不同的抗原（包括本发明的IEA）。

针对本发明的一种或多种不同IEA的抗体可以是单克隆或多克隆并且可以来源于任何哺乳动物如，例如，小鼠、兔子、猪、豚鼠、大鼠并优选人类。可以从受感染哺乳动物或哺乳动物携带者（例如，通常为人类，但也可以使用马、牛、猪、绵羊或山羊）的血清中采集多克隆抗体并且保存用于向已存在感染的患者进行后续施用。施用抗体以治疗感染，无论是多克隆或是单克隆，均可以通过多种现有机制进行，包括但不限于吸入、摄取和/或皮下（SQ）注射、静脉内（IV）注射、腹膜内（ID）注射和/或肌内（IM）注射，并且可以定期或不定期施用，或以推注剂量施用。

针对本发明的一种或多种IEA的单克隆抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM中的一类或多类，其含有α、δ、ε、γ或μ重链和k或λ轻链或重链和轻链的任意组合（包括其有效级分），如，例如，单链抗体、分离的可变区、分离的Fab或Fc片段、分离的补体决定区（CDR）以及分离的抗体单体。针对IEA的单克隆抗体可以产生自或来源于人类或非人类细胞并且，如果是非人类细胞，则该抗体可以是嵌合MAB或人源化的。非人抗体优选为人源化的，所述人源化是通过修饰肽的重链和/或轻链的氨基酸序列使之与人类变体类似，或对非编码结构进行从非人源到人源的基因操作或重组。本发明还包括用于产生重组载体和重组表达载体（其表达本发明的肽疫苗）的重组质粒和核酸构建体。本发明还包括产生自抗体生产细胞与人类或其它细胞系的融合的杂交瘤细胞系，其用于生成本发明的单克隆抗体。

当被免疫系统识别出时，针对IEA和其他物质的抗体能促进吞噬作用和清除微生物感染和/或产生对感染的免疫。用某些抗生素对MTB进行预治疗或同时治疗使微生物的免疫增强抗原暴露于免疫系统的细胞杀伤机制，这些机制包括但不限于吞噬作用、细胞凋亡、巨噬细胞和自然杀伤细胞的活化、细胞因子和T细胞介导的细胞杀伤以及补体启动的细胞裂解。

本发明的另一个实施方案涉及用于向患者施用含有本发明的抗体的组合物（并且优选地连同药学上可接受的载体）的方法。针对微生物IEA的抗体，以仅多克隆抗体或仅单克隆抗体或兼具两者或以一种或多种抗体的混合物的形式，可以单独施用和/或经相互组合和/或与其它疫苗和/或微生物感染的治疗或预防措施组合施用。针对免疫增强抗原的抗体可以在可能的感染之前预防性地施用，或施用以治疗活动性或疑似的MTB感染。

优选地，结合常规的针对MTB的疫苗（例如，BCG）或将其作为另一种疫苗如，例如BCG的初免加强来施用免疫增强抗原的疫苗和/或针对本发明的免疫增强抗原的抗体。本发明的组合疫苗提供了对所产生的免疫应答的增强和/或延长了免疫的有效性和/或时间长度。增强优选地为对MTB感染的免疫应答的提升如由宿主免疫系统所产生的细胞或体液应答的提升。本发明的疫苗、佐剂和增强抗原的有效量为产生感染清除免疫应答或激发吞噬活性的量。当施用组合疫苗时，细胞应答的提升可包括产生被靶向的吞噬细胞、被靶向及引发的自然杀伤细胞和/或记忆T细胞，这些细胞能够保持和/或促进相比常规疫苗将会单独提供的更长时间的对感染的有效应答。体液应答的提升可包括产生更多样化的抗体，包括但不限于不同的IgG同种型或针对不止一种微生物或不止一种MTB分子的抗体，相比仅从常规MTB疫苗所将会产生的体液应答，这些抗体能够提供有效应答以预防MTB和/或另一种微生物的感染。施用优选地包括将BCG疫苗和在患者体内产生体液应答的疫苗抗原与MTB的表面抗原组合。优选地，应答是针对分枝菌酸、肽聚糖、脂阿拉伯甘露聚糖和/或微生物的另一种成分，优选存在或暴露于MTB表面的或在感染过程中分泌的成分。MTB所产生的一些物质可能对于宿主免疫系统是有毒的或会阻碍免疫功能。能清除或中和这些有毒物质（如释放的或游离的分枝菌酸成分）的抗体可以进一步作用以增强和改善宿主免疫。

通过单独或组合使用抗生素、细胞因子和其它杀菌和/或抑菌物质（例如，抑制蛋白质或核酸合成的物质、损害膜或其它微生物结构的物质、抑制微生物的必需代谢物合成的物质）以及优选地一种或多种攻击微生物的细胞壁结构或细胞壁合成的抗生素或物质来进行预先或大约同时治疗，可以增加或大幅提高这些MTB抗原对本发明的抗体或患者免疫系统的抗体的暴露程度。优选地，抗生素不会造成细胞表面抗原的释放，但会将原本并不暴露于免疫系统或免疫系统原本不容易接近的抗原暴露出来。抗生素的有效量预计小于制造商推荐量，或者为更高的剂量但时间短（例如约一小时、约4小时、约6小时、小于一或两天）。此类抗生素的实例包括但不限于青霉素、阿莫西林、沃格孟汀、多粘菌素B、环孢霉素、自溶素、杆菌肽、先锋霉素、万古霉素和β内酰胺的一种或多种化学形式、衍生物和类似物。抗生素与本发明的免疫增强抗原协同作用以提供对感染高效和有效的预防或治疗。在抑菌或杀菌量中不需要抗生素，这不仅在费用、可用性和处理上是有利的，而且这些更低的剂量不一定会促使抗性发展到相同程度，所以合起来就成为本发明的巨大益处。优选地，一开始施用抗生素以破坏和改变病原体的细胞壁和表位（例如产生非天然表面并使细胞壁成分（如分枝菌酸非天然表位和其它可以由患者免疫系统所识别的部分）暴露出来），在短时间后使用抗体治疗，使得当施用时，抗体能更充分地接近IEA。治疗间的时间周期可以为一小时或以上、优选4小时或以上、优选8小时或以上、或优选12或24小时或以上。

可以通过吸入、口服、SQ、IM、IP、IV或另一种有效途径（经常由感染和/或受感染的细胞的物理位置所决定）向患者直接施用针对本发明的免疫增强抗原的抗体以治疗或预防MTB感染。治疗优选地是那种其中患者不出现或仅出现减轻的与MTB感染相关的症状（例如，在严重程度、强度、时间周期和/或数量上降低）并且/或不会变得具有传染性。与抗MTB抗生素结合使用抗体将增加对MTB或阻碍免疫的非活性物质的清除，以更快的症状减轻、更快的转涂片阴性时间以及改善的体重增加和一般健康作为衡量。此外，治疗能有效减轻症状的严重程度、产生对MTB的免疫和/或缩短感染的时间周期。优选地，单独地或作为抗生素辅助治疗而向患者施用有效量的抗体以预防或克服MTB感染。

本发明的另一个实施方案涉及识别一种或多种活化吞噬细胞的抗体的方法。这些方法包括筛选抗体群并从筛选出的抗体中选择一种或多种能有效地活化吞噬细胞的抗体。作为第一步，提供了目的微生物并将其纯化或分离或既纯化又分离。微生物可以是灭活的、减毒的或活的微生物。优选的微生物包括MTB或另一种会在人类中引起传染病的微生物。任选地，可用化学或物理试剂处理微生物，并且优选的处理包括，例如，暴露于会改变微生物的一种或多种抗原的化学结构的化学品（如乙醇或戊二醛）或会改变微生物结构的物理条件。改变可以涉及化学变化，如，例如，移除或改变特定的化学部分或物理地如例如部分的移位从而出现新的区域或表位。可以产生或生成或商业提供有待于在本发明的方法中进行筛选的抗体。优选地，抗体为多克隆抗体、抗体片段（如，例如，Fab、Fc）和单链抗体或来源于小鼠或另一种哺乳动物的单克隆抗体。然后将抗体与吞噬细胞在条件下温育，其中可以在规定的温育期间或之后测量细胞活性。活性可以是任何细胞活性如，例如，增殖、标记物存在或不存在、氧气摄取或利用，或是确定任何细胞活性如，优选地，吞噬活性。吞噬细胞包括大多数表现出吞噬作用的任何细胞并且包括例如：巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、白细胞、树突状细胞、吞噬细胞系、HL-60细胞、U-937细胞、经PMA处理过的细胞、经PMA处理过的U-937细胞及其组合。对活性的测量可以通过本领域技术人员已知的任何技术进行，并且优选地通过对细胞的观察、通过细胞液泡的外观、通过微生物或抗原摄取测定或通过测量吞噬标记物。优选地，使用基于荧光的显微测定进行活性测量。当测定经过与抗体温育的吞噬细胞的活性时，选择一种或多种显示出活性或与对照相比增加的活性的抗体。对照包括，例如，尚未经任何抗体处理过的细胞的吞噬活性、与针对未经处理的抗原所提供的抗体温育后的细胞的吞噬活性或经过不产生吞噬活性的试剂处理后的细胞的吞噬活性。优选地，仅在与对微生物有特异性反应的抗体温育时显示出活性。所选抗体优选地可用于治疗和/或预防微生物感染。优选地，当微生物为MTB时，一种或多种相比于对照显示出增加的吞噬细胞活性的抗体可被用于治疗和/或预防人类或其它哺乳动物的MTB感染。

尽管本发明是就人类的结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）感染做出了一般性描述，但本领域技术人员应当清楚，包括许多抗体、工具和方法的组合普遍并且特别适用于治疗和预防许多其它个体（例如，猫、狗、宠物等）中的许多其它疾病和感染，并且尤其是其中病原体来源于病毒、细菌、真菌和寄生物的疾病。

下列实例说明了本发明的实施方案，但不应当被视为对本发明范围的限制。

实施例

实施例1

小鼠采血：于研究开始前7-14天获得3-4周龄的雌性Balb/c小鼠，以使之适应环境设施。随后，给小鼠加上耳标用于分辨，并于免疫前在眶叶处采血以作为参照点。在第20、29、63天以及融合前给小鼠采血。在每次放血时采集约150μL-200μL血液。测定用WashedBattelleBugs免疫的MS1319-1342的抗血清效价（批次IIIOD600nM=1.000）。

血清处理：在每次放血时，将血液收集在微型离心管中并保存在冷冻小瓶中于2-8℃过夜。次日，在22℃将样品以2000rpm离心10分钟。小心收集顶层血清，避开血红细胞（RBC），并保存在新的微型离心管中于负20℃。在血清不能在次日处理的情况下，在采血的同一天处理血清样品。将血清样品置于37℃培养箱中30分钟，并随后置于2-8℃下15分钟。之后，以上述方式离心和处理血清样品。血清处理在操作台上进行。

灭活的MTB生物体：结合分枝杆菌生长于Middlebrook培养液中，在PBS中洗涤三次并随后悬浮于经碳酸氢钠活化的70%乙醇或2%戊二醛中。第三抗原制备物为经超声处理（Son）、戊二醛灭活的MTB。经过洗涤的乙醇灭活的和戊二醛灭活的MTB以5.0x10⁸CFU/mL的浓度得自Battelle。TBPep01由PiProteomics生产，其纯度在90%以上。

小鼠免疫：

WholeBug免疫：将乙醇灭活（EtOH-k）或戊二醛灭活（Glut-k）的结核杆菌菌株Battelle（批次III）在PBS中洗涤以去除潜在的毒性物质。将1mL初始浓度的抗原以12,000rpm离心10分钟。移除900μL上清液并将团块以12000rpm离心10分钟重悬浮于900μLPBS中。将此过程再重复两次，总共洗涤三次。使用PBS是因为其与血液等渗并且不会对小鼠造成不适。

佐剂免疫：50%明矾和Titer-MaxGold（佐剂）。对于使用佐剂Titer-MaxGold的组，佐剂占注射量的60%。在制备乳液的双柱塞式玻璃注射器中，向佐剂中加入抗原。在第0天为小鼠免疫并在第22天以及融合前一周内进行加强。使用200μL不同浓度的抗原对每只小鼠进行免疫以评估免疫原性。在融合前，通过皮下方式然后是静脉内方式递送免疫。

酶联免疫吸附测定（ELISA）：通过ELISA测试血清和上清液（来自杂交瘤细胞）以测定抗血清和杂交瘤效价。

融合与杂交瘤生产：在第63天后，处死已经由ELISA识别为高抗血清效价的小鼠并采收其脾脏。使用乙二醇将脾细胞融合至SP2/0骨髓瘤细胞，并作为粘附细胞在无菌96孔培养平板中以100μl接种和生长。将融合后的细胞保存于37℃、加湿的、5%CO₂的培养箱中。融合是在无菌层流罩中进行的。

细胞培养：在第1天（融合后的次日），引入1XHAT选择培养基以选择杂交瘤细胞。将细胞在37℃于加湿的5%CO₂培养箱中温育。在第9或10天，测试杂交瘤上清液中的抗体产量。之后，在每周一和每周五，每周两次用杂交瘤培养基饲喂细胞，所述杂交瘤培养基由15%FBS、1%L-谷氨酰胺、0.1%庆大霉素、1%无蛋白质的杂交瘤培养基和1XHT培养基在DMEM中组成。对于每次再饲喂：弃去60μl上清液并向每孔中加入100μl培养基。此过程是使用无菌技术在无菌罩中进行的。参考SOP-1005-00基本细胞培养技术。

分枝菌酸-BSA结合：

试剂：来自结核分枝杆菌的分枝菌酸，Sigma目录号：M4537。正己烷，Sigma目录号：296090。1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，TCI目录号：D1601。DMSO，Sigma目录号：D2650。牛血清白蛋白，Sigma目录号：A9418。

方法：将1.2mg分枝菌酸溶于25μL正己烷。将1.7mgBSA溶于1.2mL0.1MMES缓冲液（pH6），并在涡旋下加入0.06mLDMSO。在涡旋下将分枝菌酸溶液缓慢加入到BSA溶液中。在搅拌下加入14mgEDC干粉。在完成所有添加后，pH记录为5.5并且在4℃继续反应过夜。次日，在14kMWCO管中以PBS-T对缀合物溶液进行渗析。

TB肽-结合：

CRM-流感肽5906（NS0243）、CRM-TB肽1（NS0245）、CRM-TB肽2（Ns0246）（参见表1）：将CRM在0.1MHEPESpH8+0.1%Tween80中配成6mg/mL。在涡旋下加入30倍过量的0.2MSBAP（DMSO中）并在室温温育1小时。在温育后，用PBS-EDTA（pH7.7）对CRM进行渗析。将所有的肽以10mg/mL溶于0.1MHEPES（pH8）中。在涡旋下加入两倍摩尔过量的0.2MSATA（DMSO中）并将溶液在室温温育一小时。用1M醋酸钠将溶液调节至pH6，并加入1MNH₂OH至50mM的最终浓度。将CRM-SBAP从渗析中取出并分成3x3mg的等分试样。在涡旋下将肽加入CRM-SBAP中，并用1MHEPES（pH8）将pH调节至8。使缀合物在4℃温育过夜。用PBS（pH8）对缀合物进行渗析，使其通过0.2μm过滤器，并使用1.07作为CRM的0.1%消光系数在A₂₈₀读取浓度。CRM-分枝菌酸（NS0244）：将CRM在0.1MHEPESpH8+0.1%Tween80中配成6mg/mL。将5mg分枝菌酸溶于100μL正己烷。将CRM（3mg）与2mg分枝菌酸混合并加入50mgEDC。溶液具有7.9的最终pH，并在4℃温育过夜。用PBS（pH8）对缀合物进行渗析，以0.2μm过滤，并通过A₂₈₀确定浓度。

表1：

试剂：破伤风类毒素得自SerumInstitute，批次031L1006。白喉类毒素（CRM）得自FinaBiosolutions,Rockville,MD。DMSO，Sigma目录号：D2650。N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫醇)-丙酸（SPDP），MolecularBioSciences目录号：67432。4-马来酰亚胺丁酸NHS酯（GMBS），MolecularBioSciences目录号：98799。TB肽，PiProteomics,名称肽1(SEQIDNO1；16KD热休克MTB抗原“混杂肽”)(Gowthaman等人，JID204:1328-1338,2011年11月1日）。二硫苏糖醇，Spectrum目录号：DI184。将0.8mg肽于80μL0.1MHEPES（pH8）稀释，并在涡旋下加入19μL0.1MSPDP（DMSO中）。在单独的小瓶中，将5mgBSA于0.48mL0.1MHEPES（pH7.4）稀释，并在涡旋下加入7μL0.1MGMBS（DMSO中）。将两种溶液在室温下温育1小时。用2LPBS-EDTA（pH6.8）对BSA-GMBS进行渗析。向肽溶液中加入1MDTT（NaOAc中）至15mM的最终浓度并温育1小时。用PBS-EDTA（pH6.8）在P2柱上对肽进行脱盐并收集到0.2mL级分。在280nm的吸光度检查级分并将具有280OD的曲线的前半部汇集并加入到BSA-GMBS中。使溶液在4℃反应过夜，然后在PBS中渗析。

实施例2：体液免疫的诱导

用乙醇（图1）或戊二醛（图2）灭活的MTB所免疫的小鼠产生了强烈的体液抗体应答并与MTB结合良好。此外，相比用戊二醛灭活的MTB所免疫的小鼠，用乙醇灭活的MTB所免疫的小鼠具有更高的抗体效价和更迅速的抗体效价上升，并且在免疫途径上，SQ优于IV。相比IV，用超声处理的MTB通过SQ免疫的小鼠（图3）具有增加的抗体应答，并且佐剂，明矾和Tmax（角鲨烯、水油乳液）（图4）在一些小鼠中增强了针对MTB的抗体。表2提供了这些实验结果的汇总。

表2ELISA结果

用乙醇灭活的TB所免疫的小鼠具有最佳应答，并且SQ或IV免疫之间差别不大。在第21天，SQ和IV免疫的效价出现显著差异。至第42天和第63天，几乎没有差别。戊二醛灭活的TB小鼠直到第42天才发展出效价，就像似乎对免疫应答存在延迟。超声处理被认为会增加表位的可用性，但仅1331和1333（均为SQ）在第42天发展出效价并在第63天有所升高。尽管佐剂应该会增加免疫系统活性，但使用佐剂的组仅在第63天有小幅提升的效价。一种可能性是表位对这种类型的佐剂没有有效应答。

在免疫后血清中证实了对分枝菌酸的强结合，并且进一步研究显示，当融合脾细胞时，大部分的MAB与MTB和分枝菌酸结合。分枝菌酸会阻碍调理吞噬（opsonophagoctosis）以及阻碍能诱导对此细胞壁成分的体液免疫的疫苗，不然结合此脂质的抗体将可用于预防或治疗TB。能诱导对MTB的体液免疫的分枝菌酸亚基疫苗或结合疫苗将可用于预防或减轻TB感染。

肽结合疫苗

用小TB肽结合疫苗（SEQIDNO1）免疫的小鼠发展出了对此16KD热休克蛋白的体液免疫。这些针对重要TB部分的抗体提供了用于体液免疫诱导以减轻TB感染的另一种方法，其单独地或与其它抗体一起针对一种或多种关键靶标，如分枝菌酸。

实施例3：免疫

在第0、21、42和112天，用TB热休克肽-BSA结合疫苗（100μg）对小鼠1124进行免疫。在第152天（在处死以进行脾融合的3天前），静脉内（IV）注射6个对数的乙醇灭活的MTB。用MTB肽激发然后是完整的MTB攻击会诱发激发肽的迅速上升，这可在3天内被检测到（图5）。

令人惊奇的是，在用完整的灭活的MTB攻击的3天内，效价更高。另外，尽管小，但是用MTB肽激发然后是完整的MTB攻击诱发了激发肽的迅速上升，这可在3天内被检测到。

实施例4：用未洗涤的、乙醇灭活的MTB所免疫的小鼠（如上）产生了大量杂交瘤生产的抗体，其与完整的乙醇灭活的MTB结合（图6）。令人惊奇地，结合分枝菌酸的血清与MTB芽孢杆菌之间存在紧密的相关性。这类灭活的MTB免疫产生了对分枝菌酸和MTB的体液免疫应答，因而证实了根据本发明制备的针对分枝菌酸的多克隆和单克隆抗体可用于预防和治疗MTB感染。

实施例5：肽序列

所有的肽均是合成制造的。表3中示出了序列以及包含在每个肽内的表位的列表（Flu=流感病毒）。

表3疫苗的肽序列

按照标准方案，用乙醇灭活的MTB以及MTB结合疫苗CRM-TBPep01对小鼠进行免疫。小鼠产生了针对TBPep01、分枝菌酸以及其它表面抗原的快速灵敏的抗体效价，如ELISA所测得（见图）。按照方案生产、表征和纯化单克隆抗体。来自用乙醇灭活的MTB所免疫的小鼠的分离的MAB通常为IgG1型，而结合CRM–Pep01疫苗MAB各自为IgG2（表4）。疫苗诱导了针对其各自免疫原的良好的血清效价。分枝菌酸结合MAB和MTB表面结合MAB均为完整的灭活的MTB所诱导。据信，针对一种或多种免疫增强抗原的MAB可用于预防和/或治疗MTB或其它感染。TBPep02诱导了针对流感和流感肽（SEQIDNO5）的血清效价，并且针对流感肽序列产生了MAB（表4）。

表4：分离的和纯化的单克隆抗体

实施例6

根据标准方案，将吞噬细胞（HL60）与乙醇灭活的MTB一起温育。MTB被迅速摄入细胞内，但保持不变。此外，吞噬细胞没有反应。形成鲜明对比的是，加入能结合MTB表面的MAB（经纯化的AB9IA5）在吞噬细胞内造成了迅速而强烈的反应。MTB被包在液泡中并且其生物形态被迅速破坏。开发了基于荧光的显微测定以在存在和/或不存在人类补体的条件下，使用已分化的HL60细胞检查针对灭活的结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）的功能性抗体活性。细菌：灭活的结核分枝杆菌得自Battelle(WestJefferson,Ohio)。贮备MTB：将1mL细菌悬浮液固定在EtOH或戊二醛中，浓度为1到10x10⁸CFU/ml(OD600nM=1.000)。固定剂的移除：在染色和/或与已分化的HL60细胞混合之前，移除MTB中的乙醇和戊二醛固定剂以防止对巨噬细胞的损害。离心：除非另有说明，否则移除固定剂、染色、脱色和洗涤步骤均采用以12000rpm离心5分钟来完成。在离心后记下细菌团块的位置。使用移液器，在不破坏团块的情况下，从管中移除~1,000μl上清液。以每种试剂1.2mL的最大体积将MTB团块重悬浮，并通过上下吹吸轻轻混合。

对MTB进行金胺O（AuramineO）染色的程序

将1mL贮备MTB离心得到团块，用无菌组织培养级的水洗涤3次以除去固定剂。用1mLTB金胺O重悬浮MTB团块并在室温下染色15分钟，并随后用软化水离心洗涤一次。用1mLTB脱色剂（Truant-Moore）重悬浮MTB团块2-3分钟，然后同样用软化水离心洗涤一次。用1mLTB高锰酸钾重悬浮MTB团块2-4分钟，并用软化水离心洗涤三次。将MTB团块重悬浮于1mL无菌TC水中。HL60细胞的生长和分化：在使用前，调整来自HL60细胞系（早幼粒细胞人类白血病细胞：Ass#98070106,Lot11D009;Sigma）的细胞的状态。贮备HL60：将冷冻的贮备小瓶解冻并散布到装有RPMI-1640培养液（含有1%L-谷氨酰胺并补充有10%胎牛血清(FBS)）的T-25烧瓶中，得到密度为5x10⁵细胞/mL。培养液中未加入抗生素。未分化的HL60：在200mL悬浮液中，于37^oC、5%C0₂加湿的气体环境中生长细胞。细胞每3-4天以1-1.5x10⁵细胞/mL在含有1%L-谷氨酰胺和10%FBS、无抗生素的RPMI-1640培养液中进行传代。已分化的HL60：细胞每周一次以2x10⁵细胞/mL在含有1%L-谷氨酰胺、20%FBS、1.25%二甲基亚砜（DMSO）、无抗生素的RPMI-1640培养液中进行分化。这些细胞已经准备就绪可用于在经DMSO诱导后第5或6天的测定。在无菌条件下，将处于第5或6天的1mL已分化的HL60细胞等分至微型离心管中用于基于荧光的显微测定。对已分化的HL60细胞进行ActinRed555染色：用ActinRed555ReadyProbes试剂（目录号R37112,LifeTechnologies）对已分化的HL60细胞进行染色。在每mL培养液/细胞中加入两滴ActinRed555染料，随后轻轻涡旋并温育5-15分钟。抗体试样：干净的血清或经纯化的MAB样品在使用前被保存在负20^oC，将其解冻并稀释于磷酸盐缓冲生理盐水（pH7.4）（目录号100049,LifeTechnologies）中。所选测试样品含有针对MTB的抗体，其效价和/或结合活性通过酶联免疫吸附测定（ELISA）得到确认。血清稀释液：通过向微型离心管中加入990μLPBS然后再向这990μLPBS中加入10μL干净血清，从而将干净的血清稀释成1:100的试样。均轻轻涡旋以混合。经纯化的MAB稀释液：通过将贮备MAB在PBS中稀释至100μg/mL来制备1mLMAB样品。通过向微型离心管中加入45μLPBS并向90μLPBS中加入10μL经纯化的MAB，从而将100μg/mL的样品进一步稀释至10μg/mL，再次轻轻涡旋以混合。补体：人类补体得自ThermofisherScientific，目录号NC988107;Lot908634，并且等分并保存于负80^oC直到使用。将保存的样品稀释于补充有Hepes缓冲液（目录号H0887,Sigma）的冷的DMEMF-12培养液（目录号D8062,Sigma）中。将补体稀释成1:16的样品：通过在冰浴中解冻然后通过向微型离心管中加入150μL冷的培养液，将10μL人类补体置于这150μL冷的培养液中，反复吹吸以混合并保持在冰浴中直到使用。使用NikonEclipseE600荧光显微镜，检查了包括如下试样的各种组合：(1)经ActinRed染色的已分化的细胞、(2)经金胺O染色的MTB、(3)抗MTB抗体和(4)人类补体。将单独的样品或样品的组合按规定量（参见表5）置于经标记的管中：100μLHL60：100μLMAB/血清：10μLMTB：10μLC’。使用移液器，将20μL样品放置在微型玻片的中部并用100X放大率及浸油进行检查。NikonEclipseE600荧光显微照相机使用专业的图像采集软件以处理和管理图像。

表5-FluMic001&002

实施例7：由抗体激发的增强的吞噬活性

使用HL60吞噬细胞进行研究以评价针对特定MTB靶分子的抗体增强针对MTB的吞噬活性的能力。使用B群链球菌（GBS）的平行研究证实了被导向针对GBS荚膜的抗体可以促进快速的吞噬作用并通过HL60细胞杀死GBS。在不存在抗体的条件下，将乙醇灭活的MTB与同样的经调理的HL60吞噬细胞一起温育。虽然MTB被摄入吞噬细胞内部，但是芽孢杆菌保持着正常的大小和形态，并且HL60细胞未被激发且外观无变化。尽管MTB位于细胞质中，但MTB芽孢杆菌和HL60细胞均未变化。这已被认为是TB潜伏的问题：MTB可以安然无恙地存留在吞噬细胞内部。

为了分析针对特定MTB物质的抗体激活吞噬细胞并增强吞噬活性的能力，经克隆和纯化的小鼠单克隆抗体（MAB）被用于各种MTB靶标和表位（表4）。将MABAB9IA5（表4）仅与MTB温育的确似乎改变了芽孢杆菌的形状或形态。芽孢杆菌周围的晕圈（细胞壁/表面基质）没有变化。当将HL60吞噬细胞加入MTB和MAB时，细胞被迅速激活以包住并吞噬芽孢杆菌，这发生在液泡而非细胞质中。经过3-10分钟，液泡扩大而芽孢杆菌的形态遭到破坏。这些变化随时间推移继续进行，伴随着整个细胞出现大的水泡和凸起。MTB抗体增强了吞噬作用和芽孢杆菌的摄取，并且直观的破坏与由抗体和GBS所展示的吞噬作用和杀死的数据是一致的。MABAB9IA5是IgG1抗体，经ELISA测定，其结合未经确认的MTB表面抗原。

为了进一步确定抗体激活吞噬细胞以吞噬并破坏MTB的能力，使用了不同的经纯化的MABGG9IIG2（表4），经同时结合MTB芽孢杆菌和分枝菌酸部分的ELISA测定，其结合分枝菌酸表面表位。令人惊奇地，当此MAB仅与MTB温育时，形态有变化并且芽孢杆菌扩大，伴随着细胞壁/表面基质晕圈的增大。当HL60吞噬细胞与MTB和MAB一起温育时，吞噬细胞被明显激活并伸展伪足以结合和吞噬MTB。伪足活跃地移动以将芽孢杆菌摄入液泡内，而MTB在5-15分钟内被变形和降解。此抗分枝菌酸抗体促进了对MTB的主动吞噬接合并刺激了剧烈的MTB摄取以及液泡形成。在接下来的数分钟内，芽孢杆菌被降解和消灭。分枝菌酸是MTB表面基质的主要成分并且被认为可以使得MTB能够避开有效的吞噬作用和杀伤。并非所有的分枝菌酸抗体都会结合MTB芽孢杆菌（表4）并因而将不会激活吞噬细胞以吞噬和杀死MTB。这种产生能检测对完整MTB和靶分子的结合的MAB并随后使用基于荧光的显微镜法分析MAB激活吞噬HL60细胞的能力的方法可用于检测用于预防或治疗TB的MAB。此外，此方法可用于验证被设计用来诱导针对MTB的抗体的疫苗靶标。

实施例8

通过使用非天然、合成生产的MTB和流感（Flu）缀合肽抗原（SeqID7）进行免疫，在小鼠体内诱导经纯化的MABM1438FE11IIB3，所述缀合肽抗原与CRM蛋白质结合。此缀合肽序列含有5个Flu肽和1个MTB肽。肽3和肽6为HA的非天然Flu肽复合物表位，其结合不同Flu血清型的序列（SeqID2和4）。Pep9为3和6的缀合肽。FluPep10为NA肽，当其与Pep3和6合成时，为序列Pep11（SeqID5和6）。TBPep02为TBPep01（SeqID1）与FluPep2、3和4的组合（SeqID7）。根据方案，通过ELISA分析与各种表位和抗原结合的MAB（图7）。在1和10μg/ml时，MAB很好地结合TBPep02，并且在10μg/ml时，其很好地结合FluPep11以及令人惊奇地结合戊二醛灭活的MTB（Glut-KTB）。与Glut-KTB而非乙醇灭活的TB（EtOH-KTB）结合说明每种类型的微生物灭活会不同程度地改变生物体的正常抗原，产生多种非天然抗原或表位，并且在这种情况下，乙醇和戊二醛各自不同程度地改变MTB的表面部分，从而产生可由免疫系统所识别的新的和非天然的结构。

通过考察本文中所公开的本发明的说明书和实践，本发明的其它实施方案和用途对于本领域技术人员将会是显而易见的。本文中所引用的所有参考文献，包括所有出版物和美国及外国专利和专利申请，均专门以全文引用方式并入，包括提交于2013年1月25日、名称为“CompositeAntigenicSequencesandVaccines”的美国专利申请公布No.2013/0195909；提交于2011年4月26日、名称为“CompositionsandMethodforDetecting,IdentifyingandQuantitatingMycobacterial-SpecificNucleicAcid”的美国专利申请公布No.2011/0281754；提交于2008年8月27日、名称为“ImmunogenicCompositionsandMethods”的美国专利申请公布No.2009/0081202；以及提交于2012年12月28日、名称为“MultipurposeCompositionsforCollecting,TransportingandStoringBiologicalSamples”的美国临时专利申请No.61/746,962。术语“包含（comprising）”，在其所用之处，旨在包括术语“由…组成（consisting）”和“主要由…组成（consistingessentiallyof）”。此外，术语包含（comprising）、包括（including）、含有（containing）等并非旨在限制。其目的是，说明书和实施例在由以下权利要求书所表明的本发明的真实范围和精神内被认为仅仅是示例性的。

Claims (50)

1.用于在哺乳动物中治疗或预防结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染的疫苗，其包含抗原和药学上可接受的载体，其中所述抗原包含非天然存在的MTB免疫增强抗原（IEA），其中所述IEA为天然存在的MTB抗原的经改变的形式。

2.根据权利要求1的疫苗，其中所述IEA来源于热灭活的MTB、酒精灭活的MTB、戊二醛灭活的MTB或超声处理的MTB。

3.根据权利要求1的疫苗，其中所述MTB免疫增强抗原包含MTB热休克蛋白的经改变的部分、MTB表面抗原、MTB内抗原、MTB复合肽、MTB/流感缀合肽或列于表3中的肽序列。

4.根据权利要求1的疫苗，其中所述MTB免疫增强抗原在所述哺乳动物体内产生体液或细胞免疫应答。

5.根据权利要求4的疫苗，其中所述细胞免疫应答包括吞噬活性。

6.根据权利要求4的疫苗，其中所述哺乳动物保持免受MTB感染状态的时间为至少一年。

7.根据权利要求4的疫苗，其中所述体液免疫应答包括产生促进MTB吞噬作用的抗体。

8.根据权利要求1的疫苗，其中所述药学上可接受的载体包括油、脂肪酸、脂质、聚合物、碳水化合物、明胶、溶剂、糖、缓冲液、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、避光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、加香剂、矫味剂或免疫惰性物质、被指定为公认安全（GRAS）的载体或其组合。

9.根据权利要求1的疫苗，还包含佐剂。

10.根据权利要求9的疫苗，其中所述佐剂包括明矾、氨基酸、蛋白质、脂质/水乳液。

11.根据权利要求1的疫苗，其含有多种不同的MTBIEA。

12.用于治疗或预防MTB感染的方法，其包括向哺乳动物施用根据权利要求1的疫苗。

13.根据权利要求12的方法，其中所述疫苗经口服、通过喷雾、鼻内、肌内、静脉内或皮下施用。

14.根据权利要求12的方法，其中所述疫苗在一级疫苗之前或之后施用。

15.根据权利要求14的方法，其中所述疫苗在所述一级疫苗之前的约2至约30天施用。

16.根据权利要求14的方法，其中所述一级疫苗为BCG、灭活的全细胞或减毒的MTB疫苗。

17.根据权利要求12的方法，其中所述疫苗在所述哺乳动物体内产生体液或细胞免疫应答。

18.根据权利要求17的方法，其中所述体液免疫应答包括产生对MTB表面的分枝菌酸有特异性反应的抗体。

19.根据权利要求17的方法，其中所述细胞免疫应答包括增强的吞噬细胞活性。

20.根据权利要求17的方法，其中所述细胞免疫应答包括产生记忆T细胞。

21.非天然存在的抗体，其对MTB的部分有特异性反应。

22.根据权利要求21的抗体，其中所述MTB的部分已经通过化学处理而被改变。

23.根据权利要求22的抗体，其中所述化学处理为乙醇或戊二醛处理。

24.根据权利要求21的抗体，其中所述MTB的部分来源于MTB热休克蛋白、MTB的肽聚糖、MTB的分枝菌酸、MTB的脂阿拉伯甘露聚糖或其组合。

25.根据权利要求23的抗体，其为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM、或分离的Fab或Fc部分。

26.根据权利要求21的抗体，其包含单克隆或多克隆抗体。

27.根据权利要求26的单克隆抗体，其来源于小鼠或小鼠-人嵌合体，或是全部或部分地人源化自非人抗体。

28.杂交瘤，其生产根据权利要求26的单克隆抗体。

29.用于在哺乳动物中治疗或预防MTB感染的方法，其通过施用增强对MTB的吞噬活性的非天然存在的抗体进行。

30.根据权利要求29的方法，其中相比天然抗体针对所述完整的生物体所生成的，所述吞噬活性有所增强。

31.根据权利要求29的方法，其中所述抗体包含多克隆抗体、单克隆抗体或多克隆和单克隆抗体两者。

32.根据权利要求29的方法，其中所述抗体对肽聚糖、分枝菌酸、脂阿拉伯甘露聚糖或其组合的表位特异性反应。

33.根据权利要求29的方法，其中所述抗体作为辅助疗法而与施用抗生素组合。

34.用于在哺乳动物中治疗或预防MTB感染的方法，其包括施用包含两种或更多种单克隆抗体的混合物。

35.根据权利要求34的方法，其中所述混合物中的至少一种单克隆抗体对热休克蛋白、肽聚糖、分枝菌酸、脂阿拉伯甘露聚糖、肽聚糖、分枝菌酸、脂阿拉伯甘露聚糖或其组合中的一种或多种具有特异性。

36.根据权利要求34的方法，其中所述混合物含有多种不同的单克隆抗体，每种不同的单克隆抗体对不同的IEA有特异性反应。

37.抗原，其包含非天然存在的MTB免疫增强表位，其中所述免疫增强表位为天然存在的MTB表位的经改变的形式。

38.根据权利要求37的抗原，其中所述天然存在的表位为热休克蛋白、肽聚糖、分枝菌酸、脂阿拉伯甘露聚糖或其组合的表位。

39.识别一种或多种能活化吞噬细胞的抗体的方法，包括：

提供微生物；

产生对所述微生物有特异性反应的抗体；

将所述产生的抗体与所述吞噬细胞一起温育；

测定所述吞噬细胞在与所述抗体温育后的活性；以及

相比对照，选择所述一种或多种能增加所述吞噬细胞活性的抗体。

40.根据权利要求39的方法，其中所述微生物为活的或灭活的MTB。

41.根据权利要求39的方法，其中使用化学或物理试剂处理所述微生物。

42.根据权利要求41的方法，其中所述化学试剂为乙醇或戊二醛。

43.根据权利要求39的方法，其中所述抗体从小鼠或人类中产生。

44.根据权利要求39的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。

45.根据权利要求39的方法，其中所述吞噬细胞选自巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞、白细胞、树突状细胞、吞噬细胞系、HL-60细胞、U-937细胞、经PMA处理过的细胞、经PMA处理过的U-937细胞及其组合。

46.根据权利要求39的方法，其中所述活性为细胞增殖、标记物存在或不存在、液泡形成或吞噬活性。

47.根据权利要求39的方法，其中所述活性是对吞噬细胞通过目测、通过抗原吸收或通过基于荧光的显微测定确定。

48.根据权利要求39的方法，其中所述吞噬细胞仅在与所述一种或多种选定的抗体温育时显示出活性。

49.根据权利要求39的方法，其中所述对照是：尚未经所述抗体处理过的细胞的吞噬活性、与针对未经处理的微生物所提供的抗体温育后的细胞的吞噬活性或经过不产生吞噬活性的试剂处理后的细胞的吞噬活性。

50.根据权利要求39的方法，其中所述一种或多种选定的抗体治疗或预防由所述微生物引起的哺乳动物感染。