CN109641040A

CN109641040A - 用于预防牛白血病的药剂及其使用方法

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Publication number: CN109641040A
Application number: CN201780050553.XA
Authority: CN
Inventors: 弗拉迪斯拉夫·尼古拉耶维奇·拉斯卡维
Original assignee: Andrei Valentinovic Ivriv
Current assignee: Andrei Valentinovic Ivriv
Priority date: 2016-11-22
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2037-06-13
Also published as: CN109641040B; WO2018097750A1; AU2017363399A1; CA3018982A1; AU2017363399B2; US20180169207A1; MX2019002570A; CA3018982C; EP3403668A4; BR112019003609A2; US10434163B2; EP3403668A1; RU2631607C1

Abstract

本发明整体涉及兽医学领域，并且可用于预防牛白血病。本发明扩展了要求保护的申请的手段范围，并为动物提供了对白血病病毒的终生抗性。本发明旨在解决扩展预防性药物范围并形成预防牛白血病的新方法的问题，其使得可以确保动物对白血病感染的终生抗性。技术结果包括设计用于预防牛白血病的治疗剂及其用途，其通过增加杀伤细胞的数量来激活针对牛白血病病毒的细胞免疫，从而高效地且以最小的成本提供靶向免疫反应。所述用于预防牛白血病的治疗剂包含：水溶性蛋白质级分，其分子量为18‑20kDa、从结核分枝杆菌的破坏产物中分离、特征在于在UV区中在214nm波长处存在峰；磷酸盐缓冲盐水；甲醛水溶液；和等渗氯化钠溶液：所述用途包括将所述治疗剂以每头4.0‑6.0ml的剂量通过单次肌内注射而施用给1至9日龄的小牛。

Description

用于预防牛白血病的药剂及其使用方法

本发明整体涉及兽医学领域，并且可用于预防牛白血病。本公开扩展了要求保护的申请的手段范围，并提供了动物对牛白血病病毒(BLV)的终生抗性。

迄今已知几种治疗剂可以预防牛白血病，并且存在使用这些药物来预防这种疾病的方法。

已知一种针对牛白血病的灭活疫苗(参见USSR发明人证书号820,015，分类A61K39/12，1987年10月23日公布)，其含有从患有白血病的动物的外周血白血病细胞中分离的蛋白质级分p25和gP70。

将比率为1:1的所得抗原-蛋白质免疫剂与弗氏完全佐剂施用给1至3月龄的小牛。该免疫以10-12天的间隔进行三次。

还公开了另一种针对牛白血病的灭活疫苗(参见RF专利号2,202,367，IPC分类A61K39/12，2003年4月20日公布)，其含有动物外周血的含病毒的白细胞。动物的免疫在皮下以10-14天的间隔进行三次。动物在2个月至2岁时接种疫苗。

然而，由于缺乏免疫失败纠正手段和形成低滴度抗体，这些疫苗尚未发现广泛的实际应用。

还已知用于预防牛白血病的各种治疗剂。

具体地讲，琥珀酸生物刺激剂(参见RF专利号2,420,275，IPC分类A61K31/194，2011年6月10日公布)、聚羧基乙烯(参见RF专利号2,421,184，IPC分类2421184，2011年6月20日公布)、甲硝唑和磺胺噻唑或磺胺二甲基嘧啶(参见RF专利号2,300,883，IPC分类A61K67/02，2007年6月20日公布)、ligfol(参见RF专利号2,320,357，IPC分类A61K36/00，2008年3月27日公布)等的使用是已知的。

然而，尚未研究这些制剂在治疗白血病时对免疫系统的影响，并且这些治疗剂没有发现实际应用。

更具体地讲，甲硝唑和磺胺类具有杀菌作用而不是杀病毒作用，这使得它们不能对BLV产生特定的作用。Ligfol是天然木质素的水解产物，腐殖质是其活性成分。Ligfol显示出应激校正和适应原作用，其注射是痛苦的并导致动物的长期焦虑。作为琥珀酸和Dorogov抗菌刺激剂(DAS)(2号级分，如同任何生物活性药)的混合物的琥珀酸生物刺激剂也研究较少，需要进行进一步的研究。

最接近本发明的是基于结核类毒素的牛白血病预防(参见RF专利号2,396,978，IPC分类A61K39/295，2010年8月20日公布)。在用针对牛白血病的灭活疫苗接种前20-30天，皮下施用结核类毒素。通过使用两种解毒剂，即在7-9天期间在42-45℃下0.2％的福尔马林溶液以及在7-9天期间在42-45℃下0.5％的aethonium溶液，对结核外毒素和内毒素解毒，获得该结核类毒素(参见例如RF专利号2,392,002，IPC分类A61K39/00，2010年6月20日公布)。

然而，这种预防牛白血病的方法使用作为一个整体的分枝杆菌破坏产物，而不是从其中分离的蛋白质级分。降解产物通常含有蛋白质、脂质和多糖。脂质和多糖增加对动物生物体的免疫原性负荷，改变动态平衡状态并防止对分枝杆菌蛋白质的靶向免疫反应，这最终降低了这种预防措施的效率，并且不能确保动物对该疾病的终生抗性。

本发明旨在解决扩展预防手段范围并形成预防牛白血病的新方法的问题，其使得可以确保动物对白血病感染的终生抗性。

所实现的技术结果是设计用于预防牛白血病的治疗剂及其用途，其通过增加杀伤细胞的数量来激活针对牛白血病病毒的细胞免疫，从而可以高效率和最小的成本提供靶向免疫反应。

为了解决所提出的任务并实现该技术结果，提出了一组权利要求，即，一种用于预防牛白血病的治疗剂及其用途。

实现了关于该治疗剂本身的技术结果，其在于，根据本公开的用于预防牛白血病的治疗剂按下列以重量％计的组分浓度包含：水溶性蛋白质级分，其分子量为18-20kDa、从结核分枝杆菌的破坏产物中分离并且特征在于在UV区中在214nm波长下存在峰；磷酸盐缓冲盐水；甲醛水溶液；和等渗氯化钠溶液：

分子量为18-20kD、从结核分枝杆菌的破坏产物中分离的水溶性蛋白质级分………………………………………………0.05-0.125，

磷酸盐缓冲盐水……………………9.95-24.875

甲醛水溶液…………………………0.025-0.046，和

等渗氯化钠溶液……………………其余部分。

实现了关于该治疗剂的用途的所述技术结果，其在于，以4.0-6.0ml的剂量对1至9日龄小牛进行单次肌内注射，该制剂按下列以重量％计的组分浓度包含：水溶性蛋白质级分，其分子量为18-20kDa、从结核分枝杆菌的破坏产物中分离并且特征在于在UV区中在214nm波长下存在峰；磷酸盐缓冲盐水；甲醛水溶液；和等渗氯化钠溶液：

磷酸盐缓冲盐水……………………9.95-24.875，

甲醛水溶液…………………………0.025-0.046，和

等渗氯化钠溶液……………………其余部分。

所指出的特征是显著的并且足以获得要求保护的技术结果。

已知的专利和科学技术信息来源并未描述以下用于预防牛白血病的制剂：它通过增加杀伤细胞的数量来激活细胞免疫，从而确保动物对白血病感染的终生抗性。分子量为18-20kDa、从结核分枝杆菌的破坏产物中分离的水溶性蛋白质级分在具有甲醛溶液和氯化钠溶液的磷酸盐缓冲盐水中的混合物提供了杀伤防御系统的激活，即T淋巴细胞(Th₀)亚群参与免疫反应。

在要求保护的用于牛白血病的治疗剂中，甲醛溶液与等渗氯化钠溶液的混合物用作在杀伤系统层面上使免疫反应稳定的组分而不是作为解毒剂。

仅引入蛋白质级分或仅引入甲醛不能产生所需的结果。只有组分的协同作用和它们的经实验选择的浓度才能通过激活动物的杀伤系统来获得动物对白血病感染的高抗性效果。此外，甲醛浓度不会改变分枝杆菌的蛋白质组分的结构。

我们已经找到了一种新的、非显而易见的方法来解决预防牛白血病的问题，该方法是使用组分的混合物(从结核分枝杆菌的破坏产物中提取的一定分子量的蛋白质级分，以及甲醛和氯化钠溶液的混合物)来增加免疫系统的杀伤细胞的数量。

已知杀伤细胞抑制肿瘤细胞的发育(参见例如RF专利号2,443,411，IPC分类A61K9/08，2012年2月27日公布，RF专利号2,262,941，IPC分类A61K35/16，2005年10月27日公布)。然而，它们仅用于治疗疾病。

增加免疫系统的杀伤细胞数量来预防白血病的机制的使用迄今未知，并且尚未在任何地方公开。

使用从结核分枝杆菌的破坏产物中分离的任何蛋白质级分来预防白血病也是未知的。

向最大10日龄(即，新生期)的小牛施用我们的基于分离的蛋白质级分与甲醛溶液的混合物的治疗剂来预防牛白血病也是未知的。

通过这种治疗剂治疗新生期的小牛可以通过以下事实来解释：在出生时此类小牛中不存在体液免疫，而细胞免疫已经充分发育。在如此早的年龄激活细胞免疫，并因此激活免疫杀伤系统，使动物对白血病感染具有终身抗性。

已知细胞毒性T淋巴细胞CD8和炎性T淋巴细胞CD4(Th1)负责细胞免疫，而T辅助淋巴细胞CD4(Th2)和B淋巴细胞分别负责体液免疫。

本发明通过增加细胞毒性淋巴细胞(CD8)和炎性T淋巴细胞CD4(Th1)、降低T辅助淋巴细胞CD4(Th2)以及增加Th淋巴细胞第三亚群(Th0)的数量，解决了激活针对牛白血病的有效免疫的问题。

因此，事先在动物生物体中产生了增加杀伤细胞数量的适当条件，而杀伤细胞作为屏障抑制肿瘤细胞的发育。这种机制可以保持细胞免疫与体液免疫之间的平衡，这种平衡在整个生命过程中得以维持。

前述内容使我们能够对要求保护的发明中的创造性标准作出总结。

本公开在图1中示出，其显示了从牛结核病病原体即牛型分枝杆菌(M.bovis)(8号菌株)的破坏产物中分离的蛋白质级分的色谱图。

预防牛白血病的治疗剂如下制备。

作为结核病病原体的破坏产物，使用哺乳动物的PPD结核菌素，它从牛型分枝杆菌8号菌株获得并呈浅棕色的透明液体(参见2011年9月30日俄罗斯联邦俄罗斯动植物防疫检疫局副局长批准的哺乳动物的PPD结核菌素的使用说明)。

为了获得蛋白质级分，用盐水溶液(例如硫酸铵)沉淀具有病原体破坏产物的液体，并离心。然后除去上清液，将沉淀物重新溶解在盐水缓冲溶液中。

进行透析，并将溶液的pH调至7.0-7.4，然后通过常规方法特别是通过劳里法(Lowry method)分析蛋白质浓度。

通过体细胞中的相应值来解释对溶剂的此类pH值的选择。众所周知的是(参见例如http://zenslim.ru/content)，体细胞和细胞外液中的pH分别约为7.0和7.4。

蛋白质的分子量通过高压液相色谱(HPLC)测定，其具体地讲在Stayer液相色谱仪上使用分光光度检测器A214(波长214nm)进行。使用BioSep-SEC-S 2000柱(5μm 145A，300×7.8mm)进行分离。使用0.01M磷酸盐缓冲盐水作为洗脱剂，流速为1ml/min；或使用含0.025％叠氮化钠溶液的0.01M磷酸盐缓冲盐水(pH6.8)，流速为2ml/min。

将分子量在64-70kDa内的牛血清白蛋白、分子量为75-80kDa的乳铁蛋白和分子量为20kDa的木瓜蛋白酶用作标准品。

考虑标准品值，例如样品在柱上的保留时间或收缩时间(RT，min)，以高度表示的峰强度(mAU)，以及物质的相对定量含量，其计算为每个峰占峰总面积的百分比(A，％)。

从牛结核病病原体即牛型分枝杆菌(8号菌株)的破坏产物中分离的级分中的主要蛋白质的分子量在18-20kDa之间(参见图1)。

表1显示了基于从牛结核病病原体的破坏产物中分离的蛋白质级分的组合物的色谱分析结果。

表1

接下来，将所得的分子量为18-20kDa的蛋白质级分在含有4.8-5.2mg/ml蛋白质(即0.48-0.52％)的缓冲溶液中与浓度在0.85-0.95％内的等渗氯化钠溶液混合。

为了制备50％的蛋白质级分溶液，取1份含有蛋白质的缓冲溶液，并添加1份等渗溶液。

所得混合物的组成如下：

-蛋白质级分-0.24-0.26％，

-磷酸盐缓冲盐水-49.74-49.76％，和

-氯化钠溶液-其余部分。

当制备20％的蛋白质级分溶液时，所得混合物的组成如下：

-蛋白质级分-0.096-0.104％，

-磷酸盐缓冲盐水-49.896-49.904％，和

-氯化钠溶液-其余部分。

接下来，制备甲醛水溶液与等渗氯化钠溶液的混合物。

为此，取0.15-0.25ml 36.5-37.5％的医用蚁醛(甲醛)溶液，并加到99.75-99.85ml等渗0.85％(或0.95％)氯化钠溶液中。彻底搅拌这些溶液的混合物。

通过实验选择甲醛和等渗氯化钠溶液的组分比例。

当从37％甲醛溶液制备治疗剂时，所得组合物中的最终甲醛浓度将为0.055-0.099重量％。

然后将所得的蛋白质级分溶液在缓冲液和等渗溶液中的混合物与甲醛溶液和等渗氯化钠溶液的混合物混合。

实例1。用于预防白血病的治疗剂的制备

获取100ml得自牛型分枝杆菌8号菌株的哺乳动物的PPD结核菌素。如下制备蛋白质级分。

将42g硫酸铵加入100ml结核菌素中以沉淀蛋白质，在4,500rpm下离心20分钟。除去上清液，将沉淀物重新溶解在1ml 0.01M磷酸盐缓冲盐水中。该系统通过孔径为3,500Da的透析膜在0.01M磷酸盐缓冲盐水中透析24小时，将溶液的pH调至7.2-7.4，之后通过劳里法使用StatFax 3300生化分析仪测定蛋白质浓度。

来自牛结核病原体的破坏产物的蛋白质级分的浓度为5.0mg/ml。

类似于实例1，获得来自其他批次的PPD结核菌素的蛋白质级分。各地的蛋白质含量从4.8到5.2mg/ml不等。

接下来，将含有5mg/ml蛋白质(即0.5％)的缓冲溶液中分子量为18-20kDa的所得蛋白质级分与等渗氯化钠溶液(0.85-0.95％)混合。

然后制备甲醛水溶液和等渗氯化钠溶液的混合物。

为此，取0.2ml 37％的医用蚁醛(甲醛)溶液，并加到99.8ml等渗(0.85％)氯化钠溶液中。彻底搅拌这些溶液的混合物。所得组合物中的最终甲醛浓度将为0.074重量％。

将磷酸盐缓冲盐水中的蛋白质级分与甲醛溶液和氯化钠溶液的等比例(1:1)混合物相混合。

组合物中组分的含量(重量％)如下：

水溶性蛋白质级分

(分子量为18-20kD、

从牛型分枝杆菌8号菌

株的破坏产物中分离)..................0.125

磷酸盐缓冲盐水...............24.875

甲醛水溶液............0.037，和

等渗氯化钠溶液..........其余部分

类似地，从蛋白质含量为0.48-0.52％的蛋白质级分制备治疗剂。

实例2。对治疗剂中的组分的定量含量进行证实。

在我们的实验中使用120头2至9日龄的小牛，其中108头以4至6ml的剂量注射以用不同定量含量的组分预防白血病。

12头动物形成参考组，按每头5ml的剂量注射纯盐水。

结果如表2所示。

表2

参考组中的12头有4头丢失，占33.3％。

实例3。

为了证实动物(小母牛和奶牛)体内杀伤细胞数量的增加，对在2-9日龄时用我们的治疗剂处理以预防牛白血病的动物的血液进行了免疫学研究：

-2.5岁小母牛，和

-5岁奶牛。

结果如表3所示。

表3

2.5岁小母牛和5岁奶牛的免疫指标

从表3可以看出，2.5岁的小母牛显示出T辅助细胞与T-抑制细胞的比率(Th/Ts)降低和T淋巴细胞第三亚群(Th0)的数量增加。

在5岁(实验)奶牛中，记录到所有淋巴细胞部分(T和B)的含量显著增加，同时保持高Th0(杀伤细胞)含量。

我们分别在2.5岁小母牛和5岁奶牛中作为免疫扩散反应针对BLV抗体的存在性进行的血清学检测结果均为阴性。

因此，要求保护的用于预防牛白血病的治疗剂及其使用方法通过增加杀伤细胞的数量来激活针对BLV的细胞免疫，从而确保动物对白血病感染的终生抗性。

Claims

1.一种用于预防牛白血病的治疗剂，其特征在于它按下列以重量％计的组分浓度包含：水溶性蛋白质级分，其分子量为18-20kDa、从结核分枝杆菌的破坏产物中分离且特征在于在UV区中在214nm波长附近存在峰；磷酸盐缓冲盐水；甲醛水溶液；和等渗氯化钠溶液：

分子量为18-20kD、从结核分枝杆菌的破坏产物中分离的水溶性蛋白质级分……………………………………………0.05-0.125，

磷酸盐缓冲盐水………………………9.95-24.875，

甲醛水溶液……………………………0.025-0.046，和

等渗氯化钠溶液………………………其余部分。

2.一种使用所述治疗剂预防牛白血病的方法，包括以每头4.0-6.0ml的剂量对1至9日龄的小牛进行肌内施用，其中所述治疗剂按下列以重量％计的组分浓度包含：水溶性蛋白质级分，其分子量为18-20kDa、从结核分枝杆菌的破坏产物中分离且特征在于在UV区中在214nm波长附近存在峰；磷酸盐缓冲盐水；甲醛水溶液；和等渗氯化钠溶液：

分子量为18-20kD、从结核分枝杆菌的破坏产物中分离的水溶性蛋白质级分…………………………………………0.05-0.125，

磷酸盐缓冲盐水……………………9.95-24.875，

甲醛水溶液…………………………0.025-0.046，

以及等渗氯化钠溶液………………其余部分。