CN101969976A

CN101969976A - 针对分枝杆菌的多肽疫苗和接种策略

Info

Publication number: CN101969976A
Application number: CN2009801088394A
Authority: CN
Inventors: 苏拉吉·塞布尔; 邦尼·B·普利卡亚蒂斯; 托马斯·M·欣尼克; 拉玛·罗亚·阿玛拉; 马尼·舍吕武
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2008-01-11
Filing date: 2009-01-12
Publication date: 2011-02-09
Also published as: BRPI0905725B8; EP2818178A1; WO2009089535A3; US8741313B2; US20110027349A1; BRPI0905725B1; EP2244720A2; ZA201005742B; WO2009089535A2; EP2244720A4; BRPI0905725A2

Abstract

本发明提供一种疫苗，其中来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的多肽或肽的组合施用于受治疗者以引发免疫应答。多肽疫苗作为使用BCG疫苗的初免-加强(prime-boost)策略的一部分进行施用以增加受治疗者中的免疫保护，以便实现疾病的预防或消除。最后，提供一种药物包，其包括当施用于受治疗者时引发免疫保护的结核分枝杆菌多肽疫苗。

Description

针对分枝杆菌的多肽疫苗和接种策略

对相关申请的交叉引用

本申请要求在2008年1月11日提交的美国临时专利申请序列第61/020,573号的优先权，其在这里通过引用并入本文。

政府利益

在这里描述的本发明可由或者为了美国政府而制造、使用和许可。

技术领域

本发明总体而言涉及重组疫苗和接种方法领域。更特别地，本发明涉及用于初免-加强(prime-boost)免疫策略的重组结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)蛋白的施用。

背景技术

每年全世界有800至1000万人患结核病。结核病的全球发病率以每年1％的速率增长，这主要是由于非洲疾病患病率的快速增长。在其他区域中，成功的控制努力已经开始稳定疾病的发病率。然而估计大约2,000,000,000人，即等于世界人口的三分之一，被结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis bacilli)即导致TB的微生物感染(World Health Organization 2006Tuberculosis Facts(世界卫生组织2006年结核病事实))。

对于找到结核病的新治疗或接种策略的需要受到世界HIV感染率增加的压力，目前250,000例TB死亡是HIV相关的。结核病自身是人类的第二大杀手，其每年导致世界上超过200万例死亡(World Health Organization 2006Tuberculosis Facts(世界卫生组织2006年结核病事实))。减毒的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡介苗(bacillus Calmette-Guerin，BCG)疫苗是目前许可用于人类的唯一的结核病疫苗。BCG疫苗对于严重的儿科的和肺外形式的结核病是有效的。然而，对发展中国家的成年人肺结核的保护是不足的，成年人的保护在0至80％之间变动(Fine P.E.M.，Lancet 2000；346：1339-1345)。结核病接种的可变效力看上去在地理上是集中的。例如在英国，已观察到大约75％的保护(Hart P.D.和Sutherland I.，BMJ，1977；2，293-295)。相比之下，在印度和马拉维的临床研究未能显示针对肺结核的一致保护(Fine，PE等人，Scand J Infec Dis，2001；33：243-45；Ponnighaus J.M.，Lancet，1992； 339：636-639)。

由于TB的唯一有效疫苗是BCG疫苗，目前的研究努力集中在改进BCG效力上(Dietrich G.，Vaccine，2003；21：667-670)。例如，相对于标准BCG疫苗、单独表达Ag85B的重组BCG疫苗或表达Ag85B和ESAT-6的融合蛋白的重组BCG疫苗，过量表达抗原Ag85B、早期分泌的抗原(ESAT-6)和IFN-γ的融合蛋白的重组BCG疫苗增加了特定抗体滴定度和细胞免疫应答(Xu Y.，FEMS Immunology and Medical Microbiology，2007；51：480-487)。ESAT-6，一种由毒性的结核分枝杆菌产生的蛋白，在标准的BCG疫苗菌株中不存在，并且目前作为针对结核病的潜在的疫苗亚单位(subunit)得到了大量的研究。例如，在随后用结核病H37Rv激发的小鼠中与BCG免疫联合的编码ESAT-6的DNA疫苗显示了改进的ESAT-6特异性干扰素γ(Fan X.，Scandinavian Journal of Immunology，2007年10月4日；66：523-528)。

除了新的亚单位疫苗的研究之外，初免-加强策略作为改进BCG免疫原性的方法目前正在研究中(Goonetilleke N.P.，Journal of Immunology 2003；171：1602-1609；Kaufmann S.H.，Nature Reviews Immunology 2001；1：20-30)。初免-加强策略通常使用DNA疫苗。例如，当表达Ag85B的DNA疫苗被施用于接着用BCG疫苗加强的鼠结核分枝杆菌模型中时，观察到超过单独的BCG疫苗的改进的保护效力(Feng C.G.，Infectious Immunology 2001；69：4174-4176)。相似地，编码结核分枝杆菌蛋白Apa、HSP-65和HSP-70的DNA注射以及随后的常规BCG接种也改进了针对小鼠中结核病激发的保护(Ferraz，Infection and Immunity 2004；72：6945-6950)。

通常通过肌肉内或皮下途径来进行传统的免疫。然而，结核病主要是呼吸系统疾病。因此，针对感染的保护和随后疾病的根除可最好通过对呼吸道粘膜的直接施用来实现(Kallenius 等人，Tuberculosis(爱丁堡)，2007；87：257-66)。鼻内接种可具有超过其他施用途径的优势，例如鼻内接种不受到已形成的全身免疫的影响，而肠胃外接种在含有预先存在的抗体的个体中不太有效(van Savage J.M.，Journal of Infectious Disease 1990；161：487-492)。

对预先存在的抗体的存在的规避在一些地理区域中是重要的，在所述地理区域中最需要针对结核病的改进的疫苗。之前暴露于蠕虫和腐生分枝杆菌所致的先前Th2背景免疫已被认为降低BCG疫苗诱发免疫保护的能力(Rook，Vaccine，2005；23：2115-2120)。此外，设想鼻内接种在预防宿主中结核分枝杆菌感染中可能是有效的(Kauffman SH.，Nature Reviews of Immunology 2006；6：699-704)。鼻内接种的动物研究显示了与皮下接种途径相比保护效力的增加(Giri，PK.等人，FEMS Immunology and Medical Microbiology，2005；45：87-93；Chen，L.等人，Infection and Immunity，2004；72：238-246)。

尽管已在人类和动物系统二者中对活BCG疫苗或死BCG疫苗、蛋白亚单位疫苗、重组细菌载体疫苗、血浆DNA疫苗或组合的免疫手段进行了初步研究，但是对于哪个方法在受治疗者中产生最强的免疫应答和最高水平的保护知道的很少。此外，有关由每种疫苗类型诱发的免疫应答特征的细节有待完全阐明。增加的结核病感染的患病率和增加的抵抗，特别是在发展中世界中，引起对改进的结核病疫苗和接种策略的需要。

发明内容

本发明提供一种疫苗，其增加受治疗者中的免疫应答，其中所述疫苗包含至少一种结核分枝杆菌多肽，其中所述多肽可选地为Ag85A、Ag85B、MPT-64、Pst-S1、Apa、GroES、GroEL、Dnak、CFP-10、Rv0831c和Rv1324、其部分、其组合或其多重体(multiple)。可选地以其天然形式将这些重组蛋白纯化，或者它们还包含适合增加纯化的标签。结核分枝杆菌多肽可选地为重组的。

本发明的疫苗可选地含有乳液。适合的乳化剂包括超分子生物载体(supramolecular biovector，SMBV)、纳米颗粒、脂质体或其组合。

本发明的疫苗可选地含有佐剂。适合的佐剂说明性地包括二甲基双十八烷基溴化铵(dimethyl dioctadecyl-ammonium bromide，DDA)；单磷酰脂A(monophosphoryl lipid A，MPL)；LTK63，亲脂性季铵盐-DDA(lipophilic quaternary ammonium-DDA)，DDA-MPL，铝盐，氢氧化铝，磷酸铝，磷酸铝钾，Montanide ISA-51，ISA-720，微颗粒，免疫刺激复合物，脂质体，病毒体，病毒样颗粒，CpG寡核苷酸，霍乱毒素，来自大肠杆菌(E.coli)的不耐热的毒素，脂蛋白，树突状细胞，IL-12，GM-CSF，说明性地包括磷酸钙纳米颗粒的纳米颗粒，用以形成纳米乳液的大豆油、乳化剂和乙醇的组合；AS04，ZADAXIN或其组合。

本发明还提供了增加受治疗者免疫应答的方法，其中结核分枝杆菌多肽施用于受治疗者。施用可选地通过包括如下的途径：皮内、经皮、皮下、肌肉内、鼻内、雾化、口服、舌下、阴道内、经直肠、静脉内、粘膜内或者本领域已知的其他递送方法。增加免疫应答的方法可选地使用对受治疗者施用第二疫苗，其可选地为Ag85A、Ag85B、MPT-64、Pst-S1、Apa、GroES、GroEL、Dnak、CFP-10、Rv0831c和Rv1324或其组合、上述多肽的表位或其肽。可选地，BCG疫苗的施用在重组结核病多肽的施用之前发生。可选地，BCG疫苗的施用可在重组结核病多肽的施用之后发生，或者可选地，BCG疫苗的施用与重组结核病多肽、表位或肽的施用同时发生。BCG疫苗可选地为重组的(表达一个或多个上述多肽)或天然的。此外，BCG疫苗和/或重组结核病多肽的施用在受治疗者暴露于分枝杆菌感染或患病之前、过程中或之后发生。

本发明还提供了药物包(pharmaceutical package)，其包含选自包含Ag85A、Ag85B、MPT-64、Pst-S1、Apa、GroES、GroEL、Dnak、CFP-10、Rv0831c和Rv1324的组的至少一种多肽或其组合。还有乳化剂和佐剂。乳化剂可选地为二甲基双十八烷基溴化铵。佐剂可选地为单磷酰脂A。

附图说明

图1表示由银染色法处理的纯化的新重组结核分枝杆菌蛋白的SDS-PAGE(4-20％梯度凝胶)，其中第1道表示分子量标志物，第2道是Rv0164，第3道是Rv0831c，而第4道是Rv1324；

图2表示由鼻内或皮下BCG接种所诱发的T细胞应答的动力学；

图3表示由鼻内或皮下BCG接种所诱发的无应答的动力学；

图4表示在鼻内BCG接种后的早期(6周)和晚期(30周)时间点处的受治疗者的局部和外周免疫区室(compartment)中结核分枝杆菌全细胞溶胞产物(whole cell lysate，WCL)和短期培养滤液(short term culture filtrate，STCF)特异性T细胞的分布，其中所述结果表示为从各自的未受刺激的培养物中减去SFU之后的3至6次测定的平均值±标准偏差；

图5表示在鼻内BCG接种后的早期(6周)和晚期(30周)时间点处的受治疗者的局部和外周体液中结核分枝杆菌全细胞溶胞产物(WCL)和短期培养滤液(STCF)特异性抗体的水平，其中所述ELISA测量的结果表示为减去对照孔吸光度之后的三个孔在492nm的平均吸光度±标准偏差；

图6表示结核分枝杆菌重组抗原在早期(3周)和晚期(30周)时间点处诱发鼻内BCG接种的受治疗者的T细胞应答的能力，其中ELISPOT测定的结果表示为从各自的未受刺激的培养物中减去SFU之后的两次测定的平均值±标准偏差；

图7表示在用多组分亚单位疫苗进行鼻内免疫2周后的受治疗者中结核分枝杆菌重组抗原诱发T细胞应答的能力，其中ELISPOT测定的结果表示为从各自的未受刺激的培养物中减去SFU之后的两次测定的平均值±标准偏差；

图8表示在用多组分亚单位疫苗进行鼻内免疫2周后的受治疗者中结核分枝杆菌重组抗原特异性抗体应答，其中结果表示为减去对照孔吸光度之后的三次测定中在492nm的平均吸光度±标准偏差；

图9表示免疫6周后用Apa扩展的T细胞抑制巨噬细胞中结核分枝杆菌的细胞内生长；

图10表示鼻内免疫的受治疗者的多肽免疫原特异性增殖应答，其中Rv0164、Rv0831c 和Rv1324单独地封装在阳离子脂质体中并单独地施用；

图11表示用封装在阳离子脂质体中的Rv0164、Rv0831c和Rv1324的组合进行鼻内免疫的受治疗者的多肽免疫原特异性增殖应答被；

图12表示用编码Rv0164、Rv0831c或Rv1324的单个多肽进行鼻内免疫的受治疗者的肺、CLN和脾中多肽免疫原特异性T细胞的分布；

图13表示在用封装在阳离子脂质体中的重组Rv0164、Rv0831c或Rv1324免疫2和4周后的受治疗者的鼻灌洗液和血清中的多肽免疫原特异性的异型和同种型抗体应答；

图14表示在用封装在阳离子脂质体中的重组Rv0164、Rv0831c和Rv1324的组合免疫2和4周后的受治疗者的鼻灌洗液和血清中的多肽免疫原特异性的异型和同种型抗体应答；

图15表示结核分枝杆菌的天然Apa(nApa)、重组APA(rApa)、重组Ag85A(rAg85A)和对照DDA-MPL佐剂在用各自的蛋白亚单位疫苗或单独的DDA-MPL佐剂进行鼻内免疫的BALB/c小鼠中对肺、颈部淋巴结(CLN)或脾细胞诱发Th1应答(IFN-γ和IL-2)的比较能力；

图16表示结核分枝杆菌的天然Apa、重组APA、重组Ag85A和对照DDA-MPL在用各自的蛋白亚单位疫苗或单独的DDA-MPL佐剂进行鼻内免疫的BALB/c小鼠中对肺、CLN和脾细胞诱发Th2或Th17应答的比较能力；

图17表示在肺、颈部淋巴结(CLN)和脾细胞培养物中，免疫4周后用牛分枝杆菌BCG体外激发之后亚单位免疫及假免疫的小鼠中的肺、CLN和脾细胞培养物中分泌Th1(IFN-γ和IL-2)细胞因子的细胞的频率；

图18表示免疫4周后用牛分枝杆菌BCG体外激发之后亚单位免疫及假免疫的小鼠中的肺、颈部淋巴结(CLN)和脾细胞培养物中分泌Th2(IL-4)和Th17(IL-17)细胞因子的细胞的频率。

具体实施方式

增加的HIV患病率增加了对结核分枝杆菌疫苗的需要，所述疫苗对发达和发展中世界的儿童和成年患者都具有效力。本发明作为针对分枝杆菌(Mycobacterium)的新疫苗具有用途。

为了回应针对结核病的大范围BCG疫苗效力，提供了全新发明的策略以加强BCG疫苗施用后产生的免疫应答。为此，结核分枝杆菌的分泌蛋白代表用于加强BCG疫苗效力的抗原的宝贵来源。本发明提供单独或与BCG联合使用的增加受治疗者的免疫应答的疫苗。在优选的实施方案中，本发明使用至少一种结核分枝杆菌多肽。适合于本发明的多肽包括毒性结核分枝杆菌在受治疗者体内表达的任何多肽。适合用于本发明的多肽可选地包括Ag85A、Ag85B、MPT-64、Pst-S1、Apa、GroES、GroEL、Dnak、CFP-10、Rv0831c和Rv1324、其部分、其组合或其多重体。多重体说明性地指超过一种多肽序列类型或超过一个拷贝的单一多肽序列。适合于本发明的多肽可选地为重组的或天然产生的。

优选地，适合于本发明的多肽是重组的和通过本领域已知方法获得的。说明性地，将核苷酸序列克隆进质粒，所述质粒转染进大肠杆菌并表达。为了简化纯化步骤，从大肠杆菌表达的多肽可选地包括标签序列。适合用于本发明的标签的说明性实例包括多组氨酸、CBP、CYD(共价但可解离的NorpD肽)、strep-2、FLAG、HPC或蛋白C肽重链标签(heavy chain of protein C peptide tag)或者GST和MBP蛋白融合标签系统。可理解，其他标签系统是相似地可操作的。在优选的实施方案中，重组多肽表达在大肠杆菌中，并使用亲和标签系统纯化，接着通过例如在表达的多肽中引入因子Xa、凝血酶或其他酶的切割位点将标签酶促切割。标签切割的方法是本领域中已知的，而且任何有效方法被理解为适合用于本发明。

在优选的实施方案中，使用多组分疫苗。多亚单位疫苗可选地含有一组单独的多肽或者单个融合蛋白或融合蛋白家族，其中每种蛋白可选地表示由毒性结核分枝杆菌表达的单个蛋白。优选地，使用九个多肽的疫苗。可理解，每种单独的抗原或多肽独立地适合用于本发明。没有料到地，多组分疫苗的施用增加每种单独组分的免疫原性。因此，九个亚单位的疫苗的优选实施方案证明协同的免疫原性。

术语受治疗者说明性地为能够对疫苗的激发产生免疫应答的活生物体。受治疗者的非限制性的实例包括人、任何较低等的灵长类、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、猪、仓鼠、马、驴、牛、负鼠、獾、山羊或其他哺乳动物或非哺乳动物。

术语免疫应答说明性地为受治疗者免疫系统的任何改变，其响应于来自如下的激发：疫苗、传染性的或另外的外来生物体、组织、细胞、抗原、抗体、核苷酸链或本领域公认的其他免疫刺激物质。免疫应答的非限制性实例包括CD4⁺或CD8⁺T细胞中的IL-2、IL-4或IFN-γ的体外分泌；免受结核分枝杆菌H37Rv或其他传染性生物体激发的保护；亚硝酸盐水平的改变；在各种免疫区室中的Th1和Th2细胞因子应答；异型和同种型抗体水平的改变；抗原的体外识别；B细胞应答；受感染的巨噬细胞中结核分枝杆菌的生长抑制；存活；或本领域已知的其他应答。

术语多肽说明性地为具有两个或更多个氨基酸残基的链。在优选的实施方案中，适合用于本发明的多肽是Rv1860(Apa)蛋白、整个重组的或天然的蛋白、其突变体、其部分、表位或肽、其同系物的氨基酸序列，或者与其他肽序列合并的Apa序列。以登录号YP_177849 找到Apa序列。

优选地，本发明的疫苗是多组分疫苗。多组分疫苗说明性地包括九个多肽抗原例如Ag85A、Ag85B、MPT-64、Pst-S1、Apa、GroES、GroEL、DnaK和CFP-10。作为包含在疫苗中的候选者的可操作的代表性结核分枝杆菌H37Rv多肽以及它们各自的核苷酸序列：

Ag 85A(Rv3804c)：基因ID：886132；蛋白ID：NP_218321

Ag 85B(Rv1886c)：基因ID：885785；蛋白ID：NP_216402

MPT-64(Rv1980c)：基因ID：885925；蛋白ID：NP_216496

Pst-S1(Rv0934)：基因ID：885724；蛋白ID：YP_177770

Apa(Rv1860)：基因ID：885896；蛋白ID：YP_177849

GroES(Rv3418c)：基因ID：887583；蛋白ID：NP_217935

GroEL(Rv0440)：基因ID：886354；蛋白ID：NP_214954

Dnak(Rv0350)：基因ID：885946；蛋白ID：NP_214864

CFP-10(Rv3874)：基因ID：886194；蛋白ID：NP_218391

CFP-31(Rv0831c)：基因ID：885349；蛋白ID：NP_215346

CFP-32(Rv1324)：基因ID：886897；蛋白ID：NP_215840

MTSP-17/CFP-15(Rv0164)：基因ID：886267；蛋白ID：YP_177617。

多肽优选地来自结核分枝杆菌实验室菌株或临床分离株，但是还可来自牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)或其他分枝杆菌来源。疫苗可选地包括等摩尔浓度的每种抗原，但是可理解每种抗原的独特摩尔浓度也适合于本发明。示例性的疫苗将向小受治疗者递送每剂包括10μg的每种抗原的总共90μg的重组抗原混合物，或者向人类受治疗者递送达到或超过1000μg的每种抗原。以与剂量制剂相适合的方式并以预防、治疗有效的和致免疫的量施用疫苗。待施用的量取决于待治疗的受治疗者，包括例如个体的免疫系统产生免疫应答的能力，以及期望的保护程度。适合的剂量范围是每次接种大约几百微克活性成分的水平，优选的范围是从约0.1至1000μg。初期施用和加强注射的适合方案也是可变的，但是其通常为初期施用接着是随后的接种或其他施用。疫苗的剂量将取决于施用途径，并且将根据待接种的人的年龄而改变而且根据待接种的人的体型而在更小的程度上改变。

令人吃惊地，上述多亚单位疫苗的鼻内(i.n.)递送导致对九个单独抗原中每个的肺特异性免疫应答。每种抗原的识别水平是独特的，而IFN-γ分泌细胞的水平如下排序：

Apa＞MPT-64＞DnaK＞Pst-S1＞GroEL＞GroES＞Ag85A＞Ag85B＞CFP-10。

还在其他免疫区室中观察到该抗原识别模式。然而，当测量了IL-2水平时，基于微球体的细胞因子多重免疫测定(multiplexed micro-sphere based cytokine immunoassay)显示了对Ag85A、Ag85B和Pst-S1的最大应答(表2)。

在一个优选的实施方案中，疫苗含有单个多肽抗原。优选地，抗原是分枝杆菌Apa分泌蛋白，其也被称作45/47-kDa蛋白复合物或来自基因modD的蛋白(Romain，F.等人，Infect.Immun.，1993；61：724-750)。Apa作为具有九种糖形式的糖基化蛋白进行分泌(Horn，C等人，J.Biol.Chem.，1999；274：32023-32030)。先前的研究证明，Apa的糖基化对于体外和体内的抗原性是必需的(Romain，R等人，Infect Immun，1999；67：5567-5572)。关于在引发免疫应答中对糖基化的需要，这些作者提供了三种可能的解释。第一，已经报道了当用其他糖肽免疫时的糖肽特异性应答，暗示肽主链和糖基化二者都与T淋巴细胞受体相互作用(Carbone，FR和Gleeson PA，Glycobiology，1997；7：725-730；Deck B等人，J Immunol，1995；155：1074-1078；Haurum，JS等人，J Exp Med，1994；180：739-744)。第二，对于引发免疫应答负责任的受体在本质上可能是非特异性的以便许多抗原的甘露糖基化是可通过单一受体类型识别的(Stahl，PD和Ezekowitz，RAB，Curr Opin Immunol，1998；10：50-55)。最后，糖基化的存在或不存在可改变巨噬细胞或树突状细胞对这种分子的摄取或加工。Apa的抗原性被认为与糖基化的存在相关。然而，在蛋白亚单位接种之后，糖基化对APA的T和B细胞免疫原性的作用未被详细评估。

相应地，Romain等人的初免-加强策略成功地在用包括编码Apa、Hsp70和Hsp65的载体的三价DNA疫苗初免并用BCG疫苗加强之后引发改进的免疫应答。由于抗原表达在宿主细胞中，DNA疫苗的使用产生糖基化的抗原(Apa等)。在Romain的情况下，初免抗原在表达过程中进行哺乳动物细胞糖基化，而且任何抗原性或免疫原性预计是糖基化抗原暴露的结果。

在本发明优选的实施方案中，多肽不经糖基化而产生。在一个非限制性的实例中，多肽在大肠杆菌中合成，其中大肠杆菌在本领域中被公认为不能将与哺乳动物细胞类型或结核分枝杆菌相关的蛋白适当地糖基化。可理解，不将多肽糖基化的其他合成方法是相似地适合的。因此，在该实施方案中，蛋白免受糖基化。由于Apa的高度细胞识别可例如归因于糖基化的存在，而且分析Apa的免疫原性或抗原性的所有先前研究可归因于糖基化的抗原，所以期望糖基化的缺失将不产生有效的结果。令人吃惊地，在本发明中，使用非糖基化的多肽的接种导致稳健的免疫原性。

本发明适合作为标准的独立的疫苗、初免疫苗或加强疫苗。优选地，本发明用于初免- 加强策略。更优选地，本发明用作初免疫苗。当用作初免疫苗时，本发明说明性地接着是用BCG疫苗或其他亚单位/DNA疫苗的免疫。在本发明的一个实施方案中，使用单个的亚单位初免疫苗。优选地，其中多肽是Apa的疫苗。可理解，其他多肽是相似地适合的。在该实施方案中，用Apa蛋白的免疫可选地接着是用单个的亚单位或多组分疫苗的免疫，所述多组分疫苗说明性地使用除了Apa之外或者排除Apa之后的超过一种蛋白。随后接种的递送可选地是在短的或长的时间段内。在非限制性的实例中，在一天或一周中递送第二次接种。可选地，在一年或几年后递送第二次接种。可理解，第二疫苗的递送可以是在受治疗者生命中的任何时间。

优选地，第二疫苗是蛋白亚单位疫苗或甚至BCG疫苗(正常的或重组的)。第二或随后的疫苗的递送可选地是通过与第一免疫相同的递送途径或通过可选的途径。在优选的实例中，初免疫苗通过鼻内途径递送。随后的加强疫苗也通过鼻内途径递送。

在优选的实施方案中，在用单或多组分疫苗加强之前进行BCG疫苗的递送。优选地，通过多组分疫苗的递送加强BCG接种。更优选地，通过用单组分疫苗的接种来加强BCG，其中所述单组分是编码Apa蛋白的多肽。相似地，可理解，加强疫苗的递送可选地在受治疗者生命中任何时间递送。

本发明可选地被用作组合疫苗。说明性地，用单或多组分疫苗来补充BCG疫苗。该策略允许单个多肽、多组分和BCG疫苗以任意组合同时递送。

在优选的实施方案中，包含单个或多个多肽的单或多组分疫苗通过鼻内途径递送，而BCG疫苗通过皮内或皮下途径递送。更优选地，单或多组分疫苗通过鼻内途径递送，而加强BCG疫苗也通过鼻内途径递送。可选地，通过鼻内或经皮途径递送BCG疫苗，而加强的单或多组分疫苗也通过相同途径递送。可理解，本领域已知的递送方法适合于通过这些或其他进入途径来递送疫苗。

发明的疫苗的递送可选地在用TB进行主动或非主动感染之前、过程中或之后，或者在患病之后，单独或者与抗结核化疗联合。因此，单或多组分疫苗的递送可选地为预防性的、感染后的或治疗性的。在优选的实施方案中，本发明设计为预防或消除疾病，或者预防感染。可选地，单或多组分疫苗的递送是治疗性的。

多肽可选地作为裸露的多肽在水溶液中、在乳液中或在其他适合的递送组合物中进行递送。在优选的实施方案中，本发明作为疫苗或作为药物包的疫苗组分进行递送。可选地，多肽(或多个多肽)或免疫原性肽或表位存在于包括适合的乳化剂的乳液中。在优选的实施方案中，多组分疫苗乳化或封装在适合的疫苗载运体(carrier)中。更优选地，单个的亚单位疫苗被乳化。更优选地，编码Apa的多肽被乳化。适合的乳化剂说明性地包括超分子生物载体(SMBV)、例如Major，M等人，Biochim.Biophys.Acta，1997；1327：32-40，De Migel，I等人，Pharm.Res.，2000；17：817-824，美国专利第6,017,513，7,097,849，7,041,705，6,979,456，6,846,917，6,663,861，6,544,646，6,541,030，6,368,602号，Castignolles，N.等人，Vaccine，1996；14：1353-1360，Prieur，E.等人，Vaccine，1996；14：511-520，Baudner B等人，Infect Immun，2002；70：4785-4790中所述的；脂质体例如El Guink等人，Vaccine，1989；7：147-151和美国专利第4,196,191号中所述的纳米颗粒；或本领域已知的其他试剂。适合使用的试剂通常是商业上可得的。

可选地，本发明包括多肽与佐剂的共同递送。适合的佐剂说明性地包括二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)；单磷酰脂A(MPL)；大肠杆菌不耐热的肠毒素，其基因修饰的衍生物，LTK63，海藻糖二分枝酸酯和合成的衍生物，亲脂性季铵盐-DDA，DDA-MPL，DDA-TDM，DDA-TDB，IC-31，铝盐，氢氧化铝，磷酸铝，磷酸铝钾，美国专利公布20070212329中所述的那些，节约抗原的佐剂(antigen-sparing adjuvants)，Montanide ISA-51，ISA-720，微颗粒，免疫刺激复合物，脂质体，病毒体，病毒样颗粒，CpG寡核苷酸，霍乱毒素，来自大肠杆菌的不耐热的毒素，脂蛋白，树突状细胞，IL-12，GM-CSF，说明性地包括磷酸钙纳米颗粒的纳米颗粒，用以形成纳米乳液的大豆油、乳化剂和乙醇的组合；Glaxo-Smith Kline(Middlesex，UK)生产的AS04；可从SciClone Pharmaceuticals(香港)获得的ZADAXIN；本领域已知的其他试剂，其组合或其片段。

有关下面的非限制性的实施例，对本发明进一步进行说明。

实施例1

BCG、单和多组分疫苗的产生：BCG(哥本哈根)疫苗提供作为美国Bethesda的食品与药品管理局(FDA)的生物制品评估研究中心的TB临床前疫苗参考标准。将冻干的BCG疫苗重新悬浮于疫苗稀释剂(稀释的Sauton培养基，Statens血清研究所，哥本哈根，丹麦)中。

对于单或多组分疫苗的产生，单一剂量由在DDA(250μg/剂，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和MPL(产生自明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)Re 595；25μg/剂，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中乳化的10μg的每种多肽所组成。如Sable SB等人，Vaccine，2005；23：4175-4184中所述制备了乳液。简言之，首先将MPL与含有0.2％三乙胺(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)的不含内毒素的无菌水(Burdick & Jackson，Muskegon，MI)混合。混合物在70℃水浴中加热30s，然后超声处理30s，进行三次。通过将DDA悬浮于无菌水中来制备乳液，并通过在水浴中在80℃下将悬液加热5-10min来获得均匀的粉末分散。冷却至室温之后，就在使用之前将MPL和抗原与DDA混合。

实施例2

多肽的产生：在科罗拉多Fort Collins的科罗拉多州立大学的微生物学、免疫学和病理学系，通过由美国国立卫生研究院(NIH)/美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)资助的TB疫苗测试和研究材料协议(TB Vaccine Testing and Research Material contract)获得了九个重组结核分枝杆菌H37Rv蛋白(表1)、全细胞溶胞产物(WCL)和总的短期培养滤液蛋白(STCF)。

表1

可选地，特定的多肽被克隆，表达和分离。说明性地，如Sable，S.等人，Infection and Immunity，2005；73：3547-3558和Sable，S等人，Vaccine，2005；23：4175-4184所述的进行分离和表征。简言之，在疾病防控中心的生物技术核心机构合成了用于克隆和测序的引物。设计用于在NCBI数据库中发现的Rv0164(mtsp-17/TB18.5)、Rv0831c(cfp-31)和Rv1324(cfp-32)基因序列的下述PCR引物以特异性地扩增相应基因并引入BamHl/Ndel限制性内切酶识别位点：Rv0164正向，GCT CATATGATG ACG GCAATC TCG TGC TC(SEQ ID NO 1)；Rv0164反向，GCT GGA TCC TTA GCT GGC CGC CAG CTG CTC GGC GC(SEQ ID NO 2)；Rv0831c正向，GCT CAT ATG CTC CCC GAG ACA AAT CAG G(SEQ ID NO 3)；和Rv0831c反向，GCT GGATCC TTACTG GCGAAG CAG CTC AT(SEQ ID NO 4)；Rv1324正向，GCT CATATG ACG CGT CCG CGA CCC CCG C(SEQ ID NO 5)；和Rv1324反向，GCT GGA TCC TCAGTA CAG CGC GTT GGC GAG(SEQ ID NO 6)。通过用这些引物组进行结核分枝杆菌H37Rv染色体DNA的PCR扩增获得了DNA片段，在琼脂糖凝胶上纯化并克隆进TOPO TA克隆载体(Invitrogen，CA，美国)。在含卡那霉素(25μg/ml)的Luria-Bertani培养基上选择假定的重组大肠杆菌(TOP 10)克隆。提取了质粒并通过PCR、限制性内切酶消化和测序确认了插入片段。将BamHl/Ndel切割的插入片段符合读框地克隆进表达载体pET19-b(Novagen，CA，美国)，并通过测序确认所得的质粒。

含有感兴趣的基因的pET19-b表达载体随后用来转化大肠杆菌BL-21(DE3)细胞(Novagen；EMD Biosciences，CA，美国)。在含有100μg/ml氨苄西林的Luria-Bertani培养基中用0.25mM IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)诱导了编码相应重组蛋白的基因，同时在25℃水浴中培养16h。按照制造商的说明，使用Bugbuster试剂盒(Novagen，CA，美国)将细胞裂解，并且在8M脲存在下溶解之后使用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖基质(HisBind纯化试剂盒；Novagen，CA，美国)将重组蛋白从内含体中，或者根据制造商的实验方案从可溶性周质级分中纯化。在洗脱之前在冲洗缓冲液中使用0.5％ASB-14从柱子中除去内毒素，同时如Oganesyan，N等人，2005；1345-711X所述的进行柱上的重新折叠(on-column refolding)。将重组蛋白制剂集中起来并针对0.1M PBS(pH 7.2)进行透析。使用用相同缓冲液平衡的分析型superdex-200柱(10/300；Amersham Pharmacia Biotech)，通过快速蛋白液相色谱法将透析的Rv0164和Rv0831c进一步纯化。在针对20mM Tris-HCl(pH 8.2)透析后使用UNO Q1阴离子交换柱(Bio-Rad，CA，美国)并使用0-1M NaCl线性梯度将Rv1324纯化。通过SDS-PAGE分析了级分，用PBS(pH 7.2)进行缓冲液更换并将其在Centricon YM-3(Millipore，MA，USA)上浓缩。将纯化的重组蛋白过滤(0.22μM；Millipore，MA，美国)灭菌并使用microBCA蛋白评价方法(QuantiPro BCA测定试剂盒；Sigma-Aldrich，MO，美国)进行定量。通过LC-MS-MS进一步确认了蛋白身份。根据制造商的实验方案，通过鲎变形细胞溶胞产物测定(LAL-QCL-1000测定试剂盒；Cambrex，MD，美国)确定了蛋白制剂中脂多糖(LPS)的含量。将蛋白等分并储存在-70℃直到进一步使用。

如microBCA方法所评估，一贯地以1-2mg/L的Rv0164、4-5mg/L的Rv0831c和6-8mg/L的Rv1324蛋白的范围内的产量来实现重组蛋白的表达。在还原条件下(SDS-PAGE；4-20％梯度)进行的凝胶的银染(图1)表明了纯化的重组Rv0164蛋白的分子量为20.0kDa，重组Rv0831c蛋白的分子量为33.0kDa，而重组Rv1324蛋白的分子量为37.0kDa。通过LC-MS-MS进一步确认了纯化的蛋白的身份。在将蛋白用于受治疗者的免疫或体外免疫测定之前，分析了制剂的内毒素(LPS)污染。在所有情况下，LPS以不被怀疑干扰体内或体外免疫原性实验的量存在(9.0EU的LPS/mg的Rv0164，16EU的LPS/mg的Rv0831c和Rv1324)。

实施例3

受治疗者的接种：对于小鼠受治疗者，通过使用26规格(gauge)注射针在两条后腿的臀浅肌(gluteus superficialis muscle)和股二头肌(biceps femoralis muscle)的上方注射50μl的BCG悬液(7×10⁵CFU)的施用来通过皮下接种对BCG疫苗进行递送。通过使用细头微量移液器将总共30μl的BCG疫苗(7×10⁵CFU)应用于外鼻孔(每鼻孔15μl)，并允许小鼠将悬液自然地吸入肺部来施用BCG疫苗。对于所有研究，对于任何施用途径都将BCG疫苗稀释剂用作对照。相似地进行人类受治疗者的接种。通过鼻内或皮下注射施用的人类受治疗者的BCG给药是在1-8×10⁵CFU之间。

除了使用每剂90μg的重组结核分枝杆菌蛋白混合物(每种多肽10μg)之外，如上所述以2周的间隔通过鼻内途径将多组分疫苗向小鼠递送三次。人受治疗者的剂量包括施用10-1000μg的每种多肽。大动物受治疗者的剂量范围接近于具有相似分级的接收区间的人的剂量范围。由于接收区间在尺寸上成比例地更小，所以小动物需要在范围低端的剂量。对于所有研究，通过施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.2)DAA-MPL来进行假免疫。

实施例4

样品采集：在靶时间点上在麻醉中通过心脏穿刺来进行小动物的血液采集。大动物和人受治疗者已被/将被从静脉内抽血至适合的抗凝血剂中。通过确立的步骤收集尿。通过用含有完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)的200μl的PBS(pH 7.2)反复冲洗被处死小鼠的鼻孔和相连的上呼吸道来进行鼻灌洗。血清、尿和鼻冲洗液被储存在-20℃直到使用。

对于小鼠研究，来自肺、脾、鼻相关的淋巴样组织(nasal associated lymphoid tissue，NALT)、颈部淋巴结(CLN)、腹股沟淋巴结(ILN)、肠系膜淋巴结(MLN)以及股骨和胫骨骨髓(BM) 的样品被无菌地摘除并置于补充了100IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素、1mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、1mM丙酮酸钠、5×10^-5Mβ-巯基乙醇、维生素和非必需氨基酸(Gibco-Invitrogen，Grand Island，NY)和10％的内毒素测试的热灭活的胎牛血清(FCS；Atlas Biologicals，Fort Collins，CO)的RPMI 1640中。通过用RPMI 1640培养基冲洗相应的腔分离了胸廓和腹膜渗出液细胞。

实施例5

免疫细胞的分离：为了分离肺细胞，在麻醉中通过心脏穿刺将小鼠放血并用含有10U ml^-1的肝素的PBS通过右室灌流它们的肺以除去血管内的白血球。然后用补充的RPMI中的含有1mg/ml胶原酶IV型(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和25U ml^-1的DNA酶(Roche，Penzberg，德国)的酶混合物对肺灌流并在无菌皿中将其切成小片，在37℃下将碎片(fragment)在酶混合物中温育1h。将消化的肺碎片用5ml注射器活塞挤压穿过70μm孔径的细胞过滤器(BD Falcon，Bedford，MA)以获得单细胞悬液，并且用RBC裂解缓冲液(eBioscience，San Diego，CA)将红细胞在室温下裂解4-5min。将肺细胞冲洗，通过离心回收并在补充的RPMI中重新悬浮以使用台盼蓝染料排除方法计数。如所述的分离NALT(Asanuma，H，等人，J Immunol Methods，1997；202：123-131)，并通过用RPMI冲洗股骨和胫骨的腔来分离BM。通过将各自器官轻轻地研磨穿过70μm孔径的细胞过滤器进入10-20ml的补充的RPMI来获得脾、淋巴结、BM或NALT的单细胞悬液。以300×g将细胞悬液离心10min，并在必要时通过用RBC裂解缓冲液处理来除去红细胞。用新鲜的RPMI将细胞冲洗几次并相应地调节细胞浓度。

实施例6

来自鼻内和皮下BCG施用的Th1应答：在鼻内或皮下施用后，在12周的过程中测量了肺、脾和各自的引流淋巴结中分泌干扰素-γ(IFN-γ)、IL-2和IL-4的抗原特异性T细胞的频率和分布。如上所述分离了细胞，并且获得的细胞的总数量不依赖于所进行的免疫的类型。根据制造商的实验方案，通过IFN-γ、IL-2和IL-4ELISPOT测定试剂盒(BD-Biosciences，San Diego，CA)，在鼻内和皮下两种BCG免疫(图1)之后在肺和脾中评估了结核分枝杆菌WCL特异性IFN-γ、IL-2和IL-4应答。

在评估的所有三个时间点，在肺和引流CLN中发现鼻内免疫之后比皮下免疫之后有更多的分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的细胞，除了在12周时间点时，在肺中观察到在皮下BCG免疫之后比鼻内免疫之后有更多的分泌WCL特异性IL-4的SFU(p＜0.0001)。相反地，在评估的所有时间点，在引流侧面(接种位点)的ILN中和脾中皮下BCG免疫比鼻内免疫诱导更高的WCL特异性IFN-γ、IL-2和IL-4应答，除了对于IFN-γ和IL-2，其中在12周时间点时，在鼻内组的脾中观察到比皮下组更高的WCL特异性SFU(对于IFN-γ和IL-2分别地p＜0.01和0.05)。

实施例7

单独BCG免疫之后一氧化氮的产生：如Sable，S等人，Eur Respir J，2007；29：337-346所述的，通过使用亚硝酸钠标准物的Griess测定来测量作为一氧化氮(NO)产生的指示物的培养的细胞的上清液中亚硝酸盐(NO2^-)的积累。在37℃下培养96h之后用10μg ml^-1WCL、大肠杆菌LPS-TLR-4配体(InvivoGen，San Diego，CA)或单独的RPMI培养基刺激的每种条件的1×10⁶个细胞ml^-1的上清液(100μl)被一式三份地测定，并在550nm处测量吸光度。

用BCG鼻内免疫的小鼠肺细胞培养物的WCL刺激在所有三个时间点上产生了显著高于鼻内稀释免疫的(p＜0.0001)或皮下BCG免疫的(p＜0.0001)小鼠的亚硝酸盐水平(图3A)。皮下BCG之后在脾细胞培养物中的WCL诱导的亚硝酸盐水平在所有三个时间点(p＜0.0001)上显著高于皮下稀释免疫所观察到的，以及在3周(p＜0.0001)和6周(p＜0.05)时间点上显著高于鼻内BCG免疫之后所观察到的。然而，在12周时间点上，与皮下BCG免疫相比，鼻内BCG免疫诱导了脾中增加的WCL特异性亚硝酸盐水平(p＜0.05)，虽然在每个情况下的水平相对低(图3A)。

此外，发现在12周时鼻内BCG免疫之后的胸廓和腹膜渗出液细胞在用WCL刺激之后产生比皮下BCG免疫之后分离的那些水平显著更高(p＜0.0001)的亚硝酸盐水平(图3B)。

在免疫后6和30周使用ELISPOT和淋巴细胞增殖以及两个结核分枝杆菌抗原制剂STCF和WCL评估了鼻内BCG免疫在各种局部免疫区室和远部免疫区室中诱发分枝杆菌特异性Th1(IFN-γ和IL-2)和Th2(IL-4)细胞因子应答的能力。

从不同位置分离的细胞以1×10⁶个细胞/ml接种在含有100μl补充的RPMI-1640的无菌96孔平底组织培养板中(Costar，Corning，NY)。以5∶1淋巴细胞/DC使用了BM衍生的树突状细胞(DC)。对每个处理组，一式三份地或或一式四份地用100μl补充的RPMI中10μg/ml的纯化的重组结核分枝杆菌抗原、抗原组合、WCL、STCF或Con-A作为细胞生活力和反应性的阳性对照、或者单独的培养基作为阴性对照激发细胞。在37℃下含有5％CO₂的潮湿气氛中将培养物培养72h。向各孔加入1μCi的³H-胸腺嘧啶核苷(Perkin Elmer，Wellesley，MA)，并在培养18-20h后在玻璃纤维滤器(Perkin Elmer，Wellesley，MA)上使用自动细胞收集器(TOMTEC，Inc.Hamden，CT)来收集细胞。一旦干燥，使用β-闪烁计数器(Perkin Elmer， Wellesley，MA)对掺入的放射性进行计数。增殖表示为在减去不含抗原的培养物的每分钟的平均计数(CPM)之后的抗原刺激的培养物的每分钟的平均计数，并且通过将抗原刺激的孔中每分钟的平均计数除以未刺激的孔中每分钟的平均计数来计算刺激指数(SI)。

鼻内BCG免疫在肺、排空鼻道的局部淋巴结(即CLN)和脾中诱导了STCF和WCL二者特异性的长期T细胞应答(图4)。在MLN中免疫6周后还观察到强的细胞因子应答，所述MLN使胃肠道排空。然而，MLN中STCF和WCL特异性应答在30周降低。在鼻内BCG免疫之后，腹膜渗出液细胞(PEC)显示了自6周至30周的分泌STCF和WCL特异性Th1和Th2细胞因子的细胞的应答的增加。从6周至30周，骨髓中分泌STCF和WCL二者特异性的IFN-γ和IL-2的SFU也增加了，而从6周至30周，WCL特异性IL-4SFU减少了。NALT显示了在早期(在6周SI分别为12.15和18.60；未刺激的培养物的平均CPM为720)和晚期(在30周SI分别为10.26和12.52；未刺激的培养物的平均CPM为660)时间点的STCF和WCL二者特异性的增殖。

STCF和WCL特异性的抗体异型(IgG和IgA)和同种型(IgG1和IgG2a)水平在鼻内BCG免疫的小鼠的血清、鼻灌洗液和尿中进行评估。在30周，通过鼻内途径的免疫诱发了与6周时间点相比显著升高的抗原特异性抗体应答(图5)，并且其特征为在血清中占优势的抗原特异性IgG异型水平以及鼻灌洗液和尿中占优势的IgA水平。

实施例8

鼻内BCG免疫之后由结核分枝杆菌的多肽诱发的IFN-γ应答：评估了结核分枝杆菌的多肽在3和30周被T和B淋巴细胞识别的能力，并在图6中对其说明。

在3周时间点处，肺和CLN中所有抗原的识别比来自脾的细胞中的高。在被评估的所有抗原中，Apa在3周时诱发最强的IFN-γ应答，而GroEL在30周时诱发最强的IFN-γ应答。通常，与Apa或GroEL诱发的那些相比，Ag85A、Ag85B、Pst-S1和GroES诱发的IFN-γ应答是中等的。在评估的所有时间点上，与GroEL诱发的应答相比，Apa诱发的IL-2应答是低的。在30周时在MLN、PEC和BM中评估的抗原识别模式与在肺、CLN和脾中观察到的相似(图5)，虽然抗原特异性应答的大小在器官到器官之间变化。

在3周时，血清、鼻灌洗液和尿中抗原特异性的异型和同种型应答是低的。然而，在30周时，观察到的最强的抗体应答是针对Ag85复合物蛋白(对于Ag85B，平均血清IgG A₄₉₂是1.189±0.009)接着是Pst-S1，而与其余抗原(平均A₄₉₂＜0.1)相比，Apa特异性抗体应答(平均A₄₉₂范围是0.3-0.1)是中等的。

实施例9

多组分多肽接种之后T细胞和抗体的应答：图7中说明了在用单独多肽进行体外刺激之后在不同免疫区室中分泌Th1和Th2细胞因子的细胞的频率。在用多肽多组分混合物-DDA-MPL鼻内免疫之后，如ELISPOT(图7)和T细胞增殖(³H-胸腺嘧啶核苷摄取)测定所评估的，肺的T淋巴细胞比衍生自其他器官的那些更强地识别所有九种多肽。在肺水平上在诱导分泌IFN-γ的细胞的方面单独多肽的识别顺序是Apa＞MPT-64＞Dnak＞Pst-S1＞GroEL＞GroES＞Ag85A＞Ag85B＞CFP-10。除了NALT、MLN和BM之外，在被评估的所有免疫区室中抗原识别模式是相似的。虽然在免疫之后Apa在大多数位点上诱导了产生IFN-γ和IL-4二者的细胞，但是分泌IL-2的细胞的频率是低的。另一方面，据观察Ag85复合物(A和B)、Pst-S1和Dnak是分泌IL-2的细胞的突出的诱导剂。

测量单独多肽对细胞因子的诱导的基于微球体的细胞因子多重免疫测定的结果表明，作为对Apa刺激的响应，在肺细胞培养物上清液中分泌了升高水平的IL-12(p70)、TNF-α、GM-CSF、IL-4和IL-10。在评估的纯化的抗原中，Ag85A、Ag85B和Pst-S1诱导了最强的IL-2应答，而Apa产生的IL-2水平是最低的(表2)。

评估了在多组分亚单位免疫之后单独多肽诱导细胞毒性T细胞应答的能力。如所观察到的靶细胞对中性红的摄取的减少(数据未显示)，只有Apa诱导了显著的巨噬细胞细胞毒性(平均百分比细胞毒性30％)。

表2

实施例10

在鼻内多组分免疫之后的多肽特异性抗体应答：鼻内免疫主要地诱导了血清中的免疫原特异性IgG水平，而在鼻灌洗液中观察到IgA和IgG二者的水平(图8)。Apa在鼻灌洗液、血清和尿中分别诱导了显著的IgA、IgG1和IgG2a同种型应答。Pst-S1、Ag85B和Ag85A还诱导了强的体液应答。

实施例11

在BCG免疫之后Apa扩展的淋巴细胞对感染的巨噬细胞中结核分枝杆菌的抑制：如Worku和Hoft，Infect Immun，2003；71：1763-1773所述的并作下述修改，进行了抗原扩展的效应T淋巴细胞对巨噬细胞中细胞内结核分枝杆菌生长的体外作用。通过在24孔板(Costar，Cambridge，Mass.)中培养腹膜渗出液细胞制备了来自BCG免疫的或假免疫的小鼠的腹膜巨噬细胞，并允许巨噬细胞在腹膜T细胞存在下于37℃分化5天。5天后，通过轻轻冲洗除去未粘附的细胞以获得粘附的巨噬细胞群体。在单独的RPMI培养基中将来自BCG免疫的或假免疫的小鼠的效应细胞、肺细胞和脾细胞(2×10⁵个细胞/ml)培养5天以用作静止的(rested)T细胞阴性对照，或者将其用WCL(20μg/ml)或Apa(10μg/ml)在24孔板中刺激5天。在第6天，用结核分枝杆菌以1的感染复数(multiplicity of infection)将巨噬细胞感染。4小时后，通过低速离心(＜1,000rpm)除去细胞外杆菌，并将巨噬细胞重新悬浮于新鲜的培养基中。在96孔板(100μl/孔)中以1×10⁶个细胞/ml接种感染的巨噬细胞，并将其与未粘附的肺或脾效应细胞(100μl/孔)以1∶1的比例在37℃、5％CO₂下共同培养72小时。在72h通过用0.06％的十二烷基硫酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)裂解巨噬细胞15分钟来进行CFU的计算。来自每孔的溶胞产物的3组连续10倍稀释物在0.05％吐温-80(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中被制备，并被铺板在7H11琼脂上。在37℃下用5％CO₂培养3-4周后对菌落进行计数。使用下式来确定结核分枝杆菌生长抑制的百分比：抑制百分比＝100-[100×[(来自抗原刺激的T细胞的CFU)/(来自培养基静止的T细胞的CFU)]]。

鼻内BCG免疫6周后分离并用Apa扩展的肺T细胞展现了与只用培养基扩展的T细胞相比对腹膜巨噬细胞中结核分枝杆菌生长的更大的抑制(图9)。此外，该抑制比皮下BCG免疫之后分离的肺细胞所带来的抑制显著地更高(p＜0.01)。

实施例12

用单组分疫苗鼻内免疫之后增殖应答的诱导：在用包含用阳离子脂质体封装的多肽的单个或多个多肽的疫苗鼻内免疫之后，评估了单独的多肽在从肺、CLN或脾分离的细胞中诱导增殖应答的能力。作为增殖应答的量度，评估了³[H]-胸腺嘧啶核苷掺入。在用代表性多肽体外刺激之后，肺细胞显示了比从脾分离的细胞更高的掺入(图10)。多肽Rv0831c和Rv1324在不同的靶器官中诱导了相当的增殖应答，而在2和4周时间点上评估的由Rv0164诱导的应答是低的。在鼻内免疫之后，用编码Apa的多肽的免疫还诱导强的增殖应答，其二者在免疫2周后都被观察到。

在用Rv0831c、Rv1324和Rv0164(10μg每种蛋白/剂)的组合进行免疫之后，Rv0831c和Rv1324在体外刺激后的靶器官培养物中诱导了比Rv0164显著更好的增殖(图11)。

实施例13

单或多组分鼻内免疫之后分泌免疫原特异性细胞因子的细胞的频率：通过如之前的实施例中所述的ELISPOT评估了Rv0831c、Rv1324或Rv0164诱导分泌Th1和Th2细胞因子的细胞的能力。在免疫后2和4周，用Rv0831c的鼻内免疫显示了与用Rv1324或Rv0164的免疫相比更高数目的分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的细胞(图12)。用Apa的免疫产生高水平的分泌Th1和Th2细胞因子的细胞。在评估的三个器官中，单独的分泌免疫原特异性细胞因子的细胞的频率在肺的水平上较高，其与增殖测定的结果是可比的。

当三种多肽通过鼻内共同施用时，Rv0831c比Rv1324和Rv0164诱导了更高数目的分泌细胞因子的细胞。在肺中观察到的水平对于Apa蛋白来说比Rv0831c高两倍以上(比较图7和12)。

实施例14

在单或多组分鼻内免疫之后血清和鼻灌洗液中的免疫原特异性的异型和同种型应答：在免疫之后2和4周通过ELISA测量了异型和同种型免疫球蛋白应答。简言之，估计了对纯化的重组抗原和抗原组合有特异性的总免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和IgG同种型IgG1和IgG2a。在100μl包被缓冲液(0.05M碳酸盐，pH 9.5)中以浓度2μg/ml悬浮的单独的抗原或抗原混合物在37℃下2h允许结合至MaxiSorp的ELISA板(Nalge Nunc International，Rochester，NY)的孔中。在用PBS-T冲洗三次后，在4℃下在PBS-T中用3％的牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)将孔阻断过夜。在含有1％BSA的PBS-T中分别以1∶200或1∶100稀释度向每孔中加入血清或鼻灌洗液样品(100μl)。在37℃下允许抗原抗体结合进行2h。用PBS-T将板冲洗4次，并向相应孔中加入在含有1％BSA的PBS-T中1∶1,000稀释的100μl的偶联辣根过氧化物酶的抗小鼠二抗(抗小鼠IgG和IgA，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO和抗小鼠IgG 1和IgG2a，BD-Biosciences，San Diego，CA)。90min后用PBS-T将板冲洗6次。用柠檬酸盐底物缓冲液(pH 5.0)中的邻苯二胺(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和过氧化氢将反应显色。20min后通过加入100μl的1M H₂SO₄终止反应，并在492nm下测量吸光度(A₄₉₂)。

用Rv1324的免疫显示了超过对Rv0831c和Rv0164所观察到的强的免疫原特异性抗体应答(图13)。鼻内Rv1324免疫诱导的抗体应答特征为在2和4周时间点所评估的血清中具有 IgG1和IgG2a同种型二者水平的强的免疫原特异性IgG应答以及鼻灌洗液中具有显著的IgG1同种型水平的混合的IgA和IgG应答。

用阳离子脂质体封装的Rv1324鼻内免疫的小鼠的血清和鼻灌洗液中Rv1324特异性的异型和同种型的滴定度随后在2周时间点评估并描绘于图14中。

实施例15-基于天然和重组的Apa的实验性亚单位疫苗在小鼠中的免疫原性

对于亚单位接种，单独地使用10μg的天然结核分枝杆菌Apa、重组大肠杆菌表达的Apa或重组的Ag85A[在二甲基双十八烷基溴化铵(DDA；250μg/剂，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和单磷酰脂A(产生自明尼苏达沙门氏菌Re 595的MPL；25μg/剂，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中单独地乳化的10μg的每种免疫原]以2周的间隔通过鼻内途径将BALB/c小鼠免疫三次。首先将MPL与含有0.2％三乙胺(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)的不含内毒素的无菌水(Burdick&Jackson，Muskegon，MI)混合。在70℃水浴中将混合物加热30s，然后超声处理30s。加热和超声步骤重复两次。为了制备乳液，将DDA悬浮于无菌水中并通过在水浴中在80℃下将悬液加热5-10min来获得均匀的粉末分散。冷却至室温之后，就在使用之前将MPL和抗原与DDA混合。假免疫的小鼠接受了在DDA-MPL中乳化的PBS(pH 7.2)。

接种后，在麻醉中通过心脏穿刺将小鼠放血并在免疫之后2和4周处死。肺、脾和颈部淋巴结(CLN)被无菌地摘除并置于补充了100IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素、1mML-谷氨酰胺、25mM HEPES、1mM丙酮酸钠、5×10^-5M β-巯基乙醇、维生素和非必需氨基酸(Gibco-Invitrogen，Grand Island，NY)和10％的内毒素测试的热灭活的胎牛血清(FCS；Atlas Biologicals，Fort Collins，CO)的RPMI 1640中。在每种情况下，对于每个处理组，从4只小鼠收集了相应的淋巴样器官或淋巴样器官以外的器官(extra-lymphoid organ)，并且提取了细胞以分析体外结核分枝杆菌抗原特异性细胞应答。使用从每个处理组收集的集中的鼻灌洗液和血清评估了抗原特异性抗体应答。

为了分离肺细胞，在麻醉中通过心脏穿刺将小鼠放血并用含有10U ml^-1的肝素的PBS通过右室灌流它们的肺以除去血管内的白血球。然后用补充的RPMI中的含有1mg/ml胶原酶IV型(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和25U ml^-1的DNA酶(Roche，Penzberg，德国)的酶混合物对肺灌流并在无菌皿中将其切成小片，并且在37℃下将片段在酶混合物中温育1h。将消化的肺片段用5ml注射器活塞挤压穿过70μm孔径的细胞过滤器(BD Falcon，Bedford，MA)以获得单细胞悬液，并且用RBC裂解缓冲液(eBioscience，San Diego，CA)将红细胞在室温下裂解4-5min。将肺细胞冲洗，通过离心回收并在补充的RPMI中重新悬浮以使用台盼蓝染料排除方法计数。通过将相应器官轻轻地研磨穿过70μm孔径的细胞过滤器进入10-20ml的补充的RPMI来获得脾和淋巴结的单细胞悬液。以300×g将细胞悬液离心10min，并在必要时通过用RBC裂解缓冲液处理来除去红细胞。用新鲜的RPMI将细胞冲洗几次并相应地调节细胞浓度。

根据制造商的方案，使用了商业上可得的干扰素(IFN)-γ、IL-2、IL-4(小鼠ELISPOT组；BD-Biosciences，San Diego，CA)和IL-17(小鼠ELISPOT组；eBioscience)来计算结核分枝杆菌抗原特异性细胞的频率。简言之，用100μl的PBS(pH 7.2)中的5μg/ml捕捉抗体将96孔ELISPOT板进行包被并在4℃下温育过夜。用含有10％FCS的200μl补充的RPMI在室温下2h将游离的结合位点阻断。对于所有位点将细胞浓度调节至1×10⁶和2×10⁶个细胞/ml并加入适当的孔中。如之前对抗原性或免疫原性研究所述的，未加入BM衍生的DC或巨噬细胞以补充已经存在于细胞悬液中的抗原呈递细胞。对于每个处理组，用在100μl体积中的10μg/ml的单独的纯化的结核分枝杆菌抗原、WCL、伴刀豆球蛋白A(Con-A；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或单独的培养基一式三份地刺激了细胞。在37℃的含有5％CO₂的潮湿气氛下温育36h之后，将未附着的细胞从孔中吸走，并用蒸馏水裂解余下的细胞。用含有0.05％吐温-20(PBS-T)的PBS将孔再次冲洗，并用标记了生物素的抗小鼠细胞因子抗体和偶联了辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白检测细胞因子分泌的位点。使用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物试剂组(BD-Bioscience，San Diego，CA)对酶反应显色。使用ELISPOT读数器(Cellular Technology Limited，Cleveland，OH)来对每孔中斑点形成单位(spot forming unit，SFU)的数目进行计数。

如ELISPOT测定所评估的，在免疫后4周，使用DDA-MPL佐剂中天然的或重组的Apa对小鼠的免疫在肺、颈部淋巴结(CLN)和脾中诱导了相当的Th1(IFN-γ和IL-2)(图15)、Th2(IL-4)和Th17(IL-17)(图16)细胞因子应答。在图15中，结核分枝杆菌的天然Apa(nApa)、重组APA(rApa)、重组Ag85A(rAg85A)和对照DDA-MPL佐剂在用各自的蛋白亚单位疫苗或单独的DDA-MPL佐剂进行鼻内免疫的BALB/c小鼠中对肺、颈部淋巴结(CLN)或脾细胞诱发Th1应答(IFN-γ和IL-2)的可比较的能力。鼻内rAg85A-DDA-MPL亚单位接种用作评估天然或重组Apa的免疫原性的阳性对照。免疫之后四周(用于接种的小鼠的结核分枝杆菌激发的时间点)，通过ELISPOT计算了肺、颈部淋巴结(CLN)和脾中分泌抗原特异性Th1(IFN-γ和IL-2)细胞因子的细胞的频率并表示为斑点形成单位(SFU)/器官的百万个细胞。结果显示为3至6次测定的平均值±标准偏差。在图16中，结核分枝杆菌的天然Apa、重组APA、重组Ag85A和对照DDA-MPL在用各自的蛋白亚单位疫苗或单独的DDA-MPL佐剂进行鼻内免疫的BALB/c小鼠中对肺、CLN和脾细胞诱发Th2或Th17应答的可比较的能力。免疫之后四周，通过ELISPOT测定计算了肺、颈部淋巴结(CLN)和脾中分泌抗原特异性Th2(IL-4)和Th17(IL-17)细胞因子的细胞的频率并表示为斑点形成单位(SFU)/器官的百万个细胞。结果显示为3至6次测定的平均值±标准偏差。天然或重组Apa诱导的T细胞应答与rAg85A免疫所诱导的那些也是可比的。在用活的牛分枝杆菌BCG体外刺激各自的肺、CLN和脾细胞培养物之后也未观察到在三种疫苗免疫的组中诱导T细胞(Th1、Th2和Th17)应答的差异，这表明三个疫苗组在结核分枝杆菌遭遇或体内实验激发之后可能诱导相似的T细胞细胞因子应答(图17和18)。在图17中，在肺、颈部淋巴结(CLN)和脾细胞培养物中免疫4周后，用牛分枝杆菌BCG体外激发之后亚单位免疫及假免疫的小鼠的肺、CLN和脾细胞培养物中分泌Th1(IFN-γ和IL-2)细胞因子的细胞的频率。在不含抗生素的情况下用活的牛分枝杆菌BCG哥本哈根CFU来刺激各自的器官细胞培养物(1∶10的比例)36小时。通过ELISPOT测定计算了分泌IFN-γ和IL-2的细胞并表示为斑点形成单位(SFU)/器官的百万个细胞。结果显示为3至6次测定的平均值±标准偏差。

对于使用本发明必要的所有试剂是从本领域已知的来源可得的，或者通过本文所述的技术或通过本领域公认的方法所容易合成的。

所引用的或本文所另外呈现的参考文献指示本发明所涉及的领域的技术水平。这些参考文献特此通过引用被并入，如同每份单独的参考文献被清楚地和单独地并入本文一样。

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Claims

1.一种疫苗，包含：Ag85A、Ag85B、MPT-64、Pst-S1、Apa、GroES、GroEL、Dnak、CFP-10、Rv0831c、Rv1324中的至少一种结核分枝杆菌多肽或其免疫原性部分、肽或表位。

2.如权利要求1所述的疫苗，其中所述多肽是重组的。

3.如权利要求1所述的疫苗，其中所述多肽是Apa。

4.如权利要求1所述的疫苗，其中所述多肽是Rv1324。

5.如权利要求1所述的疫苗，其中所述多肽是Rv0831c。

6.如权利要求1所述的疫苗，其中所述多肽还包含适合纯化的标签。

7.如权利要求1所述的疫苗，还包含佐剂。

8.如权利要求8所述的疫苗，其中所述佐剂是二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)；单磷酰脂A(MPL)；LTK63，亲脂性季铵盐-DDA，海藻糖二分枝酸酯和合成的衍生物，DDA-MPL，DDA-TDM，DDA-TDB，IC-31，铝盐，氢氧化铝，磷酸铝，磷酸铝钾，Montanide ISA-51，ISA-720，微颗粒，免疫刺激复合物，脂质体，病毒体，病毒样颗粒，CpG寡核苷酸，霍乱毒素，来自大肠杆菌的不耐热的毒素，脂蛋白，树突状细胞，IL-12，GM-CSF，说明性地包括磷酸钙纳米颗粒的纳米颗粒，用以形成纳米乳液的大豆油、乳化剂和乙醇的组合；AS04，ZADAXIN或其组合。

9.如权利要求8所述的疫苗，还包含乳化剂或成胶囊剂。

10.如权利要求10所述的疫苗，其中所述乳化剂是超分子生物载体(SMBV)、纳米颗粒、脂质体或其组合。

11.一种药物包，包含：

单独的或与BCG疫苗组合的根据权利要求1所述的疫苗；

乳化剂；和

佐剂。

12.如权利要求12所述的药物包，其中所述佐剂是二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)；单磷酰脂A(MPL)；LTK63，亲脂性季铵盐-DDA，海藻糖二分枝酸酯和合成的衍生物，DDA-MPL，DDA-TDM，DDA-TDB，IC-31，铝盐，氢氧化铝，磷酸铝，磷酸铝钾，Montanide ISA-51，ISA-720，微颗粒，免疫刺激复合物，脂质体，病毒体，病毒样颗粒，CpG寡核苷酸，霍乱毒素，来自大肠杆菌的不耐热的毒素，脂蛋白，树突状细胞，IL-12，GM-CSF，说明性地包括磷酸钙纳米颗粒的纳米颗粒，用以形成纳米乳液的大豆油、乳化剂和乙醇的组合；AS04，ZADAXIN或其组合。

13.如权利要求12所述的药物包，其中所述乳化剂是超分子生物载体(SMBV)、纳米颗粒、脂质体或其组合。

14.一种在受治疗者细胞组织中产生免疫应答的方法，包括向受治疗者施用第一疫苗，所述第一疫苗为根据权利要求1、8或10所述的疫苗。

15.如权利要求15所述的方法，还包括施用第二疫苗。

16.如权利要求16所述的方法，其中所述第二疫苗是根据权利要求1、8或10所述的疫苗、BCG或其组合。

17.如权利要求17所述的方法，其中所述第一疫苗的施用是在所述第二疫苗的施用之前。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述第一疫苗的所述施用是在所述第二疫苗的施用之后，而且所述第二疫苗是BCG。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述第一疫苗的所述施用与所述第二疫苗同时。

20.如权利要求15所述的方法，其中所述第一疫苗的所述施用是在受治疗者细胞组织暴露于结核分枝杆菌之后。