CN114404582B

CN114404582B - 通过分枝杆菌特异性免疫治疗肿瘤的方法及使用的抗原肽

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Publication number: CN114404582B
Application number: CN202111566496.5A
Authority: CN
Inventors: 邹征云; 秦岚群
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN114404582A

Abstract

本发明提供可被肿瘤细胞提呈的抗原肽在治疗癌或肿瘤中的用途。本发明提供通过抗原肽激活特异性免疫(优选地，结核分枝杆菌的预存免疫)而治疗或预防癌症或肿瘤的方法，及该方法中使用的抗原肽，及该抗原肽在制备癌症或肿瘤的治疗药物中的用途。通过预测与HLA I类分子分型亲和力筛选的一种或多种来源于结核分枝杆菌与卡介苗共有的保护性抗原的抗原肽，能够激活受试者的预存免疫，识别攻击肿瘤细胞，治疗癌及肿瘤特别是实体瘤。

Description

通过分枝杆菌特异性免疫治疗肿瘤的方法及使用的抗原肽

技术领域

本发明涉及肿瘤的免疫治疗领域。本发明提供利用细胞免疫治疗肿瘤的方法，及所述方法中使用的抗原肽。具体而言，所述方法通过使用卡介苗或源自卡介苗的抗原肽激活受试者体内的分枝杆菌特异性免疫治疗肿瘤。所述抗原肽来源于Ag85A蛋白，并且能被肿瘤细胞MHC分子有效呈递。

背景技术

近年来，免疫治疗如T细胞治疗已成为癌症治疗领域一大治疗热点。例如TCR-T、CAR-T等细胞治疗技术，通过靶向肿瘤抗原，分别在实体瘤和血液系统肿瘤中显示出强大的治疗效果。

但是TCR-T、CAR-T等细胞治疗的应用存在限制。首先，作为这些细胞疗法能够发挥疗效的前提，被治疗的实体肿瘤细胞必须高表达某种肿瘤特异性抗原，且这种抗原在肿瘤细胞上是有效呈递的。其次，由于肿瘤细胞的异质性，不是所有的肿瘤细胞均表达同一种抗原，限制了TCR-T、CAR-T等细胞治疗技术能够被应用的肿瘤(癌症)种类。治疗性细胞的有效送达率也成为问题。

此外，肿瘤细胞的表面抗原表达缺失也限制了T细胞治疗的疗效。抗原调变、抗原覆盖等现象的存在导致肿瘤细胞表面抗原表达缺失，从而使此部分肿瘤细胞不受特定T细胞的免疫监视，造成免疫逃逸。

再者，肿瘤抗原存在抗原呈递能力较差的问题。肿瘤中存在各种抗原成分，最广为人知的抗原包括肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen，TAA)，如癌胚抗原、甲胎蛋白；和肿瘤特异性抗原(Tumor-specific antigen，TSA)，如MAGE-1和NY-ESO-1。近年来，新抗原也逐渐进入肿瘤免疫治疗的视野，显示出强大的治疗效果。但上述抗原有一个共同的缺陷：抗原的疏水性较强，呈递能力弱，即使新抗原也没能被有效呈递来发挥抗肿瘤作用。因此，需要能够被肿瘤分子有效提呈的新的抗原肽。

另一方面，为了使上述细胞疗法发挥抗肿瘤作用，还需要具有治疗能力的细胞能穿透畸形复杂的肿瘤血管，抵达肿瘤实质。因此，实际上能够到达病灶起效的细胞利用率也成为问题。因此，过继性细胞治疗在实体肿瘤治疗中至今尚难以取得突破。与此同时，大部分过继性细胞治疗研究尚处于临床试验阶段，临床操作程序复杂，价格昂贵。

存在肿瘤中的被称为肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)的免疫细胞，与大多数类型癌症的更好治疗结果相关。TIL中包括了肿瘤抗原特异性T细胞，也包括很多非肿瘤抗原特异性T细胞。所述非肿瘤抗原特异性T细胞可以包括例如细菌/病毒抗原特异性的T细胞。在TIL群体中，表达细胞表面糖蛋白CD8的TIL被称为CD8+TIL，它们能够发现癌细胞表面上的肿瘤抗原并将它们破坏。因此，许多免疫治疗策略旨在激活、增强和维持这些细胞的癌症杀伤能力。但根据Evan Newell等报道，肺癌或结直肠癌患者的肿瘤中，大量的CD8+TIL细胞的特异性指向了与肿瘤无关的抗原，仅一小部分CD8+TIL细胞群体靶向的是突变相关的癌症抗原。换言之，大量CD8+TIL细胞是对肿瘤熟视无睹的“旁观者”。“旁观者”T细胞虽存在于肿瘤内，但不能发挥识别与杀伤肿瘤的作用。

因此，仍需要开发特异性好、疗效佳、安全性好且性价比高的肿瘤治疗方法。

发明内容

2020年发表在Science杂志的研究发现，几乎在所有肿瘤内均存在大量细菌(PMID:32467386)。而最近发表的一项研究表明，在黑色素瘤中，来自具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)内的HLA-I相关肽在肿瘤细胞的表面被呈递(PMID:25831525)。也就是说来自细菌的HLA-I相关肽在肿瘤细胞的表面被呈递。这些微生物对于受到它们感染的感染者具有危害。例如具核梭杆菌能够引起多种机会性感染，而头状葡萄球菌能够引起败血症。

值得注意的是，与来自同一肿瘤的肿瘤相关抗原特异性T细胞相比，在肿瘤微环境中，细菌特异性肿瘤浸润T细胞虽然不识别肿瘤抗原，但识别相应细菌抗原及进行杀伤的功能是正常的。

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin疫苗，BCG)是一种用来预防结核病(tuberculosis)的减毒活疫苗，其主要成分为牛分枝杆菌(Mycobacterium bovine)。在出生后通过皮内注射进行免疫接种，接种后可使儿童对结核病产生免疫力，可预防发生儿童结核病。目前，世界上多数国家都已将卡介苗列为计划免疫必须接种的疫苗之一。卡介苗也是我国新生儿出生后必须接种的疫苗，通常在出生后24小时内接种。卡介苗的超高接种率保证了人群中对分枝杆菌已经存在免疫的个体比例也较高。

如前所述，一方面本领域希望开发新的肿瘤治疗方法，另一方面肿瘤内存在不攻击肿瘤的“旁观者”免疫细胞。基于这些问题，针对如何动员自体的免疫系统中的“旁观者”，使其苏醒并攻击肿瘤细胞的角度进行了大量研究。

发明人发现，对于已经具有了卡介苗特异性免疫应答的肿瘤受试者，当以源自结核分枝杆菌的保护性抗原Ag85A蛋白作为抗原肽的来源，并选择其片段中包含与受试者HLAI类分子分型具有高亲和力的抗原表位的那些作为抗原肽时，通过在肿瘤内注射递送上述抗原肽，能够使肿瘤细胞被T细胞识别与杀伤。发明人通过实验证实，上述抗原肽成功地加载至肿瘤细胞表面的空MHC分子。

发明人认为由于计划免疫接种的存在，人体内普遍存在着对于卡介苗的记忆性免疫应答(预存免疫)，但是由于TCR特异性，在这种结核分枝杆菌特异性T细胞仅识别结核分枝杆菌相关表位，作为“旁观者”存在于肿瘤组织中，无法靶向肿瘤细胞进行杀伤。但是，当本发明的结核分枝杆菌抗原表位提呈到肿瘤细胞表面时，原先不被识别的肿瘤细胞变得能够被这些“旁观”的细菌特异性肿瘤浸润T细胞(具体地，肿瘤内的结核分枝杆菌抗原特异性T细胞，本发明人将其称为“BCG-特异性-CTL”(BCG-specific-CTLs))识别与杀伤，从而实现了抗肿瘤效果，由此完成了本发明。

因此，在第一方面，本发明提供了一种癌或肿瘤的治疗方法，其通过给予卡介苗或抗原肽，使肿瘤细胞表达来自结核分枝杆菌的相关表位，利用人群中广泛存在的卡介苗预存免疫识别并杀伤肿瘤细胞。

第二方面，本发明提供用于第一方面的方法的抗原肽，其源自结核分枝杆菌的Ag85A蛋白，并与受试者HLA I类分子分型具有高亲和力。

第三方面，本发明提供用于获得所述抗原肽的筛选方法。

第四方面，本发明提供卡介苗和第二方面的抗原肽在肿瘤治疗中的应用。

发明人还发现，对于体内未形成卡介苗预存免疫的受试者，例如从未接种过卡介苗的受试者，或卡介苗免疫失效的受试者，可以通过事先接种卡介苗形成免疫，即创造“预存免疫”。卡介苗的免疫接种安全性高，并且其接种方式、有效剂量和耐受剂量等接种相关知识均为公知常识。

因此，在底物方面，本发明提供使用卡介苗和第二方面的抗原肽治疗肿瘤的方法，包括接种卡介苗，和在其后一段时间接种所述抗原肽。

本发明至少具有如下的优点：

·基于肿瘤内存在大量“旁观者T细胞”无法发挥杀伤功能的缺陷，利用预存免疫，利用人体存在的对于卡介苗的记忆性免疫应答，以己之“矛”、攻己之“盾”，是一项可行且安全的肿瘤治疗策略。

·卡介苗在我国以及很多国家和地区均属于计划接种的疫苗，普及率非常高，使得本发明的方法对于这些国家公民中的大多数，都是非常便利、安全的方法。

·即使在需要先额外接种卡介苗的情况下，由于卡介苗是一种成熟疫苗，整个方案仍然具有很高的安全性和可行性。

·细菌来源的肽作为抗原肽比肿瘤相关抗原等更疏水，这一特性可能使这些肽更适合T细胞的抗原呈递和识别。

·本发明利用抗原肽激活存在于肿瘤内的自体免疫系统发挥抗肿瘤作用，由于发挥效能的细胞本身存在于肿瘤中，从而不需要穿透过程，能够避免过继性细胞治疗需要考虑的有效送达率的问题。

·通过调动免疫细胞，大大增加了发挥效能的T细胞总量，提高治疗细胞相对于肿瘤细胞的数量比例。

附图说明

图1A为受试者中存在卡介苗特异性预存免疫应答的比例。

图1B为显示结核菌素试验(PPD)结果的示意图。

图1C显示外周血单个核细胞(PBMC)与抗原肽进行体外孵育后IFN-γ的分泌水平。左侧为PPD阴性健康志愿者的PBMC，右侧为PPD强阳性健康志愿者的PBMC。

图2为抗原肽的体外功能试验。图2A为抗原肽在细胞表面提呈的激光共聚焦显微镜图像。图2B为不同浓度抗原肽与肿瘤细胞共孵育的异硫氰酸荧光素(FITC)荧光强度，及肿瘤细胞表面FITC荧光强度的经时变化。图2C显示与抗原肽共孵育后T细胞的杀伤效能的柱状图，以不加抗原肽但其他条件相同的样品为对照。

图3为注射卡介苗或者抗原肽的体内抑瘤效果。图3A显示不同处理组的肿瘤生长曲线。图3B显示不同处理组最后1天的肿瘤体积。图3C为不同处理组的小鼠生存曲线。图3D为治疗期间不同处理组的小鼠体重变化图。图3E为不同处理组的小鼠生化指标对比图。图3F为不同处理组的小鼠重要脏器的HE染色图。

图4显示小鼠肿瘤组织免疫微环境分析。图4A为不同处理组中肿瘤内不同类型的T细胞所占的比例。图4B显示不同处理组的小鼠肿瘤细胞的PD-L1表达水平。图4C显示PD-L1表达程度的对比图，左图为“卡介苗免疫-PBS组”在治疗后肿瘤细胞表面的PD-L1表达水平，右图为“卡介苗免疫-抗原肽组”在治疗后肿瘤表面的PD-L1表达水平。

图5为本发明的治疗机制示意图。

发明详述

定义

“预存免疫”一般指机体遇到抗原之前就已经具有针对该抗原的成熟的特异性抗体或特异性淋巴细胞，能快速对抗原产生抵抗。在本发明中，预存免疫特别指对特定微生物来源的抗原肽具有识别能力的淋巴细胞，如T细胞。在本发明中，特别地，提呈所述抗原肽的细胞主要为肿瘤细胞。因此，本发明所述的预存免疫例如符合以下三点：1)宿主能够特异性识别所述抗原，2)宿主的免疫系统能够攻击提呈所述抗原的细胞，3)宿主对该抗原的免疫应答属于记忆性免疫应答，例如由CD8⁺T细胞参与的记忆性免疫应答。这样的预存免疫反应的宿主例如是经历过该抗原的挑战的个体。

“免疫原性”指外来物质，如抗原，刺激机体内的免疫应答的能力。

“抗原肽”指一段具有免疫原性的多肽。因此，在本发明的上下文中，抗原肽与“免疫原性肽”可以互换使用。在本发明中，特别地，提呈所述抗原的细胞主要为肿瘤细胞。

“保护性抗原”在本发明的上下文中指来自病原体的免疫原性抗原，其能够使生物体如人产生保护性免疫如保护性抗体，从而在再次受到病原体攻击时可以免于感染。“保护性抗体”是保护性抗原的实例是包含在疫苗中或作为疫苗使用的微生物来源的抗原肽。

“裸肽”指本发明的抗原肽本身，其不与其他肽段或有功能的结构域融合、也不与其他分子缀合的状态。当存在于药物组合物中时，以裸肽形式存在的本发明的抗原肽可以以盐的形式存在，如醋酸盐。

“Ag85A”指抗原85复合物(抗原85A、B、C)中的成员抗原85A，是一种来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的分泌性蛋白，例如具有如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。Ag85A在分枝杆菌中高度保守。顾名思义，Ag85A是能够产生保护性抗体的保护性抗原。有研究认为其能够加强卡介苗的细胞免疫(H.McShane et al.,Nat Med,10(11)(2004),pp.1240-1244)。

“主要组织相容性复合体(MHC)”是脊椎动物基因组中由一组紧密连锁且多样性丰富的基因组成的基因座，其编码对于免疫系统至关重要的细胞表面蛋白，即MHC分子。人体内的MHC也称作“人类白细胞抗原(HLA)复合物”，或简称为“HLA”，其位于6号染色体上的一段区域中。HLA基因复合物包括I类、II类和III类，其中主要由I类和II类编码的HLA分子参与抗原呈递和免疫应答。经典的I类HLA基因座为A、B和C，非经典I类基因座为E、F、G。II类HLA基因座包括DR、DQ、DP等基因座。每个基因座又包括多种不同的等位基因类型。根据IMGT数据库中登记的数据，I类HLA的等位基因数超过一万九千种，II类HLA的等位基因数超过七千种。尽管总数非常庞大，但很大一部分出现概率都非常低，例如仅在少数一两个个体中有所报道。在本发明的上下文中，在笼统地提到“MHC”时，既包含非人动物的MHC，如小鼠的MHC，也包含人的“HLA”，除非明确通过修饰词限定了所提及的MHC的来源物种。

“抗原呈递”指细胞内将抗原加工成肽段并以T细胞(具体而言T细胞受体，即TCR)能够识别的方式展示到细胞表面的过程。

“抗原呈递细胞”是指可以进行抗原提呈的细胞。抗原呈递细胞例如包括树突状细胞、B细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞。在本发明中，抗原是来自微生物的抗原性多肽，抗原提呈细胞是肿瘤细胞。

“免疫应答”指机体受抗原刺激后，免疫细胞对抗原分子识别、活化、增殖和分化，产生免疫物质发生特异性免疫效应的过程。

“记忆性免疫应答”指机体在对某一抗原产生特异性识别及应答的同时，记住该抗原，当再次遭遇同一抗原时，能发生快速和强烈的免疫应答。

“‘旁观者’免疫细胞”在本文的上下文中指本身具有肿瘤细胞杀伤功能且存在于肿瘤细胞附近，如存在于肿瘤中，但并未针对肿瘤细胞发挥杀伤功能的免疫细胞，如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，如CD8+TIL细胞。

“卡介苗(BCG Vaccine)”在本发明中以其最广的意义使用，即，为包含减毒牛型分枝杆菌(bovine Mycobacterium)或牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)活菌的剂，包括由减毒牛型分枝杆菌制成的免疫用或治疗用的活菌悬浮液，也包括粉剂，由粉剂制备而成的溶液，悬浮液等。卡介苗主要通过细胞免疫保护接种者免于结核分枝杆菌的感染。

“结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)”也可称为结核杆菌(tuberclebacilli)。结核分枝杆菌是人类结核病的致病菌。与牛型分枝杆菌同属分枝杆菌属。

“受试者”在本发明中指接受施用的动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，如啮齿动物，例如小鼠、大鼠；灵长类动物，例如猴；最优选人。

“肿瘤”以其最宽的含义理解，指非正常过度生长的组织，与“新生物”同义。“癌”或“癌症”指恶性肿瘤。

具体实施方式

抗原肽的来源

在本发明中，通过施用抗原肽调动“旁观者”免疫细胞来杀伤肿瘤细胞。为了利用个体体内的预存免疫，抗原肽优选是能够被构成预存免疫的抗体和/或T细胞所识别的抗原肽，所述预存免疫一般而言是通过疫苗接种获得的预存保护性免疫。

在具体的实施方案中，对于接种过卡介苗(BCG)的个体而言，体内存在预存免疫。由于卡介苗的保护作用主要依赖于细胞免疫，所以该预存免疫主要依赖于能够特异性识别并攻击结核分枝杆菌的免疫细胞。因此，在这个具体的实施方案中，所述抗原肽是能够被识别并攻击结核分枝杆菌的免疫细胞所识别的抗原肽。

在一个实施方式中，本发明的抗原肽是来自分枝杆菌属的保护性抗原，如Ag85A蛋白。优选地，所述抗原肽是来自于结核分枝杆菌或卡介苗的保护性抗原肽，如Ag85A蛋白，更优选是来自结核分枝杆菌的保护性抗原肽，如结核分枝杆菌Ag85A蛋白。Ag85A肽在结核杆菌中非常保守，因此来自结核分枝杆菌或卡介苗(牛型分枝杆菌)的Ag85A肽具有相同的氨基酸序列。

所述抗原肽可以是所述保护性抗原肽的片段，例如所述Ag85A蛋白的片段。所述抗原肽的长度可以为8～17个，8～15个，8～13个，8～10个氨基酸或更长，例如8、9、10、11、12或13个氨基酸长。例如，所述抗原肽是Ag85A蛋白的多肽片段，其长度为8～17个，8～15个，8～13个，8～10个氨基酸或更长，例如8、9、10、11、12或13个氨基酸。

所述抗原肽的重要特征之一是能够被预存免疫中的T细胞所识别。因此，在一个实施方案中，源自Ag85A蛋白的所述抗原肽包含一个或多个能够被预存免疫所涉及的T细胞识别的表位。在另一个实施方案中，同时使用超过一个，例如两个或多个针对不同表位的抗原肽。

所述抗原肽的另一个特征是能够被感兴趣的细胞如肿瘤细胞呈递。因此，在一个实施方案中，所述抗原肽与所述肿瘤细胞的MHC分型(包括I类MHC和/或II类MHC)如HLA分型相匹配，特别是与I类HLA分型相匹配。具体通过预测表位来筛选抗原肽的方法在接下来的段落中进行详细描述。

根据HLA I类分子预测表位并筛选抗原肽的方法

本发明选择抗原肽的标准之一是其能够被HLA呈递。也就是说，抗原肽需要与受试者中特定分型的HLA具有足够的亲和力。受试者的HLA分型会影响抗原肽的选择。本发明特别关注I类HLA的分型，特别是I类HLA分子的基因座A的分型。

在HLA分型中，HLA等位基因通常以一个包括至少四位数字的分类代码表示，例如，HLA-A*0210，其中HLA-A代表基因座，02代表以血清型分类的等位基因小类，10代表产生的具体蛋白质类型。

在一个实施方式中，在确定了待接受治疗的受试者的HLA I类分子表位后，可以按照例如以下方法根据HLA I类分子表位预测并筛选抗原肽。当受试者为非人动物时，根据其MHC I类分子和/或MHC II类分子表位预测并筛选抗原肽。

在无法实现针对每位受试者的个性化HLA分型进行筛选时，优选选择在人群中高频存在的HLA I类分子分型。可以针对不同的人群调整作为筛选基础的HLA I类分子的分型。在具体的实施方案中，以HLA-A2型(即HLA-A*02:n分型)作为筛选抗原肽的HLA分型。例如，可以以HLA-A*02:01分型作为HLA-A2型的代表筛选抗原肽的HLA分型。这是因为发明人发现同一抗原肽往往与同一等位基因小类的HLA分型表现出相似的亲和力。例如，发现HLA-1*02:01位点和HLA-A*02:06位点对于筛选的抗原肽存在着相似的亲和力，因此推测HLA-A2型的其他具体分型对于这些抗原肽很可能也都会显示出较强的亲和力。因此，通过某一等位基因小类(如HLA-A2)中的一个代表性蛋白质类型(如HLA-A*02:01)筛选出的抗原肽可扩展至适用于具有HLA-A2等位基因小类中任何蛋白质类型的受试者，包括所述用于筛选的代表分型和其他不同的具体分型。

用于预测抗原肽是否能够被特定分型的HLA或MHC呈递的方法是本领域技术人员已知的。

在一个实施方式中，以个体具有HLA-A*02:01分型为例，用以下四个网站预测了结核杆菌和卡介苗共有的保护性抗原Ag85A蛋白与HLA-A*02:01位点亲和力的抗原肽，优选将各软件的结果合并分析，筛选在所有软件中都显示具有强亲和的抗原肽。

可使用的预测网站网址分别为：

NetMHCpan(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)

IEDB(http://tools.iedb.org/mhci/)

SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)

NetCTL(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)。

具体地，NetMHC 4.0server能预测肽段与人类HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-E类别的MHC分子的结合情况。登录该软件，提交Ag85A蛋白氨基酸序列。HLA分子倾向于和8～15，优选为8～10，更优选为9个氨基酸的肽段结合，此处可以限定肽链长度为8～15，优选为8～10中的几个或几个整数值，优选为9个氨基酸，并选择HLA-A*02:01(A2)分子进行预测分析。分析结果根据亲和值的大小来判断，找出强结合与弱结合的肽段。

SYFPEITHI软件是MHC的数据库，它能分析输入的肽段，如源自Ag85A的肽段，与指定类型的MHC分子的结合强度情况。登录该软件，选择HLA-A*02:01类型，限定肽链长度为9，提交Ag85A蛋白的氨基酸序列，选择结果得分在前2％的序列。

NetCTL1.2Server能同时预测抗原肽段与MHC I类的结合情况，切断抗原羧基端的蛋白酶体以及抗原加工与转运的速率，并综合三者的得分。登录软件，提交Ag85A蛋白的氨基酸序列，选择A2超类型，将参数“Weight on C terminal cleavage(C末端切割权重)”设置为0.15，将参数“Weight on TAP transport efficiency(TAP转导效率权重)”设置为0.05，将参数“Threshold for epitope identification(表位鉴定阈值)”设置为0.05。预测结果为上述三者得分的加权和，综合得分的高低反映灵敏度或特异性的高低，之后再对预测出的含9个氨基酸且得分在0.75以上的肽段进行分析。

IEDB可通过判断其与MHC结合能力、与MHC加工相关性、结合后免疫原性来实现，预测抗原肽与MHC的亲和力，登录该软件，选择HLA-A*02:01类型，提交Ag85A蛋白的氨基酸序列，提高后选择排名前列的抗原肽。

本领域技术人员应该知道，这样的方法可以同样适用于其他HLA I类分子，获得来源于Ag85A蛋白的相应的抗原肽序列。

需要说明的是，筛选得到的来源于Ag85A蛋白的抗原肽对于亚群相同或分类近似的HLA I类分子也具有一定的适用性。本发明人通过试验发现，本发明的抗原肽K242V250和抗原肽G48V56不仅对于HLA-A*02:01分型的有效，也对HLA-A*02:01至HLA-A*02:06的分型具有抗肿瘤效果，进一步，对HLA-A2整个亚群是有效的。因此，应理解，本发明的抗原肽的治疗范围并非仅对应于在其筛选时使用的HLA I类分子的最小分类。

在一个实施方式中，在应用本发明的治疗方法治疗罹患癌症或肿瘤的受试者时，除了使本发明的抗原肽在体内被肿瘤细胞提呈而使用自身免疫系统的T细胞外，为了增加对这样的抗原肽应答的T细胞，还可以与回输TIL细胞的方法组合使用。优选地，所述回输的TIL细胞为分离自患者的细胞或其后代细胞，并包含对本发明的抗原肽特异性应答的细胞，优选对本发明的抗原肽特异性应答的细胞占多数。

抗原肽的制备和纯化

在一个实施方式中，制备上述抗原肽的方法包括根据预先确定的氨基酸序列进行合成。合成并经鉴定的抗原肽可以进一步进行纯化、冻干、纯度检测等处理中的一种或多种。

在一个实施方式中，制备上述抗原肽-抗体融合肽，抗原肽-接头-抗体融合肽的方法包括合成编码融合肽全长的核苷酸序列，在表达系统中进行表达，或合成上述融合肽的多个部分后，分别将各部分进行表达并进行连接。本领域中，这样的方法的具体步骤，方法和能够使用的合适表达载体是已知的。

以下示出制备和纯化抗原肽的一个实施方式。

1、根据抗原肽的氨基酸序列合成抗原肽，合成顺序：从C端到N端。

2、称取100mmol当量的树脂放入反应器中，加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉DCM。加入序列中第一个氨基酸(100mmol)，200mmol的DIEA(二异丙基乙胺)，适量的DMF(二甲基甲酰胺)、DCM溶液(适量是指以可使树脂充分鼓动起来)，用氮气鼓泡反应60min。然后加入约500×100mmol当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净。

3、加入适量20％哌啶/DMF去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，检测试剂检测。

4、往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为200mmol)，200mmol HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)及DIEA，氮气鼓泡反应半小时，抽掉液体，用DMF,DCM洗净，茚三酮检测。

5、依步骤3、4的方式依次加入序列中氨基酸.抽掉液体，用DMF洗净，检测试剂检测。

6、将树脂用氮气吹干后，从反应柱中取下并称取重量，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量的95％TFA(三氟乙酸)切割液，震荡反应2h，目的是将多肽从树脂载体上裂解下来并去除氨基酸的侧链保护基团。

7、滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到该序列的粗产物。

8、分析提纯和质谱检测：用ESI(电喷雾电离)离子源质谱仪检测该序列分子量的正确性，用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。

9、收集纯化好的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

抗原肽-抗体融合肽(抗体介导的抗原肽递送)

本发明的抗原肽也可以通过能够特异性识别肿瘤细胞表面抗原的抗体来递送到肿瘤细胞处。

作为本发明可使用的抗原肽-抗体融合肽，可将抗原肽与靶向肿瘤细胞的抗体(可举例利妥昔单抗、西妥昔单抗)相连。为了方便融合，所述抗体优选是单链抗体。

任选地，所述抗原肽和抗体可通过接头序列连接，形成抗原肽-接头序列-抗体融合肽。

所述接头序列可以是酶切位点序列，例如MMP酶可识别序列。这样的融合肽可以通过抗体的肿瘤靶向作用到达肿瘤区域，随后由肿瘤内分泌的酶(可举例MMP酶)识别融合蛋白中的酶切位点，从而使抗原肽与抗体分离，并掉落在肿瘤细胞表面空的MHC分子上(例如，参考在2020年发表在Nature Biotechnology的研究[PMID:32042168])。

只要是可以将抗原肽靶向递送至肿瘤中的抗体介导的抗原肽递送形式，均可用于本发明的抗原肽和癌症或肿瘤的治疗方法中。

卡介苗

本发明的受试者优选接种过卡介苗。对于没有接种过卡介苗的受试者，则需要在使用本发明的抗原肽前先为其接种卡介苗。

本发明的卡介苗可以包括具有不同遗传背景的牛型分枝杆菌菌株(strain)。在优选的实施方案中，本发明所述的卡介苗是那些已经被用作疫苗的牛型分枝杆菌菌株，包括但不限于：BCG China(BCG Shanghai),BCG Tokyo(BCG Japan),BCG Pasteur,BCG Tice,BCG Danish(BCG Denmark/BCG SSI 1331)或BCG Prague。

考虑到本发明实施的便利性时，则优选所述卡介苗是按照该受试者所在国家或地区的相关规定要求公众接种的卡介苗。因此，在优选的实施方案中，所述卡介苗是卡介苗中国型。

在一些实施方案中，本发明的卡介苗可以是重组卡介苗，即通过分子生物学方法改造从而相对于野生型卡介苗表达不同的蛋白质或以不同水平表达特定蛋白质的卡介苗。重组卡介苗可能能够实现比传统卡介苗更强力的保护。由于本发明涉及使用源自Ag85A的抗原肽，使用过表达Ag85A的重组卡介苗可能是更加优选的。

药物组合物

在一个实施方式中，本发明的药物组合物包含上述分离的抗原肽。所述分离的抗原肽可以以抗原肽裸肽形式存在，或作为包含于多个抗原肽的含有酶切位点的融合肽、抗原肽-抗体融合肽、抗原肽-酶切位点序列-抗体融合肽、抗原肽-纳米材料(优选为DSPE-PEG)或纳米颗粒(可举例脂质纳米粒子(lipidnanoparticle,LNP))中的形式。这些抗原肽形式中，可以包含一种抗原肽或多种抗原肽，从可在肿瘤细胞表面提呈更多抗原表位的角度，优选包含多种抗原肽。

在一个实施方式中，所述药物组合物中可以包含药学上允许的材料。作为药学上允许的材料，可列举例如：赋形剂，如灭菌水、生理盐水、非水溶剂、惰性粉末，缓冲剂，表面活性剂，螯合剂(EDTA等)，稳定剂，防腐剂，稀释剂，填充剂，添加剂，崩解剂，粘合剂，包覆剂，润滑剂，调味剂，甜味剂，增溶剂，香味剂。

在抗原肽以裸肽施用的情况下，可以将其以醋酸盐形式施用。用于溶解抗原肽的溶剂例如可以为抑菌注射用水(BWFI)，生理盐水，磷酸缓冲生理盐水，林格氏液，及葡萄糖溶液等药学上允许的水性载剂或缓冲液。为了分散良好，也可以优选先使用适量油性溶剂溶解再加入水性溶液中。例如，可用适量(例如50ul)DMSO溶解抗原肽，之后溶解于氯化钠注射液中，直接进行后续使用。当使用DMSO时，可使得DMSO终浓度低于0.05％，此浓度下细胞活性及状态不受影响。优选使用在其中抗原肽的溶解度更高，和/或注射该溶剂时引发的局部副作用(例如疼痛，给药部位的发红及硬化)更小的那些溶剂。作为溶剂可以含有多种成分。

本发明的抗原肽和药物组合物能够为液体或固体(包括胶囊包封体，琼脂状，粉末状等)，也可以为它们的冷冻体，冷冻干燥体。状态可以为安瓿状，胶囊状，粉末状，颗粒状，丸剂，片剂状，固态状，液态，凝胶态，气泡状，乳汁液态，乳膏状，软膏状，片状，慕斯状。本发明抗原肽及药物组合物也可以包含于胶体状药品递送系统(例如：脂质体，白蛋白小球体，微乳液，纳米粒子，及纳米胶囊)中，也可以包含于粗滴乳液中。

给药方式

作为本发明的抗原肽和药物组合物的施用方式，可以为针对病灶或病灶周围的局部施用，或通过靶向技术如静脉注射等全身性地递送，使得所述分离的抗原肽在体内(例如，可经过酶切，生物修饰等生物作用)最终以能够被肿瘤细胞的MHC提呈的形态集中于病灶。所述局部施用优选为注射，可以为皮下注射或瘤内注射，优选为瘤内注射。

作为给药剂量，可以根据给药方式，受试者的病情等而进行调整。目前没有文献报道瘤内注射抗原肽应用于人体的实例，报道的抗原肽大多以皮下注射作为疫苗使用。例如在日本有关GPC3系列研究(PMID31024850)中，I期临床研究通过剂量递增试验确定的最佳皮下注射剂量为3mg。同时该研究也提到，因溶剂体积而限制了剂量最大化。

在临床施用过程中，当进行病灶施用例如瘤内注射时，最大剂量受到溶解度和最大施用体积的限制。这是因为肿瘤是实质性的，瘤体内注射需要很费力，若注射过大剂量，则会引起疼痛、给药部位的发红及硬化。

作为本发明的抗原肽及片段的施用剂量，在保证安全性的前提下，一般而言剂量越大则效果越好。施用剂量也与目标肿瘤的大小相关，更大的肿瘤需要更高的剂量。抗原肽在溶剂中的溶解度会对最高剂量产生限制。

作为对人体施用的剂量，例如使用含有DMSO的溶剂时，可采用例如2-4mg抗原肽/病灶/次的剂量进行施用，例如，可以以100～200ul体积抗原肽的DMSO溶液/病灶/次的量进行施用。前述抗原肽的量以裸肽或其盐的量为准。当以融合肽的形式施用时，本领域技术人员能够理解需要相应地增加施用量。

需要说明的是，在使用与DMSO相比抗原肽在其中溶解度更高的溶剂，和/或注射该溶剂时引发的局部副作用(例如疼痛，给药部位的发红及硬化)更小时，上述单次剂量可相应地增大。为了更好的治疗或预防效果，这样的施用是优选的。作为这样的溶剂，可以是多种成分的混合。

本发明的抗原肽可以单次施用，或多次施用。与单次大剂量注射相比，更优选反复多次在肿瘤不同部位注射。

作为在本发明的癌症或肿瘤的治疗方法中使用的卡介苗的施用方式，可以与卡介苗作为疫苗的免疫接种相同。可以参考卡介苗疫苗制造商的说明，根据常用的卡介苗免疫剂量和部位进行。具体地，可参照例如“皮内注射用卡介苗”成都生物制品研究所有限责任公司所附的说明书对受试者进行免疫。

作为卡介苗的使用剂量，在用于本发明诱导产生卡介苗特异性免疫应答时，可以使用通常用于进行免疫接种的剂量范围(例如，按活菌数/kg体重换算)。

在本发明的一个实施方式中，包括使用所述抗原肽或卡介苗进行瘤内多点注射来治疗癌症及相关疾病特别是实体瘤。

在优选的实施方案中，优选在卡介苗施用后至少2周，优选至少3周，更优选至少4周施用本发明的抗原肽。在这样的实施方案中，在施用本发明的抗原肽前，需要进行PPD试验并获得阳性结果，以确认卡介苗的免疫。

受试者

受试者在本发明中指动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，如啮齿动物，例如小鼠、大鼠；灵长类动物，例如猴；最优选人。

在一些实施方案中，本发明的受试者预存对抗细菌特别是结核分枝杆菌的免疫力，具有“结核分枝杆菌特异性免疫应答”，即，受试者体内具有对于结核分枝杆菌具有特异性的免疫细胞。优选为对结核分枝杆菌具有特异性的预存免疫，这种预存的免疫力可以通过，先前的细菌感染或被动感染或主动接种疫苗，例如卡介苗获得。

在一个实施方式中，所述受试者中预存的结核分枝杆菌特异性免疫应答不限于通过基于减毒牛型结核杆菌的接种而获得，也可以因感染过结核相关疾病所自然获得，或通过经遗传修饰改造的重组牛型或其他型分枝杆菌获得，或通过能够表达结核分枝杆菌特异性抗原位点的肽，或通过递送或含有这些肽的编码序列的载体等实现。

结核分枝杆菌特异性免疫应答的判定

某位受试者是否存在针对结核分枝杆菌的保护性免疫可以通过已知的方法来检测。

PPD试验(结核菌素试验)是检测体内是否存在针对结核分枝杆菌的免疫力的常用方法。在本发明的一个实施方式中，在进行本发明的治疗之前，可以通过PPD试验来检查受试者是否具有结核分枝杆菌特异性免疫应答。

本领域技术人员能够理解检测预存免疫的方法并不限于此。例如，也可以通过检测受试者体内是否具有相关的结核分枝杆菌特异性T细胞类群来判定。

在本发明的一个优选的实施方案中，在通过本发明的抗原肽进行治疗之前，所述受试者进行PPD试验并呈现阳性结果。在本发明的一个实施方式中，当受试者被检测为PPD阴性时，对受试者补行接种卡介苗免疫，在接种约20天或更长后重新进行PPD试验，当PPD为阳性时，判定为受试者已具有结核分枝杆菌特异性免疫应答，能够接受基于本发明的抗原肽的治疗。

癌症的治疗

本发明的方法具有普适性，作为能够治疗的癌症的类型，可以列举以下这些。

例如本发明抗原肽及癌症和肿瘤的治疗方法可以应用于实体性病灶的癌症和肿瘤例如实体瘤，包括但不限于乳腺癌，宫颈癌，睾丸癌，卵巢癌，卵管癌，子宫癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，宫颈癌，肺癌，气管癌，横纹肌肉瘤，小细胞肺肿瘤，肾癌，膀胱癌，肾上腺皮质癌，生殖泌尿道癌，胆道癌，小肠癌，唾液腺癌，食管癌，胃癌，胰腺癌，结肠癌，直肠癌，胃肠道间质瘤(GIST)，恶性胰腺胰岛素瘤(insulanoma)，恶性类癌瘤，脾癌，肠癌，头颈部癌，鼻咽癌，脑癌，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，神经母细胞瘤，淋巴瘤，甲状腺癌，葡萄膜黑色素瘤，畸胎癌，成神经细胞瘤，神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，角化棘皮瘤，视网膜癌，肝癌，皮肤癌，神经内分泌癌，间皮瘤，血管肉瘤，卡波西肉瘤，类癌瘤，腹膜癌，纤维肉瘤，横纹肌肉瘤，骨癌，骨软组织肿瘤、黑色素瘤，肌层浸润癌，表皮癌。这其中，优选为黑色素瘤(因为该瘤种常存在体表可注射病灶)。

在优选的实施方案中，所述肿瘤为实体瘤。

与其他抗癌疗法、药物的联用

1、与免疫检查点抑制剂联用

在对小鼠肿瘤微环境进行分析时，我们发现，免疫组小鼠肿瘤细胞中的PD-L1表达显著上调，并且存在着治疗效果越好，PD-L1表达越高的趋势，鉴于免疫检查点作用原理，此种治疗模式可与PD-1单抗进行联合。原理上而言，通过解除肿瘤局部免疫负性微环境，可以最大化T细胞的杀伤效能。

2、与过继性T细胞治疗(ACT)联合

对于ACT而言，肿瘤细胞表面抗原表达限制其疗效，故此种抗原递送策略也可以适用。例如，递送特定TCR-T可识别的抗原至肿瘤区域，从而增加TCR-T细胞可识别与杀伤的靶细胞。

3、以原位疫苗的形式与其他治疗方法联合

瘤内注射高亲和力抗原肽可使T细胞可识别与杀伤靶细胞增加，从而导致更多的肿瘤细胞死亡，释放更多的肿瘤抗原，使肿瘤局部免疫微环境转变为利于肿瘤免疫治疗的“热肿瘤”，可与其他免疫治疗策略联合。

4、与TIL治疗方法联合

也可以为了增加对抗原肽应答的T细胞而与回输TIL细胞的治疗方法组合使用。回输的TIL细胞为分离自患者的细胞或其经体外培养的后代细胞，并优选包含对本发明的抗原肽特异性应答的细胞。优选地，对本发明的抗原肽特异性应答的细胞占回输的细胞中的多数。

本发明还涉及以下各项：

1.抗原肽在制备用于治疗受试者中的癌症或肿瘤的药物中的用途，

所述抗原肽包含来自微生物的氨基酸序列并且与所述受试者的MHC分子的分型具有高亲和性，

所述氨基酸序列对所述受试者具有免疫原性，并且所述受试者对所述微生物具有预存免疫，所述预存免疫包括特异性识别微生物的所述氨基酸序列的能力。

2.根据项1所述的用途，其中所述微生物为结核分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌。

3.根据项2所述的用途，其中所述氨基酸序列来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)Ag85A蛋白(序列示于SEQ ID No:3)，所述抗原肽具有8-15个，优选为8～10个氨基酸残基。

4.根据项3所述的用途，其中所述受试者为人，并且所述MHC I类分子的分型为HLA-A2，更优选为HLA-A*02:01～HLA-A*02:06。

5.根据项1～4所述的用途，其中所述氨基酸序列为示于SEQ ID No:1的氨基酸序列G48V56，或示于SEQ ID No:2的氨基酸序列K242V250。

6.癌症或肿瘤的治疗方法，包括使用结核分枝杆菌或抗原肽激活罹患癌或肿瘤的受试者的结核分枝杆菌特异性免疫，

其中，所述抗原肽包含具有来自结核分枝杆菌的蛋白的氨基酸序列并与受试者的HLA I类分子的分型具有高亲和性。

7.根据项6所述的方法，其中结核分枝杆菌特异性免疫为结核分枝杆菌预存免疫。

8.根据项6所述的方法，其进一步包括对所述受试者进行结核分枝杆菌挑战而使其获得结核分枝杆菌特异性免疫。

9.根据项8所述的方法，其中，所述结核分枝杆菌挑战通过给予牛分枝杆菌，优选为卡介苗进行。

10.根据项6～9中任一项所述的方法，其中，所述抗原肽的长度为8～15个，优选为8～10个氨基酸残基。

11.根据项10所述的方法，受试者为灵长类(例如，人)，所述结核分枝杆菌为牛分枝杆菌，所述蛋白为牛分枝杆菌Ag85A蛋白(示于SEQ ID No:3)。

12.根据项10所述的方法，受试者为啮齿类(例如大鼠，小鼠)，所述抗原肽为示于SEQ ID No:4的鼠抗原短肽序列，和/或示于SEQ ID No:5的鼠抗原长肽序列。

13.根据项6～11所述的方法，其中，当所述HLA I类分子的分型为HLA-A2，更优选为HLA-A*02:01～HLA-A*02:06时，所述抗原肽包含示于SEQ ID No:1的氨基酸序列G48V56，或示于SEQ ID No:2的氨基酸序列K242V250。

14.根据项6～11,13中任一项所述的方法，其中，具有结核分枝杆菌特异性免疫应答的指标为PPD试验阳性，和/或存在卡介苗特异性CD8阳性细胞毒性T细胞。

15.根据项6～11,13中任一项所述的方法，其进一步包括将在体外培养的受试者的TIL细胞回输于受试者，优选所述TIL细胞中包含对结核分枝杆菌特异性免疫应答的细胞。

16.分离的抗原肽，其包含源自结核分枝杆菌属细菌的蛋白的片段并与MHC I类分子具有高亲和力，所述片段的长度为8～15个，优选为8～10个氨基酸；优选地，所述片段包含来自分枝杆菌属细菌的蛋白的抗原性表位。

17.根据项16所述的抗原肽，其中，所述结核分枝杆菌属细菌为牛分枝杆菌，所述人MHC I类分子为HLA-A2。

18.根据项17所述的抗原肽，其中，所述源自结核分枝杆菌属细菌的蛋白为Ag85A蛋白，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

19.根据项16～18中任一项所述的抗原肽，其包含如SEQ ID No:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。

20.根据项16所述的抗原肽，其包含如SEQ ID No:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成。

21.分离的核苷酸序列，其编码上述抗原肽。

22.表达构建体，其包含上述分离的核苷酸序列。

23.药物组合物，其包含上述分离的抗原肽，所述分离的抗原肽以裸肽形式存在，或为包含于多个抗原肽的含有酶切位点的融合肽，抗原肽-抗体融合肽，抗原肽-酶切位点序列-抗体融合肽，抗原肽-纳米材料(优选为DSPE-PEG)或纳米颗粒中的形式，

任选地，所述药物组合物中包含药学上可接受的载体。

24.根据项23所述的药物组合物，其中，抗原肽在以裸肽形式存在时为其醋酸盐形式。

25.根据项23所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒进一步包含包裹所述抗原肽的脂质外壳。

26.卡介苗，项16～20中任一项的抗原肽，或项23～11中任一项的药物组合物在制备用于在受试者中治疗或预防癌症的药物中的用途。

27.根据项26的用途，其中所述受试者的PPD试验呈阳性，和/或存在卡介苗特异性CD8阳性细胞毒性T细胞。

28.根据项27的用途，其中所述受试者经过结核分枝杆菌挑战或经历过结核分枝杆菌感染。

29.上述26～28中任一项所述的用途，其中当所述抗原肽以裸肽形式存在或为包含于多个抗原肽的含有酶切位点的融合肽时，所述施用为局部施用，优选为肿瘤内或邻近组织的注射，

当所述分离的抗原肽为包含于抗原肽-抗体融合肽，抗原肽-酶切位点序列-抗体融合肽，抗原肽-纳米材料(优选为DSPE-PEG)或纳米颗粒中的形式时，所述施用为局部施用或全身施用，所述全身施用优选通过静脉输注递送。

30.上述用途，其中抗原肽的施用浓度范围为以抗原肽计2～4mg/病灶/次。

31.药物组合，包含上述抗原肽和另一种肿瘤治疗剂。

32.上述药物组合，其中所述肿瘤治疗剂为抗体。

33.上述药物组合，其中所述肿瘤治疗剂为针对免疫检查点的抗体。

34.上述药物组合，其中所述免疫检查点选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIM3、LAG3、TIGIT、BTLA、VISTA。

35.癌症或肿瘤的治疗方法，包括以下步骤：

1)测定受试者的HLA I类分子的分型；

2)对受试者进行PDD试验，

当PDD试验为阳性时，判定该受试者符合抗原肽治疗要求；

当PDD试验为阴性时，对该受试者进行卡介苗免疫，重新进行PDD试验，直至PDD试验为阳性时，判定该受试者符合抗原肽治疗要求；

3)根据受试者HLA I类分子的分型，用软件筛选结核分枝杆菌Ag85A蛋白(示于SEQID NO:3)序列中具有8～15个，优选为8～10个氨基酸残基，并与受试者HLA I类分子的分型具有高亲和力的序列，将筛选得到的序列作为抗原肽的序列，对被判定为符合抗原肽治疗要求的受试者给予所述抗原肽。

36.项35所述的治疗方法，其中，当3)中的受试者HLA I类分子的分型为HLA-A2，优选为HLA-A*02:01～HLA-A*02:06时，所述抗原肽为抗原肽G48V250(SEQ ID NO:1)和/或抗原肽K242V250(SEQ ID NO:2)。

37.项35或36所述的治疗方法，其中，被给予的抗原肽的形式为裸肽，多个抗原肽的含有酶切位点序列的融合肽，抗原肽-抗体融合肽，抗原肽-酶切位点序列-抗体融合肽，或抗原肽-纳米材料(优选为DSPE-PEG)。

38.项37所述的治疗方法，其中，所述软件为选自由NetMHCpan(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)，IEDB

(http://tools.iedb.org/mhci/)，

SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和NetCTL(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)组成的组中的至少一种，优选为三种，更优选为四种。

39.筛选用于癌症或肿瘤治疗的抗原肽的方法，包括单独进行下列项中的一种操作，或组合进行下列项中的多种：

1)使用NetMHC 4.0server预测Ag85A蛋白氨基酸序列中肽链长度为8～15，优选为8～10个，9～10个，更优选为9个氨基酸的肽段与受试者的HLA分型类别的MHC分子的结合情况，根据亲和值的大小筛选出强结合的肽段；

2)使用SYFPEITHI软件预测Ag85A蛋白氨基酸序列中肽链长度为8～15，优选为8～10个，更优选为9个氨基酸的肽段与受试者的HLA分型类别的MHC分子的结合情况，选择结合强度得分在前2％的序列；

3)使用NetCTL1.2Server软件预测Ag85A蛋白氨基酸序列与受试者的HLA分型类别的MHCⅠ类分子的结合情况，切断抗原羧基端的蛋白酶体以及抗原加工与转运的速率，选择三者的综合得分在0.75以上且肽链长度为8～15，优选为8～10个，更优选为9个氨基酸的肽段；

4)使用IEDB选择与受试者的HLA分型类别MHC的亲和力排名前列且肽链长度为8～15，优选为8～10个，更优选为9个氨基酸的肽段。

实施例

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1.人群中卡介苗的记忆性免疫应答的存在率

在本实施例中，发明人首先通过对健康志愿者进行PPD试验(结核菌素试验)检查了人群中卡介苗的记忆性免疫应答的存在率。

随机选定了15名健康志愿者进行了PPD试验，具体操作如下。

1.1PPD试验

取受试者左臂屈侧中部皮肤无瘢痕部位，吸取结核菌素纯蛋白衍化物(TB-PPD，北京祥瑞生物制品有限公司)0.1ml进行皮内注射，使得形成6～8mm大小圆形皮丘，观察接种者有无不良反应，如出现晕倒昏厥等严重不良反应则暂停试验。无严重不良反应者在注射后72小时由有经验的医师观察判读结果(示于图1A)。

PPD判读标准：

(1)“+”：红晕、硬结直径5～9mm。

(2)“++”：红晕、硬结直径10～19mm。

(3)“+++”：红晕、硬结直径大于20mm。

(4)“++++”：出现红晕、硬肿等局部症状，还出现疱疹、坏死、发热等全身症状。

将“+”～“++++”作为PPD阳性结果。皮肤无红晕及硬结，或者红晕或硬结直径小于5mm判定为阴性结果。将结果示于图1A。

结果显示：15例健康志愿者行PPD试验时，阳性率达67％(图1A)，表明人群中具有卡介苗特异性免疫应答的比例较高。

实施例2.HLA分型和抗原肽筛选

2.1 HLA-A分型

对受试者进行HLA I类分子基因座A的分型(简称HLA-A分型)，将检测出的HLA分型数据用于后续的抗原肽筛选。

通过抗凝管获得了61名受试者的外周血1～2mL，分别以红细胞裂解法提取PBMCs。利用荧光标记的HLA-A2抗体(PE anti-human HLA-A2 Antibody from Biolegend,cat#343305)对上述PBMCs进行细胞染色，染色30分钟后利用流式细胞技术检测了HLA分型。部分受试者利用抗凝管抽外周血1～2mL送公司(北京博奥医学检验所)检测具体HLA I类分子亚型。

细胞染色步骤如下。将细胞调整至约10⁶个细胞/ml的浓度，取100ul细胞悬液，加入1ul HLA-A2抗体，混合均匀后避光4℃共孵育30分钟，加入PBS清洗多余的抗体，流式上机。

结果显示，在61名受试者中，被检测为HLA-A*02:01的有14名受试者，其中，病人10例，健康志愿者4人。对这14名受试者进行后续试验。

2.2使用软件预测抗原肽

由于HLA-A*02:01为人群中占比较多的HLA-A分型，因此选择HLA-A*02:01位点，通过软件(NetMHCpan、IEDB、SYFPEITHI、NetCTL)预测了卡介苗Ag85A蛋白中对于HLA-A*02:01具有高亲和力的肽段作为抗原肽，具体操作如下。

A.获得Ag85A蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID No:3所示。

B.利用软件NetMHCpan、IEDB、SYFPEITHI、NetCTL预测了Ag85A的氨基酸序列中与HLA特定分型，即HLA-A*02:01分子具有高亲和力的抗原表位。

上述软件通过登录如下网页获得：

NetMHCpan：(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)；

IEDB：(http://tools.iedb.org/mhci/)；

SYFPEITHI：(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)

NetCTL：(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)

通过上述软件预测，得到了Ag85A蛋白中针对HLA-A*02:01的高亲和力抗原表位，筛选出了其中两种亲和力高，疏水性好的抗原肽序列，分别为：抗原肽KLIANNTRV(下文中也称为抗原肽G48V56，示于SEQ ID No:1)和GLPVEYLQV(下文中也称为抗原肽K242V250，示于SEQ ID No:2)。

将所筛选的上述两种抗原肽进行合成(例如，委托苏州强耀生物治疗公司)，合成纯度为98％，并转化为其醋酸盐形式，以粉末1mg/瓶分装用于后续试验。

实施例3.体外验证抗原肽亲和力和预存免疫的效果

发明人试验发现，若体内有特异性预存免疫，给予相应表位的抗原肽刺激后，T细胞能短时间内迅速活化应答。若体内没有既存的免疫应答，T细胞活化速度很慢。一般人体在首次接触抗原时，需要3周左右的时间T细胞才能转化为效应T细胞。若曾经接触过抗原并产生了记忆的话，T细胞通常能在24小时内活化进而产生应答。

在本实施例中，发明人将制备的两种抗原肽G48V56与K242V250的混合物与来自存在或不存在预存免疫的健康成年志愿者(PDD阳性或阴性)的外周血单核细胞共孵育，并采用CBA磁珠加流式法检测IFN-γ的分泌水平。本实施例的目的在于确定上述抗原肽是否确实包含具有高亲和力的抗原表位，以及预存免疫在本发明的方案中的重要性。

下文中提到抗原肽G48V56与K242V250的混合物时，如无特殊说明，混合比例为1:1。具体方法如下。

IFN-γ标准曲线绘制

1.将小瓶冻干的IFN-γ粉末标准品(CBA Human IFN-γKit试剂盒，美国BDPharmingen公司，下同)加入15ml离心管，加入4ml PBS稀释，室温放置15分钟，充分吹匀。

2.取10支1.5ml EP管，分别标记TOP、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256，每管加入500ul PBS，按顺序进行序列稀释，吹匀。

3.使用CBA Human IFN-γKit试剂盒(美国BD Pharmingen公司)，按照说明书配制磁珠及抗体悬液，磁珠配置前需要轻轻震荡至少15分钟使其重悬，配制体系(1ml)＝980ul+10ul磁珠+10ul抗体。

4.在八排管中每孔加入40ul样品，加入40ul磁珠抗体悬液(加样前后都需要震荡混匀)，室温避光孵育2小时。

5.2小时后加入100ul washing buffer洗涤充分混匀，300g离心5分钟，弃上清后使用PBS重悬成单细胞悬液，使用流式上机。

6.取2通道荧光强度为纵坐标，浓度梯度为横坐标，通过excel软件作图，进行拟合，R2越接近1，认为拟合较好。通过上述曲线将流式的荧光强度换算成IFN-γ的表达。

PBMC提取

1.取2个50ml离心管，一管加入10ml生理盐水，另一管加入10ml人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)。

2.将10ml外周血与10ml生理盐水混匀稀释。

3.用巴氏管将稀释后的外周血逐滴加入人淋巴细胞分离液中，过程中注意不打破液平面。

4.离心AEC 3DEC 3(缓升缓降)800g，25分钟。

5.吸出人淋巴细胞分离液与血清中间一层细胞，即为所需PBMCs。

6.用生理盐水清洗PBMCs 2次，离心AEC 9DEC 9(快升快降)300g 10分钟，控干水分，进行后续实验或者液氮冻存(温度低于-80℃)。

抗原肽溶解

分别地，上述抗原肽1mg溶于50ul DMSO，静置数分钟，再加入1ml PBS充分混匀溶解，此时配制浓度为1mg/ml，后分装-80℃冻存。

阳性对照植物凝集素PHA溶解

PHA标准品冻干粉(深圳达科为生物工程有限公司)加入500ul灭菌PBS混匀静置数分钟，此时浓度为25ug/ml，混匀后分装-20℃冻存，作为抗原肽试验的阳性对照。

抗原肽刺激PBMC

1.将液氮冻存的PBMCs加入体积的3-5倍AIMV完全培养基(美国Thermo Fisher公司)重悬，250g离心5分钟，弃上清。

2.加入含1％双抗(青霉素及链霉素)的AIMV培养基(不加血清和刺激因子)重悬至1*10⁶细胞/ml，使用96孔板(圆底)，每孔加入100ul单细胞悬液，实质上每孔加入约1*10⁵个细胞。

3. 96孔板边缘1圈孔中加入生理盐水或者PBS，100ul/孔，以免样品蒸干。

4.在含有细胞的样品孔中分别加入两种待测抗原肽，两种均为2.5ul/100ul，每组设置三个复孔，分别设置阳性对照(植物凝集素PHA2.5ul/100ul)，阴性对照(仅PBMCs细胞)。

5.孵箱孵育20-24h，收集上清40ul/孔进行流式检测，并留存1份样品，备用于重复检测。

IFN-γ检测流式上机

1.样品上清40ul/孔。

2.使用CBA Human IFN-γKit试剂盒(美国BD Pharmingen公司)，每孔加入40ul配好的CBA磁珠抗体体系(1ml＝980ul+10ul磁珠+10ul抗体)。

3.加磁珠前充分震荡(磁珠易沉淀)，磁珠加入后需立刻涡旋混匀。

4.加样后避光孵育2h。

5.2小时后加入100ul洗涤缓冲液洗涤充分混匀，200g离心5分钟，弃上清后使用100ul PBS重悬，使用流式上机。

将PPD试验阴性和强阳性志愿者外周血单核细胞与两种抗原肽的混合物共孵育24小时之后，使用CBA磁珠法检测上清中的IFN-γ分泌水平。如图1B所示，PPD强阳性受试者的IFN-γ分泌在使用抗原肽时相对于阴性对照显著升高(图1C，右侧小图)，而PPD试验阴性受试者的IFN-γ分泌在使用抗原肽刺激时与阴性对照相比没有显著差异。该结果提示了抗原肽G48V56和K242V250的混合物在体外能提高外周血单核细胞中的记忆性免疫应答强度。

实施例4.抗原递送加载至肿瘤细胞表面

卡介苗属于计划免疫接种，在人群体内普遍存在着对于卡介苗的记忆性免疫应答，但是由于TCR特异性，卡介苗的记忆性T细胞仅识别卡介苗相关表位，作为“旁观者”存在于肿瘤组织中，无法靶向肿瘤细胞进行杀伤。

在本实施例中，发明人试验了来源于结核分枝杆菌的Ag85A蛋白的抗原肽G48V56和抗原肽K242V250在肿瘤细胞表面是否提呈。

将HLA-A*02:01型的肿瘤细胞株A375、NUGC4(例如可购自南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心实验室)分别与连有FITC荧光(绿色)的抗原肽G48V56或K242V250共孵育4小时后，激光共聚焦显微镜拍摄成像，将抗原肽G48V56的激光共聚焦显微镜结果示例性地示于图2A。

使用流式法检，检测了不同条件下上述肿瘤细胞与连有FITC荧光的抗原肽G48V56共孵育4h后的上述肿瘤细胞表面荧光信号强度。所述条件包括在不同时间点(0小时、0.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、24小时、48小时)进行拍照，以及不同的抗原肽浓度(0.5ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml)。将结果示于图2B。

上述两项实验的具体操作步骤如下。

肿瘤细胞的抗原吞噬和呈递实验(图2A)

1.将人胃癌细胞株NUGC4、人黑色素瘤细胞株A375细胞悬液种于已放置圆形细胞爬片的24孔板中，约10⁶个细胞/ml。

2.待细胞贴壁后，分别加入连接有FITC荧光标记的抗原肽G48V56或抗原肽K242V250各20ug/ml，置于37℃孵箱共孵育2小时，用PBS洗涤3次，将未吞噬或呈递的抗原肽洗净。

3.再次放入孵箱孵育4小时，使用4％多聚甲醛固定后，依次用Dil染料染细胞膜，DAPI染料染细胞核，PBS洗涤3次后取出细胞爬片固定于载玻片上，将样品在激光共聚焦显微镜下拍照，观察两种抗原肽各自的裸肽的吞噬及抗原呈递情况。

如图2A所示，在两种肿瘤细胞中，激光共聚焦图像融合后，原先带有红色荧光(Dil染料)的细胞膜变成了橙红色(图中显示为浅色)，说明两种肿瘤细胞均摄取了抗原肽并将其加载至肿瘤细胞表面，证实了本发明的抗原肽能够被肿瘤细胞提呈。

肿瘤细胞对抗原肽的摄取量及持续存在时间(图2B)

1)摄取剂量

将人胃癌细胞株NUGC4(分型为HLA-A*02:01)，人黑色素瘤细胞株A375(分型为HLA-A*02:01)分别种于流式管内，加入不同剂量连接有FITC荧光的抗原肽(0.5ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml)，37℃孵箱共孵育2小时。用PBS洗涤3次，以将未加载或吞噬的抗原肽洗涤干净。然后通过流式法检测肿瘤细胞表面FITC荧光信号强度，将抗原肽G48V56的结果示于图2B。

2)持续存在时间

将人胃癌细胞株NUGC4(HLA-A*02:01)，人黑色素瘤细胞株A375(HLA-A*02:01)分别种于流式管内，加入10ug/ml连接有FITC荧光的抗原肽，37℃孵箱共孵育2小时，用PBS洗涤3次，以将未加载或吞噬的抗原肽洗涤干净，在不同时间点(0小时、0.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、24小时、48小时)进行流式检测肿瘤细胞表面FITC荧光信号强度，两种抗原肽获得了相似的结果，将抗原肽G48V56的结果示于图2B。

如图2B所示，随着抗原肽浓度的增加，肿瘤细胞A375、NUGC4的表面FITC荧光强度不断增加(图2B上方两个小图)。在不同时间点(包括0小时、0.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、24小时、48小时)检测了荧光强度(FITC荧光通道为488nm激光，525/40BP荧光通道)，荧光信号处于稳定状态，表明抗原肽能与肿瘤细胞稳定结合，持续存在至少48个小时(图2B下方两个小图)。在人黑色素瘤细胞株A375中，这种提呈在24h时达到最高。在人胃癌细胞株NUGC4中，这种提呈较为平稳，具体在5h后稍有增加。

实施例5.抗原肽使T细胞的杀伤效能增强

发明人将抗原肽(抗原肽G48V56和K242V250的混合物)、PPD试验阳性的HLA-A*02:01健康志愿者的外周血单核细胞与肿瘤细胞(A375或NUGC4，南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心实验室保存)共孵育20小时，并使用CFSE/PI染色法检测了T细胞的杀伤能力，将结果示于图2C。具体实验流程如下。

1)靶细胞制备：将人胃癌细胞株NUGC4(HLA-A*02:01)，人黑色素瘤细胞株A375(HLA-A*02:01)作为靶细胞，对数生长期后消化离心，重悬成10⁶个细胞/ml的单细胞悬液，加入终浓度为1uM的CFSE染液混匀，37℃避光孵育10分钟，加入5倍以上体积的含血清的1640培养基终止反应，离心洗涤，用培养基调整细胞浓度为10⁶个细胞/ml。

2)效应细胞的制备：将HLA-A*02:01人PBMCs(其中大部分为T细胞)重悬于AIMV培养基中，按照效靶比(包括0：1，1：1，5：1，10：1，20：1，50：1)加入已经标记好CFSE染液的肿瘤细胞。

3)将肿瘤细胞、PBMCs、抗原肽于37℃孵箱里共孵育20小时，收集流式管中的细胞，离心并用200ul PBS重悬。加入2ul染液PI(终浓度为50ug/ml)，4℃避光孵育10分钟，离心收集染色后的细胞，PBS洗涤后重悬于200ul生理盐水中，进行流式检测，结果示于图2C。

如图2C所示，CFSE/PI染色法试验表明，当以效靶比0：1，1：1，5：1，10：1，20：1，50：1加入抗原肽G48V56和K242V250的混合物后，T细胞的杀伤效能均得到增强，从功能上验证上述抗原肽可在体外增强T细胞对具有特定HLA分型的肿瘤细胞的杀伤功能。

实施例6.卡介苗与抗原肽在体内减缓肿瘤生长

在本实施例中，发明人进行了上述抗原肽的体内试验，通过5组进行不同处理的小鼠，检验本发明的抗原肽在体内的效果。具体操作如下。

小鼠荷瘤模型制备方法

将30只雌性C57BL/6J鼠(购自江苏集萃药康生物科技有限公司)分成5组，每组6只。每组接受不同的处理，具体为：(A)卡介苗免疫+PBS对照组，(B)卡介苗免疫+卡介苗治疗组，(C)卡介苗免疫+抗原肽治疗组，(D)PBS免疫+卡介苗治疗组，(E)PBS免疫+抗原肽治疗组。

卡介苗免疫与未免疫小鼠模型的构建

选择相同体重，4周龄大小的SPF级C57BL/6J小鼠。

对于卡介苗免疫小鼠((A)-(C)组，共18只)，分别于D-28/D-21(以皮下瘤种植日为第0天＝D0)皮内注射每只小鼠0.1ml卡介菌悬液(治疗用卡介苗，国药准字S20123007，成都生物制品研究所，根据说明书使用无菌生理盐水溶解配制，下同)(包含1*10⁵cfu卡介菌)进行免疫。28天后形成记忆性免疫应答。

对于卡介苗未免疫小鼠((D)-(E)组，共12只)，在同样的SPF屏障内饲养至28天，分别于D-28/D-21皮内注射0.1ml PBS。

B16F10黑色素瘤皮下瘤模型的构建

选择对数生长期的小鼠黑素瘤B16F10肿瘤细胞，胰酶消化后收集细胞，用生理盐水重悬成单细胞悬液。

将体重均在18～20g之间，8周龄的SPF级C57BL/6J小鼠(包括卡介苗免疫28天后的小鼠，以及卡介苗未免疫的小鼠)，取酒精棉球消毒小鼠左下腹部区域皮肤，用1ml无菌注射器进行皮下瘤种植，每只鼠皮下注射0.1ml细胞悬液，所含肿瘤细胞数约为2*10⁵个细胞。

测量肿瘤长径(a)和短径(b)，肿瘤体积按a*b²/2的公式计算，待肿瘤体积长至50mm³时开始治疗。

将卡介苗免疫小鼠随机分为3组，分别是：PBS组、PEPTIDE治疗组、BCG治疗组，每组6只；并设置卡介苗未免疫小鼠对照组，分别是PEPTIDE治疗组、BCG治疗组。每隔4天治疗1次。PBS组为瘤内注射PBS0.1ml，BCG治疗组为瘤内注射BCG 0.1ml(包含1*10⁵cfu卡介菌)，PEPTIDE治疗组为瘤内注射0.1ml抗原肽溶液(包含与B16F10肿瘤细胞的MHC分子分型具有高亲和力的抗原肽的混合物0.2mg，详情见下文)。从治疗开始，每隔两日测量肿瘤长短径，记录各组小鼠的肿瘤体积变化，以评价治疗效果。

瘤体内注射方法

由于鼠的MHC分型和人体不一致，在本实施例中，作为抗原肽使用了根据C57BL/6J鼠独特的MHC分型以同上方法预测而得的针对鼠的MHC具有高亲和力的两种抗原肽。所述两种抗原肽是如SEQ ID No:4所示的鼠抗原短肽序列(SGGANSPAL，与C57BL/6J鼠MHC I类分子具有高亲和力)，以及如SEQ ID No:5所示的鼠抗原长肽序列(YHPQQFVYAGAMSGLLD，与C57BL/6J鼠MHC II类分子具有高亲和力)。

将1mg卡介苗(成都生物制品研究所有限责任公司)或者2mg(包括1mg鼠抗原长肽+1mg鼠抗原短肽，下文称为高亲和力抗原肽)合成的抗原肽(苏州强耀生物有限公司)使用公司推荐方法溶解于1ml生理盐水中，使得卡介菌浓度为10⁶cfu/ml，抗原肽浓度为2mg/ml，使用1ml注射器瘤体内多点注射高亲和力抗原肽(每点约50～100微升体积，0.1ml体积/只)，间隔4-5天在瘤体内进行重复注射，共注射4次直至治疗终点。观察记录小鼠体重、饮食及活动度，血生化指标(包括ALT谷丙转氨酶，AST谷草转氨酶，UREA尿素氮，CREA肌酐)、重要脏器HE染色(包括心肝脾肺肾)评估治疗副作用，示于图3。

治疗终点：1、小鼠自然死亡；2、肿瘤长径+短径/2的结果大于20mm(伦理要求的终点)。

如图3中所示，相较于未免疫组而言，免疫后不论使用高亲和力抗原肽、还是使用卡介苗瘤内注射，均显著减缓了肿瘤生长速度(图3A，B)，延长了小鼠生存时间(图3C)。提示在建立结核分枝杆菌特异性免疫后，采用卡介苗或抗原肽进行免疫激活均能够实现抗癌作用，减缓肿瘤生长。

另一方面，在免疫后，分别使用卡介苗或者高亲和力抗原肽的混合物注射的两组中，此两种治疗方案在抑瘤效果(减缓肿瘤生长、延长小鼠生存时间)中基本相仿，提示瘤体内注射高亲和力抗原肽或卡介苗中的结核分枝杆菌特异性抗原均可以被肿瘤细胞提呈，而使肿瘤细胞受到免疫系统的攻击，从而用于肿瘤的预防和治疗(图3A-C)。同时，通过监测，小鼠体重、血生化指标、重要脏器HE染色均显示各治疗组无显著差异，提示此种治疗模式存在良好的生物安全性(图3D-F)。

从以上实验结果可知，抗原肽和卡介苗都以激活预存免疫来治疗肿瘤。但是考虑到反复瘤体内注射卡介苗存在一些潜在的副作用，包括发热、寒战、局部淋巴结炎、局部脓肿、与肉芽肿性肝炎相关的偶发性全身感染，施用结构更简单的抗原肽更加安全。这使得抗原肽可以以相对更高的剂量施用，并且也可以重复施用。因此，与卡介苗相比，更优选使用抗原肽。

实施例7.免疫组动物肿瘤内的免疫微环境变化

在实施例6的治疗终点(在肿瘤体积长至50mm³时开始治疗，每4天治疗一次)，通过外科方式取出小鼠肿瘤组织，进行免疫微环境分析，将结果示于图4。具体操作步骤如下。

1.钝性分离肿瘤组织，放入生理盐水中，适当修剪掉肿瘤表面黏着的皮肤组织、肿瘤中间坏死破溃的组织。取花生米大小的无坏死的组织，留做后续处理。

2.准备消化液：在无血清RPMI 1640培养基加入工作浓度为1mg/mL的胶原酶IV和100U/mL的DNA酶，加入6孔板，每孔2-3ml。

3.将肿瘤组织剪碎成米粒大小的组织碎片，放入盛有消化液的6孔板，使消化液没过组织碎片。

4.放入37℃孵箱孵育2小时。

5.向各孔加入等体积完全培养基终止消化。将各孔组织悬液吹匀，通过40um的细胞滤器并收集滤出液。

6. 350g，5分钟离心，弃上清。

7.每管加入3-5ml的红细胞裂解液，用枪头或巴氏管充分吹匀。

8. 350g，5分钟离心，弃上清。

9.对获得的细胞进行染色，4℃，避光孵育30分钟，加1ml PBS清洗一次，过滤膜，上机。

如图4A所示，相较于未免疫组，卡介苗免疫组(卡介苗免疫-抗原肽治疗，卡介苗免疫-卡介苗治疗)小鼠的肿瘤内存在更多的T细胞浸润(图4A)，并且这部分T细胞中存在更多的记忆表型(CD4，CD8，CD3/效应记忆T细胞，图4A)。由于目前认为肿瘤中免疫细胞得到良好支持的患者，更有可能在更长的时间内控制其癌症的生长，因此该结果不仅有助于解释治疗机理，也证实了治疗效果。

结果还显示，卡介苗-抗原肽治疗组整体与卡介苗-卡介苗治疗组相似，在CD4，CD8方面，卡介苗-抗原肽治疗组优于卡介苗-卡介苗治疗组，表明了细胞毒T细胞与T辅助细胞，效应记忆T细胞参与了该过程。同时，免疫组小鼠肿瘤细胞中的PD-L1表达显著上调，并且存在着治疗效果越好，PD-L1表达越高的趋势(图4B-C)。

基于以上试验，发明人通过体外、体内实验验证了通过将来源于分枝杆菌Ag85A蛋白的抗原肽(优选与受试者的MHC/HLA I类分子具有高亲和力的抗原肽)外源性递送至肿瘤部位，能够使该抗原肽被加载至肿瘤细胞表面，从而预存免疫(通过实现接种卡介苗获得)中特异性识别该抗原的T细胞针对肿瘤的杀伤能力，实现对肿瘤细胞的杀伤。特别是在动物体内试验中，“先卡介苗免疫、后抗原肽/卡介苗治疗”的治疗模式和治疗方法能显著延缓肿瘤的生长，减少肿瘤体积，增加小鼠的生存天数。

工业实用性

本发明创新性地提供了通过卡介苗或来自其的抗原肽激活自身免疫系统，利用人体普遍存在着的对于卡介苗的记忆性免疫应答治疗肿瘤的方法。通过该方法，可以根据受试者的HLA I类分型制定个体化的肿瘤免疫治疗剂。

同时，提供了来自保护性抗原Ag85A蛋白且与HLA I类分型具有高亲和力的新型抗原肽及筛选方法。通过将其瘤内注射，能成功抑制肿瘤发展。本发明提供的卡介苗及抗原肽及它们的组合能够用于抗肿瘤领域中，作为可行且安全的肿瘤治疗策略应用于临床及基础研究，并基于它们制备各种药物或与其他治疗肿瘤的方法及药物进行联用。

序列表

<110> 南京大学医学院附属鼓楼医院

<120> 通过分枝杆菌特异性免疫治疗肿瘤的方法及使用的抗原肽

<130> PS13007GLH33CN

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val

1 5

<210> 3

<211> 338

<212> PRT

<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<400> 3

Met Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met Ser Arg

1 5 10 15

Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val

20 25 30

Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly

35 40 45

Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile

85 90 95

Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val

100 105 110

Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro

115 120 125

Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro

145 150 155 160

Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu

165 170 175

Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met

180 185 190

Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly

195 200 205

Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met Trp Gly

210 215 220

Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val

225 230 235 240

Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn

245 250 255

Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu

260 265 270

Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn

275 280 285

Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr

290 295 300

His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Pro Asp

305 310 315 320

Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln

325 330 335

Gly Ala

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu

1 5 10 15

Asp

Claims

所述抗原肽来自分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌，并且所述抗原肽的氨基酸序列为示于SEQ ID No: 1的氨基酸序列G48V56，或示于SEQ ID No: 2的氨基酸序列K242V250，并且与所述受试者的MHC分子的分型具有高亲和性，

所述受试者的免疫系统对所述分枝杆菌属细菌具有预存免疫，所述预存免疫是通过接种卡介苗获得的，

所述癌症或肿瘤是胃癌或黑色素瘤。

2.根据权利要求1所述的用途，在所述药物中，所述抗原肽以裸肽形式存在，或以包含多个抗原肽且含有酶切位点的融合肽的形式存在，以抗原肽-抗体融合肽的形式存在，以抗原肽-接头-抗体融合肽的形式存在，以抗原肽-纳米材料的形式存在，或以抗原肽-纳米颗粒的形式存在。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述抗原肽-纳米材料中的纳米材料为DSPE-PEG。

4.根据权利要求1所述的用途，所述抗原肽与另一种肿瘤治疗剂组合使用。