CN101822829B - 一种用于结核病预防的重组卡介苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人GM-CSF基因与结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6基因嵌合表达GMCSF-CFP10-ESAT6蛋白重组卡介苗的构建及其免疫原性研究，即利用基因工程技术将人GM-CSF基因和结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6基因序列插入到同一大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361的序列中，构建重组穿梭质粒rpMV361GMCSF-CFP10-ESAT6。然后采用电穿孔的方法将上述载体导入卡介苗，构建重组卡介苗rBCG：GMCSF-CFP10-ESAT6。本发明构建的重组卡介苗可以稳定的表达GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合蛋白，其免疫原性优于传统卡介苗。本发明提供了一种重组卡介苗的制备过程，并研究了其免疫性，属于基因工程领域和结核疫苗领域。本发明将更有效的预防结核病的发生及传播。

Description

一种用于结核病预防的重组卡介苗

技术领域：

本发明涉及基因工程领域和新型结核疫苗领域，具体涉及一种重组的卡介苗。

背景技术：

结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌引起的一种传染病，近年来随着流动人口增加、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核杆菌伴发感染以及结核杆菌多重耐药性菌株的出现，使全球结核病疫情增高，给全球结核病的防治提出了新的挑战。卡介苗(Bacille CalmetteGuerin，BCG)是目前唯一用于预防结核病的疫苗，但是其免疫保护效果极不稳定，不同地区的人群接种BCG后其免疫保护作用差异很大(保护率为0-80％不等)。开发比BCG更为有效的抗结核病疫苗已成为当今迫切需要解决的问题。但目前尚没有任何一种新型疫苗能完全替代BCG免疫，因此对卡介苗进行分子改造，研制更为安全有效的新型抗结核病疫苗具有特别重要的意义。

BCG作为一种活疫苗，应用于免疫力低下的人群(如HIV感染者或艾滋病患者等)有较大的局限性，将外源性基因导入卡介苗构建重组卡介苗(rBCG)是TB疫苗改造的重要方向之一。通过BCG的生长繁殖，在体内表达分枝杆菌保护性抗原，从而更有效地激发机体免疫应答，增强BCG的免疫效果。Horwitz在BCG菌株中引入编码MTB 30kD主要分泌型和细胞外蛋白(Ag85B)的质粒来观察rBCG的效力，发现rBCG均能稳定表达这种蛋白分子，与亲本BCG免疫的豚鼠相比，rBCG免疫的豚鼠尽管体重变化不明显，但动物存活率和组织抑制细菌生长的能力均超过BCG，已计划开始进行I期人体试验。Bao构建了两株分别表达Hsp60-ESAT6融合蛋白和ESAT6分泌蛋白的rBCG，前者比BCG诱导更高滴度的特异性抗体和更强烈的细胞免疫应答，而后者的免疫原性与亲本BCG株相似，两株rBCG的毒力未见增强，都能明显抵御MTB感染，但免疫保护效力方面尚低于BCG。目前，结核疫苗的研究主要集中在以下几个方面：(1)营养缺陷型结核减毒活疫苗；(2)亚单位疫苗；(3)DNA疫苗；(4)重组卡介苗。尽管前三种方法都能不同程度的刺激机体的保护性免疫反应，但其安全性也受到质疑。

在结核分枝杆菌中，早期分泌抗原靶6(earlier secreted antigenic taget 6，ESAT-6)是一种分泌性抗原，和培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)是结核病免疫诊断中2个很有前途的抗原。这2个抗原均由RD(Regions of deletion，RD)1区的RV3875和RV3874基因编码，该区只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌基因组中，所有BCG菌株基因组中均缺乏该区域，是BCG减毒传代过程中最先缺失的一段区域，与结核分枝杆菌毒力和抗原性相关，能被宿主免疫系统高度识别，该区基因编码所表达的蛋白多属于免疫优势抗原，可望成为新疫苗研制的主要候选分子。

ESAT-6可致再感染结核菌小鼠的记忆性免疫CD₄ ⁺T细胞增殖及早期IFN-γ的大量产生，从而显著活化巨噬细胞，提高巨噬细胞对胞内结核菌的生长抑制作用和杀伤能力，同时在保护性细胞免疫反应中也发挥着作用，并介导长期持久的免疫记忆。表达ESAT-6的重组BCG疫苗优于亚单位疫苗和DNA疫苗，它既保留了BCG中的原有抗原，又增添了新的保护性抗原，且这种抗原可被广泛识别，能强烈诱导宿主T淋巴细胞增殖和持久的免疫记忆。CFP10也是一种有效的T细胞抗原，能够引发PPD阳性试验者的外周血单核细胞的增殖反应和IFN-γ的产生。单一抗原的抗结核免疫效果不理想，而编码CFP10的基因RV3874的3′端位于ESAT-6基因RV3875上游34bp处，2个基因方向一致，协同表达，共用1个启动子，CFP10和ESAT6形成1∶1紧密的异二聚体结构，CFP10-ESAT6融合蛋白基因疫苗能诱导较强的细胞免疫应答，表明表达CFP10-ESAT6融合蛋白的疫苗免疫效果较好，这种疫苗可能具有更好的免疫原性和保护力。

机体对结核病的免疫主要通过CD₄ ⁺T、CD₈ ⁺T细胞等的细胞免疫来完成，BCG是一种强的CD₄ ⁺T细胞型免疫应答诱导剂，但它诱导MHCI类限制性CD₈ ⁺T细胞的作用较弱，这可能是BCG的主要缺陷之一，而CD₈ ⁺T细胞可通过多种机制在宿主防御结核杆菌感染和潜伏感染中发挥重要作用。粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor GM-CSF)是一种能够刺激粒细胞、巨噬细胞形成集落的细胞因子，可调控粒细胞、单核/巨噬细胞的分化、增殖和存活，激活单核-巨噬细胞、释放炎性介导因子，杀死某些微生物和肿瘤，在造血调控和免疫调节中发挥重要作用。GM-CSF在体内外都能影响巨噬细胞的活性，促进树突状细胞发育，并增加其表面MHC分子的表达，有效促进抗原提呈，已作为免疫佐剂广泛应用于免疫学领域。利用GM-CSF作为佐剂的动物模型试验均表明，GM-CSF能增强感染的免疫原性，在与BCG一起免疫的小鼠中，GM-CSF能显著增强小鼠对结核分枝杆菌二次攻击的免疫保护作用。

CD₄ ⁺Th1型细胞免疫反应和CD₈ ⁺CTL反应是机体抗结核必需的保护免疫，有效的疫苗既要能刺激产生上述参与保护免疫的T细胞，又要产生所需的细胞因子，而由单个靶抗原同时产生这两种效果可能存在一定困难，理想的结核疫苗应为含多个靶抗原的多价疫苗，以期提高TB疫苗效果，因此，多价疫苗是结核病疫苗研制的重要研究方向之一。由于GM-CSF不仅能诱导强的CD₄ ⁺T细胞反应，又能诱导强的CD₈ ⁺T细胞反应，可以弥补卡介苗功能上的缺陷，选择其作为佐剂与结核分枝杆菌免疫优势抗原CFP10和ESAT6共同转入卡介苗，构建能表达人GM-CSF和结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的重组卡介苗可能具有更好的免疫原性和保护力，对今后结核新疫苗的开发、发病机制的研究及结核病的防治有重大意义。

发明内容：

1、本发明的目的是提供一种重组卡介苗的制备方法。

根据Genbank中报道的人GM-CSF的CDS序列和结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6基因序列设计3对引物，用SOE法(重叠延伸，Gene splicing by overlap extension)先扩增CFP10-ESAT6融合基因，再次用SOE法将人GM-CSF基因与CFP10-ESAT6融合基因连接到一起，组成GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因。将此嵌合基因与大肠杆菌-结核分支杆菌穿梭质粒pMV361同时双酶切插入至穿梭质粒的多克隆位点处，构建重组穿梭质粒rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6，先用卡那霉素筛选阳性重组子，再用PCR、酶切及基因序列分析进行鉴定。PCR、酶切及测序结果均显示，在穿梭质粒pMV361中插入了一个1065bp的特异性片段，与预期的GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因大小一致，重组穿梭表达载体构建成功。

将-70℃冻存的BCG菌株快速解冻后，迅速转移至37℃预热的Sauton培养基中，放入37℃培养箱静置培养4-5周，待菌膜长出，直至菌体恢复正常生长状态，菌体呈白色或略带黄色，有皱褶并覆盖整个培养基液面，将其转种并扩大培养，待菌膜覆盖满液面后用于电转化。将测序正确的重组质粒rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6用电转化的方法转入至感受态BCG中，构建rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6重组卡介苗。通过卡那霉素筛选阳性重组子，一方面提取重组卡介苗的基因组行PCR鉴定，另一方面，通过热诱导的方法，用小鼠抗hGM-CSF单克隆抗体进行Western-blot分析，观察其蛋白表达水平。以提取具有卡那霉素抗性的重组BCG菌的基因组为模板，经PCR扩增出1065bp的目的片段，证明重组质粒pMV GMCSF-ESAT6已成功转化进BCG菌；重组BCG经热诱导后，菌体裂解液上清用GM-CSF单克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，经ECL显色后显示在35kDa左右出现一特异性的条带，和目的蛋白的预期分子量吻合，而空质粒(pMV361)电转化组未出现阳性条带，表明重组BCG可以表达GMCSF-CFP10-ESAT6外源目的蛋白，重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6构建成功。

2、本发明的另一个目的是提供一种效果优于目前市售卡介苗的重组卡介苗。

取6周龄的BALB/C小鼠32只(雌雄不限)，每组8只，随机分为PBST组、BCG组、rBCG:361组和rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组，各组适应性饲养1周后，于背部皮下多点分别注射PBST、BCG及rBCG(5×10⁶CFU/只，用PBST稀释成0.1mL)，共免疫1次。免疫后6、8、10、12周四个时间点各组随机抽取小鼠2只，摘眼球取血，分离血清，检测各组小鼠血清特异性抗体滴度IgG。同时无菌分离脾脏，收集脾淋巴细胞，经台盼蓝染色后细胞计数，活细胞数在90％以上，调整细胞密度为2×10⁶/L进行下述实验：

(1)特异性脾淋巴细胞增殖试验：分离培养的脾细胞加入96孔圆底培养板，每组小鼠脾细胞做6个复孔，并设阴性对照孔和调零孔，试验孔加入25mg/L TB-PPD，对照孔不加特异性蛋白，调零孔不加淋巴细胞。于37℃5％CO₂培养68小时后加入XTT再培养4h，用酶标仪测定A450吸光值，结果用刺激指数表示，SI＝刺激组/非刺激组。

(2)细胞因子的诱生：上述分离培养的脾细胞加入24孔圆底培养板(0.5mL/孔)，每组小鼠脾细胞做3个复孔，25mg/L TB-PPD刺激72h后，收集培养液上清，按ELISA检测试剂盒说明书测定IFN-γ和IL-4水平。

(3)流式细胞术检测T淋巴细胞CD₄ ⁺及CD₈ ⁺细胞亚群：脾淋巴细胞转入6孔板，每组做3个复孔(1mL/孔)，同时加入25mg/L TB-PPD刺激，培养72h后，加入PE荧光素标记的抗小鼠CD₄ ⁺和FITC标记的CD₈ ⁺抗小鼠一抗，流式细胞仪检测T淋巴细胞表面CD₄ ⁺及CD₈ ⁺细胞亚群所占比例。

结果显示，免疫后6、8、10、12周rBCG:361组和卡介苗组各时间点血清抗体滴度相差不明显，而rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组免疫小鼠的抗体滴度明显高于rBCG:361组和卡介苗组，在第8周达到高峰，然后逐渐降低，但仍然高于卡介苗组和rBCG:361组；各免疫组脾淋巴细胞增殖活性均较PBST组明显升高，在第10周时达到最高，rBCG:361组和卡介苗组比较，刺激指数差异不显著，而rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组脾淋巴细胞增殖活性显著高于卡介苗组和rBCG:361组；各免疫小鼠IFN-γ水平均较PBST明显升高，10周达到高峰，rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组IFN-γ含量显著高于卡介苗组和rBCG:361组；卡介苗组、rBCG:361组和重组BCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞CD₄ ⁺T细胞均有增高的趋势，在免疫后10周达到最高，其中，卡介苗组和rBCG:361组CD₄ ⁺T细胞的比例相当，而重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组CD₄ ⁺T细胞比例在各个时间点均明显高于其它各组，重组BCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞CD₈ ⁺T细胞比例自免疫8周就明显增加，10周时达高峰，至12周有所回落。体液免疫反应和细胞免疫反应均提示重组BCG:GMCSF-CFP10-ESAT6免疫原性强于BCG。

本发明的疫苗具有以下优势：

1、重组表达了人GMCSF和结核分枝杆菌两个重要的优势保护性抗原CFP10和ESAT6。

2、将人GM-CSF基因与结核分枝杆菌CFP10和ESAT6基因通过分子生物学工程技术融合在一起。

3、能稳定的在卡介苗中表达外源蛋白GMCSF-CFP10-ESAT6。

4、重组疫苗的免疫原性优于传统卡介苗。

附图说明：

图1为hGMCSF基因、CFP10基因、ESAT6基因、CFP10-ESAT6融合基因及GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因的PCR图。1，DNA分子量标准；2，hGMCSF条带；3，CFP10条带；4，ESAT6条带；5，CFP10-ESAT6条带；6，GMCSF-CFP10-ESAT6条带。

图2为rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6的PCR及酶切鉴定图。1，DNA分子量标准1；2，PCR鉴定；3，pMV361空质粒双酶切；4，rpMV GMCSF-CFP10-ESAT6单酶切；5，rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6双酶切。

图3为rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6基因组PCR鉴定图。1，DNA分子量标准；2，GMCSF-CFP10-ESAT6条带。

图4为pMV361的质粒图谱。

图5为Western-blot检测rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6细胞裂解液中GMCSF-CFP10-ESAT6蛋白表达图。1，rBCG:361菌体蛋白Western-blot检测。2，rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6菌体蛋白Western-blot检测。

图6为血清特异性抗体滴度IgG。

图7为血清IgG2a/IgG1.

图8为免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应。

图9为脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平。

图10为免疫小鼠脾淋巴细胞CD4细胞百分比。

图11为免疫小鼠脾淋巴细胞CD8细胞百分比。

图12为免疫小鼠脾淋巴细胞亚群分析。1，PBST组；2，BCG组；3，rBCG:361；4，rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组。

具体实施方式：

1、分别以pORF-hGMCSF质粒和结核分枝杆菌H37Rv基因组序列为模板，分别设计人GM-CSF基因和结核分枝杆菌CFP10和ESAT6基因的引物，克隆GM-CSF、CFP10和ESAT6基因。

2、通过基因工程手段，将克隆的CFP10和ESAT6基因末端加上连接肽段，获得CFP10-ESAT6融合蛋白基因。

3、将克隆的GM-CSF基因和CFP10-ESAT6融合基因末端加上连接肽段，获得GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因。

4、将嵌合基因转入pMV361穿梭质粒，构建rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6重组质粒。

5、提取重组质粒，分别进行PCR、酶切及测序鉴定。

6、运用电转化的方法将各重组质粒转入卡介苗，构建重组BCG:GMCSF-CFP10-ESAT6。

7、用卡那霉素进行初步筛选。

8、提取重组BCG:GMCSF-CFP10-ESAT6基因组并进行PCR鉴定。

9、通过热诱导的方法诱导重组卡介苗蛋白表达并用Western-blot的方法鉴定。

10、分别用重组卡介苗、传统卡介苗和PBS免疫小鼠，观察并分析各组小鼠的体液免疫和细胞免疫反应。

实施例：

实施例1  GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因重组卡介苗的构建、表达与鉴定

1材料

1.1菌株及质粒

BCG上海株由成都生物制品研究所提供，质粒pMV361由本室保存，pORF-hGMCSF质粒购自Invitrogen公司。

1.2主要试剂

prime STAR^TM HS DNA聚合酶、dNTP、DNA连接试剂盒是Takara公司产品；EcoR I、HindIII及蛋白分子量标准购自晶美公司；Omega质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒及胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒购自宝信生物；人GM-CSF单克隆抗体为Abcam公司产品；HRP酶标羊抗鼠IgG和ECL显色试剂盒购自北京中杉公司。

1.3主要仪器

PCR仪、电转仪购自百乐公司，低温冰箱购自三洋公司。

2方法

2.1人GM-CSF和结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6基因的PCR扩增

根据Genbank中报道的人GM-CSF的CDS序列和结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6基因序列设计3对引物，引物序列为：hGMCSF上游：5’-CG

ACATGTGGCTGCAGAGCCTG-3’，hGMCSF下游：5’-GTCTTCATCTCTGCCATCTCCTGGACTGGCTCCC-3’，上游黑体字是EcoR I的酶切位点，下游删除终止密码子TGA，下划线部分是含有17个碱基的linker序列。CFP10上游：5’-GGGAGCCAGTCCAGGAGATGGCAGAGATGAAGAC-3’，CFP10下游：5’-GCTGCCGCCACCGCCGGATCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCGAAGCCCATTTGCGAGGAC-3’，上游下划线部分是含有17个碱基互补的linker序列，下游删除终止密码子TGA，下划线部分是含有45个碱基的linker序列。ESAT6上游：5’-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGCAGCATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCG-3’，ESAT6下游：5’-TA

CTATGCGAACATCCCAGTG-3’，上游下划线部分是含有45个碱基的linker序列，下游黑体字是Hind III的酶切位点。

以pORF-hGMCSF质粒DNA为模板，PCR扩增hGMCSF基因。hGMCSF基因PCR扩增体系：总体积为50μL，5×prime STAR^TM Buffer 10μL，dNTP 4μL(dATP，dGTP，dCTP，dTTP各10mmoL/L)，pORF-hGMCSF质粒DNA 1μL，hGMCSF基因上下游引物各1μL，prime STAR^TM HS DNAPoLymerase 1U，去离子水32.5μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃复性45秒，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟。扩增得到下游带linker的hGMCSF基因。

以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，分别PCR扩增CFP10基因和ESAT6基因。CFP10基因PCR扩增体系：总体积为50μL，5×prime STAR^TM Buffer 10μL，dNTP 4μL(dATP，dGTP，dCTP，dTTP各10mmoL/L)，H37Rv株基因组DNA 1μL，CFP10基因上下游引物各1μL，prime STAR^TMHS DNA Polymerase 1U，去离子水32.5μL。ESAT6基因PCR扩增体系：总体积为50μL，5×primeSTAR^TM Buffer 10μL，dNTP 4μL(dATP，dGTP，dCTP，dTTP各10mmoL/L)，H37Rv株基因组DNA 1μL，ESAT6基因上下游引物各1μL，prime STAR^TM HS DNA Polymerase 1U，去离子水32.5μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃复性45秒，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃延伸10分钟。扩增得到上、下游均带linker的CFP10基因和上游带linker的ESAT6基因。

2.2CFP10-ESAT6融合基因的PCR扩增

取设计的CFP10基因上游引物1μL，ESAT6基因的下游引物1μL，以上述扩增的CFP10和ESAT6的PCR产物各1μL为模板，dNTP 4μL，5×prime STAR^TM Buffer 10μL，prime STAR^TMHS DNA Polymerase 1U，去离子水31.5μL，总体积50μL，用SOE法扩增CFP10-linker-ESAT6序列的融合基因CFP10-ESAT6。PCR反应条件：95℃预变性5分钟，94℃变性45秒，68℃复性1分钟，72℃延伸1分30秒，30个循环，72℃延伸10分钟。扩增得到上游带linker的CFP10-ESAT6融合基因。

2.3GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因的PCR扩增

取设计的GMCSF基因上游引物1μL，ESAT6基因的下游引物1μL，以上述扩增的GMCSF基因和CFP10-ESAT6融合基因的PCR产物各1μL为模板，dNTP 4μL，5×prime STAR^TM Buffer10μL，prime STAR^TM HS DNA Polymerase 1U，去离子水31.5μL，总体积50μL，用SOE法扩增GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因。PCR反应条件：95℃预变性5分钟，94℃变性45秒，68℃复性1分钟，72℃延伸1分30秒，30个循环，72℃延伸10分钟。扩增得到GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因。将GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因PCR产物用柱式胶回收试剂盒纯化，具体实验步骤参照说明书。

2.4重组质粒rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6的构建：用质粒提取试剂盒提取pMV361空质粒，和上述GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因纯化产物用EcoR I和Hind III进行双酶切，反应体系分别为：pMV361空质粒5μL，5×Tango buffer 4μL，EcoR I 0.5μL，Hind III0.5μL，总体积20μL；GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因PCR纯化产物5μL，5×Tango buffer 4μL，EcoR I 0.5μL，Hind III0.5μL，总体积20μL。反应条件：37℃水浴5小时。纯化后的空质粒和嵌合基因的双酶切产物按照基因∶空质粒浓度比1∶10的比例混合，再加入等体积的连接试剂，轻轻混匀后，16℃连接3小时。取5μL连接液加入至50μL DH5a感受态菌液中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃水浴静置90秒，取出迅速转入至冰浴中2分钟，加入不含抗生素的LB液体培养基250μL，37℃缓慢振摇60分钟，取转化后的菌液100μL铺于含卡那霉素50μg/mL的LB平板上，37℃过夜培养。

2.5重组质粒rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6的鉴定

随机挑取3个生长菌落分别接种于3mL LB液体培养基中(含卡那霉素50μg/mL)，37℃振摇过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，电泳初步观察质粒DNA大小。取较空质粒略大者进行PCR鉴定，其中阴性对照以pMV361为模板，待检样本则以含有插入片段的重组质粒DNA为模板进行PCR扩增，引物为GM-CSF上游和ESAT6下游，PCR反应体系及循环参数同前述，另一方面用HindIII+EcoR I双酶切消化，电泳检测有无插入片段及其大小。初步鉴定重组质粒插入片段大小与预期相符后，将重组质粒送至Invitrogen公司进行DNA序列测定，测序引物分别为GMCSF上游和ESAT6下游。

2.6重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6的构建

将-70℃冻存的BCG菌株快速解冻后，迅速转移至37℃预热的Sauton培养基中，放入37℃培养箱静置培养4-5周，待菌膜长出，直至菌体恢复正常生长状态，菌体呈白色或略带黄色，有皱褶并覆盖整个培养基液面，将其转种并扩大培养，待菌膜覆盖满液面后用于电转化。

37℃静置培养于Sauton培养液约20天的卡介苗于转化前加入甘氨酸至终浓度为4％，继续培养24小时。用无菌玻璃珠振摇3小时以打碎菌膜。冰浴1小时后，4000rpm 4℃离心10分钟集菌，菌团用预冷的10％甘油洗涤4次后重悬于10％甘油中。取200μL菌液加入10μL重组质粒，冰浴30分钟，转入预冷2mm电穿孔杯中，在2.5KV/cm，25μF，720Ω条件下电转化。放电完毕后立即冰浴10分钟，轻柔加至10mL Sauton培养液中，37℃静置培养。待长出菌膜后转入含20μg/mL卡那霉素的Sauton培养液中，于37℃继续静置培养3～4周。

2.7重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6的鉴定

待菌膜长满液面后，离心集菌，依据基因组提取试剂盒提取重组卡介苗总DNA，以其为模板按前述扩增条件，分别以GMCSF上游和ESAT6下游为引物，进行PCR扩增。含外源基因的重组卡介苗在Sauton培养液(含20μg/mL卡那霉素)中静置培养两周，迅速加入等体积53℃的Sauton培养液，置45℃水浴热诱导30分钟。5000rpm离心15分钟集菌。收集培养液上清备用。菌体用冰预冷的PBS(pH7.2)洗涤2次，振荡混匀，超声波裂解菌体40分钟，-20℃备用。

根据Laemmli等介绍的方法，依次灌制12％的分离胶5mL和5％的浓缩胶2mL，待胶完全凝固后，将上述制备的蛋白样品及蛋白质分子量标准各取10μL上样于疏齿孔中进行电泳，先80V稳压电泳至分离胶，再120V电泳至结束。电泳完毕后，剥下凝胶块，先剪与凝胶块相同大小的4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。连同凝胶块一起浸入转移电泳缓冲液(25mmoL/LTris，0.2moL/L氨基乙酸，20％甲醇)中浸泡30分钟，然后在BR10592型半干转移装置的阳极板上依次平铺滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸，盖上阴极板，接通电源，于10V稳压电泳45分钟；取出硝酸纤维素膜，将膜置5％脱脂奶粉中封闭1小时后用TTBS(10mM/LTris-HCl，150mmoL/L NaCl，0.05％Tween20，pH7.5)室温轻摇洗涤3×5分钟，然后浸入含小鼠抗GM-CSF多克隆抗体(1∶1000)的一抗中于室温孵育2小时，TTBS洗膜3×5分钟，浸入含竦根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(1∶5000)的二抗稀释液液中，室温孵育1小时；TTBS洗膜3×5分钟，ECL显色，观察嵌合蛋白在卡介苗中的表达。

3结果

3.1人GM-CSF基因、结核分枝杆菌CFP10基因、ESAT6基因、CFP10-ESAT6融合基因及GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因的扩增

以设计的GM-CSF基因上下游为引物，通过PCR方法从pORF-hGMCSF质粒获得449bp的人GM-CSF基因片段(不含终止密码子)；以CFP10和ESAT6基因上下游为引物，从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中分别获得362bp和333bp的结核分枝杆菌CFP10基因(不含终止密码子)和ESAT6基因，以CFP10基因上游、ESAT6基因下游为引物，CFP10和ESAT6基因为模板，扩增得到650bp的CFP10-ESAT6融合基因；以GM-CSF基因上游、ESAT6基因下游为引物，GM-CSF基因和CFP10-ESAT6融合基因为模板，扩增得到1065bp的特异性片段，与预期的GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因大小一致(见图1)。

3.2重组质粒rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6的鉴定

以抗生素筛选阳性重组子提取的质粒为模板，以GM-CSF基因上游、ESAT6基因下游为引物进行PCR扩增，同时用EcoR I、HindIII双酶切该重组质粒，均证实有大小为1065bp的目的片段插入pMV361质粒(见图2)，测序结果和GenBank中人GM-CSF基因、结核分枝杆菌CFP10基因、ESAT6基因序列比对，均100％匹配，表明重组质粒构建成功。

3.3重组BCG的PCR鉴定

以提取具有卡那霉素抗性的重组BCG菌的基因组为模板，经PCR扩增出1065bp的目的片段，证明重组质粒pMV GMCSF-CFP10-ESAT6已成功转化进BCG菌(图3)。

3.4重组BCG表达产物的Westrn-blot分析

重组BCG经热诱导后，菌体裂解液上清用GM-CSF单克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，经ECL显色后显示在35kDa左右出现一特异性的条带，和目的蛋白的预期分子量吻合，而空质粒电转化组未出现阳性条带，表明重组BCG可以表达GMCSF-CFP10-ESAT6外源目的蛋白(见图5)，重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6构建成功。

4结论

运用分子生物学技术成功构建了能表达GMCSF-CFP10-ESAT6外源蛋白的重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6。

实施例2重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6免疫原性研究

1材料

1.1实验动物BALB/C小鼠购自四川大学华西校区实验动物中心。

1.2主要试剂IFN-γ、IL-4 ELISA检测试剂盒购自R&D公司，PE标记的CD₄和FITC标记的CD₈抗小鼠一抗购自eBioscience公司，RPMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

1.3主要仪器FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)，酶标仪(Bio-Rad)。

2方法

2.1动物免疫

取6周龄的BALB/C小鼠32只(雌雄不限)，每组8只，随机分为PBST组、BCG组、rBCG:361组和rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组，各组适应性饲养1周后，于背部皮下多点分别注射PBST(0.05％Tween80)、BCG及rBCG(5×10⁶CFU/只，用PBST稀释成0.1mL)，共免疫1次。免疫后观察动物注射部位有无红肿、溃疡、化脓等，同时观察动物皮毛、精神状态、饮食及大小便。

2.2血清特异性抗体水平检测

免疫后6、8、10、12周四个时间点各组随机抽取小鼠2只，摘眼球取血，待血液固体成分凝结固缩，离心吸取血清，分装后-70℃冻存备用。用TB-PPD标准品(100μL/孔)包被酶标板，4℃避光过夜。PBST洗涤，5％脱脂奶粉封闭90分钟，再次洗涤后依次加入2倍系列稀释的待检血清，37℃温育90分钟，洗板后分别加入1∶1000稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a，再次37℃温育90分钟，洗板，加入底物液(含0.4mg/mL邻苯二胺的0.05M磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH5.0，临用前加5μL 30％H₂O₂/10mL)100μL/孔，室温避光15-30分钟。加入50μL/孔H₂SO₄(2M)终止反应，于波长490nm测定吸光度。实验中以PBST组为空白对照、以rBCG:361rBCG:361组及BCG组血清为阴性对照，以结核病人血清作为阳性对照(1∶100稀释)，检测各组小鼠血清特异性抗体滴度。结果以双复孔A值均值表示，当A值＞0.05，A实验组/A对照组＞2.0时，判为阳性，以出现阳性反应的最高稀释度作为该样本的抗体滴度。

2.3脾淋巴细胞分离

免疫后6、8、10、12周各组随机抽取2只小鼠，无菌分离脾脏，同组脾脏混合后，用玻璃匀浆器研磨，经200目筛网过滤，PBS洗涤1-2次，加入0.83％NH₄Cl溶液(0.15M NH₄Cl，10mMNaHCO₃，1mM EDTA-Na₂)混匀后静置5分钟以裂解红细胞，1500rpm离心5分钟，收集细胞，加入含10％FBS和双抗的RPMI1640，经台盼蓝染色后细胞计数，活细胞数在90％以上，调整细胞密度为2×10⁶/L进行后续实验。

2.4特异性脾淋巴细胞增殖试验(XTT)

将上述分离培养的脾细胞加入96孔圆底培养板(0.1mL/孔)，每组小鼠脾细胞做6个复孔，并设阴性对照孔和调零孔，试验孔加入25mg/L TB-PPD，对照孔不加特异性蛋白，调零孔不加淋巴细胞。于37℃5％CO₂培养68小时后加入XTT(含1mg/mL XTT和0.125mmoL/L PMS)再培养4h，用酶标仪测定A450吸光值，结果用刺激指数表示，SI＝刺激组/非刺激组。

2.5细胞因子的诱生

将上述分离培养的脾细胞加入24孔圆底培养板(0.5mL/孔)，每组小鼠脾细胞做3个复孔，25mg/L TB-PPD刺激72h后，3000rpm离心5分钟收集培养液上清，-70℃冻存备用，按ELISA检测试剂盒说明书测定IFN-γ和IL-4水平。根据标准品各孔的OD值及其所对应的标准品含量绘制标准曲线，然后根据待测样品孔OD值从标准曲线上求出样本中IFN-γ和IL-4的含量。采用方差分析对各组的测得值进行差异显著性分析，P＜0.05为具有统计学意义。

2.6流式细胞术检测T淋巴细胞CD4⁺及CD8⁺细胞亚群

将上述分离培养的小鼠脾淋巴细胞转入6孔板，每组做3个复孔(1mL/孔)，同时加入25mg/L TB-PPD刺激，培养72h后，3000rpm离心5分钟收集细胞，用PBS洗涤2次，细胞悬液加入PE荧光素标记的抗小鼠CD₄ ⁺和FITC标记的CD₈ ⁺抗小鼠一抗，4℃避光30min，再用PBS-BSA-NaN₃(含2％BSA和0.5％NaN₃的PBS)洗涤2次，再加入400μL PBS-BSA-NaN₃，流式细胞仪检测T淋巴细胞表面CD₄ ⁺及CD₈ ⁺细胞亚群所占比例。

3结果

3.1血清特异性抗体滴度测定

rBCG:361组和卡介苗组各时间点血清抗体滴度相差不明显(P＞0.05)，而rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组免疫小鼠的抗体滴度明显高于rBCG:361组和卡介苗组，在第8周达到高峰，然后逐渐降低，但仍然高于卡介苗组和rBCG:361组(P＜0.05)(见图6)。BCG组和rBCG:361组血清IgG2a/IgG1比值在各时间点变化趋势基本一致，6周时IgG2a/IgG1比值较大，8-10周降低，然后又逐渐增大，rBCG:361组高于BCG组。rBCG:GCE组6周时IgG2a/IgG1比值较低，8周时升高，10周出现回落，至12周IgG2a/IgG1显著增大升高，且明显高于rBCG:361和BCG组(见图7)。

3.2特异性淋巴细胞增殖实验

各组经皮下免疫小鼠后，脾淋巴细胞增殖活性均较PBST组明显升高，且有增高的趋势，并在第10周时达到最高；其中，rBCG:361组和卡介苗组比较，刺激指数差异不显著(P＞0.05)，而rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组脾淋巴细胞增殖活性显著高于卡介苗组和rBCG:361组(P＜0.05)(见图8)。

3.3细胞因子的诱生

各免疫小鼠IFN-γ水平均较PBST明显升高，且有增高的趋势，在免疫后10周达到高峰；其中，rBCG:361组和卡介苗组比较，IFN-γ产生差别不大(P＞0.05)，而rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组IFN-γ含量显著高于卡介苗组和rBCG:361组(P＜0.05)(见图9)。各组细胞因子IL-4在各时间点产生均不明显，未达到试剂盒检测的最低浓度，OD值维持在0.015左右。

3.4免疫小鼠脾淋巴细胞亚群的变化

卡介苗组、rBCG:361组和重组BCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞CD₄ ⁺T细胞与PBST组相比均有增高的趋势，在免疫后10周达到最高；其中，卡介苗组和rBCG:361组CD₄ ⁺T细胞的比例相当；而重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组CD₄ ⁺T细胞比例明显高于PBST组、卡介苗组rBCG:361组(P＜0.05)(见图10)；BCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞CD₈ ⁺T细胞比例也显著高于其它组，10周时达高峰，至12周有所回落(P＜0.05)(见图11，12)。

4结论

共表达人GMCSF和结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6免疫原性优于传统卡介苗，为研制具有特异性抗结核杆菌免疫保护和佐剂增强双重效应的新型重组BCG疫苗奠定了基础。

Application Project

<110>四川大学

<120>一种用于结核病预防的重组卡介苗

<130>App File Reference：

<140>Current App Number：

<141>Current Filing Date：

<211>1065

<212>DNA

<213>人工序列和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<220>

<221>misc_feature

<220>

<221>mat_peptide

<222>(1)...(432)

<223>删除了终止密码子的人GM-CSF基因的CDS序列

<220>

<221>misc_peptide

<222>(433)...(732)

<223>删除了终止密码子的结核分枝杆菌CFP10的gene序列

<220>

<221>misc_binding

<222>(733)...(777)

<223>根据极性设计，以用作CFP10和ESAT6之间接头的核苷酸序列。

<220>

<221>gene

<222>(778)...(1065)

<223>结核分枝杆菌ESAT6的gene序列

<400>

atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc    60

cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg    120

cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc    180

tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag    240

cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac    300

tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt    360

gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag    420

ccagtccagg agatggcaga gatgaagacc gatgccgcta ccctcgcgca ggaggcaggt    480

aatttcgagc ggatctccgg cgacctgaaa acccagatcg accaggtgga gtcgacggca    540

ggttcgttgc agggccagtg gcgcggcgcg gcggggacgg ccgcccaggc cgcggtggtg    600

cgcttccaag aagcagccaa taagcagaag caggaactcg acgagatctc gacgaatatt    660

cgtcaggccg gcgtccaata ctcgagggcc gacgaggagc agcagcaggc gctgtcctcg    720

caaatgggct tcggtggcgg tggaagcggc ggtggcggat ccggcggtgg cggcagcatg    780

acagagcagc agtggaattt cgcgggtatc gaggccgcgg caagcgcaat ccagggaaat    840

gtcacgtcca ttcattccct ccttgacgag gggaagcagt ccctgaccaa gctcgcagcg    900

gcctggggcg gtagcggttc ggaggcgtac cagggtgtcc agcaaaaatg ggacgccacg    960

gctaccgagc tgaacaacgc gctgcagaac ctggcgcgga cgatcagcga agccggtcag    1020

gcaatggctt cgaccgaagg caacgtcact gggatgttcg catag                    1065

SequenceName：嵌合基因GMCSF-CFP10-ESAT6

SequenceDescription：将人的GM-CSF和结核分枝杆菌CFP10的mat_peptide与ESAT6基因连接在一起。

Claims (3)

1.一种重组卡介苗rBCG：GMCSF-CFP10-ESAT6，其特征在于，将GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因重组入卡介苗。

2.如权利要求1所述的重组卡介苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下几个步骤：

(1)hGM-CSF基因的扩增、结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6基因的扩增；

(2)CFP10-ESAT6融合基因的扩增；

(3)GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因的扩增；

(4)将GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因插入至大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361中，构建rpMV361GMCSF-CFP10-ESAT6；

(5)将(4)中的重组质粒电转化入卡介苗；

(6)用卡那霉素进行筛选；

(7)提取基因组，扩增GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因；

(8)热诱导后收集细菌蛋白，Western-blot鉴定GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合蛋白的表达。

3.一种重组质粒的制备方法，其特征在于，将人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)序列和结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6基因序列共同插入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒序列中。

Images