CN101455846A - 脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，由脱乙酰壳聚糖与结核抗原编码质粒组成，结核抗原编码质粒中插入有结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因，HSP65全长基因中插入4个来自结核杆菌抗原中的T细胞表位基因EAST－6_189－228、Ag85A_369－405、CFP10_162－207和Ag85B_420－459。本发明还公开了这种结核基因疫苗的应用，通过将本发明的基因疫苗滴鼻免疫小鼠，证实可诱导针对多个结核抗原的特异性抗体应答，能诱导全身及肺脏粘膜局部较强的结核特异性T细胞杀伤应答，同时可诱导分泌高水平IFNγ的Th1免疫应答，效果显著优于传统BCG疫苗，是一种优良的预防和治疗结核病的疫苗。

Description

脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，尤其涉及用于预防或治疗结核病的疫苗及其制备方法和应用，特别是一种脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗及其制备和应用。

背景技术

结核分枝杆菌感染导致的结核病的死灰复燃是当今全球重大的健康问题，由于人口密集度和流动性日益增加、常规BCG疫苗的无效性、结核耐药菌株的出现、以及AIDS病导致的结核并发感染，目前结核发病及死亡非常严重，全球每年有800万活动性结核患者并导致300万死亡；我国约有5.5亿人口曾经感染结核，每年13万人死于结核，每月约有12万新发病人。2006年结核已一跃成为我国感染性疾病发病的首位，研制新型结核预防疫苗非常迫切。

结核研究表明，结核杆菌主要感染肺部巨噬细胞。诱导Th1型的细胞免疫应答对于清除结核杆菌至关重要，诱导CD4+Th1及其分泌的高水平的IFNγ，不仅能够增强巨噬细胞的吞噬和杀菌能力，还可以通过促进CD8+CTL的诱导发挥特异性杀伤结核感染细胞，发挥免疫保护作用。基因疫苗或称DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达质粒、直接注射动物的第三代疫苗，由于可在体内表达目的抗原，通过外源性、内源性以及交叉抗原提呈途径被DC细胞提呈，有效激活CD4+Th1和CD8+T细胞，因此特别有利于诱导Th1型免疫应答。

除诱导Th1型细胞免疫应答至关重要以外，诱导肺粘膜局部的粘膜T细胞免疫应答同样非常关键。结核杆菌主要通过呼吸道粘膜入侵机体，粘膜免疫是人体免疫的第一道防线，可在感染的早期和最初感染部位有效控制感染，防止感染扩散。诱导呼吸道和肺部特异性粘膜免疫应答，对于有效控制结核早期感染具有非常重要的意义，因此结核特异性粘膜免疫的诱生成为新型结核疫苗研制的热点问题。通过呼吸道给予DNA疫苗可更好地模拟结核杆菌的天然感染，诱导特异性粘膜免疫，在粘膜局部感染的第一时间清除病原体，可能会产生更为有效的抗结核免疫保护作用。

然而，通常粘膜部位接种抗原通常很难诱导免疫应答，这是由于粘膜局部纤毛的频繁摆动、粘膜局部水解酶、DNA酶的大量存在，使得外来抗原迅速降解，不足以被APC提呈。因此需要通过粘膜疫苗递送系统来对DNA疫苗进行组装，而后在粘膜部位免疫。

因此，应用申请人过去申请的脱乙酰壳聚糖递送系统(一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳聚糖粘膜递送系统和其应用。专利申请号：200610147575.1)，根据这一专利的方法，再以申请人过去申请的基于T细胞表位的结核基因疫苗(基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用。专利申请号：200710171416.X)为基础，以特定性质的一种chitosan天然多糖通过共聚沉淀的方法与结核基因疫苗形成chitosan-DNA纳米颗粒复合物，而后进行滴鼻免疫，诱导结核特异性全身和肺部T细胞应答。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗及其制备和应用，所述的这种脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗要解决现有技术中由于常规BCG疫苗的无效性、以及结核耐药菌株的出现和AIDS病导致的结核伴发感染使得现有疫苗预防和治疗结核病的效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，由脱乙酰壳聚糖与结核抗原编码质粒组成，所述的结核抗原编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核杆菌热休克蛋白的全长基因，所述的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞表位分别是结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因，结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因，结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因，结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因。

进一步的，所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

进一步的，所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步的，所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的DNA序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步的，所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步的，所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因的DNA序列如SEQ ID NO：6所示。

进一步的，所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

进一步的，所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因的DNA序列如SEQ ID NO：8所示。

进一步的，所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

进一步的，所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因的DNA序列如SEQ ID NO：10所示。

进一步的，在结核杆菌的热休克蛋白HSP65全长基因中的第438位碱基后插入结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因、第486位碱基后插入结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因、第1185位碱基后插入结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因和结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因。

进一步的，所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因和所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因之间以gccgcctac基因序列相连接。

进一步的，所述的结核基因疫苗，嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

进一步的，所述的结核基因疫苗，嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO：12所示。

进一步的，所述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，所用的脱乙酰壳聚糖的分子量在380000～420000之间，脱乙酰度为75％-85％。

进一步的，所述的结核抗原编码质粒的构建方法，包括以下步骤：

1)提取结核分枝杆菌DNA作为模板，通过PCR方法扩增结核杆菌热休克蛋白HSP65编码基因；

2)以结核杆菌热休克蛋白HSP65基因作为模板，分别通过PCR扩增彼此有17个碱基重叠的双链DNA片段1、片段2、片段3，所述的片段1的双链DNA的序列为

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccga gctgaacaac gcgctgcaga acctggcgcg gacgatcgca

ctcgtctaac gccggtggct cgacttgttg cgcgacgtct tggaccgcgc ctgctagcgt

gcgatttcgg cgggtgacca gtccatcg

cgctaaagcc gcccactggt caggtagc

所述的片段2的双链DNA的序列为

           gggtgacca gtccatcggt gacctgatcg ccgagggtct ttcgatggct

           cccactggt caggtagcca ctggactagc ggctcccaga aagctaccga

gcttcttcgg cgctgacgct ggcgatggac aaggtgggca acgagggcgt catcaccgtc

cgaagaagcc gcgactgcga ccgctacctg ggccacccgt tgctcccgca gtagtggcag

gaggagtcca acacctttgg gctgcagctc gagctcaccg agggtatgcg gttcgacaag

ctcctcaggt tgtggaaacc cgacgtcgag ctcgagtggc tcccatacgc caagctgttc

ggctacatct cggggtactt cgtgaccgac ccggagcgtc aggaggcggt cctggaggac

ccgatgtaga gccccatgaa gcactggctg ggcctcgcag tcctccgcca ggacctcctg

ccctacatcc tgctggtcag ctccaaggtg tccactgtca aggatctgct gccgctgctc

gggstgtagg acgaccagtc gaggttccac aggtgacagt tcctagacga cggcgacgag

gagaaggtca tcggagccgg taagccgctg ctgatcatcg ccgaggacgt cgagggcgag

ctcttccagt agcctcggcc attcggcgac gactagtagc ggctcctgca gctcccgctc

gcgctgtcca ccctggtcgt caacaagatc cgcggcacct tcaagtcggt ggcggtcaag

cgcgacaggt gggaccagca gttgttctag gcgccgtgga agttcagcca ccgccagttc

gctcccggct tcggcgaccg ccgcaaggcg atgctgcagg atatggccat tctcaccggt

cgagggccga agccgctggc ggcgttccgc tacgacgtcc tataccggta agagtggcca

ggtcaggtga tcagcgaaga ggtcggcctg acgctggaga acgccgacct gtcgctgcta

ccagtccact agtcgcttct ccagccggac tgcgacctct tgcggctgga cagcgacgat

ggcaaggccc gcaaggtcgt ggtcaccaag gacgagacca ccatcgtcga gggcgccggt

ccgttccggg cgyyccagca ccagtggttc ctgctctggt ggtagcagct cccgcggcca

gacaccgacg ccatcgccgg acgagtggcc cagatccgcc aggagatcga gaacagcgac

ctgtggctgc ggtagcggcc tgctcaccgg gtctaggcgg tcctctagct cttgtcgctg

tccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcg

aggctgatgc tggcactctt cgacgtcctc gccgaccggt tcgaccggcc accacagcgc

gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag

cactagttcc ggccacggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggcgtagctc

gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactcgccgc ctacc

caccacgcga aggttcttcg tcggttattc gtcttcgtcc ttgagcggcg gatgg

所述的片段3的双链DNA的序列为

                                         gg aactcgccgc ctaccagcag

                                         cc ttgagcggcg gatggtcgtc

ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc caaggccgcc

aagtagatgc ggccgagcga cagccgggac gacctacgcc aagcgttacg gttccggcgg

gtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcaagcggc cccgaccctg

cagctcctcc cgtagcagcg gccaccccca cactgcgaca acgttcgccg gggctgggac

gacgagctga agctcgaagg cgacgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctg

ctgctcgact tcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagcactt ccaccgcgac

gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag

caccggggcg acttcgtcta gcggaagttg aggcccgacc tcggcccgca ccaccggcgc

aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat

ttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcgag tctggccaca gatgctccta

ctgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcg

gacgagcgac ggccgcaacg actgggccag ttccactggg caagccgcga cgtcttacgc

gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaag

cgcaggtagc gccccgacaa ggactggtgg ctccggcagc aacggctgtt cggccttttc

gagaaggctt ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggatttc

ctcttccgaa ccgaagggcc accgccgctg tacccaccgt acctaaag；

3)将上述的3段片段混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，通过PCR方法扩增获得嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因，将目的基因经EcoRI和Hind III双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得权利要求1所述的结核抗原编码质粒。

进一步的，是以SEQ ID NO：13所示的HSP65上游引物和SEQID NO：15所示的引物HSP65 T1序列通过PCR扩增片段1。

进一步的，以SEQ ID NO：16所示的引物HSP65 T2序列和SEQID NO：17所示的引物HSP65 E1序列通过PCR扩增片段2。

进一步的，以SEQ ID NO：18所示的引物HSP65E2序列和SEQID NO：14所示的HSP65下游引物通过PCR扩增片段3。

具体的，是将上述的片段1和片段2混合，热变性使各自成为单链DNA，由于片段1、2有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，再通过PCR法可扩增获得片段(1+2)的片段，再与片段3混合，热变性成为单链，由于片段2和片段3也有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，用SEQ ID NO：13所示的HSP65上游引物和SEQ ID NO：14所示的下游引物经PCR可扩增获得片段(1+2+3)，即嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因。

进一步的，所述的结核分枝杆菌DNA自结核分枝杆菌H37Rv株。

进一步的，所述的载体选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

本发明还提供了一种制备上述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)构建结核抗原编码质粒pECANS；

(2)将0.01～0.04％浓度、PH5.5-5.7的脱乙酰壳聚糖溶液，与50～400μg/ml pECANS质粒溶液在50-60℃下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的脱乙酰壳聚糖溶液中，所述的脱乙酰壳聚糖的分子量在38000～420000之间，脱乙酰度75％～85％，所述的质粒DNA溶解在5mM～25mM的Na2SO4中，通过共聚交联作用，获得的脱乙酰壳聚糖-pECANS纳米颗粒为球形，直径在50～200nm之间。

本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，以及药学上可以接受的载体或者赋形剂。

本发明还提供了上述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗在制备预防或治疗结核病的药物中的应用。

本发明通过DNA预测软件，从结核分枝杆菌的已知的4种关键抗原Ag85A、Ag85B、ESAT-6和CFP-10中各自筛选了一个T细胞表位，共4个T细胞表位，拟构建含有4个T细胞表位的结核靶抗原编码质粒。由于表位的氨基酸序列仅有8—20个，结构太小和简单，免疫原性很弱，通常不能诱导很强的免疫应答。因此拟挑选一种载体基因，将4个T细胞表位插入载体基因中，共同构成结核外源目的基因。

本发明选择结核杆菌来源的热休克蛋白65(HSP65)作为嵌入T细胞表位的基因载体。HSP65是热休克蛋白60家族成员，在细菌到人体细胞有很高的同源性。全长1623bp，编码540个氨基酸，分子量65kD。选择结核杆菌来源HSP65作为嵌入T细胞表位的基因载体的原因有两点：1、HSP内含有多个结核T细胞和B细胞表位，本身就是重要的免疫保护性抗原，已证实HSP65作为目的抗原免疫小鼠可产生抗结核强保护性免疫应答，且与产生IFN-γ的CD8⁺/CD44^hi细胞有关。2、HSP作为细胞内伴侣蛋白，参与蛋白质转位、折叠和装配，可帮助嵌入的表位更好地折叠形成空间结构。

本发明选择的4个T细胞表位来自以下4种结核抗原：

1)Ag85A，295氨基酸。结核菌的培养滤液中分泌蛋白的一个主要成分是Ag85复合体(antigen85complex)，由Ag85A、Ag85B、Ag85C组成的相对分子质量为38000蛋白家族。Ag85A可刺激机体产生体液免疫，也可激发Th1型细胞免疫，诱导CD8⁺T细胞增殖和IL-2及IFN-γ等上升。

2)Ag85B，蛋白质全长285氨基酸，分子量34.6KD。又称MPT59、Rv1886，是一种分枝杆菌转移酶，与细菌细胞壁合成有关，具有多个T细胞表位，能诱导Th1反应、IFN-γ的产生。

3)ESAT-6，又称Rv3875，全长288bp，95个氨基酸，分子量9.9KD，仅在强毒株中有这种抗原。含有多个T细胞表位，能激活CD4⁺、CD8⁺T细胞，在抗结核保护性免疫应答中起重要作用。ESAT-6还可刺激Mtb病人的外周血T细胞增殖，促进IFN-γ释放。用ESAT-6和佐剂制成的亚单位疫苗免疫小鼠具有较好的保护性。

4)CFP-10，低分子量结核杆菌培养滤液蛋白，全长303bp，100个氨基酸，分子量10000，与结核分枝杆菌毒力有关，刺激机体产生强烈的T细胞免疫应答并释放高水平的IFN-γ。

BCG传代过程中ESAT-6和CFP-10基因丢失，而在绝大多数毒株中这两个基因都存在。

本发明通过BLAST网络数据库比对、DNAstar生物软件分析以及亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性等参数的分析，选择各类参数均较好的结构区域作为候选疫苗表位区段；然后通过网络数据库(http://www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析预测这些区段中存在的T细胞抗原表位、同时与HLAI、II类分子可高亲和力结合的表位。经过计算机分子预测最后获得的4个T细胞表位分别是：结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因(EAST-6_189-228)；结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因(Ag85A_369-405)；结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因(CFP10_162-207)；结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因(Ag85B_420-459)。分别插入到HSP65基因的第438位碱基、第486位碱基、第1185位碱基后，构建结核靶抗原编码质粒。

本发明在pcDNA3.1或pVAX1质粒中，插入一段结核外源目的基因，作为靶抗原编码质粒，该结核外源目的基因由4个结核T细胞表位嵌合到结核HSP65蛋白的3个非关键结构位置所共同构成，经分析，4个表位的嵌入不会影响HSP65本身的正常三级、四级空间结构，因此将这一嵌合有4个T细胞表位的HSP65基因的靶抗原编码质粒称为ECANS(Epitope Cast in A Natural Structure，ECANS)。

本发明的疫苗可以以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种。

进一步的，所述的结核基因疫苗的粘膜免疫方法如下：

1)首先对动物进行轻度麻醉；

2)在鼻腔、口腔或生殖道内逐滴注入脱乙酰壳聚糖-pECANS纳米颗粒，

3)二周后重复1)+2)的免疫过程，

4)共免疫3～4次，pECANS DNA总量在150～200μg。

本发明采用的脱乙酰壳聚糖(chitosan，化学名为β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖)是甲壳类动物来源的天然生物多糖，是几丁质(chitin)的脱乙酰衍生物，完全无毒，具有生物可容性和生物可降解性。更重要的是：脱乙酰壳聚糖天然带正电荷，可与带负电荷的粘膜天然静电吸附，因此具有增强粘膜黏附吸收作用；此外还具有促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被广泛用于药物赋形剂与缓释剂。

以合适分子量和脱乙酰度的脱乙酰壳聚糖与质粒DNA在特定的浓度、温度、pH值、振荡速度条件下，可形成大小不一的共聚复合物。本发明以特定性质的脱乙酰壳聚糖制备特定溶液，与特定的DNA溶液，以共凝聚方法成功制备了直径在50-200nm的纳米颗粒复合物。具体选择0.02％浓度、PH.5.7的脱乙酰壳聚糖(分子量约400000，脱乙酰度75％～85％)溶液，与400μg/ml编码靶抗原的质粒DNA(pcDNA3.1载体构建)溶液(5mM Na2SO4)，在55℃下，以15000rpm速度高速混旋，通过共聚交联作用，制备了脱乙酰壳聚糖-结核靶抗原DNA纳米颗粒。

本发明中，将chitosan-pECANS结核基因疫苗免疫小鼠的方法采用滴鼻方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行：以常规小鼠麻醉方法轻度麻醉小鼠，将小鼠鼻孔向上，以枪头吸取<20μl液体直接逐滴滴入鼻腔内，待液滴随小鼠呼吸自主进入呼吸道后，再滴下一滴液体。可交替滴入两个鼻孔。液体总体积不宜超过50μl。

本发明中，所述的真核表达质粒的载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于：pcDNA3.1、pVAX以及常见和市售的真核质粒载体。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、变态反应)、有合理效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于：水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。

本发明的药物组合物，含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，pH值通常约6—8。

综上所述，本发明公开的一种脱乙酰壳聚糖递送系统组装的多表位ECANS结核粘膜基因疫苗，具有以下三大特性：

1)其核心是一种已申请专利的pECANS多表位靶抗原编码质粒(基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用。专利申请号：200710171416.X)，其中编码的结核靶抗原包括结核杆菌HSP65蛋白基因，和嵌入其中的4个结核杆菌优势抗原来源的4个T细胞表位，理论上含有至少5种结核抗原，可诱导多抗原特异性的、更有效的抗结核免疫保护作用。

2)通过已申请专利的脱乙酰壳聚糖粘膜递送系统chitosan(一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳聚糖粘膜递送系统和其应用。专利申请号：200610147575.1)，与上述pECANS质粒DNA形成共聚复合物后，再通过粘膜途径接种DNA疫苗，具有安全无毒性、缓释性、亲粘膜性等多种优势，可促进粘膜局部特异性免疫应答的诱导。

3)该结核粘膜基因疫苗通过优化免疫途径、免疫程序、免疫剂量、间隔时间，能更有效地诱导全身和粘膜T细胞和抗体应答。

本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明的chitosan-pECANS结核粘膜疫苗通过滴鼻途径免疫小鼠，有效诱导针对多个结核抗原的特异性抗体应答；更重要的是，能诱导全身及肺脏粘膜局部很强的结核特异性T细胞杀伤应答，同时可诱导分泌高水平IFNγ的Th1免疫应答，效果显著优于传统BCG结核疫苗。

附图说明

图1显示了chitosan-pECANS结核粘膜疫苗的构建示意图。图A显示了pECANS结核基因疫苗的构建图；图B显示了chitosan与pECANS形成共聚复合物示意图；图C显示了chitosan-pECANS纳米颗粒的电镜图。

图2显示了通过HSP65上游引物/T1、T2/E1、E2/HSP65下游引物三对引物分别扩增得到的双链DNA片段1(1-508bp)、片段2(491-1315bp)、片段3(1298-1788bp)，而后通过彼此重叠的17个碱基互补相连得到嵌合4个T细胞表位的HSP65全长基因，其中，粗体带下划线的序列是插入的4个T细胞表位序列。

图3显示了本发明中嵌合4个T细胞表位的HSP65全长基因的质粒PCR(图3A)、酶切(图3B)及部分测序鉴定结果(图3C)。

图4显示了chitosan-pECANS结核粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱生结核特异性抗体血清IgG水平。图A显示HSP65抗原特异性IgG的水平；图B显示Ag85A抗原特异性IgG效价；图C显示EAST6特异性IgG效价。

图5显示了chitosan-pECANS结核粘膜疫苗免疫小鼠诱导的特异性淋巴细胞杀伤活性。

图6显示了免疫小鼠脾细胞经结核抗原刺激后分泌IFN-γ的水平。

图7显示了chitosan-pECANS结核粘膜疫苗滴鼻免疫诱生脾脏特异性IFN-γ⁺T细胞数量。图A显示HSP65抗原特异性IFN-γ⁺T的水平；图B显示Ag85A抗原特异性IFN-γ⁺T数量；图C显示EAST6特异性IFN-γ⁺T数量。

图8显示了chitosan-pECANS结核粘膜疫苗滴鼻免疫诱生肺局部特异性IFN-γ⁺T细胞数量。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。

实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：

结核分枝杆菌标准H37Rv株(上海市疾病预防控制中心结防科提供)。质粒pcDNA3.1(-)、pVAX、pET32a、宿主细菌DH5α、BL21(Invitrogen公司)。基因合成委托上海赛百盛公司。chitosan(分子量在380000～420000之间，脱乙酰度为75％-85％)购自sigma公司、CFSE和PI染料购自sigma公司、小鼠IFN-γE LISA检测试剂盒购自R&D公司；HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体(Sant Clous公司)；。HSP65蛋白为本实验室自行表达(见200610027572.4号专利)、Ag85A及ESAT-6蛋白由上海市海归生物科技公司李忠明教授惠赠、Ag85A、ESAT-6多肽委托上海吉尔公司合成、Lipofectamin-2000购自invitrogen公司。限制性核酸内切酶EcoR I、Hind III(TaKaRa公司)、T4DNA连接酶(MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、SDS、EB(上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜公司)，大量质粒抽提试剂盒(Qiagen)。6-8周龄雌性BALB/c(H-2^d)小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。

实施例1：pcDNA3.1-ECANS结核基因疫苗的构建

1、ECANS结核基因疫苗的目的T细胞表位的预测

通过BLAST网络数据库、DNAstar生物软件、网络数据库(http://www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析，综合亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性、与HLAI、II类分子结合、等参数，预测获得的4个T细胞表位：结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因(EAST-6_189-228)；结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因(Ag85A_369-405)；结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因(CFP10_162-207)；结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因(Ag85B_420-459)。

以pcDNA3.1或pVAX为质粒载体，以结核分枝杆菌HSP65基因作为嵌合表位的基因载体，在计算机预测其二级结构的基础上，在其中不影响关键结构的位置第438位碱基后插入ESAT-6189～228表位基因、第486位碱基后插入Ag85A369～405、第1185位碱基后插入CFP-10162～207和Ag85B420～459，CFP-10和Ag85B之间以gccgcctac相连接，如图1A所示。

实施例2 pcDNA3.1-ECANS结核基因疫苗的构建

为了不在HSP65基因和T细胞表位基因之间引入酶切位点，本发明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，从5‘和3’端依次扩增三段彼此部分重叠的包含部分HSP65基因和T细胞表位的基因片段，变性后通过彼此重叠的互补序列连接，最后用5‘和3’两端HSP65引物PCR扩增出嵌合有4个T细胞表位的HSP65全长基因。同时在基因两端分别带上EcoR I和Hind III酶切位点，经双酶切后可连接入载体pcDNA3.1(-)或原核表达载体pET32a。

首先提取结核分枝杆菌H37Rv株(上海市疾病预防控制中心结防科)DNA，作为模板，用HSP65上游引物(SEQ ID NO：13)和下游引物(SEQ ID NO：14)通过PCR方法扩增获得HSP65片段，回收并纯化PCR产物(华舜公司小量胶回收试剂盒)。

以HSP65基因作为模板，分别以引物HSP65上游引物(SEQ IDNO：13)和T1引物(SEQ ID NO：15)通过PCR扩增片段1(如图2所示HSP65上游引物和T1相对，经PCR扩增得到的1—508bp双链DNA片段)，所述的片段1的双链DNA的序列为：

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccga gctgaacaac gcgctgcaga acctggcgcg gacgatcgca

ctcgtctaac gccggtggct cgacttgttg cgcgacgtct tggaccgcgc ctgctagcgt

gcgatttcgg cgggtgacca gtccatcg

cgctaaagcc gcccactggt caggtagc

，以T2引物(SEQ ID NO：16)和E1引物(SEQ ID NO：17)通过PCR扩增片段2(如图2所示T2引物和E1相对，经PCR扩增得到的491—1315bp双链DNA片段)，所述片段2的双链DNA的序列为：

           gggtgacca gtccatcggt gacctgatcg ccgagggtct ttcgatggct

           cccactggt caggtagcca ctggactagc ggctcccaga aagctaccga

gcttcttcgg cgctgacgct ggcgatggac aaggtgggca acgagggcgt catcaccgtc

cgaagaagcc gcgactgcga ccgctacctg ggccacccgt tgctcccgca gtagtggcag

gaggagtcca acacctttgg gctgcagctc gagctcaccg agggtatgcg gttcgacaag

ctcctcaggt tgtggaaacc cgacgtcgag ctcgagtggc tcccatacgc caagctgttc

ggctacatct cggggtactt cgtgaccgac ccggagcgtc aggaggcggt cctggaggac

ccgatgtaga gccccatgaa gcactggctg ggcctcgcag tcctccgcca ggacctcctg

ccctacatcc tgctggtcag ctccaaggtg tccactgtca aggatctgct gccgctgctc

gggstgtagg acgaccagtc gaggttccac aggtgacagt tcctagacga cggcgacgag

gagaaggtca tcggagccgg taagccgctg ctgatcatcg ccgaggacgt cgagggcgag

ctcttccagt agcctcggcc attcggcgac gactagtagc ggctcctgca gctcccgctc

gcgctgtcca ccctggtcgt caacaagatc cgcggcacct tcaagtcggt ggcggtcaag

cgcgacaggt gggaccagca gttgttctag gcgccgtgga agttcagcca ccgccagttc

gctcccggct tcggcgaccg ccgcaaggcg atgctgcagg atatggccat tctcaccggt

cgagggccga agccgctggc ggcgttccgc tacgacgtcc tataccggta agagtggcca

ggtcaggtga tcagcgaaga ggtcggcctg acgctggaga acgccgacct gtcgctgcta

ccagtccact agtcgcttct ccagccggac tgcgacctct tgcggctgga cagcgacgat

ggcaaggccc gcaaggtcgt ggtcaccaag gacgagacca ccatcgtcga gggcgccggt

ccgttccggg cgyyccagca ccagtggttc ctgctctggt ggtagcagct cccgcggcca

gacaccgacg ccatcgccgg acgagtggcc cagatccgcc aggagatcga gaacagcgac

ctgtggctgc ggtagcggcc tgctcaccgg gtctaggcgg tcctctagct cttgtcgctg

tccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcg

aggctgatgc tggcactctt cgacgtcctc gccgaccggt tcgaccggcc accacagcgc

gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag

cactagttcc ggccacggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggcgtagctc

gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactcgccgc ctacc

caccacgcga aggttcttcg tcggttattc gtcttcgtcc ttgagcggcg gatgg

以E2引物(SEQ ID NO：18)和HSP65下游引物(SEQ ID NO：14)通过PCR扩增片段3(如图2所示E2引物和HSP65下游引物相对，经PCR扩增得到的1298—1788bp双链DNA片段)，所述的片段3的双链DNA的序列为：

                                         gg aactcgccgc ctaccagcag

                                         cc ttgagcggcg gatggtcgtc

ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc caaggccgcc

aagtagatgc ggccgagcga cagccgggac gacctacgcc aagcgttacg gttccggcgg

gtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcaagcggc cccgaccctg

cagctcctcc cgtagcagcg gccaccccca cactgcgaca acgttcgccg gggctgggac

gacgagctga agctcgaagg cgacgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctg

ctgctcgact tcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagcactt ccaccgcgac

gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag

caccggggcg acttcgtcta gcggaagttg aggcccgacc tcggcccgca ccaccggcgc

aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat

ctgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcg

gacgagcgac ggccgcaacg actgggccag ttccactggg caagccgcga cgtcttacgc

gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaag

cgcaggtagc gccccgacaa ggactggtgg ctccggcagc aacggctgtt cggccttttc

gagaaggctt ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggatttc

ctcttccgaa ccgaagggcc accgccgctg tacccaccgt acctaaag；

将上述的片段1和片段2混合，变性使各自成为单链DNA，由于片段1、2有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，再以HSP65上游引物和E1引物通过PCR法可扩增获得片段(1+2)的片段，再与片段3混合，变性成为单链，由于片段2和片段3也有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，以HSP65上游引物(SEQ ID NO：13)和HSP65下游引物(SEQ ID NO：14)作为引物，通过PCR方法扩增获得获得片段(1+2+3)，即嵌合了4个T细胞表位的HSP目的基因即ECANS编码基因(如图2所示)。PCR鉴定结果显示产物为1807bp，如图3A所示。再将扩增产物经EcoR I和Hind III双酶切，回收酶切片段，与经相应酶切的载体pcDNA3.1(-)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选转化菌落。经酶切(图3B)及测序鉴定(图3C)，成功构建了pcDNA3-ECANS真核表达质粒。4段表位基因就以没有酶切位点的方式插入HSP65基因了。

将重组质粒ECANS转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经LB(Amp100μg/ml)液体培养基振荡培养15h，收集菌体，按照QIAGENPlasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。

实施例3 pET32a-ECANS原核表达载体的构建及蛋白表达纯化

将扩增得到的ECANS编码基因片段或者HSP65基因用EcoR I和Hind III双酶切，与经相应酶切的原核表达载体pET32a连接，构建了pET32a-ECANS和pET32a-HSP65原核表达质粒。

以pET32a-ECANS转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。经LB(Amp100μg/ml)液体培养基振荡培养至A600达到0.75左右，加入异丙基硫代半糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM。继续振荡培养3小时，4000r/min离心20min收集菌体，1×PBS重悬后超声破碎，12000r/min于4℃离心20min，分别收获上清和沉淀。上清过亲和层析柱，以不同浓度洗脱液洗脱，收集每1ml洗脱液，保存A280大于1.0的洗脱液，最后经12％ SDS-PAGE电泳鉴定表达的蛋白。最后得到纯化融合蛋白ECANS或HSP65。

实施例4 chitosan-pECNAS结核基因疫苗的制备

1)质粒DNA的大量制备：依照QIAGEN Plasmid Mega Kit进行。

2)分别制备chitosan溶液和pcDNA3.1-pECANS溶液，方法如下：首先制备0.02％、pH5.7的chitosan溶液，称取0.02g chitosan(Fluka，MW约400000，脱乙酰度75％—85％)，先以500μl-1ml 1％HAc溶液将其缓慢溶解，37℃放置1hr。而后称取0.042g NaAc，以80ml H₂O溶解，加入上述已彻底溶解的chitosan溶液，混匀后，以1N NaOH调节pH值至5.7，此即0.02％、pH5.7的chitosan溶液。pcDNA3.1-pECANS质粒以5mM Na₂SO₄溶解，DNA浓度为1mg/ml，-20℃保存备用。

3)采用共沉淀法(共凝聚法)制备chitosan-DNA纳米颗粒，方法如下：在55℃水浴中，将0.02％、pH5.7的chitosan溶液逐滴滴入400ug/ml质粒DNA溶液中，同时15000rpm高速振荡20秒，即可形成均一略带混浊的chitosan-DNA纳米颗粒(图1B、图1C)。

实施例5 chitosan-pECNAS结核粘膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠

将6-8周BALB/c雌鼠分为9组，其中滴鼻免疫5组，分别为：chitosan-pECANS、chitosan-pHSP65、pcDNA3.1-ECANS(简称pECANS)、pcDNA3.1-pHSP65(简称pHSP65)、chitosan；肌注免疫3组，分别为：pECANS、pHSP65、pcDNA3.1；皮下免疫组：BCG，每组6只小鼠。滴鼻免疫程序如下：以0.75％戊巴比妥钠80-120μl经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉。以含有50μg质粒DNA的chitosan-pECANS疫苗溶液逐滴滴入小鼠两侧鼻腔。肌注免疫程序如下：以0.75％戊巴比妥钠80-120μl经腹腔注射小鼠，使轻微麻醉。于小鼠胫骨前肌接种50μg pECANS质粒DNA疫苗，每腿50μl。每两周免疫1次，共4次，质粒总量为200μg。皮下免疫程序如下：小鼠麻醉后，以含有BCG(1×10⁵CFU)的PBS于小鼠背部皮下多点接种，总量100μl。每两周经眼眶后眦静脉采血，37℃静置30min，6000rpm×10min，收集血清，分装冻存于-70℃。

实施例6 chitosan-pECANS滴鼻免疫可诱导结核特异性抗体应答

间接ELISA法检测免疫小鼠血清中特异的抗结核抗原IgG。以5μg/ml HSP65蛋白、Ag85A蛋白、ESAT-6蛋白包被聚苯乙烯微孔板(包被液0.1M Na₂CO₃，pH9.6)4℃过夜。以5％ milk-PBS封闭板，200μl/孔，37℃ 1h。依次加1：50稀释血清、100μl/孔，37℃1h，洗板后加HRP-羊抗小鼠IgG 37℃ 1h，洗板后以邻苯二胺显色30min，2N H₂SO₄终止反应后测A₄₉₀值。

如图4A显示：chitosan-pECANS结核粘膜基因疫苗免疫三次以后在小鼠体内诱生了HSP65特异性IgG，在免疫第4周即可检测到HSP65特异性血清IgG，其水平随时间不断增高，于第10周达到OD值1.03，抗体滴度为1:4200，显著高于对照组。但IgG水平低于chitosan-pHSP65、pECANS、pHSP65滴鼻组和pECANS、pHSP65肌注组。此外，chitosan-pECANS结核粘膜基因疫苗还诱导了另外两种结核抗原Ag85A和ESAT-6特异性抗体应答。其中，Ag85A特异性IgG于第10周达到最高，但不高于其他组(图4B)；但其诱导的ESAT-6特异性IgG水平显著高于其他各组，效价达4000(图4C)。总之，chitosan-pECANS疫苗滴鼻免疫诱导了较强的结核多个抗原特异性抗体应答。

实施例5 chitosan-pECANS滴鼻免疫可诱导脾脏T细胞的特异性CTL杀伤和IFNγ分泌

1)小鼠脾细胞CTL功能检测

以瞬转pcDNA3.1-HSP65的SP2/0(SP2/0-HSP65)作为靶细胞，制备方法如下：取5μg纯化pcDNA3.1-HSP65加入245μl无血清1640中；取10μl Lipofectamin-2000加入240μl无血清1640中，分别小心混匀，将DNA逐滴加入到Lipofectamin-2000中，轻轻混匀，室温静置20min，逐滴加入2×10⁶ SP2/0细胞表面，收集24hr细胞作为靶细胞。

取末次免疫后10天小鼠脾脏细胞，重悬于含20U/ml IL-2的完全1640中，以5×10⁷细胞/孔接种6孔板，加入HSP65蛋白(200μg/ml)，37℃，5％ CO₂体外培养7天作为效应细胞，并以1μmCFSE进行标记。将2×10⁶个效应细胞/孔接种入96孔圆底板中，同时以100：1、50：1、10：1的比例加入相应数量靶细胞，37℃，5％ CO₂共孵育4小时，收集细胞，以20μg/ml PI进行染色，4℃染色30分钟后，应用流式细胞术进行CTL检测，计算被杀伤的靶细胞(CFSE^-PI⁺)的百分比。

结果显示，效靶比为50:1时，chitosan-pECANS组特异性杀伤率达79.66％，高于其他疫苗免疫组和阳性对照BCG组(图5)，提示chitosan-pECANS基因疫苗有效诱生了较强的结核特异性细胞免疫应答，有抵抗结核分枝杆菌感染的潜能。

2)小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平检测

取末次免疫后10天小鼠脾脏细胞，以HSP65蛋白(200μg/ml)，体外刺激培养(同上)，取48hr、96hr、144hr培养上清1ml，用小鼠IFN-γ ELISA试剂盒(R&D)检测脾脏T细胞分泌IFN-γ水平。

ELISA方法：以4μg/ml大鼠抗小鼠IFN-γ抗体(PBS)包被4℃过夜；以1％ BSA-PBS封闭；依次加100μl细胞培养上清或标准品、0.4μg/ml生物素标记羊抗小鼠IFN-γ抗体，100μl HRP标记链亲和素(Streptavidin-HRP)，以OPD显色，2N H₂SO₄终止，OD_490nm读数，绘制标准曲线，计算培养上清中IFN-γ表达量。

如图6所示，与其他疫苗免疫组相比，chitosan-pECANS滴鼻免疫小鼠脾脏T细胞经抗原特异性刺激后，分泌最高水平的IFN-γ，48hr最高，随后逐渐下降，但至144hr时仍高达1700pg/ml，提示该疫苗能够有效激活分泌IFN-γ的脾脏T细胞，有利于打破因结核杆菌感染而引起的免疫耐受或免疫抑制状态。

(3)小鼠脾细胞IFN-γ+T细胞的ELISPOT检测

以ELISPOT方法直接检测脾脏T细胞中分泌IFNγ的T细胞。以5μg/ml IFN-γ包被抗体100μl/孔4℃包被过夜，吸去孔内液体，用200μl完全1640 37℃封闭2hr。去液体，取末次免疫后10天小鼠脾脏，重悬于含20U/ml IL-2的完全1640中，以1×10⁶细胞/孔加入ELISPOT板，随后分别加入特异性抗原HSP65蛋白(200μg/ml)、表位多肽Ag85A、ESAT-6(20μg/ml)或非特异性抗原ConA(10μg/ml)，37℃，5％ CO₂培养60hr，吸弃各孔液体，加200μl冰预冷的去离子水，在冰上放置10min，PBST洗3次。加100μl生物素标记的抗小鼠IFN-γ检测抗体(2μg/ml)，37℃放置1hr。去液体，PBST洗3次。加100μl HRP标记链亲和素(Streptavidin-HRP)，37℃ 1hr，PBST洗4次，PBS洗2次，拍干。加100μl AEC底物避光显色30min，用自来水冲洗终止反应，室温下干燥板，在免疫斑点成像分析仪下计数斑点。

结果显示，chitosan-pECANS结核粘膜疫苗经滴鼻免疫后，脾脏HSP65特异性分泌IFN-γ的T细胞较其他组最高，达550/10⁶脾细胞(图7A)。此外，表位Ag85A、ESAT-6特异性I FN-γ⁺T细胞数量也最高，分别为400、280/10⁶脾细胞(图7B、图7C)。提示chitosan-pECANS可诱生强烈的结核特异性IFN-γ⁺T细胞的产生。

实施例6 chitosan-pECANS滴鼻免疫可诱导肺粘膜局部T细胞的特异性CTL杀伤和IFNγ分泌

1)小鼠肺脏局部淋巴细胞细胞的分离

分离免疫小鼠肺脏局部淋巴细胞，分离方法如下：取末次免疫后10天小鼠肺组织，称重约100mg/只，剪碎置于消化液中(胶原酶(1mg/ml)、DNA酶(5U/ml)、完全1640)，300mg/10ml消化液，于37℃摇床180rpm振摇60min。将混悬液过尼龙指套去除碎块，1500rpm离心5min，细胞重悬于4ml 40％ Percoll中，轻柔加至等体积70％ Percoll上方，2400rpm离心30min，吸取淋巴细胞，10mlPBS洗涤1次，重悬于含有20U/ml IL-2的完全1640中，调整浓度为5×10⁶/ml备用。

2)小鼠肺脏局部淋巴细胞IFN-γ ELISPOT检测

以ELISPOT方法直接检测肺脏T细胞中分泌IFNγ的T细胞，方法同实施例5：IFN-γ包被抗体包板，加入5×10⁵末次免疫后10天小鼠肺脏淋巴细胞，再加入特异性抗原HSP65蛋白(200μg/ml)、表位Ag85A、ESAT-6(20μg/ml)或ConA(10μg/ml)刺激培养60hr，加抗小鼠IFN-γ抗体和HRP标记链亲和素，最后AEC底物避光显色。

如图8所示，chitosan-pECANS免疫小鼠肺脏局部HSP65特异性IFN-γ⁺T细胞数量显著高于其他各组，达到280个IFN-γ⁺SFC/10⁶肺淋巴细胞。在表位Ag85A、ESAT-6特异性IFN-γ⁺T细胞方面，chitosan-pECANS粘膜疫苗同样诱导了最高数目的IFN-γ⁺T细胞，分别达290、330个IFN-γ⁺SFC/10⁶肺淋巴细胞；肌注pECANS组也诱导了的IFN-γ⁺T细胞，分别为160、170。结果提示，chitosan-pECANS通过呼吸道粘膜给入后，可诱导肺局部特异性分泌IFNγ的功能性的T细胞免疫应答，提示其可能在感染早期和感染局部有效清除结核杆菌，有效预防结核发生的潜力。

序列表

<110>复旦大学

<120>脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗及其制备和应用

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>540

<212>PRT

<213>结核杆菌热休克蛋白65

<400>1

<210>2

<211>1620

<212>DNA

<213>结核杆菌热休克蛋白65

<400>2

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>结核杆菌EAST-6189-228抗原

<400>3

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>结核杆菌EAST-6189-228抗原

<400>4

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>结核杆菌Ag85A369-405抗原

<400>5

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>结核杆菌Ag85A369-405抗原

<400>6

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>结核杆菌CFP-10162-207抗原

<400>7

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>结核杆菌CFP-10162-207抗原

<400>8

<210>9

<211>13

<212>PRT

<213>结核杆菌Ag85B420-459抗原

<400>9

<210>10

<211>39

<212>PRT

<213>结核杆菌Ag85B420-459抗原

<400>10

<210>11

<211>596

<212>PRT

<213>嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白65外源目的基因蛋白

<400>11

<210>12

<211>1788

<212>DNA

<213>嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白65外源目的基因

<400>12

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>HSP65上游引物

<400>13

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>HSP65下游引物

<400>14

<210>15

<211>88

<212>DNA

<213>T1引物

<400>15

<210>16

<211>88

<212>DNA

<213>T2引物

<400>16

<210>17

<211>73

<212>DNA

<213>E1引物

<400>17

<210>18

<211>73

<212>DNA

<213>E2引物

<400>18

Claims (25)

1.一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核基因疫苗由脱乙酰壳聚糖与结核抗原编码质粒组成，所述的结核抗原编码质粒由一个载体构成，在所述的载体中插入有结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因，所述的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞表位分别是结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因，结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因，结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因，结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因。

2.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

3.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

6.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的DNA序列如SEQ ID NO：4所示。

7.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

8.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因的DNA序列如SEQ ID NO：6所示。

9.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

10.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因的DNA序列如SEQ ID NO：8所示。

11.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

12.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因的DNA序列如SEQ ID NO：10所示。

13.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：在结核杆菌的热休克蛋白HSP65全长基因中的第438位碱基后插入结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因、第486位碱基后插入结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因、第1185位碱基后插入结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因和结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因。

14.根据权利要求13所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因和所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因之间以gccgcctac基因序列相连接。

15.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

16.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQ ID NO：12所示。

17.根据权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，其特征在于：所用的脱乙酰壳聚糖的分子量在380000～420000之间，脱乙酰度为75％-85％。

18.一种如权利要求1所述的结核抗原编码质粒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取结核分枝杆菌DNA作为模板，通过PCR方法扩增结核杆菌热休克蛋白HSP65编码基因；

2)以结核杆菌热休克蛋白HSP65基因作为模板，分别通过PCR扩增彼此有17个碱基重叠的双链DNA片段1、片段2、片段3，所述的片段1的双链DNA的序列为

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccga gctgaacaac gcgctgcaga acctggcgcg gacgatcgca

ctcgtctaac gccggtggct cgacttgttg cgcgacgtct tggaccgcgc ctgctagcgt

gcgatttcgg cgggtgacca gtccatcg

cgctaaagcc gcccactggtcaggtagc，

所述的片段2的双链DNA的序列为

           gggtgacca  gtccatcggt gacctgatcg ccgagggtct ttcgatggct

           cccactggt  caggtagcca ctggactagc ggctcccaga aagctaccga

gcttcttcgg cgctgacgct ggcgatggac aaggtgggca acgagggcgt catcaccgtc

cgaagaagcc gcgactgcga ccgctacctg ggccacccgt tgctcccgca gtagtggcag

gaggagtcca acacctttgg gctgcagctc gagctcaccg agggtatgcg gttcgacaag

ctcctcaggt tgtggaaacc cgacgtcgag ctcgagtggc tcccatacgc caagctgttc

ggctacatct cggggtactt cgtgaccgac ccggagcgtc aggaggcggt cctggaggac

ccgatgtaga gccccatgaa gcactggctg ggcctcgcag tcctccgcca ggacctcctg

ccctacatcc tgctggtcag ctccaaggtg tccactgtca aggatctgct gccgctgctc

gggstgtagg acgaccagtc gaggttccac aggtgacagt tcctagacga cggcgacgag

gagaaggtca tcggagccgg taagccgctg ctgatcatcg ccgaggacgt cgagggcgag

ctcttccagt agcctcggcc attcggcgac gactagtagc ggctcctgca gctcccgctc

gcgctgtcca ccctggtcgt caacaagatc cgcggcacct tcaagtcggt ggcggtcaag

cgcgacaggt gggaccagca gttgttctag gcgccgtgga agttcagcca ccgccagttc

gctcccggct tcggcgaccg ccgcaaggcg atgctgcagg atatggccat tctcaccggt

cgagggccga agccgctggc ggcgttccgc tacgacgtcc tataccggta agagtggcca

ggtcaggtga tcagcgaaga ggtcggcctg acgctggaga acgccgacct gtcgctgcta

ccagtccact agtcgcttct ccagccggac tgcgacctct tgcggctgga cagcgacgat

ggcaaggccc gcaaggtcgt ggtcaccaag gacgagacca ccatcgtcga gggcgccggt

ccgttccggg cgyyccagca ccagtggttc ctgctctggt ggtagcagct cccgcggcca

gacaccgacg ccatcgccgg acgagtggcc cagatccgcc aggagatcga gaacagcgac

ctgtggctgc ggtagcggcc tgctcaccgg gtctaggcgg tcctctagct cttgtcgctg

tccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcg

aggctgatgc tggcactctt cgacgtcctc gccgaccggt tcgaccggcc accacagcgc

gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag

cactagttcc ggccacggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggcgtagctc

gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactcgccgc ctacc

caccacgcga aggttcttcg tcggttattc gtcttcgtcc ttgagcggcg gatgg，

所述的片段3的双链DNA的序列为

                                         gg aactcgccgc ctaccagcag

                                         cc ttgagcggcg gatggtcgtc

ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc caaggccgcc

aagtagatgc ggccgagcga cagccgggac gacctacgcc aagcgttacg gttccggcgg

gtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcaagcggc cccgaccctg

cagctcctcc cgtagcagcg gccaccccca cactgcgaca acgttcgccg gggctgggac

gacgagctga agctcgaagg cgacgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctg

ctgctcgact tcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagcactt ccaccgcgac

gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag

caccggggcg acttcgtcta gcggaagttg aggcccgacc tcggcccgca ccaccggcgc

aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat

ttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcgag tctggccaca gatgctccta

ctgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcg

gacgagcgac ggccgcaacg actgggccag ttccactggg caagccgcga cgtcttacgc

gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaag

cgcaggtagc gccccgacaa ggactggtgg ctccggcagc aacggctgtt cggccttttc

gagaaggctt ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggatttc

ctcttccgaa ccgaagggcc accgccgctg tacccaccgt acctaaag；

3)将上述的3段片段混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，通过PCR方法扩增获得嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因，将目的基因经EcoRI和Hind III双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得权利要求1所述的结核抗原编码质粒。

19.根据权利要求18所述的结核抗原编码质粒的构建方法，其特征在于：所述的结核分枝杆菌DNA来自结核分枝杆菌H37Rv株。

20.根据权利要求18所述的结核抗原编码质粒的构建方法，其特征在于：所述的载体选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

21.一种制备如权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建结核抗原编码质粒pECANS；

(2)将0.01～0.04％浓度、PH5.5-5.7的脱乙酰壳聚糖溶液，与50～400μg/ml编码结核抗原的质粒pECANS溶液在50-60℃下，以15000-17000rpm速度高速混旋，在所述的脱乙酰壳聚糖溶液中，所述的脱乙酰壳聚糖的分子量在38000～420000之间，脱乙酰度75％～85％，所述的质粒DNA溶解在5mM～25mM的Na2SO4中，通过共聚交联作用，获得的脱乙酰壳聚糖-结核抗原质粒纳米颗粒为球形，直径在50～200nm之间。

22.一种药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求1所述的一种以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗，以及药学上可以接受的载体或者赋形剂。

23.一种权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗的应用方法，其特征在于，以滴鼻、口服或经生殖道方式实施粘膜部位接种。

24.如权利要求23所述的结核基因疫苗的粘膜部位接种方法如下：

1)首先对动物进行轻度麻醉；

2)在鼻腔、口腔或生殖道内逐滴注入脱乙酰壳聚糖-pECANS纳

米颗粒，

3)二周后重复1)+2)的免疫过程，

4)共免疫3～4次，pECANS DNA总量在150～200μg。

25.权利要求1所述的以脱乙酰壳聚糖递送系统组装的结核基因疫苗在制备预防或治疗结核病的药物中的应用。

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