CN101088559B

CN101088559B - 一种多表位结核基因疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN101088559B
Application number: CN2006100275724A
Authority: CN
Inventors: 熊思东; 高海峰; 王缨; 徐薇
Original assignee: Shanghai Xin'an Gene Immunity & Vaccine Research Development Co Ltd
Current assignee: Shanghai Xin'an Gene Immunity & Vaccine Research Development Co Ltd
Priority date: 2006-06-12
Filing date: 2006-06-12
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2026-06-12
Also published as: CN101088559A

Abstract

本发明公开了一种多表位结核基因疫苗，由一个载体构成，在载体中插入有一段目的基因，目的基因的5’端是HSP65全长基因，3’端串联排列选取的表位基因，依次是ESAT-6的1～20位基因和61～81位基因、Ag85A的62～84位基因、Ag85B的121～155位基因、Ag85A的143～166位基因、Ag85B的234～256位基因和MPT64C末端177～228位基因。本发明还公开了多表位结核基因疫苗的应用。小鼠免疫实验表明，本发明的基因疫苗能诱导较好的体液免疫应答。使用本发明的基因疫苗能诱导较好的以Th1型为主的针对结核分枝杆菌的免疫应答，显著增强抗结核杆菌免疫应答水平。

Description

一种多表位结核基因疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种重组基因疫苗，尤其涉及一种用于治疗和预防结核病的疫苗及其制备方法，具体来说是一种多表位结核基因疫苗及其制备方法。

背景技术

研究表明热休克蛋白65(HSP65)是热休克蛋白60家族成员之一，在原核和真核细胞中高度保守，从细菌到人体细胞的HSP序列有很高的同源性。在Mtb中全长1623bp，540个氨基酸，分子量65kD。正常情况下，HSP参与一些重要的细胞生理活动，如蛋白质转位、折叠和装配，起着分子伴侣的重要作用。在Mtb感染过程中，HSP65是机体对抗其入侵的最重要的免疫保护性抗原之一。在被Mtb感染的小鼠体内，20％的效应性T细胞能够识别HSP65。有实验证实分枝杆菌HSP65作为免疫系统的内源性基因抗原时，能产生抗结核的强保护性，而且这与脾T细胞群中占主导地位的CD8+/CD44hi的IFN-γ产生细胞有关。

ESAT-6，又称Rv3875，在减毒株中没有这种抗原成分，全长288bp，95个氨基酸，分子量9.9KD。它是重要的T细胞抗原，含有多个T细胞表位，能激活CD4+、CD8+T细胞，在抗Mtb的保护性免疫应答中起重要作用，是免疫记忆应答中的主要靶抗原之一。此外，ESAT-6还可刺激Mtb病人的外周血T细胞增殖，促进IFN-γ释放。用ESAT-6和佐剂制成的亚单位疫苗免疫小鼠已观察到具有较好的保护性。

Ag85A，抗巨噬细胞的主要成分，成熟蛋白质全长295氨基酸。在结核菌和BCG的培养滤液中分泌蛋白的一个主要成分是Ag85复合体(antigen 85 complex)，由Ag85A、Ag85B、Ag85C组成的相对分子质量为38000蛋白家族。Ag85A不仅可以刺激机体产生体液免疫，尚可激发较强Th1型细胞免疫，引起CD8+T细胞增殖和IL-2及IFN-γ等细胞因子水平的上升，结核病的免疫学特征表现为细胞免疫功能低下，研究结果显示，CD8+T细胞的保护功能可能与IFN-γ诱导有关。

Ag85B，又称MPT59、Rv1886，是一种分枝杆菌转移酶，成熟蛋白质全长285氨基酸，分子量34.6KD。它在细菌培养液中分泌量最多，与细菌细胞壁合成有关，具有多个T细胞表位，能诱导Th1反应、IFN-γ的产生。

MPT64，又称Rv1980，在某些减毒株中不存在这种抗原，全长228个氨基酸，分子量24.8KD。MPT64属于Mtb的早期分泌性蛋白，也是重要的T细胞抗原，主要刺激特异性CTL形成和IFN-γ产生，同样也能诱导机体抵御Mtb的攻击。Roche等绘制了MPT64蛋白的免疫原性表位，发现T细胞决定族遍布蛋白的全长，而C末端序列184～228位氨基酸是相对特异的T细胞表位，190～198多肽为H2-D(b)限制性的CD8+T细胞表位。因此，在Mtb疫苗免疫的策略中，加入激活特异性的CD8+T细胞抗原成分可能提高疫苗的整体保护率。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种多表位结核基因疫苗及其制备方法，所述的多表位结核疫苗解决了现有技术中的疫苗诱导细胞免疫应答水平不高的技术问题。

本发明一种多表位结核基因疫苗，由一个载体构成，在所述的载体中插入有一段外源目的基因，所述的外源目的基因的5’端是HSP65全长基因，3’端串联排列选取的表位基因，依次是ESAT-6的1～20位基因和61～81位基因、Ag85A的62～84位基因、Ag85B的121～155位基因、Ag85A的143～166位基因、Ag85B的234～256位基因和MPT64C末端177～228位基因。

进一步的，上述的各表位基因序列之间采用编码AAY的碱基序列进行连接。

进一步的，所述的载体为质粒。

进一步的，所述的质粒为pcDNA3。

进一步的，上述的一种多表位结核基因疫苗，含有SEQ ID NO：18所示的碱基序列。

本发明还提供了一种制备上述的多表位结核基因疫苗的方法，包含以下步骤：

1)PCR方法合成结核分枝杆菌来源的HSP65编码基因(SEQ ID NO：2)；

2)合成多表位串联的编码基因：ESAT-6的1～20位基因和61～81位基因、Ag85A的62～84位基因、Ag85B的121～155位基因、Ag85A的143～166位基因、Ag85B的234～256位基因和MPT64C末端177～228位基因；

3)用HSP65的N端上游引物及MPT64的C端下游引物，PCR方法大量扩增基因疫苗的外源目的基因，将外源目的基因经双酶切后克隆入质粒，构建重组的质粒，将重组质粒转化宿主细菌，进行筛选、分离、纯化。

进一步的，所述的质粒为pcDNA3。

本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的权利要求1所述的一种多表位结核基因疫苗，以及药学上可以接受的载体或者赋形剂。

本发明还提供了上述的一种多表位结核基因疫苗在制备预防结核病的药物中的应用。

本发明通过BLAST网络数据库比对、DNAstar生物软件分析以及亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性等参数的分析，结合已有的研究成果，进一步选择各类参数均较好的结构区域作为候选疫苗表位区段；通过网络数据库(http://www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析确定这些区段中可能存在的T细胞抗原表位；最后结合上述数据，预测同时具有T、B细胞表位的理想短肽作为候选疫苗表位。利用分子模拟技术在设计抗原表位、小分子拮抗剂、配体-受体阻断剂等方面得到广泛应用，并取得了良好的预期结果。本发明用计算机分子模拟的方法分析候选基因的T细胞表位，并筛选出与HLAI、II类分子具有高亲和力的表位进行串联。通过基因免疫的手段研究其诱导免疫应答及抗结核分枝杆菌的功能及其机制。

最终确定选用ESAT-6的1～20位基因和61～81位基因、Ag85A的62～84位基因、Ag85B的121～155位基因、Ag85A的143～166位基因、Ag85B的234～256位基因和MPT64C末端177～228位基因作为基因疫苗的候选表位，串联后连接到HSP65基因C末端，构建多表位结核基因疫苗。

小鼠免疫实验表明，本发明的多表位基因疫苗能诱导较好的体液免疫应答。在体外的小鼠淋巴细胞增殖及杀伤实验及细胞因子检测表明，使用本发明的多表位基因疫苗能诱导较好的以Th1型为主的针对结核分枝杆菌的免疫应答，显著增强抗结核杆菌免疫应答水平。

附图说明

图1显示了基于多表位基因疫苗的质粒模式图。

图2显示了基于多表位基因疫苗的质粒PCR(图2A)、酶切(图2B)及测序鉴定结果(图2C)。

图3显示了pcDNA3-HEAT基因疫苗免疫小鼠后，产生的特异性体液免疫应答能力。

图4显示了pcDNA3-HEAT基因疫苗免疫小鼠后，小鼠脾细胞在体外经抗原特异性刺激后，淋巴细胞增殖应答能力。

图5显示了pcDNA3-HEAT基因疫苗免疫小鼠后，小鼠脾细胞在体外经抗原特异性刺激活化后，淋巴细胞杀伤活性。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。

实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：

质粒、菌种、细胞、动物：质粒pcDNA3、pET32a、宿主细菌DH5α、BL21(均由本室保存)。基因合成委托上海赛百盛公司。4-6周龄雌性BALB/c(H-2K^d)小鼠购自中国科学院动物中心。

分子生物学试剂：限制性核酸内切酶EcoRI、XbaI、SalI(TaKaRa公司)、T4 DNA连接酶(MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、SDS、EB、重蒸酚(上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜生物制品公司)。

免疫学试剂和材料：羊抗小鼠CXCR3多克隆抗体(Sant Clous公司)；FITC标记驴抗羊IgG(ELISA效价1：5000，华美生物工程有限公司)；2ml和1ml无菌注射器(米沙瓦医科工业有限公司)。

实施例1：HEAT基因疫苗的设计、构建、鉴定和表达

运用分子生物学软件和网络数据库预测的方法，结合已有的结核蛋白表位研究的相关报道，确定由结核分枝杆菌HSP65全长基因、ESAT-6的1～20位基因和61～81位基因、Ag85A的62～84位基因、Ag85B的121～155位基因、Ag85A的143～166位基因、Ag85B的234～256位基因和MPT64 C末端177～228位基因串联构建本发明的基因疫苗。

本发明分别利用PCR方法和DNA序列直接合成的方法，扩增目的基因，最后用头尾两段引物PCR扩增出全长基因。同时在基因两端分别带上EcoRI和XbaI酶切位点，经双酶切后连接入载体pcDNA3；或用另一套引物使基因两端分别带上EcoRI和SalI酶切位点，经双酶切后连接入原核表达载体pET32a。

HEAT基因片段的合成

以软件预测结合网络数据库，首先确定了下述目的序列：HSP65氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：

MAKTIAYDEEARRGLERGLNALADAVKVTLGPKGRNVVLEKKWGAPTITND

GVSIAKEIELEDPYEKIGAELVKEVAKKTDDVAGDGTTTATVLAQALVREGLR

NVAAGANPLGLKRGIEKAVEKVTETLLKGAKEVETKEQIAATAAISAGDQSIG

DLIAEAMDKVGNEGVITVEESNTFGLQLELTEGMRFDKGYISGYFVTDPERQE

AVLEDPYILLVSSKVSTVKDLLPLLEKVIGAGKPLLIIAEDVEGEALSTLVVNKI

RGTFKSVAVKAPGFGDRRKAMLQDMAILTGGQVISEEVGLTLENADLSLLGK

ARKVVVTKDETTIVEGAGDTDAIAGRVAQIRQEIENSDSDYDREKLQERLAKL

AGGVAVIKAGAATEVELKERKHRIEDAVRNAKAAVEEGIVAGGGVTLLQAAP

TLDELKLEGDEATGANIVKVALEAPLKQIAFNSGLEPGVVAEKVRNILPAGHGL

NAQTGVYEDLLAAGVADPVKVTRSALQNAASIAGLFLTTEAVVADKPEKEKA

SVPGGGDMGGMDF。

HSP65(SEQ ID NO：2)：

atggccaagacaattgcgtacgacgaagaggcccgtcgcggcctcgagcggggcttgaacgccctcgccgatgcggta

aaggtgacattgggccccaagggccgcaacgtcgtcctggaaaagaagtggggtgcccccacgatcaccaacgatggt

gtgtccatcgccaaggagatcgagctggaggatccgtacgagaagatcggcgccgagctggtcaaagaggtagccaag

aagaccgatgacgtcgccggtgacggcaccacgacggccaccgtgctggcccaggcgttggttcgcgagggcctgcgc

aacgtcgcggccggcgccaacccgctcggtctcaaacgcggcatcgaaaaggccgtggagaaggtcaccgagaccct

gctcaagggcgccaaggaggtcgagaccaaggagcagattgcggccaccgcagcgatttcggcgggtgaccagtccat

cggtgacctgatcgccgaggcgatggacaaggtgggcaacgagggcgtcatcaccgtcgaggagtccaacacctttgg

gctgcagctcgagctcaccgagggtatgcggttcgacaagggctacatctcggggtacttcgtgaccgacccggagcgtc

aggaggcggtcctggaggacccctacatcctgctggtcagctccaaggtgtccactgtcaaggatctgctgccgctgctcg

agaaggtcatcggagccggtaagccgctgctgatcatcgccgaggacgtcgagggcgaggcgctgtccaccctggtcgt

caacaagatccgcggcaccUcaagtcggtggcggtcaaggctcccggcttcggcgaccgccgcaaggcgatgctgca

ggatatggccattctcaccggtggtcaggtgatcagcgaagaggtcggcctgacgctggagaacgccgacctgtcgctgc

taggcaaggcccgcaaggtcgtggtcaccaaggacgagaccaccatcgtcgagggcgccggtgacaccgacgccatc

gccggacgagtggcccagatccgccaggagatcgagaacagcgactccgactacgaccgtgagaagctgcaggagcg

gctggccaagctggccggtggtgtcgcggtgatcaaggccggtgccgccaccgaggtcgaactcaaggagcgcaagc

accgcatcgaggatgcggttcgcaatgccaaggccgccgtcgaggagggcatcgtcgccggtgggggtgtgacgctgtt

gcaagcggccccgaccctggacgagctgaagctcgaaggcgacgaggcgaccggcgccaacatcgtgaaggtggcg

ctggaggccccgctgaagcagatcgccttcaactccgggctggagccgggcgtggtggccgagaaggtgcgcaacctg

ccggctggccacggactgaacgctcagaccggtgtctacgaggatctgctcgctgccggcgttgctgacccggtcaaggt

gacccgttcggcgctgcagaatgcggcgtccatcgcggggctgttcctgaccaccgaggccgtcgttgccgacaagccg

gaaaaggagaaggcttccgttcccggtggcggcgacatgggtggcatggatttc。

EAST-6的1-20氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：

MTEQQWNFAGIEAAASAIQG。

EAST-6的1-20 DNA序列(SEQ ID NO：4)：

atgacagagcagcagtggaatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatccaggga。

EAST-6的61-81氨基酸序列(SEQ ID NO：5)：

TATELNNALQNLARTISEAGQ。

EAST-6的61-81 DNA序列(SEQ ID NO：6)：

acggctaccgagctgaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagcgaagccggtcag。

Ag85A的62-84氨基酸序列(SEQ ID NO：7)：

DQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQ。

Ag85A的62-84 DNA序列(SEQ ID NO：8)：

gaccagtcgggcctgtcggtggtcatgccggtgggtggccagtcaagcttctactccgactggtaccag。

Ag85B的121-155氨基酸序列(SEQ ID NO：9)：

AAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSALLDP。

Ag85B的121-155DNA序列(SEQ ID NO：10)：

gctgcaatcggcttgtcgatggccggctcgtcggcaatgatcttggccgcctaccacccccagcagttcatctacgccggc

tcgctgtcggccctgctggacccc。

Ag85A的143-166氨基酸序列(SEQ ID NO：11)：

FVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGL。

Ag85A的143-166 DNA序列(SEQ ID NO：12)：

ttcgtctacgcgggagcgatgtcgggcctgttggacccctcccaggcgatgggtcccaccctgatcggcctg。

Ag85B的234-256氨基酸序列(SEQ ID NO：13)：

RSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNF。

Ag85B的234-256 DNA序列(SEQ ID NO：14)：

cgtagcagcaacctgaagttccaggatgcgtacaacgccgcgggcgggcacaacgccgtgttcaacttc。

MPT64的177-228氨基酸序列(SEQ ID NO：15)：

APNAGLDPVNYQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPEAAGPTQVLVPRSAIDSMLA。

MPT64的177-228 DNA序列(SEQ ID NO：16)：

gcgccgaatgccggcttggacccggtgaattatcagaacttcgcagtcacgaacgacggggtgattttcttcttcaacccgg

gggagttgctgcccgaagcagccggcccaacccaggtattggtcccacgttccgcgatcgactcgatgctggcctag。

如图1所示，在以短肽为基础的多表位疫苗设计中，氨基酸的短肽分子很可能以线性形态存在，将大大降低表位分子的抗原性，为此必须引入高分子刚性连接序列。此外，由于所选表位往往都是抗原性参数较好的氨基酸序列，连接序列必须表现为低抗原性，才能保证各表位间的独立性，从而诱导以各表位为单位的免疫应答。因此，存在一定分子刚性，又表现为低抗原性的α-螺旋结构可能是进行表位连接的理想选择。本发明选用通用的编码AAY的碱基序列作为基因疫苗各个表位基因之间的连接序列，正好符合上述各项要求。由此，我们所设计的多表位串联结核基因疫苗分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，DNA序列如SEQ ID NO：18所示；

实施例2 多表位结核基因疫苗的构建

以提取的结核分枝杆菌H37Rv株(由上海市疾病预防控制中心结防科提供)DNA作为模板，用HSP65上游(SEQ ID NO：19)和下游(SEQ ID NO：20)特异性引物通过PCR方法扩增HSP65片段，低熔点胶回收并纯化PCR产物。

将设计好的粘端互补DNA序列1～7，以T₄ DNA连接酶连接，连接产物再分别与PCR扩增的HSP65和MPT64进行连接；以连接产物为模板，再用HSP65上游(SEQ ID NO：19)和MPT64下游(SEQID NO：29)特异性引物通过PCR方法扩增多表位基因疫苗全长基因片段。结果如图2所示，得到2296bp的全长编码基因，命名为HEAT。再将扩增产物双酶切后分别连接入pcDNA3质粒载体中，经测序证明序列完全正确。

将设计好的粘端互补DNA序列1～7，以T₄ DNA连接酶连接，连接产物再分别与PCR扩增的HSP65和MPT64进行连接；以连接产物为模板，再用HSP65上游(SEQ ID NO：19)和MPT64下游(SEQID NO：30)特异性引物通过PCR方法扩增多表位基因疫苗全长基因片段，再将扩增产物双酶切后分别连接入pET32a质粒载体中，经测序证明序列完全正确。

根据上述编码基因，设计PCR引物如表1：

表1.多表位基因疫苗引物

实施例3 pcDNA3-HEAT真核表达载体的构建及质粒纯化

将扩增得到的HEAT编码基因片段用EcoR I和Xba I双酶切，回收酶切片段，与经相应酶切的载体pcDNA3连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选转化菌落。经PCR、酶切及测序鉴定，成功构建了pcDNA3-HEAT真核表达质粒(图2A，2B，2C)。

将重组质粒pcDNA3-HEAT转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经LB(Amp100μg/ml)液体培养基振荡培养15h，收集菌体，按照QIAGEN Plasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，最后得到纯化的质粒DNA，即我们的基因疫苗pcDNA3-HEAT。

实施例4 pET32a-HEAT原核表达载体的构建及蛋白表达纯化

将扩增得到的HEAT编码基因片段用EcoR I和Sal I双酶切，回收酶切片段，与经相应酶切的载体pET32a连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21，氨苄青霉素筛选转化菌落。经PCR、酶切及测序鉴定，成功构建了pET32a-HEAT原核表达质粒(图2A，2B，2C)。

以重组表达质粒pET32a-HEAT转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。经LB(Amp100μg/ml)液体培养基振荡培养至A600达到0.75左右，加入异丙基硫代半糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM。继续振荡培养3小时，4000r/min离心20min收集菌体，1×PBS重悬后超声破碎，12000r/min于4℃离心20min，分别收获上清和沉淀。上清过亲和层析柱，以不同浓度洗脱液洗脱，收集每1ml洗脱液，保存A280大于1.0的洗脱液，最后经12％SDS-PAGE电泳鉴定表达的蛋白。最后得到我们所需的纯化融合蛋白HEAT。

实施例5 多表位基因疫苗诱导小鼠体液免疫应答

将实施例3中获得的真核表达质粒pcDNA3-HEAT溶解于无菌、无热源的生理盐水中，浓度调为2μg/μl。6-8周龄雌性BALB/c(H-2^d)健康小鼠12只，分为2组：(1)以纯化的pcDNA3空质粒载体免疫组作对照，6只；(2)以纯化的pcDNA3-HEAT质粒免疫，6只。肌肉免疫雌性BALB/c小鼠采用轻度麻醉后胫骨前肌肉注射法以100μg质粒DNA免疫每只小鼠，两腿各50μg。于0周、3周、6周肌注基因免疫小鼠三次。每两周经眼眶采血一次，检测产生的体液免疫应答水平。获得血样4℃放置过夜后，6000转/min离心15min获得血清样本，-20℃冻存备用。

选取经实施例4获得的纯化的融合蛋白HEAT 5μg/ml 4℃16h包被聚苯乙烯微孔板，100μl/孔。含有10％山羊血清、0.5％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的封闭液200μl/孔，37℃作用1h，间接ELISA法检测免疫小鼠抗血清中特异的IgG。抗血清经1：80稀释后，100μl/孔，37℃作用1h，洗涤后加入1：4000稀释的HRP-羊抗鼠IgG在37℃作用1h，以邻苯二胺显色30min，终止反应后测A₄₉₀值。

如图3所示，实验结果显示：基因疫苗免疫三次以后可在小鼠体内诱导产生特异性的体液免疫应答，其抗血清中IgG滴度在第14周时达到最高，达1：640，而空质粒注射组则无特异性抗体生成。

实施例6 多表位基因疫苗诱导小鼠细胞免疫应答

免疫小鼠第8周时处死取脾细胞，以5×10⁵细胞/孔加入96孔板，分别加入非特异性抗原con A(5μg/ml)或由实施例4中获得的特异性抗原纯化的融合蛋白HEAT(50μg/ml)，37℃、5％CO₂培养72小时，在收获细胞前18小时每孔加入0.5uCi³H-TdR，最后以多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液体闪烁计数器测量cpm值。以各数值除以空白对照，得到各组的刺激指数，见图4。

同样取自8周免疫小鼠的脾细胞，以4×10⁶细胞/孔加入6孔板中，以由实施例4中获得的50μg/ml的纯化融合蛋白HEAT刺激，第二天加入50μ/ml的IL-2，培养5天后作为效应细胞，而转染了pcDNA3-HEAT基因的SP2/0细胞作为靶细胞，用CFSE标记效应细胞后，以10：1、20：1和40：1的效靶比混合加入96孔板，37℃作用6小时后收集细胞，加入7-AAD 4℃染色30分钟，流式细胞仪检测靶细胞调亡情况。以杀伤百分比作图见图5。

不同质粒免疫小鼠脾脏细胞的增殖情况见图4，不同质粒免疫小鼠脾脏细胞的特异性杀伤情况见图5，可以见到免疫组脾细胞增殖能力增加，特异性杀伤能力明显增强，证明该基因疫苗能够诱导较好的细胞免疫应答，有利于抵抗结核分枝杆菌的感染。

序列表

<110>上海欣安基因免疫与疫苗研究开发有限公司

<120>一种多表位结核基因疫苗及其制备方法

<160>30

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>540

<212>PR

<213>Mtb

<400>1

<210>2

<211>1620

<212>DNA

<213>Mtb

<400>2

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>Mtb

<400>3

<210>4

<211>60

<212>DNA

<213>Mtb

<400>4

<210>5

<211>21

<212>PRT

<213>Mtb

<400>5

<210>6

<211>63

<212>DNA

<213>Mtb

<400>6

<210>7

<211>23

<212>PRT

<213>Mtb

<400>7

<210>8

<211>69

<212>DNA

<213>Mtb

<400>8

<210>9

<211>35

<212>PRT

<213>Mtb

<400>9

<210>10

<211>105

<212>DNA

<213>Mtb

<400>10

<210>11

<211>24

<212>PRT

<213>Mtb

<400>11

<210>12

<211>72

<212>DNA

<213>Mtb

<400>12

<210>13

<211>23

<212>PRT

<213>Mtb

<400>13

<210>14

<211>69

<212>DNA

<213>Mtb

<400>14

<210>15

<211>52

<212>PRT

<213>Mtb

<400>15

<210>16

<211>159

<212>DNA

<213>Mtb

<400>16

<210>17

<211>759

<212>PRT

<213>人工序列

<400>17

<210>18

<211>2280

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

<210>20

<211>35

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>20

<210>21

<211>79

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>21

<210>22

<211>79

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>22

<210>23

<211>79

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>23

<210>24

<211>79

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>24

<210>25

<211>79

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>25

<210>26

<211>79

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>26

<210>27

<211>79

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>27

<210>28

<211>37

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>28

<210>29

<211>24

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>29

<210>30

<211>24

<212>DNA引物

<213>人工序列

<400>30

Claims

1.一种多表位结核基因疫苗，由一个载体构成，其特征在于：在所述的载体中插入有一段外源目的基因，所述的外源目的基因的5’端是HSP65全长基因，3’端串联排列选取的表位基因，依次是ESAT-6的1～20位基因和61～81位基因、Ag85A的62～84位基因、Ag85B的121～155位基因、Ag85A的143～166位基因、Ag85B的234～256位基因和MPT64C末端177～228位基因，各表位基因序列之间采用编码AAY的碱基序列进行连接，所述的外源目的基因的基因序列如SEQ ID NO：18所示。

2.根据权利要求1所述的多表位基因疫苗，其特征在于：所述的载体为质粒。

3.根据权利要求2所述的多表位基因疫苗，其特征在于：所述的质粒为pcDNA3。

4.制备权利要求1所述的多表位结核基因疫苗的方法，其特征在于：包含以下步骤：

1)PCR方法扩增结核分枝杆菌来源的HSP65编码基因，所述的结核分枝杆菌来源的HSP65编码基因序列如SEQ ID NO：2所示；

2)分别合成粘端互补的各表位编码基因：ESAT-6的1～20位基因和61～81位基因、Ag85A的62～84位基因、Ag85B的121～155位基因、Ag85A的143～166位基因、Ag85B的234～256位基因和MPT64C末端177～228位基因，以T4DNA连接酶依次连接；而后与1)步骤扩增的HSP65基因以T4DNA连接酶连接，构成外源目的基因，所述的外源目的基因的基因序列如SEQ ID NO：18所示；

3)以外源目的基因为模板，用HSP65的N端上游引物及MPT64的C端下游引物，PCR方法扩增基因疫苗的外源目的基因，所述的HSP65的N端上游引物序列如SEQ ID NO：19所示，MPT64的C端下游引物序列如SEQ ID NO：29或者SEQ IDNO：30所示，将扩增产物经EcoR I和Xba I双酶切，或经EcoRI和Sal I双酶切后，克隆入质粒，构建重组质粒，将重组质粒转化宿主细菌，进行筛选、分离、纯化。

5.如权利要求4所述的制备多表位结核基因疫苗的方法，其特征在于：所述的质粒为pcDNA3。

6.一种药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求1所述的一种多表位结核基因疫苗，以及药学上可以接受的载体或者赋形剂。

7.权利要求1所述的一种多表位结核基因疫苗在制备预防结核病的药物中的应用。