CN104302325B - 用于预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的联合抗原和dna疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用包含RSV抗原和编码所述RSV抗原的DNA的组合来治疗和预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染的症状。

Description

用于预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的联合抗原和DNA疫苗
序列表
本申请包括以ASCII格式提交的并据此整体以引用方式并入的序列表。2012年8月2日创建的ASCII拷贝的名称为“030276-9016_SequenceListing_ST25.txt”，其大小为116,697个字节。
技术领域
本发明涉及使用包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的DNA的组合来治疗和预防呼吸道合胞病毒(RSV)感染。
发明背景
人RSV属于副黏液病毒科的肺病毒属，是儿童和老年人中下呼吸道感染的主要原因，但在年龄小于三岁的婴幼儿中最常见。在如今的美国，保守的估计表明老年人中每年有大约330万呼吸道疾病病例。与甲型流感病毒疾病相似，RSV在每年冬天流行，在整个一生中反复再次感染RSV非常常见。虽然开发抗RSV的疫苗是一项最优先考虑的工作，但是由于相关的疫苗诱发疾病(VID)尚无安全有效的抗RSV疫苗可用。VID在受试者中因来自RSV抗原的增强的炎性CD4+T细胞反应而由强烈的病原性炎症反应导致。
更安全有效的RSV疫苗应当无害并诱导针对病毒的正确的免疫反应。然而，第一种候选疫苗即在20世纪60年代开发的福尔马林灭活RSV(FI-RSV)疫苗在后续自然暴露于病毒后诱发严重的疾病，而不是用作抗感染的疫苗。其导致80％接种疫苗后的婴幼儿入院和两例死亡。得自这些儿童的外周血淋巴细胞表明与原初或RSV感染对照相比的T淋巴细胞高反应性。
在用FI-RSV免疫然后用活RSV攻毒的动物模型中揭露了类似的VID发病。小鼠中增强的VID组织病理学变化可通过RSV攻毒前CD4+T细胞或IL-4的去除而消除，从而进一步表明FI-RSV诱导的病理学变化在该动物模型中为T细胞介导的。
RSV的F和G蛋白用作重要的中和性和主要的保护性抗原，但是也会导致VID。具体地讲，据发现，用呼吸道合胞病毒(RSV)G糖蛋白(G)免疫的小鼠在RSV攻毒后表现出VID并发生了非典型肺嗜酸性粒细胞增多。CD4+T细胞的去除导致疾病的严重性较轻，从而表明G抗原内的序列可能包含过度刺激T细胞反应的表位。
虽然在RSV攻毒时会发生VID的情况下需要RSV疫苗，但是尚未得到可避免进一步导致肺病理学变化的过激反应(诸如VID)的RSV疫苗。理想的抗RSV感染的疫苗应当满足两个要求：1)诱导RSV特异性中和抗体；以及2)不刺激会导致VID的过度T细胞反应。已经测试了许多方法，诸如使用DNA疫苗、腺病毒载体、Th1型佐剂和经口递送，但是迄今为止无一取得成功。因此，本领域需要开发将诱导抗RSV感染的中和抗体但抑制炎性CD4+T细胞的疫苗。
发明概述
本发明涉及抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的疫苗，该疫苗包含RSV抗原肽和编码该RSV抗原肽的核酸，其中该疫苗刺激iTreg细胞(CD4+、CD25-、FoxP3+、IL-10+)。该疫苗的RSV抗原肽可以为F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID NO：4(优化的氨基酸RSV G氨基酸序列)、SEQ IDNO：25(优化的氨基酸RSV F氨基酸序列)及其功能片段。该疫苗可以具有选自5∶1和1∶5以及1∶1和2∶1的核酸和抗原肽质量比。本发明的疫苗可以是核酸。核酸可以是RNA、DNA或cDNA。该核酸编码选自以下的RSV抗原肽：F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID NO：4(优化的氨基酸RSV G氨基酸序列)、SEQ ID NO：25(优化的氨基酸RSV F氨基酸序列)及其功能片段。DNA可存在于环形质粒的线性表达盒中。质粒可选自pVAX、pcDNA3.0和proVAX。质粒还可以包含选自以下的启动子：CMV、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子和多角体启动子。
本发明还涉及包括疫苗施用装置和如上所述的疫苗的疫苗接种试剂盒。试剂盒的疫苗施用装置可以为疫苗枪、针或电穿孔装置。试剂盒可以包括微创电穿孔装置。
本发明还涉及用于预防或治疗受试者中的呼吸道合胞病毒感染的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如上所述的疫苗。该方法还保护受试者免于发生呼吸道合胞病毒攻毒后的气道高反应性(AHR)。
本发明还涉及诱导抗呼吸道合胞病毒感染的中和抗体并抑制炎性T细胞的方法，该方法包括向有需要的受试者施用所述疫苗，其中诱导iTreg细胞而抑制自身反应性CD4+和CD8+T细胞。疫苗可通过电穿孔而施用，例如使用微创电穿孔装置，其中电穿孔路径选自皮内和肌内。
本发明还涉及治疗或预防进行呼吸道合胞病毒(RSV)免疫的受试者中的疫苗诱发疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如上所述的疫苗，其中受试者在遭遇自然RSV感染前已接受了福尔马林灭活RSV(FI-RSV)或RSV抗原的免疫。疫苗可通过电穿孔而施用，例如使用微创电穿孔装置，其中电穿孔路径可以为皮内和肌内。
附图简述
图1显示了NIH/3T3细胞中的质粒proVAX/G的真核表达。在用proVAX/G转然后48h从NIH/3T3细胞提取了总RNA。用于RT-PCR的模板如下：泳道1，得自具有RT的转染NIH/3T3细胞的cDNA；泳道2，proVAX载体对照转染细胞；泳道3，作为阴性对照的得自非转染NIH/3T3细胞的RNA。
图2A-2B显示了在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中重组蛋白表达的SDS-PAGE的考马斯蓝染色。图2A-2B显示了：泳道M，蛋白分子标记；泳道1，未诱导的大肠杆菌BL21(DE3)；泳道2，由IPTG以0.5mM诱导的大肠杆菌BL21(DE3)；泳道3，未诱导的BL21(DE3)pET28a(+)；泳道4，由IPTG以0.5mM诱导的大肠杆菌BL21(DE3)pET28a；泳道5，未诱导的大肠杆菌BL21(DE3)pET28a(+)/G；泳道6和10，由IPTG以0.5mM诱导的大肠杆菌BL21(DE3)pET28a(+)/G；泳道7，纯化的多聚组氨酸标签重组蛋白；泳道8，在0.5mM IPTG诱导下由pET28a(+)/G转化的大肠杆菌BL21(DE3)裂解物的上清液；以及泳道9，在0.5mM IPTG诱导下由pET28a(+)/G转化的大肠杆菌BL21(DE3)裂解物的沉淀物。
图3显示了多聚组氨酸标签重组G蛋白的Western印迹分析。大肠杆菌BL21(DE3)裂解物得自在LB肉汤中生长并用0.5mM IPTG诱导的细胞。将蛋白样品在12％SDS-PAGE上分离，然后转移到硝酸纤维素膜。使膜与山羊抗RSV抗体反应，并通过与偶联的抗山羊二抗反应而可视化。泳道1，在0.5mM IPTG诱导下由pET28a(+)/G转化的大肠杆菌BL21(DE3)裂解物的上清液；泳道2，由pET28a(+)/G转染的大肠杆菌BL21(DE3)裂解物的不溶性部分；泳道3，镍柱纯化的重组RSV G蛋白。
图4A-4B显示了体液反应的分析。在最后一次免疫后第7天从Balb/c小鼠采集血清样品。使用紫外线灭活的RSV通过ELISA确定RSV G特异性抗体(图4A)和RSV F特异性抗体(图4B)。结果以一式三份的三个组的数据平均值表示，误差条表示标准偏差。所示的数据总结了三个实验之一，它们都展示出相似的结构。单星号表示p＜0.05，双星号表示p＜0.01。
图5显示了通过DNA和蛋白疫苗联合免疫诱导了T细胞反应的损害。从已用PSB或proVAX/G或His-G免疫或用proVAX+His-G(抗原错配的)或proVAX/G+OVA(抗原错配的)联合免疫或用proVAX/G+His-G(抗原匹配的)联合免疫的小鼠中分离了T细胞。将T细胞用作为特异性抗原的紫外线照射RSV抗原(从左边起的第三个数据列)、作为非特异性抗原的BSA(从左边起的第二个数据列)或作为阳性对照刺激剂的PMA+Ion(从左边起的第一个数据列)在体外进行再刺激。如实施例1中所述测定T细胞增殖。所示的数据是得自三个独立实验的代表性数据。单星号表示P＜0.05，双星号表示p＜0.001。
图6A-6B显示了免疫小鼠的肺RSV滴度。
图7A-7D显示了在RSV攻毒后与总细胞相比的所存在的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的量。在最后一次免疫后第14天，将小鼠经鼻内用106TCID50活RSV进行攻毒。在RSV攻毒后5天将小鼠处死，并分析BAL。显示了总嗜酸性粒细胞(图7A)、单核细胞(图7B)、淋巴细胞(图7C)和总细胞(图7D)的平均值±SEM(n＝6/组)。单星号表示与PBS组相比p＜0.05。
图8A-8D显示了在RSV攻毒后与总细胞相比的所存在的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的量。在最后一次免疫后第14天，将小鼠经鼻内用106TCID50活RSV进行攻毒。在RSV攻毒后5天将小鼠处死，并分析BAL。显示了总嗜酸性粒细胞(图8A)、单核细胞(图8B)、淋巴细胞(图8C)和总细胞(图8D)的平均值±SEM(n＝6/组)。单星号表示与PBS组相比p＜0.05。
图9A-9D显示了响应于乙酰氯化胆碱的颈静脉内施用的全身体积描记。RSV在攻毒后5天，通过响应于各种剂量(x轴)下乙酰氯化胆碱的颈静脉内施用的全身体积描记测量了气道阻塞，并在y轴上表示为动态阻力(Rrs)(图9A和9C)和动态顺应性(Cldyn)(图9B和9D)。原初小鼠未进行预处理和攻毒。单星号表示与其它组相比p＜0.05。
图10A-10H显示了苏木精和伊红染色后肺组织的组织学检查。RSV攻毒后5天，对小鼠实施安乐死，摘除肺组织并在福尔马林中固定。切取石蜡包埋组织的萍切片，用苏木精和伊红染色。对于得自原初/未攻毒的小鼠(图10A)、PBS小鼠(图10B)、FI-RSV小鼠(图10C)、proVAX/G小鼠(图10D)、His-G小鼠(图10E)、proVA+His-G小鼠(图10F)、proVAX/G+OVA小鼠(图10G)和proVAX/G+His-G小鼠(图10H)的组织，显示了各放大倍数下(放大倍数100倍或400倍)的(每组6只的)代表性切片。
图11A-11H显示了苏木精和伊红染色后肺组织的组织学检查。RSV攻毒后5天，对小鼠实施安乐死，摘除肺组织并在福尔马林中固定。切取石蜡包埋组织的薄切片，用苏木精和伊红染色。对于得自原初/未攻毒的小鼠(图11A)、PBS小鼠(图11B)、FI-RSV小鼠(图11C)、proVAX/G小鼠(图11D)、His-G小鼠(图11E)、proVA+His-G小鼠(图11F)、proVAX/G+OVA小鼠(图11G)和proVAX/G+His-G小鼠(图11H)的组织，显示了各放大倍数下(放大倍数100倍或400倍)的(每组6只的)代表性切片。
图12A-12E显示了苏木精和伊红染色后肺组织的组织学检查。RSV攻毒后5天，对小鼠实施安乐死，摘除肺组织并在福尔马林中固定。切取石蜡包埋组织的薄切片，用苏木精和伊红染色。对于得自proVAX/F小鼠(图12A)、His-F小鼠(图12B)、proVA+His-F小鼠(图12C)、proVAX/F+OVA小鼠(图12D)和proVAX/F+His-F小鼠(图12E)的组织，显示了各放大倍数下(放大倍数100倍或400倍)的(每组6只的)代表性切片。
图13显示了图10中所述的肺组织的组织病理学评分。如实施例1中所述，由病理学家以设盲方式在苏木精和伊红染色组织中评估织病理学评分(HPS)。单星号表示与其它组相比p＜0.05。
图14A-14B显示了在用活RSV攻毒后免疫小鼠的体重损失。在RSV攻毒后，每天对小鼠称重，并将体重归一化到第0天的基础体重。单星号表示与其它组相比p＜0.05。
图15A-15D显示了在RSV攻毒后第5天通过qPCR检查的小鼠肺组织中的细胞因子产生情况。测量了IL-4(图15A)、IL-5(图15B)、IL-13(图15C)和IFN-T(图15D)。单星号表示p＜0.05，双星号表示p＜0.01，而三星号表示p＜0.001。
图16A-16N显示了T细胞表型的荧光活化细胞分选(FACS)分析。联合免疫诱导的iTreg细胞可在体内介导抗原特异性T细胞抑制并在体外抑制同种混合淋巴细胞反应。淋巴细胞得自最后一次免疫后7天的小鼠，并用抗CD4-FITC和抗CD25-PE Cy5 mAb染色，然后用抗IL-10-PE和抗Foxp3-APC mAb进行细胞内染色。图16A显示了SSC-H与FSC-H的关系图。图16B显示了CD4与CD25的关系图。图16C-16N显示了IL-10(x轴)和Foxp3(y轴)共表达。将CD4+CD25-(R1)(图16I-16N)和CD4+CD25+(图16C-16H)(R2)T细胞针对IL-10和Foxp3的共表达进行分类。所示的结果是三个实验的代表性结果。百分率表示双阳性细胞的百分比。
图17A-17B显示了总脾细胞中CD4+CD25-Foxp3+IL-10+(图17B)或CD4+CD25+Foxp3+IL-10+(图17A)T细胞的百分率汇总。三星号表示与其它组相比时p＜0.001。
图18显示了通过过继转移的CD4+CD25-供体T细胞介导的抑制。通过已用proVAX/G+His-G联合免疫的Balb/c小鼠或通过原初小鼠制备了细胞的CD4+CD25-或CD4++CD25+亚组，并过继转移到原初Balb/c小鼠中。然后在转移后24小时将受体小鼠用His-G免疫，并用于在免疫后7天进行脾细胞分离。将受体的脾细胞用作为特异性抗原的紫外线照射RSV抗原在体外进行再刺激，并通过MTT法测量了增殖反应。
图19显示了通过过继转移的CD4+CD25-供体T细胞介导的抑制。通过已用proVAX/G+His-G联合免疫的Balb/c小鼠或通过原初小鼠制备了细胞的CD4+CD25-或CD4++CD25+亚组，并过继转移到原初Balb/c小鼠中。然后在转移后24小时将受体小鼠用His-G免疫，并用于在免疫后7天进行脾细胞分离。将受体动物的脾细胞(作为应答细胞)与得自原初C57BL/6小鼠的用丝裂霉素C处理过的脾细胞(作为同种异体的刺激细胞)混合以进行MLR。单星号表示p＜0.05，双星号表示p＜0.01。
图20A-20F显示了通过从联合免疫小鼠过继转移CD4+CD25-iTreg细胞而改善肺炎性反应。在最后一次免疫后第7天从通过proVAX/G+His-G(抗原错配的)或proVAX/G+OVA(抗原错配的)联合免疫的小鼠纯化了CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞，将它们经静脉内过继转移到之前用His-G免疫的小鼠中，然后进行RSV攻毒。RSV攻毒后5天，对小鼠实施安乐死，摘除肺组织并在福尔马林中固定。切取石蜡包埋组织的薄切片，用苏木精和伊红染色。对于得自原初小鼠(图20A)、His-G小鼠(图20B)、“得自proVAX/G+His-G的CD4+CD25+”小鼠(图20C)、“得自proVAX/G+His-G的CD4+CD25-”小鼠(图20D)、“得自proVAX/G+OVA的CD4+CD25+”小鼠(图20E)和“得自proVAX/G+OVA的CD4+CD25-”小鼠(图20F)的组织，显示了各放大倍数下(放大倍数100倍或400倍)的(每组6只的)代表性切片。
图21显示了图20中所述的肺组织的组织病理学评分。如实施例1中所述，由病理学家以设盲方式在苏木精和伊红染色组织中评估织病理学评分(HPS)。单个星号表示p＜0.05。
详细描述
本发明涉及用于治疗和保护受试者免受RSV感染同时抑制因之前的RSV抗原免疫而导致的疫苗诱发疾病的方法。
疫苗诱发疾病(VID)的原因是原初(naive)个体在遭遇自然RSV感染前用RSV抗原(诸如F/G蛋白)免疫时使炎性反应加重的倾向，这些炎性反应包括大量淋巴细胞浸润、肺嗜酸性粒细胞增多和2型细胞因子产生。然而，抗体在保护中具有重要作用。中和抗体的被动转移可保护免疫缺陷个体或儿童免受RSV感染，并且小鼠模型已表明用抗RSV中和单克隆抗体进行治疗明显减少了RSV复制并与疾病严重性的炎性和临床标志的显著降低相关。由于被动免疫疗法在儿童中的高成本，致力于诱导高水平的抗RSV中和抗体的疫苗引起了人们的巨大兴趣。
本发明的疫苗包含编码RSV蛋白的核酸及其同源重组RSV蛋白以避免RSV感染并且还改善RSV诱导的肺部炎性疾病。该疫苗通过与福尔马林灭活RSV(FI-RSV)感染一样高地诱导抗RSV感染中和抗体而提供肺中病毒复制的明显降低，但通过诱导iTreg(CD4+、CD25-、FoxP3+、IL10+)细胞而抑制炎性T细胞。通过用DNA和蛋白一起进行联合免疫诱导了抗原特异性iTreg细胞。iTreg刺激细胞生成高水平的IL-10，其表明刺激B细胞产生中和抗体。该策略诱导高水平的中和抗体以及抗原特异性iTreg细胞，这些细胞抑制炎性T细胞并减轻病变。因此，该策略可有效地避免RSV感染，VID即使有也甚微。
使用蛋白和编码同源抗原的核酸进行联合免疫而在体内诱导iTreg具有若干优点：1)其相对简单，因为只需要施用限定的蛋白抗原及其表达质粒；2)其诱导强效的iTreg而以抗原特异性方式抑制T细胞；3)其还诱导高水平的抗体。该方法可扫除RSV疫苗开发的主要障碍，因为具有双重功能(如本文所公开，诱导中和抗体和iTreg细胞)的疫苗可能是有效的，而无VID副作用。
1.定义
本文所用的术语只是为了描述特定的实施方案，并非旨在进行限制。如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括多个指代物，除非上下文另有明确指出。
关于本文中数字范围的引述，明确地包括相同精度的介于其间的每个居间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9以外还包括数字7和8，而对于范围6.0-7.0，明确地包括数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文所用的“气道高反应性”(AHR)是指气道异常使得它们太易狭窄和/或对能够引起气道受限的刺激反应性太高。AHR可以是因气道炎症或气道重塑(诸如，通过胶原沉积)引起的呼吸系统的功能改变。气流受限是指气道变窄，这可能是不可逆的或可逆的。胶原沉积、支气管痉挛、气道平滑肌肥大、气道平滑肌收缩、粘液分泌、细胞沉积、上皮破坏、上皮渗透性的改变、平滑肌功能或敏感性的改变、肺实质异常以及气道内和周围的浸润疾病可引起气流受限或气道高反应性。许多这些致病因素可与炎症相关。
如本文所用的“共有”、“共有序列”或“优化序列”可意指基于特定抗原多种亚型的比对分析而构建的合成核酸序列或相应的多肽序列。该序列可用于诱导针对特定抗原多种亚型或血清型的广泛免疫。可将合成抗原(诸如融合蛋白)操纵成共有序列(或共有抗原)。
如本文关于核酸序列所用的“片段”或“功能片段”意指核酸序列或其部分，所述核酸序列或其部分编码能够引起哺乳动物免疫反应的多肽，所述免疫反应与全长野生型RSV抗原交叉反应。片段可以是选自编码本文所示的蛋白片段的各种核苷酸序列中的至少一种的DNA片段。片段可以是编码RSV抗原的一部分的核酸序列，其中所述部分编码可在哺乳动物中引起免疫反应的表位，所述免疫反应与全长野生型RSV抗原交叉反应。
如本文关于多肽序列所用的“片段”或“功能片段”意指能够引起哺乳动物免疫反应的多肽，所述免疫反应与全长野生型RSV抗原交叉反应。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。片段可以是特定RSV蛋白(诸如G糖蛋白或F糖蛋白)的全长多肽抗原的一部分的肽序列，并编码可在哺乳动物中引起免疫反应的表位，该免疫反应与全长野生型RSV多肽抗原序列交叉反应。RSV蛋白的片段可包含全长RSV蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，并能够产生免疫反应。
如本文所用的“nTreg细胞”是T细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+)，其主要机理是通过抑制常规CD4和CD8 T细胞的增殖反应而实现外周耐受，并可抑制自然免疫和变应性疾病。转录因子Foxp3是必需的并足以实现nTreg细胞的免疫抑制活性。nTreg细胞在体内响应抗原攻毒或自我平衡扩增而容易地增殖，并表现出比常规CD4 T细胞更高的自我平衡分裂速率。nTreg细胞具有自身抗原的高亲和力T细胞受体，从而允许这些细胞通过自身抗原而得到有效活化从而抑制自身反应性T细胞。
如本文所用的“肽”或“多肽”可意指连接的氨基酸序列并且可以为天然的、合成的或天然和合成的修饰或组合。
如本文所用的“治疗”可意指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病而保护动物免于疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的组合物。抑制疾病涉及在引起疾病后，但是在其临床表现之前向动物施用本发明的组合物。压制疾病涉及在疾病的临床表现之后向动物施用本发明的组合物。
如本文所用的“受试者”可意指想要或需要进行RSV疫苗免疫的哺乳动物。它们可以为人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。
如本文所用的“超抗原”可意指一类抗原，它们导致T细胞的非特异性活化，从而使得多克隆T细胞活化和大规模细胞因子释放。与普通抗原诱导的T细胞反应相比(其中机体T细胞中0.001-0.0001％被活化)，超抗原能够活化高达20％的机体T细胞。大量的活化T细胞产生大规模的免疫反应，其不是超抗原上任何特定表位特异性的，因此逐渐损害适应性免疫系统的基本强度之一，即，其以高亲和力靶向抗原的能力。更重要的是，大量活化的T细胞分泌大量的细胞因子，其中最重要的干扰素γ(IFN-γ)。该过量的IFN-γ继而活化巨噬细胞。活化的巨噬细胞继而过量产生促炎性细胞因子，诸如IL-1、IL-6和TNF-α。TNF-α作为机体炎性反应的一部分是尤其重要的。在正常情况下，其以低水平局部释放并有助于免疫系统打败病原体。然而，当其在血液中并以高水平全身性释放时(由于超抗原结合所导致的大量T细胞活化)，其可导致严重且致命的症状，包括休克和多器官衰竭。
如本文所用的“基本上相同的”可意指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如这里所用的“变体”可意指因氨基酸的插入、缺失或保守取代而使氨基酸序列不同，但是保持至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫反应的能力。变体还可以意指其氨基酸序列与参考蛋白的氨基酸序列基本上相同的蛋白，其保持至少一种生物活性。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电荷区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域被认为通常涉及微小的变化。这些微小的变化可部分地通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来鉴定，如本领域中所理解的。Kyte等人，J.Mol.Biol.157：105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的背景下对氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这一有用的指标已报道与抗原性和免疫原性相关。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可产生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本领域中所理解。可利用亲水性值在彼此±2内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，应理解与生物功能相容的氨基酸取代依赖于氨基酸的相似性，尤其是那些氨基酸的侧链的相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质所揭示。
2.疫苗
本发明涉及包含呼吸道合胞病毒(RSV)抗原和编码所述RSV抗原的核酸的疫苗。该疫苗通过如本文所述的病毒RSV抗原和编码所述RSV抗原的核酸使有需要的受试者联合免疫。该疫苗向有需要的受试者提供在后续RSV攻毒后的抗原特异性免疫反应。抗原特异性免疫反应生成与通过福尔马林灭活RSV(FI-RSV)疫苗所生成的水平相当的高水平的中和抗体。然而，该疫苗与基于FI-RSV的疫苗的不同之处在于：对iTreg细胞(CD4+、CD25-、FoxP3+、IL10+)进行诱导，这导致与通过FI-RSV疫苗免疫的受试者相比肺异常的明显减轻。iTreg刺激的细胞生成高水平的IL-10，其表明刺激B细胞产生中和抗体。iTreg刺激还导致更少的在使受试者再次暴露于RSV感染时疫苗诱发疾病所特有的总体炎症和T细胞向肺中的浸润。该疫苗还可以通过保护受试者在RSV攻毒后免于发生气道高反应性(AHR)或气道阻塞而预防和治疗受试者的呼吸道合胞病毒感染。该疫苗还可以改善RSV感染的肺组织病理。该疫苗还可以减轻活RSV攻毒后疾病的严重性,包括对抗体重减轻。
FI-RSV因Th2(CD4+)型反应的活化而诱发VID，这导致B细胞活化因子和其它相关的细胞因子诸如IL-3、IL-4、IL-5、CD40配体、IL-10、IL-13、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和嗜酸粒细胞趋化因子的释放。RSV G糖蛋白(G)疫苗在RSV攻毒后诱发VID，因为同时诱导了Th1和Th2型反应。Th1释放巨噬细胞活化效应子和其它相关细胞因子，诸如干扰素-γ(IFN-γ)、GM-CSF、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-3、TNF-β和IL-2。所述疫苗以抗原依赖性方式同时抑制Th1和Th2反应，而生成与Th2辅助细胞所生成的相似的中和抗体滴度，从而诱导中和并降低RSV感染水平。
该疫苗通过疫苗接种而消除T细胞(Th1、Th2、Th17)反应。疫苗联合免疫活性诱导iTreg(CD4+、CD25-、Foxp3+)细胞。iTreg细胞在调节对急性感染的适应性和固有性免疫反应中以及在消除病毒清除后的炎症中均发挥着作用。iTreg刺激的细胞可生成高水平的IL-10，其刺激B细胞生成中和抗体。该疫苗不诱导nTreg细胞。RSV感染实际上可引起受RSV感染的受试者中CD4+CD25+nTreg的去除，从而导致疾病严重性增加，包括体重损失加重、固有细胞募集到支气管肺泡灌洗(BAL)液和肺以及产IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞的水平增加。
用所述疫苗进行联合免疫不仅保护了受试者免受RSV攻毒的影响，还抑制了会导致VID的加重的肺部炎症。对RSV感染的预防和VID的减少的原因可能是诱导了高水平的抗原特异性中和抗体和iTreg细胞，而iTreg细胞可以抗原特异性方式抑制T细胞记忆增殖。这种联合免疫上调抗炎细胞因子IL-10的水平，而下调RSV诱导的炎性细胞因子，诸如IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ。
该疫苗可具有质量比为10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10的RSV编码核酸与RSV抗原。该疫苗可具有10∶1至1∶10、9∶1至1∶9、8∶1至8∶1、7∶1至1∶7、6∶1至1∶6、5∶1至1∶5、4∶1至1∶4、3∶1至1∶3或2∶1至1∶2的RSV编码核酸与RSV抗原质量比范围。
a.抗原
该疫苗可包含RSV抗原。RSV抗原可由核酸编码。核酸可以为编码RSV抗原或其片段的DNA、RNA或cDNA。RSV抗原可以为导致免疫反应的肽或蛋白。抗原可触发免疫系统产生抗体。核酸可编码为全长RSV抗原的片段的RSV抗原，并具有存在于RSV抗原上能够触发免疫应发的表位。RSV抗原可以为全长RSV抗原的片段，并具有存在于RSV抗原上能够触发免疫应发的表位。通过免疫反应所生成的抗体然后可杀灭或中和被视为外来物和可能有害的侵入者的抗原。RSV抗原可以是被主要组织相容性复合体(MHC)结合并呈递到T细胞受体的任何分子或分子片段。RSV抗原可以是免疫原，其为能够促使适应性免疫反应的分子。
根据本发明，RSV抗原可衍生自任何类型，诸如亚型A或亚型B，或天然存在的或重组的RSV的任何菌株，优选地衍生自人类RSV菌株。RSV菌株的实例包括但不限于亚型A菌株，诸如Long(VR-26)、A2(VR-1540)、RSB1734、RSB5857、RSB6190、RSB6256、RSB642和RSB6614；亚型B菌株，诸如B1、18537、8/60和9320、S2、RSS-2、RSP112/Sweden/02-03、RSP120/Sweden/02-03、RSP121/Sweden/02-03、RSP122/Sweden/02-03、RSP13/Sweden/02-03)、RSP140/Sweden/02-03、RSP16/Sweden/02-03、RSP171/Sweden/02-03、RSP 183/Sweden/02-03、RSP191/Sweden/02-03、RSP199/Sweden/02-03、RSP212/Sweden/02-03、RSP41/Sweden/02-03、RSP45/Sweden/02-03、RSP56/Sweden/02-03、RSP58/Sweden/02-03、RSP67/Sweden/02-03和RSP94/Sweden/02-03。
本公开证实了通过用编码RSV F抗原的DNA疫苗及其F蛋白进行联合免疫或通过用编码RSV G抗原的DNA疫苗及其G蛋白进行联合免疫得到的保护效力，其得到的对RSV攻毒的保护与通过FI-RSV得到的相当。其它RSV抗原可具有相似的效力。该保护可归因于与FI-RSV类似的对高水平中和抗体的诱导，然而，联合免疫保护与iTreg的诱导相关并导致更少的炎症和T细胞向肺的浸润，即，明显减少肺异常。
该疫苗包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的DNA。在一些实施方案中，RSV抗原肽选自人RSV F和G蛋白。
本文还提供编码所述抗原的DNA。该DNA可包含编码所述抗原的编码序列。该DNA还可以包含另外的序列，其编码通过肽键连接到抗原的接头或标签序列。
(1)RSV F和G抗原
RSV抗原可以是人RSV融合蛋白(在本文也称为“RSV F”、“RSV F蛋白”和“F蛋白”)或其片段或变体。人RSV融合蛋白在RSV亚型A与B之间是保守的。RSV抗原可以是得自RSVLong菌株(GenBank AAX23994.1；SEQ ID NO：1)的RSV F蛋白或其片段或变体，其由SEQ IDNO：26的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.1(SEQ ID NO：6)的第5660-7384位。RSV抗原可以是得自RSV A2菌株(GenBank AAB59858.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是单体、RSV F蛋白的二聚体或三聚体、或其片段或变体。RSV抗原可以是优化氨基酸RSV F氨基酸序列或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是RSV F的第412-524位氨基酸或其优化氨基酸序列。RSV抗原可以是RSV F的第412-524位氨基酸或其优化氨基酸序列的二聚体的融合蛋白，诸如SEQ ID NO：25。RSV抗原可以是由SEQ ID NO：23、24或26编码的RSV F蛋白。
RSV F的融合后形式在免疫动物中引起高滴度的中和抗体并保护动物免受RSV攻毒的影响。本发明利用受权利要求书保护的疫苗中的这种免疫反应。根据本发明，RSV F蛋白可以是融合前形式或融合后形式。
RSV抗原可以是人RSV附着糖蛋白(在本文也称为“RSV G”、“RSV G蛋白”和“G蛋白”)或其片段或变体。人RSV G蛋白在RSV亚型A与B之间不同。抗原可以是得自RSV Long菌株(GenBank AAX23993；SEQ ID NO：2)的RSV G蛋白或其片段或变体，其由SEQ ID NO：19的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.1(SEQ ID NO：6)的第4687-5583位。RSV抗原可以是得自以下的RSV G蛋白或其片段或变体：RSV亚型B分离株H5601(SEQID NO：46)、RSV亚型B分离株H1068(SEQ ID NO：48)、RSV亚型B分离株H5598(SEQ ID NO：50)、RSV亚型B分离株H1123(SEQ ID NO：52)。RSV抗原可以是优化氨基酸RSV G氨基酸序列或其片段或变体。例如，抗原可以是RSV G蛋白的第67-298位氨基酸或其优化氨基酸序列，诸如SEQ ID NO：4。RSV抗原可以是由SEQ ID NO：3、5、19、20、21、22、45、47、49或51编码的RSV G蛋白。
(2)其它RSV抗原
RSV抗原可以是人RSV非结构蛋白1(“NS1蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得自RSV Long菌株(GenBank AAX23987.1；SEQ ID NO：28)的RSV NS1蛋白或其片段或变体，其由SEQ ID NO：27的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.1(SEQ ID NO：6)的第99-518位。
RSV抗原可以是人RSV非结构蛋白2(“NS2蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得自RSV Long菌株(GenBank AAX23988.1；SEQ ID NO：30)的RSV NS2蛋白或其片段或变体，其由SEQ ID NO：29的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.1(SEQ ID NO：6)的第628-1002位。
RSV抗原可以是人RSV核衣壳(“N”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得自RSV Long菌株(GenBank AAX23989.1；SEQ ID NO：32)的RSV N蛋白或其片段或变体，其由SEQ ID NO：31的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.1(SEQ IDNO：6)的第1140-2315位。
RSV抗原可以是人RSV磷蛋白(“P”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得自RSVLong菌株(GenBank AAX23990.1；SEQ ID NO：34)的RSV P蛋白或其片段或变体，其由SEQ IDNO：33的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262.1(SEQ ID NO：6)的第2346-3071位。
RSV抗原可以是人RSV基质蛋白(“M”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得自RSV Long菌株(GenBank AAX23991.1；SEQ ID NO：36)的RSV M蛋白或其片段或变体，其由SEQ ID NO：35的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.1(SEQ IDNO：6)的第3261-4031位。
RSV抗原可以是人RSV小疏水(“SH”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得自RSV Long菌株(GenBank AAX23992.1；SEQ ID NO：38)的RSV SH蛋白或其片段或变体，其由SEQ ID NO：37的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.1(SEQ IDNO：6)的第4302-4496位。
RSV抗原可以是人RSV基质蛋白2-1(“M2-1”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得自RSV Long菌株(GenBank AAX23995.1；SEQ ID NO：40)的RSV M2-1蛋白或其片段或变体，其由SEQ ID NO：39的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBank AY911262.1(SEQ ID NO：6)的第7605-8189位。
RSV抗原可以是人RSV基质蛋白2-2(“M2-2”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得自RSV Long菌株(GenBank AAX23997.1；SEQ ID NO：42)的RSV M2-2蛋白或其片段或变体，其由SEQ ID NO：41的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262.1(SEQID NO：6)的第8158-8430位。
RSV抗原可以是人RSV聚合酶L(“L”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是得自RSV Long菌株(GenBank AAX23996.1；SEQ ID NO：44)的RSV L蛋白或其片段或变体，其由SEQ ID NO：43的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列对应于GenBankAY911262.1(SEQ ID NO：6)的第8497-14994位。
RSV抗原可以是NS1、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2或L蛋白的优化氨基酸序列。
(3)RSV抗原汇总
RSV抗原可以是人RSV抗原或重组抗原，诸如由人RSV基因组(SEQ ID NO：6)编码的蛋白的任何一种。抗原可以是SEQ ID NO：1、2、4、25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或52的人RSV或其重组蛋白或共有蛋白、其片段或其变体。RSV抗原可以是由SEQ ID NO：3、5、19、20、21、22、23、24、26、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51编码的人RSV或其重组蛋白或共有蛋白、其片段或其变体。
SEQ ID NO：1和26表示得自RSV Long菌株的RSV F蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：2和19表示得自RSV Long菌株的RSV G蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：3、5、20、21和22表示编码SEQ ID NO：4的优化氨基酸RSV G氨基酸序列的核苷酸序列。SEQ ID NO：20编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列。SEQ ID NO：3和21表示编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列的原核(大肠杆菌)密码子优化序列，并且SEQ ID NO：5和22表示编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列的原核的真核(小鼠)密码子优化序列。
SEQ ID NO：6表示RSV Long菌株的人RSV基因组的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23和24表示编码SEQ ID NO：25的优化氨基酸RSV F氨基酸序列的核苷酸序列。SEQ ID NO：23编码SEQ ID NO：25的氨基酸序列。SEQ ID NO：24表示编码SEQ IDNO：25的氨基酸序列的原核(大肠杆菌)密码子优化序列。
SEQ ID NO：27和28表示得自RSV Long菌株的RSV NS1蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：29和30表示得自RSV Long菌株的RSV NS2蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：31和32表示得自RSV Long菌株的RSV N蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：33和34表示得自RSV Long菌株的RSV P蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：35和36表示得自RSV Long菌株的RSV M蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：37和38表示得自RSV Long菌株的RSV SH蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：39和40表示得自RSV Long菌株的RSV M2-1蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：41和42表示得自RSV Long菌株的RSV M2-2蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：43和44表示得自RSV Long菌株的RSV L蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：45和46表示得自RSV亚型B分离株H5601的RSV G蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：47和48表示得自RSV亚型B分离株H1068的RSV G蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：49和50表示得自RSV亚型B分离株H5598的RSV G蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
SEQ ID NO：51和52表示得自RSV亚型B分离株H1123的RSV G蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
b.载体
该疫苗可包含编码抗原的RSV核酸，并且该核酸可位于载体中。载体因此可包含编码上述抗原的核酸。载体能够表达抗原。载体可以为表达构建体，其通常为用于将特定基因引入靶细胞的质粒。一旦表达载体处于细胞内部，就通过细胞转录和翻译机制核糖体复合物生成由基因编码的蛋白。常常对质粒进行工程改造以含有用作增强子和启动子区并导致表达载体上所携带的基因有效转录的调节序列。本发明的载体表达大量的稳定信使RNA，并因此表达蛋白。
包含编码抗原的DNA的特定DNA载体为proVAX/G(SEQ ID NO：22)，其对应于RSV G糖蛋白(全长核苷酸序列对应于GenBank：AY911262.1(RSV基因组；SEQ ID NO：6)的第4687-5583位；全长核苷酸序(SEQ ID NO：19))的第67-298位氨基酸的编码区。包含编码抗原的DNA的另一种特定DNA载体为proVAX/F(SEQ ID NO：23)，其对应于RSV F融合蛋白(全长核苷酸序列对应于GenBank：AY911262.1(SEQ ID NO：6)的第5660-7384位；全长F融合蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO：26))的第412-524位氨基酸的编码区的二聚体。编码区可进行密码子优化，即，在一种生物体中相对于另一种生物体、远亲生物体更频繁应用的密码子，以及添加或修饰Kozak序列和/或内含子的修饰，和/或除去不希望的序列，比如潜在转录因子结合位点。
载体可具有表达信号，诸如强启动子、强终止密码子，启动子与克隆基因之间距离的调节，以及转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)的插入。
(1)表达载体
载体可以为环形质粒或线性核酸。环形质粒和线性核酸能够在适当的受试者细胞中指导特定核苷酸序列的表达。载体可具有可操作地连接到编码抗原的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接到终止信号。载体还可以含有核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含所关注的核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其至少一种组分与其至少一种其它组分异源。核苷酸序列在表达盒中的表达可受组成型启动子或诱导型启动子的控制，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才开始转录。
就多细胞生物而言，启动子也可对特定的组织或器官或发育阶段有特异性。
(2)环形或线性载体
载体可以为环形质粒，其可通过整合进细胞基因组而转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。
载体可以为pVAX、pcDNA3.0或proVAX，或能够表达DNA并且使细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。本文还提供了能够经由电穿孔有效递送至受试者并表达一种或多种所需抗原的线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)。LEC可以为无任何磷酸骨架的任何线性DNA。DNA可编码一种或多种抗原。LEC可含有启动子、内含子、终止密码子、多腺苷酸化信号。抗原的表达可受启动子控制。LEC可不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可不含与所需抗原基因表达无关的其它核酸序列。
LEC可源自能够被线性化的任何质粒。质粒能够表达抗原。质粒可以为pNP(波多黎各/34)或pM2(新喀里多尼亚/99)。质粒可以为pVAX、pcDNA3.0或proVAX，或能够表达DNA并且使细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。
LEC可以为pcrM2。LEC可以为pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别源自pNP(波多黎各/34)和pM2(新喀里多尼亚/99)。LEC可与抗原以5∶1与1∶5之间，或1∶1与2∶1之间的质量比结合。
(3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号
载体可具有启动子。启动子可以为能够驱动基因表达并调节分离核酸的表达的任何启动子。这种启动子为经由DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件，该聚合酶转录本文所述的抗原序列。对用于指导异源核酸的表达的启动子的选择取决于特定的应用。启动子在载体中可定位在与其在自然环境中距转录起始位点的大约相同距离。然而，可允许该距离的变化，而不丧失启动子功能。
启动子可与编码抗原的核酸序列和转录物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号可操作地连接。启动子可以为CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或经证实在真核细胞中表达有效的另一启动子。
载体可包括增强子和具有功能剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有结构基因下游的转录终止区以提供有效终止。终止区可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同的基因获得。
c.疫苗的赋形剂和其它组分
疫苗还可以包含其它组分，诸如转染促进剂、药学上可接受的赋形剂、佐剂。药学上可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包含表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡例如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。
转染促进剂可以为聚阴离子、聚阳离子，包括多聚L谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂可以为多聚L-谷氨酸。多聚L-谷氨酸可以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡例如角鲨烯和角鲨烯，并且也可将透明质酸与基因构建体一同施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包含转染促进剂例如脂质、脂质体，包括作为DNA-脂质体混合物的卵磷脂脂质体或其它本领域已知的脂质体(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括多聚L-谷氨酸(LGS)或脂质。疫苗中转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可以为佐剂。佐剂可以是在替代质粒中表达的其它基因，或作为蛋白与疫苗中的上述质粒一起递送。佐剂可选自：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括信号序列缺失的并任选包含来自IgE的信号肽的IL-15。佐剂可以为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK，TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
可以为有用佐剂的其它基因包括编码以下的基因：MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl、TAP2及其功能片段。
疫苗还可以包含1994年4月1日提交的美国专利No.021,579(其以引用方式整体并入本文)中描述的基因疫苗促进剂。
可根据待使用的施用模式来配制疫苗。注射用疫苗药物组合物可以是无菌、无热原以及无颗粒的。可使用等渗制剂或溶液。等渗添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸缓冲盐水。疫苗还可以包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使制剂在室温或环境温度下稳定更长时间，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。
3.接种疫苗进行治疗或预防的方法
本发明还涉及用于预防和治疗患者中的呼吸道合胞病毒(RSV)感染的方法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。联合免疫疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于CD4+、CD25-、FoxP3+、IL-10+。
联合免疫可用于治疗或改善疫苗诱发疾病(VID)，疫苗诱发疾病的原因是原初个体在遭遇自然RSV感染前用FI-RSV或其G抗原或其F抗原免疫时使炎性反应加重的倾向，这些炎性反应包括大量淋巴细胞浸润、肺嗜酸性粒细胞增多和2型细胞因子产生。VID改善可通过病毒攻毒后肺组织病理学变化的减小而指示，和/或与淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的增殖和浸润的明显抑制相关。例如，VID的改善可由表现出CD4+CD25-FoxP3+IL-10+表型的G抗原特异性iTreg细胞的诱导所致。iTreg刺激的细胞可生成高水平的IL-10，其刺激B细胞产生中和抗体。
联合免疫可诱导抗炎细胞因子Il-10水平的上调，而下调RSV诱导的炎性细胞因子，诸如IL-4、Il-5、IL-13和IFN-γ。
疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/次，并且可以为20μg至10mg组分/kg体重/次。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
a.施用
可根据制药领域的技术人员熟知的标准技术配制疫苗。可考虑诸如特定受试者的年龄、性别、体重和状况以及施用途径等因素，按医学领域技术人员熟知的剂量和技术施用此类组合物。受试者可以为哺乳动物，诸如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。
可预防性或治疗性地施用疫苗。在预防性施用中，可按足以诱导iTreg反应的量施用疫苗。在治疗性应用中，可按足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用疫苗。将足以实现这一目的的量定义为“治疗有效剂量”。对该用途有效的量将取决于(例如)所施用的疫苗方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况和处方医师的判断。
可通过如Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.15：617-648(1997))；Felgner等人(美国专利No.5,580,859，1996年12月3日公布)；Felgner(美国专利No.5,703,055，1997年12月30日公布)以及Carson等人(美国专利No.5,679,647，1997年10月21日)中描述的本领域熟知的方法施用疫苗，所有这些参考文献的内容均以引用方式整体并入本文。疫苗的DNA可复合到可(例如)使用疫苗枪施用给个体的颗粒或小珠。本领域的技术人员将了解，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。
可经由多种途径递送疫苗。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如皮内、肌内或皮下递送。其它途径包括经口施用、鼻内和阴道内途径。尤其对于疫苗的DNA而言，可将疫苗递送至个体组织的胞间隙(Felgner等人，美国专利No.5,580,859和No.5,703,055，它们的内容均以引用方式整体并入本文)。也可将疫苗施用至肌肉，或可经由皮内或皮下注射，或经皮，诸如通过离子电渗疗法施用。也可采用疫苗的表皮施用。表皮施用可涉及机械或化学刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫反应(Carson等人，美国专利No.5,679,647，其内容以引用方式整体并入本文)。
也可配制疫苗用于经由鼻通道施用。其中载体为固体的适合鼻腔施用的制剂可包括粒度(例如)在约10至约500微米范围内的粗粉，以采用鼻烟的方式，即通过鼻通道从接近鼻子的粉末容器中迅速吸入而施用所述粗粉。制剂可以为鼻喷剂、滴鼻剂，或通过喷雾器经气溶胶施用。制剂可包括疫苗的水或油溶液。
疫苗可以为液体制剂，诸如混悬剂、糖浆剂或酏剂。疫苗也可以为供肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如，注射用)的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。
可将疫苗掺入脂质体、微球或其它聚合物基质(Felgner等人，美国专利No.5,703,055；Gregoriadis，Liposome Technology，第Ito III卷(第2版，1993年)，其内容以引用方式整体并入本文)。脂质体可由磷脂或其它脂质组成，并且可以为制备和施用相对简单的无毒、生理学上可接受且可代谢的载体。
可经由电穿孔，诸如通过其内容以引用方式并入本文的美国专利No.7,664,545中描述的方法施用疫苗。电穿孔可通过美国专利No.6,302,874、No.5,676,646、No.6,241,701、No.6,233,482、No.6,216,034、No.6,208,893、No.6,192,270、No.6,181,964、No.6,150,148、No.6,120,493、No.6,096,020、No.6,068,650和No.5,702,359中描述的方法和/或设备进行，它们的内容以引用方式整体并入本文。可经由微创装置进行电穿孔。
微创电穿孔装置(“MID”)可以为用于将上述疫苗和相关流体注射进机体组织的设备。该装置可包括空心针、DNA盒和流体递送机构，其中该装置适于启动使用中的流体递送机构以便在将针插入所述机体组织的同时(例如，自动地)将DNA注射进机体组织。这样的优点在于，在插入针的同时能够逐渐注射DNA和相关流体，导致流体在机体组织更均匀的分布。由于注射的DNA在更大的区域分布，注射时经受的疼痛可得以减轻。
MID可将疫苗注射进组织，无需使用针。MID可注射作为细流或射流的疫苗，其力量使得疫苗刺入组织表面并进入下层组织和/或肌肉。细流或射流后面的力可通过压缩气体(诸如二氧化碳)在一瞬间通过微型孔的膨胀提供。微创电穿孔装置及其使用方法的实例在已公布的美国专利申请No.20080234655、美国专利No.6,520,950、美国专利No.7,171,264、美国专利No.6,208,893、美国专利No.6,009,347、美国专利No.6,120,493、美国专利No.7,245,963、美国专利No.7,328,064和美国专利No.6,763,264中有描述，它们每一者的内容以引用方式并入本文。
MID可包括产生无痛刺入组织的高速液体射流的注射器。此类无针注射器可商购获得。本文可用的无针注射器的实例包括美国专利No.3,805,783、No.4,447,223、No.5,505,697和No.4,342,310中描述的无针注射器，它们每一者的内容以引用方式并入本文。
可使用无针注射器，通常通过使组织表面与注射器接触，以便用足以使疫苗穿透进组织的力启动药剂射流的递送，将呈适于直接或间接电迁移形式的所需疫苗引入(例如，注射)至待治疗的组织中。例如，如果待治疗的组织为粘膜、皮肤或肌肉，则用足够的力将药剂射向粘膜或皮肤表面以使药剂穿透角质层并进入真皮层，或分别进入下层组织和肌肉。
无针注射器很适合将疫苗递送至所有类型的组织，尤其是皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可用于将含有疫苗的液体推至表面并进入受试者的皮肤或粘膜。可使用本发明方法治疗的各类组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。
MID可具有使组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列中多对电极之间产生脉冲(例如呈矩形或正方形模式的设置)提供比在一对电极之间产生脉冲改善的结果。例如，标题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利No.5,702,359公开了针阵列，其中在治疗期间可使多对针产生脉冲。在如同全面阐述地以引用方式并入本文的该申请中，将针布置成圆形阵列，但是具有使得能够在反向针电极对之间产生脉冲的连接器和转换设备。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针电极。在美国专利No.6,763,264中描述了这种装置和系统，其内容以引用方式并入本文。作为另外一种选择，可使用单针装置，其允许用类似于普通注射针的单根针来注射DNA和进行电穿孔并施加比目前使用的装置递送的脉冲电压低的脉冲，从而减轻患者经受的电感觉。
MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括两根或更多根具有相同直径或不同直径的针。针均匀或不均匀地间隔开。针可在0.005英寸与0.03英寸之间，在0.01英寸与0.025英寸之间，或在0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以为0.0175英寸。针可间隔开0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更远。
MID可由脉冲发生器和一步递送疫苗和电穿孔脉冲的两针或多针疫苗注射器组成。脉冲发生器可允许经由以闪存卡运行的个人计算机灵活编程脉冲和注射参数，以及全面记录并存储电穿孔和患者数据。脉冲发生器可在短时间内递送多个电压脉冲。例如，脉冲发生器可在持续期间递送3个100ms的15V脉冲。这种MID的实例为Inovio Pharmaceuticals的Elgen 1000系统，其在内容以引用方式并入本文的美国专利No.7,328,064中有描述。
MID可以为CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals)装置和系统，这是促进将大分子(诸如DNA)引入机体或植物中的选定组织的细胞内的模块化电极系统。该模块化电极系统可包括多个针电极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲控制器向所述多个针电极的导电性连接的电连接器；和电源。操作员可握住安装在承载结构上的所述多个针电极并将它们牢牢插入机体内或植物的选定组织。然后大分子经由皮下针递送至选定的组织。激活可编程恒定电流脉冲控制器并将恒定电流电脉冲施加到所述多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进大分子引入所述多个电极之间的细胞。通过借助恒定电流脉冲限制组织内的功率耗散将由于细胞过热导致的细胞死亡减到最少。美国专利No.7,245,963中描述了Cellectra装置和系统，其内容以引用方式并入本文。
Elgen 1000系统可包括提供空心针的装置；和流体递送机构，其中该设备适于启动使用中的流体递送机构以便在将针插入所述机体组织的同时(例如，自动地)将流体(本文所述的疫苗)注射进机体组织。优点是在插入针的同时能够逐渐注射流体，导致流体在机体组织更均匀的分布。还认为，由于注射的流体的体积在更大的区域分布，注射时经受的疼痛得以减轻。
另外，自动注射流体有利于自动监测并记录注射的实际流体剂量。如果需要，可通过控制单元对该数据进行存储以用于通过文件进行记录的目的。
应了解，注射速率可以为线性的或非线性的并且可在将针插入待治疗受试者的皮肤后和将其进一步插入机体组织的同时进行注射。
可通过本发明的设备将流体注入其中的合适组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但是可以为肌肉组织。
该设备还可以包括用于指导将针插入机体组织内的针插入机构。流体注射速率受针插入速率控制。这样的优点在于，可控制针插入和流体的注射，使得可根据需要使插入速率与注射速率匹配。这还使得仪器更易于为使用者操作。如果需要，可提供用于自动将针插入机体组织内的机构。
使用者可选择何时开始流体注射。然而理想的是，当针尖到达肌肉组织时开始注射并且所述设备可包括用于感测针已经插入开始流体注射的足够深度的机构。这意味着，当针已到达所需深度(通常为肌肉组织开始的深度)时可自动提示开始流体注射。例如可取肌肉组织开始的深度为预设针插入深度，例如将认为足够使针通过皮肤层的4mm的值。
感测机构可包括超声探针。感测机构可包括用于感测阻抗或电阻变化的机构。在这种情况下，所述机构可能不会同样记录针在机体组织内的深度，但是将更适于感测当针从不同类型的机体组织移至肌肉内时阻抗或电阻的变化。这些替代方案的任一种提供相对准确且操作简档的感测可开始注射的机构。如果需要，可进一步记录针的插入深度并可将其用于控制流体的注射，使得在记录针插入的深度时确定待注射的流体体积。
所述设备还可以包括：支撑针的底座；和将底座容纳于其中的壳，其中底座可相对于壳移动，使得当底座相对于壳处于第一向后位置时针缩回在壳内，并当底座处于壳内的第二向前位置时针伸出壳外。这对于使用者而言有利，因为可在患者的皮肤上将壳对准，然后可通过相对于底座移动壳将针插入患者的皮肤内。
如上所述，可取的是实现受控的流体注射速率，使得当将针插入皮肤时使流体在针的长度上均匀地分布。流体递送机构可包括适于以受控的速率注射流体的活塞传动机构。例如可通过伺服电机激活活塞传动机构。然而，可通过使底座相对于壳以轴向移动而启动活塞传动机构。应了解，可提供用于流体递送的替代机构。因此，例如，可提供可挤压以按受控或不受控速率进行流体递送的密闭容器代替注射器和活塞系统。
上述设备可用于任何类型的注射。然而，设想在电穿孔领域中尤其有用，因此其还包括用于向针施加电压的机构。这允许针不仅用于注射，还在电穿孔期间用作电极。这特别有利，因为这意味着向与注射流体相同的区域施加电场。电穿孔一直存在的问题在于，很难使电极与先前注射的流体精确对准，因此使用者往往在更大的区域注射大于所需体积的流体并且向更大的区域施加电场以试图保证注射物质与电场之间的重叠。使用本发明，在实现电场与流体之间的良好切合的同时可减小注射流体的体积和施加电场的大小。
4.接种抗RSV感染的疫苗的方法
本发明还涉及为受试者接种抗RSV感染的疫苗的方法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗可包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于CD4+、CD25-、FoxP3+、IL-10+，其继而生成抗原特异性响应。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10，其刺激B细胞产生中和抗体。
5.用于诱导抗RSV感染的中和抗体并抑制炎性T细胞的方法
本发明还涉及用于在受试者中诱导抗RSV感染的中和抗体并抑制炎性T细胞的方法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。该疫苗可包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。该疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于CD4+、CD25-、FoxP3+、IL-10+。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10，其刺激B细胞生成中和抗体。抑制炎性T细胞包括诱导iTreg细胞。
该方法利用抗原特异性免疫反应，该免疫反应通过用如上所述的RSV抗原和编码所述RSV抗原的核酸对受试者进行联合免疫而产生。
6.用于抑制RSV攻毒后的自身反应性CD4+T细胞诱导的方法
本发明还涉及用于在受试者中抑制RSV攻毒后的自身反应性CD4+T细胞诱导的方法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。该疫苗可包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。该疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于CD4+、CD25-，FoxP3+、IL-10+。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10，其刺激B细胞生成中和抗体。抑制炎性T细胞包括抑制自身反应性CD4+和CD8+T细胞。
7.改善疫苗诱发疾病(VID)的方法
本发明还涉及改善VID的方法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗可包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。该疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于CD4+、CD25-、FoxP3+、IL-10+。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10，其刺激B细胞生成中和抗体。可将受试者在遭遇自然RSV感染前用福尔马林灭活RSV(FI-RSV)或RSV抗原免疫。
8.用于保护受试者免于发生RSV攻毒后的气道高反应性(AHR)的方法
本发明还涉及用于保护受试者免于发生RSV攻毒后的气道高反应性(AHR)的方法。该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗可包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸。该疫苗可刺激iTreg细胞，包括但不限于CD4+、CD25-、FoxP3+、IL-10+。iTreg刺激细胞可生成高水平的IL-10，其刺激B细胞生成中和抗体。可将受试者在遭遇自然RSV感染前用福尔马林灭活RSV(FI-RSV)或RSV抗原免疫。该方法利用抗原特异性免疫反应，该免疫反应通过用如上所述的RSV抗原和编码所述RSV抗原的核酸对受试者进行联合免疫而产生。
RSV可在之前对RSV致敏的受试者中触发AHR。对RSV致敏是指之前暴露于RSV一次或多次使得产生对RSV的免疫反应。与变态反应相关的反应(例如组胺释放、鼻炎、浮肿、血管舒张、支气管收缩、气道炎症)通常不会在将原初个体首次暴露于RSV时发生，但是一旦产生了针对RSV的细胞和体液免疫反应后，个体即对RSV“致敏”。AHR或气道阻塞可在致敏受试者再次暴露于RSV时发生。一旦受试者对RSV致敏，变态反应可在随后每次暴露于RSV时变得更糟，因为每次重新暴露于不仅产生变态症状，还进一步增加针对RSV产生的抗体的水平和针对RSV的T细胞反应的水平。
有发生气道高反应性风险的受试者是这样的受试者，其已暴露于足以触发AHR的RSV或有暴露于足以触发AHR的RSV的风险，但尚未表现出可测量或可检测的AHR特征或症状。有发生RSV诱发的AHR风险的哺乳动物是这样的哺乳动物，其之前已对RSV致敏，并已暴露于一定量的足以触发AHR的RSV或有暴露于一定量的足以触发AHR的RSV(即，RSV的触发剂量或攻毒剂量)的风险，但尚未表现出可测量或可检测的AHR特征或症状。
炎症的特征通常在于炎性介质(例如细胞因子或趋化因子)的释放，这些炎性介质将炎症中涉及到的细胞募集到组织。RSV攻毒后的AHR涉及引起一种类型的针对RSV的免疫反应(例如Th2型免疫反应)，这可导致释放炎性介质，这些炎性介质募集哺乳动物炎症中涉及到的细胞，其存在可导致组织损害，有时会导致死亡。Th2型免疫反应的特征部分在于释放诱导IL-4、IL-5和IL-13的细胞因子。
9.联合疗法
如本文所用，术语“联合”在施用其它疗法的背景下是指使用不止一种疗法。使用术语“联合”不限制向感染个体施用疗法的顺序。可以在将第二疗法施用给已患有或疑似患有RSV感染、中耳炎或与之相关的呼吸道病症的受试者之前(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用第一疗法。任一另外的疗法可以按任何顺序与其它另外的疗法一起施用。在某些实施方案中，可以将本发明的疫苗与一种或多种疗法(例如，同时施用以预防、治疗、管理和/或改善RSV感染(例如，急性RSV疾病或RSV URI和/或LRI)、中耳炎和/或症状或呼吸道病症或与之相关的其它症状的疗法)联合施用。
可与本发明的疫苗联合施用的疗法的非限制性实例包括任何合适且有效量的组合物或药物组合物中的任一种，所述组合物包含对此调节、治疗或疗法有需要的细胞、组织、器官、动物或患者的至少一种RSV抗体，任选地还包含选自以下的至少一种：至少一种TNF拮抗剂(例如但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、其融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药物(例如甲氨喋呤、金诺芬、金硫葡糖、硫唑嘌呤、依那西普、硫代苹果酸金钠、硫酸羟氯喹、来氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉药物、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛药物、麻醉药物、镇静药物、局部麻醉药物、神经肌肉阻断剂、抗微生物药物(例如氨基糖苷、抗真菌药物、抗寄生虫药物、抗病毒药物、碳青霉烯、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺酰胺、四环素、另外的抗微生物药物)、抗牛皮癣药、皮质类固醇、促合成代谢类甾醇、糖尿病相关药物、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙相关激素、止泻药物、镇咳药物、止吐药物、抗溃疡药物、轻泻药物、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如促红素α)、非格司亭(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫疗法、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环胞菌素、达珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷基化剂、抗代谢药物、有丝分裂抑制剂、放射药物、抗抑郁药物、抗狂躁剂、安定药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、刺激剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色苷酸、肾上腺素或类似物、阿法链道酶(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂，或U.S.Pharmacopoeia和/或Physician′s Desk Reference中所列的任何其它药剂。此类细胞因子的非限制性实例包括但不限于IL-1至IL-23的任一者。合适的剂量是本领域熟知的。参见例如Wells等人编辑，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，Conn.(2000)；PDRPharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，精装本，Tarascon Publishing，Loma Linda，Calif.(2000)，这些参考文献的每一者均以引用方式整体并入本文。
10.试剂盒
本文提供可用于对受试者进行疫苗接种的试剂盒。该试剂盒可包括疫苗，其包含抗原肽和编码所述抗原肽的DNA；以及MID。该试剂盒还可以包括使用试剂盒并进行分析、监测或治疗的说明。
试剂盒还可以包括一个或多个容器，诸如小瓶或瓶子，而每个容器容纳单独的试剂。试剂盒还可以包括书面说明，其可以描述如何开展或解读分析、监测、治疗或本文所述的方法。试剂盒还可以包括疫苗施用装置。疫苗施用装置可以为疫苗枪、用于施用疫苗的针、或连接到用于递送疫苗的导管的电穿孔装置。
本发明具有通过以下非限制性实施例示出的多个方面。
实施例
实施例1
材料和方法
以下是用于下述实施例2-8的材料和方法的描述。
对于动物和细胞，6-8周龄的Balb/c小鼠购自中国北京中国医学科学院实验动物研究所，在12小时的光照循环下照料，并喂养无病原体的食物和水。所有动物方案均得到中国农业大学动物福利委员会的批准。将NIH/3T3细胞系(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA CCL-1658)和HEp-2(ATCC，CCL-23)维持在设为37℃和5％CO2的潮湿培养箱中的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)(Gibco/BRL，NY，USA)中，该培养基补充有10％胎牛血清(FCS)和青霉素/链霉素(Gibco/BRL)。
对于细菌菌株和质粒，将大肠杆菌TOP 10(中国北京天根生化科技有限公司)用作进行操纵的宿主菌株，并将大肠杆菌BL21(DE3)(天根公司)用作表达菌株。真核表达载体proVAX之前在该实验室中由巨细胞病毒(CMV)启动子和hCG-β先导序列构建(Du等人，TheJournal ofGene Medicine 9：136-146(2007))。原核表达载体pET28a(+)(Novagen Inc，WI，USA)包含T7启动子并允许表达融合到多聚组氨酸标签的重组蛋白。所有细菌培养均使用在适当时补充有卡那霉素的LB培养基(中国上海生工生物工程技术服务有限公司)在摇瓶中进行。蛋白表达通过购自Invitrogen(CA，USA)的异丙基β-D-1-巯基半乳糖苷(IPTG)诱导。
对于质粒构建和真核表达，使用了编码RSV G糖蛋白的第67-298位氨基酸的优化形式的基因(全长RSV G核苷酸序列对应于GenBank：AY911262.1(RSV基因组；SEQ ID NO：6)的第4687-5583位；RSV G糖蛋白氨基酸序列(GenBank AAX23993；SEQ ID NO：2)；RSV G糖蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO：19))。优化氨基酸RSV G氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)通过外包(中国上海生工生物工程技术服务有限公司)进行了小鼠密码子优化(SEQ IDNO：22)和合成。密码子优化不仅消除了G片段的稀有密码子，还移除了N端的66个氨基酸的跨膜域(Ghildyal等人，Joumal of General Virology 86：1879-1884(2005))。将密码子优化的基因在EcoR I和Xho I限制性位点亚克隆进真核表达载体proVAX，并指定为proVAX/G。通过限制性消化和测序确认了其正确性。将纯化的质粒用Lipofectamine根据制造商的说明(Invitrogen，CA，USA)转染进了NIH/3T3细胞。在48h后收获转染子，根据前人所述的方案(Jin等人，Vaccine 22：2925-2935(2004))提取了总细胞RNA。用以下特异性引物组通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测了所关注的基因的表达：正向引物，5’-ATGCATAAGGTGACTCCT-3’(SEQ ID NO：7)；反向引物，5’-TTACTGCCGTGGGGTGTT-3’(SEQ IDNO：8)。
使用了编码RSV F融合蛋白的第412-524位氨基酸的优化形式的基因(全长RSV F融合蛋白核苷酸序列对应于GenBank：AY911262.1(SEQ ID NO：6)的第5660-7384位；RSV F融合蛋白氨基酸序列(GenBank AAX23994.1；SEQ ID NO：1)；RSV F融合蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO：26))。对优化氨基酸RSV F氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)针对原核(即，大肠杆菌)表达进行了密码子优化(SEQ ID NO：24)。
对于质粒构建和原核表达，将编码RSV G糖蛋白(SEQ ID NO：21)第67-298位氨基酸的原核密码子优化基因通过类似的程序亚克隆进原核表达载体，并指定为pET28a(+)/G。将编码RSV F(SEQ ID NO：24)第412-524位氨基酸的原核密码子优化基因通过类似的程序亚克隆进原核表达载体，并指定为pET28a(+)/F。通过限制性消化和测序确认了其正确性。将大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞用pET28a(+)/G通过标准方法(Molecular cloning：Alaboratory manual，第2版，J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis编辑，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)进行转化，并用0.5mmol/L的IPTG在37℃下诱导了蛋白表达。4h后，收集细胞、洗涤并重悬在PBS中。在超声处理后从细胞中分离了可溶性部分和包含包涵体的不溶性部分。根据制造商手册使之穿过Biologic DuoFlowTM色谱系统(Bio-Rad，CA，USA)上的Ni-NTA SuperfloW柱(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)而对重组蛋白进行了纯化。通过12％SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析。
对于western印迹分析，使蛋白样品在12％SDS-PAGE凝胶上接受电泳，然后使用Bio-Rad转膜仪(Bio-Rad，CA，USA)转移到纤维素膜上。在与2％BSA混合的PBST中过夜封闭后，将膜用山羊抗RSV抗血清(Meridian，Me，USA)以1∶2000的稀释度在4℃下孵育2h。将膜用150mM PBST洗涤三次，然后用封闭缓冲液(与2％BSA混合的PBST)中的牛抗山羊IgG-HRP偶联物(Santa Cruz，CA，USA)以1∶1000的稀释度在室温下孵育1h。通过ECL法根据制造商的说明(GE Healthcare Europe，Uppsala，Sweden)检测了免疫复合物。
对于RSV母液制备，从ATCC(目录号VR-26)获得RSV Long菌株，然后在含有5％CO2的潮湿氛围中在37℃下在HEp-2细胞中传播。将病毒以4∶1的感染复数(m.o.i.)加入DMEM中的细胞。1h后，将含有2％FCS的DMEM加入摇瓶，并监测3-4天的细胞感染。通过在3,000×g和4℃下离心以除去细胞碎片而收获RSV，等分，然后储藏在-80℃下直至使用。
如Kim等人，American Joumal ofEpidemiology 89：422-434(1969)所述制备了福尔马林灭活RSV(FI-RSV)。简而言之，将1份福尔马林(约37％-40％)用4,000份澄清的病毒裂解物在37℃下孵育3天，然后通过在50,000×g下离心1h而沉淀。将病毒按1∶25在最小必需培养基(MEM)中稀释，然后用氢氧化铝(4mg/ml)沉淀，以原始体积的1/100重悬在无血清MEM中，然后储藏在4℃下。
对于小鼠的免疫和攻毒，使用EndoFree Plasmid Giga试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)根据制造商的建议分离了用于免疫的质粒DNA。将质粒和重组蛋白均溶于PBS。对于疫苗接种，将小鼠随机分组，每组9只动物，如表1所列。将小鼠经肌内用FI-RSV、质粒、质粒+蛋白或盐水溶液之一在第0、14和28天免疫。在免疫前以及免疫后以2周的间隔对小鼠采集血样。在最后一次免疫后第14天将小鼠经鼻内用RSV(50μl中106TCID50)攻毒。在攻毒后每天对小鼠称重。将数据表示为攻毒第0天时基础体重的百分率。5天后将小鼠处死，测定肺泡灌洗液中的肺病毒滴度和白细胞浸润。
表1.免疫组
组 疫苗
1 原初
2 FI-RSV
3 100μl盐水溶液
4 100μg proVAX/G
5 100μg His-G
6 100μg proVAX+100μg His-G
7 100μg proVAX/G+100μg OVA
8 100μg proVAX/G+100μg His-G
9 100μg proVAX/F
10 100μg His-F
11 100μg proVAX+100μg His-F
12 100μg proVAX/F+100μg OVA
13 100μg proVAX/F+100μg His-F
对于抗体的测定，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了抗病毒抗体。将96孔板在4℃下用0.05M碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中的紫外线灭活RSV过夜包被(100μl/孔)。将板在37℃下用5％BSA-PBST封闭1h，洗涤，然后用序列稀释的血清在37℃下孵育1h。将与辣根过氧化物酶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)偶联的山羊抗小鼠IgG二抗按1∶1000稀释，加到各孔中，并在37℃下孵育1h。将10毫克TMB片溶于0.025M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，然后加入各孔进行显色。在添加2M H2SO4后，将板用酶标仪(Magellan；Tecan Group，Maennedorf，Switzerland)在450nm下读取。将抗体滴度以2.1的截止值表示为事后/原初血清的绝对比率。
对于病毒中和测定，如前人所述(Singh等人，Vaccine 25：6211-6223(2007)；Anderson等人，J Clin Microbiol 22：1050-1052(1985))并加以修改进行了病毒中和测定。简而言之，将血清在总共100μl的PBS中进行两倍序列稀释，在56℃下热灭活30分钟，然后用3×103TCID50病毒在4℃下孵育2h。大致地，将100μl补充有2％FCS的DMEM中的5×104个HEp-2细胞加到96孔微孔板的各孔中。将病毒-血清混合物加到适当的孔中，并在37℃下在5％CO2培养箱中孵育3天。然后将板用0.05％的Tween-20的PBS溶液洗涤三次，再用80％的冷丙酮的PBS溶液固定，然后用3％的封闭缓冲液封闭。将山羊抗RSV抗体(Meridian，ME，USA)加入适当的孔中并在37℃下孵育60分钟。在三次洗涤后，将牛抗山羊IgG-HRP(SantaCruz，CA，USA)加入，通过在450nm/630nm读取的平均OD建立了酶促反应。中和滴度通过对导致RSV活性降低50％的血清稀释度的倒数进行外推而由各孔的平均OD计算。
对于病毒定量，在RSV攻毒后5天从免疫小鼠中收获了肺，匀化，然后在2000rpm下离心10分钟。将得自这些样品的无细胞上清液在液氮中急冻，在解冻样品中测定了病毒滴度。简而言之，将序列log10稀释度的2％FCS-DMEM中的各测试样品加入含有3×103个HEp-2细胞/孔的微孔板，并在37℃下用5％CO2孵育。在第5天，通过视觉检查合胞体的形成对孔进行评分。通过Karber法计算了终点。将存在于各悬液中的病毒的量表示为几何平均病毒滴度(GMT；log10TCID50/g)。
对于流式细胞术分析，分离T细胞，然后用PBS中的藻红蛋白-(PE-)、异硫氰酸荧光素-(FITC-)或别藻蓝蛋白-(APC-)偶联的单抗在4℃下染色30分钟。对于细胞内染色，将T细胞在体外用G蛋白(10μg/ml)刺激8h，随后用莫能菌素(100μg/ml)处理2h。将细胞用PBS中的Fc-Block(BD Pharmingen，San Diego，USA)在4℃下封闭30分钟，然后用4％多聚甲醛固定并用皂草苷透化。将细胞在4℃下用适当浓度的抗体进行30分钟的细胞内染色，这些抗体包括APC标记的抗FoxP3或PECy5标记的抗CD25抗体、FITC标记的抗CD4抗体或PE标记的抗IL-10抗体(BD Pharmingen，San Diego，USA)。对细胞进行洗涤，然后通过使用Cell QuestPro软件的FACScalibur(BD Bioscience，San Jose，USA)进行分析。
对于T细胞增殖测定，在最后一次免疫后7天从免疫小鼠摘除脾脏，并用于制备单T细胞悬液(Tim.Journal of Immunological Methods65：55-63(1983))。将单淋巴细胞悬液一式三份地在96孔板中以5×104个细胞/孔在RPMI-1640+5％FCS中在37℃下在5％CO2培养箱中孵育，并用作为阳性对照的0.1μg/ml的豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)+1μg/ml的离子霉素(Ion)、作为特异性抗原的10μg/ml的紫外线灭活RSV抗原、作为不相关抗原的2μg/ml牛血清白蛋白(BSA)或作为阴性对照的无抗原刺激48h。使用MTT法评价了T细胞增殖，在用MTT孵育4h(Wang等人，Vaccine 18：1227-1235(2000))后通过酶标仪(Magellan；Tecan AustriaGmbH)在570nm下读取板的OD值。将数据表示为刺激指数(SI)，作为抗原刺激的三平行孔的平均读数而计算，除以培养基刺激的三平行孔的平均读数。
对于细胞分离和过继转移，由小鼠脾脏制备了单脾细胞悬液。通过使用MagCellect小鼠CD4+CD25++T细胞分离试剂盒根据制造商的方案(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA)分离并纯化了CD4+CD25+或CD4+CD25-T细胞。所得的CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞悬液的纯度通过流式细胞术(FACSCalibur， BD Bioscience，San Jose，USA)测得＞90％。将4×105个/小鼠的CD4+CD25-(约6×104个iTreg细胞)或2×105个/小鼠的CD4+CD25+(约1.8×105个nTreg细胞)经静脉内过继转移到小鼠中。
对于混合淋巴细胞反应，如上文的细胞分离章节下所述从Balb/c小鼠纯化了CD4+CD25+或CD4+CD25-T细胞群，并用作应答细胞。通过使用抗CD3单抗(eBioscience，CA，USA)进行淘洗以除去T细胞而从原初C57BL/6小鼠的脾脏分离了刺激细胞，并在使用前进一步用丝裂霉素C处理。将应答细胞和刺激细胞以1∶1、1∶3至1∶10(Balb/c应答：C57BL/6刺激)的各种比率混合，在三平行孔中以2×105个总细胞/孔接种，然后培养48h。通过MTS/PMS比色测定法(Kang等人，Vaccine 23：5543-5550(2005))使用在酶标仪(Magellan；Tecan Group，Maennedorf，Switzerland)上在490nm读取的OD值测量反应。
对于实时PCR，从RSV攻毒后第5天从免疫小鼠分离的肺样品中提取了总mRNA。通过逆转录PCR合成了cDNA，并使用FastStart SYBR Green mix(Roche)在ABI7400序列检测系统(Applied Biosystems)中测量了定量实时PCR中的SYBR Green结合。所用的引物列于表2。
表2.实时PCR引物(5’-3’)
ID NO：17) GCA(SEQ ID NO：18)
对于体积描记法，通过将小鼠置于全身体积描记器(型号AniRes2005，中国北京贝兰博科技有限公司)中根据制造商手册测量了呼吸系统动态阻力(Rrs)和顺应性(Cldyn)测量值。简而言之，将小鼠在RSV攻毒后5天进行麻醉。进行气管切开术，并将气管连接至呼吸机。进行机械通气，记录动态气道压力(ΔP)和室体积(ΔV)，并在经颈静脉内施用各200μl各种剂量的乙酰氯化胆碱(mg)后作为Rrs＝ΔP/(ΔV/ΔT)和Clydn＝ΔV/ΔP自动测量峰值阻力和顺应性(Jin等人，European Journal of Immunology 38：2451-2463(2008))。对于支气管肺泡灌洗液(BAL)采集，在攻毒后5天，对小鼠实施安乐死，进行气管切开术，将大气道用1ml含0.1％牛血清白蛋白的PBS洗涤。对支气管肺泡灌洗液(BAL)进行离心，移除上清液。将BAL沉淀重悬，并通过FACS得到总细胞计数。将细胞用Wright′s Giemsa(中国上海力臣生物科技有限公司)染色，然后通过形态学标准鉴定细胞类型。对于分类计数，每个载玻片检查了至少两百个总细胞。
对于组织病理学，将肺组织固定在缓冲福尔马林中，将横向切片(厚度5μm)用苏木精和伊红染色。组织病理学评分(HPS)基于五个不同参数的评级：(i)细支气管周和支气管浸润物，(ii)细支气管和支气管管腔渗出物，(iii)血管周浸润物，(iv)单核细胞的量，和(v)实质肺炎。HPS系统赋予0至21的值；评分越高，肺中的炎性变化越大(Jafri等人，Journal ofInfectious Diseases 189：1856-1865(2004)；Mejías等人，AntimicrobialAgents and Chemotherapy 48：1811-1822(2004))。HPS由不清楚采集标本的动物的感染状态的病理学家确定。
对于统计分析，将结果表示为平均值±平均值的标准误差(S.E.M.)。将斯氏t检验和非参数检验分析用于数据分析。将p值＜0.05视为具有统计显著性。
实施例2
DNA的表达和蛋白疫苗
将真核表达构建体proVAX/G和proVAX/F转染进NIH/3T3细胞以确认表达。通过RT-PCR对G特异性mRNA的测定确认了高效表达(图1)。将原核表达构建体pET28a(+)/G和pET28a(+)/F转化进大肠杆菌BL21(DE3)，通过Biologic DuoFlowTM色谱系统上的Ni-NTASuperflow纯化了所得的重组蛋白(图2A-2B中的pET28a(+)/G)。通过Western印迹使用特异性山羊抗RSV多克隆抗血清确认了所产生的G蛋白和F蛋白的种类(图3所示的G蛋白的种类)。
实施例3
抗体反应
将由七只Balb/c小鼠构成的组经肌内在第0、14和28天进行免疫，并在最后一次免疫后7天通过ELISA测定了抗病毒IgG抗体的水平。将单独给出的proVAX/G和His-G与proVAX/G+His-G蛋白以及与作为阳性对照的FI-RSV进行了比较。此外，将单独给出的proVAX/F和His-F与proVAX/F+His-F蛋白以及作为阳性对照的FI-RSV进行了比较。另外的对照小鼠接受了proVAX(空载体)+His-G、proVAX(空载体)+His-F、proVAX/G+不相关的蛋白(卵清蛋白，OVA)、proVAX/F+不相关的蛋白(卵清蛋白，OVA)或PBS。除了用PBS免疫的小鼠外，所有免疫小鼠均产生了可检测的IgG抗体(阳性：ODExp/ODPre＞2.1)。虽然FI-RSV免疫小鼠实现了最高的水平，但是用proVAX/G+His-G、单独的His-G或His-G+proVAX免疫的小鼠产生了相似水平的抗体反应。用proVAX/F+His-F、单独的His-F或His-F+proVAX免疫的组也产生了抗体反应。proVAX/G、proVAX/G+OVA、proVAX/F或proVAX/F+OVA组产生的水平最低(图4A-4B)。
动物和人类中的研究已证实了与更高水平的抗RSV感染保护相关的更高水平的中和抗体。因此，评估了血清抗体中和RSV的能力。血清中和滴度的测定如下：将从最后一次免疫后第7天采自免疫小鼠的汇集血清用于如实施例1所述测定RSV中和滴度。肺RSV滴度的测定如下：将得自用指定抗原免疫以及随后用RSV(106TCID50)攻毒的小鼠的肺样品用于采集RSV。如实施例1所述并如实施例5所讨论测定病毒滴度。数据通过至少六个平行样带有标准误差而提供(表3)。如表3所示，阳性对照、FI-RSV疫苗接种提供了最高的中和抗体水平；而得自His-G、proVAX+His-G、proVAX/G+His-G、His-F、proVAX+His-F和proVAX/F+His-F免疫组的抗血清表现出明显更高且相似的中和抗体水平。因此，结合抗体的水平根据中和活性而大致平行。
表3.血清中和滴度和肺RSV滴度(log10)
抗原 血清中和滴度 病毒滴度(log10TCID50/g肺组织)
PBS 0.418±0.052 5.107±0.0994
FI-RSV 3.710±0.036 1.543±0.1233
proVAX/G 1.867±0.089 3.790±0.2479
proVAX/F 1.667±0.032 4.893±0.3034
His-G 3.354±0.026 2.217±0.3005
His-F 2.911±0.023 3.783±0.1590
proVAX/G+His-G 3.463±0.042 1.850±0.1041
proVAX/F+His-F 3.089±0.030 3.857±0.2942
proVAX+His-G 3.454±0.038 2.023±0.1468
proVAX+His-F 3.085±0.050 3.883±0.2205
proVAX/G+OVA 1.935±0.046 3.300±0.2887
proVAX/F+OVA 1.634±0.032 4.733±0.2333
实施例4
通过用抗原匹配的DNA和蛋白疫苗进行联合免疫而抑制自身反应性CD4+T细胞
由于在RSV攻毒时的严重VID通过诱导自身反应性CD4+T细胞而介导，并且用抗原匹配的DNA和蛋白疫苗进行联合免疫已证实可损害抗原特异性T细胞但不损害抗体反应，因此检查了在最后一次免疫后7天在体内对紫外线照射RSV抗原的T细胞增殖反应。在从用proVAX/G+His-G联合免疫的小鼠分离的T细胞中观察到了最低水平的增殖反应，而在从除了PBS或BSA阴性对照外的其它免疫组(图5)分离的T细胞中观察到了强烈的增殖反应。在从proVAX/G免疫组分离的T细胞中观察到了强烈的增殖反应，表明在该组中很好地引发了细胞免疫反应。用作为抗原错配对照的proVAX/G+OVA或His-G+proVAX载体联合免疫并未揭露出任何不相关的载体或蛋白对反应的影响。该结果表明用DNA疫苗+蛋白(proVAX/G+His-G)联合免疫在优先抑制T细胞增殖反应方面是独特的。
实施例5
在RSV攻毒后作为病毒载量的降低而测得的保护
在最终免疫后两周，将小鼠用RSV经鼻内以106TCID50(50μl)/动物进行攻毒(参见表3和图6A-6B)。在攻毒后5天当病毒载量在肺中达到峰值时采集的肺样品和BAL中对病毒滴度进行定量。在PBS对照小鼠中，RSV复制到5.107±0.0994 log10 TCID50/g肺组织的高滴度。用FI-RSV、His-G、proVAX+His-G或proVAX/G+His-G免疫的小鼠与PBS、proVAX/G和proVAX/G+OVA免疫组(表3和图6A)相比表现出病毒滴度的显著降低。用His-F、proVAX+His-F或proVAX/F+His-F免疫的小鼠与PBS、proVAX/F和proVAX/F+OVA免疫组相比也表现出病毒滴度的降低(表3和图6B)。保护力显然与中和抗体滴度相关(表3)。
实施例6
从联合免疫小鼠中消除VID
研究了联合免疫策略保护动物免于在RSV攻毒后发生气道高反应性(AHR)的能力。从BAL中分离细胞，染色，然后通过显微镜分析以测量RSV攻毒后所存在的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的量。如图7A-7D所示，炎性细胞的浸润在proVAX/G+His-G联合免疫组中明显低于其它免疫组，从而表明用RSV G抗原进行联合免疫保护了小鼠免受RSV感染并改善了肺部炎性反应。相似地，炎性细胞的浸润在proVAX/F+His-F联合免疫组中比其它免疫组更少(图8A-8D)。FI-RSV或His-G或proVAX+His-G免疫组的肺在RSV攻毒后表现出了大量的浸润。
由于该浸润，受RSV感染的小鼠发生了明显的气道阻塞。为了评估各组之中该气道阻塞程度，在RSV攻毒后五天在通过颈静脉内施用各种剂量的乙酰氯化胆碱进行刺激期间进行了全身体积描记。如图9A-9B所示，在proVAX/G+His-G联合免疫组中观察到了响应于乙酰胆碱刺激的最低的Rrs和Cldyn值；而在用FI-RSV或His-G或proVAX+His-G免疫的小鼠中Rrs和Cldyn值与PBS对照相比明显增加。该结果表明气道阻塞通过proVAX/G+His-G联合免疫而得到改善。对于proVAX/F+His-F联合免疫组观察到了类似的结果(图9C-9D)。
经由肺切片的组织病理学分析进一步评估了改善情况。PBS对照组在攻毒后5天表现出RSV感染的组织病理学特征(图10A-10H、图11A-11H和图12A-12E)。RSV复制导致了明显的肺部感染，具有致密的淋巴细胞性浸润物。在血管周和支气管周区域中均观察到了强烈的淋巴细胞性浸润。与用proVAX/G、proVAX/G+OVA或PBS免疫的小鼠相比，用FI-RSV或His-G或proVAX+His-G免疫的小鼠得到了明显更高的组织病理学评分(HPS)(图13)，具有致密的血管周和支气管周浸润物和严重的肺炎(图10A-10H)。然而，用proVAX/G+His-G免疫的小鼠表现出明显更轻的肺部炎性反应，并且肺HPS值明显低于其它组。这些结果进一步证实了：用proVAX/G+His-G或proVAX/F+His-F联合免疫可改善RSV感染的肺部组织病理。
除了损害呼吸功能外，RSV感染还会严重影响体重。在用活RSV攻毒后，每天对小鼠称重。所有免疫组在攻毒后均具有相对于第一天的早发型(第2天)体重损失，然而，proVAX/G+His-G联合免疫组在攻毒后第5至7天表现出比其它组在统计上更轻的体重损失(图14A，p＜0.05)。相比之下，在攻毒后第8至9天，用FI-RSV或His-G或proVAX+His-G免疫的小鼠具有比其它组更大的体重损失。因此，用proVAX/G+His-G联合免疫可在活RSV攻毒后实质性减轻疾病的严重性。对于proVAX/F+His-F联合免疫组观察到了类似的结果(图14B)。
之前已证实FI-RSV诱发的VID与Th2型反应的活化相关。为了研究细胞因子谱是否受联合免疫方案的影响，将qPCR用于测定RSV攻毒后第5天肺组织中细胞因子的水平。如图15A-15D所示，在His-G或proVAX+His-G免疫组中测试的几乎所有细胞因子的水平均类似于FI-RSV免疫组中的那些水平；然而，用proVAX/G+His-G联合免疫的小鼠产生了最低水平的这些细胞因子。这表明Th1和Th2反应均受到联合免疫的抑制。用proVAX/G或proVAX/G+OVA免疫的小鼠表现出来更高水平的IFN-γ表达，从而表明DNA疫苗接种可引起倾向于Th1的免疫力。
实施例7
RSV-G特异性iTreg细胞损害T细胞反应
之前已证实，通过用DNA和蛋白疫苗进行联合免疫而诱导的T细胞反应受损是由于诱导了CD4+CD25-IL-10+FoxP3+iTreg细胞。为了确定这里在联合免疫组中观察到的损害的T细胞反应和扭曲的细胞因子表达是否是由于诱导了iTreg细胞，在最后一次联合免疫后7天通过FACS分析了T细胞表型。结果表明脾脏中的CD4+CD25-IL-10+FoxP3+iTreg细胞群实际上在用proVAX/G+His-G联合免疫的小鼠中与其它组相比以明显更高的水平(p＜0.001)受到诱导(图16A-16N和图17A-17B)。相比之下，作为nTreg对照，得自各组的CD4+CD25+T细胞高度表达了FoxP3和IL-10，但是在各组之间在其浓度上无明显差异。
将CD4+CD25-iTreg细胞过继转移以在体内测试它们在改善所观察到的VID中的作用。原初Balb/c小鼠接受了得自联合免疫小鼠的CD4+CD25-iTreg细胞。对照接受了作为由原初小鼠制备的nTreg细胞群的CD4+CD25+细胞。然后将受体小鼠针对His-G抗原进行免疫，在T细胞增殖测定和体外MLR中评估了它们对该免疫的反应。如图18所示，得自接受了从用proVAX/G+His-G联合免疫的Balb/c小鼠分离的CD4+CD25-iTreg细胞的小鼠的脾细胞明显抑制了T应答细胞记忆免疫反应。相同的脾细胞还抑制了响应于同种异体APC的增殖(图19)，而得自原初供体的相应CD4+CD25-细胞未抑制增殖。得自接受了来自免疫小鼠的CD4+CD25+nTreg细胞的小鼠的脾细胞，以及得自接受了来自原初小鼠的CD4+CD25+nTreg细胞的那些小鼠的细胞可一样好地抑制T细胞增殖，从而表明转染的nTreg细胞的非特异性抑制。这些结果表明用proVAX/G+His-G联合免疫可诱导CD4+CD25-IL-10+FoxP3+iTreg细胞，这些细胞以抗原依赖性方式损害T细胞反应。
实施例8
CD4+CD25-T细胞的过继转移遏制Ag特异性炎症
从用proVAX/G+His-G或proVAX/G+OVA(抗原错配的对照)联合免疫的小鼠纯化了CD4+CD25-iTreg和CD4+CD25+nTreg细胞，并经静脉内过继转移到之前已用His-G免疫的小鼠中。7天后，将小鼠用RSV感染进行攻毒。淋巴细胞性浸润在接受来自用proVAX/G+His-G联合免疫的小鼠的CD4+CD25-iTreg细胞的小鼠中明显减轻，但在接受来自proVAX/G+OVA免疫小鼠的此类细胞的那些小鼠中不然(图20A-20F)。组织学分析揭露出在接受抗原特异性CD4+CD25-iTreg细胞的组中炎性细胞浸润物更少(图20A-20F和图21)。虽然在接受CD4+CD25+nTreg细胞的组中也观察到了组织病理学结果的相似改善，但是得自nTreg的改善未表现出任何抗原特异性。
得自用编码G抗原的DNA疫苗和G蛋白疫苗联合免疫的小鼠的CD4+CD25-细胞明显减轻了在活RSV攻毒后观察到的VID(图20A-20F和图21)。应当注意，从错配疫苗接种方案转移到His-G免疫小鼠的CD4+CD25-细胞导致了在感染时更严重的临床发作，从而表明得自抗原错配对照的这些细胞可能存在缺乏iTreg细胞的问题而含有效应T细胞(图20A-20F和图21)。
用表达RSV G抗原的DNA疫苗及其G蛋白一起联合免疫(proVAX/G+His-G)不仅在小鼠中避免了受到RSV攻毒的影响，还抑制了会导致VID的加剧的肺部炎症。对RSV感染的预防和VID的减少明显是因为诱导了高水平的抗原特异性中和抗体和iTreg细胞，而iTreg细胞可以抗原特异性方式抑制T细胞记忆增殖。这种联合免疫上调抗炎细胞因子IL-10的水平，而下调RSV诱导的炎性细胞因子，诸如IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ。
虽然得自联合免疫小鼠或错配对照的CD4+CD25+细胞(nTreg)能够在转移后减轻受体中的炎性细胞浸润(图20A-20F和图21)，但是它们仅提供全局性的非特异性抑制。据推测，它们对炎症的抑制在体内是有限的，因为nTreg不是诱导性细胞群，并具有依赖于免疫大环境的塑性。例如，其难以在体内或离体诱导大量的nTreg细胞。此外，全局性免疫抑制能力可能增大患癌症的风险并造成发生感染的机会。

Claims (19)

1.一种抗呼吸道合胞病毒感染的疫苗，其包含RSV抗原肽和编码所述RSV抗原肽的核酸，其中所述核酸为DNA并且所述DNA编码选自以下的所述RSV抗原肽：SEQ ID NO:4和SEQID NO:25，并且其中所述疫苗刺激iTreg细胞，其中所述iTreg细胞是CD4+CD25-FoxP3+IL-10+iTreg细胞。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述DNA存在于环形质粒的线性表达盒中。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其中所述质粒选自pVAX、pcDNA3.0和proVAX。
4.根据权利要求2所述的疫苗，其中所述质粒还包含选自以下的启动子：CMV、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子和多角体启动子。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸和抗原肽处于选自5:1和1:5、1:1和2:1的质量比。
6.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗能够电穿孔到有需要的受试者中。
7.一种疫苗接种试剂盒，其包括疫苗施用装置和根据权利要求1所述的疫苗。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述疫苗施用装置选自疫苗枪、针和电穿孔装置。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述电穿孔装置为微创电穿孔装置。
10.根据权利要求1所述的疫苗在制备用于预防或治疗受试者中的呼吸道合胞病毒感染的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述受试者还受到保护免于发生呼吸道合胞病毒攻毒后的气道高反应性。
12.根据权利要求10所述的用途，其中所述疫苗通过电穿孔而施用。
13.根据权利要求1所述的疫苗在制备用于诱导抗呼吸道合胞病毒感染的中和抗体并抑制炎性T细胞的药物中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其中抑制炎性T细胞包括诱导iTreg细胞，并抑制自身反应性CD4+和CD8+T细胞。
15.根据权利要求1所述的疫苗在制备用于治疗或预防接受呼吸道合胞病毒免疫的受试者中的疫苗诱发疾病的药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中将所述受试者在遭遇自然RSV感染前用福尔马林灭活RSV或RSV抗原免疫。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述疫苗经由电穿孔而施用。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述电穿孔途径选自皮内和肌内。
19.根据权利要求15所述的用途，其中所述疫苗通过微创电穿孔装置进行电穿孔。
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