CN101862450B - 一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗及其应用。该重组卡介苗疫苗是以卡介苗为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含细菌复苏促生长因子基因片段的表达载体。该重组卡介苗疫苗能够持续分泌具有生物活性的Rpf因子，能够诱导体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平，针对外源性的Rpf产生的抗体能够阻断Rpf对MTB的刺激效果，而且诱导的IFN-γ水平优于BCG。该重组卡介苗疫苗应用于MTB感染和/或MTB隐性感染的预防免疫疫苗的制备。

Description

一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗及其应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种重组卡介苗(rBCG)疫苗，特别涉及一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗及其应用。

背景技术

1、重组BCG是制备TB疫苗的有效途径

卡介苗疫苗(BCG)是一种减毒的活牛型分枝杆菌，是目前预防结核病最有效的疫苗，自1948年以来世界上已有35亿人接种。随着研究的深入，人们发现BCG不仅是一种活疫苗，而且也是外源基因的表达载体，这个发现为BCG的应用开辟了新领域。

rBCG(Recombinate BCG)是将BCG作为工程菌，利用基因工程技术将几种外源基因导入同一BCG中，依靠BCG在宿主细胞内的长期存活而得到表达。通常是将外源目的基因插入卡介苗基因组或其质粒的某些部位使之高效表达，但不影响该疫苗株的生存与繁殖。接种这种重组疫苗以后，除可激发对疫苗同类细菌的保护外，还可获得对所插入外源抗原的免疫，从而建立对相关疾病的保护力。rBCG集佐剂和载体于一身、兼多种外源基因与活疫苗于一体，一次接种，可获得强而持久的多种特异性免疫。更重要的是，rBCG比重组病毒载体更容易开发。

多种病毒、寄生虫和细菌抗原，包括细菌毒素，均可在rBCG中成功表达。在某些rBCG，外源抗原的表达量可占rBCG全部蛋白的15％。对啮齿类动物的实验研究表明，单次接种可诱发强烈的体液免疫，常可持续几个月之久。如果继续接种rBCG可获得高水平的抗体。目前已知，在BCG中表达了多种外源基因，如：HIV-1nef基因、HIV-1gag基因、HIV-1pol基因、HIV-1env基因、HIV-1gp120基因、HIV-1gp41基因、破伤风毒素C片段以及麻风分枝杆菌等基因。然而，值得注意的是有些蛋白则只能分泌于BCG细菌外，方可作为有效的免疫原诱导免疫应答。

目前，rBCG疫苗已广泛用于新型结核病疫苗的研究，MTB的Ag85复合物和ESAT6等保护性抗原来分别或组合构建rBCG，以期诱导机体产生对MTB更强的免疫应答。但也都还存在着一定不足，只有表达分泌蛋白Ag85B的rBCG在豚鼠体内的保护力超过BCG，提示有效的TB疫苗应以rBCG为基础。实验研究表明，现有的TB疫苗尽管可以有效抑制早期MTB的增殖，但对已被巨噬细胞吞噬的MTB则作用甚微，MTB处于潜伏状态，当机体免疫力低下时，处于潜伏状态的MTB又开始进行性生长，导致组织损伤或死亡，人类的TB病例大部分也是这种复发性疾病。因此，理想的TB疫苗诱导的免疫应答应是既能有效抑制早期MTB的增殖，又能有效防止潜伏状态的MTB的激活。

2、Rpf与MTB的相关研究：

细菌复苏促生长因子(Resuscitation-promoting factor，Rpf)最初是在M.luteus(藤黄微球菌)中发现，该因子可以在皮克(10^-12)水平以自分泌和旁分泌形式促进休眠菌的复活和生长，其机制可能是参与了细胞间的信号转导。Rpf除能促使休眠菌复活和生长以外，对正常生长的细菌也有效。由于Rpf的功能类似于真核生物的生长因子，所以被称为细菌的生长因子。

目前已查明了Rpf的氨基酸顺序，并确定了编码这种蛋白的基因。相似的Rpf基因广泛分布在高G+C％含量的革兰氏阳性菌中。研究发现M.Luteus的Rpf蛋白结构域具有与Rpf蛋白一致的生物学功能，代表了Rpf的完整活性。经杂交试验证实在多种分枝杆菌中也存在Rpf基因，在结核分枝杆菌(M.tuberculosis，MTB)H37Rv株和牛分枝杆菌的基因组中Rv0867C(RpfA)、Rv1009(RpfB)、Rv1884C(RpfC)、Rv2389C(RpfD)和Rv2450C(RpfE)基因所编码的蛋白均具有Rpf样作用域，推测这些基因编码的蛋白可能也具有Rpf的促进细菌生长作用。

Rpf蛋白的作用机制尚不清楚，推测可能在细胞外发挥作用，参与了细胞间的信号转导。Rpf蛋白发挥作用在两种情况下是必需的，一种是将低密度细菌接种于培养基时，繁殖生长需要Rpf；Rpf对10²CFU/ml的BCG生长具有明显促进作用，但对10⁵CFU/ml的BCG作用不明显。另外一种情况是休眠菌复苏时需要Rpf，在E.coli中表达的任何一种Rpf样蛋白，在皮克浓度就可以刺激BCG休眠菌的生长。

通过细胞壁酶谱分析，发现Rpf蛋白具有溶菌酶样结构域，由于在休眠菌的细胞壁中，新生肽聚糖被惰性肽聚糖所代替，使得其被膜成为一个“茧”样结构，在胞壁复苏时，必须由特定的胞壁溶解酶对其进行溶解，而Rpf就是行使这种功能的蛋白质。其作用细胞壁后释放的小分子物质可能作为信号物质参与了细菌的复苏过程。正常生长的BCG可表达Rpf样蛋白，而处于缓慢生长或休眠状态的BCG不表达任何一种Rpf样蛋白。

Rpf蛋白作为迄今为止发现的第一个能使休眠的细菌恢复生长繁殖能力的分泌型蛋白，也是细菌宿主免疫系统识别的靶抗原，能引起较强的免疫应答。Rpf蛋白刺激宿主机体产生的特异性抗体能阻断Rpf蛋白对MTB的作用，阻止MTB在体内的复苏和复发，因此Rpf蛋白可能是预防和控制MTB感染的一种新型途径。

重组的Rpf样蛋白可以刺激BCG的生长，但当培养基中加入亲和纯化的抗Rpf抗体时却能有效抑制BCG或H37Rv的生长，如果再加入一定量的Rpf蛋白可以抵消抗体的生长抑制作用，使BCG或H37Rv重新维持正常生长。同样纯化的Rpf抗体能在体外抑制M.luteus的生长，说明封闭这种细胞表面蛋白可以抑制细菌在体内的复制。

3、Rpf蛋白在小鼠体内诱导产生的免疫应答水平

进一步研究表明，这几种具有Rpf样作用域的分泌蛋白均可被宿主免疫系统识别，引起较强的细胞免疫应答。Yeremeev等用Rpf自身和5种Rpf样蛋白分别作为亚组疫苗免疫C57BL/6鼠，发现除RpfC外Rpf自身和Rpf样蛋白均可诱导产生IgG1和IgG2，活化T细胞增殖，刺激产生高水平的Th1型细胞因子，如γ干扰素和IL-12，但Th2型细胞因子IL-4，IL-5的水平极低，被免疫的小鼠可明显抵抗高剂量毒株H37Rv的攻击，包括延长动物存活时间，降低肺和脾脏中MTB的复制。Rpf样蛋白提供的保护效果与MTB早期分泌蛋白(如Ag85B或ESAT6)相当，与10³CFU BCG保护力一致，但稍低于10⁴-10⁶CFU BCG的保护效果，同时Rpf样蛋白免疫豚鼠后可有效抵抗H37Rv的攻击。而RpfC引起的细胞免疫和体液免疫均很低，免疫源性很弱。由于Rpf样蛋白具有高度保守的结构域，所以家族的每个蛋白在体液和细胞免疫中显示了很高的交叉反应性。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗，该重组卡介苗疫苗分泌的细菌复苏促生长因子(Rpf)引起的免疫应答，能够有效防止潜伏状态的MTB(M.tuberculosis，结核分枝杆菌)的激活，是一种安全有效的TB(Tuberculosis结核病)疫苗。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗，是以卡介苗为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含细菌复苏促生长因子基因片段的表达载体。

所述的细菌复苏促生长因子基因片段其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的包含细菌复苏促生长因子基因片段的表达载体是pDE22-Rpf，该表达载体是通过BamHI和HindIII酶切位点将细菌复苏促生长因子基因克隆入分支杆菌表达载体pDE22。

分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗应用于MTB感染和/或MTB隐性感染的预防免疫疫苗的制备。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明提供的分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗，以BCG作为宿主细胞，构建的外源表达载体pDE22-Rpf得到表达后，能够持续分泌具有生物活性的Rpf因子；

连续传代培养监测rBCG-Rpf的生长曲线和Rpf的分泌，结果表明其生长曲线稳定，第1、4、8、10代分泌的Rpf与Rpf抗体具有抗体反应。

2、本发明利用rBCG疫苗防御结核病疫苗的独特之处在于，在保持BCG疫苗的原有特征的基础上，rBCG-Rpf免疫宿主后，由于相对于宿主的外源性Rpf因子的持续分泌，机体产生针对Rpf因子的体液免疫应答，产生特异性的抗体；而免疫应答的结果能够阻断Rpf因子对休眠的MTB的复苏和初始阶段的增殖的促进作用，达到既能有效抑制早期MTB的增殖，又能有效防止潜伏状态的MTB的激活的效果；

本发明通过对免疫rBCG-Rpf的小鼠测定特异性抗Rpf的抗体为1∶4000，而大量抗Rpf抗体的存在能够有效抑制结核菌的生长和休眠菌的复苏。

3、本发明构建的rBCG-Rpf作为一种重组BCG疫苗，能够引起细胞免疫应答，包括刺激IFN-γ的产生水平和淋巴细胞增殖指数；动物保护性验证结果表明rBCG-Rpf菌株可有效抵抗MTB的感染，在小鼠体内达到与普通BCG相同的保护效果，并且其安全性验证表明免疫后小鼠的脾脏、肺脏无变化；

并且，由于TB疫苗的免疫效果取决于细胞免疫应答的水平，而rBCG-Rpf诱导的IFN-γ水平优于BCG，因此有望取代BCG用于抵抗MTB的感染。

4、本发明构建的rBCG-Rpf疫苗接种对象将比原有BCG疫苗大大扩展：rBCG-Rp f疫苗一方面保持BCG疫苗的原有特征，可用于如新生儿的预防接种，有效控制MTB的急性感染；另一方面，由于机体产生针对Rpf的特异性抗体可有效控制结核休眠菌的复苏，从而使该疫苗可用于已接种过BCG的成年人和/或隐性感染者。

附图说明

图1是PCR扩增的Rpf基因片段的电泳检测结果图；

图2是pDE22-Rpf重组表达载体双酶切鉴定结果图；

图3是pDE22-Rpf表达载体双酶切片段PCR扩增产物的电泳检测结果；

图4是rBCG-Rpf菌株提取质粒后的PCR扩增产物电泳鉴定结果；

图5a是rBCG-Rpf菌株培养上清的SDS-PAGE电泳，图5b是rBCG-Rpf菌株培养上清的Western-blot检测结果；

图6是rBCG-Rpf菌株与BCG菌株的生长曲线比较图；

图7是rBCG-Rpf菌株免疫诱导的IFN-γ水平检测结果；

图8是rBCG-Rpf菌株连续传代后分泌的Rpf与Rpf抗体的Western-blot结果；

图9是rBCG-Rpf免疫小鼠8周后肺脏和脾脏的组织切片检测图。

具体实施方式

本发明提供一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗，在构建外源性表达载体pDE22-Rpf的基础上，将其转染BCG制备重组卡介苗，经过抗性筛选得到rBCG-Rpf；并对目的基因的表达和rBCG-Rpf的免疫效果进行验证。下面结合附图对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、Rpf基因的克隆

以M.luteus DNA为模板PCR克隆Rpf基因，扩增引物P设计如下：

上游引物P1：cgaggatcca ccatggacac catgact    27；

下游引物P2：tcaaagcttt caggcctgcg gcaggac    27；

上游引物P1引入了BamHI酶切位点ggatcc，下游引物P2引入了HindIII酶切位点aagctt；

PCR反应体系为：10×buffer 3μL，dNTPs1.2μL，DNA模板0.6μL，P1、P2引物各0.6μL，Taq酶0.3μl，加水至30μL；

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃45s，60℃45s，72℃50s，共30个循环；最后再于72℃延伸5min；

凝胶纯化回收PCR产物，扩增的672bp的Rpf基因片段的凝胶电泳结果如图1所示，其中，泳道M为Marker，泳道1为扩增的Rpf基因片段；

将Rpf基因片段和pMD-18T表达载体分别用BamH I和Hind III双酶切，然后T4连接酶将带有黏性末端的Rpf基因片段和pMD-18T表达载体16℃连接过夜，构建中间载体pMD-18T-Rpf；

将pMD-18T-Rpf转染E.Coli DH5α后，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取阳性克隆pMD-18T-Rpf，提取质粒，将提取的质粒用BamH I和Hind III双酶切进行鉴定，观察到672bp的目的片段Rpf基因；

将筛选出的阳性克隆进行测序分析(由北京奥科生物技术有限公司完成测序)，其中Rpf基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示(NCBI ReferenceSequence：NC_012803.1)。

2、重组表达载体pDE22-Rpf的构建

将表达载体pMD-18T-Rpf、pDE22分别用BamH I和Hind III双酶切，并琼脂糖电泳后回收载体片段，将带有黏性末端的pDE22线性载体和Rpf基因片段，通过T4DNA连接酶的连接构建重组表达载体pDE22-Rpf；

将构建完成的pDE22-Rpf重组表达载体用BamH I和Hind III双酶切进行鉴定，酶切鉴定结果如图2所示：泳道1为Marker，泳道2、3为pDE22-Rpf载体被BamH I和Hind III双酶切的结果，可以在泳道2、3清晰的看到672bp的目标基因条带；

酶切鉴定结果正确的载体序列进行PCR分析，以因对P1、P2作为引物检测到目的Rpf基因，如图3所示的pDE22-Rpf表达载体双酶切片段PCR扩增产物的电泳检测结果；其中泳道1为Marker，泳道2、3为pDE22-Rpf载体被BamH I和Hind III双酶切的结果，可以在泳道2、3清晰的看到672bp的目标基因的条带；表明重组表达载体pDE22-Rpf构建成功。

3、分泌表达Rpf的重组BCG菌株(rBCG-Rpf)的构建及表达

将BCG在7H9培养基中大量培养4周后，按1％的比例转接；再培养3周时，7H9培养基中加入2M的甘氨酸，继续培养2d后冰浴30min(使细菌休克，制备BCG感受态)；

用冰浴的10％甘油制备5×10⁶CFU(菌落形成单位)BCG感受态细胞，然后将纯化的pDE22-Rpf用电穿孔法转化感受态BCG；所述的电穿孔法其具体参数为：0.4cm的电穿孔杯，电压2.5KV，电容25uF，电阻1000Ω；

转染后rBCG在7H9培养基中37℃培养24h后，将重组的菌株涂布于含ADC(葡萄糖-牛血清白蛋白因子v-过氧化氢酶)和潮霉素的7H10平板中，设空白质粒作为对照，37℃培养30～35d；

利用潮霉素抗性筛选和PCR方法获得含pDE22-Rpf基因的重组BCG：

在含有潮霉素的7H10平板培养5周后，挑出7H10平板上生长的克隆，接种于5ml 7H9培养基中培养21d后，离心集菌后，提取细菌NDA，用PCR法鉴定pDE22-Rpf成功转染的阳性克隆，引物用Rpf基因的克隆时设计的引物P1和P2，RCR扩增体系和条件也相同；PCR扩增产物的电泳结果如图4所示；其中，泳道1、2为挑取的阳性克隆的PCR扩增鉴定结果，泳道3为Marker，可以在泳道1、2清晰的看到672bp的目标基因Rpf的条带；这表明Rpf基因整合到了潮霉素抗性筛选的阳性克隆中。

PCR鉴定正确的阳性克隆加入含有潮霉素的7H9培养基中培养，37℃震荡培养30d；10000rpm离心3min，分别收集菌体沉淀和培养上清；

如果rBCG-Rpf的外源表达载体pDE22-Rpf得到表达，而由于Rpf是分泌型的，那么在离心收集rBCG-Rpf菌体时分离得到的上清中就应该包含Rpf；因此对分离得到包含Rpf的上清进行如下的SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定：

取部分rBCG-Rpf菌株的培养上清进行经12％SDS-PAGE电泳分离，并电转至PVDF膜；以含5％脱脂奶粉的TBST(Tris-Tween盐缓冲液)4℃封闭过夜，TBST洗膜，分别加入抗人Rpf单抗(一抗)(1∶500稀释)作用1h，TBST洗膜；HRP标记的山羊抗小鼠抗体(二抗)(1∶500稀释)(Sigma)室温孵育1h，TBST洗膜后，DAB显色；

鼠源性的抗人Rpf单抗由第四军医大学西京医院检验科提供；关于该单抗可以参见：樊爱琳，师长宏，苏明权，等.抗藤黄微球菌Rpf结构域单克隆抗体的制备与特性鉴定.细胞与分子免疫学杂志.2008；24(5)；

SDS-PAGE电泳和Western-blot结果证实rBCG-Rpf菌株有Rpf的表达，其结果分别如图5a、图5b所示：

在图5a中泳道1为标准Marker，泳道2为作为对照的BCG，泳道3为rBCG-Rpf菌株培养的上清，泳道4、5为经过纯化的rBCG-Rpf菌株培养的上清包含的Rpf蛋白；图b所示为rBCG-Rpf菌株培养上清的Western-blot结果；

泳道3、4、5与作为对照泳道2比较可以清楚的看到目的蛋白的30kD条带得到表达，尤其是经过纯化后的结果更为明显；而且图b所示的Western-blot结果显示该条带能够与抗Rpf的单抗结合；这表明rBCG-Rpf菌株以分泌的形式表达了目的蛋白Rpf。

4、rBCG-Rpf菌株的生长特性鉴定

将分泌表达Rpf蛋白的rBCG-Rpf菌株和普通BCG菌株分别接种在含10％ADC的7H9培养液中，37℃振荡培养，测定不同时间点的值，OD₆₀₀绘制生长曲线，比较观察rBCG的增殖特性与普通BCG的差别；结果如图6所示，培养30d之后rBCG-Rpf的生长要快于BCG，但是两者无显著差别；这表明rBCG-Rpf菌株并没有因为Rpf的分泌而减缓菌体的生长。

5、rBCG-Rpf菌株在小鼠体内诱导产生的免疫应答和保护力

1)将rBCG-Rpf和普通BCG首先用7H10琼脂平板稀释计数，取6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组进行免疫：卡介苗(BCG)对照组、生理盐水对照组、rBCG-Rpf组，每组10只；BCG对照组和rBCG-Rpf组采用1×10⁶CFU/只皮下接种，生理盐水组为皮下0.2ml/只，均免疫1次。

2)6周后取每组10只小鼠断颈处死，取血，分离血清，夹心ELISA测定特异性抗Rpf抗体(IgG)的水平：

抗Rpf抗体结果显示rBCG-Rpf免疫组诱导产生的特异抗体滴度为1∶4000，而BCG免疫组只有1∶500，具有显著的差异；而大量抗Rpf抗体的存在能够有效抑制结核菌的生长和休眠菌的复苏。

3)在分离血清的同时无菌取脾脏，置于200目的钢网上，用注射器针芯研磨，并用不含血清的RPMI1640培养液冲洗，将获取的脾脏细胞悬液转入2倍体积的小鼠淋巴细胞分离液，1000r/min离心15min，吸取中间单核细胞层，用不含血清的RPMI1640洗涤两次后，用含10％FCS的RPMII640培养液，将收集的脾细胞数调整至5×10⁶/ml，分别加入到24孔板中培养，800μl/孔；

再分别加入120μl/孔的Rpf蛋白(30mg/L溶于PBS)刺激诱导产生IFN-γ，置37℃，5％CO₂孵箱中培养72h，收集培养液，以5000r/min离心5min，取上清，采用夹心ELISA法检测IFN-γ的含量；

图7所示的免疫诱导的IFN-γ的水平检测结果：rBCG-Rpf诱发的IFN-γ的水平为7.76±0.70ng/ml，显著高于BCG组(5.32±0.28ng/ml)，但两者均高于生理盐水组；说明rBCG-Rpf诱导的细胞免疫应答水平高于普通BCG，可能具有强的保护力抵抗MTB的感染。

4)用含10％FCS的RPMI-1640完全培养液将分离的淋巴细胞浓度调整至5×10⁵/ml，加入96孔板中，200μl/孔，同时实验组用PPD(30mg/L溶于PBS)刺激，每孔加入30μl，对照组不加抗原刺激，调零孔不加脾细胞，置CO₂孵箱中37℃培养68h后，每孔加20μl MTT(5mg/ml，溶于PBS，PH7.2，过滤除菌)，继续培养4h后终止培养，弃上清，加DMSO 150μl/孔，振荡10min，测定OD_490nm值，结果用刺激指数SI＝OD实验组/OD对照组表示：

结果可见rBCG-Rpf与BCG的免疫所诱导均可有效活化淋巴细胞，其淋巴细胞增殖指数分别为3.16±0.55和2.89±0.63；具有促进脾淋巴细胞的增殖，诱发强的细胞免疫应答水平的效果。

5)动物保护性验证：

取6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组进行免疫：卡介苗(BCG)对照组、生理盐水对照组、rBCG-Rpf组，每组10只；BCG对照组和rBCG-Rpf组用1×10⁶CFU/只皮下接种，生理盐水组为皮下0.2ml/只，均免疫1次。

6周后，用结核分枝杆菌毒株经静脉感染BALB/c小鼠，感染4周后取小鼠脾脏组织匀浆，倍比稀释后涂于7H10平板，4周后计数CFU，计算脏器MTB荷菌数，结果以脾脏和肺脏MTB荷菌数的log10CFU表示：

结果表明：与生理盐水组相比，rBCG-Rpf免疫组均可有效抵抗MTB的感染，有效降低脾脏荷菌数，其脾脏荷菌对数值(Ig，CFU/g)为4.43±0.37；

BCG免疫组脾脏荷菌对数值为4.39±0.20，与rBCG-Rpf免疫组相比无显著差别；

这表明rBCG-Rpf菌株可有效抵抗MTB的感染，在小鼠体内达到与普通BCG相同的保护效果。

综合上述1)～5)的验证结果表明：在接受rBCG-Rpf免疫后，机体产生的免疫应答包括体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平；

针对外源性的Rpf产生的抗体能够阻断Rpf对MTB的刺激效果，有效抑制结核菌的生长和休眠菌的复苏；

rBCG-Rpf免疫所引起的细胞免疫应答包括IFN-γ的刺激性产生和淋巴细胞增殖指数；由于TB疫苗的免疫效果取决于细胞免疫应答的水平(如IFN-γ水平和淋巴细胞增殖指数)，而rBCG-Rpf诱导的IFN-γ水平优于BCG，因此有望取代BCG用于抵抗MTB的感染。

6、rBCG-Rpf菌株的稳定性验证

将分泌表达Rpf的rBCG-Rpf连续传代，检测插入基因Rpf有无缺失，生长曲线有无变化；

检测到第10代传代培养的rBCG-Rpf菌株，其生长曲线稳定，外源基因稳定表达，rBCG-Rpf连续传代后分泌的Rpf与Rpf抗体的Western-blot结果如图8所示，可以清晰看到第1、4、8、10代的菌株均稳定分泌Rpf。

7、rBCG-Rpf菌株的安全性验证

一组小鼠皮下接种10⁷CFU的Rpf-rBCG，另一组接种10⁶CFU的BCG，8周时分别处死部分小鼠，无菌取脾和肺，肉眼观察无明显的病理变化；

将小鼠的肺脏、脾脏组织用10％的甲醛固定，制备病理切片，100×镜下观察肺脏和脾脏的组织变化，结果显示：小鼠的肺、脾脏以淋巴细胞浸润为主，无明显的病理变化，其结果分别如图9a、图9b所示。

在rBCG-Rpf菌株具有稳定的Rpf分泌和免疫后的安全性的基础上，由于此免疫后诱导的体液免疫应答和细胞免疫应答，其对象将比原有BCG疫苗大大扩展：

rBCG-Rpf疫苗一方面保持BCG疫苗的原有特征，可用于如新生儿的预防接种，有效控制MTB的急性感染；另一方面，由于机体产生针对Rpf的特异性抗体可有效控制结核休眠菌的复苏，从而使该疫苗可用于已接种过BCG的成年人和/或隐性感染者。

核苷酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗及其应用

<160>1

<210>1

<211>672

<212>DNA

<213>结核分枝杆菌(M.luteus)

<400>1

atggacacca tgactctctt caccacttcc gccacccgct cccgccgtgc caccgcctcg     60

atcgtcgcgg gcatgaccct cgccggcgcc gccgccgtgg gcttctccgc cccggcccag    120

gccgccaccg tggacacctg ggaccgcctc gccgagtgcg agtccaacgg cacctgggac    180

atcaacaccg gcaacggctt ctacggcggc gtgcagttca ccctgtcctc ctggcaggcc    240

gtcggcggcg aaggctaccc gcaccaggcc tcgaaggccg agcagatcaa gcgcgccgag    300

atcctccagg acctgcaggg ctggggcgcg tggccgctgt gctcgcagaa gctgggcctg    360

acccaggctg acgcggacgc cggtgacgtg gacgccaccg aggccgcccc ggtcgccgtg    420

gagcgcacgg ccaccgtgca gcgccagtcc gccgcggacg aggctgccgc cgagcaggcc    480

gctgccgcgg agcaggccgt cgtcgccgag gccgagacca tcgtcgtcaa gtccggtgac    540

tccctctgga cgctcgccaa cgagtacgag gtggagggtg gctggaccgc cctctacgag    600

gccaacaagg gcgccgtctc cgacgccgcc gtgatctacg tcggccagga gctcgtcctg    660

ccgcaggcct ga                                                        672

Claims (3)

1.一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗，其特征在于，以卡介苗作为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含细菌复苏促生长因子基因片段的表达载体；

所述的细菌复苏促生长因子基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.如权利要求1所述的分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗，其特征在于，所述的包含细菌复苏促生长因子基因片段的表达载体是pDE22-Rpf，该表达载体是通过BamHI和HindIII酶切位点将细菌复苏促生长因子基因克隆入分支杆菌表达载体pDE22。

3.权利要求2所述的分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗应用于MTB感染和/或MTB隐性感染的预防免疫疫苗的制备。

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