CN104673821A - 多噬菌体裂解酶基因的共表达体系、构建方法、携载体系的活疫苗、活疫苗的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多噬菌体裂解酶基因的共表达体系、构建方法、携载体系的活疫苗、活疫苗的制备及其应用,是以真核表达质粒为表达载体，将LysinA、LysinB以及Holin基因片段定向插入所述质粒中，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系；以具有巨噬细胞良好靶向性的耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG为活载体，将同时携载三种基因的共表达体系电转化入耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG中，然后通过体外扩增，得到所述重组治疗性结核活疫苗。所述活疫苗在治疗增殖性结核杆菌、休眠性结核杆菌与耐药性结核杆菌引起的活动性结核或潜伏结核感染领域均有良好的效果。

Description

多噬菌体裂解酶基因的共表达体系、构建方法、携载体系的活疫苗、活疫苗的制备及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因，更具体的说涉及多噬菌体裂解酶基因的共表达体系、携载共表达体系的结核活疫苗技术及其应用。

背景技术

全世界三分之一的人口感染了结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)，其中约90％的活动性结核病由潜伏结核感染(latent tuberculosisinfection,LTBI)演变而来。LTBI者体内的Mtb处于潜伏状态，机体不能将其彻底清除；在一定条件下，Mtb可重新复制，发展成活动性结核并产生临床症状，成为新的结核传染源。LTBI与结核病的持留感染、久治不愈、再燃复发、肺外播散、多药耐药等现象的形成密切相关。

目前全球约有20亿人存在Mtb的潜伏感染。我国是结核病疫情高负担国，居世界第二位，国人Mtb感染率约为44.5％。LTBI随时都有可能发展为活动性结核病并成为新的传染源；若同时罹患免疫抑制性疾病，如艾滋病，LTBI发展为活动性结核的机率就更高。

LTBI已成为结核病防治中的巨大障碍。及早治疗LTBI成为控制结核病传播的最有效手段之一。如果能够及时对LTBI患者进行彻底根治，既可以减少其发展成为活动性结核的机会，又能消除潜在的传染源，对结核病的治疗和控制具有非常重要的意义。

然而要对潜伏结核感染进行有效的治疗十分困难。现有的异烟肼、利福平、氟喹诺酮类等常规的抗结核药物都是通过抑制活动性结核杆菌的DNA复制或细胞壁合成等方式起作用，对杀灭处于增殖期的菌体效果明显，但对处于胞内潜伏的非增殖状态的细菌作用甚微，甚至没有效果。目前，随着耐多药和广泛耐药结核株病例在我国的快速上升和传播，导致常规抗结核药物对LTBI的治疗效果更是微乎其微。探索新的可以有效治疗和控制潜伏感染性结核的策略迫在眉睫！

随着致病菌对大多数抗生素产生耐药性问题的出现，人类正在逐渐进入无药可用的“后抗生素”时代。噬菌体对细菌的侵袭具有高度专一性，具有自然裂菌和追踪杀菌的天然性能，且对动植物无明显毒性。噬菌体作为生物制剂以其独特的抗菌优势引起科学家的广泛关注。传染性疾病权威—诺贝尔奖得主Lederberg博士指出：因耐药性细菌的出现，抗生素治疗不再像以前那样有效，应高度重视噬菌体作为抗菌治疗的研究。目前噬菌体全菌治疗体内细菌感染遇到的最大瓶颈，一是较难实现体内靶向性给药；二是其全菌本身具有较强的免疫原性，体内多次应用会产生中和抗体，使噬菌体失去治疗作用。因此，当前噬菌体全菌疗法大多数集中在皮肤和黏膜表面细菌感染的治疗，而不能有效用于体内细菌感染治疗。噬菌体特异裂解杀死宿主菌的本质是依赖特异的噬菌体裂解酶，比起噬菌体全菌治疗，裂解酶体内应用不易产生中和抗体，噬菌体裂解酶作为一种新的生物治疗手段已受到国内外学者的密切关注。作为新型的抗菌药物，噬菌体裂解酶杀菌具有很多优势：

A、杀菌具有高效性：细菌的内部高渗透压(约3～5个大气压)由高度交联的细胞壁支撑，任何对细胞壁完整性的破坏都将导致细菌的胞质溢出和最终低渗裂解。噬菌体裂解酶能通过特异水解细菌细胞壁上糖与肽间的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连接键，裂解细胞壁，从而能高效彻底地杀死细菌。大量实验证明：裂解酶不仅能在体外高效地杀死细菌，体内应用对感染细菌的模型动物也有很好的治疗作用。纯化的10ng裂解酶作用于链球菌5秒钟后，菌量减少10⁷菌落形成单位。除毒性化学药剂外，尚无任何已知的生物制品能够如此快速灭活细菌，彰显出噬菌体裂解酶强大的杀菌作用。

B、杀菌具有高特异性：噬菌体裂解酶与抗生素作用机制不同，抗生素通常是广谱的，而噬菌体裂解酶具有极强的特异性，仅攻击杀死特定种类或特定型的病原体，不影响其它无害或有益的人体寄生菌，也不影响人体细胞。不同噬菌体裂解酶的分子量不同(25kD～40kD)，但都由一个决定催化溶菌活性的催化域和一个决定细胞壁结合位点的细胞壁结合域构成。细胞壁结合域可与宿主细胞壁上的特定基质高效、特异结合，这是噬菌体裂解酶实现高效裂解靶细菌的前提。

C、杀菌不易产生耐受性：研究发现，应用噬菌体裂解酶分别处理固体培养和液体培养的细菌，处理细菌40多代后亦未能诱导产生耐药现象。当前临床常见的耐药细菌对噬菌体裂解酶不起抗药作用，噬菌体裂解酶在许多菌属多药耐药株治疗上的成功报道表明，噬菌体裂解酶具有广阔的临床应用前景。Mtb具有极为特殊的，富含大量脂质的高疏水性细胞壁。共价交联的分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物是Mtb特有的细胞壁组分。MAPc结构对于Mtb的生存与致病性至关重要，是多种抗结核药物作用的分子靶标。

Mtb特异性噬菌体D29是从土壤中分离得到的毒性噬菌体，基因组为含49,136bp的双链DNA(GenBank accession No.AF022214)。体外、体内研究证明：D29对Mtb(包括标准株H37Rv和临床上分离的Mtb)有很强的亲噬性与裂解性，其产生的裂解酶具有治疗结核病的重要潜在价值。对普通G⁺菌而言，仅裂解酶LysinA就能高效裂解肽聚糖破坏细胞壁而杀死细菌。而对于具有特殊细胞壁结构的Mtb而言，噬菌体D29要彻底溶解Mtb细胞壁不仅需要Lys inA裂解肽聚糖，还需要另一种裂解酶LysinB来破坏分枝菌酸与阿拉伯半乳聚糖的连接，才能达到彻底破坏Mtb细胞壁的作用。普通细菌细胞壁破坏后一般就会死亡，但Mtb是一种胞内寄生菌，潜伏感染者体内Mφ(巨噬细胞)中残留的一些细胞壁缺陷型Mtb(cell wall deficient forms,CWD-form or L-form)仍然可能长期存活。Holin是噬菌体编码的另一种裂解因子，靶部位在细菌细胞膜，能特异插入胞质膜形成孔洞杀死细菌。

作为新一代基因治疗载体的要求是应具有良好的安全性、靶向性和廉价性。耻垢分枝杆菌本身是人体的正常菌群，具有很好的巨噬细胞靶向性。耻垢分枝杆菌递送系统不仅能够把目标质粒很好地靶向导入巨噬细胞中，本身还可作为细胞免疫佐剂，有效地对已经感染Mtb的机体进行二次免疫激发，协同治疗性基因来共同杀灭细胞内潜伏的Mtb。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系。

本发明所要解决的第二个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系的构建方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗，对具有特殊细胞壁结构的Mtb、潜伏感染者体内Mφ中残留的一些细胞壁缺陷L型Mtb均具有良好杀灭效果，且对结核感染治疗具有良好的安全性、靶向性和廉价性的优势。

本发明所要解决的第四个技术问题是：提供携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗在治疗增殖性结核杆菌、休眠性结核杆菌与耐药性结核杆菌引起的活动性结核或潜伏结核感染领域的应用。

为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案是：

一种多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，是以真核表达质粒为表达载体，同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系。

作为一种优选的技术方案，所述共表达体系是通过将LysinA、LysinB以及Holin基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的pZM0质粒框架中而获得的。

作为进一步优选的技术方案，所述共表达体系是通过将获得的LysinA基因片段、LysinB-Holin基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的pZM0质粒框架中而获得的。

作为一种改进的技术方案，所述共表达体系是通过将获得的LysinA基因片段、LysinB-link-Holin融合基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的pZM0质粒框架中而获得的。

为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案是：

构建多噬菌体裂解酶基因的共表达体系的方法，包括以下步骤：先用PCR扩增技术分别获得OriM复制子基因片段、LysinA基因片段、LysinB基因片段与Holin基因片段，以pZM0真核表达质粒为框架质粒，将测序正确的分枝杆菌属OriM复制子插入所述框架质粒的NheⅠ酶切位点，获得载体pZM0Y；将测序正确的LysinB-Holin基因片段插入所述框架质粒的HindⅢ和XbaⅠ之间，将测序正确的Lys inA基因片段插入所述框架质粒的NotⅠ和BstBⅠ之间，获得了同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系pZM0A。

作为一种改进，先用PCR扩增技术分别获得OriM复制子基因片段、LysinA基因片段、LysinB基因片段与Holin基因片段，将LysinB与Holin基因片段用疏水甘氨酸接头编码序列拼接获得LysinB-link-Holin融合基因片段，将测序正确的分枝杆菌属OriM复制子插入所述框架质粒的NheⅠ酶切位点，获得载体pZM0Y；将测序正确的LysinB-link-Holin融合基因片段插入所述框架质粒的HindⅢ和XbaⅠ之间，将测序正确的LysinA基因片段插入所述框架质粒的NotⅠ和BstBⅠ之间，获得了同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系pZM0A。

作为一种优选的技术方案，所述pZM0真核表达质粒含有2个多克隆酶切位点区域，两个独立的启动子。

为解决上述第三个技术问题，本发明的技术方案是：

携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗，是以具有巨噬细胞良好靶向性的耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG为活载体，同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系的重组活疫苗。

为解决上述第四个技术问题，本发明的技术方案是：

携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗的制备方法，是以具有巨噬细胞良好靶向性的耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG为活载体，将同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因的共表达体系电转化入耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG中，然后通过体外大量廉价扩增，得到所述重组治疗性结核活疫苗。

pZM0A是在真核启动子控制下的真核表达载体，在原核细胞中不能表达裂解酶，对原核宿主菌—耻垢分枝杆菌本身不产生自溶作用；但由于在pZM0A中引入了分枝杆菌复制子OriM，因此可以在耻垢分枝杆菌里面大量复制pZM0A携载的治疗基因拷贝。本发明将pZM0A电转化入耻垢分枝杆菌中，在体外繁殖耻垢分枝杆菌，从而实现该重组治疗性活疫苗在菌体内的大量廉价扩增。

为解决上述第五个技术问题，本发明的技术方案是：

携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗在治疗增殖性结核杆菌、休眠性结核杆菌与耐药性结核杆菌引起的活动性结核或潜伏结核感染领域的应用。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明以真核表达质粒为表达载体，构建了同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系，并以具有巨噬细胞良好靶向性的耻垢分枝杆菌或带有BCG基因的重组耻垢分枝杆菌为活载体，制备了同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系的重组活疫苗。构建了一种兼具基因治疗与免疫治疗效果的，靶向递送和表达针对Mtb的多靶点特异性裂解酶重组治疗性活疫苗：通过耻垢分枝杆菌、Mtb专嗜性裂解酶等多重靶向机制，实现对Mφ细胞内Mtb的多靶点特异性高效裂解杀灭；同时其杀菌机理与目标Mtb是否是耐多药菌株无关，是否是增殖与休眠状态无关，因此有望解决结核病防治中的胞内潜伏、多药耐药、再燃和复发等棘手问题。用耻垢分枝杆菌作为生物载体，在靶向传递治疗性基因的同时，还能够通过其携带的分枝杆菌属共同抗原，激发机体的抗Mtb保护性免疫，兼具免疫治疗功能。常规噬菌体直接治疗细菌感染的主要障碍在于靶向性差，同时人体会产生噬菌体中和抗体，导致治疗失效；本发明靶向在Mφ细胞内表达Mtb噬菌体裂解功能蛋白，大大减小了其分子量和其与免疫系统的接触，绕开了以上障碍，从而为利用天然噬菌体对众多难治性细菌感染的治疗开辟了一条思路，具有重要的研究价值和科学意义。

本发明治疗性疫苗具有杀菌高效性：联合应用LysinA、LysinB和Holin裂解酶基因，来实现对Mtb的多靶点高效裂解和杀灭。本发明的活疫苗滴鼻给药后，耻垢分枝杆菌在机体内很快被Mφ吞噬裂解并释放出Mtb噬菌体LysinA/LysinB-link-Holin三联裂解酶双独立启动子真核共表达质粒，利用巨噬细胞旺盛的蛋白合成能力，在巨噬细胞胞浆内转录合成三种各自独立靶向Mtb的特异性裂解酶，不仅能够杀灭潜伏感染的有细胞壁Mtb和细胞壁缺陷L型Mtb，还可以高效杀灭增殖型Mtb与耐药型Mtb；与此同时，耻垢分枝杆菌本身还可作为细胞免疫佐剂，发挥免疫治疗作用，激活已经感染Mtb机体的免疫记忆，协同基因治疗来共同杀灭体内感染的Mtb，从而获得对Mtb感染的综合治疗效果。

本发明治疗性疫苗具有良好靶向性：一是耻垢分枝杆菌具有巨噬细胞靶向性：此载体进入机体后，Mφ作为免疫系统的第一道防线，会主动趋化并将其吞噬。另外，分枝杆菌属还拥有多种入侵Mφ细胞的蛋白，如Mce1A蛋白，具有主动侵入Mφ的能力。二是Mtb噬菌体LysinA/LysinB-link-Holin三联裂解酶的靶向性：与抗生素的作用机理不同，裂解酶对Mtb的裂解具有高度的特异性，对其它不敏感细菌和真核细胞无作用。此治疗方法的结合靶位在Mtb的细胞壁和细胞膜上，不存在很难渗透穿过Mtb特殊坚韧的细胞壁的阻碍。

本发明治疗性疫苗具有良好的生物安全性：耻垢分枝杆菌本来就是人体的正常菌群，也是一种细胞免疫佐剂。用它作为基因治疗的生物载体，进入机体后很快被吞噬细胞裂解，释放出内部携带的大量基因治疗质粒。Mφ本身是一种终末细胞，在体内存在几个月后就会通过自然发生程序性死亡等方式崩解，在天然杀菌过程中，被杀灭的外源病菌基因组以及Mφ自身的基因组都会在此历程中断裂崩解。这与肌肉细胞不同，因此基本不必考虑进入的质粒引发耐药、基因整合后诱发癌变、终身存在、难以清除等基因治疗的风险。

本发明治疗性疫苗不易产生耐药性：噬菌体全菌疗法遇到的最大瓶颈一是很难实现靶向性，二是全菌具有较强的免疫原性，体内多次应用会产生中和抗体，使噬菌体失去治疗作用。本治疗性疫苗去芜存菁，由载体靶向携载目的基因在Mφ细胞内表达Mtb噬菌体裂解酶，大大减小了其分子量和其与免疫系统的接触，可以绕开全菌疗法的弊端，从而为利用天然噬菌体对众多难治性细菌感染的治疗开辟了一条蹊径。

本发明的活疫苗可以廉价获得：基因重组活疫苗中携带的Mtb噬菌体LysinA/LysinB-link-Holin治疗性基因，可以预先通过耻垢分枝杆菌活疫苗在体外专用培养基中进行廉价增殖而获得大量的治疗性基因拷贝。

本申请的发明人利用体外细胞层面实验检测该基因重组活疫苗对治疗性基因的递送、表达、对Mφ内Mtb的杀伤效果及对宿主细胞的安全性进行评估。结果显示：本发明所提供的重组活疫苗具有良好的Mφ靶向递送性，活疫苗携载的三种噬菌体裂解酶LysinA、LysinB与Holin都能在巨噬细胞内成功表达，活疫苗能够明显抑制Mtb在巨噬细胞内的增长，同时对宿主细胞无明显的毒副作用。发明人利用建立的小鼠活动性与潜伏结核感染模型，动物实验评价该治疗性活疫苗的治疗作用、安全性评价并分析其相关作用机制。结果显示：本发明提供的重组活疫苗具有明显的体内杀菌效应，能明显抑制活动性结核小鼠体内肺脏内Mtb的增长，能显著抑制潜伏结核感染小鼠体内Mtb的活化，能显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，能显著增加细胞因子IFN-γ，TNF-α的含量，对小鼠无明显毒副作用。也就是说，所述重组活疫苗在治疗Mtb引起的感染的中具有很大用途。

该类活疫苗可以采用滴鼻、喷雾等给药方式，抓住了结核感染病机的关键，还可有效激发机体的黏膜免疫能力，十分廉价方便，因此具有良好的可行性。

总之，本发明构建的重组活疫苗既能安全靶向，又能高效、特异杀灭细胞内Mtb，特别是对如何清除潜伏耐多药Mtb的研究而言，意义重大。对结核患者、LTBI患者进行彻底根治，既可以减少其发展成为活动性结核的机会，又能消除潜在的传染源，对结核病的治疗和控制具有非常重要的科学意义和应用前景；同时也为探索解决其它病原菌的胞内潜伏感染、多药耐药等棘手问题，开创了全新思路；本发明对于新型噬菌体生物制剂应用于胞内感染性疾病的治疗也提供了一个全新的思路和有益探索。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是LysinA、LysinB-link-Holin真核共表达质粒pZM0A构造示意图；

图2是Lysin A、LysinB与Holin的PCR扩增结果电泳图；

图3是Lysin A(A)、LysinB(B)与Holin(C)基因的测序图；

图4是pZM0A的PCR鉴定(A)与双酶切(B)结果电泳图；

图5是抗酸染色(A)与培养菌落计数(B)检测pZM0A对胞内Mtb的杀菌效应；

图6是pZM0A对正常巨噬细胞的影响；

图7是Lysin A、LysinB与Holin三种裂解酶体系裂解Mtb作用模式图；

图8是抗酸染色检测耻垢分枝杆菌的Mφ靶向性；

图9是肺部HE染色(A)与菌落计数(B)检测重组活疫苗对结核的治疗作用；

图10是活疫苗对健康小鼠的影响。

其中图2中，泳道1:LysinA；2:DNA Marker；3:LysinB；4:Holin；

图4中，泳道1:DNA Marker；2:LysinA；3:LysinB；4:Holin；5:pZM0A的双酶切(LysinA)；6:pZM0A的双酶切(LysinB+Holin)；7:DNA Marker

图5中，a:感染对照组；b:pZM0A治疗组；

图9中，a:感染对照组；b:活疫苗治疗组；

图10中，A:生理盐水组健康小鼠肺组织；B:活疫苗组健康小鼠肺组织。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

三种噬菌体裂解酶基因的共表达体系，是以真核表达质粒pZM0为表达载体，通过将LysinA、LysinB以及Holin基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的pZM0质粒框架中，使得重组质粒同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因(pZM0A)。pZM0A的主要框架构造示意图见图1。

实施例2

三种噬菌体裂解酶基因的共表达体系，是以真核表达质粒pZM0为表达载体，通过将LysinA基因片段、LysinB-link-Holin融合基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的pZM0质粒框架中，使得重组质粒同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因(pZM0A)。pZM0A的主要框架构造示意图见图1。

实施例3

构建表达Mtb噬菌体LysinA，LysinB-link-Holin的真核表达载体pZM0A，pZM0A的主要框架构造示意图(图1)：

按病毒基因组DNA抽提试剂盒(采用大连TaKaRa公司生产的试剂盒)的说明书提取D29噬菌体基因组DNA。根据GenBank登录的D29噬菌体LysinA、LysinB与Holin编码序列设计上游引物、下游引物，由大连TaKaRa公司合成。

LysinA上游：5'-CATCCATGGGCGGCCGCATGACGCTCATAGTCACAC-3'

LysinA下游：5'-GATCTCGAGTTCGAATCATAGGGCTCCATTC-3'

LysinB上游：5'-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3'

LysinB下游：5'-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3'

Holin上游：5'-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3'

Holin下游：5'-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3'

OriM上游：5’-GGGATCCGATATCATGGCCGAGGACCAGC-3’

OriM下游：5’-GCGGCCGC AAGCTTCTACGCGGCCGAGGT-3’

以D29噬菌体基因组DNA为模板，先用PCR扩增技术分别获得OriM复制子基因片段、LysinA基因片段、LysinB基因片段与Holin基因片段，将LysinB与Holin基因片段用疏水甘氨酸接头编码序列拼接获得LysinB-link-Holin融合基因片段。将测序正确的分枝杆菌属OriM复制子插入真核表达质粒pZM0的NheⅠ酶切位点，获得载体pZM0Y；将测序正确的LysinB-link-Holin融合基因片段插入载体pZM0Y的HindⅢ和XbaⅠ之间，PCR技术、双酶切与测序鉴定；将测序正确的LysinA基因片段插入载体的NotⅠ和BstBⅠ之间，获得了同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系pZM0A，双酶切与测序鉴定pZM0A是否构建成功。

所述pZM0真核表达质粒含有2个多克隆酶切位点区域，两个独立的启动子。

结果：应用PCR技术成功扩增出了LysinA、LysinB与Holin基因片段(图2)，测序正确(图3)；成功扩增出了OriM复制子基因片段；PCR鉴定(图4A)双酶切鉴定(图4B)结果表明pZM0A构建成功。

结论：成功构建了携带分枝杆菌复制子OriM的真核共表达载体pZM0A。

实施例4

构建表达Mtb噬菌体LysinA，LysinB-link-Holin的真核表达载体pZM0A，pZM0A的主要框架构造示意图(图1)：

按病毒基因组DNA抽提试剂盒(采用大连TaKaRa公司生产的试剂盒)的说明书提取D29噬菌体基因组DNA。根据GenBank登录的D29噬菌体LysinA、LysinB与Holin编码序列设计上游引物、下游引物，由大连TaKaRa公司合成。

LysinA上游：5'-CATCCATGGGCGGCCGCATGACGCTCATAGTCACAC-3'

LysinA下游：5'-GATCTCGAGTTCGAATCATAGGGCTCCATTC-3'

LysinB上游：5'-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3'

LysinB下游：5'-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3'

Holin上游：5'-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3'

Holin下游：5'-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3'

OriM上游：5’-GGGATCCGATATCATGGCCGAGGACCAGC-3’

OriM下游：5’-GCGGCCGC AAGCTTCTACGCGGCCGAGGT-3’

以D29噬菌体基因组DNA为模板进行PCR反应获取LysinA、LysinB与Holin基因片段。PCR产物回收三种基因片段后用重组PCR方法，以link序列连接测序正确的LysinB和Holin，将获得的LysinB-link-Holin融合基因片段连接入真核表达质粒pZM0(含有2个多克隆酶切位点区域，两个独立的启动子)中产生pZM0-1，PCR技术、双酶切与测序鉴定；将获得的LysinA基因片段连接入真核表达质粒pZM0-1中产生pZM0-2，PCR技术、双酶切与测序鉴定；以Mtb基因组为模板，用PCR扩增技术获得OriM复制子基因片段，将测序正确的OriM复制子基因片段插入pZM0-2质粒的NheⅠ酶切位点中，获得载体pZM0A，双酶切与测序鉴定pZM0A是否构建成功。

结果：应用PCR技术成功扩增出了LysinA、LysinB与Holin基因片段(图2)，测序正确(图3)；成功扩增出了OriM复制子基因片段；PCR鉴定(图4A)双酶切鉴定(图4B)结果表明pZM0A构建成功。

结论：成功构建了携带分枝杆菌复制子OriM的真核共表达载体pZM0A。

实施例5

实施例4得到的pZM0A在巨噬细胞内的表达及杀菌活性的鉴定

用脂质体将pZM0A分别导入培养的巨噬细胞中，荧光显微镜观测转染效率，RT-PCR等方法分别检测LysinA、LysinB与Holin的表达；抗酸染色观察pZM0A对Mφ内Mtb的杀菌情况，裂解细胞并作细菌培养计数；Hoechst染色观察pZM0A对巨噬细胞的影响，同时电镜观察有无超微结构的改变，包括线粒体、细胞核、内质网、高尔基体等的变化状态。

结果：用脂质体将pZM0A导入培养的小鼠巨噬细胞株RAW264.7中检测转染效率，达到了75％以上；检测到了LysinA、LysinB和Holin基因在细胞内的表达；pZM0A对胞内感染Mtb具有明显的杀菌效应(图5A，图5B)；Hoechst染色(图6A)与电镜观察(图6B)结果显示pZM0A对正常巨噬细胞无明显毒副作用，杀菌机制示意图见图7。

结论：Lysin A、Lysin B与Holin能在小鼠巨噬细胞内表达且具有明显的杀菌效应，同时对细胞无明显毒副作用。

实施例6

活疫苗对结核感染小鼠的治疗作用

将培养的耻垢分枝杆菌洗涤、计数后加入到Mφ中，观察耻垢分枝杆菌的Mφ靶向性；将质粒pZM0A电转化入耻垢分枝杆菌中，筛选获得Zeocin抗性的重组菌，大量培养扩增该重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗。

动物建模：选用潜伏感染与活动性结核感染小鼠模型，分为两组，治疗组和感染对照组；

动物实验评价该重组治疗性活疫苗的治疗作用：使用培养扩增得到的组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗：只对治疗组的小鼠滴鼻给药(5×10⁶CFU，0.1ml/次)，每周一次，共治疗四周；感染对照组不给药。

治疗与整体治疗效果检测：

各实验组分别于第一次治疗后第5个月处死，作如下处理：无菌条件下取左肺及部分脾组织精确称量，研磨、倍比稀释后接种于改良罗-琴氏培养基平板，37℃培养6周后菌落计数；病理学效果：肺组织4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色观察；PPD特异性脾淋巴细胞增殖实验(MTT法)；ELISA法定量检测PPD刺激后，小鼠脾淋巴细胞分泌到培养上清及小鼠血中细胞因子含量。

结果：耻垢分枝杆菌具有明显的Mφ靶向性(图8)；肺部HE染色(图9A)与菌落计数(图9B)显示重组耻垢分枝杆菌活疫苗治疗组比感染对照组的肺部荷菌量明显降低；MTT法结果显示治疗组比感染组具有较高的脾淋巴细胞增殖活性，细胞培养上清与血清中的细胞因子INF-γ、TNF-α含量明显上升；重组活疫苗对小鼠无明显毒副作用(图10)。

结论：重组耻垢分枝杆菌活疫苗具有良好的结核治疗作用，且对机体无明显毒副作用。

本发明不局限于上述具体实施方式，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于：以真核表达质粒为表达载体，同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系。

2.如权利要求1所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于：所述共表达体系是通过将LysinA、LysinB以及Holin基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的质粒框架中而获得的。

3.如权利要求1所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于：所述共表达体系是通过将获得的LysinA基因片段、LysinB-Holin基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的质粒框架中而获得的。

4.如权利要求3所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于：所述共表达体系是通过将获得的LysinA基因片段、LysinB-link-Holin融合基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的质粒框架中而获得的。

5.构建如权利要求1所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系的方法，其特征在于：先用PCR扩增技术分别获得OriM复制子基因片段、LysinA基因片段、LysinB基因片段与Holin基因片段，以真核表达质粒为框架质粒，将测序正确的分枝杆菌属OriM复制子插入所述框架质粒的Nhe I酶切位点，将测序正确的LysinB-Holin基因片段插入所述框架质粒的Hind Ⅲ和Xba Ⅰ之间，将测序正确的LysinA基因片段插入所述框架质粒的Not Ⅰ和BstB Ⅰ之间，获得了同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系。

6.如权利要求5所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系的构建方法，其特征在于：先用PCR扩增技术分别获得OriM复制子基因片段、LysinA基因片段、LysinB基因片段与Holin基因片段，将LysinB与Holin基因片段用疏水甘氨酸接头编码序列拼接获得LysinB-link-Holin融合基因片段，将测序正确的分枝杆菌属OriM复制子插入所述框架质粒的Nhe Ⅰ酶切位点，将测序正确的LysinB-link-Holin融合基因片段插入所述框架质粒的Hind Ⅲ和Xba Ⅰ之间，将测序正确的LysinA基因片段插入所述框架质粒的Not Ⅰ和BstB Ⅰ之间，获得了同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系。

7.如权利要求5或者6所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系的构建方法，其特征在于：所述真核表达质粒含有2个多克隆酶切位点区域，两个独立的启动子。

8.携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗，其特征在于：以具有巨噬细胞良好靶向性的耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG为活载体，携载如权利要求1所述的表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系的重组活疫苗。

9.制备如权利要求8所述的携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗的方法，其特征在于：以具有巨噬细胞良好靶向性的耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG为活载体，将同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因的共表达体系电转化入耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG活载体中，然后通过体外扩增，得到所述重组治疗性结核活疫苗。

10.如权利要求8所述的携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗在治疗增殖性结核杆菌、休眠性结核杆菌与耐药性结核杆菌引起的活动性结核或潜伏结核感染领域的应用。