CN105601753A - 结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白及其制备方法和应用,是通过设计引物对噬菌体的溶菌蛋白1和溶菌蛋白2进行PCR扩增，并将扩增出来的序列通过linker进行连接，然后连接入原核表达质粒，转化到原核表达载体并在体外诱导进行表达，通过鉴定并纯化就得到目的蛋白。该融合溶菌蛋白能够对结核分枝杆菌进行多靶点高效杀灭，具有良好的靶向性、杀菌高效性、生物安全性、可大规模生产且生产成本低廉等优点。

Description

结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

大量结核感染病例的存在和常规药物对结核感染进行治疗面临着很大困境。尤其是耐药结核分枝杆菌特别是多重耐药菌的出现对人类健康构成了极大威胁，这类耐药细菌导致的结核面临无药可用的境地，已成为结核病防治的巨大障碍。如何有效地根治结核感染特别是耐药结核感染已经成为当前许多国家结核病防治工作面对的难题。寻找新的有效的抗结核分枝杆菌制剂已经成为刻不容缓的问题。

噬菌体制剂作为新型的治疗方法，受到越来越广泛的关注。噬菌体具有高度专一的宿主选择性，噬菌体杀灭宿主菌具有高度特异性，不会影响其他菌群，不会破坏体内微生态的平衡，也不引起胃肠道反应、过敏反应等。实验证明噬菌体治疗细菌感染具有很高的有效性和安全性。噬菌体治疗细菌感染具有许多优势，尤其是耐药菌的感染。例如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的治疗是临床上面临的棘手的问题，Capparelli等人利用噬菌体来控制MRSA的感染，取得了良好的效果，研究结果显示MRSA噬菌体在体内和体外都可以杀灭巨噬细胞内部的MRSA。

目前噬菌体全菌治疗体内细菌感染遇到的最大瓶颈，一是较难实现体内靶向性给药；二是机体免疫系统对噬菌体的清除也是噬菌体治疗中必须解决的一个重要问题。此外机体免疫系统产生针对噬菌体的中和抗体，引起噬菌体失活，为了避免出现这一情况，需要找到降低噬菌体免疫原性的方法。

噬菌体对宿主菌的溶解是由噬菌体自身溶菌蛋白介导的溶解系统完成的。溶菌蛋白是一类细胞壁裂解酶类，它与细菌细胞壁的糖基特异性结合，发挥作用；而这种细胞壁糖基具有种属特异性。为了克服活性噬菌体制剂的局限性，人们探索了提纯噬菌体的特异性溶菌蛋白作为抗菌制剂治疗细菌感染。例如研究表明，纯化的噬菌体溶菌蛋白Cpl-1在肺炎链球菌引起的心内膜炎和细菌性脑膜炎的试验中，显示出了良好的抗菌活性。噬菌体编码的溶菌蛋白不仅能高效的杀灭耐药葡萄球菌属细菌引起的感染菌而且在体内无残留。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术存在的较难实现体内靶向性给药和产生噬菌体免疫原性最终会导致噬菌体失活的不足，提供一种具有靶向杀灭结核分枝杆菌的来源于噬菌体的融合双组份溶菌蛋白。

本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是：提供一种结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白在制备治疗结核分枝杆菌感染的药物中的用途。

为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案是：将两段编码噬菌体溶菌蛋白的基因序列在噬菌体溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物作用下经过扩增、连接、构建载体、转化、表达、纯化后制得结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白。所述噬菌体溶菌蛋白1引物为包含以下序列的引物：

溶菌蛋白1LB上游：

5’-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3’

溶菌蛋白1LB下游：

5’-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3’

所述噬菌体溶菌蛋白2引物为包含以下序列的引物：

溶菌蛋白2HN上游：

5’-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3’

溶菌蛋白2HN下游：

5’-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3’

优选的，所述噬菌体溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物为：

溶菌蛋白1LB上游：

5’-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3’

溶菌蛋白1LB下游：

5’-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3’

溶菌蛋白2HN上游：

5’-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3’

溶菌蛋白2HN下游：

5’-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3’

为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案是：

a.设计引物(如上所述引物)对噬菌体的溶菌蛋白1(命名为LB)和溶菌蛋白2(命名为HN)进行PCR扩增；

b.使用linker将两段序列连接获得连接基因；

c.将连接基因连接入原核表达质粒构建成重组质粒，并进行鉴定；

d.将重组质粒转化到原核表达载体，并在体外诱导进行融合双组份溶菌蛋白表达；

e.对表达后的蛋白进行鉴定并纯化表达出的蛋白，得到目的蛋白；

f.将获得的融合双组份溶菌蛋白进行杀菌实验研究。

优选的，所述的噬菌体为D29噬菌体；

优选的，所述原核表达质粒为pET32a；

优选的，所述的原核表达载体为E.coliBL21。

为解决上述第三个技术问题，本发明的技术方案是：该结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白在制备治疗结核分枝杆菌感染的药物中的用途。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：1)具有杀菌高效性：联合应用双组份溶菌蛋白，来实现对结核分枝杆菌的多靶点高效杀灭。2)具有良好靶向性：结合靶位在结核分枝杆菌的细胞壁和细胞膜上，不存在很难渗透穿过结核分枝杆菌特殊坚韧的细胞壁的阻碍，具有明显的杀灭结核分枝杆菌的效应，而对真核细胞与其他细菌无明显毒副作用。3)具有良好的生物安全性：解决了全噬菌体具有较强的免疫原性的问题。4)廉价获得：可在体外大量表达进行纯化。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1融合LB-linker-HN的PCR扩增结果(A)与重组载体酶切鉴定结果(B)；

图2LB-linker-HN重组蛋白的表达；

图3LB-linker-HN的纯化及Westernblot鉴定；

其中，图1：泳道1:LB-linker-HN的PCR结果；

泳道2:pET32a-(LB-linker-HN)酶切鉴定；

泳道M:DNAMarker

图2：泳道M1:蛋白质Marker；

泳道2:空菌诱导；

泳道3:重组菌诱导

泳道4:重组菌诱导

图3：泳道M1:蛋白质Marker；

泳道1:纯化蛋白质；

泳道2:空菌；

泳道3:重组蛋白

具体实施方式

下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：原核表达载体pET32a-(LB-linker-HN)的构建：

按病毒基因组DNA抽提试剂盒(大连TaKaRa公司)的说明书提取D29噬菌体基因组DNA。根据GenBank登录的D29噬菌体溶菌蛋白1(命名为LB)与溶菌蛋白2(命名为HN)编码序列设计上游引物、下游引物，由北京三博远志生物技术有限公司合成。

LB上游：

5’-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3’

LB下游：

5’-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3’

HN上游：

5’-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3’

HN下游：

5’-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3’

以D29噬菌体基因组DNA为模板进行PCR反应获取溶菌蛋白LB与HN的全长基因。用重组PCR方法，以linker序列连接测序正确的LB与和HN，将获得的LB-linker-HN基因连接入原核表达质粒pET32a中产生pET32a-(LB-linker-HN)，PCR技术、双酶切与测序鉴定pET32a-(LB-linker-HN)是否构建成功。

结果：应用重组PCR技术成功扩增出了LB与HN的融合基因片段(图1A)；构建的pET32a-(LB-linker-HN)载体经双酶切鉴定完全正确(图1B)；双向测序结果表明扩增出的LB基因与HN基因序列完全正确(具体序列见序列表第1部分)。

结论：成功构建了原核表达载体pET32a-(LB-linker-HN)。

实施例2：重组质粒pET32a-(LB-linker-HN)在E.coliBL21中的表达、纯化及鉴定：

重组质粒pET32a-(LB-linker-HN)转化E.coliBL21，制备E.coliBL21的感受态细菌，用1μl重组质粒转化该感受态细菌。接种于含2ml含青霉素钠的LB液体培养基中过夜，将过夜培养物以1:100接种于50ml含青霉素钠的LB液体培养基中，37℃震荡培养3h，到吸光度值约0.8取出5ml未诱导的菌备用，其余加入IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达，继续诱导培养4h。取5ml菌液菌体，5000rpm、4℃离心10min收集菌体。以100μl1×蛋白上样buffer重悬，煮沸5min，离心留取上清进行SDS-PAGE分析。电泳完毕后取出凝胶，以考马斯亮蓝R250染液染色1-2h，然后以脱色液平缓摇动脱色过夜，观察蛋白条带，采集图像，用图像分析软件分析其表达量。经可溶性分析，证实LB-linker-HN在E.coliBL21表达主要在上清中存在。采用含有Ni螯合剂的Ni-NTAHis纯化试剂盒，以亲和色谱纯化目的蛋白LB-linker-HN。将LB-linker-HN蛋白进行SDS-PAGE后，200mA恒流电转3h，转至PVDF膜上，用20g/L牛血清白蛋白在室温封闭2h，加入1:1000稀释的抗His单克隆抗体，室温结合1h，4℃封闭过夜，PBST摇床振荡洗涤3次，每次10min，与HRP标记的羊抗鼠IgG抗体结合2h，PBST摇床振荡洗涤3次，加入DAB显色液显色并观察结果。将纯化蛋白进行凝血酶切割，进行测序。

结果：LB-linker-HN的融合重组蛋白理论Mr约为45kD，与3-4泳道显示的表达条带相符，表达量约30％(图2)。纯化LB-linker-HN蛋白质经SDS-PAGE分析纯度达到95％以上。纯化后的蛋白用Bradford法进行定量，蛋白浓度为0.2mg/ml。使用His单克隆抗体进行Westernblot检测，结果证实表达条带为His标签的LB-linker-HN重组蛋白(图3)。经测序LB-linker-HN的氨基酸序列完全正确(见序列表第2部分)。

结论：获得了融合溶菌蛋白LB-linker-HN。

实施例3：融合溶菌蛋白LB-linker-HN的体外杀菌效应：

将LB-linker-HN融合蛋白分别与结核分枝杆菌、大肠埃希菌共孵育后，进行细菌培养，检测LB-linker-HN杀灭结核分枝杆菌的效应及特异性；同时将无菌LB-linker-HN加入到培养巨噬细胞的培养液中，检测LB-linker-HN蛋白对细胞的可能毒副作用。

结果：LB-linker-HN对结核分枝杆菌具有明显的杀菌效应；且对大肠埃希菌与巨噬细胞无明显毒副作用。

结论：LB-linker-HN具有治疗结核分枝感染的潜在用途。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白，其特征在于：该融合溶菌蛋白具有噬菌体双组份溶菌蛋白的氨基酸序列，是由两段编码噬菌体溶菌蛋白的基因序列在噬菌体溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物作用下经过扩增、连接、构建载体、转化、表达、纯化后制得。

2.如权利要求1所述的结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白，其特征在于：所述噬菌体溶菌蛋白1引物为包含以下序列的引物：

溶菌蛋白1LB上游：

5’-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3’

溶菌蛋白1LB下游：

5’-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3’

所述噬菌体溶菌蛋白2引物为包含以下序列的引物：

溶菌蛋白2HN上游：

5’-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3’

溶菌蛋白2HN下游：

5’-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3’。

3.如权利要求2所述的结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白，其特征在于：所述噬菌体溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物为：

溶菌蛋白1LB上游：

5’-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3’

溶菌蛋白1LB下游：

5’-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3’

溶菌蛋白2HN上游：

5’-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3’

溶菌蛋白2HN下游：

5’-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3’。

4.如权利要求1所述的结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白的制备方法，其特征在于：a设计如权利要求3所述引物对噬菌体溶菌蛋白1和溶菌蛋白2进行PCR扩增；

b用重组PCR方法，使用linker将两段序列连接获得连接基因；

c将连接基因连接入原核表达质粒构建成重组质粒；

d将重组质粒转化到原核表达载体进行表达；

e纯化表达出的蛋白，得到目的蛋白。

5.如权利要求4所述的结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述的噬菌体为D29噬菌体。

6.如权利要求5所述的结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述的原核表达质粒为pET32a。

7.如权利要求6所述的结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白的制备方法，其特征在于：所述的原核表达载体为E.coliBL21。

8.如权利要求1所述的结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白在制备治疗结核分枝杆菌感染的药物中的用途。