CN101595219A - 作为编码抗原和蛋白毒素的核苷酸序列的载体的微生物，其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为编码抗原和蛋白毒素的核苷酸序列的载体的微生物，其包含下列组分：(I)编码至少一个野生型或突变的蛋白的至少一个完整或部分抗原的至少一个核苷酸序列；和(II)编码至少一个蛋白毒素和/或至少一个蛋白毒素亚基的至少一个核苷酸序列；和(III)a)编码至少一个转运系统的至少一个核苷酸序列，所述的转运系统使得能够在微生物的外表面上表达组分(I)和组分(II)的表达产物和/或使得能够分泌组分(I)和组分(II)的表达产物；和/或编码使得能够分泌组分(I)和组分(II)的表达产物的至少一个信号序列的至少一个核苷酸序列；和/或(III)b)任选地，编码用于裂解哺乳动物细胞的胞质溶胶中的微生物且用于细胞内释放包含在裂解的微生物中的质粒或表达载体的至少一个蛋白的至少一个核苷酸序列；和(IV)用于表达组分(I)至(III)的一个或多个的至少一个活化序列的至少一个核苷酸序列，其中所述的活化序列能够在微生物中活化和/或是组织细胞特异性的，肿瘤细胞特异性的，巨噬细胞特异性的，树突特异性的，淋巴细胞特异性的，功能特异性的或非细胞特异性的；其中组分(I)至(IV)的任何一个能够以一倍或几倍存在并且可以是相同的或不同的。还公开了其制备方法，相应的质粒或表达载体以及该微生物用作药物的用途。

Description

作为编码抗原和蛋白毒素的核苷酸序列的载体的微生物，其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及作为编码抗原和蛋白毒素的异种核苷酸序列的载体的微生物，其制备方法及相应的质粒或表达载体。这些微生物可以用作药物，特别是用作用于治疗各种肿瘤的肿瘤疫苗。
现有技术
癌症的免疫治疗代表肿瘤治疗的一种有希望的选择。使用不同方法的大量临床试验专注于其在患者中的功效。原则上，区别在于被动免疫治疗和主动免疫治疗。
主动免疫治疗旨在诱导疫苗相关的肿瘤特异性免疫应答。目前，临床上使用几种不同的方法探查后者。例如，所谓的全细胞疫苗，其原料为直接获自患者(自体)的或源自适当的细胞系(异源)的肿瘤细胞。通常，这些细胞进行灭活，特别处理并且(再)应用于患者。
相反，抗原特异性疫苗包含一种(或多种)肿瘤特异性抗原，抗原的部分或特异性抗原编码DNA以及所谓的抗独特型疫苗。通常，这些疫苗不是单独地，而是与适当的载体组合在一起注射。因此，一方面使用不同的传统佐剂，但也与生物学免疫刺激剂例如细胞因子组合。
为了免疫刺激的目的，使用这样的方法，其包含与免疫刺激剂(例如破伤风毒素)联合的抗原。此外，存在将抗原与树突细胞组合使用的尝试。并且最后，存在几种使用具有病毒或细菌载体的重组活疫苗的尝试。
细菌毒素(例如破伤风毒素，志贺菌毒素，致死毒素或霍乱毒素)的融合蛋白，作为佐剂和抗原一起用作疫苗，尤其是在相当一段时间抗感染的疫苗(Freytag和Clements，1999)。另外，还使用通常与靶细胞特异性分子(例如肿瘤细胞的细胞表面分子)融合的天然毒素以破坏靶细胞。
这里，通常包含酶单元和蛋白结合结构域的与天然毒素的融合蛋白在用作佐剂方面表现出它们的最佳效果(Freytag和Clements，1999)。借助这些疫苗，在粘膜免疫后和特别是在口服免疫后获得令人满意的免疫应答。使用这些融合蛋白的问题是天然毒素是高毒的并且因此不能用于人体中(Holmgren等，2005)。
因此，一连串的研究关注于毒素的脱毒(detoxification)同时保持佐剂功效。然而，在大多数情况下，佐剂功效与酶活性一致，而酶活性是形成毒性作用的原因(Lycke等，1992)，因此不能以直接的方式进行脱毒，即使对于某些毒素而言，不丧失其酶促、佐剂活性似乎是可能的(Hormozi等，1999；Lycke等，1992)。
在霍乱毒素(CT)的情况下进行了脱毒的一些尝试(Agren等，1999；Byun等，2001；Eriksson等，2004；Kweon等，2002；Sanchez等，2002)，对于其，作为粘膜佐剂的用途仍然奏效(Freytag和Clements)。因此，首先，抗体应答(主要是粘膜IgA)的有效诱导(其受到增加的毒素相关的MHC II类限制性T细胞支持)对于由蛋白-抗原和融合的或共施用(co-applied)的毒素组成的疫苗的粘膜佐剂来说是主要的先决条件(Freytag和Clements)。
就霍乱毒素来说，特别地测试其B亚基(CtxB)作为佐剂，因为它负责与GM-1受体结合并且当单独时，不表现毒性作用(Holmgren等)。与CtxB的蛋白融合的特征在于主要诱导所谓的Th2免疫应答。这些是T细胞应答，其主要的特征在于细胞因子，例如IL-4或IL-6，并且其主要导致抗体的诱导，但是其一点也不或最大程度地不限制启动细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞(CTL)的细胞免疫应答(Holmgren等)。
另外，作为粘膜佐剂的CtxB诱导蛋白-抗原全身性耐受。全身性耐受形容抗原特异性淋巴细胞(特别是T细胞或B细胞)的耗尽或灭活。因此，这类方法不适用于全身性免疫应答的诱导(Holmgren等)。
和粘膜施用对比，腹膜内或皮下施用毒素-抗原融合蛋白能诱导全身性且低细胞毒性的应答。其已经用于模型系统中的肿瘤疫苗接种(参考例如(Becerra等人，2003))。然而，此类应答还可用经纯化的抗原本身获得并且主要依赖于所用的佐剂。除了模型中测量的CTL应答相当低的事实以外，没有证据表明保护也依赖于这些功效。而且，抗原不口服施用，而只通过抗原的直接注射(s.c.，i.d.，i.m.，i.p.)来施用。
与脱毒毒素融合的抗原蛋白如果作为口服肿瘤疫苗施用通常是无效的。主要原因是，如果真的存在，仅全身性免疫应答的低诱导或在CtxB的情况下，全身性耐受的诱导以及粘膜限制性(restricted)抗体和Th2型免疫应答的诱导。
例如McSorley等人表明使用CtxB-抗原融合蛋白的鼻免疫(对肿瘤疫苗而言，其代表诱导全身性应答的优选方法)优选耐受并且因此灭活Th1细胞，而Th2细胞不受影响(McSorley等人，1998)。Th2应答特征在于主要产生IL-4或IL-6的T辅助细胞。这些细胞因子特别负责起始B细胞产生抗体，在大多数常规的疫苗的情况下，这提供了保护。相反，Th1T细胞通常分泌IL-2和IFN-γ，因此细胞因子，其在细胞免疫应答中起作用。取决于免疫策略的目标，是发起抗体为主的Th2免疫应答(所谓的Th2免疫偏离)还是发起细胞为主的Th1应答(所谓的Th1免疫偏离)是至关重要的。
相比之下，用产生IFN-γ的T辅助细胞全身性诱导Th1为主的细胞免疫应答和诱导细胞毒性T细胞(CTL)对肿瘤免疫治疗来说是必不可少的。
现有技术表明毒素能用作佐剂。尤其是霍乱毒素(CT)表现出很强的佐剂作用。然而，该毒素一脱毒这个作用就显著地削弱。关于它的亚基CtxB，口服施用甚至诱导全身性耐受。这个问题能够通过经鼻施用部分地消除。然而，如果采用经鼻施用，则产生其他问题，特别地，例如与脑中的GM-1受体的表达有关的CtxB亚基相关的问题(vanGinkel等人，2000)，其表现为增加的特别严重的副作用的风险(Mutsch等人，2004)。
为了克服这些问题，可以产生共表达毒素和(异源)抗原的重组的活疫苗。就感染疫苗(即抗特异性病原体例如结核病原体并且意欲诱导抗该病原体的免疫的疫苗)而言，这一选择已经被采用。
在开发此类感染疫苗的过程中，已经通过使用几种重组细菌菌株产生与适当的(异源)抗原融合的重组毒素，所述菌株作为活的或灭活的疫苗口服施用。在大多数情况下，产生的细菌只表达重组毒素。因此，这些方法主要目的在于抗毒素自身的单独免疫(抗体应答的诱导)从而抗表达毒素的菌株(病原体)的单独免疫。这类疫苗不适于用作肿瘤治疗中的潜在的肿瘤疫苗并且不令人惊讶地，相应的试验未提及任何此类可能的应用(Reveneau等人，2002)(Vertiev等人，2001)(Freytag和Clements，1999；Jackson等人，1996)。
关于此类感染疫苗，在抗体应答诱导期间，毒素不作为佐剂起作用，而是诱导粘膜抗体免疫应答。这些感染疫苗试验不包括全身性免疫应答或只有非常弱的全身性免疫应答。和肿瘤疫苗形成对比，此类疫苗不诱导细胞免疫应答，尤其是细胞毒性T细胞的细胞免疫应答。表达毒素的细菌病原体通常表现出细胞外活性模式并因此不促进CTL的活化，即通过此类感染疫苗赋予的保护是不依赖于CTL的。
下列细菌菌株已用于提及的感染疫苗试验：重组乳酸杆菌(Lactobacilli)(Reveneau等，2002)，利斯特氏菌(Listeria)(Vertiev等，2001)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(Mendelson等，2005；Mesnage等，1999)，志贺氏菌(Shigellae)(Anderson等，2000；Tzschaschel等，1996b)，大肠杆菌(E.coli)(Walker等，1992)，弧菌(Vibrio)(Butterton等，1995；Chen等，1998；Thungapathra等，1999)和沙门氏菌(Salmonella)(Jackson等，1996)。
另外，尝试通过表面呈递(Konieczny等，2000)或分泌毒素作为异源抗原(沙门氏菌，志贺氏菌：(Garmory等，2003；Orr等，1999；Su等，1992；Tzschaschel等，1996a；Tzschaschel等，1996b)，耶尔森氏菌(Yersinia)：(Sory和Cornelis，1990)，弧菌(Ryan等，1997a)，大肠杆菌(Zhu等，2006))增强粘膜免疫应答。然而，在这些另外的实例中，毒素自身代表免疫应答针对的抗原。
因此，应当注意毒素既不作为佐剂起作用，所描述的研究也不意欲表达与另外的分离的(异源)抗原一起作为融合蛋白的毒素。此外，与CT或CtxB的融合蛋白既不用这些系统产生也没有被暗示。
因而，上面引用的文献中提及的融合蛋白是肽分泌信号(例如HlyA)和毒素蛋白的融合蛋白，而非由毒素和(异源)抗原组成的融合蛋白。
这些研究的主要目的仅仅是为了获得最优化的粘膜免疫应答(Tzschaschel等，1996a)。没有进行全身性免疫应答的诱导。如果进行了测量，则全身性免疫应答的分析仅限于抗体(特别是全身性IgA)，因为在这些种类的模型中保护主要由抗体介导(比较，例如[31])。未描述全身性细胞免疫应答的诱导，特别是细胞毒性T细胞应答的诱导。主要使用与分泌信号的融合以分别增加毒素的可溶性并增强它们的稳定性，因为强的，仅仅细胞质的表达通常导致不溶性聚集体的产生(Gentschev等，2002a)。
在这方面，一些作者观察到与分泌信号的融合蛋白引起快速的细胞质降解(Tzschaschel等，1996a)，然而其他人观察到稳定性(Orr等，1999)。因此，现有技术在这点上相互矛盾。到目前为止，关于分泌性毒素(毒素+分泌信号)的之前的实验首先旨在增加稳定性，其显然未在所有实例中实现。
在可变的表达强度和质粒稳定性方面确实发现了一个原因。Tzschaschel等人描述，所用的质粒系统是高度不稳定的并且首先，不经筛选，其仅在少数细菌中发现。作者用经由微转座子的染色体整合作为可能的解决方案(Tzschaschel等，1996a；Tzschaschel等，1996b)。
然而，此类系统具有几个缺点。一方面整合位点是不确定的，其能够导致宿主菌的不期望的表型改变(例如侧翼基因的增加的/减少的表达)。另一方面，使用单基因拷贝的期望的表达水平低，其对免疫原性具有负面影响。最后，染色体转座子整合相对不稳定，因为它导致在重复元件两侧非常频繁地自发切除。
如上所述，现有技术在分泌性异源毒素的稳定性方面相互矛盾。
Garmory等人甚至认为异源抗原的分泌对于抗原性不具有任何特别的益处(Garmory等，2002；Roland等，2005)。在其他的实例中，确实观察到静脉施用后对分泌性毒素的全身性抗体应答增加，然而在口服施用后没有观察到这一结果。完全相反地，口服施用还被间接质疑(Roland等，2005)。
最后，对产生破伤风毒素的革兰氏阳性菌(植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))的研究表明与分泌毒素的细菌，表达结合于其细胞膜的毒素的细菌或在细胞质包含毒素的细菌相比，在全身性抗体应答的诱导方面没有显著的差别(Reveneau等，2002)。
全身性细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答，和所产生的保护未被研究或描述。
因此，上面引用的基于毒素的感染疫苗的现有技术不能表明用作佐剂的毒素的分泌对于全身性(细胞)免疫应答的诱导是否具有优势。完全相反地，上面引用的研究指出了稳定性问题并且指出分泌性异源毒素的缺乏的优势。由分泌信号，毒素和异源抗原组成的融合蛋白完全没有被描述或提示。
上文给出的现有技术描述了异源表达毒素并且能够用作感染疫苗的细菌载体。在引用的实例中，主要对毒素的表达或稳定性和它们的可溶性进行修饰，例如插入强表达启动子或将毒素与分泌信号融合。
其他作者还研究了活疫苗中毒素与异源抗原的基因融合。在这些实例中，毒素主要用作佐剂。在一些例子中(例如(Brossier等，2000))异源抗原作为佐剂起作用而毒素作为真正的抗原起作用。
然而，应当指出，在提及的实例中，毒素-抗原基因融合构建体的表达完全在细胞质或周质发生。毒素-抗原构建体既不与另外的分泌信号(其可以导致它的完全分泌)融合，也不直接分泌。
在这些毒素-抗原基因融合构建体构建期间，使用重组大肠杆菌(Clemens等，2004)，炭疽芽孢杆菌(Brossier等，2000)，志贺氏菌(Koprowski等，2000；Ranallo等，2005；Zheng等，2005)和弧菌菌株(Silva等，2003)。对于沙门氏菌(概述于(Garmory等，2002))，CT变体与抗原的融合(Hajishengallis等，1996；Huang等，2000)或其他毒素与抗原的融合(Barry等，1996；Cardenas和Clements，1993；Chabalgoity等，1997；Chabalgoity等，1996；Chabalgoity等，2000；Chabalgoity等，1995；Chacon等，1996；Jagusztyn-Krynicka等，1993；Khan等，1994a；Khan等，1994b；Lee等，2000；Pogonka等，2003；Schodel等，1990；Smerdou等，1996；Ward等，1999；Wu等，2000)也已经被描述。
这些实例大多数主要关注于粘膜(抗体)免疫应答的诱导并且对于全身性免疫应答的诱导来说，只选择皮下而非口服施用[36]。
将沙门氏菌用作支持菌株(supporter strain)的一些工作仅限于菌株的特征描述(Gomez-Duarte等，1995；Jagusztyn-Krynicka等，1993)，其他工作仅分析粘膜和/或全身性抗体应答和/或保护(Barry等，1996；Cardenas和Clements，1993；Dunstan等，2003；Hajishengallis等，1996；Harokopakis等，1997；Khan等，1994a；Khan等，1994b；Pogonka等，2003；Smerdou等，1996；Somner等，1999)。在其中附带使用抗原和破伤风毒素之间的融合并且其专门用作感染疫苗的所有这些实例中，全身性细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答还未被研究。
因此，从免疫学观点，关于作为肿瘤疫苗的潜在的应用的结论不能够从这些研究得到，因为它们关注于抗体介导的效应作为感染疫苗。
包括所研究的免疫应答的同种型分析的研究似乎更相关。事实上，在这些实例中不直接测量细胞免疫应答，但是抗体应答的同种型谱允许得到免疫应答的Th1/Th2免疫偏离的结论。抗体同种型如IgG1与Th2应答相关并且同种型如IgG2a与Th1应答相关。如已经指出的，Th1应答为细胞为主的免疫应答，然而Th2应答主要代表体液抗体驱动(driven)的应答。同样，这些研究既未描述肿瘤疫苗，也未暗示任何作为抗肿瘤剂的应用。
基于作为载体的表达破伤风-毒素抗原融合蛋白的沙门氏菌的一个感染疫苗的研究已经在狗中实现。在狗中诱导的低抗体应答表明Th1免疫偏离，因此，在抗体谱方面，该应答与细胞型免疫应答更相关(Chabalgoity等人，2000)。然而，狗的免疫学几乎没有被研究过，因此，不清楚狗抗体谱能够在什么程度上提供关于Th1免疫偏离的信息。
然而，在小鼠中通过相同的组进行的，使用相当的(comparable)构建体的研究，表明抗体谱对于IgG1具有与对于IgG2a相同的水平，这表明混合的Th1/Th2应答。
有趣的是，如由于之前的免疫而在大多数人中所发现的，抗破伤风毒素的现有的免疫导致另一个相对强的IgG1的诱导，然而几乎不诱导IgG2a。这清楚地指示明确的Th2免疫偏离(Chabalgoity等，1995)。由于这个原因，基于破伤风毒素的活疫苗作为肿瘤疫苗用于人十分有害。因为能够预期其在表现出破伤风毒素特异性应答的大多数患者中诱导强的Th2抗体为主的应答。
只有很少的研究还分析细胞免疫应答并且比较具有和不具有毒素融合的基因构建体。在一个实例中，例如，与和不与破伤风毒素的抗原的融合已经在沙门氏菌中进行比较(Lee等人)。其中，破伤风毒素抗原融合构建体主要增加总的抗体水平，然而Th1/Th2谱难以改变。甚至代表性Th1细胞因子例如IFN-γ和IL-2的抗原特异性CD4+T细胞分泌，分别只表现出很微小的区别。经相同的组在较早的研究中，细胞IFN-γ水平也已经被测量。然而，没有与不具有破伤风毒素的构建体进行比较(Chabalgoity等人)。用不同的革兰氏阴性菌载体，如志贺氏菌(Koprowski等人，；Ranallo等人，；Zheng等人)或弧菌(Campos等人；Ryan等人)的其他研究也未分别分析同种型和细胞免疫应答。
总之，能够确定的是，提及的研究明确关注于抗体驱动的体液免疫应答的诱导。其中，确实使用了基因毒素抗原构建体，但是这些不具有分泌信号也不直接分泌。然而，绝对没有分析全身性细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答。而且，此类细胞毒性T细胞应答不能从体液抗体应答推断并且如果由Th1/Th2组成抗体应答，此类细胞毒性T细胞应答不能进行检测。
然而，正是这些细胞毒性T细胞免疫应答对于在肿瘤疫苗治疗中的应用是至关重要的。
因此，就毒素-抗原融合物(其仅限于粘膜感染疫苗)而言，现有技术没有提供任何关于任何此类构建体可以用作肿瘤疫苗的表述。
如已经指出的，基因融合构建体的表达可无需分泌系统的帮助进行。通常，毒素和毒素抗原构建体分别定位于细胞质及周质，即在两个膜之间。为了诱导有效的细胞免疫应答，毒素必须可自由接近抗原呈递细胞(APC)。通常，天然毒素产生于革兰氏阴性菌的周质中。这对于仅粘膜免疫应答是足够的，因为周质毒素能够从结肠中的周质逃脱从而也是可接近的(Hunt和Hardy，1991)。然而，如果载体靶向结肠外例如派尔斑(Peyer’s Patches)或淋巴器官如淋巴结或脾的抗原呈递细胞，则这不计算在内。
原则上，两种因素对于肿瘤疫苗的功效至关重要：Th1型细胞免疫应答的诱导和先天免疫系统的组分的参与，例如NK细胞，NKT细胞和γ-δT细胞，其在肿瘤治疗的功效中起重要作用(Dunn等人，2004)。
先天免疫系统的这些组分的重要性在于多个水平。适当活化的NK和γ-δT细胞能够局部地产生大量IFN-γ。还由特定Th1极化T细胞产生的这种干扰素具有多种功能，与肿瘤治疗有关。它的核心功能之一是抑制血管生成，其切断了肿瘤的氧和营养的供给并且事实上饿死肿瘤。此外，NK细胞具有受体，所述受体识别MHC I类分子。如果这些分子在细胞上呈递，NK细胞被抑制。
对于其诱导特异性细胞毒性T细胞的疫苗，肿瘤细胞能够被这些CTL杀死。如果肿瘤细胞失去了表达MHC I类分子的能力(这种情况在肿瘤中非常频繁地发生)，则特异性细胞毒性T细胞无效。因此，在这种情况下，NK细胞的抑制终止，并且它们能够直接清除肿瘤细胞。
因而，如果肿瘤疫苗有效诱导两种组分，其是理想的。存在关于融合的毒素佐剂的Th1-Th2免疫偏离的相互矛盾的数据。如之前讨论的，以单独的形式使用的毒素抗原融合构建体明显诱导强Th2极化免疫应答。一些作者还描述活载体的低Th2免疫偏离；其他作者观察到了轻微的Th1免疫偏离。
然而，这些数据仍基于非分泌性构建体。借助此类感染疫苗的先天免疫的诱导从未被比较或被关注(contemplate)。
如已经指出的，主要原因为现有的疫苗是粘膜感染疫苗，而非肿瘤疫苗。因此，Th1免疫应答、CTL免疫应答和先天免疫系统的应答的诱导未被关注。相比之下，对于肿瘤疫苗，这些免疫应答的诱导是必不可少的。
有趣的是，在细胞生物学中，天然毒素通常用作信号途径的抑制剂。其中已表明天然百日咳毒素，而非霍乱毒素，能够抑制NK细胞的特定的凋亡方式(Ramirez等人，1994)。不同的调查研究已能够表明霍乱毒素，而非它的B亚基，阻断特异性NK细胞功能(Poggi等人，1996)。使用天然百日咳毒素以抑制淋巴细胞的趋化作用(Spangrude等人，1985)。即使这些研究不涉及肿瘤疫苗接种，本领域技术人员也可以推断毒素作为肿瘤疫苗的应用是有害的，因为对于肿瘤治疗至关重要的先天免疫系统的应答被抑制而不是被诱导。
其他研究已能够表明毒素如天然百日咳毒素(而非灭活的百日咳毒素)有效诱导先天免疫系统的组分。对于抗肿瘤的免疫治疗，这意味着如果有可能，可以使用天然毒素。然而，由于毒性原因，此类施用是不可行的。进一步，此类诱导不可避免地导致Th2定向的二次免疫应答，其反过来对肿瘤治疗是有害的(Boyd等人，2005)。因此，关于先天免疫应答的诱导，现有技术未描述也未关注肿瘤疫苗接种。完全相反，文献的关键分析还对肿瘤治疗中毒素的应用产生不利的影响。
然而，毒素或它们的亚基与其他刺激剂，例如具有低甲基化CpG基序的免疫刺激DNA寡核苷酸(CpG ODN)(Holmgren等人，2005)或脂多糖(LPS)的协同效应的分析是引人关注的。在LPS的情况下，主要地，单核细胞的诱导似乎主要通过毒素的B亚基增加，然而其被作为整体的毒素(全毒素)抑制(Hajishengallis等，2004)。然而，这些研究只依赖于纯化的毒素抗原融合构建体的使用，对其加入物质如LPS或CpG作为佐剂。而且，该分析只在巨噬细胞上进行，其诱导适应性免疫应答，但是不直接攻击肿瘤。因此，这些研究对先天免疫系统的组分(特别是能够直接攻击肿瘤的NK细胞)的诱导没有意义。
然而，其他研究表明NK细胞能够被毒素如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A活化并且趋化吸引(Muhlen等，2004)。依赖于实验系统，还能诱导Th1应答，尽管主要出现NK细胞和Th1应答的抑制(Michalkiewicz等，1999)。然而，这些实验主要旨在分析外毒素A的肝毒性并且不涉及肿瘤疫苗接种。有趣的是，该作用高度依赖于剂量，并且只要轻微地改变剂量就能逆转该作用。然而，作者未能揭示在体内有效地发生哪种应答。结果，该数据没有提供如果毒素乃至脱毒的毒素用作佐剂，可以产生哪种作用的预测。
总而言之，免疫应答强烈依赖于所使用的特定系统。在大多数实例中，粘膜抗感染疫苗旨在在粘膜处局部操纵(manipulation)免疫系统，以诱导有效的粘膜免疫应答(Lycke，2005)。然而，这些研究不包括肿瘤疫苗的开发。另外，这些研究缺乏关于全身性细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞的应答的诱导的信息，其对于肿瘤疫苗接种是基本的。
已经表明，异源抗原的分泌赋予对全身性免疫应答的优势(Hess等，1996)。然而，所述的分泌性抗原不是分泌性毒素-抗原构建体；没有使用毒素或其亚基。因此转基因肿瘤模型中可获得的免疫应答也是高度有限的(Gentschev等，2005)。当然，可以在这一实例中诱导弱的抗体和细胞毒性T细胞应答，其部分避免肿瘤进展。然而，不仅免疫应答自身，保护自身也是有限的。同样，这些肿瘤疫苗接种研究缺少与非分泌性构建体的比较。此外，没有在肿瘤疫苗接种的背景中进行比较研究(Hess等，1996)并且比较研究和进一步的研究相反，所述的进一步的研究未见到任何关于分泌的优点(Garmory等，2002；Roland等，2005)。
总之并且如前所述，现有技术在分泌方面是高度相互矛盾的，并且，总而言之，对分泌性毒素-抗原构建体在肿瘤治疗中的潜在优势没有给出任何线索。完全相反，现有文献的关键分析对此类应用意见非常不一致。
细菌毒素(Todar，2002)：在化学水平，存在两类细菌毒素，脂多糖，其与革兰氏阴性菌的细胞壁结合，以及蛋白，其从细菌细胞释放并且可以在远离细菌生长位置的组织位置起作用。细胞结合脂多糖(LPS)毒素被称为内毒素并且细胞外可扩散的毒素被称为外毒素。
外毒素通常是由指数生长期间的活的细菌分泌的可溶蛋白，但是在一些实例中，它们通过细菌细胞的裂解释放。毒素的产生通常对产生与毒素相关的疾病的特定细菌种类是特异性的(例如只有破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生破伤风毒素；只有白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生白喉毒素)。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都产生可溶蛋白毒素。
通常，存在三类蛋白(外-)毒素：(i)I型毒素(超抗原)，其与宿主细胞表面结合并且调节免疫应答但不转位入细胞，(ii)II型毒素(成孔毒素)，其在宿主细胞膜上起作用并且使得宿主细胞渗漏并死亡，和(iii)III型毒素(A-B毒素)，其经由一个特异性受体与宿主细胞结合，转位入细胞，在细胞中变成有活性的修饰蛋白或宿主细胞的其他组分。
如上面指出的，III型毒素(对于宿主细胞在细胞内起作用)，由两个组分组成：一个组分(亚基A)负责毒素的酶活性；另一个组分(亚基B)参与与宿主细胞膜上的特异性受体的结合和酶的跨膜转运。直至其从天然(A+B)毒素释放，酶组分才具有活性。分离的A亚基具有酶活性但是缺乏结合和进入细胞的能力。分离的B亚基可以与靶细胞结合(并且甚至阻断天然毒素的结合)，但是它们是无毒的。
存在可以合成和装配(arranged)毒素亚基的多种方法：A+B表示毒素作为在靶细胞表面相互作用的两个分离的蛋白亚基进行合成和分泌；A-B或A-5B或AB5表示A亚基和B亚基分别合成，但是在分泌和与它们的靶结合期间通过非共价键结合；5B或B5表示蛋白的结合结构域由5个相同亚基组成。AB或A/B表示作为单一多肽合成的毒素，分为A和B结构域，其可以通过蛋白水解切割进行分离。AB或A/B的实例为白喉毒素，外毒素A，肉毒杆菌毒素和破伤风毒素。A-5B或AB5毒素的实例为霍乱毒素和志贺菌毒素，而炭疽毒素LF和炭疽毒素EF为A-B毒素的实例。
其他相关的现有技术文献包括下列：
Michl等描述了细菌和细菌毒素作为用于实体瘤的治疗剂的用途。公开了毒素-抗原融合构建体及此类构建体的细菌靶向。研究了白喉毒素(DT)，假单胞菌外毒素A(PE)和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)肠毒素(CPE)的用途。然而，作者既没有提及霍乱毒素的用途，也没有展示或提出细菌递送的毒素-抗原融合构建体的明显的分泌(Michl和Gress，2004)。
Lahiri给出了关于不同细菌毒素的综述并且讨论了它们的多种形式的应用。尽管作者提到了毒素-抗原融合蛋白，他完全没有提到霍乱毒素和分泌性毒素-抗原融合构建体的细菌靶向(Lahiri，2000)。
Lavelle等人公开了作为免疫调节药物的感染剂的分子。作者还提及霍乱毒素-抗原融合蛋白，但是此类构建体仅作为蛋白直接应用而没有借助遗传修饰的活疫苗进行应用(Lavelle等，2004)。
WO 01/74383关注嵌合抗原-肠毒素粘膜免疫原并且还提及霍乱毒素亚基A2和B的应用。然而，此类嵌合免疫原总是同时包含A2和B亚基并且意欲在粘膜免疫而非肿瘤治疗中使用。
WO 02/077249描述了用于将异源蛋白递送到特异性突变靶细胞的非致命性小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)突变体菌株。还提及了霍乱毒素亚基A1的应用但是该专利文献完全没有提及分泌并且只涉及了感染和感染状态的治疗。
WO 2004/018630公开了编码双链真核表达盒的重组双链RNA噬菌体。尽管提及霍乱毒素亚基A，但该文献没有进一步的相关性。
Holmgren等人给出了关于粘膜免疫和佐剂领域的简短的综述。其中他们讨论了霍乱毒素作为粘膜佐剂的功效但是没有公开关于遗传表达系统或活疫苗的信息并且也完全没有提及肿瘤治疗(Holmgren等人，2003)。
Holmgren和Czerkinsky也给出了关于粘膜免疫和疫苗的综述。然而，这篇文章仅限于抗感染药并且没有讨论或提出在肿瘤治疗领域中明显的可能的应用(Holmgren和Czerkinsky，2005)。
Freytag和Clements的另一篇评论公开了用于抗感染免疫治疗的粘膜佐剂。尽管霍乱毒素作为粘膜佐剂被提及，但作者完全没有提及分泌性毒素抗原构建体和作为施用的可能范围的肿瘤治疗(Freytag和Clements，2005)。
Shaw和Starnbach描述了经修饰的细菌毒素用于递送疫苗抗原的应用。然而，该文章没有提及霍乱毒素并且由于疫苗接种的原因，进一步地限于毒素-抗原融合蛋白的直接使用(Shaw和Starnbach，2003)。
WO 03/072789关注于作为编码用于治疗肿瘤的细胞抗原的核苷酸序列的载体的微生物。尽管专利文献提及分泌和在肿瘤治疗领域中的应用，但其完全没有提及细菌毒素和融合蛋白。
Gentschev，Dietrich和Goebel以及Gentschev等人描述了细菌靶向和它在肿瘤疫苗开发中的应用。然而，这两篇文献均没有提及细菌毒素和融合蛋白在肿瘤治疗中的应用(Gentschev等人，2002a；Gentschev等人，2002b)。
WO 98/23763公开了将大肠杆菌溶血素B和D亚基与包括与hylA融合的异源抗原的融合多肽一起表达的霍乱弧菌细胞。进一步描述了表达霍乱毒素亚基B及分泌信号序列，异源抗原和霍乱毒素A2亚基的融合多肽的弧菌霍乱疫苗菌株。最后，公开了包括与艰难梭菌(C.difficile)毒素A或毒素B亚基的抗原部分融合的霍乱毒素B亚基的融合多肽。然而，该专利申请没有提及蛋白毒素加上异源非蛋白毒素抗原的融合蛋白在肿瘤治疗中的应用。
Dietrich和合作者讨论了两种疫苗递送工具——溶血素A和利斯特菌溶胞素--其能够用于细胞介导的免疫。然而，没有提及蛋白毒素-异源抗原融合蛋白或共表达(Dietrich等人，2003)。
Gentschev等人描述了大肠杆菌的α-溶血素分泌系统在伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)Ty21a疫苗菌株中用于抗原递送的应用。然而，作者没有提及细菌毒素和融合蛋白在肿瘤治疗中的应用(Gentschev等人，2004)。
WO 02/47727关注于包含蛋白毒素的B亚基的治疗剂。该文献只公开了CtxB和EtxB与病毒抗原的融合蛋白。没有提及细菌疫苗或细菌疫苗递送。
Cheng-hua S和合作者描述了霍乱毒素B亚基和HBV PreS2表位的基因融合及在直接免疫研究中该融合蛋白的抗原性。然而，没有提及细菌疫苗或细菌疫苗递送(Cheng-hua等人，1995)。
Sanchez等人公开，当与DNA疫苗皮内共同施用时霍乱毒素B亚基基因增强粘膜免疫球蛋白A，Th1型和CD8+细胞毒性应答(Sanchez等人，2004)。然而，在该方法中，作者用DNA作为载体，其单独用作Th1促进佐剂。另外，蛋白由宿主细胞产生而非直接地或经由细菌载体进行递送从而蛋白对于真核细胞来说是可以直接获得的。
WO 01/29233关注于嵌合免疫原性组合物和编码它们的核酸。然而，没有提及细菌疫苗或细菌疫苗递送。
WO 2007/044406涉及通过使用基于具有III型分泌信号的SopE的细菌抗原递送系统刺激免疫应答的方法。然而，该专利申请没有提及细菌毒素和融合蛋白在肿瘤治疗中的应用。
总之，从现有技术能够得到这样的结论，由于它们的强毒性，天然毒素不能在人体中使用。进一步地，因为先天免疫系统的应答，特别是NK细胞的应答被抑制，所以它们在肿瘤治疗中的使用将是有害的。然而，该免疫应答对于成功的肿瘤治疗来说是重要组成，因为肿瘤细胞经常失去其表达MHC I类分子的能力从而对CTL识别和攻击有抗性。
在另一方面，单独的或与(异源)抗原蛋白融合的脱毒毒素亚基的应用导致强烈的削弱的佐剂功效和/或甚至诱导免疫系统及粘膜限制性抗体和Th2型免疫应答的全身性耐受。
此外，(异源)抗原-毒素融合蛋白的分泌(其只在抗感染疫苗(即靶向抗原乃至毒素自身)期间被描述)据认为不仅在细胞质表达方面没有表现出优势，而且通常更不适用。
总之，既未给出肿瘤治疗方法也没有描述或获得用产生IFN-γ的T辅助细胞的Th1为主的细胞免疫应答的全身性诱导，CTL的诱导或先天免疫系统的激活，而对于肿瘤治疗来说，这些全部是必不可少的。
发明详述
本发明目的在于提供新的肿瘤疫苗，通过其可诱导强烈的全身性细胞免疫系统应答，并且能够获得有效的肿瘤治疗。
本发明的目的在一个方面令人惊讶地通过提供作为编码抗原和蛋白毒素的核苷酸序列的载体的微生物解决，所述微生物包含下列组分：
(I)编码至少一个野生型或突变的蛋白的至少一个完整或部分抗原的至少一个核苷酸序列；和
(II)编码至少一个蛋白毒素和/或至少一个蛋白毒素亚基的至少一个核苷酸序列；和
(III)a)编码至少一个转运系统的至少一个核苷酸序列，所述的转运系统使得能够在微生物的外表面表达组分(I)和组分(II)的表达产物和/或使得能够分泌组分(I)和组分(II)的表达产物；和/或编码使得能够分泌组分(I)和组分(II)表达产物的至少一个信号序列的至少一个核苷酸序列；和/或
b)任选地，编码用于裂解哺乳动物细胞的胞质溶胶中的微生物且用于细胞内释放包含在裂解的微生物中的质粒或表达载体的至少一个蛋白的至少一个核苷酸序列；和
(IV)用于表达组分(I)至(III)的一个或多个的至少一个活化序列的至少一个核苷酸序列，其中所述的活化序列能够在微生物中活化和/或是组织细胞特异性的，肿瘤细胞特异性的，巨噬细胞特异性的，树突特异性的，淋巴细胞特异性的，功能特异性的或非细胞特异性的；
其中组分(I)至(IV)的任何一个能够以一倍或几倍存在并且如果组分(I)至(IV)的组分以几倍存在，其相互独立地可以是相同的或不同的。
在优选的实施方案中，提供包含上述组分(I)至(IV)的微生物，其中组分(I)和组分(II)是不同的，即组分(I)不编码编码至少一个蛋白毒素和/或至少一个蛋白毒素亚基的至少一个核苷酸序列。
在本发明中与组分(IV)相关的术语“组织细胞特异性”指在靶组织细胞中特异性活化的活化序列，例如在前列腺组织中的激素依赖性启动子。
在本发明中与组分(IV)相关的术语“肿瘤细胞特异性”指在肿瘤细胞中特异性活化的活化序列，例如通过肿瘤特异性癌基因的作用而活化的启动子元件。
在本发明中与组分(IV)相关的术语“巨噬细胞特异性”指在巨噬细胞中特异性活化的活化序列，例如编码巨噬细胞特异性基因，例如编码F4/80的基因的启动子元件。
在本发明中与组分(IV)相关的术语“树突特异性”指在树突细胞中特异性活化的活化序列，例如控制B7.1表达的启动子元件。术语“树突特异性”和“树突细胞特异性”是等价的，即他们具有相同的意义并且都涉及树突细胞。
在本发明中与组分(IV)相关的术语“淋巴细胞特异性”指在淋巴细胞谱系的细胞中特异性活化的元件，如在T细胞中调节CD3分子表达的启动子元件或在成熟B细胞中调节CD20表达的启动子元件。
在本发明中与组分(IV)相关的术语“功能特异性”指在细胞背景(context)中例如缺失p53表达的肿瘤细胞中特异性活化的活化序列，或依赖于背景，例如细胞定位或氧分压在细菌内活化的活化序列。
在本发明中与组分(IV)相关的术语“非细胞特异性”指具有广泛活性的活化序列，例如组成型活性细菌启动子。
在本发明中术语“核苷酸序列”指dsDNA，ssDNA，dsRNA，ssRNA或dsDNA/RNA杂交物。优选dsDNA。
在本发明中术语“抗原”指与抗体反应的分子，即其能够产生抗体。一些抗原不通过自身引起抗体产生；只有那些能够诱导抗体产生的抗原被称为免疫原。为了本发明的目的，意欲包括所有种类的已知抗原。通过数据库和/或实验筛选找到关于潜在抗原的必要的信息而没有额外负担在本领域技术人员的知识范围内。抗原的实例包括细胞抗原，组织细胞特异性抗原(例如从其衍生肿瘤的组织细胞)，细胞蛋白抗原，病毒抗原，病毒蛋白抗原等。优选蛋白抗原。进一步优选异源抗原或外源抗原，即对于本发明的各自的微生物不是内源的抗原或天然地不由本发明的各自的微生物表达，但是通过标准分子生物学方法导入微生物的抗原。
在本发明中术语“完整抗原”指根据上述定义与抗体反应的完整分子。完整抗原的实例例如全长蛋白，其也是优选的。
在本发明中术语“部分抗原”指根据上述定义与抗体反应的分子的特定部分。例如，部分抗原可以是例如蛋白基序，例如蛋白质内的氨基酸环，蛋白激酶结构域，表位等。优选蛋白激酶结构域和表位，后者是被抗体识别的抗原特异性位点(也称为抗原决定簇)。
在本发明中与“蛋白”相关的术语“野生型”和“突变的”分别指由它们的“天然的”主要氨基酸序列(由各自的核苷酸序列编码)组成的蛋白和与野生型序列相比在它们的氨基酸序列(由各自的核苷酸序列编码)中具有一个或多个突变的蛋白。优选野生型和/或突变的蛋白得自肿瘤细胞。对于部分抗原而言，进一步优选具有突变的序列，即优选包含一个或多个突变的表位，例如B-Raf V600E表位。
本发明意义上的微生物为细菌，革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌和真核细胞，后者包含单细胞寄生虫，酵母，肿瘤细胞和细胞系细胞，例如酿酒酵母(Sacharomyces cerevisiae)，利什曼原虫属的种(Leishmania spp.)，得自患者的自体肿瘤细胞和肿瘤细胞系。此类微生物通常用作用于转移对微生物来说是外源的(异源的或异种的)核苷酸序列的载体。优选地，使用其毒性减弱的细菌，例如携带缺失或灭活的aroA，aro，asd，gal，pur，cya，crp，phoP/Q，omp基因的细菌或其为温度敏感型突变体或抗生素依赖性突变体的细菌(Cardenas和Clements，1992)。进一步优选的包含上述组分(I)至(IV)的微生物为革兰氏阴性的，减毒的，兼性细胞内细菌，其作为载体能够克服(overcome)肠粘膜(例如沙门氏菌属的种或志贺氏菌属的种)。
在优选的实施方案中，提供包含上述组分(I)至(IV)的微生物，其中微生物选自“细菌，革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，真核细胞”并且优选选自“埃希氏菌属的种(Escherichia spp.)，大肠杆菌，沙门氏菌属的种(Salmonella spp.)，伤寒沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，耶尔森氏菌属的种(Yersinia spp.)，小肠结肠炎耶尔森氏菌，弧菌属的种(Vibrio spp.)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，利斯特氏菌属的种(Listeria spp.)，单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，志贺氏菌属的种(Shigella spp.)，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)”，其中优选微生物的毒性被减弱。进一步优选，将霍乱弧菌排除在上述定义的微生物以外。
与任意微生物相关的术语“属的种”为了本发明的目的意欲包含给定属的所有成员，包括种，亚种和其他。例如术语“沙门氏菌属的种”意欲包含沙门氏菌属的所有成员，例如伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
在另一个优选的实施方案中，提供根据上述定义的微生物，其中根据组分(I)的至少一个野生型或突变蛋白的至少一个完整或部分抗原选自下列野生型蛋白和它们的已知的突变体：“受体；受体的胞外，跨膜或胞内部分；黏着分子；黏着分子的胞外，跨膜或胞内部分；信号转导蛋白；细胞周期蛋白；转录因子；分化蛋白；胚胎蛋白(embryonicprotein)；病毒蛋白；过敏原；微生物病原体蛋白；真核病原体蛋白；癌-睾丸(cancer testis)抗原蛋白；肿瘤抗原蛋白；和/或组织细胞特异性蛋白”，其中组织细胞选自“甲状腺，乳腺，唾液腺，淋巴结，乳腺，胃粘膜，肾，卵巢，前列腺，宫颈，膀胱浆膜和痣”。
就突变蛋白而言，突变可以是致癌的并且可以导致其原有的细胞功能的丧失或增强。
此类抗原在细胞中控制细胞生长和细胞分裂并且呈递于正常细胞的细胞膜，例如通过MHC I类分子。在肿瘤细胞中，这些抗原经常被过表达或特异性突变。因而，此类突变可以对癌基因抑制物具有功能限制或导致原癌基因活化为癌基因并且可以单独或通常与过表达一起参与肿瘤生长。此类细胞抗原呈递于肿瘤细胞膜上从而代表肿瘤细胞上的抗原，而不导致影响患者的肿瘤疾病的免疫反应。Rapp(US5,156,841)已经描述了癌蛋白(即癌基因的表达产物)作为用于肿瘤疫苗的免疫原的应用。
根据本发明的抗原和其(致癌性)突变的实例为i)受体，例如Her-2/neu，雄激素受体，雌激素受体，乳铁蛋白受体，肝素结合生长因子(midkine)受体，EGF受体，ERBB2，ERBB4，TRAIL受体，FAS，TNFα受体，TGF-β受体；ii)信号转导蛋白，例如c-Raf(Raf-1)，A-Raf，B-Raf，B-Raf V599E，B-Raf V600E，B-Raf KD，B-Raf V600E激酶结构域，B-Raf V600E KD，B-Raf V600E激酶结构域KD，B-Raf激酶结构域，B-Raf激酶结构域KD，Ras，Bcl-2，Bcl-X，Bcl-W，Bfl-1，Brag-1，Mcl-1，A1，Bax，BAD，Bak，Bcl-Xs，Bid，Bik，Hrk，Bcr/abl，Myb，C-Met，IAP1，IAO2，XIAP，ML-IAP LIVIN，存活素(survivin)，APAF-1；iii)细胞周期控制蛋白，例如细胞周期蛋白D(1-3)，细胞周期蛋白E，细胞周期蛋白A，细胞周期蛋白B，细胞周期蛋白H，Cdk-1，Cdk-2，Cdk-4，Cdk-6，Cdk-7，Cdc25C，p16，p15，p21，p27，p18，pRb，p107，p130，E2F(1-5)，GAAD45，MDM2，PCNA，ARF，PTEN，APC，BRCA，p53和同源物；iv)转录因子，例如C-Myc，NFkB，c-Jun，ATF-2，Spl；v)胚胎蛋白，例如癌胚抗原，甲胎蛋白，MAGE，MAGE-1，MAGE-3，NY-ESO-1，PSCA；vi)分化抗原，例如MART，Gp100，酪氨酸酶，GRP，TCF-4，碱性髓磷脂，α-乳清蛋白，GFAP，前列腺特异性抗原(PSA)，纤维酸性蛋白，酪氨酸酶，EGR-1，MUC1；vii)病毒抗原，例如下列病毒的抗原：HIV，HPV，HCV，HPV，EBV，CMV，HSV，流感病毒，A型流感病毒，A型流感病毒(H5N1)和(H3N2)，B型流感病毒，C型流感病毒；血凝素，血凝素H1，血凝素H5，血凝素H7，血凝素HA1(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12C(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，neuramidase，微生物抗原：p60，LLO，脲酶等。真核病原体抗原：CSP(疟疾)，calflagin(锥虫属)，CPB(硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor))等。
在另一个优选的实施方案中，提供根据上述定义的微生物，其中根据组分(I)的至少一个野生型或突变蛋白的至少一个完整或部分抗原选自下列野生型蛋白和其已知突变体：“Her-2/neu，雄激素受体，雌激素受体，肝素结合生长因子受体，EGF受体，ERBB2，ERBB4，TRAIL受体，FAS，TNFα受体，TGF-β受体，乳铁蛋白受体，碱性髓磷脂，α-乳清蛋白，GFAP，纤维酸性蛋白，酪氨酸酶，EGR-1，MUC1，c-Raf(Raf-1)，A-Raf，B-Raf，B-Raf V599E，B-Raf V600E，B-RafKD，B-Raf V600E激酶结构域，B-Raf V600E KD，B-Raf V600E激酶结构域KD，B-Raf激酶结构域，B-Raf激酶结构域KD，N-Ras，K-Ras，H-Ras，Bcl-2，Bcl-X，Bcl-W，Bfl-1，Brag-1，Mcl-1，A1，Bax，BAD，Bak，Bcl-Xs，Bid，Bik，Hrk，Bcr/abl，Myb，C-Met，IAP1，IAO2，XIAP，ML-IAP LIVIN，存活素，APAF-1，细胞周期蛋白D(1-3)，细胞周期蛋白E，细胞周期蛋白A，细胞周期蛋白B，细胞周期蛋白H，Cdk-1，Cdk-2，Cdk-4，Cdk-6，Cdk-7，Cdc25C，p16，p15，p21，p27，p18，pRb，p107，p130，E2F(1-5)，GAAD45，MDM2，PCNA，ARF，PTEN，APC，BRCA，Akt，PI3K，mTOR，p53和同源物，C-Myc，NFkB，c-Jun，ATF-2，Sp1，前列腺特异性抗原(PSA)，癌胚抗原，甲胎蛋白，PAP；PSMA；STEAP；MAGE，MAGE-1，MAGE-3，NY-ESO-1，PSCA，MART，Gp100，酪氨酸酶，GRP，TCF-4，病毒HIV，HPV，HCV，HPV，EBV，CMV，HSV，流感病毒，A型流感病毒，A型流感病毒(H5N1)和(H3N2)，B型流感病毒，C型流感病毒的病毒抗原；血凝素，血凝素H1，血凝素H5，血凝素H7，血凝素HA1(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12C(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，neuramidase，p60，LLO，脲酶，CSP，calflagin和/或CPB”。
在另一个优选的实施方案中，提供根据上述定义的微生物，其中根据组分(I)的至少一个野生型或突变蛋白的至少一个完整或部分抗原选自由下列野生型蛋白和它们的已知的突变体组成的激酶(括号中是登录号)：
AAK1(NM 014911)，AATK(NM 004920)，ABL1(NM005157)，ABL2(NM 005158)，ACK1(NM 005781)，ACVR1(NM 001105)，ACVR1B(NM 020328)，ACVR2(NM 001616)，ACVR2B(NM 001106)，ACVRL1(NM 000020)，ADCK1(NM 020421)，ADCK2(NM 052853)，ADCK4(NM 024876)，ADCK5(NM174922)，ADRBK1(NM 001619)，ADRBK2(NM 005160)，AKT1(NM 005163)，AKT2(NM 001626)，AKT3(NM 005465)，ALK(NM 004304)，ALK7(NM 145259)，ALS2CR2(NM 018571)，ALS2CR7(NM 139158)，AMHR2(NM 020547)，ANKK1(NM 178510)，ANKRD3(NM 020639)，APEG1(NM 005876)，ARAF(NM 001654)，ARK5(NM014840)，ATM(NM 000051)，ATR(NM 001184)，AURKA(NM 003600)，AURKB(NM004217)，AURKC(NM 003160)，AXL(NM 001699)，BCKDK(NM 005881)，BCR(NM004327)，BIKE(NM 017593)，BLK(NM 001715)，BMPR1A(NM 004329)，BMPR1B(NM 001203)，BMPR2(NM 001204)，BMX(NM 001721)，BRAF(NM 004333)，BRD2(NM 005104)，BRD3(NM 007371)，BRD4(NM 014299)，BRDT(NM 001726)，BRSK1(NM 032430)，BRSK2(NM 003957)，BTK(NM 000061)，BUB1(NM 004336)，BUB1B(NM 001211)，CABC1(NM 020247)，CAMK1(NM 003656)，CaMK1b(NM 198452)，CAMK1D(NM 020397)，CAMK1G(NM 020439)，CAMK2A(NM 015981)，CAMK2B(NM 001220)，CAMK2D(NM 001221)，CAMK2G(NM 001222)，CAMK4(NM 001744)，CAMKK1(NM 032294)，CAMKK2(NM 006549)，CASK(NM 003688)，CCRK(NM012119)，CDC2(NM 001786)，CDC2L1(NM 001787)，CDC2L5(NM 003718)，CDC42BPA(NM 014826)，CDC42BPB(NM 006035)，CDC7L1(NM 003503)，CDK10(NM 003674)，CDK11(NM 015076)，CDK2(NM 001798)，CDK3(NM 001258)，CDK4(NM 000075)，CDK5(NM 004935)，CDK6(NM 001259)，CDK7(NM 001799)，CDK8(NM 001260)，CDK9(NM 001261)，CDKL1(NM 004196)，CDKL2(NM 003948)，CDKL3(NM 016508)，CDKL4(NM 001009565)，CDKL5(NM 003159)，CHEK1(NM001274)，CHUK(NM 001278)，CIT(NM 007174)，CLK1(NM 004071)，CLK2(NM003993)，CLK3(NM 003992)，CLK4(NM 020666)，CRK7(NM 016507)，CSF1R(NM005211)，CSK(NM 004383)，CSNK1A1(NM 001892)，CSNK1D(NM 001893)，CSNK1E(NM 001894)，CSNK1G1(NM 022048)，CSNK1G2(NM 001319)，CSNK1G3(NM 004384)，CSNK2A1(NM 001895)，CSNK2A2(NM 001896)，DAPK1(NM 004938)，DAPK2(NM 014326)，DAPK3(NM 001348)，DCAMKL1(NM 004734)，DCAMKL2(NM152619)，DCAMKL3(XM 047355)，DDR1(NM 013993)，DDR2(NM 006182)，DMPK(NM 004409)，DMPK2(NM 017525.1)，DYRK1A(NM 001396)，DYRK1B(NM006484)，DYRK2(NM 006482)，DYRK3(NM 003582)，DYRK4(NM 003845)，EEF2K(NM 013302)，EGFR(NM 005228)，EIF2AK3(NM 004836)，EIF2AK4(NM_001013703)，EPHA1(NM 005232)，EPHA10(NM 001004338)，EPHA2(NM004431)，EPHA3(NM 005233)，EPHA4(NM 004438)，EPHA5(NM 004439)，EPHA6(XM 114973)，EPHA7(NM 004440)，EPHA8(NM 020526)，EPHB1(NM 004441)，EPHB2(NM 017449)，EPHB3(NM 004443)，EPHB4(NM 004444)，EPHB6(NM004445)，ERBB2(NM 004448)，ERBB3(NM 001982)，ERBB4(NM 005235)，ERK8(NM 139021)，ERN1(NM 001433)，ERN2(NM 033266)，FASTK(NM 025096)，FER(NM 005246)，FES(NM 002005)，FGFR1(NM 000604)，FGFR2(NM 022970)，FGFR3(NM 000142)，FGFR4(NM 022963)，FGR(NM 005248)，FLJ23074(NM 025052)，FLJ23119(NM 024652)，FLJ23356(NM 032237)，FLT1(NM 002019)，FLT3(NM004119)，FLT4(NM 002020)，FRAP1(NM 004958)，FRK(NM 002031)，FYN(NM002037)，GAK(NM 005255)，GPRK5(NM 005308)，GPRK6(NM 002082)，GPRK7(NM 139209)，GRK4(NM 005307)，GSG2(NM 031965)，GSK3A(NM 019884)，GSK3B(NM 002093)，GUCY2C(NM 004963)，GUCY2D(NM 000180)，GUCY2F(NM001522)，H11(NM 014365)，HAK(NM 052947)，HCK(NM 002110)，HIPK1(NM152696)，HIPK2(NM 022740)，HIPK3(NM 005734)，HIPK4(NM 144685)，HRI(NM014413)，HUNK(NM 014586)，ICK(NM 016513)，IGF1R(NM 000875)，IKBKB(NM001556)，IKBKE(NM 014002)，ILK(NM 004517)，INSR(NM 000208)，INSRR(NM014215)，IRAK1(NM 001569)，IRAK2(NM 001570)，IRAK3(NM 007199)，IRAK4(NM016123)，ITK(NM 005546)，JAK1(NM 002227)，JAK2(NM 004972)，JAK3(NM000215)，KDR(NM 002253)，KIS(NM 144624)，KIT(NM 000222)，KSR(XM 290793)，KSR2(NM 173598)，LAK(NM 025144)，LATS1(NM 004690)，LATS2(NM 014572)，LCK(NM 005356)，LIMK1(NM 016735)，LIMK2(NM 005569)，LMR3(XM 055866)，LMTK2(NM 014916)，LOC149420(NM 152835)，LOC51086(NM 015978)，LRRK2(XM 058513)，LTK(NM 002344)，LYN(NM 002350)，MAK(NM 005906)，MAP2K1(NM 002755)，MAP2K2(NM 030662)，MAP2K3(NM 002756)，MAP2K4(NM 003010)，MAP2K5(NM 002757)，MAP2K6(NM 002758)，MAP2K7(NM 005043)，MAP3K1(XM042066)，MAP3K10(NM 002446)，MAP3K11(NM 002419)，MAP3K12(NM 006301)，MAP3K13(NM 004721)，MAP3K14(NM 003954)，MAP3K2(NM 006609)，MAP3K3(NM 002401)，MAP3K4(NM 005922)，MAP3K5(NM 005923)，MAP3K6(NM 004672)，MAP3K7(NM 003188)，MAP3K8(NM 005204)，MAP3K9(NM 033141)，MAP4K1(NM007181)，MAP4K2(NM 004579)，MAP4K3(NM 003618)，MAP4K4(NM 145686)，MAP4K5(NM 006575)，MAPK1(NM 002745)，MAPK10(NM 002753)，MAPK11(NM002751)，MAPK12(NM 002969)，MAPK13(NM 002754)，MAPK14(NM 001315)，MAPK3(NM 002746)，MAPK4(NM 002747)，MAPK6(NM 002748)，MAPK7(NM002749)，MAPK8(NM 002750)，MAPK9(NM 002752)，MAPKAPK2(NM 032960)，MAPKAPK3(NM 004635)，MAPKAPK5(NM 003668)，MARK(NM 018650)，MARK2(NM 017490)，MARK3(NM 002376)，MARK4(NM 031417)，MAST1(NM 014975)，MAST205(NM 015112)，MAST3(XM 038150)，MAST4(XM 291141)，MASTL(NM032844)，MATK(NM 139355)，MELK(NM 014791)，MERTK(NM 006343)，MET(NM000245)，MGC33182(NM 145203)，MGC42105(NM 153361)，MGC43306(C9orf96)，MGC8407(NM 024046)，MIDORI(NM 020778)，MINK(NM 015716)，MKNK1(NM003684)，MKNK2(NM 017572)，MLCK(NM 182493)，MLK4(NM 032435)，MLKL(NM152649)，MOS(NM 005372)，MST1R(NM 002447)，MST4(NM 016542)，MUSK(NM005592)，MYLK(NM 053025)，MYLK2(NM 033118)，MYO3A(NM 017433)，MYO3B(NM 138995)，NEK1(NM 012224)，NEK10(NM 152534)，NEK11(NM 024800)，NEK2(NM 002497)，NEK3(NM 002498)，NEK4(NM 003157)，NEK5(MGC75495)，NEK6(NM 014397)，NEK7(NM 133494)，NEK8(NM 178170)，NEK9(NM 033116)，NLK(NM016231)，NPR1(NM 000906)，NPR2(NM 003995)，NRBP(NM 013392)，NRBP2(NM178564)，NRK(NM 198465)，NTRK1(NM 002529)，NTRK2(NM 006180)，NTRK3(NM002530)，OBSCN(NM 052843)，OSR1(NM 005109)，PACE-1(NM 020423)，PAK1(NM 002576)，PAK2(NM 002577)，PAK3(NM 002578)，PAK4(NM 005884)，PAK6(NM 020168)，PAK7(NM 020341)，PASK(NM 015148)，PCTK1(NM 006201)，PCTK2(NM 002595)，PCTK3(NM 212503)，PDGFRA(NM 006206)，PDGFRB(NM 002609)，PDK1(NM 002610)，PDK2(NM 002611)，PDK3(NM 005391)，PDK4(NM 002612)，PDPK1(NM 002613)，PFTK1(NM 012395)，PHKG1(NM 006213)，PHKG2(NM000294)，PIK3R4(NM 014602)，PIM1(NM 002648)，PIM2(NM 006875)，PIM3(NM001001852)，PINK1(NM 032409)，PKE(NM 173575)，PKMYT1(NM 004203)，pknbeta(NM 013355)，PLK(NM 005030)，PLK3(NM 004073)，PRKAA1(NM 006251)，PRKAA2(NM 006252)，PRKACA(NM 002730)，PRKACB(NM 002731)，PRKACG(NM 002732)，PRKCA(NM 002737)，PRKCB1(NM 002738)，PRKCD(NM 006254)，PRKCE(NM 005400)，PRKCG(NM 002739)，PRKCH(NM 006255)，PRKCI(NM002740)，PRKCL1(NM 002741)，PRKCL2(NM 006256)，PRKCM(NM 002742)，PRKCN(NM 005813)，PRKCQ(NM 006257)，PRKCZ(NM 002744)，PRKD2(NM016457)，PRKDC(NM 006904)，PRKG1(NM 006258)，PRKG2(NM 006259)，PRKR(NM 002759)，PRKWNK1(NM 018979)，PRKWNK2(NM 006648)，PRKWNK3(NM020922)，PRKWNK4(NM 032387)，PRKX(NM 005044)，PRKY(NM 002760)，PRPF4B(NM 003913)，PSKH1(NM 006742)，PSKH2(NM 033126)，PTK2(NM005607)，PTK2B(NM 004103)，PTK6(NM 005975)，PTK7(NM 002821)，PTK9(NM002822)，PTK9L(NM 007284)，PXK(NM 017771)，QSK(NM 025164)，RAD53(NM007194)，RAF1(NM 002880)，RAGE(NM 014226)，RET(NM 020975)，RHOK(NM002929)，RIOK1(NM 031480)，RIOK2(NM 018343)，RIPK1(NM 003804)，RIPK2(NM003821)，RIPK3(NM 006871)，RIPK5(NM 015375)，RNASEL(NM 021133)，ROCK1(NM 005406)，ROCK2(NM 004850)，ROR1(NM 005012)，ROR2(NM 004560)，ROS1(NM 002944)，RPS6KA1(NM 002953)，RPS6KA2(NM 021135)，RPS6KA3(NM004586)，RPS6KA4(NM 003942)，RPS6KA5(NM 004755)，RPS6KA6(NM 014496)，RPS6KB1(NM 003161)，RPS6KB2(NM 003952)，RPS6KC1(NM 012424)，RPS6KL1(NM 031464)，RYK(NM 002958)，SBK(XM 370948)，SCYL1(NM 020680)，SCYL2(NM 017988)，SGK(NM 005627)，SgK069(SU SgK069)，SgK085(XM 373109)，SgK110(SU SgK110)，SGK2(NM 016276)，SgK223(XM 291277)，SgK269(XM370878)，SgK424(CGP SgK424)，SgK493(SU_SgK493)，SgK494(NM 144610)，SgK495(NM 032017)，SGKL(NM 013257)，SK681(NM 001001671)，SLK(NM014720)，SMG1(NM 015092)，SNARK(NM 030952)，SNF1LK(NM 173354)，SNF1LK2(NM 015191)，SNK(NM 006622)，SNRK(NM 017719)，SRC(NM 005417)，SRMS(NM 080823)，SRPK1(NM 003137)，SRPK2(NM 003138)，SSTK(NM032037)，STK10(NM 005990)，STK11(NM 000455)，STK16(NM 003691)，STK17A(NM 004760)，STK17B(NM 004226)，STK18(NM 014264)，STK19(NM 032454)，STK22B(NM 053006)，STK22C(NM 052841)，STK22D(NM 032028)，STK23(NM014370)，STK24(NM 003576)，STK25(NM 006374)，STK3(NM 006281)，STK31(NM031414)，STK32B(NM 018401)，STK33(NM 030906)，STK35(NM 080836)，STK36(NM 015690)，STK38(NM 007271)，STK38L(NM 015000)，STK39(NM 013233)，STK4(NM 006282)，STLK5(NM 001003787)，STYK1(NM 018423)，SUDD(NM003831)，SYK(NM 003177)，TAF1(NM 138923)，TAF1L(NM 153809)，TAO1(NM004783)，TAOK1(NM 020791)，TAOK3(NM 016281)，TBCK(NM 033115)，TBK1(NM013254)，TEC(NM 003215)，TEK(NM 000459)，TESK1(NM 006285)，TESK2(NM007170)，TEX14(NM 031272)，TGFBR1(NM 004612)，TGFBR2(NM 003242)，TIE(NM 005424)，TIF1(NM 003852)，TLK1(NM 012290)，TLK2(NM 006852)，TNIK(NM015028)，TNK1(NM 003985)，TOPK(NM 018492)，TP53RK(NM 033550)，TRAD(NM007064)，TRIB1(NM 025195)，TRIB2(NM 021643)，TRIB3(NM 021158)，TRIM28(NM 005762)，TRIM33(NM 015906)，TRIO(NM 007118)，TRPM6(NM 017662)，TRPM7(NM 017672)，TRRAP(NM 003496)，TSSK4(NM 174944)，TTBK1(NM032538)，TTBK2(NM 173500)，TTK(NM 003318)，TTN(NM 003319)，TXK(NM003328)，TYK2(NM 003331)，TYRO3(NM 006293)，ULK1(NM 003565)，ULK2(NM014683)，ULK3(NM 015518)，ULK4(NM 017886)，VRK1(NM 003384)，VRK2(NM006296)，VRK3(NM 016440)，WEE1(NM 003390)，Wee1B(NM 173677)，YANK1(NM145001)，YES1(NM 005433)，ZAK(NM 016653)，和/或ZAP70(NM 001079)。
在本发明中术语“过敏原”指如本文所定义的完整或部分抗原，其引起过敏和/或变态反应。实例为Der p 5(螨)，Bet v 1(桦树花粉)，Phl p 1(草花粉(grass pollen))，Asp f I/a(曲霉)，PLA2(蜜蜂)，Hev b(胶乳)(Schmid-Grendelmeier和Crameri，2001)。
微生物和真核病原体的抗原和癌-睾丸抗原附于上述列表中。
在本发明中，根据组分(I I)的蛋白毒素和/或它们的亚基优选细菌蛋白毒素，更优选外毒素。细菌外毒素的实例为I型毒素(超抗原)，II型毒素(成孔毒素)和(iii)III型毒素(A-B毒素)。
在优选的实施方案中，提供根据上述定义的微生物，其中组分(II)选自“细菌毒素，肠毒素，外毒素，I型毒素，II型毒素，III型毒素，IV型毒素，V型毒素，RTX毒素，AB毒素，A-B毒素，A/B毒素，A+B毒素，A-5B毒素和/或AB5毒素”。
在进一步优选的实施方案中，提供根据上述定义的微生物，其中组分(II)选自“腺苷酸环化酶毒素，炭疽毒素，炭疽毒素(EF)，炭疽毒素(LF)，肉毒杆菌毒素，霍乱毒素(CT，Ctx)，霍乱毒素B亚基(CTB，CtxB)，白喉毒素(DT，Dtx)，大肠杆菌LT毒素，大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)，大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LTB)，大肠杆菌ST毒素，大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)，红斑毒素，表皮剥脱毒素(Exfoliatin toxin)，外毒素A，产气荚膜菌肠毒素(Perfringens enteratoxin)，百日咳毒素(PT，Ptx)，志贺菌毒素(ST，Stx)，志贺菌毒素B亚基(STB，StxB)，志贺样毒素，葡萄球菌肠毒素，破伤风毒素(TT)，中毒性休克综合征毒素(TSST-1)，Vero细胞毒素(VT)，艰难梭菌(Clostridium difficile)的毒素A(TA)和毒素B(TB)，索氏梭菌(Clostridium sordellii)的致死毒素(LT)和出血毒素(HT)，诺氏梭菌(Clostridium novyi)的α毒素(AT)”。
然而，如果霍乱毒素或其亚基CtxB用作根据本发明的组分(II)的毒素，优选不用霍乱弧菌作为细菌载体(微生物)。
在优选的实施方案中，提供根据上述定义的微生物，其中组分(I)和组分(II)连接在一起使得能够表达和/或分泌由两个组分编码的融合蛋白。更优选，融合蛋白选自“CtxB-PSA，CtxB-B-Raf V600E KD(激酶失活型(kinase dead))，CtxB-B-Raf V600E激酶结构域，CtxB-B-Raf V600E激酶结构域KD(激酶失活型)，CtxB-B-Raf，CtxB-B-Raf KD(激酶失活型)，CtxB B-Raf激酶结构域KD(激酶失活型)，CtxB-HA1(流感病毒的血凝素亚基1)，CtxB-HA12C”。
分泌是从细胞分离，精心制作和释放化学物的过程，或分泌的化学物质或物质的量。分泌不是真核细胞独有的；其还存在于细菌和古细菌(archaea)中。ATP结合盒(ABC)型转运蛋白是三种生物界所共有的。Sec系统是另一种保守的分泌系统，其与在酵母中由Sec61易位子复合物组成的真核内质网中的易位子及细菌中的Sec Y-E-G复合物同源。革兰氏阴性菌具有两层膜，因此使得分泌在拓扑学上更复杂。因此，在革兰氏阴性菌中存在至少五种专门的分泌系统：
(1)I型分泌系统：其与上述的ATP结合盒转运蛋白相同。
(2)II型分泌系统：其依赖于用于使蛋白跨过内膜的Sec系统和另一个用于跨过外膜的特殊系统。细菌菌毛利用修饰的sec系统，但是不同于I型系统。
(3)III型分泌系统(T3SS)：其与细菌鞭毛基体同源。其像是分子注射器，通过其细菌(例如志贺氏菌或耶尔森氏菌)能够将蛋白注入真核细胞中。胞质溶胶中的低Ca2+浓度打开调节T3SS的门控。植物病原体中的Hrp系统通过相似的机制将发夹结构注入植物中。
(4)IV型分泌系统：其与细菌(和古细菌鞭毛)的接合装置(conjugation machinery)同源。其能够转运DNA和蛋白。其在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中被发现，所述菌使用这一系统将Ti质粒和蛋白导入宿主中，宿主形成冠瘿(根瘤)。幽门螺杆菌(Helicobactor pylori)使用IV型分泌系统将Cag A注入胃上皮细胞。百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)(百日咳的致病剂)部分通过IV型系统分泌百日咳毒素。
(5)V型分泌系统，也称为自主转运蛋白系统：该系统使用sec系统跨过内膜。使用这一途径的蛋白具有在其C末端形成β桶并且插入到外膜中以将肽的剩下的部分转运出去的能力。最后，β桶可以被切除并留在外膜中。一些人认为自主转运蛋白的这些残余部分产生与β桶相似的孔蛋白(porin)。
细菌及线粒体和叶绿体还使用多种其他的特殊转运系统，例如双精氨酸转运(twin-arginine translocation)(Tat)途径，与Sec依赖性输出相比，其转运完全折叠的蛋白跨膜。该系统的名称来自靶向这一系统所需的信号序列中的两个连续的精氨酸的需要。革兰氏阴性菌的分泌包括通过合适的分泌系统，如例如Hly I型或III型分泌系统或AIDA自主转运蛋白，克服内膜和外膜。在革兰氏阳性菌中，分泌系统必须克服内膜和细胞壁，在大多数菌株中，其可以通过与合适的分泌信号融合来实现。
组分(III)a)为编码至少一个转运系统的至少一个核苷酸序列，所述的转运系统使得能够在微生物的外表面上表达组分(I)和组分(II)的表达产物和/或使得能够分泌组分(I)和组分(II)的表达产物。各个组分可以供选择地被分泌或在微生物细胞膜上表达，即是膜结合的。此类转运系统为例如i)I型分泌系统，II型分泌系统，III型分泌系统，IV型分泌系统，V型分泌系统，ii)大肠杆菌的溶血素转运系统(信号)(在hly-特异性启动子控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)；使用下列转运信号：对于分泌-在HlyB和HlyD蛋白存在的情况下，C末端HlyA转运信号；对于膜结合表达-在HlyB蛋白存在的情况下，C末端HlyA转运信号，iii)大肠杆菌的溶血素转运系统(信号)(在非hly特异性细菌启动子控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)，iv)新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)的S-层蛋白(RsaA)的转运信号；使用下列转运信号：对于分泌和膜结合表达-C末端RsaA转运信号，v)大肠杆菌TolC蛋白的转运信号；使用下列转运信号：对于膜结合表达-TolC的N末端转运信号(大肠杆菌膜整合蛋白TolC是大肠杆菌的外膜的多功能成孔蛋白，其除了用于接受大肠杆菌素E1(Morona等人，1983)和分泌大肠杆菌素V(Fath等人，1991)外还用做U3噬菌体的受体(Austin等人，1990)；该蛋白不仅在大肠杆菌中发现，还在多数革兰氏阴性菌中发现(Wiener，2000)；在外膜中的定位和广泛存在使TolC成为呈递异源抗原以例如引起免疫反应的理想的候选物。
革兰氏阳性菌不具有外膜。在这些情况中分泌较简单并且通常不需要专用的分泌装置用于转运通过细胞膜和细胞壁。在革兰氏阳性菌的情况下，将分泌信号与异源蛋白N末端融合对分泌来说通常是必要的并且是充分的。已描述用于其的这些信号序列的蛋白主要包含所有的分泌性细菌蛋白。利斯特菌属的实例为源自利斯特菌溶胞素，p60或ActA的分泌信号。通常，相似的方法用于真核细胞，其中在保留信号不存在的情况下，使蛋白靶向内质网的信号序列(例如广泛存在的分泌信号Vtgss)对分泌是必要的并且是充分的。
任选的组分(III)b)为编码至少一个蛋白的至少一个核苷酸序列，所述蛋白用于裂解哺乳动物细胞的胞质溶胶中的微生物和细胞内释放质粒或表达载体，所述质粒或表达载体包含在裂解的微生物中。此类裂解性蛋白(细胞内溶素)例如为在利斯特菌启动子控制下的利斯特菌属特异性裂解蛋白，例如PLY551(Loessner等人，1995)和/或利斯特菌属特异性穿孔素(holin)。本发明优选的实施方案为不同的组分(III)b)的组合，例如裂解蛋白和穿孔素的组合。
组分(III)a)和/或组分(III)b)可以相互独立地具有组成型活性。
在优选的实施方案中，提供根据上述定义的微生物，其中组分(III)a)选自“I型分泌系统，II型分泌系统，III型分泌系统，IV型分泌系统，V型分泌系统，大肠杆菌溶血素转运系统(信号)(在hly特异性启动子控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)，大肠杆菌溶血素转运系统(信号)(在非hly特异性细菌启动子的控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)，新月柄杆菌的S层(Rsa A)蛋白的转运信号，大肠杆菌的TolC蛋白的转运信号，分泌信号Vtgss和/或源自利斯特菌溶胞素，p60和/或ActA的分泌信号”并且其中组分(III)b)选自“细胞内溶素，革兰氏阳性菌的裂解性蛋白，单核细胞增生利斯特菌的裂解性蛋白，单核细胞增生利斯特菌的PLY551和/或单核细胞增生利斯特菌的穿孔素”。
在进一步优选的实施方案中，相同的组分(III)a)使得能够在微生物的外表面上表达组分(I)和组分(II)的表达产物和/或使得能够分泌组分(I)和组分(II)的表达产物。即在这一优选的实施方案中，组分(III)a)为编码仅一个转运系统的至少一个核苷酸序列，所述的转运系统使得能够在微生物的外表面上共表达组分(I)和组分(II)的表达产物和/或使得能够共分泌组分(I)和组分(II)的表达产物，其中此类优选的组分(III)a)为编码大肠杆菌溶血素转运系统(信号)(在hly特异性启动子的控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)或大肠杆菌的溶血素转运系统(信号)(在非hly特异性细菌启动子控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)的至少一个核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，提供根据上述定义的微生物，其中根据组分(III)a)，分泌组分(I)和组分(II)的表达产物。更优选地，组分(I)和组分(II)连接在一起，一起表达并且作为由两个组分编码的融合蛋白分泌。更优选地，该融合蛋白选自“CtxB-PSA，CtxB-B-Raf V600E KD(激酶失活型)，CtxB-B-Raf V600E激酶结构域，CtxB-B-Raf V600E激酶结构域KD(激酶失活型)，CtxB-B-Raf，CtxB-B-Raf KD(激酶失活型)，CtxB B-Raf激酶结构域KD(激酶失活型)，CtxB-HA1(流感病毒的血凝素的亚基1)，CtxB-HA12C”。
在本发明中，术语“分泌”指通过合适的分泌系统，例如上述系统，将蛋白抗原，蛋白毒素和/或毒素-抗原融合蛋白分泌通过革兰氏阴性菌的两层膜或通过革兰氏阳性菌的内膜和细胞壁到附近环境中。
如所已知的，使用分泌系统，例如源自大肠杆菌的溶血素I型分泌系统，分泌产物通常在所有细胞部分中被发现：在细胞质中，膜结合的，在自体-膜小泡(auto-membrane vesicle)中定位的和完整分泌到附近环境中的(Balsalobre等人，2006)，在本发明中分泌不必是完全的。然而，期望和优选完全的或几乎完全的分泌(即大量的完整分泌的分泌产物)。
组分(IV)指用于组分(I)至(III)的一个或多个的表达的至少一个活化序列的至少一个核苷酸序列，其中所述的活化序列能够在微生物中被活化和/或其为组织细胞特异性的，肿瘤细胞特异性的，巨噬细胞特异性的，树突特异性的，淋巴细胞特异性的，功能特异性的或非细胞特异性的。
如果表达为在微生物的外表面上膜结合的，则活化序列优选经选择以便其能够在微生物中活化。此类活化序列例如：i)组成型活性启动子区域，例如具有大肠杆菌的β-内酰胺酶的或tetA基因的“核糖体结合位点”(RBS)的启动子区域(Busby和Ebright，1994)，大肠杆菌hly基因座的内源启动子；ii)能够被诱导的启动子，优选在细胞中接受后变成有活性的启动子。单核细胞增生利斯特菌的actA启动子(Dietrich等人，1998)或鼠伤寒沙门氏菌的pagC启动子(Bumann，2001)属于这些启动子。
如果在微生物裂解后质粒从微生物释放到哺乳动物细胞的胞质溶胶中，则活化序列不是细胞特异性的，而是组织细胞特异性的，细胞周期特异性的或功能特异性的。优选地，选择此类活化序列，其特别地在巨噬细胞，树突细胞和淋巴细胞中被活化。
在进一步优选的实施方案中，提供根据上述定义的微生物，其中
组分(I)选自B-Raf V600E，B-Raf V600E激酶结构域，B-RafV600E KD(激酶失活型)，B-Raf V600E激酶结构域KD(激酶失活型)，B-Raf KD(激酶失活型)，B-Raf激酶结构域，B-Raf激酶结构域KD(激酶失活型)，前列腺特异性抗原(PSA)，血凝素HA1(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12C(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)”；
组分(II)选自“霍乱毒素B亚基(CTB，CtxB)，大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LTB)，破伤风毒素(TT)”；
组分(III)a)选自“和Hly分泌系统的组分一起的大肠杆菌HlyA溶血素转运信号(在hly特异性启动子的控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)”；
组分(IV)选自“大肠杆菌hly基因座的内源启动子”；
其中组分(I)和组分(II)连接在一起以使得能够表达由两个组分编码的融合蛋白并且其中该融合蛋白被分泌。
根据组分(I)至(IV)及优选的实施方案的上述举例说明的微生物在下文中称为本发明的微生物。
本发明的微生物有利地适合于在肿瘤治疗中使用，在肿瘤靶向中作为活疫苗。即借助用作遗传信息的载体的本发明的微生物，异源抗原和蛋白毒素一起转运到肿瘤位点，以融合蛋白形式表达并且在原位分泌。
本发明的微生物令人惊讶地并且有利地通过被转运、编码和表达的毒素-抗原融合蛋白的有效的和较高的表达和分泌来表征，即不出现细胞质和/或周质集体。
此外，与口服施用的蛋白疫苗相比(其诱导免疫系统的全身性耐受)，通过本发明的微生物的施用，令人惊讶地引起强的全身性细胞免疫系统应答。
更显著地，除了诱导Th1型全身性细胞免疫系统应答，本发明的微生物还诱导MHC I类限制性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)的活化并且强烈地增强该CTL免疫应答。
进一步地，除了强的细胞全身性Th1和CTL免疫系统应答的诱导和/或增强，令人惊讶地，先天免疫系统，例如NK细胞，NKT细胞和/或λ-δT细胞也通过本发明的微生物以协同方式被活化。
如果霍乱毒素用作毒素组分，则本发明的微生物具有这样的优势，即在人体中通常不存在抗该毒素的预先存在的免疫性(与例如破伤风毒素相反，由于在儿童期间接种抗破伤风疫苗)。因此，优选使用霍乱毒素和/或其亚基，特别是CtxB。
本发明的微生物特别适合于在基于活疫苗的靶向肿瘤(免疫)治疗中口服施用。从而，能够实现提高的患者依从性。
然而，本发明的微生物不仅限于在肿瘤治疗中使用。主要地，本发明的微生物还适用于所有这些疾病的治疗和/或预防，所述的疾病需要这样的治疗，其中全身性细胞Th1免疫系统应答的诱导是必须的。此类感染性疾病的实例包括但不限于HIV，流感病毒，HCV和其他病毒性疾病，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，单核细胞增生利斯特菌和其他细菌性疾病。
本发明的微生物优选适用于疾病如流行性感冒的治疗，其需要通过粘膜免疫系统应答和全身性细胞免疫应答的组合的最佳的保护。另外，它们可用于过敏性疾病中Th1样免疫性的特异性诱导，所述过敏性疾病例如过敏性鼻炎。在此类情况下，抗原可以是与蛋白毒素组分融合的过敏原并且各个疫苗的作用原理是免疫应答从抗过敏反应(疾病)中的过敏原的Th2为主的免疫应答向Th1免疫应答的转变。
施用的优选方式为口服施用。在优选的实施方案中，根据本发明的沙门氏菌菌株在合适的介质中发酵，通过离心收获和清洗并且随后用合适的物质配制和稳定并进行冻干。将冻干的物质装入包含数目优选在109至1010个细菌之间的活细胞的胃抗性胶囊。胶囊用液体口服摄取。
可选地，上述冻干的细菌和包含能够中和胃酸的缓冲剂的囊剂(sachet)一起分布(药物试剂盒)。在优选的实施方案中，该缓冲剂为碳酸盐缓冲剂。紧在使用前，用水制备该缓冲剂并摄取，然后立即用水混合摄取冻干的细菌。
另一个可选方案使用冷冻的细菌。在这种情况下，清洗后，细菌经由稳定剂(优选蔗糖(succhrose)或甘油)稳定，然后冷冻并在-80℃保存，优选以109至1010个细菌每剂量的浓度。该制剂优选在上述药物试剂盒中与碳酸盐缓冲剂结合使用。
在优选的实施方案中，提供包含至少一种本发明的微生物(优选至少一种本发明的冻干微生物)和药学上可接受的载体(优选胶囊)的药物组合物。
根据本发明的组分(I)至(IV)通过本领域技术人员公知的方法导入本发明的微生物。如果微生物指细菌，则将组分插入质粒或表达载体中，并且将该质粒或表达载体转移到细菌中。适用于制备本发明的质粒，表达载体和微生物的分子生物学克隆和转化技术是本领域技术人员公知的并且为常规的实验操作。
本发明的另一个主题为包含本发明的微生物的药物制剂的施用。施用为局部的或全身性的，例如口服，经口，经直肠，表皮内，皮下组织内，肌肉组织内，体腔内，器官内，肿瘤内或血液循环内施用。
此类药物制剂为例如在药剂师熟悉的，适用于注射的溶液中的本发明的微生物的悬浮液。
本发明的特别的主题为用于治疗和/或预防疾病的根据本发明的药物的经口或直肠施用。施用可以是一次或数次。在每次施用时，施用大约10至1011个本发明的微生物。如果施用这一数目的本发明的微生物不能引起足够的免疫反应，则必须增加待注射的数目。
施用本发明的微生物后，呈递组分(I)的细胞，例如肿瘤细胞，或肿瘤源自其的组织细胞的耐受被破坏，并且触发抗肿瘤和/或它的组织细胞的强的全身性免疫应答。依靠组分(I)的选择，该细胞免疫反应只抗肿瘤或还抗包含肿瘤细胞的组织细胞(肿瘤细胞源自于其)。
在另一方面，本发明的目的已经通过提供包含含有上述遗传组分(I)至(IV)的至少一种本发明的微生物或至少一种本文所定义的药物组合物的药物而解决。
在优选的实施方案中，本发明的微生物能够用于制备用于治疗和/或预防生理学和/或病理生理学病况的药物，所述的病况选自“不受控制的细胞分裂，恶性肿瘤，良性肿瘤，实体瘤，肉瘤，癌，过度增殖性疾病，类癌，尤文肉瘤(Ewing sarcoma)，卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)，脑肿瘤，源自脑和/或神经系统和/或脑脊膜的肿瘤，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，胃癌，肾癌，肾细胞癌，前列腺癌(prostate cancer)，前列腺癌变(prostate carcinomas)，结缔组织肿瘤，软组织肉瘤，胰腺肿瘤，肝肿瘤，头部肿瘤，颈部肿瘤，食管癌，甲状腺癌，骨肉瘤，视网膜母细胞瘤，胸腺瘤，睾丸癌，肺癌，支气管癌，乳腺癌，乳癌，肠癌，结直肠肿瘤，结肠癌，直肠癌，妇科肿瘤，卵巢肿瘤(ovaryt umors)/卵巢的肿瘤(ovariantumors)，子宫癌，宫颈癌(cervical cancer)，宫颈癌变(cervixcarcinomas)，子宫体癌，子宫体癌变(corpus carcinomas)，子宫内膜癌(endometrial carcinomas)，尿膀胱癌(urinary bladdercancer)，膀胱癌(bladder cancer)，皮肤癌，基底细胞瘤，肌脊瘤(spinaliomas)，黑色素瘤，眼内黑色素瘤，白血病，慢性白血病，急性白血病，淋巴瘤，感染，病毒性或细菌性感染，流行性感冒，慢性炎症，器官排斥和/或自身免疫性疾病”。
细菌感染包括但不限于炭疽，细菌性脑膜炎，肉毒中毒(botulism)，布鲁氏菌病，弯曲菌病(campylobacteriosis)，猫抓病，霍乱，白喉，流行性斑疹伤寒，脓疱病，军团病，麻风(汉森氏病)，钩端螺旋体病(leptospirosis)，利斯特氏菌病(listeriosis)，莱姆病(lyme disease)，类鼻疽，MRSA感染，诺卡氏菌病，百日咳(pertussis，whooping cough)，鼠疫，肺炎球菌性肺炎，鹦鹉热，Q热，洛矶山斑点热(Rocky Mountain SpottedFever)(RMSF)，沙门氏菌病，猩红热，志贺氏菌病，梅毒，破伤风，沙眼，肺结核，土拉菌病(tularemia)，伤寒，斑疹伤寒，泌尿道感染，细菌引起的心脏病。
病毒感染包括但不限于AIDS，AIDS相关复合症(ARC)，禽痘(水痘)，感冒，巨细胞病毒感染，科罗拉多蜱热，登革热，埃博拉出血热，手足口病，肝炎，单纯疱疹，带状疱疹，HPV，流行性感冒(flu)，拉沙热，麻疹，马尔堡出血热，传染性单核细胞增多症，腮腺炎，脊髓灰质炎，进行性多灶性脑白质病，狂犬病，风疹，SARS，天花(痘疮)，病毒性脑炎，病毒性肠胃炎，病毒性脑膜炎，病毒性肺炎，西尼罗病(West Nile disease)，黄热病。
慢性炎症或慢性炎性疾病包括但不限于，慢性胆囊炎，支气管扩张，类风湿性关节炎，桥本甲状腺炎，炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)，硅肺病和其他尘肺病。
自身免疫性疾病包括但不限于，全身性综合征，例如SLE，干燥综合征，硬皮病，类风湿性关节炎和多发性肌炎以及局部综合征，例如IDDM，桥本甲状腺炎，爱迪生氏病(Addison′s disease)，寻常性天疱疹，银屑病，特应性皮炎，过敏综合征，哮喘，自身免疫性溶血性贫血，多发性硬化。
用于治疗和/或预防本文所描述和定义的生理学和/或病理生理学病况的根据所有本文描述的实施方案的包含本文所定义的至少一种微生物或本文所定义的至少一种药物组合物的相应的药物也包含在本发明中。
在另一个方面，本发明的目的通过提供包含本文所述的组分(I)至(IV)的质粒或表达载体而解决。优选是携带至少一个包含本文所述的组分(I)至(IV)的质粒或表达载体的本发明的微生物。
在另一方面，本发明的目的通过提供用于制备本发明的微生物的方法而解决，其中制备如本文所述的质粒或表达载体，并且用该质粒或表达载体转化微生物。
在另一方面，本发明的目的通过提供包含至少一种本发明的微生物或如上所述的药物组合物或如上所述的药物以及药学上可接受的缓冲剂(优选碳酸盐缓冲剂)的药物试剂盒而解决。
附图简介
图1描述了大肠杆菌溶血素A(hlyA)分泌信号的核苷酸序列(5’→3’)。下划线为NsiI位点。
图2描述了大肠杆菌溶血素I型转运系统的大肠杆菌溶血素B(hlyB)的核苷酸序列(5’→3’)。
图3描述了大肠杆菌溶血素I型转运系统的大肠杆菌溶血素D(hlyD)的核苷酸序列(5’→3’)。
图4描述了不具有信号肽的人前列腺特异性抗原(PSA)的核苷酸序列(5’→3’)，登录号M26663(智人(Homo sapiens)前列腺特异性抗原mRNA，完整cds)，区域100-807(相应的肽：AA26-261)。
图5描述了不具有信号肽的霍乱毒素B亚基(CtxB)的核苷酸序列(5’→3’)，其包含登录号K01170(霍乱肠毒素A2亚基(γ)的霍乱弧菌toxA和toxB基因)的区域204-494。
图6描述了人B-raf蛋白(BRAF)的B-Raf激酶结构域(B-Raf KD)的核苷酸序列(5’→3’)，登录号M95712(智人B-raf蛋白(BRAF)mRNA，完整cds)，包含V600E突变的不具有区域1448-1477的区域1403-2359(相应的肽：不具有AA463-472的AA448-766)。
图7描述了人HLA B27限制性B-Raf V600E表位的核苷酸序列(5’→3’)。
图8描述了CtxB-PSA-HlyA的基因融合构建体的核苷酸序列(5’→3’)。
图9描述了Ctx-B-Raf V600E-HlyA的基因融合构建体的核苷酸序列(5’→3’)。
图10描述了CtxB-B-Raf V600E激酶结构域KD-HlyA的基因融合构建体的核苷酸序列(5’→3’)。
图11描述了pMKhly-PSA-CtxB的不同细菌物种的重组体中PSA-CtxB融合蛋白的功能性表达和分泌。
图12描述了作为对在用不同活疫苗载体免疫的小鼠中的CD8+T细胞和先天免疫系统(NK细胞)应答的测量的IFN-γ分泌脾细胞。
图13描述了对用不同活疫苗载体的免疫应答的肿瘤体积的减小。
图14描述了作为对小鼠中的CD8+T细胞和先天免疫系统(NK细胞)应答的测量的IFN-γ分泌脾细胞，所述小鼠用具有不同免疫学佐剂与CtxB-OVA融合构建体的不同活疫苗免疫。
图15描述了在兽医疫苗菌株中鸡流感病毒血凝素H1-CtxB融合蛋白的有效表达和功能性分泌，所述的融合蛋白具有H5N1血凝素(HA1+HA2，描述为HA12)的全长序列，不具有跨膜区域(HA12c)。活的减毒的肠沙门氏菌鼠伤寒血清型(Salmonella enterica serovarTyphimurium)vacT(gyrA D87G)和活的减毒的肠沙门氏菌肠炎血清型(Salmonella enterica serovar Enteritidis)vacE，(Sm24/Rif12/Ssq菌株)，都得自LOHMANN ANIMAL HEALTH GMBH & COKG。
图16描述了编码CtxB-HA12c-HlyA融合蛋白的核苷酸序列。
图17描述了利用电穿孔到伤寒沙门氏菌Ty21a菌株和其他细菌菌株中的载体pMBKDC的融合蛋白的表达和分泌：
A)道A1-A3：使用用于检测的抗B-Raf抗体的根据TPStMoBKDC的上清液分析。道A1：伤寒沙门氏菌Ty21a pMoBKDC，A2：伤寒沙门氏菌Ty21a，A3：鼠伤寒沙门氏菌aroA。
用上面的箭头标记融合蛋白BRaf-V600E KD-CtxB并且其具有预期的约48kDa的分子量。蛋白分子量标准：Invitrogen Bench-MarkPre-Stained protein ladder，#10748-010。
B)和A中等价的分析，使用新制备的抗HlyA抗体作为检测抗体。道1，2：StMoPC构建体，道3：伤寒沙门氏菌Ty21a MoBKDC；道4：大肠杆菌MoBKDC，道5：伤寒沙门氏菌Ty21a，道6：鼠伤寒沙门氏菌aroA。蛋白分子量标准：Invitrogen BenchMark Pre-Stainedprotein ladder，#10748-010，Lot.1315592。
图18描述了空载体pMKhly1的全核苷酸序列(5’→3’)。
所有引用的参考文献和专利的内容通过引用以其全文并入本文。通过下列实施例更详细的说明本发明，但是本发明不限于此。
实施例
实施例1：在不同细菌载体菌株中PSA-CtxB融合蛋白的构建，表达和分泌
为了证明大肠杆菌I型溶血素分泌系统分泌肿瘤抗原的融合蛋白的可行性和功效，在此，前列腺特异性抗原(PSA)，和作为佐剂的蛋白毒素组分，在此为CtxB，PSA-CtxB融合蛋白如本文所述进行构建。测试在不同革兰氏阴性菌菌株中的表达和分泌，所述的革兰氏阴性菌菌株潜在地用作肿瘤治疗中的活疫苗菌株。分子生物学克隆基于质粒/表达载体pMOhly1，其之前已经被描述过(Gentschev等人，2005；Gentschev等人，1996，WO 03/072789)。
1A卡那霉素抗性pMOhly1表达载体衍生物的构建
如在(Datsenko和Wanner，2000)中描述的，进行pMOhly1氨苄青霉素抗性盒的替换。
简单而言，有义引物P1(5′-GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTC CCTTTTTTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′)和反义引物P2(5′-GCGATCTGTC TATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCATATGAATATCCTCCTTA-3′)和作为模板的质粒pKD4用于PCR以产生携带卡那霉素抗性基因(KanR)的片段，所述基因侧翼于与氨苄青霉素抗性基因同源的区域(加下划线的)。
在转化PCR片段前，包含pKD46质粒和靶质粒pMOhly1的大肠杆菌菌株BW25114在37℃下在添加有0.2％L-(+)-阿拉伯糖的LB培养基(Difco)中培养3-4小时。
转化后，将细菌细胞铺到包含25μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上并在37℃下过夜温育。
第二天，挑选KanR克隆并在包含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中另外温育48小时以除去所有赋予氨苄青霉素抗性的质粒。
最后，选择具有KanR和氨苄青霉素敏感表型的克隆。通过PCR和测序证实KanR盒对ApR基因的取代。所得的质粒称为pMKhly1。
1B pMKhly-PSA质粒的克隆
有义引物PSA-Nsi1(5′-GATTGGTGATGCATCCCTCAT-3′；下划线为NsiI限制性位点)和反义引物PSA-Nsi2(5′-GGTGCTCATGCATTGGCCACG-3′)用于通过PCR扩增编码PSA的DNA片段。在Thermal Cycler 60(Biometra，Germany)中进行PCR，以94℃1分钟，54℃1分钟，72℃2分钟循环30次。
用NsiI限制性酶消化后，将携带psa基因的DNA片段插入输出载体pMKhly1的单一NsiI位点中。从大肠杆菌DH5α(Invitrogene，Germany)分离所得的质粒pMKhly-PSA，并通过限制性酶切进行分析并测序。
1C pMKhly-PSA/CtxB质粒的克隆
有义引物Ptac-SalI(5′-AAAAAAGTCGACGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGC-3′)和反义引物Ptac-NotI(5′-AAAAAAGCGGCCGCGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCC-3′)用于通过PCR扩增来自pGEX-6p-1-质粒(Amersham Bioscience，Germany)的编码Ptac启动子的201bp的DNA片段。在T3 thermocycler(Biometra，Germany)中进行PCR：以95℃30秒，55℃30秒，72℃90秒循环30次。有义引物Rbs-NotI-正向(5′-AAAAAAGCGGCCGCTAAGGATGAATTATGATTAAATTAAAATTTGG-3′)和反义引物ctb-SalI-反向(5′-TTTATAGTCGACTTAATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGC-3′)用于通过PCR扩增编码核糖体结合位点的413bp DNA片段和来自霍乱弧菌El tor的CtxB全编码序列。在T3Thermocycler(Biometra，Germany)中进行PCR：步骤1：以95℃30秒，50℃30秒和72℃2分钟循环30次。用Qiaquick PCRPurification Kit(Qiagen，Germany)纯化和用NotI限制性酶消化两个片段后，将两个片段连接，获得594bp Ptac-ctxB片段。纯化所得的片段并且用SalI限制性酶消化后，将Ptac-ctxB片段插入到输出载体pMKhly-PSA的单一SalI位点中。从大肠杆菌DH5α(Invitrogene，Germany)分离所得的质粒pMKhly-PSA/CtxB，分析并测序。
1D PSA-CtxB-HlyA融合构建体的克隆
正义引物5′ctxB NsiI(5′-GCATATGCACATGCATCACCTCAAAATATTACTGAT-3′)和反义引物3′ctxB SrfI NsiI(5′-GGCTTTTTTATATCTTATGCAT
Figure A20078004457600531
Figure A20078004457600532
ATTGCGGCAATCGC-3′)(粗体为SrfI位点)用于通过PCR扩增代表来自霍乱弧菌El tor的ctxB基因的～300bp DNA片段。用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Germany)纯化和用NsiI限制性酶消化后，将携带全长ctxB基因而不具有N末端信号序列的DNA片段插入到输出载体pMKhly1的单一NsiI位点中。从大肠杆菌DH5α(Life Technologies)分离所得的质粒pMKhly-CtxB，分析并测序。通过PCR用引物5-PSA-Blunt(5′-GTGGGAGGCTGGGAGTGC-3′)和3-PSA-Blunt(5′-GGGGTTGGCCACGATGGT-3′)从质粒pCDNA3PSA扩增人psa基因。在Thermal Cycler 60(Biometra，
Figure A20078004457600541
Germany)中进行PCR，以94℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟循环30次。然后将0.7kbDNA产物克隆到pMKhly-CtxB的SrfI位点中。通过限制性酶切分析和测序验证所得的质粒pMKhly-CtxB-PSA。
1E融合蛋白在不同细菌种中的表达和分泌
使用标准电穿孔法，将质粒pMKhly-CtxB-PSA转化到不同的电转感受态细菌菌株中。挑选单个卡那霉素抗性克隆并且在BHI培养基中培养(Beckton Dickinson，USA：牛脑，浸出物200g，6.0g/L；牛心，浸出物250g，9.8g/L；蛋白胨10.0g/L；氯化钠溶液5.0g/L；葡萄糖2.0g/L；磷酸氢二钠2.5g/L)至1×109个细胞每ml的密度。培养后，将20ml培养物在Heraeus离心机中在4℃以4000rpm(3000g)离心30分钟。将18ml上清液转移到新鲜试管中。然后，加入1.8ml TCA(三氯乙酸，Applichem，Germany)，混合液体并在冰上温育至少1小时。温育后，将悬浮液在Heraeus离心机中在4℃以4000rpm(3000g)离心30分钟。移去上清液并用1ml丙酮p.a.(Applichem，Germany)清洗沉淀。沉淀物在Heraeus离心机中在4℃以4000rpm(3000g)离心10分钟。沉淀进行风干并且用具有或不具有β-巯基乙醇(Laemmli，1970)的150μl 5x Laemmli缓冲液(70mM Tris-HCl，pH 6.8，40％(v/v)甘油，3％(v/v)十二烷基硫酸钠，5％(v/v)2-巯基乙醇和0.05％(w/v)溴酚蓝)进行处理。在SDS PAGE中的各道使用20μl溶液。分离的蛋白经电泳转移到(Western印迹)Hybond ECL硝化纤维素膜(Amer-sham-Pharmacia，Little Chalfont，UK)并且用包含1％BSA的PBS(0.20g/l氯化钾，0.20g/l磷酸二氢钾，8.00g/l氯化钠，1.15g/l无水磷酸氢二钠)封闭过夜。用PBS-Tween 0.05％清洗膜，用多克隆兔抗PSA抗体(1∶750，DAKO，Denmark)，CtxB抗体(1∶1000，Zytomed，Berlin，Germany)或HlyAs抗体(Gentschev等，1996))温育，然后用HRP偶联的抗兔IgG(1/2,000；Dianova，Hamburg，Germany)温育1小时。用增强的化学发光试剂盒(GE Healthcare LifeScience，Germany)对Western印迹显影。
图11描述了在不同的细菌菌株中PSA-CtxB融合蛋白的功能性表达和分泌，所述细菌菌株包括大肠杆菌的种(Escherichia coli spp.)，都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)，柠檬酸杆菌属的种(Citrobacter spp)，伤寒沙门氏菌Ty21a，鼠伤寒沙门氏菌的种，欧文氏菌属的种(Erwinia spp)和弗氏志贺氏菌的种。
表达和分泌PSA-CtxB融合蛋白的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株保藏在德意志微生物保藏中心(German Collection of Microorganismsand Cell Cultures)(DSMZ)，保藏号为DSM19244。
实施例2：用分泌肿瘤抗原和CtxB的融合蛋白或分泌单独的CtxB的沙门氏菌菌株免疫的小鼠中抗肿瘤细胞攻击的免疫应答和保护
通过以下实验，在动物肿瘤模型中证明肿瘤抗原和蛋白毒素的分泌性融合蛋白的较高的保护功效。对于这个模型，将表达和分泌CtxB-PSA融合蛋白的菌株鼠伤寒沙门氏菌aroA(SL7207)pMKhly-CtxB-PSA与其他对照菌株进行比较。
2A免疫方法
以3周的间隔免疫DBA/2小鼠三次。为了用细菌免疫，通过胃内施用50μl 7％NaHCO3来预处理动物以增加胃内pH。预处理后5-10分钟，胃内施用在体积为100μl的PBS中的5×108个活的卡那霉素不敏感的细菌。作为对照，如(Fensterle等人，2005)中所描述用编码PSA的裸质粒DNA(pcDNA-PSA)肌内免疫小鼠。
2B T细胞应答
最后一次免疫7天后，如之前所公开的(Fensterle等人，1999)，通过使脾通过网眼然后裂解红细胞来制备经免疫的小鼠的脾细胞。根据(Fensterle等人，1999)中公开的方法，进行ELISPOT分析，以检测PSA特异性CD8+T细胞。
简单而言，用于PSA特异性CD8+T细胞的离体分析的96孔硝化纤维素板(Millititer HA；Millipore，Bedford，MA)用在pH 9.6的100μl碳酸盐缓冲液(Fensterle等，1999)中的5μg/ml抗小鼠IFN-γ单克隆抗体(mAb)R4(PharMingen)进行包被。在4℃温育过夜和用含1％BSA的PBS封闭后，将来自经免疫的小鼠的1×105个脾细胞加入每孔100μl RP10中(Fensterle等人，1999)。
对于CD8+T细胞应答的分析，使用表达PSA的P815细胞克隆PPSA24；简单来说，该克隆经由由质粒pCDNA3编码的CMV启动子表达全长PSA(Fensterle等人，2005)。在37℃，5％CO2，在30U/ml IL-2存在下温育20-22小时后，清洗平板并且用100μl生物素化的抗小鼠IFN-γmAb XMB1.2(0.25μg/ml，PharMingen)另外温育2小时。清洗平板并且在100μl 1/20,000稀释的碱性磷酸酶-偶联的链霉亲和素(PharMingen)的存在下，在37℃温育1小时。通过加入50μl溶于水中的即用的底物BCIP/NBT(Sigma，St.Louis，MO)显现斑点。在解剖显微镜下以3倍放大倍率对斑点计数。
肽特异性T细胞(CTL)的频率表达为每105个脾细胞的IFN-γ分泌细胞的数目。对于再刺激后T细胞应答的分析，用2×106个经辐射处理的表达PSA的P815细胞(Fensterle等，2005)在RP10培养基(Fensterle等，1999)中，在60U/ml重组IL-2存在下再刺激2.5×107个脾细胞5天。如上所述，用与4×105个饲养细胞(＝来自首次用于实验的DBA/2小鼠的新鲜制备的脾细胞)混合的不同量的再刺激细胞(105，3×104，104或3×103每孔)和105个PPSA24细胞进行ELISPOT分析。
细胞免疫应答的诱导，尤其是CD8+细胞毒性T细胞的诱导对肿瘤治疗的功效具有重要的作用(Boon等人，2006；Rosenberg，2001)。因此，首先测试携带pMKhly-CtxB-PSA表达载体的重组细菌菌株鼠伤寒沙门氏菌(SL7207)诱导PSA特异性CD8+T细胞免疫应答的功效。
为了这一目的，如本文所描述，用重组SL7207/pMKhly-CtxB(n＝10)，SL7207/pMKhly-CtxB-PSA(n＝10)，SL7207/pMKhly-PSA(n＝10)，SL7207/pMKhly-PSA/CxtB(n＝10)，SL7207/pMKhly1(n＝7)和作为阳性对照的裸pcDNA3-PSA(n＝10)p.o.免疫10-14周龄的64只雌性DBA-2小鼠。
图12展示ELISPOT数据，其揭示经DNA免疫的小鼠表现出显著的CD8+T细胞应答。再刺激后，在用分泌与CtxB融合的PSA蛋白的沙门氏菌接种的动物中检测到显著的免疫应答，而在分泌单独的PSA或分别分泌PSA和CtxB的菌株中没有检测到显著的免疫应答。有趣的是，用分泌单独的CtxB毒素的沙门氏菌接种的动物在再刺激后也表现出显著的免疫应答。这些应答很可能是由于先天免疫系统的NK细胞或其他细胞引起，所述细胞非特异性识别靶细胞系。因此，从分泌单独的CtxB的数据可以推断观察到的针对分泌性CtxB-PSA融合蛋白的免疫应答(分泌IFN-γ的脾细胞)由CD8+T细胞应答和先天免疫系统(很可能是NK细胞)的显著应答组成。
2C抗肿瘤细胞攻击的保护
为了分析免疫的保护能力，按照上述程序免疫每组6-7只小鼠。第三次免疫两周后，通过将1×106个细胞s.c.注射到剃毛的腹部皮肤两侧内两次，用PPSA 24攻击小鼠(见上文)。在14天期间内监测小鼠的肿瘤外观，通过测量最大(a)和最小(b)的肿瘤直径来评估肿瘤体积。使用如下公式，按照旋转椭球计算肿瘤体积：
V = π 6 * a * b 2 , a＞b.。
通过单因素ANOVA和Dunnett’s多重比较事后检验(Dunnett′smultiple comparison post-test)使用Graph Pad Prism软件分析结果的显著性。仅当ANOVA表现出显著性时，进行事后检验。
图13以平均值+/-SD表示结果。在第6，9，12和14天观察到显著的保护功效。如所预期的，所包括的作为对照的裸DNA疫苗接种完全保护小鼠避免肿瘤生长。然而，裸DNA疫苗接种在人体中至多表现出中等功效。关于细菌构建体，疫苗菌株SL7207/pMKhly-CtxB-PSA(表达和分泌CtxB-PSA融合蛋白)表现为最有效。其在肿瘤攻击后的第9，12和14天显著减小了肿瘤体积。引人注意的是，在第14天，就数值而言，菌株SL7207/pMKhly-CtxB对肿瘤生长的降低也与SL7207/pMKhly-CtxB-PSA相当。尽管不显著，但这一延迟效应与在ELISPOT试验中测量到的细胞应答非常一致。此外，SL7207/pMKhly-PSA菌株在第14天也实现了显著的保护，这表明该菌株也诱导低于检测阈的T细胞应答。相反，SL7207/pMKhly-PSA/CxtB菌株不诱导相关效应并且保持在与单独的SL7207/pMKhly1相同的范围。
实施例3：伤寒沙门氏菌Ty21a中癌基因-毒素融合蛋白的表达和分泌
与实施例1相似，使用另一个肿瘤抗原——在激酶结构域具有10个氨基酸缺失的癌基因B-Raf V600E的激酶结构域(BRaf V600E激酶结构域激酶失活型(KD)，或简称BRaf*KD，更简单称为BKD)。该癌基因和作为佐剂的蛋白毒素组分，在此为CtxB，BKD-CtxB融合蛋白如本文所述进行构建。在人疫苗菌株伤寒沙门氏菌Ty21a中证明表达和分泌。分子克隆基于质粒/表达载体pMOhly1，其之前已被描述(Gentschev等人，2005；Gentschev等人，1996)并且克隆方法与本申请实施例1相似。所得的载体命名为pMBKDC。该融合蛋白的序列在图10中给出。
图17描述了使用电穿孔到伤寒沙门氏菌Ty21a菌株和其他细菌菌株中的载体pMBKDC的融合蛋白的表达和分泌。
表达和分泌BKD-CtxB融合蛋白的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株保藏在德意志微生物保藏中心(German Collection of Microorganisms andCell Cultures)(DSMZ)，保藏号为DSM 19245。
实施例4：OVA-CtxB融合构建体与不同的遗传编码的免疫学佐剂的比较
为了比较通过活疫苗分泌的毒素-抗原融合蛋白的免疫学功效，构建包含对免疫学研究来说广泛使用的抗原，鸡卵清蛋白(OVA)和CtxB的融合蛋白。
有义引物NsiI-OVA-正向5′-CAT GTA TGC ATT AGC CAT GGTATA CCT GG-3′和反义引物NsiI-OVA-反向5′-TTT TTT ATG CATAAG GG AAA CAC CAC ATC TGC C-3′用于通过PCR扩增代表ova基因(NM205152)的1033bp DNA片段。用QIAquick PCR PurificationKit(Qiagen，Germany)纯化并用NsiI限制性酶消化后，将携带不具有N末端信号序列的完整ova基因的DNA片段插入输出载体pMKhly1的单一NsiI位点中。从大肠杆菌DH5α(Life Technologies)分离所得的质粒pMKhly-Ova，分析并测序。
使用有义引物5′ctxB NsiI(5′-GCATATGCACATGCATCACCTCAAAATATTACTGAT-3′)和反义引物3′ctxB SrfI NsiI(5′-GGCTTTTTTATATCTTATGCAT ATTGCGGCAATCGC-3′)(粗体为SrfI位点)通过PCR扩增表示来自霍乱弧菌El tor的ctxB基因的～300bp DNA片段。用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Germany)纯化和用NsiI限制性酶消化后，将携带不具有N末端信号序列的完整ctxB基因的DNA片段插入输出载体pMKhly1的单一NsiI位点中。从大肠杆菌DH5α(Life Technologies)分离所得的质粒pMKhly-CtxB，分析并测序。用5-OVA-SfrI GCC ATC ATG TCA GCT CTA和3-OVA-SfrI AGG GGA AAC ACA TCT GCC引物通过PCR从pCI-OVA质粒扩增ova基因。在Thermal Cycler 60(Biometra，
Figure A20078004457600592
Germany)中进行PCR，以94℃1分钟，49℃1分钟和72℃2分30秒循环30次。然后将1.1-kb DNA产物克隆到pMKhly-CtxB的SrfI位点中。通过限制性酶切分析和测序检验所得的pMKhly-CtxB-OVA质粒。
将该融合蛋白引起Th1免疫应答的能力与和编码干扰素(IFN-γ)，白介素(IL-12)和趋化因子(IP-10)的DNA递送质粒(编码在真核启动子控制下的蛋白)相结合的仅编码分泌性OVA的pMKhly载体的能力进行比较。
如上述的进行免疫程序和ELISPOT分析。简单来说，用不同菌株口服免疫C57BL/6小鼠三次。最终免疫后7天，取出脾细胞，再刺激5天并且在ELISPOT测定中进行分析。为了再刺激脾细胞，使用用SIINFEKL肽(字母表示氨基酸)，卵清蛋白的H-2b限制性MHC-I表位脉冲的细胞。
图14展示与共递送IFN-γ或IP-10的构建体相比，包含鸡卵清蛋白(OVA)和CtxB的融合蛋白在诱导OVA特异性CD8+T细胞应答和潜在的先天免疫系统应答中的较高的功效。其表现出与具有共递送IL-12构建体的菌株相似的功效。
实施例5：病毒抗原的表达和分泌
通过在兽医疫苗菌株，鼠伤寒沙门氏菌VacT中表达与CtxB融合的鸡流感病毒H5N1的血凝素H1蛋白，证明本发明的微生物用于分泌和表达任意(非肿瘤的)抗原的适宜性。
在PCR中使用有义引物5`-HA-G：5′-ATC TGT CAA ATG GAG AAA-3′和反义引物3-HA12C：5`-TAC TCC ACT TAT TTC CTC TCT-3`扩增编码不具有C末端膜结构域的H5的DNA片段(H12C)。然后将PCR产物克隆到pMKhly-CtxB的SrfI位点中。通过限制性酶切分析和测序检验所得的pMKhly-CtxB-H12C质粒。鼠伤寒沙门氏菌VacT/pMKhly-CtxB-H12C菌株有效地表达和分泌杂合的H5蛋白，如通过用抗CtxB和HlyA的多克隆抗体的免疫印迹所示(图2)。在实验条件下，分泌的H5的量为2-3μg蛋白/ml上清液。
在BHI培养基中培养细菌达到1×109个细胞每毫升的密度。20ml培养物在Hereaus离心机中在4℃以4000rpm(3000g)离心30′。将18ml上清液转移入新鲜试管中。然后，加入1.8ml TCA(三氯乙酸，Applichem，Germany)；混合液体并且在冰上温育至少1小时。温育后，悬浮液在Hereaus离心机中在4℃以4000rpm(3000g)离心30′。移去上清并且用1ml丙酮p.a.(Applichem，Germany)清洗沉淀；沉淀物在Hereaus离心机中在4℃以4000rpm(3000g)离心10′。风干沉淀并用150μl 5x Laemmli缓冲液进行处理。在SDS PAGE中各道使用20μl溶液。分离的蛋白电泳转移到Hybond ECL硝化纤维素膜(Amersham-Pharmacia，Little Chalfont，U.K.)并且用含1％BSA的PBS封闭过夜。在PBS-Tween 0.05％中清洗膜，用多克隆兔抗CtxB抗体(1∶1000，Zytomed，Berlin，Germany)或HlyAs抗体(Gentschev等人，1996)温育，然后用HRP-偶联的抗兔IgG(1/2,000；Dianova，Hamburg，Germany)温育1小时。用增强的化学发光试剂盒(GEHealthcare Life Science，Germany)进行Western印迹。
图15描述了在兽医疫苗菌株，鼠伤寒沙门氏菌VacT中HA12C-CtxB融合蛋白的有效表达和功能性分泌。
实施例6：经由III型分泌系统的毒素佐剂和肿瘤抗原的融合蛋白的表达和分泌
一些革兰氏阴性细菌具有III型分泌系统，所述分泌系统能够用于抗原分泌。通常，这些系统能够用于直接将异源抗原注射入细胞中。在该实施例中，用作分泌信号的耶尔森氏菌的毒素组分(YopE)与作为佐剂的热不稳定肠毒素B亚基(LT-B)片段和肿瘤抗原PSA基因融合。该构建体在合适的，优选减毒的耶尔森氏菌菌株中表达，其导致融合蛋白经由YopE信号序列由内源III型分泌装置分泌。
在该实施例中，将基因融合体YopE18-LT-B-PSA克隆到paCYC184质粒的EcoRI位点中，使用具有和cat基因相同的方向的构建体，产生由编码cat启动子的质粒表达的产物(http://www.fermentas.com/tecbinfo/nucleicacids/mappacyc184.htm)。为了增强表达，可以使用任何合适的启动子。
在下文中，示例了克隆方法。具有热不稳定肠毒素B亚基的大肠杆菌的染色体DNA或具有该序列(GenBank登录号AF242418)的载体用下列引物在PCR反应中进行扩增：
Eco-yope18-f(包含EcoRI位点+YopE18信号序列)：
Figure A20078004457600621
ATGAAAATATCATCATTTATTTCTACATCACTGCCCCTGCCGGCATCAGTGTCA
Figure A20078004457600622
(5’区域黑色：EcoRI位点+3碱基5’，红色：编码用于YopE蛋白的III型分泌的分泌信号的序列(aa 1-18)，GenBank登录号M92066；斜体区域：LT-B基因的同源区域(GB登录号AF242418)，碱基4-28)。
磷酸化的反向引物LT-B-r：
5’GTTTTCCATACTGATTGCCGCAATTGAATTGG-3’
(GB AF242418的反向链372-341)。
同时，如在本申请中所描述的来自载体pMK CtxB-PSA的PSA序列用下列引物进行扩增：
磷酸化的正向引物psa-f：5’-GTGGGAGGCTGGGAGTGCGAG-3’
反向引物psa-eco-r：5’CCTGAATTCTTAGACGTGATACCTTGAAGCAC
(5’黑色：EcoRI位点+3碱基5’，蓝色：终止密码子，黑色：本申请PSA序列的3’区域)
然后用DNA连接酶在合适的条件下连接这两个片段。连接后，在第二次PCR反应中用上述的Eco-yope18-f和PSA-Eco-R引物扩增新的片段。
用合适的PCR纯化试剂盒纯化所得的片段以除去缓冲液和寡核苷酸，然后用EcoRI酶在合适的反应条件下进行消化。用琼脂糖凝胶电泳纯化所得的1040bp片段并连接到EcoRI消化的载体paCYC184中。对抗四环素，cm敏感的克隆测序后，选择具有以与cm基因相同的方向整合的正确的序列的克隆，并且用电穿孔法转化到合适的耶尔森氏菌菌株中。该疫苗菌株将经由它的内源的III型分泌系统分泌LT-B-PSA融合蛋白。
实施例7：在革兰氏阳性菌中毒素-抗原融合蛋白的表达和分泌
革兰氏阳性菌和阴性菌就分泌而言具有不同的先决条件。革兰氏阴性菌具有两层膜，因此对于完整分泌来说，除分泌信号以外，分泌装置也是必须的。在革兰氏阳性菌的情况下，分泌信号序列是充分的。
在该实施例中，描述了在利斯特菌中使用p60分泌信号的用于破伤风类毒素PSA融合蛋白的分泌的系统。
在第一步中，用NsiI消化载体pUC18(PS)actAOVATinlA(Loeffler等人，2006)，然后用3’-5’核酸外切酶在适宜条件下进行处理。最后通过琼脂糖凝胶电泳纯化片段。
同时，从合适的来源，例如来自破伤风梭菌菌株的基因组DNA扩增破伤风类毒素片段C(GenBank登录号M12739)，使用下列磷酸化引物：
tetc for：5’-TAAAAATCTGGATTGTTGGGTTG-3’，下划线的额外的碱基是为了确保正确的融合框。
tetc rev：5’-ATCATTTGTCCATCCTTCATCTG-3’.
从本申请中描述的质粒pMO BKDC扩增BRAF KD片段，使用下列磷酸化的引物：
br for：5’-GATTGGGAGATTCCTGATG-3’
br rev：5’-CCCGTGGACAGGAAACGCACC-3’.
用合适的PCR纯化试剂盒纯化两个片段，然后用DNA连接酶在合适的条件下进行连接。连接后，用合适的PCR纯化试剂盒再次纯化片段并且用tetc for和br rev引物进行扩增。扩增后，经琼脂糖凝胶电泳纯化所得的2280bp片段并将其连接到经纯化的pUC18(PS)actAOVATinlA的NsiI-3’-5’核酸外切酶片段中。连接并转化到大肠杆菌中后，选择携带符合读框片段的克隆。然后，用PstI和SacI切割质粒并且用凝胶电泳纯化2837bp片段并且将其连接到适宜的经PstI和SacI消化并经纯化的载体pSP118(Loeffler等人，2006)中。
将所得的载体，pSP118-act-TetC-BRaf*KD转化到携带trpS缺失的利斯特菌菌株，例如单核细胞增生利斯特菌ΔtrpsΔaroA/B(Loeffler等，2006)中。在该环境中，该质粒经由基于质粒的trpS(“平衡致死系统”)稳定并且编码导致菌株的细胞内裂解的噬菌体赖氨酸。act-TetC-BRaf*KD盒在actA启动子控制下主要在真核宿主细胞中表达，其具有一些细胞外渗漏(Loeffler等人，2006)。该盒的actA信号序列导致TetC-BRaf*KD融合蛋白的分泌。
实施例8：真核细胞分泌毒素-抗原融合蛋白
在本实施例中，构建真核细胞系(例如肿瘤细胞系)，所述细胞系分泌CtxB-PSA融合蛋白。为了这一目的，使用通用性分泌信号(US6,733,997)，其原则上允许相应的表达盒在不同来源(包括哺乳动物细胞，酵母和原核细胞)的细胞中分泌。
在第一步中，从质粒pMO BKDC(本申请)扩增CtxB-BRaf*KD融合物，使用下列引物：
CB-for：5’-atcGGATCCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGC-3’(小写字母：间隔，下划线：BamHI位点，大写字母：CtxB 5’)
CB-rev：5’-tagGGATCC
Figure A20078004457600641
GTGGACAGGAAACGCACCATATCC-3’(小写字母：间隔，下划线：BamHI位点，斜体：终止密码子，大写字母：BRa f*KD3’)。
然后，用合适的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，然后用BamHI进行部分消化(片段包含内部BamHI位点)。经由琼脂糖凝胶电泳分离部分消化物的1231bp片段，然后将其连接到经BamHI消化并且经凝胶纯化的质粒pVtgEGFP(美国专利申请6733997)中。然后，选择携带符合读框的与Vtgss同向的插入物的克隆并且命名为pVtgCtxBRAf。该质粒可以经由电穿孔转化到真核细胞系中，其可以经由kan/neo选择盒进行选择。该细胞系可以建立用作异源癌疫苗的细胞系如癌细胞系或用作自体癌疫苗的得自患者的肿瘤细胞。
无论如何，由载体pVtgEGFP编码的与CtxB-BRaf*KD基因融合的分泌信号Vtgss将导致融合蛋白的分泌。
使用相似的方法，还能够在酵母中表达融合蛋白。作为实例，示范如US 6,733,997的图11中所描述的改进的克隆策略。在第一步中，通过EagI和Eco47III从上述的质粒pVtgCtxBRAf中切出包含Vtgss-CtxB-BRaf*KD融合物的盒并将其插入载体pBSPGK中(US6,733,997，图11)。然后，类似于US 6,733,997(图11)的描述，用SacI和HindIII消化所得的载体并且将包含PGK元件和Vtgss-CtxB-BRaf*KD融合物的片段整合到载体pYEX-S1的相应区域中。通过电穿孔能够将所得的质粒转化到酵母菌株(如酿酒酵母)中。该酵母将表达并分泌融合蛋白并且能够用于接种疫苗的目的。
缩写
ABC       ATP结合盒
AIDA      参与扩散粘着的粘附素
APC       抗原呈递细胞
aroA      aroA基因
AT        α毒素
ATP       三磷酸腺苷
B-Raf KD  B-Raf激酶结构域
BSA       牛血清白蛋白
Cag A     幽门螺杆菌的主要疾病相关的毒性蛋白
CPE       产气荚膜梭菌肠毒素
CpG       包含低甲基化的含有CpG基序的免疫刺激
          DNA序列的DNA序列
CT/Ctx    霍乱毒素
CTB/CtxB  霍乱毒素B亚基
CTL       细胞毒性CD8+T细胞(T杀伤细胞)
CMV       巨细胞病毒
DNA       脱氧核糖核酸
ds        双链
DT/Dtx      白喉毒素
E.coli      大肠杆菌
EBV         EB病毒
GM-1受体    单唾液酸神经节苷脂受体1
HA          血凝素
HCV         丙型肝炎病毒
HIV         人免疫缺陷病毒
Hly         溶血素
HPV         人乳头瘤病毒
HT          出血毒素
i.d.        皮内
i.m.        肌内
i.p.        腹膜内
IFN         干扰素
IgA         免疫球蛋白同种型A
IgG         免疫球蛋白同种型G
IL          白介素
KD          激酶失活型
LPS         脂多糖
LT          大肠杆菌热不稳定肠毒素
LT          致死毒素
LTB         大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基
mAb         单克隆抗体
MHC         主要组织相容性复合物
NK细胞      自然杀伤细胞
NKT细胞     自然杀伤T细胞
PAGE        聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS         磷酸盐缓冲液
PCR         聚合酶链式反应
PE           假单胞菌外毒素A
PSA          前列腺特异性抗原
PT/Ptx       百日咳毒素
RNA          核糖核酸
s.c.         皮下
SDS          十二烷基硫酸钠
Sec          通用分泌(Sec)途径
ss           单链
ST           大肠杆菌热稳定肠毒素
ST/Stx       志贺菌毒素
STB/StxB     志贺菌毒素B亚基
T3SS         III型分泌系统
Tat          双精氨酸转运
TCA          三氯乙酸
Th1(细胞)    炎性CD4+T细胞
Th2(细胞)    辅助CD4+T细胞
TSST-1       中毒性休克综合征毒素
TT           破伤风毒素
VT           Vero细胞毒素
参考文献
Agren，L.C.，Ekman，L.，Lowenadler，B.，Nedrud，J.G.，and Lycke，N.Y.(1999).Adju-vanticity of the cholera toxin A1-based gene fusion protein，CTA1-DD，is critically de-pendent on the ADP-ribosyltransferase and Ig-binding activity.J Immunol 162，2432-2440.
Anderson，R.J.，Pasetti，M.F.，Sztein，M.B.，Levine，M.M.，and Noriega，F.R.(2000).DeltaguaBA attenuated Shigella flexneri 2a strain CVD 1204 as a Shigella vaccine andas a live mucosal delivery system for fragment C of tetanus toxin.Vaccine 18，2193-2202.
Austin，E.A.，Graves，J.F.，Hite，L.A.，Parker，C.T.，and Schnaitman，C.A.(1990).Genetic analysis of lipopolysaccha ride core biosynthesis by Escherichia coli K-12：in-sertion mutagenesis of the rfa locus.J Bacte riol 172，5312-5325.
Balsalobre，C.，Silvan，J.M.，Berglund，S.，Mizunoe，Y.，Uhlin，B.E.，and Wai，S.N.(2006).Release of the type I secreted alpha-haemolysin via outer membrane vesiclesfrom Escherichia coli.Mol Microbiol 59，99-112.
Barry，E.M.，Gomez-Duarte，O.，Chatfield，S.，Rappuoli，R.，Pizza，M.，Losonsky，G.，Galen，J.，and Levine，M.M.(1996).Expression and immunogenicity of pertussis toxinS1 subunit-tetanus toxin fragment C fusions in Salmonella typhi vaccine strain CVD908.Infect Immun 64，4172-4181.
Becerra，J.C.，Arthur，J.F.，Landucci，G.R.，Forthal，D.N.，and Theuer，C.P.(2003).CD8+T-cell mediated tumor protection by Pseudomonas exotoxin fused to ovalbuminin C57BL/6 mice.Surgety 133，404-410.
Boon，T.，Coulie，P.G.，Van den Eynde，B.J.，and van der Bruggen，P.(2006).HumanT cell responses against melanoma.Annu Rev Immunol 24，175-208.
Boyd，A.P.，Ross，P.J.，Conroy，H.，Mahon，N.，Lavelle，E.C.，and Mills，K.H.(2005).
Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin modulates innate and adaptive immuneresponses：distinct roles for acylation and enzymatic activity in immunomodulation andcell death.J Immunol 175，730-738.
Brossier，F.，Weber-Levy，M.，Mock，M.，and Sirard，J.C.(2000).Protective antigen-mediated antibody response against a heterologous protein produced in vivo by Bacil-Ius anthracis.Infect Immun 68，5731-5734.
Bumann，D.(2D01).Regulated antigen expression in live recombinant Salmonella en-terica serovar Typhimurium strongly affects colonization capabilities and specificCD4(+)-T-cell responses.Infect Immun 69，7493-7500.
Busby，S.，and Ebright，R.H.(1994).Promoter structure，promoter recognition，andtranscription activation in prokaryotes.Cell 79，743-746.
Butterton，J.R.，Beattie，D.T.，Gardel，C.L.，Carroll，P.A.，Hyman，T.，Killeen，K.P.，Mekalanos，J.J.，and Calderwood，S.B.(1995).Heterologous antigen expression inVibrio cholerae vector strains.Infect Immun 63，2689-2696.
Byun，Y.，Ohmura，M.，Fujihashi，K.，Yamamoto，S.，McGhee，J.R.，Udaka，S.，Kiyono，H.，Takeda，Y.，Kohsaka，T.，and Yuki，Y.(2001).Nasal immunization with E.coli vero-toxin 1(VT1)-B subunit and a nontoxic mutant of cholera toxin elicits serum neutralizingantibodies.Vaccine 19，2061-2070.
Campos，J.，Martinez，E.，Marrero，K.，Silva，Y.，Rod riguez，B.L.，Suzarte，E.，Ledon，T.，and Fando，R.(2003).Novel type of specialized transduction for CTXphi or its sat-ellite phage RS1 mediated by filamentous phage VGJ phi in Vibrio cholerae.J Bacteriol185，7231-7240.
Cardenas，L.，and Clements，J.D.(1992).Oralimmunization using live attenuatedSalmonella spp.as carriers of foreign antigens.Clin Microbiol Rev 5，328-342.
Cardenas，L.，and Clements，J.D.(1993).Development of mucosal protection againstthe heat-stable enterotoxin(ST)of Escherichia coli by oral immunization with a geneticfusion delivered by a bacterial vector.Infect Immun 61，4629-4636.
Chabalgoity，J.A.，Harrison，J.A.，Esteves，A.，Demarco de Hormaeche，R.，Ehrlich，R.，Khan，C.M.，and Hormaeche，C.E.(1997).Expression and immunogenicity of anEchinococcus granulosus fatty acid-binding protein in live attenuated Salmonella vac-cine strains.Infect Immun 65，2402-2412.
Chabalgoity，J.A.，Khan，C.M.，Nash，A.A.，and Hormaeche，C.E.(1996).A Salmo-nella typhimurium htrA live vaccine expressing multiple copies of a peptide comprisingamino acids 8-23 of herpes simplex virus glycoprotein D as a genetic fusion to tetanustoxin fragment C protects mice from herpes simplex virus infection.Mol Microbiol 19，791-801.
Chabalgoity，J.A.，Moreno，M.，Carol，H.，Dougan，G.，and Hormaeche，C.E.(2000).Salmonella typhimurium as a basis for a live oral Echinococcus granulosus vaccine.Vaccine 19，460-469.
Chabalgoity，J.A.，Villareal-Ramos，B.，Khan，C.M.，Chatfield，S.N.，de Hormaeche，R.D.，and Hormaeche，C.E.(1995).Influence of preimmunization with tetanus toxoidon immune responses to tetanus toxin fragment C-guest antigen fusions in a Salmo-nella vaccine carrier.Infect Immun 63，2564-2569.
Chacon，M.R.，Londono，P.，Dougan，G.，and Selkirk，M.E.(1996).Heterologous ex-pression of the cuticular-glutath ione peroxidase of lymphatic filariae in an attenuatedvaccine strain of Salmonella typhimurium abrogates H-2 restriction of specific antibodyresponses.Parasite Immunol 18，307-316.
Chen，I.，Finn，T.M.，Yanqing，L.，Guoming，Q.，Rappuoli，R.，and Pizza，M.(1998).Arecombinant live attenuated strain of Vibrio cholerae induces immunity against tetanustoxin and Bordetella pertussis tracheal colonization factor.Infect Immun 66，1648-1653.
Cheng-hua，S.，Cheng，C.，Jing-sheng，Z.，Jiezhi.，L.，and Qing-jun，M.(1995).Genefusion of cholera toxin B subunit and HBV PreS2 epitope and the antigenicity of fusionprotein.Vaccine 13，933-937.
Clemens，J.，Savarino，S.，Abu-Elyazeed，R.，Safwat，M.，Rao，M.，Wierzba，T.，Sven-nerholm，A.M.，Holmgren，J.，Frenck，R.，Park，E.，and Naficy，A.(2004).Developmentof pathogenicity-driven definitions of outcomes for a field trial of a killed oral vaccineagainst enterotoxigenic Escherichia coli in Egypt：application of an evidence-basedmethod.J Infect Dis 189，2299-2307.
Datsenko，K.A.，and Wanner，B.L.(2000).One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA 97，6640-6645.
Dietrich，G.，Bubert，A.，Gentschev，I.，Sokolovic，Z.，Simm，A.，Catic，A.，Kaufmann，S.H.，Hess，J.，Szalay，A.A.，and Goebel，W.(1998).Delivery of antigen-encoding plas-mid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocyto-genes.Nat Biotechnol 16，181-185.
Dietrich，G.，Viret，JF，and Gentschev，I.(2003).Haemolysin A and listeriolysin-twovaccine delivery tools for the induction of cell-mediated immunity.Int.J.Parasitol 33，495-505
Dunn，G.P.，Old，L.J.，and Schreiber，R.D.(2004).The immunobiology of cancer im-munosurveillance and immunoediting.Immunity 21，137-148.
Dunstan，S.J.，Simmons，C.P.，and Strugnell，R.A.(2003).In vitro and in vivo stabilityof recombinant plasmids in a vaccine strain of Salmonella enterica var.Typhimurium.FEMS Immunol Med Microbiol 37，111-119.
Eriksson，A.M.，Schon，K.M.，and Lycke，N.Y.(2004).The cholera toxin-derivedCTA1-DD vaccine adjuvant administered intranasally does not cause inflammation oraccumulate in the nervous tissues.J Immunol 173，3310-3319.
Fath，M.J.，Skvirsky，R.C.，and Kolter，R.(1991).Functional complementation be-tween bacterial MDR-like export systems：colicin V，alpha-hemolysin，and Erwinia pro-tease.J Bacteriol 173，7549-7556.
Fensterle，J.，Grode，L.，Hess，J.，and Kaufmann，S.H.E.(1999).Effective DNA vacci-nation against listeriosis by prime/boost inoculation with the gene gun.J Immunol 163，4510-4518.
Fensterle，J.，Schwartz，V.，Riedmiller，H.，and Rapp，U.R.(2005).Animal models forDNA vaccination against prostate cancer using PSA encoding plasmids.Onkologie 28(suppl 2)，52.
Freytag，L.C.，and Clements，J.D.(1999).Bacterial toxins as mucosal adjuvants.CurrTop Microbiol Immunol 236，215-236.
Freytag，L.C.，and Clements，J.D.(2005).Mucosal adjuvants.Vaccine 23，1804-1813.
Garmory，H.S.，Brown，K.A.，and Titball，R.W.(2002).Salmonella vaccines for use inhumans：present and future perspectives.FEMS Microbiol Rev 26，339-353.
Garmory，H.S.，Titball，R.W.，Griffin，K.F.，Hahn，U.，Bohm，R.，and Beyer，W.(2003).Salmonella enterica serovar typhimurium expressing a chromosomally integrated copyof the Bacillus anthracis protective antigen gene protects mice against an anthraxspore challenge.Infect Immun 71，3831-3836.
Gentschev，I.，Dietrich，G.，and Goebel，W.(2002a).The E.coli alpha-hemolysin secre-tion system and its use in vaccine development.Trends Microbiol 10，39-45.
Gentschev，I.，Dietrich，G.，Spreng，S.，Pilgrim，S.，Stritzker，J.，Kolb-Maurer，A.，andGoebel，W.(2002b).Delivery of protein antigens and DNA by attenuated intracellularbacteria.Int J Med Microbiol 291，577-582.
Gentschev，I.，Fensterle，J.，Schmidt，A.，Potapenko，T.，Troppmair，J.，Goebel，W.，andRapp，U.R.(2005).Use of a recombinant Salmonella enterica serovar Typhimuriumstrain expressing C-Raf for protection against C-Raf induced lung adenoma in mice.BMC Cancer 5，15.
Gentschev，I.，Mollenkopf，H.，Sokolovic，Z.，Hess，J.，Kaufmann，S.H.，and Goebel，W.(1996).Development of antigen-delivery systems，based on the Escherichia colihemolysin secretion pathway.Gene 179，133-140.
Gentschev，I.，Dietrich，G.，Spreng，S.，Neuhaus，B.，Maier，E.，Benz，R.，Goebel，W.，Fensterle，J.，and Rapp，UR.(2004).Use of the alpha-hemolysin secretion system ofEscherichia coli for antigen delivery in the Salmonella typhi Ty21a vaccine strain.Int JMed Microbiol 294，363-371.
Gomez-Duarte，O.G.，Galen，J.，Chatfield，S.N.，Rappuoli，R.，Eidels，L.，and Levine，M.M.(1995).Expression of fragment C of tetanus toxin fused to a carboxyl-terminalfragment of diphtheria toxin in Salmonella typhi CVD 908 vaccine strain.Vaccine 13，1596-1602.
Hajishengallis，G.，Harokopakis，E.，Hollingshead，S.K.，Russell，M.W.，and Michalek，S.M.(1996).Construction and oral immunogenicity of a Salmonella typhimurium strainexpressing a streptococcal adhesin linked to the A2/B subunits of cholera toxin.Vac-cine 14，1545-1548.
Hajishengallis，G.，Nawar，H.，Tapping，R.I.，Russell，M.W.，and Connell，T.D.(2004).The Type II heat-labile enterotoxins LT-IIa and LT-IIb and their respective B pentamersdifferentially induce and regulate cytokine production in human monocytic cells.InfectImmun 72，6351-6358.
Harokopakis，E.，Hajishengallis，G.，Greenway，T.E.，Russell，M.W.，and Michalek，S.M.(1997).Mucosal immunogenicity of a recombinant Salmonella typhimurium-clonedheterologous antigen in the absence or presence of coexpressed cholera toxin A2 andB subunits.Infect Immun 65，1445-1454.
Hess，J.，Gentschev，I.，Miko，D.，Welzel，M.，Ladel，C.，Goebel，W.，and Kaufmann，S.H.(1996).Superior efficacy of secreted over somatic antigen display in recombinantSalmonella vaccine induced protection against listeriosis.Proc Natl Acad Sci U S A 93，1458-1463.
Holmgren，J.，Adamsson，J.，Anjuere，F.，Clemens，J.，Czerkinsky，C.，Eriksson，K.，Flach，C.F.，George-Chandy，A.，Harandi，A.M.，Lebens，M.，et al.(2005).Mucosaladjuvants and anti-infection and anti-immunopathology vaccines based on choleratoxin，cholera toxin B subunit and CpG DNA.Immunol Lett 97，181-188.
Holmgren，J.，and Czerkinsky，C.(2005).Mucosal immunity and vaccines.Nat Med 11，S45-53.
Holmgren，J.，Czerkinsky，C.，Eriksson，K.，and Mharandi，A.(2003).Mucosal immuni-sation and adjuvants：a brief overview of recent advances and challenges.Vaccine 21Suppl 2，S89-95.
Hormozi，K.，Parton，R.，and Coote，J.(1999).Adjuvant and protective properties ofnative and recombinant Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin preparations inmice.FEMS Immunol Med Microbiol 23，273-282.
Huang，Y.，Hajishengallis，G.，and Michalek，S.M.(2000).Construction and characteri-zation of a Salmonella enterica serovar typhimurium clone expressing a salivary adhe-sin of Streptococcus mutans under control of the anaerobically inducible nirB promoter.Infect Immun 68，1549-1556.
Hunt，P.D.，and Hardy，S.J.(1991).Heat-labile enterotoxin can be released from Es-cherichia coli cells by host intestinal factors.Infect Immun 59，168-171.
Jackson，R.J.，Marinaro，M.，VanCott，J.L.，Yamamoto，M.，Okahashi，N.，Fujihashi，K.，Kiyono，H.，Chatfield，S.N.，and McGhee，J.R.(1996).Mucosal immunity：regula-tion by helper T cells and a novel method for detection.J Biotechnol 44，209-216.
Jagusztyn-Krynicka，E.K.，Clark-Curtiss，J.E.，and Curtiss，R.，3rd(1993).Escherichiacoli heat-labile toxin subunit B fusions with Streptococcus sobrinus antigens expressedby Salmonella typhimurium oral vaccine strains：importance of the linker for antigenicityand biological activities of the hybrid proteins.Infect Immun 61，1004-1015.
Khan，C.M.，Villarreal-Ramos，B.，Pierce，R.J.，Demarco de Hormaeche，R.，McNeill，H.，Ali，T.，Chatfield，S.，Capron，A.，Dougan，G.，and Hormaeche，C.E.(1994a).Con-struction，expression，and immunogenicity of multiple tandem copies of the Schisto-soma mansoni peptide 115-131 of the P28 glutathione S-transferase expressed as C-terminal fusions to tetanus toxin fragment C in a live aro-attenuated vaccine strain ofSalmonella.J Immunol 153，5634-5642.
Khan，C.M.，Villarreal-Ramos，B.，Pierce，R.J.，Riveau，G.，Demarco de Hormaeche，R.，McNeill，H.，Ali，T.，Fairweather，N.，Chatfield，S.，Capron，A.，and et al.(1994b).Construction，expression，and immunogenicity of the Schistosoma mansoni P28 glu-tathione S-transferase as a genetic fusion to tetanus toxin fragment C in a live Aro at-tenuated vaccine strain of Salmonella.Proc Natl Acad Sci U S A 91，11261-11265.
Konieczny，M.P.，Suhr，M.，Noll，A.，Autenrieth，I.B.，and Alexander Schmidt，M.(2000).Cell surface presentation of recombinant(poly-)peptides including functional T-cell epitopes by the AIDA autotransporter system.FEMS Immunol Med Microbiol 27，321-332.
Koprowski，H.，2nd，Levine，M.M.，Anderson，R.J.，Losonsky，G.，Pizza，M.，and Barry，E.M.(2000).Attenuated Shigella flexneri 2a vaccine strain CVD 1204 expressingcolonization factor antigen I and mutant heat-labile enterotoxin of enterotoxigenic Es-cherichia coli.Infect Immun 68，4884-4892.
Kweon，M.N.，Yamamoto，M.，Watanabe，F.，Tamura，S.，Van Ginkel，F.W.，Miyauchi，A.，Takagi，H.，Takeda，Y.，Hamabata，T.，Fujihashi，K.，et al.(2002).A nontoxic chi-meric enterotoxin adjuvant induces protective immunity in both mucosal and systemiccompartments with reduced IgE antibodies.J Infect Dis 186，1261-1269.
Laemmli，U.K.(1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of the headof bacteriophage T4.Nature 227，680-685.
Lahiri，S.S.(2000).Bacterial toxins--an overview.J Nat Toxins 9，381-408.
Lavelle，E.C.，McGuirk，P.，and Mills，K.H.(2004).Molecules of infectious agents asimmunomodulatory drugs.Curr Top Med Chem 4，499-508.
Lee，J.J.，Sinha，K.A.，Harrison，J.A.，de Hormaeche，R.D.，Riveau，G.，Pierce，R.J.，Capron，A.，Wilson，R.A.，and Khan，C.M.(2000).Tetanus toxin fragment C ex-pressed in live Salmonella vaccines enhances antibody responses to its fusion partnerSchistosoma haematobium glutathione S-transferase.Infect Immun 68，2503-2512.
Loeffler，D.I.，Schoen，C.U.，Goebel，W.，and Pilgrim，S.(2006).Comparison of differ-ent live vaccine strategies in vivo for delivery of protein antigen or antigen-encodingDNA and mRNA by virulence-attenuated Listeria monocytogenes.Infect Immun 74，3946-3957.
Loessner，M.J.，Wendlinger，G.，and Scherer，S.(1995).Heterogeneous endolysins inListeria monocytogenes bacteriophages：a new class of enzymes and evidence forconserved holin genes within the siphoviral lysis cassettes.Mol Microbiol 16，1231-1241.
Lycke，N.(2005).From toxin to adjuvant：basic mechanisms for the control of mucosalIgA immunity and tolerance.Immunol Lett 97，193-198.
Lycke，N.，Tsuji，T.，and Holmgren，J.(1992).The adjuvant effect of Vibrio choleraeand Escherichia coli heat-labile enterotoxins is linked to their ADP-ribosyltransferaseactivity.Eur J Immunol 22，2277-2281.
McSorley，S.J.，Rask，C.，Pichot，R.，Julia，V.，Czerkinsky，C.，and Glaichenhaus，N.(1998).Selective tolerization of Th1-like cells after nasal administration of a choleratoxoid-LACK conjugate.Eur J Immunol 28，424-432.
Mendelson，I.，Gat，O.，Aloni-Grinstein，R.，Altboum，Z.，Inbar，I.，Kronman，C.，Bar-Haim，E.，Cohen，S.，Velan，B.，and Shafferman，A.(2005).Efficacious，nontoxigenicBacillus anthracis spore vaccines based on strains expressing mutant variants of lethaltoxin components.Vaccine 23，5688-5697.
Mesnage，S.，Weber-Levy，M.，Haustant，M.，Mock，M.，and Fouet，A.(1999).Cell sur-face-exposed tetanus toxin fragment C produced by recombinant Bacillus anthracisprotects against tetanus toxin.Infect Immun 67，4847-4850.
Michalkiewicz，J.，Stachowski，J.，Barth，C.，Patzer，J.，Dzierzanowska，D.，andMadalinski，K.(1999).Effect of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A on IFN-gammasynthesis：expression of costimulatory molecules on monocytes and activity of NKcells.Immunol Lett 69，359-366.
Michl，P.，and Gress，T.M.(2004).Bacteria and bacterial toxins as therapeutic agentsfor solid tumors.Curr Cancer Drug Targets 4，689-702.
Morona，R.，Manning，P.A.，and Reeves，P.(1983).Identification and characterizationof the TolC protein，an outer membrane protein from Escherichia coli.J Bacteriol 153，693-699.
Muhlen，K.A.，Schumann，J.，Wittke，F.，Stenger，S.，Van Rooijen，N.，Van Kaer，L.，and Tiegs，G.(2004).NK cells，but not NKT cells，are involved in Pseudomonasaeruginosa exotoxin A-induced hepatotoxicity in mice.J Immunol 172，3034-3041.
Mutsch，M.，Zhou，W.，Rhodes，P.，Bopp，M.，Chen，R.T.，Linder，T.，Spyr，C.，andSteffen，R.(2004).Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk ofBell′s palsy in Switzerland.N Engl J Med 350，896-903.
Orr，N.，Galen，J.E.，and Levine，M.M.(1999).Expression and immunogenicity of amutant diphtheria toxin molecule，CRM(197)，and its fragments in Salmonella typhivaccine strain CVD 908-htrA.Infect Immun 67，4290-4294.
Poggi，A.，Spada，F.，Costa，P.，Tomasello，E.，Revello，V.，Pella，N.，Zocchi，M.R.，and Moretta，L.(1996).Dissection of lymphocyte function-associated antigen 1-dependent adhesion and signal transduction in human natural killer cells shown by theuse of cholera or pertussis toxin.Eur J Immunol 26，967-975.
Pogonka，T.，Klotz，C.，Kovacs，F.，and Lucius，R.(2003).A single dose of recombinantSalmonella typhimurium induces specific humoral immune responses against heterolo-gous Eimeria tenella antigens in chicken.Int J Parasitol 33，81-88.
Ramirez，R.，Carracedo，J.，Zamzami，N.，Castedo，M.，and Kroemer，G.(1994).Per-tussis toxin inhibits activation-induced cell death of human thymocytes，pre-B leukemiacells and monocytes.J Exp Med 180，1147-1152.
Ranallo，R.T.，Fonseka，C.P.，Cassels，F.，Srinivasan，J.，and Venkatesan，M.M.(2005).Construction and characterization of bivalent Shigella flexneri 2a vaccinestrains SC608(pCFAI)and SC608(pCFAI/LTB)that express antigens from enterotoxi-genic Escherichia coli.Infect Immun 73，258-267.
Reveneau，N.，Geoffroy，M.C.，Locht，C.，Chagnaud，P.，and Mercenier，A.(2002).Comparison of the immune responses induced by local immunizations with recombi-nant Lactobacillus plantarum producing tetanus toxin fragment C in different cellularlocations.Vaccine 20，1769-1777.
Roland，K.L.，Tinge，S.A.，Killeen，K.P.，and Kochi，S.K.(2005).Recent advances inthe development of live，attenuated bacterial vectors.Curr Opin Mol Ther 7，62-72.
Rosenberg，S.A.(2001).Progress in human tumour immunology and immunotherapy.Nature 411，380-384.
Ryan，E.T.，Butterton，J.R.，Smith，R.N.，Carroll，P.A.，Crean，T.I.，and Calderwood，S.B.(1997a).Protective immunity against Clostridium difficile toxin A induced by oralimmunization with alive，attenuated Vibrio cholerae vector strain.Infect Immun 65，2941-2949.
Ryan，E.T.，Butterton，J.R.，Zhang，T.，Baker，M.A.，Stanley，S.L.，Jr.，and Calder-wood，S.B.(1997b).Oral immunization with attenuated vaccine strains of Vibrio chol-erae expressing a dodecapeptide repeat of the serine-rich Entamoeba histolytica pro-tein fused to the cho lera toxin B subunit induces systemic and mucosal antiamebic andanti-V.cholerae antibody responses in mice.Infect Immun 65，3118-3125.
Sanchez，J.，Wallerstrom，G.，Fred riksson，M.，Angstrom，J.，and Holmgren，J.(2002).Detoxification of cholera toxin without removal of its immunoadjuvanticity by the addi-tion of(STa-related)peptides to the catalytic subunit.A potential new strategy to gen-erate immunostimulants for vaccination.J Biol Chem 277，33369-33377.
Sanchez，AE.，Aquino，G.，Ostoa-Saloma，P.，Laclette，JP.，and Rocha-Zavaleta，L.(2004).Cholera toxin B-subunit gene enhances mucosal Immunoglobulin A，Th1-typeand CD8+cytotoxic responses when co-administeredintradermally with a DNA vac-cine.Clinic Diagnost Laborat Immun 11，711-719.
Schmid-Grendelmeier，P.，and Crameri，R.(2001).Recombinant allergens for skin test-ing.Int Arch Allergy Immunol125，96-111.
Schodel，F.，Enders，G.，Jung，M.C.，and Will，H.(1990).Recognition of a hepatitis Bvirus nucleocapsid T-cell epitope expressed as a fusion protein with the subunit B ofEscherichia coli heat labile enterotoxin in attenuated salmonellae.Vaccine 8，569-572.
Shaw，C.A.，and Stambach，M.N.(2003).Using Modified Bacterial Toxins to DeliverVaccine Antigens.ASM News 69，384-389.
Silva，A.J.，Mohan，A.，and Benitez，J.A.(2003).Cholera vaccine candidate 638：in-tranasal immunogenicity and expression of a foreign antigen from the pulmonarypathogen Coccidioides immitis.Vaccine 21，4715-4721.
Smerdou，C.，Anton，I.M.，Plana，J.，Curtiss，R.，3rd，and Enjuanes，L.(1996).A con-tinuous epitope from transmissible gastroenteritis virus S protein fused to E.coliheat-labile toxin B subunit expressed by attenuated Salmonella induces serum and secre-tory immunity.Virus Res 41，1-9.
Somner，E.A.，Ogun，S.A.，Sinha，K.A.，Spencer Valero，L.M.，Lee，J.J.，Harrison，J.A.，Holder，A.A.，Hormaeche，C.E.，and Khan，C.M.(1999).Expression of disulphide-bridge-dependent conformational epitopes and immunogenicity of the carboxy-terminal19 kDa domain of Plasmodium yoelii merozoite surface protein-1 in live attenuatedSalmonella vaccine strains.Microbiology 145(Pt 1)，221-229.
Sory，M.P.，and Cornelis，G.R.(1990).Delivery of the cholera toxin B subunit by usinga recombinant Yersinia enterocolitica strain as a live oral carrier.Res Microbiol 141，921-929.
Spangrude，G.J.，Sacchi，F.，Hill，H.R.，Van Epps，D.E.，and Daynes，R.A.(1985).Inhibition of lymphocyte and neutrophil chemotaxis by pertussis toxin.J Immunol 135，4135-4143.
Su，G.F.，Brahmbhatt，H.N.，de Lorenzo，V.，Wehland，J.，and Timmis，K.N.(1992).Extracellular export of Shiga toxin B-subunit/haemolysin A(C-terminus)fusion proteinexpressed in Salmonella typhimurium aroA-mutant and stimulation of B-subunit specificantibody responses in mice.Microb Pathog 13，465-476.
Thungapathra，M.，Sharma，C.，Gupta，N.，Ghosh，R.K.，Mukhopadhyay，A.，Koley，H.，Nair，G.B.，and Ghosh，A.(1999).Construction of a recombinant live oral vaccine froma non-toxigenic strain of Vibrio cholerae O1 serotype inaba biotype E1 Tor and as-sessment of its reactogenicity and immunogenicity in the rabbit model.Immunol Lett68，219-227.
Todar，K.(2002).Mechanism of bacterial pathogenicity：protein toxins.Todar′s OnlineTextbook of Bacteriology.：http://textbookofbacteriology.net/proteintoxins.html.
Tzschaschel，B.D.，Guzman，C.A.，Timmis，K.N.，and de Lorenzo，V.(1996a).AnEscherichia coli hemolysin transport system-based vector for the export of polypep-tides：export of Shiga-like toxin IleB subunit by Salmonella typhimurium aroA.Nat Bio-technol 14，765-769.
Tzschaschel，B.D.，Klee，S.R.，de Lorenzo，V.，Timmis，K.N.，and Guzman，C.A.(1996b).Towards a vaccine candidate against Shigella dysenteriae 1：expression ofthe Shiga toxin B-subunit in an attenuated Shigella flexneri aroD carrier strain.MicrobPathog 21，277-288.
van Ginkel，F.W.，Jackson，R.J.，Yuki，Y.，and McGhee，J.R.(2000).Cutting edge：the mucosal adjuvant cholera toxin redirects vaccine proteins into olfactory tissues.JImmunol 165，4778-4782.
Vertiev，Y.V.，Zdanovsky，A.G.，Shevelev，A.B.，Borinskaya，S.A.，Gening，E.L.，Martin，T.，Ivanov，P.A.，and Yankovsky，N.K.(2001).Recombinant Listeria strainsproducing the nontoxic L-chain of botulinum neurotoxin A in a soluble form.Res Micro-biol 152，563-567.
Walker，M.J.，Rohde，M.，Timmis，K.N.，and Guzman，C.A.(1992).Specific lung mu-cosal and systemic immune responses after oral immunization of mice with Salmonellatyphimurium aroA，Salmonella typhi Ty21a，and invasive Escherichia coli expressingrecombinant pertussis toxin S1 subunit.Infect Immun 60，4260-4268.
Ward，S.J.，Douce，G.，Figueiredo，D.，Dougan，G.，and Wren，B.W.(1999).Immuno-genicity of a Salmonella typhimurium aroA aroD vaccine expressing a nontoxic domainof Clostridium difficile toxin A.Infect Immun 67，2145-2152.
Wiener，M.C.(2000).Bacterial export takes its Tol.Structure 8，R171-175.
Wu，S.，Beier，M.，Sztein，M.B.，Galen，J.，Pickett，T.，Holder，A.A.，Gomez-Duarte，O.G.，and Levine，M.M.(2000).Construction and immunogenicity in mice of attenuatedSalmonella typhi expressing Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1(MSP-1)fused to tetanus toxin fragment C.J Biotechnol 83，125-135.
Zheng，J.P.，Zhang，Z.S.，Li，S.Q.，Liu，X.X.，Yuan，S.L.，Wang，P.，Zhan，D.W.，Wang，L.C.，and Huang，C.F.(2005).Construction of a novel Shigella live-vectorstrain co-expressing CS3 and LTB/STm of enterotoxigenic E.coli.World J Gastroen-terol11，3411-3418.
Zhu，C.，Ruiz-Perez，F.，Yang，Z.，Mao，Y.，Hackethal，V.L.，Greco，K.M.，Choy，W.，Davis，K.，Butterton，J.R.，and Boedeker，E.C.(2006).Delivery of heterologous proteinantigens via hemolysin or autotransporter systems by an attenuated ler mutant of rabbitenteropathogenic Escherichia coli.Vaccine 24，3821-3831.
序列表
<110>Zentaris GmbH
<120>作为编码抗原和蛋白毒素的核苷酸序列的载体的微生物，其制备方法和用途
<130>PCT 06/02 Z
<140>PCT/EP2007/062237
<141>2007-11-13
<150>EP 06123974.5
<151>2006-11-13
<150>US 60/939,140
<151>2007-05-21
<150>US 60/865,484
<151>2006-11-13
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atacagttaa tacaaaagac tgttatgatc atcaacctat ggttgggagc acacctggtt   1200
atttccgggg atttaagtat tggtcagtta attgctttta atatgcttgc tggtcagatt   1260
gttgcaccgg ttattcgcct tgcacaaatc tggcaggatt tccagcaggt tggtatatca   1320
gttacccgcc ttggtgatgt gcttaactct ccaactgaaa gttatcatgg gaaactgaca   1380
ttgccggaaa ttaatggtga tatcactttt cgtaatatcc ggtttcgcta taaacctgat   1440
tctccggtta ttttggacaa tatcaatctt agtattaagc agggggaggt tattggtatt   1500
gtcggacgtt ctggttcagg aaaaagcaca ttaactaaat taattcaacg tttttatatt   1560
cctgaaaatg gccaggtatt aattgatgga catgatcttg cgttggccga tcctaactgg   1620
ttacgtcgtc aggtgggggt tgtgttgcag gacaatgtgc tgcttaatcg cagtattatt   1680
gataatattt cactggctaa tcctggcatg tccgtcgaaa aagttattta tgcagcgaaa   1740
ttagcaggtg ctcatgattt tatttctgaa ttgcgtgagg ggtataacac cattgtcggg   1800
gaacaggggg caggattatc cggaggtcaa cgtcaacgca tcgcaattgc aagggcgctg   1860
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ttatatcagt tacagtcaga ctaa                                         2124
<210>31
<211>1437
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工DNA序列
<400>31
atgaaaacat ggttaatggg gttcagcgag ttcctgttgc gctataaact tgtctggagt    60
gaaacatgga aaatccggaa gcaattagat actccggtac gtgaaaagga cgaaaatgaa   120
ttcttacccg ctcatctgga attaattgaa acgccagtat ccagacggcc gcgtctggtt   180
gcttatttta ttatggggtt tctggttatt gcttttattt tatctgtttt aggccaagtg   240
gaaattgttg ccactgcaaa tgggaaatta acacacagtg ggcgtagtaa agaaattaaa   300
cctattgaaa actcaatagt taaagaaatt atcgtaaaag aaggagagtc agtccggaaa   360
ggggatgtgt tattaaagct tacagcactg ggagctgaag ctgatacgtt aaaaacacag   420
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gaattaaata aactacctga actaaagctt cctgatgagc cttattttca gaatgtatct   540
gaagaggaag tactgcgttt aacttctttg ataaaagaac agttttccac atggcaaaat   600
cagaagtatc aaaaagaact gaatttggat aagaaaagag cagagcgatt aacagtactt   660
gcccgtataa accgttatga aaatttatca agggttgaaa aaagccgtct ggatgatttc   720
agtagtttat tgcataaaca ggcaattgca aaacatgctg tacttgagca ggagaataaa   780
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工DNA序列
<400>32
gtgggaggct gggagtgcga gaagcattcc caaccctggc aggtgcttgt ggcctctcgt     60
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acaggccagg tatttcaggt cagccacagc ttcccacacc cgctctacga tatgagcctc    240
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ttgaccccaa agaaacttca gtgtgtggac ctccatgtta tttccaatga cgtgtgtgcg    480
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<212>DNA
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<223>人工DNA序列
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cctcaaaata ttactgattt gtgtgcagaa taccacaaca cacaaatata tacgctaaat     60
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<212>DNA
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<220>
<223>人工DNA序列
<400>34
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aagagtaata atatatttct tcatgaagac ctcacagtaa aaataggtga ttttggtcta    420
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<212>DNA
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<212>DNA
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tgaaacagta caggacgtca tgctgggagc agtggaacgc cgctttggca gcgagcttcc    1680
ggcgtctcca gtggagtggc tgacggataa tggttcatgc taccgggcga atgaaacacg    1740
tcagttcgcc aggatgttgg gacttgaacc gaagaacacg gcagtgcgga gtccggagag    1800
taacggaata acagagagct tcgtgaaaac gataaagcgt gattacataa gtatcatgcc    1860
caaaccagac gggttaacgg cagcaaagaa ccttgcagag gcgttcgagc attataacga    1920
atggcatccg catagtgcgc tgggttatcg ctcgccacgg gaatatctgc ggcagcgggc    1980
cagtaatggg ttaagtgata acaggtatct ggaaatatag gggcaaatcc acctggtcat    2040
tatctggaat ttgacgaagt gtgataactg gtatagccag attaatctaa acctttgtct    2100
gacaaaatca gataaagaag agtagttcaa aagacaactc gtggactctc attcagagag    2160
ataggcgtta ccaaaatttg tttggaactg aacaagaaaa ttgtatttgt gtaactataa    2220
tcttaatgta aaataaaaga caccagttct gtagaatatg cttattgaag agagtgtaat    2280
aataatttta tatagatgtt gtacaaagaa caggaatgag taattattta tgcttgatgt    2340
tttttgactc ttgcttttta tagttattat ttttaagtta gtcagcgcaa taaaaacttg    2400
cttttaatat taatgcgagt tatgacatta aacggaagaa acataaaggc atatttttgc    2460
cacaatattt aatcatataa tttaagttgt agtgagttta ttatgaatat aaacaaacca    2520
ttagagattc ttgggcatgt atcctggcta tgggccagtt ctccactaca cagaaactgg    2580
ccagtatctt tgtttgcaat aaatgtatta cccgcaatac aggctaacca atatgtttta    2640
ttaacccggg atgattaccc tgtcgcgtat tgtagttggg ctaatttaag tttagaaaat    2700
gaaattaaat atcttaatga tgttacctca ttagttgcag aagactggac ttcaggtgat    2760
cgtaaatggt tcattgactg gattgctcct ttcggggata acggtgccct gtacaaatat    2820
atgcgaaaaa aattccctga tgaactattc agagccatca gggtggatcc caaaactcat    2880
gttggtaaag tatcagaatt tcatggaggt aaaattgata aacagttagc gaataaaatt    2940
tttaaacaat atcaccacga gttaataact gaagtaaaaa gaaagtcaga ttttaatttt    3000
tcattaactg gttaagaggt aattaaatgc caacaataac cactgcacaa attaaaagca    3060
cactgcagtc tgcaaagcaa tccgctgcaa ataaattgca ctcagcagga caaagcacga    3120
aagatgcatt agcctatgga agtcagggtg atcttaatcc attaattaat gaaatcagca    3180
aaatcatttc agctgcaggt agcttcgatg ttaaagagga aagaactgca gcttctttat    3240
tgcagttgtc cggtaatgcc agtgattttt catatggacg gaactcaata accctgacca    3300
catcagcata atatattaat ttaaatgata gcaatcttac tgggctgtgc cacataagat    3360
tgctattttt tttggagtca taatggattc ttgtcataaa attgattatg ggttatacgc    3420
cctggagatt ttagcccaat accataacgt ctctgttaac ccggaagaaa ttaaacatag    3480
atttgataca gacgggacag gtctgggatt aacgtcatgg ttgcttgctg cgaaatcttt    3540
agaactaaag gtaaaacagg taaaaaaaac aattgatcga ttaaacttta tttttctgcc    3600
cgcattagtc tggagagagg atggacgtca ttttattctg actaaaatca gcaaagaagt    3660
aaacagatat cttatttttg atttggagca gcgaaatccc cgtgttctcg aacagtctga    3720
gtttgaggcg ttatatcagg ggcatattat tcttattact tcccgttctt ctgttaccgg    3780
gaaactggca aaatttgact ttacctggtt tattcctgcc attataaaat acaggagaat    3840
atttattgaa acccttgttg tatctgtttt tttacaatta tttgcattaa taacccccct    3900
ttttttccag gtggttatgg acaaagtatt agtgcacagg gggttttcaa cccttaatgt    3960
tattactgtt gcattatctg ttgtagtggt gtttgagatt atactcagcg gtttaagaac    4020
ttacattttt gcacatagta caagtcggat tgatgttgag ttgggtgcca aactcttccg    4080
gcatttactg gcgctaccga tctcttattt tgagagtcgt cgtgttggtg atactgttgc    4140
gagggtaaga gaattagacc agatccgtaa ttttctgaca ggacaggcat taacatctgt    4200
tttggactta ttattttcac tcatattttt tgcggtaatg tggtattaca gcccaaagct    4260
tactctggtg atcttatttt cgctgccttg ttatgctgca tggtctgttt ttattagccc    4320
cattttgcga cgtcgccttg atgataagtt ttcacggaat gcggataatc aatctttcct    4380
ggtggaatca gtaacggcga ttaacactat aaaagctatg gcagtctcac ctcagatgac    4440
gaacatatgg gacaaacaat tggcaggata tgttgctgca ggctttaaag tgacagtatt    4500
agcaaccatt ggtcaacaag gaatacagtt aatacaaaag actgttatga tcatcaacct    4560
atggttggga gcacacctgg ttatttccgg ggatttaagt attggtcagt taattgcttt    4620
taatatgctt gctggtcaga ttgttgcacc ggttattcgc cttgcacaaa tctggcagga    4680
tttccagcag gttggtatat cagttacccg ccttggtgat gtgcttaact ctccaactga    4740
aagttatcat gggaaactga cattgccgga aattaatggt gatatcactt ttcgtaatat    4800
ccggtttcgc tataaacctg attctccggt tattttggac aatatcaatc ttagtattaa    4860
gcagggggag gttattggta ttgtcggacg ttctggttca ggaaaaagca cattaactaa    4920
attaattcaa cgtttttata ttcctgaaaa tggccaggta ttaattgatg gacatgatct    4980
tgcgttggct gatcctaact ggttacgtcg tcaggtgggg gttgtgttgc aggacaatgt    5040
gctgcttaat cgcagtatta ttgataatat ttcactggct aatcctggca tgtccgtcga    5100
aaaagttatt tatgcagcga aattagcagg cgctcatgat tttatttctg atttgcgtga    5160
ggggtataac accattgtcg gggaacaggg ggcaggatta tccggaggtc aacgtcaacg    5220
catcgcaatt gcaagggcgc tggtgaacaa ccctaaaata ctcatttttg atgaagcaac    5280
cagtgctctg gattatgagt cggagcatgt catcatgcgc aatatgcaca aaatatgtaa    5340
gggcagaacg gttataatca ttgctcatcg tctgtctaca gtaaaaaatg cagaccgcat    5400
tattgtcatg gaaaaaggga aaattgttga acagggtaaa cataaggagc tgctttctga    5460
accggaaagt ttatacagtt acttatatca gttacagtca gactaacaga aagaacagaa    5520
gaatatgaaa acatggttaa tggggttcag cgagttcctg ttgcgctata aacttgtctg    5580
gagtgaaaca tggaaaatcc ggaagcaatt agatactccg gtacgtgaaa aggacgaaaa    5640
tgaattctta cccgctcatc tggaattaat tgaaacgcca gtatccagac ggccgcgtct    5700
ggttgcttat tttattatgg ggtttctggt tattgctttt attttatctg ttttaggcca    5760
agtggaaatt gttgccactg caaatgggaa attaacacac agtgggcgta gtaaagaaat    5820
taaacctatt gaaaactcaa tagttaaaga aattatcgta aaagaaggag agtcagtccg    5880
gaaaggggat gtgttattaa agcttacagc actgggagct gaagctgata cgttaaaaac    5940
acagtcatca ctgttacagg ccaggctgga acaaactcgg tatcaaattc tgagcaggtc    6000
aattgaatta aataaactac ctgaactaaa gcttcctgat gagccttatt ttcagaatgt    6060
atctgaagag gaagtactgc gtttaacttc tttgataaaa gaacagtttt ccacatggca    6120
aaatcagaag tatcaaaaag aactgaattt ggataagaaa agagcagagc gattaacagt    6180
acttgcccgt ataaaccgtt atgaaaattt atcaagggtt gaaaaaagcc gtctggatga    6240
tttcagtagt ttattgcata aacaggcaat tgcaaaacat gctgtacttg agcaggagaa    6300
taaatatgtc gaagcagtaa atgaattacg agtttataaa tcacaactgg agcaaattga    6360
gagtgagata ttgtctgcaa aagaagaata tcagcttgtt acgcagcttt ttaaaaatga    6420
aattttagat aagctaagac aaacaacaga caacattggg ttattaactc tggaattagc    6480
gaaaaatgaa gagcgtcaac aggcttcagt aatcagggcc ccagtttcgg gaaaagttca    6540
gcaactgaag gttcatactg aaggtggggt tgttacaaca gcggaaacac tgatggtcat    6600
cgttccggaa gatgacacgc tggaggttac tgctctggta caaaataaag atattggttt    6660
tattaacgtc gggcagaatg ccatcattaa agtggaggca tttccttata cacgatatgg    6720
ttatctggtg ggtaaggtga aaaatataaa tttagatgca atagaagacc agagactggg    6780
acttgttttt aatgttatta tttctattga agagaattgt ttgtcaaccg ggaataaaaa    6840
cattccatta agctcgggta tggcagtcac tgcagaaata aagacaggta tgcgaagtgt    6900
aatcagttat cttcttagtc ctttagaaga gtcagtaaca gaaagtttac gtgagcgtta    6960
agtttcagaa gtccagtatt tgctgctata cgtgctgcgt ggcacttgcc gtctgaacgg    7020
cattgatccg gaagccaagt caaacaacag cgtgatgagc gtcagggcaa aacaccaagg    7080
ctctctcgat gacaccagaa caaattgaaa tacgtgagct gaggaaaaag ctaccgagtt    7140
cttgatgttg gactccctga acagttctct gtaatcggga aactcaggac gcgttatcct    7200
gtggtcacac tctgccatgt gtttagggtt catcacagca gctacagata ctggtaaaac    7260
cgtcctgaaa aaccagacgg cagacgggct gtattacgta gtcaggtact tgagctacat    7320
ggcatcagtc acggtttggc cggagcaaga cgtatcacca caatggcaac ccggagaggt    7380
gtcagcgcca gtgatataag acggttaacg gttaaaaatc gtggcgttga caacatccca    7440
gtggactgag gtcacacagg cctggcagca ttcctcttcc ggccggatga cccggatttc    7500
acggggaaag tacgccgata acagtttacg ggctgaagat tggcgtaggg aggatagcag    7560
acgttttgcc gcccccattg tctggagttg ggtgagaagg catcatttca ccaacaccaa    7620
catttcacag ttacacccca cagctacatg aagcgcttcc atgaattatc gctttgattt    7680
atcatgttaa aatagctcta cacggttggt tcaggattgc gcaccgaaac cctctaaaat    7740
ccactgacgc gcctgcgaat tatccagcac cgcgcctttc gagatcctct acgccggacg    7800
catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat    7860
caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg    7920
tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt    7980
ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga    8040
gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt    8100
ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca    8160
actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg    8220
gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca    8280
agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg    8340
catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc    8400
cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat    8460
gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct    8520
taccagccta acttcgatca ttggaccgct gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc    8580
gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc ctataccttg tctgcctccc    8640
cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctcgacc tgaatggaag ccggcggcac    8700
ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt ggagccaatc aattcttgcg gagaactgtg    8760
aatgcgcaaa ccaacccttg gcagaacata tccatcgcgt ccgccatctc cagcagccgc    8820
acgcggcgca tctcgggcag cgttgggtcc tggccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg    8880
tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg    8940
atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca    9000
tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc    9060
accattatgt tccggatctg catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca    9120
tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc    9180
cataccgcca gttgtttacc ctcacaacgt tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta    9240
acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat gaacagaaat    9300
cccccttaca cggaggcatc agtgaccaaa caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc    9360
tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa    9420
caggcagaca tctgtgaatc gcttcacgac cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc    9480
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca    9540
gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt    9600
ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc    9660
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac    9720
cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg    9780
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa    9840
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc    9900
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc    9960
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat   10020
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc   10080
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct   10140
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg   10200
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc   10260
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga   10320
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa   10380
ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta   10440
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc   10500
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg   10560
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga   10620
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg   10680
agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct   10740
gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccatatg aatatcctcc ttagttccta    10800
ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcag agcgcttttg aagctggggt    10860
gggcgaagaa ctccagcatg agatccccgc gctggaggat catccagccg gcgtcccgga    10920
aaacgattcc gaagcccaac ctttcataga aggcggcggt ggaatcgaaa tctcgtgatg    10980
gcaggttggg cgtcgcttgg tcggtcattt cgaaccccag agtcccgctc agaagaactc    11040
gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac    11100
gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc    11160
tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg    11220
gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc    11280
gccgtcgggc atgcgcgcct tgagcctggc gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg    11340
ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc    11400
gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg    11460
ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag    11520
atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc    11580
gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc    11640
ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg    11700
cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata    11760
gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat    11820
catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg atcagatctt gatcccctgc gccatcagat    11880
ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac tttgcagggc ttcccaacct taccagaggg    11940
cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg    12000
ccatgtaagc ccactgcaag ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca    12060
gatagcccag tagctgacat tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta    12120
cgtgttccgc ttcctttagc agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgggggatc    12180
ttgaagttcc tattccgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc gaagcagctc    12240
cagcctacac caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc    12300
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt    12360
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca    12420
cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg    12480
aggccctttc gtcttcaaga attctcatgt ttgacagctt atcatcgatg gacattattt    12540
ttgtggagcc ggaggaaaca gaccagacgg ttcagatgag gcgcttacca ccagaaccgc    12600
tgttgtccca ccattctggc gattcccaaa cgctatttgg ataaaaagta gccttaacgt    12660
ggtttatttt cc                                                12672

Claims (20)

1.作为编码抗原和蛋白毒素的核苷酸序列的载体的微生物，其包含下列组分：
(I)编码至少一个野生型或突变的蛋白的至少一个完整或部分抗原的至少一个核苷酸序列；和
(II)编码至少一个蛋白毒素和/或至少一个蛋白毒素亚基的至少一个核苷酸序列；和
(III)a)编码至少一个转运系统的至少一个核苷酸序列，所述的转运系统使得能够在微生物的外表面上表达组分(I)和组分(II)的表达产物和/或使得能够分泌组分(I)和组分(II)的表达产物；和/或编码使得能够分泌组分(I)和组分(II)的表达产物的至少一个信号序列的至少一个核苷酸序列；和/或
b)任选地，编码用于裂解哺乳动物细胞的胞质溶胶中的微生物且用于细胞内释放包含在裂解的微生物中的质粒或表达载体的至少一个蛋白的至少一个核苷酸序列；和
(IV)用于表达组分(I)至(III)的一个或多个的至少一个活化序列的至少一个核苷酸序列，其中所述的活化序列能够在微生物中活化和/或是组织细胞特异性的，肿瘤细胞特异性的，巨噬细胞特异性的，树突特异性的，淋巴细胞特异性的，功能特异性的或非细胞特异性的；
其中组分(I)至(IV)的任何一个能够以一倍或几倍存在并且如果组分(I)至(IV)的组分以几倍存在，则其相互独立地可以是相同的或不同的。
2.根据权利要求1的微生物，其中组分(I)和组分(II)不相同，即组分(I)不编码编码至少一个蛋白毒素和/或至少一个蛋白毒素亚基的至少一个核苷酸序列。
3.根据权利要求1至2中任一项的微生物，其中所述微生物选自“细菌，革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，真核细胞”并且优选选自“埃希氏菌属的种，大肠杆菌，沙门氏菌属的种，伤寒沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，耶尔森氏菌属的种，小肠结肠炎耶尔森氏菌，弧菌属的种，霍乱弧菌，利斯特氏菌属的种，单核细胞增生利斯特氏菌，志贺氏菌属的种，弗氏志贺氏菌，耶尔森氏菌属的种，假单胞菌属的种”，其中优选微生物的毒力被减弱。
4.根据权利要求3的微生物，其中霍乱弧菌排除在所述微生物之外。
5.根据权利要求1至4中任一项的微生物，其中根据组分(I)的至少一个野生型或突变蛋白的至少一个完整或部分抗原选自下列野生型蛋白和它们已知的突变体：“受体；受体的胞外，跨膜或胞内部分；黏着分子；黏着分子的胞外，跨膜或胞内部分；信号转导蛋白；细胞周期蛋白；转录因子；分化蛋白；胚胎蛋白；病毒蛋白；过敏原；微生物病原体蛋白；真核病原体蛋白；癌-睾丸抗原蛋白；肿瘤抗原蛋白；和/或组织细胞特异性蛋白”，其中所述组织细胞选自“甲状腺，乳腺，唾液腺，淋巴结，乳腺，胃粘膜，肾，卵巢，前列腺，宫颈，膀胱浆膜和痣”。
6.根据权利要求5，其中根据组分(I)的至少一个野生型或突变蛋白的至少一个完整或部分抗原选自下列野生型蛋白和它们的已知的突变体：“Her-2/neu，雄激素受体，雌激素受体，肝素结合生长因子受体，EGF受体，ERBB2，ERBB4，TRAIL受体，FAS，TNFα受体，TGF-β受体，乳铁蛋白受体，碱性髓磷脂，α-乳清蛋白，GFAP，纤维酸性蛋白，酪氨酸酶，EGR-1，MUC1，c-Raf(Raf-1)，A-Raf，B-Raf，B-Raf V599E，B-Raf V600E，B-Raf KD，B-Raf V600E激酶结构域，B-Raf V600E KD，B-Raf V600E激酶结构域KD，B-Raf激酶结构域，B-Raf激酶结构域KD，N-Ras，K-Ras，H-Ras，Bcl-2，Bcl-X，Bcl-W，Bfl-1，Brag-1，Mcl-1，A1，Bax，BAD，Bak，Bcl-Xs，Bid，Bik，Hrk，Bcr/abl，Myb，C-Met，IAP1，IAO2，XIAP，ML-IAP LIVIN，存活素，APAF-1，细胞周期蛋白D(1-3)，细胞周期蛋白E，细胞周期蛋白A，细胞周期蛋白B，细胞周期蛋白H，Cdk-1，Cdk-2，Cdk-4，Cdk-6，Cdk-7，Cdc25C，p16，p15，p21，p27，p18，pRb，p107，p130，E2F(1-5)，GAAD45，MDM2，PCNA，ARF，PTEN，APC，BRCA，Akt，PI3K，mTOR，p53和同源物，C-Myc，NFkB，c-Jun，ATF-2，Sp1，前列腺特异性抗原(PSA)，癌胚抗原，甲胎蛋白，PAP；PSMA；STEAP；MAGE，MAGE-1，MAGE-3，NY-ESO-1，PSCA，MART，Gp100，酪氨酸酶，GRP，TCF-4，病毒HIV，HPV，HCV，HPV，EBV，CMV，HSV，流感病毒，A型流感病毒，A型流感病毒(H5N1)和(H3N2)，B型流感病毒，C型流感病毒的病毒抗原；血凝素，血凝素H1，血凝素H5，血凝素H7，血凝素HA1(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12C(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，neuramidase，p60，LLO，脲酶，CSP，calflagin和/或CPB”或其中根据组分(I)的至少一个野生型或突变蛋白的至少一个完整或部分抗原选自由下列野生型蛋白和它们的已知的突变体组成的激酶(括号中是登录号)：“AAK1(NM014911)，AATK(NM 004920)，ABL1(NM 005157)，ABL2(NM 005158)，ACK1(NM005781)，ACVR1(NM 001105)，ACVR1B(NM 020328)，ACVR2(NM 001616)，ACVR2B(NM 001106)，ACVRL1(NM 000020)，ADCK1(NM 020421)，ADCK2(NM 052853)，ADCK4(NM 024876)，ADCK5(NM 174922)，ADRBK1(NM001619)，ADRBK2(NM 005160)，AKT1(NM 005163)，AKT2(NM 001626)，AKT3(NM 005465)，ALK(NM 004304)，ALK7(NM 145259)，ALS2CR2(NM 018571)，ALS2CR7(NM 139158)，AMHR2(NM 020547)，ANKK1(NM 178510)，ANKRD3(NM 020639)，APEG1(NM 005876)，ARAF(NM 001654)，ARK5(NM 014840)，ATM(NM 000051)，ATR(NM 001184)，AURKA(NM 003600)，AURKB(NM004217)，AURKC(NM 003160)，AXL(NM 001699)，BCKDK(NM 005881)，BCR(NM 004327)，BIKE(NM 017593)，BLK(NM 001715)，BMPR1A(NM 004329)，BMPR1B(NM 001203)，BMPR2(NM 001204)，BMX(NM 001721)，BRAF(NM004333)，BRD2(NM 005104)，BRD3(NM 007371)，BRD4(NM 014299)，BRDT(NM 001726)，BRSK1(NM 032430)，BRSK2(NM 003957)，BTK(NM 000061)，BUB1(NM 004336)，BUB1B(NM 001211)，CABC1(NM 020247)，CAMK1(NM003656)，CaMK1b(NM 198452)，CAMK1D(NM 020397)，CAMK1G(NM 020439)，CAMK2A(NM 015981)，CAMK2B(NM 001220)，CAMK2D(NM 001221)，CAMK2G(NM 001222)，CAMK4(NM 001744)，CAMKK1(NM 032294)，CAMKK2(NM 006549)，CASK(NM 003688)，CCRK(NM 012119)，CDC2(NM 001786)，CDC2L1(NM 001787)，CDC2L5(NM 003718)，CDC42BPA(NM 014826)，CDC42BPB(NM 006035)，CDC7L1(NM 003503)，CDK10(NM 003674)，CDK11(NM 015076)，CDK2(NM 001798)，CDK3(NM 001258)，CDK4(NM 000075)，CDK5(NM 004935)，CDK6(NM 001259)，CDK7(NM 001799)，CDK8(NM001260)，CDK9(NM 001261)，CDKL1(NM 004196)，CDKL2(NM 003948)，CDKL3(NM 016508)，CDKL4(NM 001009565)，CDKL5(NM 003159)，CHEK1(NM 001274)，CHUK(NM 001278)，CIT(NM 007174)，CLK1(NM 004071)，CLK2(NM 003993)，CLK3(NM 003992)，CLK4(NM 020666)，CRK7(NM 016507)，CSF1R(NM 005211)，CSK(NM 004383)，CSNK1A1(NM 001892)，CSNK1D(NM001893)，CSNK1E(NM 001894)，CSNK1G1(NM 022048)，CSNK1G2(NM001319)，CSNK1G3(NM 004384)，CSNK2A1(NM 001895)，CSNK2A2(NM001896)，DAPK1(NM 004938)，DAPK2(NM 014326)，DAPK3(NM 001348)，DCAMKL1(NM 004734)，DCAMKL2(NM 152619)，DCAMKL3(XM 047355)，DDR1(NM 013993)，DDR2(NM 006182)，DMPK(NM 004409)，DMPK2(NM 017525.1)，DYRK1A(NM 001396)，DYRK1B(NM 006484)，DYRK2(NM 006482)，DYRK3(NM 003582)，DYRK4(NM 003845)，EEF2K(NM 013302)，EGFR(NM 005228)，EIF2AK3(NM 004836)，EIF2AK4(NM_001013703)，EPHA1(NM 005232)，EPHA10(NM 001004338)，EPHA2(NM 004431)，EPHA3(NM 005233)，EPHA4(NM004438)，EPHA5(NM 004439)，EPHA6(XM 114973)，EPHA7(NM 004440)，EPHA8(NM 020526)，EPHB1(NM 004441)，EPHB2(NM 017449)，EPHB3(NM004443)，EPHB4(NM 004444)，EPHB6(NM 004445)，ERBB2(NM 004448)，ERBB3(NM 001982)，ERBB4(NM 005235)，ERK8(NM 139021)，ERN1(NM001433)，ERN2(NM 033266)，FASTK(NM 025096)，FER(NM 005246)，FES(NM002005)，FGFR1(NM 000604)，FGFR2(NM 022970)，FGFR3(NM 000142)，FGFR4(NM 022963)，FGR(NM 005248)，FLJ23074(NM 025052)，FLJ23119(NM024652)，FLJ23356(NM 032237)，FLT1(NM 002019)，FLT3(NM 004119)，FLT4(NM 002020)，FRAP1(NM 004958)，FRK(NM 002031)，FYN(NM 002037)，GAK(NM 005255)，GPRK5(NM 005308)，GPRK6(NM 002082)，GPRK7(NM 139209)，GRK4(NM 005307)，GSG2(NM 031965)，GSK3A(NM 019884)，GSK3B(NM002093)，GUCY2C(NM 004963)，GUCY2D(NM 000180)，GUCY2F(NM 001522)，H11(NM 014365)，HAK(NM 052947)，HCK(NM 002110)，HIPK1(NM 152696)，HIPK2(NM 022740)，HIPK3(NM 005734)，HIPK4(NM 144685)，HRI(NM014413)，HUNK(NM 014586)，ICK(NM 016513)，IGF1R(NM 000875)，IKBKB(NM 001556)，IKBKE(NM 014002)，ILK(NM 004517)，INSR(NM 000208)，INSRR(NM 014215)，IRAK1(NM 001569)，IRAK2(NM 001570)，IRAK3(NM 007199)，IRAK4(NM 016123)，ITK(NM 005546)，JAK1(NM 002227)，JAK2(NM 004972)，JAK3(NM 000215)，KDR(NM 002253)，KIS(NM 144624)，KIT(NM 000222)，KSR(XM 290793)，KSR2(NM 173598)，LAK(NM 025144)，LATS1(NM 004690)，LATS2(NM 014572)，LCK(NM 005356)，LIMK1(NM 016735)，LIMK2(NM005569)，LMR3(XM 055866)，LMTK2(NM 014916)，LOC149420(NM 152835)，LOC51086(NM 015978)，LRRK2(XM 058513)，LTK(NM 002344)，LYN(NM002350)，MAK(NM 005906)，MAP2K1(NM 002755)，MAP2K2(NM 030662)，MAP2K3(NM 002756)，MAP2K4(NM 003010)，MAP2K5(NM 002757)，MAP2K6(NM 002758)，MAP2K7(NM 005043)，MAP3K1(XM 042066)，MAP3K10(NM002446)，MAP3K11(NM 002419)，MAP3K12(NM 006301)，MAP3K13(NM004721)，MAP3K14(NM 003954)，MAP3K2(NM 006609)，MAP3K3(NM 002401)，MAP3K4(NM 005922)，MAP3K5(NM 005923)，MAP3K6(NM 004672)，MAP3K7(NM 003188)，MAP3K8(NM 005204)，MAP3K9(NM 033141)，MAP4K1(NM007181)，MAP4K2(NM 004579)，MAP4K3(NM 003618)，MAP4K4(NM 145686)，MAP4K5(NM 006575)，MAPK1(NM 002745)，MAPK10(NM 002753)，MAPK11(NM 002751)，MAPK12(NM 002969)，MAPK13(NM 002754)，MAPK14(NM001315)，MAPK3(NM 002746)，MAPK4(NM 002747)，MAPK6(NM 002748)，MAPK7(NM 002749)，MAPK8(NM 002750)，MAPK9(NM 002752)，MAPKAPK2(NM 032960)，MAPKAPK3(NM 004635)，MAPKAPK5(NM 003668)，MARK(NM018650)，MARK2(NM 017490)，MARK3(NM 002376)，MARK4(NM 031417)，MAST1(NM 014975)，MAST205(NM 015112)，MAST3(XM 038150)，MAST4(XM291141)，MASTL(NM 032844)，MATK(NM 139355)，MELK(NM 014791)，MERTK(NM 006343)，MET(NM 000245)，MGC33182(NM 145203)，MGC42105(NM153361)，MGC43306(C9orf96)，MGC8407(NM 024046)，MIDORI(NM 020778)，MINK(NM 015716)，MKNK1(NM 003684)，MKNK2(NM 017572)，MLCK(NM182493)，MLK4(NM 032435)，MLKL(NM 152649)，MOS(NM 005372)，MST1R(NM 002447)，MST4(NM 016542)，MUSK(NM 005592)，MYLK(NM 053025)，MYLK2(NM 033118)，MYO3A(NM 017433)，MYO3B(NM 138995)，NEK1(NM012224)，NEK10(NM 152534)，NEK11(NM 024800)，NEK2(NM 002497)，NEK3(NM 002498)，NEK4(NM 003157)，NEK5(MGC75495)，NEK6(NM 014397)，NEK7(NM 133494)，NEK8(NM 178170)，NEK9(NM 033116)，NLK(NM 016231)，NPR1(NM 000906)，NPR2(NM 003995)，NRBP(NM 013392)，NRBP2(NM178564)，NRK(NM 198465)，NTRK1(NM 002529)，NTRK2(NM 006180)，NTRK3(NM 002530)，OBSCN(NM 052843)，OSR1(NM 005109)，PACE-1(NM 020423)，PAK1(NM 002576)，PAK2(NM 002577)，PAK3(NM 002578)，PAK4(NM005884)，PAK6(NM 020168)，PAK7(NM 020341)，PASK(NM 015148)，PCTK1(NM 006201)，PCTK2(NM 002595)，PCTK3(NM 212503)，PDGFRA(NM006206)，PDGFRB(NM 002609)，PDK1(NM 002610)，PDK2(NM 002611)，PDK3(NM 005391)，PDK4(NM 002612)，PDPK1(NM 002613)，PFTK1(NM 012395)，PHKG1(NM 006213)，PHKG2(NM 000294)，PIK3R4(NM 014602)，PIM1(NM002648)，PIM2(NM 006875)，PIM3(NM 001001852)，PINK1(NM 032409)，PKE(NM 173575)，PKMYT1(NM 004203)，pknbeta(NM 013355)，PLK(NM 005030)，PLK3(NM 004073)，PRKAA1(NM 006251)，PRKAA2(NM 006252)，PRKACA(NM002730)，PRKACB(NM 002731)，PRKACG(NM 002732)，PRKCA(NM 002737)，PRKCB1(NM 002738)，PRKCD(NM 006254)，PRKCE(NM 005400)，PRKCG(NM002739)，PRKCH(NM 006255)，PRKCI(NM 002740)，PRKCL1(NM 002741)，PRKCL2(NM 006256)，PRKCM(NM 002742)，PRKCN(NM 005813)，PRKCQ(NM 006257)，PRKCZ(NM 002744)，PRKD2(NM 016457)，PRKDC(NM 006904)，PRKG1(NM 006258)，PRKG2(NM 006259)，PRKR(NM 002759)，PRKWNK1(NM018979)，PRKWNK2(NM 006648)，PRKWNK3(NM 020922)，PRKWNK4(NM032387)，PRKX(NM 005044)，PRKY(NM 002760)，PRPF4B(NM 003913)，PSKH1(NM 006742)，PSKH2(NM 033126)，PTK2(NM 005607)，PTK2B(NM004103)，PTK6(NM 005975)，PTK7(NM 002821)，PTK9(NM 002822)，PTK9L(NM 007284)，PXK(NM 017771)，QSK(NM 025164)，RAD53(NM 007194)，RAF1(NM 002880)，RAGE(NM 014226)，RET(NM 020975)，RHOK(NM 002929)，RIOK1(NM 031480)，RIOK2(NM 018343)，RIPK1(NM 003804)，RIPK2(NM003821)，RIPK3(NM 006871)，RIPK5(NM 015375)，RNASEL(NM 021133)，ROCK1(NM 005406)，ROCK2(NM 004850)，ROR1(NM 005012)，ROR2(NM004560)，ROS1(NM 002944)，RPS6KA1(NM 002953)，RPS6KA2(NM 021135)，RPS6KA3(NM 004586)，RPS6KA4(NM 003942)，RPS6KA5(NM 004755)，RPS6KA6(NM 014496)，RPS6KB1(NM 003161)，RPS6KB2(NM 003952)，RPS6KC1(NM 012424)，RPS6KL1(NM 031464)，RYK(NM 002958)，SBK(XM370948)，SCYL1(NM 020680)，SCYL2(NM 017988)，SGK(NM 005627)，SgK069(SU SgK069)，SgK085(XM 373109)，SgK110(SU SgK110)，SGK2(NM 016276)，SgK223(XM 291277)，SgK269(XM 370878)，SgK424(CGP SgK424)，SgK493(SU_SgK493)，SgK494(NM 144610)，SgK495(NM 032017)，SGKL(NM 013257)，SK681(NM 001001671)，SLK(NM 014720)，SMG1(NM 015092)，SNARK(NM030952)，SNF1LK(NM 173354)，SNF1LK2(NM 015191)，SNK(NM 006622)，SNRK(NM 017719)，SRC(NM 005417)，SRMS(NM 080823)，SRPK1(NM003137)，SRPK2(NM 003138)，SSTK(NM 032037)，STK10(NM 005990)，STK11(NM 000455)，STK16(NM 003691)，STK17A(NM 004760)，STK17B(NM004226)，STK18(NM 014264)，STK19(NM 032454)，STK22B(NM 053006)，STK22C(NM 052841)，STK22D(NM 032028)，STK23(NM 014370)，STK24(NM003576)，STK25(NM 006374)，STK3(NM 006281)，STK31(NM 031414)，STK32B(NM 018401)，STK33(NM 030906)，STK35(NM 080836)，STK36(NM015690)，STK38(NM 007271)，STK38L(NM 015000)，STK39(NM 013233)，STK4(NM 006282)，STLK5(NM 001003787)，STYK1(NM 018423)，SUDD(NM003831)，SYK(NM 003177)，TAF1(NM 138923)，TAF1L(NM 153809)，TAO1(NM004783)，TAOK1(NM 020791)，TAOK3(NM 016281)，TBCK(NM 033115)，TBK1(NM 013254)，TEC(NM 003215)，TEK(NM 000459)，TESK1(NM 006285)，TESK2(NM 007170)，TEX14(NM 031272)，TGFBR1(NM 004612)，TGFBR2(NM003242)，TIE(NM 005424)，TIF1(NM 003852)，TLK1(NM 012290)，TLK2(NM006852)，TNIK(NM 015028)，TNK1(NM 003985)，TOPK(NM 018492)，TP53RK(NM 033550)，TRAD(NM 007064)，TRIB1(NM 025195)，TRIB2(NM 021643)，TRIB3(NM 021158)，TRIM28(NM 005762)，TRIM33(NM 015906)，TRIO(NM007118)，TRPM6(NM 017662)，TRPM7(NM 017672)，TRRAP(NM 003496)，TSSK4(NM 174944)，TTBK1(NM 032538)，TTBK2(NM 173500)，TTK(NM003318)，TTN(NM 003319)，TXK(NM 003328)，TYK2(NM 003331)，TYRO3(NM006293)，ULK1(NM 003565)，ULK2(NM 014683)，ULK3(NM 015518)，ULK4(NM017886)，VRK1(NM 003384)，VRK2(NM 006296)，VRK3(NM 016440)，WEE1(NM 003390)，Wee1B(NM 173677)，YANK1(NM 145001)，YES1(NM 005433)，ZAK(NM 016653)，和/或ZAP70(NM 001079)”。
7.根据权利要求1至6中任一项的微生物，其中组分(II)选自“细菌毒素，肠毒素，外毒素，I型毒素，II型毒素，III型毒素，IV型毒素，V型毒素，RTX毒素，AB毒素，A-B毒素，A/B毒素，A+B毒素，A-5B毒素和/或AB5毒素”。
8.根据权利要求7的微生物，其中组分(II)选自“腺苷酸环化酶毒素，炭疽毒素，炭疽毒素(EF)，炭疽毒素(LF)，肉毒杆菌毒素，霍乱毒素(CT，Ctx)，霍乱毒素B亚基(CTB，CtxB)，白喉毒素(DT，Dtx)，大肠杆菌LT毒素，大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)，大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LTB)，大肠杆菌ST毒素，大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)，红斑毒素，表皮剥脱毒素，外毒素A，产气荚膜菌肠毒素，百日咳毒素(PT，Ptx)，志贺菌毒素(ST，Stx)，志贺菌毒素B亚基(STB，StxB)，志贺样毒素，葡萄球菌肠毒素，破伤风毒素(TT)，中毒性休克综合征毒素(TSST-1)，Vero细胞毒素(VT)，艰难梭菌的毒素A(TA)和毒素B(TB)，索氏梭菌的致死毒素(LT)和出血毒素(HT)，诺氏梭菌的α毒素(AT)”。
9.根据权利要求1至8中任一项的微生物，其中组分(I)和组分(II)连接在一起使得能够表达和/或分泌由两个组分编码的融合蛋白。
10.根据权利要求9的微生物，其中所述融合蛋白选自“CtxB-PSA，CtxB-B-Raf V600E KD，CtxB-B-Raf V600E激酶结构域，CtxB-B-RafV600E激酶结构域KD，CtxB-B-Raf，CtxB-B-Raf KD，CtxB B-Raf激酶结构域KD，CtxB-HA1，CtxB-HA12C”。
11.根据权利要求1至10中任一项的微生物，其中组分(III)a)选自“I型分泌系统，II型分泌系统，III型分泌系统，IV型分泌系统，V型分泌系统，大肠杆菌溶血素转运系统(信号)(在hly特异性启动子控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)，大肠杆菌溶血素转运系统(信号)(在非hly特异性细菌启动子的控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)，新月柄杆菌的S层(Rsa A)蛋白的转运信号，大肠杆菌的TolC蛋白的转运信号，分泌信号Vtgss和/或源自利斯特菌溶胞素，p60和/或ActA的分泌信号”并且其中组分(III)b)选自“细胞内溶素，革兰氏阳性菌的裂解蛋白，单核细胞增生利斯特菌的裂解蛋白，单核细胞增生利斯特菌的PLY551和/或单核细胞增生利斯特菌的穿孔素”。
12.根据权利要求11的微生物，其中组分(III)a)为仅编码一个转运系统的至少一个核苷酸序列，所述的转运系统使得能够在微生物的外表面上共表达组分(I)和组分(II)的表达产物和/或使得能够共分泌组分(I)和组分(II)的表达产物，其中此类组分(III)a)优选为编码大肠杆菌的溶血素转运系统(信号)(在hly特异性启动子的控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)或大肠杆菌的溶血素转运系统(信号)(在非hly特异性细菌启动子控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)的至少一个核苷酸序列。
13.根据权利要求1至12中任一项的微生物，其中根据组分(III)a)，组分(I)和组分(II)的表达产物被分泌。
14.根据权利要求1至13中任一项的微生物，其中
组分(I)选自“B-Raf V600E，B-Raf V600E激酶结构域，B-Raf V600EKD，B-Raf V600E激酶结构域KD，B-Raf KD，B-Raf激酶结构域，B-Raf激酶结构域KD，前列腺特异性抗原(PSA)，血凝素HA1(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)，血凝素HA12C(优选来自A型流感病毒(A/泰国/1(KAN-1)2004(H5N1)”；
组分(II)选自“霍乱毒素B亚基(CTB，CtxB)，大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LTB)，破伤风毒素(TT)”；
组分(III)a)选自“与Hly分泌系统的组分一起的大肠杆菌HlyA溶血素转运信号(在hly特异性启动子的控制下的包含HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)”；
组分(IV)选自“大肠杆菌hly基因座的内源启动子”；
其中组分(I)和组分(II)连接在一起以使得能够表达由两个组分编码的融合蛋白并且其中该融合蛋白被分泌。
15.药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至14中任一项的微生物，优选至少一种冻干的根据权利要求1至14中任一项的微生物，和药学上可接受的载体，优选胶囊。
16.包含至少一种根据权利要求1至14中任一项的微生物或至少一种根据权利要求15的药物组合物的药物。
17.根据权利要求1至14中任一项的微生物用于制备用于治疗和/或预防生理学和/或病理生理学的病况的药物的用途，所述病况选自“不受控制的细胞分裂，恶性肿瘤，良性肿瘤，实体瘤，肉瘤，癌，过度增殖性疾病，类癌，尤文肉瘤，卡波西肉瘤，脑肿瘤，源自脑和/或神经系统和/或脑脊膜的肿瘤，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，胃癌，肾癌，肾细胞癌，前列腺癌，前列腺癌变，结缔组织肿瘤，软组织肉瘤，胰腺肿瘤，肝肿瘤，头部肿瘤，颈部肿瘤，食管癌，甲状腺癌，骨肉瘤，视网膜母细胞瘤，胸腺瘤，睾丸癌，肺癌，支气管癌，乳腺癌，乳癌，肠癌，结直肠肿瘤，结肠癌，直肠癌，妇科肿瘤，卵巢肿瘤/卵巢的肿瘤，子宫癌，宫颈癌，宫颈癌变，子宫体癌，子宫体癌变，子宫内膜癌，尿膀胱癌，膀胱癌，皮肤癌，基底细胞瘤，肌脊瘤，黑色素瘤，眼内黑色素瘤，白血病，慢性白血病，急性白血病，淋巴瘤，感染，病毒性或细菌性感染，流行性感冒，慢性炎症，器官排斥和/或自身免疫性疾病”。
18.包含根据权利要求1至14中任一项的组分(I)至(IV)的质粒或表达载体。
19.用于制备根据权利要求1至14中任一项的微生物的方法，其中制备根据权利要求18的质粒或表达载体，并且用该质粒或表达载体转化微生物。
20.药物试剂盒，其包含至少一种根据权利要求1至14中任一项的微生物或根据权利要求15的药物组合物或根据权利要求16的药物以及药学上可接受的缓冲剂，优选碳酸盐缓冲剂。
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Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104066447A (zh) * 2011-11-23 2014-09-24 拜奥文斯瑞有限公司 重组蛋白及其治疗用途
CN104619841A (zh) * 2012-07-26 2015-05-13 日本国立癌症研究中心 Cep55基因与ret基因的融合基因
CN105473609A (zh) * 2013-04-17 2016-04-06 杜塞尔多夫海因里希·海涅大学 用于表达肽和蛋白的方法
CN105601753A (zh) * 2016-02-22 2016-05-25 潍坊医学院 结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白及其制备方法和应用
CN107001431A (zh) * 2014-05-21 2017-08-01 巴塞尔大学 基于细菌的蛋白质递送
CN107427565A (zh) * 2014-12-19 2017-12-01 宾夕法尼亚大学理事会 使用重组李斯特菌菌株的组合疗法
CN107708713A (zh) * 2015-04-28 2018-02-16 阿尔伯特爱因斯坦医学院公司 使用由减毒细菌递送的回忆抗原治疗癌症
CN107858430A (zh) * 2017-11-20 2018-03-30 薛守海 甲基化基因组合物及制备诊断预示Her‑2过表达型乳腺癌骨转移试剂盒的用途
CN109486832A (zh) * 2018-12-29 2019-03-19 中国农业科学院棉花研究所 一种创建有限生长株型棉花的方法
CN110237240A (zh) * 2019-07-03 2019-09-17 上海市肺科医院 可溶性受体酪氨酸激酶sAxl在治疗结核病中的应用
CN111349099A (zh) * 2015-03-19 2020-06-30 浙江导明医药科技有限公司 优化的联合用药及其治疗癌症和自身免疫疾病的用途
CN113721030A (zh) * 2021-08-30 2021-11-30 河南中医药大学 用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用
CN114921546A (zh) * 2022-05-13 2022-08-19 核工业总医院 circHIPK2作为乳腺癌生物标志物的应用
CN115976033A (zh) * 2022-12-14 2023-04-18 西南大学 瓜实蝇tssk1和tssk3基因及其应用

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2331271B1 (es) * 2007-06-29 2010-10-14 Universidad Del Pais Vasco Metodo para la internalizacion de bacterias no invasivas en celulas eucariotas.
US8877201B2 (en) 2007-10-25 2014-11-04 Wake Forest University Health Sciences Bordetella outer-membrane protein antigens and methods of making and using the same
AR070568A1 (es) * 2008-02-05 2010-04-21 Aeterna Zentaris Gmbh Bacterias recombinantes con un sistema de secrecion de hemolisina de e. coli y expresion y /o secrecion incrementada de hlya, proceso para producirlas, y sus usos
US20120020996A1 (en) * 2008-08-06 2012-01-26 Jonathan Lewis Telfer Vaccines against clostridium difficile and methods of use
KR101104077B1 (ko) * 2008-10-14 2012-01-11 건국대학교 산학협력단 Ｅｇｒ－１의 발현을 증가시키는 활성을 갖는 신규한 엔터로박테리아속에 속하는 신규균주 및 그 균주를 포함하는 조성물의 항암제로서의 용도
CN101480489B (zh) * 2008-12-03 2012-07-04 中国人民解放军第三军医大学 疟原虫环子孢子蛋白抗肿瘤增殖和迁移的新用途
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
GB2478734A (en) * 2010-03-15 2011-09-21 Sense Proteomic Ltd Auto-antibody biomarkers of prostate cancer
KR101229596B1 (ko) * 2010-05-13 2013-02-04 한국외국어대학교 연구산학협력단 사람 락토페리신 펩티드의 대장균 발현 플라스미드 및 그 용도
WO2012028741A1 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Intercell Ag Isolated polypeptide of the toxin a and toxin b proteins of c. difficile and uses thereof
US9856492B2 (en) * 2011-03-02 2018-01-02 Futuragene Israel Ltd. Bacterial resistant transgenic plants having dysfunctional T3SS proteins
CN103687611A (zh) 2011-03-11 2014-03-26 阿德瓦希斯公司 基于李斯特菌属的佐剂
CN103987396A (zh) * 2011-09-06 2014-08-13 新加坡科技研究局 多肽疫苗
US11680273B2 (en) 2011-09-23 2023-06-20 Loma Linda University Treatment of autoimmune diseases
EP3760226A1 (en) 2011-09-23 2021-01-06 Loma Linda University Bacterial strains expressing methylase genes and uses thereof
EP2583975A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-24 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Agents and methods for the expression and secretion of peptides and proteins
JP2015511602A (ja) 2012-03-12 2015-04-20 アドバクシス， インコーポレイテッド リステリアワクチン処理後のサプレッサー細胞機能抑制
US9499856B2 (en) 2012-04-02 2016-11-22 The Board Institute, Inc. DDR2 mutations in squamous cell lung cancer
CN104470537B (zh) * 2012-05-23 2017-04-26 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 表达鼠疫耶尔森氏菌F1‑V融合蛋白的伤寒沙门氏菌Ty21a及其用途
US9593339B1 (en) 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
CA2904506A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Bioven 3 Limited Self-assembling synthetic proteins
LT2988762T (lt) 2013-04-25 2018-09-25 Vaximm Ag Vektoriai, sukonstruoti salmonella pagrindu, skirti vėžio imunoterapijai, nukreiptai į vilmso naviko geną wt1
CN105017256A (zh) 2014-04-29 2015-11-04 浙江导明医药科技有限公司 多氟化合物作为布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂
EP3166637B1 (en) 2014-07-10 2020-01-29 The J. David Gladstone Institutes Compositions and methods for treating dengue virus infection
WO2016019379A1 (en) * 2014-08-01 2016-02-04 Northwestern University Bacterial toxins and uses thereof as ras specific proteases
US9717745B2 (en) 2015-03-19 2017-08-01 Zhejiang DTRM Biopharma Co. Ltd. Pharmaceutical compositions and their use for treatment of cancer and autoimmune diseases
JP7266834B2 (ja) 2015-12-28 2023-05-01 北海道公立大学法人 札幌医科大学 腫瘍抗原ペプチド
SI3432916T1 (sl) 2016-09-13 2020-01-31 Allergan, Inc. Stabilizirani ne-protein klostridijski toksin sestavki
CA3037813A1 (en) 2016-09-21 2018-03-29 The Governors Of The University Of Alberta Hepatitis c virus immunogenic compositions and methods of use thereof
GB201616365D0 (en) * 2016-09-27 2016-11-09 Helsingin Yliopisto Non-genetic modification of enveloped viruses
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
TW201922256A (zh) 2017-10-27 2019-06-16 中國大陸商浙江導明醫藥科技有限公司 治療淋巴樣惡性疾病之方法
CN109593771B (zh) * 2018-07-27 2022-03-29 四川大学华西医院 一种人类map2k5第1100位碱基突变基因及其检测试剂盒
CN110330548B (zh) * 2019-06-28 2021-03-09 哈尔滨医科大学 一种抗肿瘤多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用
WO2021026335A1 (en) * 2019-08-08 2021-02-11 The Trustees Of Indiana University Methods for identifying and treating urinary tract infections
AU2020329191A1 (en) 2019-08-12 2022-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Macrophage stimulating 1 receptor (MST1R) variants and uses thereof
CN113694202B (zh) * 2020-06-29 2023-03-31 江苏省中医院 Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
WO2022098213A1 (ko) * 2020-11-09 2022-05-12 전남대학교 산학협력단 암의 예방 및 치료용 살모넬라 균주 및 이의 용도
KR102547393B1 (ko) * 2021-04-19 2023-06-23 엠브릭스 주식회사 보툴리늄 독소 전위 도메인 및 엔도라이신을 포함하는 단백질 복합체 및 이를 포함하는 항균 조성물
GB202209115D0 (en) * 2022-06-21 2022-08-10 Chain Biotechnology Ltd Compositions and methods
WO2024054673A1 (en) * 2022-09-09 2024-03-14 Texas Tech University System Listeria monocytogenes as a vector for tumor-specific delivery of chemotherapeutic agents
CN116875520A (zh) * 2023-07-12 2023-10-13 吉林农业大学 表达核糖体失活蛋白的乳酸菌及其在抗轮状病毒中的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02170053A (ja) * 1988-12-23 1990-06-29 Meiji Seika Kaisha Ltd 微生物の検出方法及び装置
RU2092556C1 (ru) * 1995-08-29 1997-10-10 Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации Способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, плазмидный вектор ркс47м для введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, способ конструирования плазмидного вектора ркс47м
AU4070097A (en) * 1996-08-16 1998-03-06 Uab Research Foundation, The Mucosal immunogens for novel vaccines
US6036953A (en) * 1996-11-29 2000-03-14 The General Hospital Corporation Heterologous antigens in live cell V. cholerae strains
US20030235594A1 (en) * 1999-09-14 2003-12-25 Antigen Express, Inc. Ii-Key/antigenic epitope hybrid peptide vaccines
WO2001029233A2 (en) * 1999-10-20 2001-04-26 The Johns Hopkins University School Of Medicine Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
GB0030067D0 (en) * 2000-12-11 2001-01-24 Univ Bristol Therapeutic agent
RU2216590C1 (ru) * 2002-02-26 2003-11-20 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий salmonella typhimurium t10/pkhbc - продуцент корового антигена вируса гепатита в
DE10208653A1 (de) 2002-02-28 2003-09-18 Medinnova Ges Med Innovationen Mikroorganismus als Träger von Nukleotidsequenzen kodierend für Zellantigene zur Behandlung von Tumoren

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11198716B2 (en) 2011-11-23 2021-12-14 In3Bio Ltd. Recombinant proteins and their therapeutic uses
CN108864261A (zh) * 2011-11-23 2018-11-23 拜奥文斯瑞有限公司 重组蛋白及其治疗用途
CN108864291A (zh) * 2011-11-23 2018-11-23 拜奥文斯瑞有限公司 重组蛋白及其治疗用途
CN104066447A (zh) * 2011-11-23 2014-09-24 拜奥文斯瑞有限公司 重组蛋白及其治疗用途
CN104619841A (zh) * 2012-07-26 2015-05-13 日本国立癌症研究中心 Cep55基因与ret基因的融合基因
US10443081B2 (en) 2013-04-17 2019-10-15 Numaferm Gmbh Methods for the expression of peptides and proteins
CN105473609A (zh) * 2013-04-17 2016-04-06 杜塞尔多夫海因里希·海涅大学 用于表达肽和蛋白的方法
CN107001431A (zh) * 2014-05-21 2017-08-01 巴塞尔大学 基于细菌的蛋白质递送
CN107427565A (zh) * 2014-12-19 2017-12-01 宾夕法尼亚大学理事会 使用重组李斯特菌菌株的组合疗法
CN111349099A (zh) * 2015-03-19 2020-06-30 浙江导明医药科技有限公司 优化的联合用药及其治疗癌症和自身免疫疾病的用途
CN107708713A (zh) * 2015-04-28 2018-02-16 阿尔伯特爱因斯坦医学院公司 使用由减毒细菌递送的回忆抗原治疗癌症
CN105601753A (zh) * 2016-02-22 2016-05-25 潍坊医学院 结核杆菌噬菌体双组份融合溶菌蛋白及其制备方法和应用
CN107858430B (zh) * 2017-11-20 2019-01-04 武汉迈特维尔生物科技有限公司 一种用于诊断预示Her-2过表达型乳腺癌骨转移的基因诊断试剂盒
CN107858430A (zh) * 2017-11-20 2018-03-30 薛守海 甲基化基因组合物及制备诊断预示Her‑2过表达型乳腺癌骨转移试剂盒的用途
CN109486832A (zh) * 2018-12-29 2019-03-19 中国农业科学院棉花研究所 一种创建有限生长株型棉花的方法
CN109486832B (zh) * 2018-12-29 2021-11-23 中国农业科学院棉花研究所 一种创建有限生长株型棉花的方法
CN110237240A (zh) * 2019-07-03 2019-09-17 上海市肺科医院 可溶性受体酪氨酸激酶sAxl在治疗结核病中的应用
CN113721030A (zh) * 2021-08-30 2021-11-30 河南中医药大学 用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用
CN113721030B (zh) * 2021-08-30 2024-02-13 河南中医药大学 用于桥本甲状腺炎不同证候特征性自身抗体检测的生物标志物及其应用
CN114921546A (zh) * 2022-05-13 2022-08-19 核工业总医院 circHIPK2作为乳腺癌生物标志物的应用
CN115976033A (zh) * 2022-12-14 2023-04-18 西南大学 瓜实蝇tssk1和tssk3基因及其应用
CN115976033B (zh) * 2022-12-14 2024-05-17 西南大学 瓜实蝇tssk1和tssk3基因及其应用

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