CN109486832A - 一种创建有限生长株型棉花的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过基因定点编辑技术快速创建主茎和果枝表现有限生长的棉花新材料的方法。本发明的方法针对株型调控候选基因GhLSGZ，利用一种基因定点编辑技术将GhLSGZ敲除，获得有限生长习性的Ghlsgz突变体，该突变体可以用于改良棉花株型，获得株型优良的棉花新品系。本发明获得的Ghlsgz突变体可通过后代分离，将转基因元件排除。本发明还提供了GhLSGZ基因的定点敲除突变基因、用于敲除GhLSGZ基因功能的靶点序列及其互补引物、用于敲除GhLSGZ基因的定点敲除载体、定点敲除零式果枝基因GhLSGZ基因的方法、以及调控棉花株型和成熟期的方法。

Description

一种创建有限生长株型棉花的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术和作物遗传育种技术领域，具体涉及一种通过基因定点编辑技术快速创建主茎和果枝表现有限生长的棉花新材料的方法。
背景技术
棉花(Gossypium)是世界上重要的经济作物和油料作物，棉花纤维是优良的天然可纺织纤维，是重要的纺织工业原料。美、澳等先进植棉国家，实现了全程机械化，国际竞争力强，引领棉花发展方向。我国是世界上最大的棉花生产国、消费国和纺织品出口国。然而，随着我国人力成本的不断攀升，棉花种植效益逐渐下降，改变棉花的种植方式将可以最大程度的提高棉花种植效益。由于棉花主茎和分枝无限生长的特性，导致棉花植株高大，生长期较长，不同棉铃成熟期不一致，棉花生产的用工较多和难以全程机械化，改变棉花无限生长的特性和缩短棉花的生育期，将可以改变棉花的种植方式，促进全程机械化进程，提高植棉效益。
目前生产上应用的大部分棉花品种为无限类型，主茎不断分化分枝，分枝包含多个节，可以无限生长；有一类果枝突变体，果枝有限生长，通常也叫作零式果枝。零式果枝突变体在海岛棉中通常表现花芽直接分化于主茎叶腋处，而在陆地棉中零式果枝材料的果枝通常为一节有限生长，顶端以2～3朵花结束，具有早熟、株型紧凑、花期集中的特点。然而，零式果枝的主茎依然保持无限生长，不断分化出有限果枝。因此，调控零式果枝基因GhLSGZ对研究果枝发育，调控株型结构，使棉花株型更紧凑，更加适于高密度种植和适于机采等具有重要的理论和实践意义。
基因编辑技术是近年发展起来的高效的基因修饰改造技术，可以定点敲除多种生物的内源基因。相比较早期发展的辛指核酸酶基因编辑技术，近年来发展的类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)系统、成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced shorepalindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)中的CRISPR/Cas9以及CRISPR/Cpf1系统的效率更高，尤其是CRISPR/Cas9系统的技术更加成熟。其原理是在20nt长的碱基靶序列(gRNA)的引导下，完成靶位点的识别，然后Cas9核酸酶切割靶点双链，形成DNA双链断裂缺口(DSB)，激活细胞内的两种修复机制(即非同源末端连接或同源重组)，从而产生断口处碱基缺失、插入和替换。
CRISPR/Cas9编辑技术目前在棉花中的应用目前还处于探索阶段，涉及对载体类型、启动子效率的优化选择方面(例如Wang等，2017，Plant Biotechnology Journal，16(1):137-150)，结果表明棉花中CRISPR/Cas9编辑效率较高，效率变幅为66.7-100％。作为一种基因敲除手段，CRISPR/Cas9编辑技术可作为一种基因功能验证手段，可用于阐明基因的生物学功能。
因此，本领域需要一种调控零式果枝基因GhLSGZ基因来调控株型结构的方法，从而使获得的棉花新材料株型更紧凑，更加适于高密度种植和适于机采。
发明内容
针对本领域中存在的上述技术问题，发明人发现，目前发现的自然界存在的GhLSGZ基因都是仅在Dt拷贝发生了功能缺失突变，At拷贝功能保持完好无损。而GhLSGZ基因存在剂量效应，如果At和Dt同时突变则表型变异可能更丰富，有利于育种应用。因此，为了克服现有育种技术的限制，本发明通过敲除GhLSGZ基因的Dt和At双拷贝，从而提供了一种快速创建主茎和果枝均为有限生长的棉花新材料的方法。
在第一个方面，本发明提供了GhLSGZ基因的定点敲除突变基因(下文中有时简称为“本发明的定点敲除突变基因”)，该突变基因的特点在于敲除了GhLSGZ基因的Dt和At亚染色体组的双拷贝，GhLSGZ基因的Dt拷贝和At拷贝的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和2所示。
在一个优选实施方案中，本发明的定点敲除突变基因是命名为Ghlsgz-1的GhLSGZ基因定点敲除突变基因，其Dt拷贝和At拷贝的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和4所示。
在另一个优选的实施方案中，本发明的定点敲除突变基因是命名为Ghlsgz-2的GhLSGZ基因定点敲除突变基因，其Dt拷贝和At拷贝的核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和6所示。
在第二个方面，本发明提供了GhLSGZ基因定点敲除突变基因在调控棉花株型和成熟期中的应用。
在本发明中，调控棉花株型和成熟期是调控主茎和果枝的生长习性，优选调控主茎和果枝均为有限生长的表型，从而提早营养生长向生殖生长的转变，在主茎顶端和第3片真叶基步分化花原基。
在第三个方面，本发明提供了用于敲除Ghlsgz基因功能的靶点序列(下文中有时简称“本发明的靶点序列”)及其互补引物的核苷酸序列。
如下所示，所述靶点序列是基于CRISPR/Cas9敲除GhLSGZ基因的靶点序列，其序列为SEQ ID No:7，如下所示，下划线为靶点PAM：
CCAACAAGCAGGTATATAATGGC(SEQ ID No:7)
上述靶点序列的互补引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No:8(正向引物)和SEQ IDNo:9(反向引物)，如下所示：
正向引物：5’-GATTGCCATTATATACCTGCTTGT-3’(SEQ ID No:8)
反向引物：3’-ACAAGCAGGTATATAATGGCCAAA-5’(SEQ ID No:9)。
在第四个方面，本发明提供了一种定点敲除载体(下文中有时简称为“本发明的定点敲除载体”)，其包括sgRNA表达盒和基因编辑元件，所述sgRNA表达盒包含AtU6启动子序列、如SEQ ID No.8-9所示的靶点引物序列和sgRNA终止子序列。
在本发明中，基因编辑元件可以采用本领域中常用的用于棉花基因编辑的CRISPR/Cas9基因编辑元件。优选地，所述CRISPR/Cas9基因编辑元件包含植物新霉素磷酸转移酶基因(nptII)表达元件和Cas9基因蛋白表达元件。更优选地，Cas9基因蛋白表达元件中的启动子序列是35S启动子序列。
在第五个方面，本发明提供了含有本发明的定点敲除载体的重组细胞(下文中有时简称为“本发明的重组细胞”)，该重组细胞是通过用本发明的定点敲除载体转化至宿主细胞中获得。在本发明中，宿主细胞可以采用本领域中常用的宿主细胞，包括但不限于农杆菌。
在第六个方面，本发明提供了本发明的重组细胞在调控棉花株型和成熟期中的应用。
在第七个方面，本发明提供了一种定点敲除零式果枝基因GhLSGZ基因的方法，该方法包括将本发明的定点敲除载体导入含有GhLSGZ基因的棉花受体材料，使所述棉花受体材料中的GhLSGZ基因被敲除，获得敲除GhLSGZ基因功能的植株。
在第八个方面，本发明提供了一种调控棉花株型和成熟期的方法，该方法包括将本发明的定点敲除载体导入至含有GhLSGZ基因的棉花受体材料，使所述棉花受体材料中的GhLSGZ基因被敲除，即获得主茎和果枝均为有限生长的棉花材料。
在第九个方面，本发明提供了一种调控棉花株型和成熟期的方法，该方法包括以下步骤：
1)利用上述第八个方面的方法获得主茎和果枝均为有限生长的棉花材料；和
2)将步骤1)中获得的主茎和果枝均为有限生长的植株与正常生长的棉花育种材料杂交，从获得的杂交后代中分离出成熟期早、果枝有限、株型表现不同于T0代而其他性状与正常材料一致，同时不携带外源转基因成分的棉花材料。
在第十个方面，本发明提供了一种创建主茎和果枝表现有限生长的棉花新材料的方法，该方法包括以下步骤:
S1.针对GhLSGZ基因的序列，以一种基因定点编辑系统，选择GhLSGZ基因中的一个靶点，构建目的基因编辑转化载体，其中所述靶点特异靶向GhLSGZ基因的At和Dt亚染色体组的双拷贝；和
S2.使用步骤S1中所获得的目的基因编辑转化载体对受体棉花材料进行定点编辑，获得敲除GhLSGZ基因Dt和At双拷贝的植株，即获得主茎和果枝表现为有限生长的棉花新材料。
在一个优选实施方案中，所述基因定点编辑系统是TALEN系统或CRISPR/Cpf1系统。
在一个优选实施方案中，所述基因定点编辑系统是CRISPR/Cpf1系统，且所述靶点的序列如SEQ ID NO:7所示。
在一个优选实施方案中，所述目的基因编辑转化载体是本发明的定点敲除载体。
在一个优选实施方案中，所述受体棉花材料是含有GhLSGZ基因的棉花材料。
本发明的有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
1.本发明针对株型调控候选基因GhLSGZ，利用一种基因定点编辑技术将GhLSGZ基因敲除，获得Ghlsgz突变体，发现该突变体的主茎和果枝生长表现为有限生长习性，首次证实GhLSGZ是棉花株型调控的关键因子，可以作为亲本用于杂交育种。
2.本发明首次提供一种以基因定点编辑技术快速创建生主茎和果枝皆长表现为有限性生长的棉花新材料的方法。所述的棉花新材料可用于改良棉花株型，获得株型改良的优良棉花新品系。
3.本发明获得的Ghlsgz突变体可以通过后代分离，将转基因元件清除。因此，本发明为棉花株型育种，提高棉花产量，适应新型棉花机械化种植模式，提供了新的分子育种技术手段。
4.本发明首次提供一种以基因定点编辑技术快速创建有限生长习性棉花的方法，所述有限生长习性棉花可用于棉花株型的遗传改良。而且，本发明获得的Ghlsgz突变体可通过后代分离，将转基因元件排除。因此，本发明为棉花株型改良，提高棉花机械化种植适应性，提供了新的分子育种技术手段。
5.本发明首次提供一种GhLSGZ基因亚染色体组双拷贝同时敲除的新方法，得到了自然界不存在的株型变异类型。自然界无法筛选得到天然的GhLSGZ基因At和Dt拷贝同时功能缺失突变的材料，表型变异有限，限制了GhLSGZ基因的育种应用。本发明的得到的突变材料的后代分离群体中可产生不同类型的突变组合，表型变异丰富。
6.本发明提供了相比于其他已有的GhLSGZ基因的编辑事件更高效的编辑事件，表现为选择位置(更靠近基因5’，敲除更彻底)、载体构建更简单(单靶标)和序列特征上(GC含量40％；序列特异性高，不易脱靶等)表现更高效的靶标位点；另外，在靶标设计上同时排除了对GhLSGZ同源基因脱靶编辑的可能。
此外，将cas9表达元件的启动子为35S启动子而非原的编辑事件使用的水稻Ubi启动子，效率更高。
附图说明
图1图示了GhLSGZ基因的基因结构和定点敲除载体的构建。图1A为GhLSGZ的基因结构，小黑框表示外显子，箭头表示CRISPR/Cas9系统的编辑位点，虚线框内序列表示靶点序列和PAM序列(下划线碱基)。图1B为GhLSGZ与其两个同源基因的序列对比。下划线为PAM序列，斜体碱基为靶点序列，该靶点特异性靶向GhLSGZ基因，脱靶率大大降低。图1C为本发明所用的CRISPR/Cas9系统，U6质粒携带sgRNA表达盒，为拟南芥AtU6驱动。
图2为对含有GhLSGZ基因的陆地棉株系YZ-1进行基因敲除获得突变体Ghlsgz的鉴定；图2A为Ghlsgz的转基因T0植株的卡那霉素抗性基因NPT的鉴定，*表示其中用于测序分析靶点突变情况的2个独立Ghlsgz突变体的转基因鉴定条带。M表示Marker，B代表空白对照，N代表阴性对照，P代表阳性对照。图2B为Ghlsgz的靶点位置测序结果。斜体碱基为靶点位置，下划线为PAM序列。WT为野生型。“-”表示碱基缺失。Dt表示GhLSGZ基因编辑结果，At表示GhLSGZ基因At亚组的同源基因。图2C为两个Ghlsgz突变体的表型。箭头所指为主茎顶端末端花。Ghlsgz突变体开花提早。
图3为Ghlsgz功能敲除突变体的转基因T1代的不含转基因个体的鉴定及表型。图3A为以PCR扩增卡那霉素基因NPT筛选不含转基因个体(以*指示)的鉴定。M表示Marker，B代表空白对照，N代表阴性对照，P代表阳性对照。图3B为鉴定单株相应的表型。箭头所指为主茎顶端末端花。
图4为编辑突变单株Ghlsgz-1与陆地棉标准系TM-1杂交的表现为中间类型有限生长单株。箭头所指为主茎顶端末端花。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。
实施例1 GhLSGZ功能敲除载体的构建
针对果枝有限性生长控制基因GhLSGZ(Dt和At拷贝，SEQ ID NO：1-2)的编码序列，设计基因特异性靶点序列(SEQ ID NO：7)(图1A)。合成相应引物(正向引物和反向引物SEQID NO：8-9)，通过95℃，2min，缓慢降至室温的处理形成带有attg与aaac粘性末端的寡核苷酸双链，与经BbsI内切酶酶切的U6载体连接，从而将靶点引物序列连接到由AtU6启动子驱动的sgRNA的表达盒中，测序验证。将构建好的sgRNA表达盒片段通过XBa I和Bbs1双酶切克隆转移到线性化CRISPR/Cas9基因编辑双元载体35S：Cas9载体(购自百奥迈科生物技术有限公司)(图1C)，T4连接酶连接，产生KO-GhLSGZ。
实施例2 GhLSGZ基因敲除系Ghlsgz的鉴定
将实施例1的双元转化载体KO-GhLSGZ通过电转导法转导农杆菌菌株LBA4404，通过农杆菌介导转化陆地棉棉花YZ-1获得T0转化体。具体过程为：把6日龄受体无菌苗的下胚轴切成5-6mm片段后，将带有目的基因的农杆菌LBA4404浸染棉花无菌苗下胚轴，接种在愈伤组织诱导培养基上。每30天继代培养一次，在愈伤组织诱导培养基上生长三个月后，将组织物接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，分化产生胚性愈伤组织后，将胚性愈伤组织接种在胚性愈伤组织增殖培养基上，15天继代一次，而后将胚性愈伤组织接种于胚状体诱导培养基中，将长出的正常成熟胚(1厘米左右)接种在生根培养基上使其成苗。所有的培养都是光暗交替14h/10h,28℃下进行。以引物NPT_F/NPT_R(表1)进行PCR鉴定得到转基因阳性敲除突变体(图2A)。进一步地，通过PCR扩增2个独立转化植株的一段含有靶点的片段，测序分析GhLSGZ基因的突变效果，获得突变体Ghlsgz-1和Ghlsgz-2(图2B)。它们由于碱基缺失产生移码和提前终止密码，即功能丧失的截断基因Ghlsgz，如SEQ ID NO：3-4以及SEQ ID NO：5-6所示。
表1卡那霉素抗性基因NPT检测引物序列
实施例3 GhLSGZ功能敲除突变体的T1植株的不含转基因个体的鉴定及表现观察
对上述GhLSGZ功能敲除突变体的转基因T1植株进行转基因(NPT基因)的PCR检测，分离出不含转基因的个体(图3A)。然后观察这些个体的生长，发现这些突变体的主茎和果枝皆变现为有限生长(图3B)。
实施例4 Ghlsgz突变体改良棉花株型的表现
利用不含转基因的Ghlsgz突变体与正常无限生长的陆地棉标准系TM-1杂交获得F1，表现为正常无限性生长。对F1自交产生的F2株系进行观察，发现无限生长个体与有限生长个体分离比例符合两对位点分离预期比例。由于GhLSGZ基因的剂量效应存在，也可观察到一些中间类型表型单株(图4)。选取TM-1为轮回亲本，可将TM-1改造为有限生长习性的材料。
本发明包括以下的实施方案：
1.GhLSGZ基因的定点敲除突变基因Ghlsgz-1，其中所述定点敲除突变基因Ghlsgz-1的Dt拷贝和At拷贝的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和4所示。
2.GhLSGZ基因的定点敲除突变基因Ghlsgz-2，其中所述定点敲除突变基因Ghlsgz-2的Dt拷贝和At拷贝的核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和6所示。
3.根据实施方案1所述的定点敲除突变基因Ghlsgz-1和根据实施方案2所述的定点敲除突变基因Ghlsgz-2在调控棉花株型和成熟期中的应用。
4.根据实施方案3所述的应用，其中所述调控棉花株型是调控主茎和果枝的生长习性，优选调控为主茎和果枝均为有限生长。
5.用于敲除Ghlsgz基因功能的靶点及其互补引物的核苷酸序列，其中所述靶点的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述互补引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8-9所示。
6.一种定点敲除载体，其特征在于所述定点敲除载体包括sgRNA表达盒和CRISPR/Cas9基因编辑元件，所述sgRNA表达盒包含AtU6启动子序列、如SEQ ID No.8-9所示的靶点序列和sgRNA终止子序列；优选地，所述CRISPR/Cas9基因编辑元件包含植物新霉素磷酸转移酶基因表达元件和Cas9基因蛋白表达元件，更优选地，Cas9基因蛋白表达元件中的启动子序列是35S启动子序列。
7.含有根据实施方案6所述的定点敲除载体的重组细胞。
8.根据实施方案7所述的重组细胞在调控棉花株型和成熟期中的应用。
9.根据实施方案8所述的应用，其中所述调控棉花株型和成熟期是调控主茎和果枝的生长习性，优选调控为主茎和果枝均为有限生长。
10.一种定点敲除零式果枝基因GhLSGZ基因的方法，其中所述方法包括将根据实施方案6所述的定点敲除载体导入含有GhLSGZ基因的棉花受体材料，使所述棉花受体材料中的GhLSGZ基因被敲除，获得敲除GhLSGZ基因功能的植株。
11.一种调控棉花株型和成熟期的方法，其中所述方法包括将根据实施方案6所述的定点敲除载体导入含有GhLSGZ基因的棉花受体材料，使所述棉花受体材料中的GhLSGZ基因被敲除，即获得主茎和果枝均为有限生长的棉花材料。
12.一种调控棉花株型和成熟期的方法，其中所述方法包括以下步骤：
1)利用根据实施方案11所述的方法获得主茎和果枝均为有限生长的棉花材料；和
2)将步骤1)中获得的主茎和果枝均为有限生长的植株与正常生长的棉花育种材料杂交，从获得的杂交后代中分离出成熟期早、果枝有限、株型表现不同于T0代而其他性状与正常材料一致，同时不携带外源转基因成分的棉花材料。
13.一种创建主茎和果枝均表现有限生长的棉花新材料的方法，所述方法包括以下步骤:
S1.针对GhLSGZ基因的序列，以一种基因定点编辑系统，选择GhLSGZ基因中的一个靶点，构建目的基因编辑转化载体，其中所述靶点特异靶向GhLSGZ基因的At和Dt亚染色体组的双拷贝；和
S2.使用步骤S1中所获得的目的基因编辑转化载体对受体棉花材料进行定点编辑，获得敲除GhLSGZ基因Dt和At双拷贝的植株，即获得主茎和果枝表现为有限生长的棉花新材料。
14.根据实施方案13所述的方法，其中所述基因定点编辑系统是TALEN系统或CRISPR/Cpf1系统。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述基因定点编辑系统是CRISPR/Cpf1系统，且所述靶点的序列如SEQ ID NO:7所示。
16.根据实施方案13所述的方法，其中所述受体棉花材料是含有GhLSGZ基因的棉花材料。
虽然已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明实质和范围的情况下可以做出多种其他改变和变型。因此，在随附的权利要求书中包括属于本发明范围内的所有这些改变和变型。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 一种创建有限生长株型棉花的方法
<130> GNCJX182359
<141> 2018-12-29
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 525
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 1
atggcaaaac tgtcagatcc tcttgtggtg gggagagtga ttggggatgt tattgatgcc 60
ctctccccat ctgtgaaaat gtcagtcact ttcaacacca acaagcaggt atataatggc 120
catgaatttt ttccatctgc agttactaac aagcctaagg ttgaggttca tggaggtgat 180
atgagatcct ttttcaccct ggtgatgaca gacccagatg ttcctggtcc tagtgaccct 240
tacctgaggg agcacttaca ctggatagtg acagatatcc ccggcacaac agatgccaca 300
tttggaaggg aaatggtgaa ctacgaaatg ccaaggccaa acatagggat ccataggttt 360
gtgttcctcc tcttcaagca gaaaggcagg caaacagtga gaagcatacc atcatcaagg 420
gatcgtttcg ataccaggaa gtttgcagaa gaaaacgaac taggggttcc tgttgcagct 480
gtctatttca atgctcaaag ggaaacagct gctagaagac gctaa 525
<210> 2
<211> 525
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 2
atggcaaaac tgtcagatcc tcttgtggtg gggagagtga ttggggatgt tattgatgcc 60
ctctccccat ctgtgaaaat gtcagtcact ttcaacacca acaagcaggt atataatggc 120
catgaatttt ttccatctgc agttactaac aagcctaagg ttgaggttca tggaggtgat 180
atgagatcct ttttcaccct ggtgatgaca gacccagatg ttcctggtcc tagtgaccct 240
tacctgaggg agcacttaca ctggatagtg acagatatcc ccggcacaac agatgccaca 300
tttggaaggg aaatggtgaa ctacgaaatg ccaaggccaa acatagggat ccataggttt 360
gtgttcctcc tcttcaagca gaaaggcagg caaacagtga gaagcatacc atcatcaagg 420
gatcgtttcg ataccaggaa gtttgcagaa gaaaacgaac taggggttcc tgttgcagct 480
gtctatttca atgctcaaag ggaaacagct gctagaagac gctaa 525
<210> 3
<211> 520
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcaaaac tgtcagatcc tcttgtggtg gggagagtga ttggggatgt tattgatgcc 60
ctctccccat ctgtgaaaat gtcagtcact ttcaacacca acaagcaggt atataatggc 120
catgaatttt ttccatctgc agttactaac aagcctaagg ttgaggttca tggaggtgat 180
atgagatcct ttttcaccct ggtgatgaca gacccagatg ttcctggtcc tagtgaccct 240
tatgagggag cacttacact ggatagtgac agatatcccc ggcacaacag atgcatttgg 300
aagggaaatg gtgaactacg aaatgccaag gccaaacata gggatccata ggtttgtgtt 360
cctcctcttc aagcagaaag gcaggcaaac agtgagaagc ataccatcat caagggatcg 420
tttcgatacc aggaagtttg cagaagaaaa cgaactaggg gttcctgttg cagctgtcta 480
tttcaatgct caaagggaaa cagctgctag aagacgctaa 520
<210> 4
<211> 524
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcaaaac tgtcagatcc tcttgtggtg gggagagtga ttggggatgt tattgatgcc 60
ctctccccat ctgtgaaaat gtcagtcact ttcaacacca acagcaggta tataatggcc 120
atgaattttt tccatctgca gttactaaca agcctaaggt tgaggttcat ggaggtgata 180
tgagatcctt tttcaccctg gtgatgacag acccagatgt tcctggtcct agtgaccctt 240
acctgaggga gcacttacac tggatagtga cagatatccc cggcacaaca gatgccacat 300
ttggaaggga aatggtgaac tacgaaatgc caaggccaaa catagggatc cataggtttg 360
tgttcctcct cttcaagcag aaaggcaggc aaacagtgag aagcatacca tcatcaaggg 420
atcgtttcga taccaggaag tttgcagaag aaaacgaact aggggttcct gttgcagctg 480
tctatttcaa tgctcaaagg gaaacagctg ctagaagacg ctaa 524
<210> 5
<211> 517
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggcaaaac tgtcagatcc tcttgtggtg gggagagtga ttggggatgt tattgatgcc 60
ctctccccat ctgtgaaaat gtcagtcact ttcaacacca acaagcaggt atataatggc 120
catgaatttt ttccatctgc agttactaac aagcctaagg ttgaggttca tggaggtgat 180
atgagatcct ttttcaccct ggtgatgaca gacccagatg ttcctggtcc tagtgaccct 240
tactgaggga gcacttacac tggatagtga cagatatccc cggcacaaca gatttggaag 300
ggaaatggtg aactacgaaa tgccaaggcc aaacataggg atccataggt ttgtgttcct 360
cctcttcaag cagaaaggca ggcaaacagt gagaagcata ccatcatcaa gggatcgttt 420
cgataccagg aagtttgcag aagaaaacga actaggggtt cctgttgcag ctgtctattt 480
caatgctcaa agggaaacag ctgctagaag acgctaa 517
<210> 6
<211> 524
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcaaaac tgtcagatcc tcttgtggtg gggagagtga ttggggatgt tattgatgcc 60
ctctccccat ctgtgaaaat gtcagtcact ttcaacacca acaagcaggt atataatggc 120
catgaatttt ttccatctgc agttactaac aagcctaagg ttgaggttca tggaggtgat 180
atgagatcct ttttcaccct ggtgatgaca gacccagatg ttcctggtcc tagtgaccct 240
taccgaggga gcacttacac tggatagtga cagatatccc cggcacaaca gatgccacat 300
ttggaaggga aatggtgaac tacgaaatgc caaggccaaa catagggatc cataggtttg 360
tgttcctcct cttcaagcag aaaggcaggc aaacagtgag aagcatacca tcatcaaggg 420
atcgtttcga taccaggaag tttgcagaag aaaacgaact aggggttcct gttgcagctg 480
tctatttcaa tgctcaaagg gaaacagctg ctagaagacg ctaa 524
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaacaagca ggtatataat ggc 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gattgccatt atatacctgc ttgt 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acaagcaggt atataatggc caaa 24

Claims (10)

1.GhLSGZ基因的定点敲除突变基因Ghlsgz-1，其特征在于所述定点敲除突变基因Ghlsgz-1的Dt拷贝和At拷贝的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和4所示。
2.GhLSGZ基因的定点敲除突变基因Ghlsgz-2，其特征在于所述定点敲除突变基因Ghlsgz-2的Dt拷贝和At拷贝的核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和6所示。
3.根据权利要求1所述的定点敲除突变基因Ghlsgz-1和根据权利要求2所述的定点敲除突变基因Ghlsgz-2在调控棉花株型和成熟期中的应用。
4.用于敲除Ghlsgz基因功能的靶点及其互补引物的核苷酸序列，其特征在于所述靶点的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述互补引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8-9所示。
5.一种定点敲除载体，其特征在于所述定点敲除载体包括sgRNA表达盒和CRISPR/Cas9基因编辑元件，所述sgRNA表达盒包含AtU6启动子序列、如SEQ ID No.8-9所示的靶点序列和sgRNA终止子序列；优选地，所述CRISPR/Cas9基因编辑元件包含植物新霉素磷酸转移酶基因表达元件和Cas9基因蛋白表达元件，更优选地，Cas9基因蛋白表达元件中的启动子序列是35S启动子序列。
6.含有根据权利要求5所述的定点敲除载体的重组细胞。
7.一种定点敲除零式果枝基因GhLSGZ基因的方法，其特征在于所述方法包括将根据权利要求5所述的定点敲除载体导入含有GhLSGZ基因的棉花受体材料，使所述棉花受体材料中的GhLSGZ基因被敲除，获得敲除GhLSGZ基因功能的植株。
8.一种调控棉花株型和成熟期的方法，其特征在于所述方法包括将根据权利要求5所述的定点敲除载体导入含有GhLSGZ基因的棉花受体材料，使所述棉花受体材料中的GhLSGZ基因被敲除，即获得主茎和果枝均为有限生长的棉花材料。
9.一种调控棉花株型和成熟期的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1)利用根据权利要求8所述的方法获得主茎和果枝均为有限生长的棉花材料；和
2)将步骤1)中获得的主茎和果枝均为有限生长的植株与正常生长的棉花育种材料杂交，从获得的杂交后代中分离出成熟期早、果枝有限、株型表现不同于T0代而其他性状与正常材料一致，同时不携带外源转基因成分的棉花材料。
10.一种创建主茎和果枝表现有限生长的棉花新材料的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:
S1.针对GhLSGZ基因的序列，以一种基因定点编辑系统，选择GhLSGZ基因中的一个靶点，构建目的基因编辑转化载体，其中所述靶点特异靶向GhLSGZ基因的At和Dt亚染色体组的双拷贝；和
S2.使用步骤S1中所获得的目的基因编辑转化载体对受体棉花材料进行定点编辑，获得敲除GhLSGZ基因Dt和At双拷贝的植株，即获得主茎和果枝表现为有限生长的棉花新材料。
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