CN107090465B - 一种适合在作物中表达的中性植酸酶基因、表达盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种适合在作物中表达的中性植酸酶基因、表达盒及其用途。该中性植酸酶基因由芽孢杆菌中的中性植酸酶基因经高等植物优选密码子优化而来，为使该基因产物能分泌到胞外，在基因的5'端加有一段胡萝卜的分泌信号肽编码序列，此融合基因由根系优先表达的水稻RCg2基因启动子驱动，Nos终止子终止，经基因枪共转化，该融合基因的表达盒被转入作物，在植酸磷为唯一磷源的MS培养基上培养后，转基因植株的生物量显著高于对照，说明转基因植株能有效利用培养基中的植酸磷，预示该基因在提高作物对中性土壤植酸磷的利用效率方面有潜在应用价值。

Description

一种适合在作物中表达的中性植酸酶基因、表达盒及其用途

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种适合在作物中表达的中性植酸酶基因、表达盒及其在提高作物有机磷利用效率方面的用途。

背景技术

磷是作物生长最重要的大量元素之一，为实现作物高产，通常要使用大量的磷肥，但磷肥施入土壤后，很快被土壤颗粒吸附并形成难溶的磷酸盐，大大减低了磷肥的有效性。近些年，随着秸秆还田措施的实施和畜禽养殖业的发展，大量的有机磷施用到土壤当中，提高了土壤有机磷的含量。自然条件下，作物能分泌一些有机酸和少量磷酸酯酶（主要是植酸酶），降低根际pH，分解一些难溶的磷酸盐和有机磷，但效率较低。

土壤中总有机磷含量的20-50%为植酸磷，为提高作物对植酸磷的利用能力，人们通过在作物中过量表达或组织特异性表达外源植酸酶基因，已取得了较好的进展。比如，专利号为ZL200510105543.0的中国专利报道，在玉米和油菜中过表达来自于黑曲霉的植酸酶基因提高了这两种作物对培养基中有机磷的利用效果；Hong等人在甘薯中过表达来自于大肠杆菌的appA基因，不但提高了对土壤有机磷的利用率，还提高了甘薯的产量；申请号为200910036465.1的中国发明专利报道说，在大豆中过表达来自拟南芥的紫色酸性磷酸酶基因提高了大豆获取沙培中植酸磷的能力，进而增加了转基因大豆的生物量和磷吸收量。目前在作物中表达的微生物来源的植酸酶基因，其最适pH几乎都偏酸性，一般在2.5-6.0，植物来源的植酸酶最适pH范围较窄，一般在4.8-6.0，两种来源的植酸酶pH都偏酸性，因此，这些转植酸酶基因的作物比较适合在偏酸性的土壤上种植。

我国的土壤类型众多，总的趋势是南方的土壤多偏酸性，中部的土壤偏中性，而北方的土壤多偏碱性，如何提高中碱性土壤上作物对植酸磷的利用效率还是一个值得研究的问题。

在水产养殖方面，申请号为201110171735.7的中国发明专利公开了一种来自芽孢杆菌的中性植酸酶PhyH，其最适pH为7.0，在pH6.0-8.0范围内有80%以上相对酶活性，该基因比较适合在中性土壤上种植的作物应用，只是直接在作物中表达来自芽孢杆菌的中性植酸酶基因，表达效率会比较差，由于原核生物和高等植物的密码子使用效率有一些差别，会导致基因的表达水平比较低，进而影响其作用效果，因此，如何提高上述中性植酸酶基因在作物中的表达效率是本发明所要解决的关键问题。

发明内容

本发明提供了一种适合在作物中表达的中性植酸酶基因、表达盒及其在作物高效利用中性pH条件下植酸磷能力方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种适合在作物中表达的中性植酸酶基因，具有如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

进一步地，还可以将序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列经过一个或几个碱基的替换和/或缺失和/或添加但其作用效果并未明显改变的DNA序列。

进一步地，所述中性植酸酶基因，是由芽孢杆菌的中性植酸酶基因PhyH经高等植物优选密码子优化而来。

本发明还提供一种融合表达基因，在权利要求1所述的中性植酸酶基因的5´端连接一段用于胞外分泌的信号肽编码序列和GCC三个碱基，GCC三个碱基连接在信号肽编码序列的3´端。

进一步地，所述的胞外分泌的信号肽编码序列为胡萝卜的胞外分泌信号肽编码序列，具有如SEQ ID NO.2所示的序列。

一种中性植酸酶基因的表达盒，在上述的融合表达基因的5´端与一个基因启动子连接，其3´端与一个转录终止子连接。

进一步地，所用的基因启动子可以是组成型启动子也可以是根特异启动子或根优先表达启动子，优选的基因启动子为根优先表达启动子，所述的基因启动子为水稻的RCg2基因启动子，具有如SEQ ID NO.4所示的序列；使用的转录终止子可来源于Nos终止子、35S终止子等，优选的为Nos终止子，具有如SEQ ID NO.5所示的序列。

一种中性植酸酶基因的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体含有上述的表达盒，所述重组表达载体为pUC57-优化中性植酸酶基因。

本发明还提供了一种适合在作物中表达的中性植酸酶基因的用途，其特征在于利用所述中性植酸酶基因的表达盒转化作物能够提高作物在中性pH条件下对植酸磷的利用效率。

进一步地，用所述中性植酸酶基因的表达盒转化作物，并从中筛选出对植酸磷利用效率显著提高的转基因作物。

进一步地，所述作物包括双子叶作物和单子叶作物，优选的单子叶作物为小麦。

进一步地，转化小麦的方法是，用中性植酸酶基因的表达盒与含Bar基因的质粒混合对小麦幼胚或幼胚愈伤组织进行基因枪共转化，抗性再生植株经PCR检测和定量PCR检测，从中筛选出中性植酸酶基因高表达且植酸磷利用效率显著提高的转基因小麦。

本发明的优点和有益效果：

用本发明的中性植酸酶基因转化小麦，在转基因后代中选择中性植酸酶基因高表达的转基因株系与非转基因的受体对照一起发芽，然后选择大小一致的幼苗分别移栽到植酸磷为唯一磷源的pH为7.0的MS培养基上，经过1周的生长，转基因幼苗比非转基因幼苗鲜重提高了89%，说明本发明的中性植酸酶基因能够提高小麦的植酸磷利用效率。

附图说明

图1是转T0代转中性植酸酶小麦的PCR检测图谱；

图中M为分子量标准；-ck为未作转化的小麦；1-8为部分T0代转基因植株。分子量较大的扩增片段为Bar基因的扩增片段，分子量较小的扩增片段为中性植酸酶基因的扩增片段。

图2是高表达中性植酸酶基因的转基因小麦与未转化的对照小麦在植酸磷为唯一磷源的MS培养基上生长情况对比；

图中A为转中性植酸酶基因小麦；B为未转化的受体小麦；

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

实施例中所用试剂如无特别说明均购自上海生工生物工程技术有限公司，所用引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

实施例1：适合在作物中表达的中性植酸酶基因的优化

中国发明专利“一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH及其基因和应用”（专利授权公告号CN102250853B）公开了一种来自芽孢杆菌（Bacillus sp. HJB17）的中性植酸酶及其基因，该中性植酸酶的最适pH为7.0，在pH6.0-8.0范围内有80%以上相对酶活性，其最适反应温度为35℃，在20-35℃范围内有60%左右的酶活性，并且在0℃还有20%的酶活性，该中性植酸酶由40个氨基酸的信号肽和644个氨基酸的成熟蛋白2部分组成。为在作物中高效表达该中性植酸酶基因，对该基因的成熟蛋白编码基因按高等植物偏爱的密码子进行了优化，优化后的成熟蛋白编码序列命名为序列表中的SEQ ID NO.1，其长度为1815bp,与原序列的相似性仅为72%，GC含量也由原来的55.65%提高到了60.17%。

实施例2：中性植酸酶基因克隆载体的构建

为使表达的成熟中性植酸酶能分泌到胞外，需要在成熟中性植酸酶基因的5′端加一段信号肽编码序列，选用的信号肽编码序列为来自于胡萝卜的分泌信号肽编码序列，长度96bp,其序列为如SEQ ID NO.2，为使信号肽能顺利切除，在信号肽编码序列的3´添加了GCC （SEQ ID NO.3）3个碱基。用于驱动中性植酸酶基因表达的启动子选用在根中优先表达的水稻RCg2基因(Plant Molecular Biology 27: 237-248, 1995)的启动子，长度1118bp，其序列如SEQ ID NO.4所示，用于目的基因转录终止的终止子选用Nos终止子，长度265bp，其序列如SEQ ID NO.5所示，为便于用PCR扩增该中性植酸酶基因的整个表达框以及用内切酶从表达载体上切下整个表达框，分别在表达框的两端各加上一段人工序列，加在启动子前端的人工序列如SEQ ID NO.6所示，加在终止子之后的人工序列如SEQ ID NO.7，包括上述各段序列的完整序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司化学合成，并把整个合成序列连接到克隆载体pUC57的EcoR V位点得到优化中性植酸酶基因的重组表达载体pUC57-优化中性植酸酶基因。

实施例3：中性植酸酶基因对小麦的遗传转化

根据上述优化中性植酸酶基因表达框两端的人工DNA序列合成一对引物，上游引物如SEQ ID NO.8所示，下游引物如SEQ ID NO.9所示，以重组表达载体pUC57-优化中性植酸酶基因为模板进行PCR扩增，扩增条件为94℃,3 min; 94℃,30 s;60℃,30 s;72℃,4min;30个循环；72℃，10 min。扩增产物经电泳检测，片段大小无误后再用试剂盒纯化。纯化后的中性植酸酶基因线性表达盒送到中国科学院遗传与发育生物学研究所进行基因枪共转化，共转化用的植物筛选标记基因为Bar基因（含Bar基因的质粒由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供），中性植酸酶基因的线性表达盒与含Bar质粒的用量比为1:1，转化的受体材料为科农199的幼胚愈伤（科农199由中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心培育），转化得到的T0代抗性再生植株用Bar基因和优化中性植酸酶基因的混合检测引物进行PCR检测。Bar基因的PCR检测引物为，Bar-F：GTCTGCACCATCGTCAACC（SEQ IDNO.10）和Bar-R：GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC（SEQ ID NO.11），扩增片段长度为445bp；优化中性植酸酶基因的PCR检测引物为Phy-P3：CGCTACGGCCTGAACTGG（SEQ ID NO.12）和Phy-P4:GCCTCGCCGGTCGTGGTAGC（SEQ ID NO.13），扩增片段长度为404bp。Bar基因和优化中性植酸酶基因的PCR扩增参数均为94℃ 3分钟，94℃ 45秒，60℃ 45秒，72℃ 1分钟，33个循环，72℃ 7分钟，图1给出了部分抗性再生植株的PCR检测结果，扩增片段大小与预期大小相符，说明中性植酸酶基因已整合到小麦的基因组中。

实施例4：转基因小麦对有机磷的利用效果

目的基因PCR检测呈阳性的T0代植株进行自交，T1代继续进行目的基因的PCR检测，并对部分纯合的T2代株系进行目的基因的定量PCR检测，方法是用北京全式金生物技术有限公司生产的ER301试剂盒提取根和叶的总RNA，然后用天根生化科技有限公司生产的KR106试剂盒反转录成cDNA,最后用天根的FP205试剂盒进行定量PCR检测,从目的基因表达量高的株系中收获种子。为检测转基因小麦对有机磷的利用效果，把从目的基因表达量高的株系中收获的种子与没有转化的对照种子（科农199）发芽后选生长一致的小苗放在植酸钠（Sigma公司生产）为唯一磷源的MS培养基（KH₂PO₄替换为等摩尔的植酸钠，pH值7.0）上23℃光下生长1周，然后调查幼苗的生长情况。试验设3次重复，每个重复10棵苗，调查时幼苗用自来水冲洗干净并用吸水纸吸干后称取每个重复的幼苗鲜重。图2为部分转基因幼苗与对照幼苗在植酸磷为唯一磷源的MS培养基上生长1周后的情况，表1为幼苗鲜重的调查结果，很明显转基因苗能更有效的利用培养基中的有机磷，这为转该中性株酸酶基因的作物有效利用中性土壤中的植酸磷奠定了基础。

表1转基因与对照幼苗在有机磷为唯一磷源的MS培养基上生长7天后的鲜重(g)

。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省农林科学院遗传生理研究所

<120> 一种适合在作物中表达的中性植酸酶基因、表达盒及其用途

<130> 2017

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1815

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctgttcaac ccctctccgt caacgcttcg cacttccata aggttcaact cgctgggcag 60

gactaccaac tgttcaccac gaccaccgcc ctgcagatca ggcaaggcaa cagagagctc 120

gctcaacagg ctgggcaatt ctcgagactc gtcctgcagc cactcgacac ggatgctctc 180

ctgctcgctg cgatggacat caacagcaac accctcttcc tgtggagatt cagcacgaag 240

caaacccctt cgctgcagct gctccaaagg agactcatct ccagcagggt ggtcgacgat 300

ctctgcttct accactcgac cgagaaccaa cagctctcac tgttcctgct cggcgggagg 360

ggcggggctg accaactgct cctgcaacag caacagcaat ggctggctca gcctgttgtg 420

atcagagagc tcaacatccc ttacgatagc acggcgtgcg tcgttgacca aaccgctggc 480

gctctctaca tcgctgaggc tgatcgggcc atctggagat accaagctga gccagaggct 540

gacgagggca ggtccctggt ccaggttaac aagccgttcg gccagctcca aggggaggtg 600

aaggcgctgc agaccctctc cgatggcagc ctcctggctc tggaggaggc tcctgctcgg 660

ctcctgcata tcaactcaga cggccaactc agatctgcta tcgctgtgcc tgctctggct 720

gaggcttctg gcctcgccgt ctccatgcag gggaacacgg cgaccgctta catctccacc 780

gaggacgctg gcgctgtcca gcaactggct gtggtcccac aggctaagcc tgagagacaa 840

cctaaggctc ctgttgtgca gctcctgccc acgctccaaa ccgagcctgc ttcccagaga 900

ggcgacgtca tggacgatcc agctgtttgg caccatccag ctaggcctga gctctccctg 960

atcctcggca cggataagag agctgggctc gacgtgtaca acatgcaagg cacccgggtg 1020

cagcaactgt cagtcgggag gctcaacaac gtggatgtcc gctacggcct gaactggcaa 1080

gggtctgctc acgacatcgc tgtggcttcc ctcagagacg ataacagcct gcagctcttc 1140

gccatcgact cgtcaggcac gctgcataac gcggggaagg tcgctacctc aatgtctgag 1200

atctacggcc tctgcatgta ccactcggcg caatcaaaca agcattacgt tttcgtgaac 1260

gacaaggccg gcctcatcca gcaatacaga atcgacaccg atggcgacca ctggcagggg 1320

tctctggtta gggctctcca ggtgccttcc caacctgagg gctgcgttgc ggacgatatc 1380

agaggcctcc tgttcgtggg ggaggaggat gctgctatct ggagattcgc tgctgaggct 1440

gaggctacca cgaccggcga ggcgatcatc agagtggacg gggagagact ggtcgacgat 1500

atcgagggca tcaccctcgc cgagcacaac gggtcttcct acctcctggt cagctcgcag 1560

ggcaacgata gctacctggt tttcgacgct gctccacctt acacggagag gccacatttc 1620

cgcatcggca ccaaccctct cctgggcatc gacggggcta gcgagaccga tggggtcgac 1680

gttacgacca ggtcgctcgg ccctgggttc gagcaaggcg ccttcatcgt gcaggacggg 1740

cggaacagaa tgcctgagca ggggcagaac ctcaagctgg tcccgtgggc cgacatcctc 1800

caacaactca actga 1815

<210> 2

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggaagaa ttgctagagg ctcaaaaatg agttctctca ttgtgtcttt gcttgtagta 60

ttggtgtcac tcaatttggc ttccgaaacc acagct 96

<210> 3

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcc 3

<210> 4

<211> 1118

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagcccgtgc gttccttcct atctcgagag aggccaagct aagcacggat cacggaaggc 60

gacggacaaa cagtagcaaa agccggagga gcatcgccat cgacacacgg cgttgcttgt 120

gagctgtgat cacactgatg agtcacccgt cgttttcgaa cttgcctagt actactccta 180

ttggtttcgt ggcatggcat gggacagaga catcgctcca tgatatccta cggagcagaa 240

ctgctttttc acacacgtgg atggttccct cgagaaatct tgggcaaatc actttccgaa 300

gaacactata ctagacagaa gttggtatgg aagatgagcc attctttgca cgctccgatg 360

ggcgatggtt atcttgtaga ccagcacact tgcttgctac ttccaccttt cactcatatt 420

ttaagttaat tgttttctca agtttggatt gcttaccacg aataccacat ggtattttag 480

ataaaatttt gatcatctat ataactaata aaatgcgaga tatattatgc tacaaaaggt 540

atatcattgg atttgtactt gaaagatgtt tcacatggta taataatatt gtagttcata 600

tttttctagt taaatttatg aaaaaaacat aaatcactcg cgcgagaggg gtcgtcgagc 660

gtagttagtt ttttctaccc cataattttc ctcaactgtt ttttaattat cggcgcaagg 720

cttcgcccaa ttcatttctt acaaggtgat ataagaatta aatacaacac tttttttctt 780

tcttttagtg gaataatttt ttctttccaa caaggggaaa aaacttgttg acgtgcaaag 840

ctgaaaagtt ccaaaccttt tcgtcttcac tgatcaacct cacgctctcg gtttcctttc 900

gtctcgtccc gttccgccgt cccgtgccgg accgccccac ccaccacact ccctcccgga 960

gcagttcaca gtctccactc cacctcccac ctataaatct cctcatcgcc gccgttcctc 1020

gtcccgtcct cactcctcct ccccttccgc aatcccctcg cttcgcacgg cgaagcagcc 1080

agagccagag cccgccttcc agaaccaacc cgcccacc 1118

<210> 5

<211> 265

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 60

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 120

catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 180

catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 240

ggtgtcatct atgttactag atcgg 265

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagcttccac agccagggca tcaaag 26

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aatgagggac ttgttcttct ggctgaattc 30

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccacagccag ggcatcaaag 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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<211> 20

<212> DNA

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<400> 11

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<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgctacggcc tgaactgg 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcctcgccgg tcgtggtagc 20

Claims (9)

1.一种适合在作物中表达的中性植酸酶基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种融合表达基因，其特征在于，在权利要求1所述的中性植酸酶基因的5´端连接一段用于胞外分泌的信号肽编码序列和GCC三个碱基，GCC三个碱基连接在信号肽编码序列的3´端。

3.根据权利要求2所述的融合表达基因，其特征在于，所述的胞外分泌的信号肽编码序列为胡萝卜的胞外分泌信号肽编码序列，所述序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种中性植酸酶基因的表达盒，其特征在于，在权利要求2或权利要求3所述的融合表达基因的5´端与一个启动子连接，其3´端与一个终止子连接。

5.根据权利要求4所述的中性植酸酶基因的表达盒，其特征在于，所述的启动子为水稻的RCg2基因启动子，其序列如SEQ ID NO.4所示；所述的终止子为Nos终止子，其序列如SEQID NO.5所示。

6.一种中性植酸酶基因的重组表达载体，其特征在于，含有权利要求4或权利要求5所述的表达盒，所述重组表达载体为pUC57-优化的中性植酸酶基因。

7.一种权利要求4或5所述的表达盒的用途，其特征在于，用所述的表达盒转化作物提高作物在中性pH条件下对植酸磷的利用效率；所述作物为小麦。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，用所述中性植酸酶基因的表达盒转化小麦，并从中筛选出中性条件下对植酸磷利用效率提高的转基因作物。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述转化小麦的方法是用中性植酸酶基因的表达盒与含Bar基因的质粒混合对小麦幼胚愈伤组织进行基因枪共转化，并从转化后代中筛选出中性对植酸磷利用效率提高的转基因小麦。