CN1566337A - 一种利用转基因植物生产植酸酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用转基因植物生产植酸酶的方法，目的是提供一种利用基因工程方法在转基因植物中高效生产植酸酶的方法。本发明的技术方案是构建含有植酸酶基因的植物表达载体，用基因枪微弹轰击受体植物的外植体，得到转基因植株，使植酸酶基因在转基因植株的种子中高效表达。采用本发明方法所得到的富含植酸酶的转基因植物可直接、方便而有效地应用于动物饲料中，以降解植物自身的植酸磷，来满足动物对磷源的需求，不仅提高动物对饲料中磷的利用率，也缓解动物高磷粪便造成的环境污染。

Description

一种利用转基因植物生产植酸酶的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中利用转基因植物生产目的物的方法，尤其是涉及利用转基因植物生产植酸酶的方法。

背景技术

磷是动物生长、发育、繁殖所必需的重要矿物元素。植酸磷(六磷酸肌醇)，是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1-5％，占植物中总磷的60-80％(Nelson T.S.et al.，Poultry Sci.47：1842-1848，1968)，是动物饲料中的重要成分。但是由于单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶，导致以植酸磷形式存在的磷不能被直接利用，其利用率仅有0-40％，从而在饲养过程中造成了许多问题：一、磷源浪费。首先是饲料中磷源不能得到有效利用；其次，为了满足动物对磷的需求，实际生产中要在饲料中额外添加无机磷，因此提高了饲料成本。二、形成的高磷粪便污染环境。饲料中85％左右的植酸磷不能被动物有效利用而直接排出体外，造成严重的土壤和水源磷污染，引发例如水环境的富营养和藻类过度生长等不良情况。三、植酸磷是抗营养因子，在动物胃肠道的消化吸收过程中与钙及其它多种金属离子、蛋白质和一些营养物质结合，形成不易被单胃动物吸收和利用的鏊合物，不但造成磷源浪费而且影响了这些营养物质特别是钙离子的吸收利用，不仅增加了饲料成本还降低了动物生产性能。

我国是世界上最大的禽畜养殖大国，每年产生禽畜粪便高达17.3亿吨，因高磷粪便带来的环境污染问题非常严重，同时，我国也是缺磷大国，磷是我国饲料业中仅次于蛋白质的第二大缺口资源。其实，饲料作物如谷物、玉米、大豆、油菜等的总磷含量一般在1％左右，其含量足已满足动物对磷的营养需求。如何通过品质改良来提高饲料作物中磷的可利用率，减轻高磷粪便造成的污染问题，是我国禽畜业需要解决的迫切问题。

植酸酶是一种能将植酸磷降解成肌醇和无机磷酸的酶，作为饲料添加剂它可使玉米等植物性饲料中磷的利用率提高60％，动物粪便中磷的排出量减少40％，从而减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本，减少高磷粪便造成的环境污染，还可降低植酸磷的抗营养作用。植酸酶作为新型单胃动物饲料添加剂，主要应用于猪、鸡、鸭等单胃动物和水产养殖类动物，应用范围广、需求量大，其优良的饲喂效果在世界范围内得到确认，对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。(Ware J.H.et al.，US Patent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition101：1289-1294，1971)。

随着植酸酶的发现和应用，人们意识到通过基因工程手段来提高饲料作物中磷的可利用率是一更有效、更切实可行的思路，它的基本原理是在不降低作物中植酸磷本身含量的情况下，在植酸磷存在的同时也使作物含有植酸酶，在动物消化过程中自动将植酸磷降解成可利用的无机磷。

目前，国内外对植酸酶和植酸酶基因的应用研究主要集中在利用基因工程手段，以微生物(包括原核和真核)作为生物反应器(Bioreactor)，提高植酸酶的表达量，生产植酸酶，用作饲料添加剂。转基因植物为多种外源蛋白提供了极具吸引力的表达系统，国内外利用转植酸酶基因作物来生产植酸酶的研究近几年才开始尝试。1993年Jan Pen等率先利用植酸酶基因进行的转基因植物品质改良，将来源于A.niger的植酸酶基因phyA转移到植物烟草中，用35S启动子控制phyA，并用烟草的PR-S蛋白的信号肽序列取代phyA上原有的信号肽序列。结果发现，烟草酸酶可以消除植酸磷的抗营养作用，提高饲料中多种营养因素和蛋白质的利用率，大大提高动物的生产性能。植酸酶基因phyA转移到烟草中，植酸酶在烟草中表达，但是并不影响烟草的形态、生长、及种子的萌发。同时对动物的饲喂试验结果表明，转基因烟草的烟草种子具有良好的饲喂效果。1997年，Lia Li等已在大豆悬浮培养细胞中表达并分泌出具有生物学活性的植酸酶。这些结果证明这一思路的可行性。

发明创造内容

本发明目的是提供一种利用基因工程方法在转基因植物中高效生产植酸酶的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种利用转基因植物生产植酸酶的方法，是构建含有植酸酶基因的植物表达载体，用基因枪微弹轰击受体植物的外植体，得到转基因植株，使植酸酶基因在转基因植株的种子中高效表达。

本发明的植酸酶基因来源于Aspergillus sp.98(曲霉)(专利号为ZL01142162.2)。

首先构建用于单子叶植物转化的植酸酶基因种子特异性表达载体：将编码植酸酶的核苷酸序列置于单子叶种子特异性启动子驱动之下，加上引导基因产物分泌和定位的信号肽序列，控制基因产物的定位。该信号肽序列可以引导植酸酶分泌到细胞间隙。

为了便于筛选成功转化的植物，另外构建选择标记基因表达载体PHP17042Bar，提供除草剂抗性的选择性标记。

为了选育得到表达植酸酶而且不含筛选标记基因的转基因植物，更符合安全性要求，通过共转化策略(Co-transformation)，将抗性选择标记基因和植酸酶基因分别构建于不同的表达载体上，这样在转基因植物后代选育中，可以利用后代分离，得到表达植酸酶且不含筛选标记基因的转基因植物。

所述植酸酶基因构建到植物表达载体是通过如下方法完成：

a)植酸酶基因插入到植物表达载体pSPHP3303上得到表达载体pSPHP3303Phy，编码基因为SEQ ID №：1；

b)植酸酶基因与信号肽序列读码框吻合地融合后，插入到植物表达载体pSPHP3303上得到表达载体pSPHP3303Tphy，编码基因为SEQ ID №：2。

所述的表达载体pSPHP3303Phy和pSPHP3303Tphy分别与抗性选择标记基因表达载体PHP17042Bar等摩尔比混合后，用于基因枪微弹制备。为了去掉细菌复制子、抗生素选择标记等成分，所述的表达载体pSPHP3303Phy和pSPHP3303TPhy以及选择标记基因表达载体PHP17042Bar可以去除细菌骨架DNA后，得到pSPHP3303TPhy和pSPHP3303Phy的植酸酶基因表达盒以及PHP17042Bar的Bar基因的表达盒，将Bar基因的表达盒分别与以上两种植酸酶基因表达盒等摩尔比混合，用于基因枪微弹制备。

所述外植体优选为玉米幼胚或幼胚诱导形成的愈伤组织。

本发明方法，将来源于微生物并能耐受饲料制粒等高温加工的植酸酶基因转移到饲料用植物品种中，并在植物器官(种子、叶片、茎杆)中高效、定点表达，培育富含植酸酶的植物饲料品种，可以大量、廉价生产植酸酶。而且富含植酸酶的转基因植物可直接、方便而有效地应用于动物饲料中，以降解植物自身的植酸磷，来满足动物对磷源的需求，而无须在饲料中添加磷酸氢钙或添加通过发酵技术生产的植酸酶添加剂，不仅提高动物对饲料中磷的利用率，也缓解动物高磷粪便造成的环境污染。无论从经济角度还是从使用方便的角度来说，都更为优越。其优势如下：1、原材料通过农业方式获得生产成本低廉，而且通常这些植物材料是饲料的主要成分，可以直接饲喂动物或加工饲料；2、相对于发酵的方法，使用植物生物反应载体，无需发酵工艺必不可少的设备，大大降低了资本投资；3、使用植物生物载体生产规模可以迅速扩大。本发明的转基因植物种子作为磷源植物饲料可以得到广泛应用。

附图说明

图1为表达载体pSPHP3303的物理图谱

图2为选择标记基因表达载体PHP17042Bar的物理图谱

图3为植酸酶基因中间载体pGEM5ZfPhy的物理图谱

图4为PCR扩增得到的植酸酶基因电泳图谱：1、空白对照；2、植酸酶基因(1.3Kb)；3、100bp ladder分子量标准

图5A为不带信号肽序列植物表达载体的物理图谱

图5B为带胞外分泌信号肽序列植物表达载体的物理图谱

图6为表达载体的酶切电泳图，1、分子量标准1Kb Ladder，2、PHP17042Bar(HindIII和SacI双切)，3、pSPHP3303Phy(NdeI酶切)，4、pSPHP3303Tphy(NdeI酶切)

图7为用于转化的DNA片段的电泳图谱：1、Bar基因表达盒，2、Tphy基因表达盒，3、Phy基因表达盒，4、分子量标准1Kb Ladder

图8为再生玉米植株PCR检测植酸酶基因的电泳图谱，1-15为再生玉米植株，其中4、5、7为PCR阴性，16分子量标准100bp ladder，17阳性对照，18阴性玉米植株对照

图9为再生玉米植株PCR检测Bar基因的电泳图谱，1阳性对照，2-11为再生玉米植株，8分子量标准100bp ladder，12阴性玉米植株对照

图10为转基因玉米基因组DNA酶切电泳图谱，1和2：样品1分别由BamH I和EcoR V酶切；3和4：样品2分别由BamH I和EcoR V酶切；5和6：样品3分别由BamHI和EcoR V酶切；7和8：阴性对照分别由BamH I和EcoR V酶切

图11为转基因玉米基因组DNA的杂交结果X光片，1和2：样品1，3和4：样品2，5：样品3

图12为磷酸盐标准曲线

图13为玉米子粒中植酸酶活性的测定流程

具体实施方式

实施例1：植酸酶表达载体的构建

1、材料的准备：

植酸酶基因：使用专利号为ZL01142162.2的植酸酶基因。

菌种：大肠杆菌E.coli DH5α、JM109。

工具酶和修饰酶：各种限制性内切酶、修饰酶、pGEM5Zf质粒和T-载体购自Promega公司，New England Biolabs公司和Gibco公司。

化学试剂：酵母浸膏和胰蛋白胨购自OXOID公司，CHU(N6)大量盐购自Gibco公司，组织培养用的其它试剂和激素购自Sigma公司。其它化学试剂均为国产分析纯。引物合成：由北京赛百盛生物工程公司和上海博亚生物技术有限公司合成。测序：由上海博亚生物技术有限公司完成。基因枪及所用耗材：购自Bio-Rad公司。

2、选择标记基因表达载体构建

Bar从中间载体上酶切克隆到pGEM5Zf上，连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定测序后得到pGEM5Zf Bar，Bam HI和EcoV酶切pGEM5ZfBar，Bam HI和PstI酶切PHP17042，分别回收目的片段，将两片断按照3∶1的摩尔比混合加入T4DNA连接酶，16℃连接4小时以上(以下凡涉及回收、连接操作，方法均同于此)。连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定后得到选择标记基因表达载体PHP17042Bar。(如图2所示)

3、植酸酶基因中间载体构建：

以载体Te-phy-2为模板，用以下一对引物进行PCR扩增，得到植酸酶基因(如图4所示)。pGEM5Zf载体用EcoV酶切，与PCR产物经过连接，连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定测序后，得到载体pGEM5ZfPhy(如图3所示)。

PCR引物：(分别在上、下游引物设计Bam HI和HpaI位点，下划线处)

正向引物：5’GGATCCATGTCCAAGTCCTGCGATAC

反向引物：5’GTTAACCTATTATCAACTAAAGCACTCTCCCC

4、不带信号肽的植酸酶植物表达载体构建

用Bam HI和HpaI酶切pGEM5ZfPhy，琼脂糖电泳回收植酸酶基因片断，Bam HIEcl136II酶切表达载体pSPHP3303，琼脂糖电泳回收载体片断。将两片断按照3∶1的摩尔比混合加入T4DNA连接酶，16℃连接4小时以上。连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定得到pSPHP3303Phy(如图5A所示)。

5、带信号肽的植酸酶植物表达载体构建

按照正确的读码框合成α-淀粉酶信号肽序列和植酸酶基因5‘端的一段序列，并在该合成片段两段设计合适的酶切为点，用合适的内切酶分别酶切合成的的片段和pSP HP3303Phy，分别回收，连接并转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定得到pSPHP3303TPhy(如图5B所示)。

实施例2：基因枪转化的前期制备

1、植物转化起始材料的获得

玉米幼胚：授粉9-12天的玉米幼穗，剥离幼胚，置于N6培养基上，28℃，黑暗培养三天后用于基因枪转化。

玉米愈伤系：授粉9-12天的玉米幼胚，置于N6培养基上经过6-8周继代培养后得到胚性愈伤系，培养条件同上。

上述玉米幼胚和胚性愈伤均可作为转化起始材料，培养基的配制参照《植物细胞，组织和器官培养：基本方法》(Plant Cell，Tissue and Organ Culture：fundamentalmethods/O.L.Gamborg，G.C.Phillips eds.，Springer)一书中第16章中的方法进行。

2、转化用DNA片段的获得

大量提取pSPHP3303Phy、pSPHP3303TPhy和PHP17042Bar质粒DNA，分别用NdeI酶切pSPHP3303Phy、pSPHP3303TPhy用HindIII和SacI双切PHP17042Bar(如图6所示)。回收目的片段(如图7所示)，并调整目的片段的浓度，分别将来自pSPHP3303Phy和pSPHP3303TPhy片段与来自PHP17042Bar的片段等摩尔比混合用于微弹制备。

3、微弹制备所需其它试剂的配制

钨粉制备、0.1M亚精胺和2.5M的CaCl₂配制参照《植物细胞，组织和器官培养》(Plant Cell，Tissue and Organ Culture)一书中第16章中的方法进行。

实施例3：转化

1、基因枪用材料准备：

将可裂膜holder、可裂膜、载物膜湿热灭菌，然后把可裂膜、载物膜预先浸泡在无水乙醇中。制备微弹前将可裂膜置于可裂膜holder上备用。

2、微弹制备：

参照《植物细胞，组织和器官培养》(Plant Cell，Tissue and Organ Culture)一书中第16章中的方法进行。

1)1.5ml的Eppendorf管中快速依次加入钨粉、用于转化的DNA片段、2.5M的CaCl₂、0.1M亚精胺。

2)在Votex上混匀3分钟。离心，弃上清；

3)加入500μl无水乙醇重新悬浮，再离心，弃上清；

4)加入合适量无水乙醇悬浮钨粒，用移液器将悬浮钨粒滴加于可裂膜上，DNA的量以每份1μg为宜。

3、植酸酶表达载体的玉米遗传转化：

玉米遗传转化参照《植物细胞，组织和器官培养》(Plant Cell，Tissue and OrganCulture)上的方法

1)转化。转化前将玉米幼胚或胚性愈伤置于含120g蔗糖的高渗培养基上4-6小时后，用于微弹轰击。使用Bio-Rad公司的PSD/1000 Hellium基因枪，氦气压力为1000Psi，真空度为28inch Hg。轰击结束后，被转化的材料在高渗培养基上保持1-4小时，然后转移到保持愈伤的培养基上恢复培养3-4天。

2)选择培养。保持愈伤的培养基中加入3mg/L的BASTA作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养，每两周继代一次。

3)再生。经过两个月的选择培养后，抗性愈伤在选择性培养基上生长迅速，颜色新鲜。将抗性愈伤转到再生培养基上，两到三周后，即可得到成熟的胚状体。

4)将胚状体放到MS培养基上生根，即得到再生玉米苗。

实施例4、再生植株的检测

1、再生玉米植株基因组DNA的提取

1)在液氮中研磨0.1-0.2g植株叶片，转移至1.5ml的Eppendorf管中；

2)加入0.7mlCTAB(Tris100mM，NaCl 1.4M，20mMEDTA，CTAB2％，巯基乙醇0.1％)，60℃，45分钟，每隔10分钟，颠倒混匀一次。

3)加入0.7ml酚∶氯仿(1∶1)，颠倒几次，1000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，10001000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管。

4)在离心管加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，1000rpm离心10分钟，弃去上清，70％乙醇洗一次，抽干，溶于50μL的无菌水中，用于PCR检测。

2、再生玉米植株的PCR检测

植酸酶基因的检测

正向引物：TCCAAGTCCTGCGATACGGTAGAC

反向引物：TCATTATCAACTAAAGCACTCTC

反应体系(20μL)：再生植株DNA1μL(20-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl₂(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加无菌水至20μL。反应条件：94℃，5分钟；94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，1分钟；35个循环；72℃延伸5分钟。筛选出PCR阳性植株(如图8所示)。

Bar基因的检测：

正向引物：CCG AGG CGG ACA TGC CGG CG

反向引物：CAG CAT GCC GCG GGG GGC AT

反应体系同上，反应条件94℃，5分钟；94℃，45秒；62℃，45秒；72℃，45秒；35个循环；72℃延伸5分钟(如图9所示)。

3、再生玉米植株的Southern-blot分析

参照Sambrook J，等编著的《分子克隆试验手册》，(科学出版社，1992年版)中的方法进行。

1)对植酸酶基因的为阳性的玉米植株，选取0.5-0.8g叶片组织，液氮研磨后提取基因组DNA，提取方法同PCR检测中所用。

2)得到的DNA经RNase和Proteinase K处理后，再用等体积的酚∶氯仿(1∶1)，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，用紫外分光光度计测定DNA的量。

3)每个样品取15μgDNA酶切过夜，50V，电泳6小时后转移至尼龙膜(见图10)。

4)预杂交6小时后，以植酸酶基因的片段作模板，经放射性同位素P³²标记探针，进行杂交。

5)洗膜完成后，尼龙膜压X光片，所得结果见图11。

结果表明植酸酶基因已经整合到玉米基因组中。

实施例5、转基因玉米后代种子中植酸酶的表达

1、转基因玉米后代种子中植酸酶的表达检测

转基因玉米T₀代植株经过分子检测，植酸酶基因为阳性的植株，作为母本，选择玉米自交系作为父本。杂交授粉结实后，所得种子为T₁种子。T₁种子播种后可以正常萌发、发育成T₁植株。对T₁植株进行PCR检测，继续用同一玉米自交系作为父本，杂交授粉，得到T₂种子。选择PCR检测植酸酶基因为阳性的T₁植株的种子用来进行植酸酶活性分析。未转基因的玉米种子作为阴性对照，内源植酸酶较高的小麦作为阳性对照。测定参照Wyss M.et.al.(1999)方法进行。

1)植酸酶活性定义。一个单位(U)的植酸酶为：在pH5.5，37℃的条件下，每分钟从底物植酸钾、镁(肌醇六磷酸钾、镁)释放出1μmol无机磷酸所需要的酶量。

2)试剂。提取缓冲液(Extraction buffer)：(0.05M pH＝5.5的NaAc缓冲液，含有1mMCaCl₂)；

0.4M pH5.5的NaAc缓冲液；50mM植酸钠；15％TCA；

显色液：(0.6M H₂SO₄-2％Vc-0.5％钼酸铵)，用前加Vc。

3)标准曲线制作。配制9mM KH₂PO₄贮液，按表1稀释度稀释KH₂PO₄贮液：

          表1、KH₂PO₄贮液稀释度

	稀释度	每毫升稀释液中各成分量			Pi浓度(nmol/ml)	体系中Pi量(nmol)
								KH2PO4贮液(μl)	H2O(μl)	0.4M NaAcbuffer(μl)
1		3/1000	3	497							500	27	27
	2				6/1000	6	494	500	54	54
3		9/1000	9	491							500	81	81
	4				12/1000	12	488	500	108	108
5		15/1000	15	485							500	135	135
	CK				H2O	0	500	500	0	0

取1ml稀释液，加入1ml 15％TCA和2ml显色液，50℃保温20分钟，每个稀释度设3个平行样，分光光度计820nm测定OD值。以OD值为横坐标，测定的体系中无机磷的量(nmol)为纵坐标作标准曲线，如图12所示，并计算直线回归方程。

4)玉米子粒中植酸酶活性的测定。取植株籽粒20粒，研磨机充分磨碎至细粉末，称取100mg粉末，加入1ml提取缓冲液(Extraction Buffer)，室温下在Gyrotory摇床上剧烈振荡1小时。3000g，离心10分钟。然后按图13所示的流程进行。每样品三次重复。

5)根据标准曲线计算出酶活性单位

计算公式：样品中植酸酶含量(U/ml)＝K×A×n×(1/0.1)÷15

其中：

K：标准曲线斜率

A：样品相对OD值(A＝OD本底-OD反应液)

n：稀释倍数

1/0.1：将0.1ml的取样量换算成1ml

15：反应时间(分钟)

n：稀释倍数

1/0.1：将0.1ml的取样量换算成1ml

15：反应时间(分钟)

6)植酸酶活性测定结果为转基因玉米种子中植酸酶活性比未转基因对照提高3-10倍，表明植酸酶基因在转基因玉米种子的胚中有表达。鉴于测定的种子为出现分离世代的种子，含植酸酶基因的种子中植酸酶基因处于杂合状态，通过对这些种子的进一步选育可以得到高表达植酸酶活性的转基因玉米。表2显示的是一株转基因玉米酶活测定结果。

          表2、转基因玉米种子植酸酶活测定结果

                       未转基因样品         转基因样品

                       空白对照   反应液    空白对照  反应液

OD                       0.132     0.137    0.1646    0.2376

无机磷(nmole)            18.1635   18.898   22.9524   33.6761

nmole/100mg              908.1750  944.90   1147.62   1683.81

无机磷mg/g               0.2815    0.2929   0.3558    0.5220

释放无机磷(mole/g)       0.3673             5.3619

植酸酶U/g(μmole/min/g)  0.0245             0.3575

植酸酶U/Kg(mole/min/Kg)  24.5               357.5

                             序列表

<160>2

<210>1

<211>1329

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgtccaagt cctgcgatac ggtagacctc gggtaccagt gctcccctgc gacttctcat    60

ctatggggcc agtactcgcc attcttttcg ctcgaggacg agctgtccgt gtcgagtaag    120

cttcccaagg attgccggat caccttggta caggtgctat cgcgccatgg agcgcggtac    180

ccaaccagct ccaagagcaa aaagtataag aagcttgtga cggcgatcca ggccaatgcc    240

accgacttca agggcaagtt tgcctttttg aagacgtaca actatactct gggtgcggat    300

gacctcactc cctttgggga gcagcagctg gtgaactcgg gcatcaagtt ctaccagagg    360

tacaaggctc tggcgcgcag tgtggtgccg tttattcgcg cctcaggctc ggaccgggtt    420

attgcttcgg gagagaagtt catcgagggg ttccagcagg cgaagctggc tgatcctggc    480

gcgacgaacc gcgccgctcc ggcgattagt gtgattattc cggagagcga gacgttcaac    540

aatacgctgg accacggtgt gtgcacgaag tttgaggcga ctcagctggg agatgaggtt    600

gcggccaatt tcactgcgct ctttgcaccc gacatccgag ctcgcgccga gaagcatctt    660

cctggcgtga cgctgacaga cgaggacgtt gtcagtctaa tggacatgtg ttcgtttgat    720

acggtagcgc gcaccagcga cgcaagtcag ctgtcaccgt tctgtcaact cttcactcac    780

aatgagtgga agaagtacaa ctaccttcag tccttgggca agtactacgg ctacggcgca    840

ggcaaccctc tgggaccggc tcaggggata gggttcacca acgagctgat tgcccggttg    900

actcgttcgc cagtgcagga ccacaccagc actaactcga ctctagtctc caacccggcc    960

accttcccgt tgaacgctac catgtacgtc gacttttcac acgacaacag catggtttcc    1020

atcttctttg cattgggcct gtacaacggc actgaaccct tgtcccggac ctcggtggaa    1080

agcgccaagg aattggatgg gtattctgca tcctgggtgg tgcctttcgg cgcgcgagcc    1140

tacttcgaga cgatgcaatg caagtcggaa aaggagcctc ttgttcgcgc tttgattaat    1200

gaccgggttg tgccactgca tggctgcgat gtggacaagc tggggcgatg caagctgaat    1260

gactttgtca agggattgag ttgggccaga tctgggggca actggggaga gtgctttagt    1320

tgataatag                                                            1329

<210>2

<211>1398

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

atggggaaga acggcagcct gtgctgcttc tctctgctgc tgctgctgct tctcgccggg    60

ttggcgtccg gctccaagtc ctgcgatacg gtagacctcg ggtaccagtg ctcccctgcg    120

acttctcatc tatggggcca gtactcgcca ttcttttcgc tcgaggacga gctgtccgtg    180

tcgagtaagc ttcccaagga ttgccggatc accttggtac aggtgctatc gcgccatgga    240

gcgcggtacc caaccagctc caagagcaaa aagtataaga agcttgtgac ggcgatccag    300

gccaatgcca ccgacttcaa gggcaagttt gcctttttga agacgtacaa ctatactctg    360

ggtgcggatg acctcactcc ctttggggag cagcagctgg tgaactcggg catcaagttc    420

taccagaggt acaaggctct ggcgcgcagt gtggtgccgt ttattcgcgc ctcaggctcg    480

gaccgggtta ttgcttcggg agagaagttc atcgaggggt tccagcaggc gaagctggct    540

gatcctggcg cgacgaaccg cgccgctccg gcgattagtg tgattattcc ggagagcgag    600

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gatgaggttg cggccaattt cactgcgctc tttgcacccg acatccgagc tcgcgccgag    720

aagcatcttc ctggcgtgac gctgacagac gaggacgttg tcagtctaat ggacatgtgt    780

tcgtttgata cggtagcgcg caccagcgac gcaagtcagc tgtcaccgtt ctgtcaactc    840

ttcactcaca atgagtggaa gaagtacaac taccttcagt ccttgggcaa gtactacggc    900

tacggcgcag gcaaccctct gggaccggct caggggatag ggttcaccaa cgagctgatt    960

gcccggttga ctcgttcgcc agtgcaggac cacaccagca ctaactcgac tctagtctcc    1020

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tgctttagtt gataatag                                                  1398

Claims (10)

1、一种利用转基因植物生产植酸酶的方法，是构建含有植酸酶基因的植物表达载体，用基因枪微弹轰击受体植物的外植体，得到转基因植株，使植酸酶基因在转基因植株的种子中高效表达。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植酸酶基因的前部连接有单子叶种子特异性启动子。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述植酸酶基因连接有引导基因产物分泌和定位的信号肽序列和/或选择标记基因。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述选择标记基因表达载体为PHP17042Bar，可以提供除草剂抗性的选择性标记。

5、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述植酸酶基因构建到植物表达载体是通过如下方法完成：

a)植酸酶基因插入到植物表达载体pSPHP3303上得到表达载体pSPHP3303Phy，编码基因为SEQ ID №：1；或

b)植酸酶基因与信号肽序列读码框吻合地融合后，插入到植物表达载体pSPHP3303上得到表达载体pSPHP3303Tphy，编码基因为SEQ ID №：2。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的表达载体pSPHP3303Phy和pSPHP3303Tphy分别与抗性选择标记基因表达载体PHP17042Bar等摩尔比混合后，用于基因枪微弹制备。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的表达载体pSPHP3303Phy和pSPHP3303TPhy以及选择标记基因表达载体PHP17042Bar去除细菌骨架DNA后，得到pSPHP3303TPhy和pSPHP3303Phy的植酸酶基因表达盒以及PHP17042Bar的Bar基因的表达盒，将Bar基因的表达盒分别与以上两种植酸酶基因表达盒等摩尔比混合，用于基因枪微弹制备。

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外植体为玉米幼胚或幼胚诱导形成的愈伤组织。

9、一种富含植酸酶的转基因植物种子，是构建含有植酸酶基因的植物表达载体，用基因枪微弹轰击受体植物的外植体，得到转基因植株，获得的富含植酸酶的转基因植物种子

10、权利要求9所述的转基因植物种子作为磷源植物饲料的应用。

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