CN1155709C - 植物细胞聚集体和植物组织的触须介导转化及其植物的再生 - Google Patents

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Abstract

可用称为“触须”的细长针状结构转化植物细胞聚集体和植物组织。此过程包括在DNA和触须存在时将待转化的植物细胞聚集体和植物组织搅拌，从而促进DNA的摄入及其整合。此方法可应用于已证实用其他技术不易转化的其他植物细胞聚集体和植物组织。

Description

植物细胞聚集体和植物组织的触须 介导转化及其植物的再生
本发明涉及用细长针状微纤维或“触须(whisker)”转化植物细胞聚集体和所选植物组织的方法。
直到最近，基因工程处理的植物几乎完全被限制于那些应用传统培育方法产生的植物。由于鉴定、杂交和将基因稳定到基因组中由此产生预期性状所需的费用和时间问题，通过培育产生新植物品种主要局限于农业上最重要的农作物，如谷物。相比之下，基因工程的出现已将许多不同的异源基因及性状以更迅速的方式引入了不同农作物，包括谷物、棉花、大豆、小麦、稻、向日葵和canola。不过，由于生产商用可存活原种、品系需组织培养和回交，将新转基因整合入原种种质内依然是一项费劲的工作。
有几种技术可用于将含异源目的基因的外源重组载体引入植物细胞、使植物再生、稳定整合和在其中表达。其中一项技术涉及将遗传物质包被的微粒直接加速进入植物细胞(Cornell的美国专利4945050；DowElanco的美国专利5141131；和Dekalb的美国专利5538877及5538880)。此技术通常称为“微粒轰击”或“biolistics”。也可用农杆菌技术转化植物(Toledo大学的美国专利5177010；Texas A&M的5104310；Schilperoot的欧洲专利申请0131624B1，欧洲专利申请120516，159418B1和176112；Schilperoot的美国专利5149645，5469976，5464763和4940838和4693976；Max Planck的欧洲专利申请116718，290799，320500；Japan Tobacco的欧洲专利申请604662，627752和美国专利5591616；Ciba-Geigy的欧洲专利申请0267159和0292435及美国专利5231019；Calgene的美国专利5463174和4762785；及Agracetus的美国专利5004863和5159135)。另一转化方法涉及利用细长针状微纤维或“触须”转化细胞悬浮培养物(Zeneca的美国专利5302523和5464765)。此外，电穿孔技术也已用于转化植物细胞，由此已得到可育的植物(Boyce Thompson研究所的WO87/06614；Dekalb的5472869和5384253；Plant Genetic Systems的5679558，5641664，WO9209696和WO9321335)。
尽管有上述所有技术成就，商用可存活原种、种质转基因植物的遗传转化和常规生产依然是费劲的工作。例如微粒轰击能用于个体细胞、细胞聚集体或植物组织，但它要求制备附着DNA的金颗粒及对昂贵且尚未广泛应用的“枪”设备最优化。涉及农杆菌的技术特别受限制，因为不是所有物种和给定物种内的变种均对该细菌的感染敏感。
由于从不同植物种类及其组织常规制备原生质体一般会遇到极大的困难和花费，且伴随着生存能力低和与此相关的转化率低，所以电穿孔技术也非优选。
正如此处所公开的，申请者已发明了一种可利用触须将含所选基因的重组载体直接且花费较少地转化到来自非原种或原种种质之植物细胞聚集体和植物组织的方法。申请人的发明以其简单、快速和方便使用而优于目前使用的方法。而且，申请人的发明比本领域所述的其他方法优越，因为它无需建立III型的愈伤组织培养物或建立和维持细胞悬浮培养物，并可用于I型或II型愈伤组织，从而更少种质局限性。按本文所述，这意味着申请人的发明可直接用于转化原种基因型，从而消除了通常与基因整合相关的问题和时间。
本发明涉及含异源DNA的可育转基因玉米(Zea mays)植物的生产，该异源DNA优选整合入所述植物的染色体且可被其后代所继承。
本发明的一方面涉及含所说异源DNA之玉米植物、植物部分、植物细胞、植物细胞聚集体和来自转基因植物的种子。
本发明也涉及含异源DNA的可育转基因稻(Oryza sativa L.)植物的生产，该异源DNA优选整合入所述植物的染色体且可被其后代所继承。
本发明的另一方面涉及含所说异源DNA之稻植物、植物部分、植物细胞、植物细胞聚集体和来自转基因植物的种子。
本发明还涉及含异源DNA的可育转基因陆地棉(Gossypiumhirsutum L.)植物的生产，该异源DNA优选整合入这类植物的染色体且可被其后代所继承。
本发明的另一方面涉及含所说异源DNA之陆地棉植物纤维、植物、植物部分、植物细胞、植物细胞聚集体和来自转基因植物的种子。
本发明还涉及用触须介导转化的方法从I型愈伤组织、II型愈伤组织、下胚轴衍生愈伤组织或子叶衍生愈伤组织生产可育的转化植物的方法。
本发明还涉及用触须介导转化的方法从分生组织生产可育的转化植物的方法。
本发明的另一方面涉及从I型或II型愈伤组织再生的可育成熟玉米植物及由其产生的转基因种子。
本发明的另一方面涉及从I型愈伤组织再生的可育成熟稻植物及由其产生的转基因种子。
还有，本发明的另一方面涉及从下胚轴衍生或子叶衍生愈伤组织再生的可育成熟棉花植物及由其产生的转基因种子和纤维。
在优选的实施方案中，本发明通过触须介导细胞穿孔和异源DNA摄入的方法产生此处所述的可育转基因植物，该触须介导的细胞穿孔对植物细胞聚集体和植物组织进行，然后用受到控制的方案选择和生产转化植物品系。
本发明的其他方面、实施方案、优越性和特性将由以下说明更显而易见。
本发明涉及通过触须介导的转化，用目的DNA构建体转化例如玉米、稻、陆地棉和蔓菁的植物细胞聚集体和植物组织从而产生所说物种的可育转基因植物及种子的方法。转化后，由该转化植物细胞聚集体和植物组织再生转基因植物，该再生植物表达嵌合的目的DNA构建体。此处用所述方法产生的转基因植物包括：所有的玉米种类，包括但不局限于饲料用玉蜀黍、爆裂种玉米、甜玉米、硬质种玉米、臼齿形玉米等等；所有的棉花种类；和所有的稻种类。
后面将用的短语和术语解释如下：
“反义”意指所含序列与靶RNA和/或mRNA或其部分互补，并可通过干扰靶基因最初转录物和/或mRNA加工、运输和/或翻译而阻断靶基因表达的RNA转录物。互补可以是与靶RNA的任何部分互补，即5’非编码序列、3’非编码序列、内含子或编码序列。反义RNA一般是有义RNA的互补物(镜像)。
“eDNA”指来自mRNA并与其互补的DNA。
“嵌合DNA构建体”指含来自一个或多个物种的有义或反义方向的基因或其部分的重组体DNA。
“组成型启动子”指在所有细胞类型中和所有时间指导连续基因表达的启动子元件(即肌动蛋白、遍在蛋白、CaMV 35S、35T启动子等等)。
“共抑制”是指引入与内源基因基本同源的外源基因，在植物细胞内引起外源基因和/或内源基因产物的活性降低。有时可通过将启动子序列、5’和/或3’末端、内含子或基因编码区引入该植物细胞完成共抑制。
“发育特异性”启动子是指在特定植物发育阶段，如早或晚期胚发生等阶段负责基因表达的启动子元件。
“增强子”是指能刺激启动子活性的核苷酸序列元件，如来自玉米条斑病毒(MSV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、乙醇脱氢酶内含子1等等的增强子。
此处所用“表达”一词指植物细胞内核酸分子、mRNA和/或反义RNA的酶促转录。基因表达也涉及基因转录，且可能涉及或不涉及mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“外源”或“异源基因”指所具有的DNA序列正常情况下不存在于宿主细胞中，但已通过触须介导转化引入的基因。
“基因”指蛋白质表达涉及的所有遗传物质，包括嵌合DNA构建体、基因、植物基因及其部分。
基因组”指生物体各细胞和/或病毒中所含的遗传物质。
“诱导型启动子”指响应特殊信号，诸如物理刺激(热休克蛋白)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代谢物、应激等信号，负责基因表达的启动子元件。
“修饰的植物”指相对于未修饰植物而言，其中特异蛋白质的mRNA水平、蛋白质水平或酶比活性已改变的植物。修饰可通过反义、共抑制或过表达来完成。
“植物细胞聚集体”、“植物细胞系”和“愈伤组织细胞系”指由经历从头形态发生的未分化和分化细胞组成、将植物材料片(外植体)在无菌条件下置于生长支持培养基上形成的组织增殖块。术语“植物细胞聚集体”、“植物细胞系”和“愈伤组织细胞系”包括单子叶植物中的I型和II型愈伤组织培养物和双子叶植物中的下胚轴和子叶衍生的培养物。此处所定义的术语不包括植物细胞悬浮培养物或III型愈伤组织培养物。
“植物组织”指有组织的组织，包括但不局限于分生组织、胚、花粉、子叶、生殖细胞等等。
“启动子调节元件”指核酸片段蒙或基因中控制该核酸片段或基因表达的核苷酸序列元件。启动子序列为RNA聚合酶和有效转录所需的其他转录因子提供了识别位点。多种来源的启动子调节元件可有效地用于植物细胞中表达有义和反义基因构建体。启动子调节元件还包括组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子等。启动子调节元件还包括可提高转录或翻译效率的增强子序列元件。
“组织特异性”启动子是在特殊细胞或组织类型，如叶片或种子中负责基因表达的启动子元件(即玉米醇溶蛋白、油质蛋白、napin、ACP、球蛋白等等)。
“转基因”指包括任何含异源DNA或嵌合基因构建体的I型或II型愈伤组织、下胚轴或子叶衍生愈伤组织、组织、植物部分或植物，该DNA或嵌合基因构建体是通过触须引入所说的愈伤组织、组织、植物部分或植物中，并随后通过有性或无性细胞杂交或细胞分裂送递给后代。
“触须”指能自许多物质产生的细长针状体，如“简明化学词典，第7版，Arthur&Elizabeth Rose编辑，Reinhold出版社，纽约(1966)”中所述。本发明不限制触须来源的材料，而是限定其为类针形结构，其中所说触须小于将用其转化的细胞。在本发明范围内，触须以便于DNA进入细胞的方式成形。本发明范围还意图包括任何类针形材料，该针形材料能穿孔进入有或无细胞壁的植物细胞从而方便DNA摄入和植物细胞转化。本发明范围不包括显微注射技术，例如其中先将针插入所说细胞，通过针本身的孔送递DNA从而使DNA分子进入细胞。优选触须是金属或陶瓷针状体，最优选用碳化硅或四氮化三硅制成，大小30×0.5um-10×0.3um。
“触须介导的转化”指通过触须方便DNA插入植物细胞聚集体和/或植物组织并以瞬时或稳定的方式表达该DNA。
产生植物细胞系时，目的组织被无菌分离并置于固体起始培养基上，由此破坏有组织的植物细胞组织中细胞分化和特化相关的过程，从而导致该组织去分化。一般地说，通过加入琼脂等使起始培养基固相化，因为愈伤组织在液体培养基中不容易引发。培养基通常以Chu等人的N6盐为基础(1978，植物组织培养进展研讨会(Proc.Symp.Plant Tissue Cluture)，Peking Press，第43-56页)，补充有蔗糖、维生素、矿物质、氨基酸，在某些情况下还有合成激素。不过，愈伤组织还能在Murashige和Skoog的MS盐衍生培养基(1962植物生理学15：473-497)上增殖。培养物通常保持于约28℃的黑暗、无菌环境中。
一般说来，优选植物细胞系来自幼叶基部区、不成熟雄花穗、下胚轴组织和子叶节。对于玉米和稻，可使用产生分生组织的植物细胞系，最优选来自合子胚组织的植物细胞系。用于生产所说植物细胞系的最优选组织分离自授粉后10-14天的发育玉米谷穗和未发芽的稻种子。苗的下胚轴和子叶衍生组织最优选用于产生棉花植物细胞系。
将所说组织置于固体培养基上数天至数周后，从盾形区(以玉米和稻为例)或者下胚轴或子叶组织(以棉花为例)产生新的分生组织。这些新的分生组织产生未分化的薄壁组织细胞聚集体，这类聚集体无来源组织的结构顺序特征。植物细胞聚集体缺少任何可识别的总体结构，且只包含在完整和有组织的植物组织中发现的许多不同种类特化细胞类型中的有限数量。所说的聚集体已被分类为非胚发生的和胚发生的类型，取决于它们的再生能力、繁殖方式和组织形态学(Franz，1988，Ph.D.Thesis，University of Wageningen，荷兰)。
在玉米和稻中，非胚发生性愈伤组织含由不能再生成植物的细长有液泡细胞组成的柔软粒状半透明组织。或者，能进行体细胞胚发生和植物再生的胚发生性单子叶愈伤组织以三种独特的形态类型存在：I型；II型；和III型。
I型愈伤组织由致密的结节状缓慢生长的胚发生性愈伤组织组成，该愈伤组织以复合组织混合物的形式增殖，显示苗和/或类盾形结构(Phillips等，1988，玉米和玉米改良，第345-387页)。所说的愈伤组织特征在于高度的细胞分化和发育良好的脉管结构，已被称为致密的胚发生性愈伤组织(美国专利5641664，Plant Genetic Systems)。基本上所有的单子叶植物都具有可产生I型愈伤组织的组织。I型愈伤组织中的植物再生通常通过分生组织延长进行器官发生(Green和Phillips，1975，Crop Sci.，15：417-421)和/或通过由明确的根-芽轴进行体细胞胚发生而完成(Vasil等，1984，Amer.J.Bot.71：158-161)。I型愈伤组织中再生幼苗的来源不总是显而易见的，看起来是通过表皮下分生组织形成而产生的(Franz和Schel，1991，Can.J.Bot.69：26-33)。
II型愈伤组织不象I型那样常见，它由柔软的易碎胚发生细胞组成，只能自某些单子叶基因型产生(Phillips等，1988，玉米和玉米改良，第345-387页)。它生长迅速，包含很少或不含脉管结构，可描述为易碎的胚发生性愈伤组织(美国专利5641664，Plant GeneticsSystems)。II型愈伤组织的一区别特征是它包含附着于其表面胚柄状结构的许多球状体细胞胚，其植物再生似乎以明显可确认的阶段进行(Franz，1988，Ph.D.Thesis，University of Wageningen，荷兰)。
III型愈伤组织只是最近才被描述的。该愈伤组织只很罕有地形成，它容易分散于液体中，在其表面无任何独特的体细胞胚。它也被描述为“易碎的非粘质”愈伤组织(Shillito等，1989，生物工程学(Bio/Technology)7：581-587)，并主要由能通过体细胞胚发生而再生的未分化组织组成。III型愈伤组织被认为是转化和再生的理想组织，因其细胞易于分离和分散，因此易于形成悬浮培养物。这类愈伤组织是最少有的，这点上不同于II型愈伤组织，它只能在II型培养物的各亚培养代数时通过直观选择和择优富集产生(WO94/28148；Zeneca)。
在棉花中，正如其他双子叶植物一样，愈伤组织类型一般不定义为I、II或III型。而且，来自棉花的下胚轴和子叶衍生愈伤组织培养物已根据形态学因素和再生能力被分类为非胚发生和胚发生的类型(Shoemaker等，1986植物细胞再生(Plant Cell Rep.)3：178-181)。非胚发生性愈伤组织由不显示强细胞质染色反应的松散易碎细胞块组成，不能用来方便地再生植物。不过，胚发生的愈伤组织看起来象是能通过体细胞胚发生而再生植物的细胞的极致密、密集胞质团。从此产生的体细胞胚首先呈现球状结构并逐渐延长，然后开始显现子叶的发育。
此处公开的愈伤组织类型中，来自单子叶植物的I型和II型愈伤组织培养物优选用于植物产生和再生中。通过触须介导转化产生的转基因玉米植物最优选制备自I型或II型培养物；而在转基因稻的生产和再生中最优选I型愈伤组织培养物。此外，在转基因棉花植物的生产中优选子叶节衍生和下胚轴衍生培养物，其中产生自子叶组织的培养物又是最优选的。
包括玉米、稻和棉花在内的植物芽尖包含顶端分生组织，在这种组织中从顶端原始细胞和表皮下细胞形成器官原基(Steeves和Sussex，1989，植物发育模式，剑桥大学出版社)。可分离分生组织，然后放至芽增殖培养基上，诱导产生可再生成植株的多个芽(Zhong等，1992，植物187：483-489)。新鲜分离或预培养而启动芽增殖的分生组织可用作按本发明教导进行触须介导转化的接受者组织。优选从正发育胚(Lowe等，1995，生物工程学13：677-682)或发芽小苗(Gould等，1991，植物生理学95：426-434)中分离含分生组织的芽尖，用经过或未经过渗透预处理的触须转化，并在植物再生前放于含选择剂的芽增殖培养基上(Zhong等，1996，植物生理学，110：1097-1107)。
此处用于转化的异源DNA可以是环状的、线性的、双链或单链的。一般地说，该DNA是重组载体质粒，其中包含编码区，可用于促进异源目的基因表达及提供选择标记，从而使含该基因的组织可被鉴定出来。优选地，这些重组载体能稳定整合入植物基因组，这样转化植物系的选择可因其中所含的组成型、组织特异型或可诱导型启动子驱动所述选择标记表达而进行。
异源DNA中一可变处是嵌合基因的选择。有义或反义方向的嵌合基因可在组成型、组织特异型、发育型或可诱导型启动子等控制下表达于植物细胞中。按技术熟练人员的判断优选特殊嵌合基因；不过，嵌合基因可来自但不局限于植物、动物或细茵等，并能用于表达在未转化细胞内没有的或在转化细胞内具有的蛋白质。嵌合基因也可用于，但不局限于内源目的基因的正调节或负调节。
另一可变处是选择标记的选择。按技术熟练人员的判断优选特殊选择标记，但任何以下选择标记可与此处未列但可用做选择标记的任何其他基因一起使用。所说的选择标记包括但不局限于编码抗生素卡那霉素、新霉素和G418抗性的转座子Tn5(AphII)的氨基糖苷磷酸转移酶，以及编码对以下物质的抗性或耐受性的基因：草甘磷；潮霉素；氨甲喋呤；膦丝菌素(bialophos)；咪唑啉酮类、磺胺脲类和三唑嘧啶除草剂，如chlorsulfuron、bromoxynil、茅草枯(dalapon)等。
除选择标记外，还可使用报道基因。在某些情况下，报道基因可在有或没有选择标记时使用。报道基因是一般不存在于接受者生物体或组织内且一般所编码蛋白质导致一些表型改变或酶促特性的基因。这些基因的例子可见于  K.Weising等，遗传学年鉴(Ann.Rev.Genetics)，22，421(1988)，该文献收编于此作为参考。优选的报道基因包括：大肠杆茵uidA位点的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、来自大肠杆菌Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自生物发光水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白和来自萤火虫Photinuspyralis的萤光素酶基因。然后可在该基因已引入受体细胞后的适当时间进行检测报道基因表达的试验。优选如Jefferson等(1987，Biochem.Soc.Trans.15，17-19)所述利用编码大肠杆菌uidA位点的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)之基因进行试验来鉴定转化细胞。
另一可变处是启动子调节元件。除植物启动子调节元件外，多种来源的启动子调节元件可有效用于植物细胞中表达异源基因。例如，细菌来源的启动子调节元件，如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子；病毒来源的启动子，如花椰菜花叶病毒(35S和19S)、35T(重改造的35S启动子，参阅PCT/US96/1682、公布于1997年4月17日的WO97/13402)等都可使用。植物启动子调节元件包括但不局限于1，6-二磷酸核酮糖(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-conglycinin启动子、云扁豆蛋白启动子、ADH启动子、热休克启动子和组织特异性启动子。
其他诸如基质附着区、支架附着区、内含子、增强子、聚腺苷酸化序列等元件也可存在，因而可提高转录效率或DNA整合。尽管这些元件能通过影响mRNA的转录、稳定性等使DNA更好地表达或行使功能，但它们对于DNA的功能可以是必需的，也可能不是。这些元件可如期望的包含于该DNA中，以获得植物细胞内转化DNA的最适效果。典型的元件包括但不局限于Adh-内含子1、苜蓿花叶病毒衣壳蛋白前导序列、玉米条斑病毒衣壳蛋白前导序列以及技术熟练人员可获得的其他元件。
也可使用组成型启动子调节元件在所有细胞类型和所有时间内指导连续的基因表达(如肌动蛋白、遍在蛋白、CaMV 35S等)。组织特异型启动子调节元件负责在特殊细胞或组织类型中的基因表达，如叶片和种子(如玉米醇溶蛋白、油质蛋白、napin、ACP、球蛋白等)，因而也可使用。
启动子调节元件也可能是在植物发育的某一阶段以及特殊植物组织和器官内有活性的。这样的例子包括但不局限于花粉特异、胚特异、玉米穗丝特异、棉花纤维特异、根特异、种子胚乳特异型启动子调节元件等。在某些情况下可能需要使用负责响应特殊信号进行基因表达的诱导型启动子调节元件，所说的信号如：物理刺激(热休克基因)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代谢物和应激状况。还可使用在植物中有功能的其他需要的转录和翻译元件。技术熟练人员已知并可得到许多植物特异型基因转移载体。
通过触须介导的转化能将异源DNA引入可再生的植物细胞培养物。此过程的总描述可见授予Zeneca的美国专利5302523和5464765，迄今为止还未出版用于I型、II型、下胚轴或子叶可再生植物细胞系之触须介导转化的流程。
在触须介导转化中，通过由生物惰性材料组成的很小的细长针状微粒可促进植物材料摄入DNA。在将该微粒与DNA和植物细胞系搅拌时，一个或多个微粒在可再生植物细胞聚集体中造成小孔，从而使该聚集体摄入DNA。已摄入DNA的细胞被视为是已转化的。一些转化细胞将稳定保留所引入的DNA并表达它。
用于植物细胞转化中的细长针状微粒被称为“触须”、优选用诸如碳化硅或四氮化三硅之类的高密度材料制备；不过，任何具有针状结构，且该结构大小小于待转化细胞的材料均在本发明范围内。更优选地，触须由碳化硅制成，如本文所述的Silar SC-9或Alfa Aesar。
转化前，优选将植物细胞系放于渗透介质上并温育，这样，相比于非渗透性处理细胞将可增强转化。最优选的是其中含约36.4g/L山梨醇和约36.4g/L甘露醇的渗透介质。在触须介导转化前将这些组织于该介质上维持约4小时。按技术熟练人员的判断在转化后保温于含渗透剂的介质上。不过，非渗透性处理的植物细胞聚集体和组织的转化也在本发明的范围内。
此处用于转基因植物产生的愈伤组织培养物通常应为约3-20周大，依培养物类型而定。一般地，愈伤组织应在大约转移期的中间，因而不处于可能与转移至新培养基相关的任何滞后期，或在到达通常与平板上培养较长时期的培养物相关的任何静止期之前。不过，可在传代培养之前或之后取植物材料；因而对于实行此处公开之本发明来说，通常认为收获时间不是关键的。每个转化中所用的愈伤组织量优选约100-500mg，更优选约100-250mg，最优选约为200mg组织。
为了转化，触须一般放于小容器中，如圆锥管或微量离心管等，其中该容器中已放有含目的DNA构建体、液体培养基和愈伤组织的混合物。对于实行此处公开的本发明来说，材料加入的顺序是不重要的。之后，将容器密封并搅拌。不象植物组织biolistic转化中所用的微粒(Sanford等，1990Physiol.Plantarum，79：206-209；和美国专利5100712)，触须在使用前不需要用DNA载体或沉淀剂，如氯化钙、亚精胺、剪切鲑精DNA等进行任何特殊预处理。
转化过程中所用的搅拌时间可变化，一般在约10-160秒之间。每个转化中加入的触须量也可为约1-4mg/管。在加入触须量和达到最佳转化所需的搅拌时间之间观察到反比关系。因此，加入触须量和完成转化所需搅拌时间是本领域技术人员可测定的。此外，所加入液体培养基的体积为约200-1000ul，优选约200ul。另外，加入的异源DNA量优选为约10-100ul 1mg/ml溶液。对于本发明来说，加入的DNA体积不是象DNA终浓度那么关键的因素。而优选的DNA终浓度约为0.03-0.14ug/ul。本发明的范围包括但不局限于此处所公开的容器大小、加入的异源DNA量或浓度、加入的异源DNA体积、加入的液体培养基量、加入的愈伤组织材料量或加入的触须量。本发明包括但不局限于搅拌混合物所用装置或搅拌是否通过手工或机械方式完成。
一旦植物细胞系被穿孔且异源DNA已进入其中，则必须鉴定、增殖和选择不只含目的异源DNA且还能再生的那些细胞。可用多种标准方法筛选该细胞或由此再生的植物中异源DNA的存在或缺乏，所说方法包括但不局限于报道基因表达的评估。或者，与异源DNA一起或作为其中一部分的选择标记的送递使那些含该DNA的细胞可通过使用选择剂而鉴定出来。
只选择那些包含和表达目的异源DNA的细胞是可育的转基因植物生产中关键的一步。选择条件必须是在抑制开始时极多的未转化细胞生长的同时允许转化细胞生长。此外，选择条件必须不会引起转化细胞丧失其植物再生能力、未来的发育能力或生殖力。通过制做生长抑制曲线，技术熟练人员可很容易确定用于选择表达特殊选择标记之转化细胞的适当条件。通过将细胞生长情况相对选择剂浓度作图，可得到生长抑制曲线。一般地说，选择剂浓度设为几乎所有非转化细胞生长被抑制但不被杀死的浓度。优选的选择剂浓度是其中90-99％的非转化细胞生长被抑制但不被杀死的浓度。最优选的选择剂浓度是其中97-99％的非转化细胞生长被抑制但不被杀死的浓度。
转移并暴露于选择剂中的转化愈伤组织通常温育于可支持生长的固体培养基上。各类型组织优选的培养基在本领域中已很明确。最初暴露于选择剂后，定期将组织转移到保持选择剂浓度的新鲜培养基中。在转化细胞量基本上增长1倍后，选择生长最快且最健康的细胞团并将其转移到所含选择剂浓度将杀死非转化细胞的新鲜培养基中。重复选择和转移生长细胞至新鲜培养基中，最后得到几乎完全由含目的异源DNA之转化细胞组成的细胞群。
再生对本发明来说是重要的，可通过技术熟练人员掌握的任何常规方式完成。若细胞已用选择标记基因转化，可将选择剂掺入再生培养基中以进一步确认再生的小植株被转化了。培养数周后，可将对选择剂有免疫力的再生小植株转移到土壤中并生长至成熟。
通过表型和/或基因型分析可将愈伤组织和由其衍生的植物鉴定为转化子。例如，如果异源DNA编码一种酶或蛋白质，就可利用特异于该特殊酶或蛋白质的酶促或免疫学检验。其他基因产物可用合适的生物试验或化学试验进行检验。别的技术包括，用Southern所述方法((1975)分子生物学杂志，98：503-517)、聚合酶链式反应(PCR)等等分析植物的基因组成分。
自转化愈伤组织再生的植物被称为R0世代或R0植物。此世代植物的多种有性杂交产生的种子被称为R1子代。随后R1种子发芽产生R1植物。应当应用本文所述方法证实并源DNA被成功地送递并遗传给R1植物和其后代。
一般来说，如果异源DNA可掺入许多不同杂合体中，转化玉米及其后代在商业上将有很大的价值。这可通过建立该品系的植物细胞聚集体并用触须转化该品系，从而如本文所述将异源DNA直接掺入大量亲代系中而完成。此外，这还可通过将最初的转基因可育植物与正常原种自交系杂交，然后将其后代与正常亲本回交而完成。此杂交的后代将发生分离，以致一些植物包含目的异源DNA而一些植物则没有。继续品系杂交直到最初的正常亲本已转变成含目的异源DNA且还基本上拥有与此品系相关的所有特征的遗传修饰品系。完成原种种质品系和其自亲所需的玉米育种技术对技术熟练人员来说是众所周知的。
本发明的特殊实施方案进一步举例说明于实施例中。不过，本领域技术熟练人员应理解，特别详述的实验只是本发明的例证，其后的权利要求中对本发明将有更完整的描述。
实施例1
I型和II型愈伤组织的建立
为了引发I型愈伤组织，如下文无茵分离基因型H99、Pa91和拥有产权的品系139/39(美国专利5306864)的合子胚(1.5-3.0mm)，并置于由以下成分组成的I型培养基上：N6常量营养物和维生素(Chu，1978，植物组织培养进展研讨会，第43-56页)、B5微量营养物(Gamborg等，Exp.Cell Res.50：151-158)、30g/L蔗糖、2.9g/L L-脯氨酸、100mg/L肌醇、100mg/L酪蛋白水解物、37mg/L乙二胺四乙酸亚铁的钠盐(NaFeEDTA)、8mg/L麦草畏、0.8mg/L 2，4-D、4.9mg/L硝酸银和2.5g/L GELRITE。自原始合子胚盾形区引发的I型愈伤组织由显示类盾形结构的致密胚发生组织和芽分生组织组成。在以21-28天为间隔进行选择性传代培养数代后，培养物用于本文所述的转化实验。
为了引发II型愈伤组织，将自B73XA188杂交来源的两S3品系杂交制备的杂种植物(Armstrong等，1991，Maize Genet.Coop.NewsLett.，65：92-93)在标准温室条件下培养并自花授粉或近缘授粉(Petolino和Genovesi，1994，玉米手册，第701-704页)。授粉10-14天后(DAP)，切下正发育的谷穗并用70％(v/v)酒精消毒表面2分钟，随后浸泡于含几滴LIQUI-NOX的20％(v/v)市售漂白粉中0.5小时，然后用无菌水漂洗数次。之后将未成熟胚(1.5-3.0mm)分离并放于起始培养基上[N6基本盐类和维生素(Chu，1978，植物组织培养进展研讨会，第43-56页)、20g/L蔗糖、2.9g/L L-脯氨酸、100mg/L酶促酪蛋白水解物(ECH)、37mg/L Fe-EDTA、10mg/L硝酸银、1mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和2.5g/L GELRITE(Schweizerhall，SouthPlainfield，NJ)，pH5.8]。黑暗中28℃放2-3周后，得到具许多球状和细长体细胞胚的II型愈伤组织。为了富集具预期形态的II型培养物，如文献Welter等，1995，Plant Cell Rep.14：725-729中所述再进行2-3代选择性传代培养。一旦建立了II型形态(4-6周)，将愈伤组织转移到维持培养液(含6mM L-脯氨酸且不含硝酸银的起始培养液)中。培养起始约16-20周后将II型愈伤组织用于转化。
实施例2
质粒pUGN81-3和pDAB418的构建
含驱动β-葡糖醛酸糖苷酶基因之遍在蛋白启动子调节元件的玉米表达载体pUGN81-3按本文所述被利用。质粒pUGN81-3是按顺时针次序含以下序列的8730个碱基对双链植物转化载体。核苷酸1-17编码序列为AGCTTCCGCG GCTGCAG的多位点接头。pUGN81-3的核苷酸18-2003位是玉米遍在蛋白启动子和其第一个内含子，是经PCR扩增自玉米基因型B73的基因组DNA(Christensen等，(1992)植物分子生物学18：675-689)。pUGN81-3的核苷酸2004-2022位编码序列为GGTACCCCCG GGGTCGACC的多位点接头。pUGN81-3的核苷酸2023-4154位相应于质粒pBI101(Clontech，Palo Alto，CA)的核苷酸2551-4682位，其后是具有相应于pUGN81-3碱基4155-4197位之序列  ATCGGGAATT  AAGCTTGCAT  GCCTGCAGGCCGGCCTTAAT TAA的多位点接头。pUGN81-3的核苷酸4198-4264相应于：GCGGCCGCTT TAACGCCCGG  GCATTTAAATGGCGCGCCGC  GATCGCTTGC  AGATCTGCAT  GGGTG。pUGN81-3的核苷酸4265-4776位包含双增强的35S启动子，其中核苷酸4265-4516位相应于花椰菜花叶病毒基因组第7093-7344位核苷酸(Franck等，(1980)细胞21：285-294)。pUGN81-3的核苷酸4525-4776位是核苷酸4265-4516位的重复，在重复序列间有含核苷酸4517-4524位的接头CATCGATG。pUGN81-3的核苷酸4777-4871位相应于花椰菜花叶病毒基因组第7345-7439位碱基(Franck等，(1980)细胞21：285-294)。核苷酸4872-4891位包含接头GGGGACTCTAGAGGATCCAG。pUGN81-3的核苷酸4892-5001位相应于玉米条斑病毒基因组的核苷酸167-277位，其中第187位碱基缺失(Mullineaux等，(1984)EMBO J.3：3063-3068)。核苷酸5002-5223位相应于玉米乙醇脱氢酶基因(Adh1-S)被修饰的第一个内含子(Dennis等，(1984)核酸研究12：3983-4000)。该修饰导致343个核苷酸的去除(第1313-1656位碱基)，而玉米Adh1-S基因的碱基1222-1312位(内含子5’端)和核苷酸1657-1775位(内含子3’端)保留。pUGN81-3的核苷酸5224-5275位相应于玉米条斑病毒(MSV)的核苷酸279-312位。玉米条斑病毒(下文称MSV)上述两部分序列都包含MSV衣壳蛋白V2基因的非翻译前导序列，在质粒pUGN81-3中被修饰的Adh1内含子打断。质粒pUGN81-3的核苷酸5258-5814位相应于吸水链霉茵(Streptomyces hygroscopicus)膦丝茵素乙酰转移酶(BAR)基因的核苷酸29-585位(White等，(1989)核酸研究18：1062)。为了便于克隆，将该公布序列中的核苷酸34和575位的A和G分别改变成G和A。此序列用作选择标记。核苷酸5815-5819位包含接头GATCT。pUGN81-3的核苷酸5820-6089位相应于质粒pBI101(Clontech，PaloAlto，CA)的核苷酸441414683位，其后是接头序列ATCGG。pUGN81-3的剩余序列(核苷酸6095-8730位)相应于pUC19的反向互补序列(Yanish-Perron等，(1985)基因33：103-119)。
含驱动β-葡糖醛酸糖苷酶基因之遍在蛋白启动子调节元件的玉米表达载体pDAB418被用于一些表达研究中。此外，该质粒携带用作植物选择标记的第二个基因。质粒pDAB418是按顺时针方向次序由以下序列组成的10149个碱基对的双链植物转化载体。核苷酸1-31位具有核苷酸序列AATTCATCGA AGCGGCCGCA AGCTTCCGCG G。质粒pDAB418的核苷酸32-2023位是玉米遍在蛋白(Ubil)启动子和其第一个内含子，是经PCR扩增自玉米基因型B73的基因组DNA(Christensen等，(1992)植物分子生物学18：675-689)。pDAB418的核苷酸2024-2042位包含接头序列  GGTACCCCCGGGGTCGACC。pDAB418的核苷酸2043-3894位相应于质粒pBI101(Clontech，Palo Alto，CA)的核苷酸2551-4402位，其后是接头序列TGGGGAATTG(碱基3895-3904位)。pDAB418的核苷酸3905-4174位相应于pBI101的4414-4683位。核苷酸4175-4192位含接头序列ATCGGGAATT AAGCTTGG。碱基4193-6184位包括如上所述的玉米遍在蛋白启动子和其第一个内含子的又一拷贝。此序列之后是接头序列GTCGGGGATC TA(6185-6196位)。质粒pDAB418的核苷酸6197-6753位相应于吸水链霉菌膦丝菌素乙酰转移酶(BAR)基因的核苷酸29-585位(White等，(1989)核酸研究18：1062)。为了便于克隆，将该公布序列中的核苷酸34和575位从A和G分别改变成G和A。此序列用作选择标记并被玉米遍在蛋白启动子调控。核苷酸6754-6758位包含接头TAACC。核苷酸6759-7472位作为3’聚腺苷酸化序列，包括根癌农杆菌章鱼碱Ti质粒pTi15955的第21728-22441位碱基(Barker等，(1983)植物分子生物学2，335-350)。序列7473-7504位含多接头GGAATTCATC GATATCTAGA TGTCGAGCTC GG。pDAB418的剩余序列(核苷酸7505-10149位)相应于pUC19质粒骨架来源的核苷酸的反向互补物(Yanish-Perron等，(1985)基因33：103-119)。
实施例3
触须制备、优化和I型玉米愈伤组织的转化
I型愈伤组织产生自不同的近交系。为了进行检测，将I型愈伤组织各约  250mg样品放入2.0mL微量离心管(BrinkmanInstuments，Inc.，Westbury，NY)中，加入由以下成分组成的I型培养基300mL：N6常量营养物和维生素(Chu，1978，植物组织培养进展研讨会，第43-56页)、B5微量营养物(Gamborg等，Exp.Ce.Res.50：151-158)、30g/L蔗糖、2.9g/L L-脯氨酸、100mg/L肌醇、100mg/L酪蛋白水解物、37mg/L NaFeEDTA、8mg/L麦草畏、0.8mg/L 2，4-D、4.9mg/L硝酸银、20uL DNA溶液(1.0mg/mL pDAB418溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)和40ug/uL(SC-9)触须悬浮液200uL。然后将各管用Vortex-Genie 2TM混匀20秒，并将愈伤组织转移回用2.5g/LGELRITE固化的I型培养基中保温16小时。之后将愈伤组织用于如下文所述的GUS表达检验，结果总结于表1。
表1.I型愈伤组织中的GUS表达
基因型                        每个样品中GUS表达单位
 H99                           31±26Pa91                          22±8139/39                        3±3
在所有被测基因型中观察到触须处理后I型愈伤组织中有瞬时GUS表达。
实施例4
触须制备、优化和II型玉米愈伤组织的转化
用约40mg干触须(来自Advanced Composite Materials Corp.，Greer，SC的Silar SC-9；来自Johnson-Matthey，Ward Hill，MA的AlfaAesar)并放于预先称重的2.0mL聚丙烯管中，制备无茵碳化硅触须悬液。将管再称重以确定所加入触须的量，然后高压蒸气灭菌。临用前加入维持液(见上文)制备40mg/mL触须悬液，高速混匀1分钟。
在转化实验中，将来自不同未成熟胚衍生品系的II型愈伤组织样品200或500mg加入17×100mm培养管(Falcon2059，BectonDickinson，Lincoln Park，NJ)中。在各管中加入液体维持培养基(无GELRITE)500uL、80uL DNA溶液(0.5ug/uL pDAB418溶于10mMTris，1mM EDTA，pH8.0)和40mg/mL(SC-9)触须悬浮液50uL。然后将各管用Vortex-Genie 2TM(Scientific Industries，Bohemia，NY)混匀20秒。还进行阴性对照实验。一种情况是无DNA时用触须处理愈伤组织。另一种情况是无触须时用DNA处理愈伤组织。不管如何处理，将愈伤组织转移回含2.5g/L GELRITE的固体维持培养基中并于黑暗中28℃保温16小时。然后将愈伤组织置于GUS检验溶液(0.2M磷酸钠pH8.0、铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.1mM、1.0M NaEDTA、0.5mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸和0.6％v/v Triton x-100)中。黑暗中37℃保温48小时后检测GUS表达，用各样品中的蓝色扇形区计数表示，总结于表2中。
表2在固定DNA浓度下(0.0635ug/uL终浓度)
经触须介导愈伤组织转化后的GUS表达
愈伤组织量/管                          GUS表达单位/样品
200mg愈伤组织+触须+DNA                    79±22200mg愈伤组织+触须-DNA                    0200mg愈伤组织-触须+DNA                    0500mg愈伤组织+触须+DNA                    51±20500mg愈伤组织+触须-DNA                    0500mg愈伤组织-触须+DNA                    0
只有当触须和DNA均与愈伤组织混匀后才观察到GUS表达。与500mg/管相比，使用200mg愈伤组织/管观察到的瞬时GUS表达稍高。
为了检测不同DNA浓度的影响，将来自不同未成熟胚衍生品系的II型愈伤组织样品200mg加入17×100mm培养管(FalcoH2059，BectonDickinson，Lincoln Park，NJ)中。各管中加入250uL液体维持培养基、DNA10、25、或50uL(1.0ug/uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)和40mg/mL(SC-9)触须悬浮液50uL。然后将各管用Vortex-Genie 2TM(Scientific Industries，Bohemia，NY)混匀20秒。将愈伤组织转移回半固体维持培养基中并于黑暗中28℃保温16小时。然后如前所述检验愈伤组织GUS表达，结果如表3所示。
表3在不同DNA浓度下200mg愈伤组织经触须介导转化后的GUS表达
DNA终浓度                    GUS表达单位/样品
0.032ug/uL              105±730.077ug/uL              86±570.143ug/uL              96±76
含约200mg愈伤组织的少到10ug DNA/管(0.032ug/uL)的浓度可产生瞬时GUS表达。增加DNA量未显示明显提高瞬时GUS表达。
如本文所述制备代表不同未成熟胚衍生品系的II型愈伤组织样品约500mg，并加入17×100mm培养管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中。在各管中加入液体维持培养基500uL和50uLDNA溶液(0.5ug/uL pDAB418溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)。然后将愈伤组织/DNA混合物在室温或冰上放1小时。在缺少DNA的条件下温育愈伤组织作为阴性对照。然后加入40ug/uL(SC-9)触须悬浮液50uL并如上所述混匀。将愈伤组织转移回含2.5g/L GELRITE的固体维持培养基中并于黑暗中28℃保温16小时。之后如前所述检测愈伤组织的GUS表达。结果总结于表4。
表4与DNA预保温1小时条件下愈伤组织经触须介导转化后的GUS表达
DNA保温                              GUS表达单位/样品
DNA+愈伤组织+触须                              70±65DNA+愈伤组织→1小时(冰置)→触须                23±37DNA+愈伤组织→1小时(室温)→触须                60±27
在与触须搅拌前温育愈伤组织和DNA导致较低的瞬时GUS表达，当室温保温时更是如此。在临进行触须处理前加入DNA可观察到最好的结果。
将代表不同未成熟胚衍生品系的II型愈伤组织样品约200mg或放于渗透培养基(含36.4g/L山梨醇和36.4g/L甘露醇的维持培养基)中保温4小时，或保持于维持培养基上。然后将愈伤组织放于17×100mm培养管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中并在各管中加入液体渗透培养基或液体维持培养基200uL、20uL DNA溶液(1.0ug/uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)和40ug/uL(Alfa)触须悬浮液50uL。然后将各管用Vortex-Genie 2TM混匀20秒，将愈伤组织转移回用2.5g/L GELRITE凝固的渗透培养基或维持培养基中并于黑暗中28℃保温16小时。之后如前所述检测愈伤组织的GUS表达。结果总结于表5。
表5在触须介导转化前和/或后经渗透处理的愈伤组织的GUS表达
渗透处理              GUS表达单位/样品
无                        72±19只在转化前处理            245±80只在转化后处理            67±37转化前后均处理            222±83
在于触须混合前经过渗透处理的培养物中瞬时GUS表达最高。
将代表不同细胞系的II型愈伤组织样品约200mg放于渗透培养基中并保温4小时。然后将愈伤组织加入17×100mm培养管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中并在每管中加入200uL液体渗透培养基(无GELRITE)、20uL DNA溶液(1.0ug/uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)和40ug/uL(Alfa)触须悬浮液25、50或100uL。各管用Vortex-Genie 2TM混匀20或60秒。将愈伤组织转移回液体渗透培养基上并于黑暗中28℃保温16小时，之后如前所述检测愈伤组织的GUS表达。结果总结于表6。
表6用不同触须量转化20和60秒的愈伤组织GUS表达
触须量                    GUS表达单位/样品20秒            60秒
 25uL(1 mg/管)         61±36         136±8050uL(2mg/管)          70±46         183±126100uL(4mg/管)         155±92        175±98
对总触须量平均后，与20秒搅拌相比，搅拌60秒观察到最高的GUS表达。不过，搅拌60秒似乎对愈伤组织有很大的伤害。使用100uL触须悬液(4mg触须/管)时也观察到高GUS表达。我们的数据表明增加触须量可补偿搅拌时间，反之亦然。最优选的条件是与100uL触须混合20秒。
将代表不同细胞系的II型愈伤组织样品约500mg放于渗透培养基中并保温4小时。然后将愈伤组织加入17×100mm培养管(Falcon 2059，Becton Dickinnson，Lincoln Park，NJ)中并在每管中加入1000uL液体渗透培养基、27.7uL DNA溶液(0.72ug/uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)和用Silar SC-9(Advanced Composite，Greer，SC)或Alfa Aesar(Johmson Matthey，Ward Hill，MA)触须配制的40ug/uL触须悬浮液200uL。各管用Vortex-Genie 2TM混匀20秒，将愈伤组织转移回用2.5g/L GELRITE凝固的渗透培养基上并于黑暗中28℃保温16小时，之后如前所述检测愈伤组织的GUS表达，结果总结于表7。
表7转化中触须类型的比较
触须类型              GUS表达单位/样品
Silar SC-9               113±48Alfa Aesar               51±9
尽管两者均有表达，但用Silar SC-9触须比用Alfa Aesar触须可观察到更好的瞬时GUS表达。
将代表不同细胞系的II型愈伤组织样品约500mg放于渗透培养基中并保温4小时。然后将愈伤组织加入17×100mm培养管(Falcon 2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)或15mL圆锥形离心管(Corning25319-15，Corning，NY)中。在每管中加入1000uL液体渗透培养基、20uL DNA溶液(1.0mg/mL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)和40ug/uL(Alfa)触须悬浮液200uL。各管用Vortex-Genie或Caulk Vari-Mix II(Estrada Dental，Ranch0 Cucamonga，CA)搅拌20秒。将愈伤组织转移回固体渗透培养基上并保温16小时，如前所述检测愈伤组织的GUS活性(表8)。
表8容器和混合仪类型对触须介导转化愈伤组织的影响
容器类型                     GUS表达单位/样品Vortex                Vari-Mix
 Falcon                 418±202              256±261Corning                395±362              353±271Agitator Average       407±294              304±270
用Vortex和Vari-Mix搅拌后都观察到高水平的瞬时GUS表达；不过Vortex混匀似乎更好一些。
实施例5
稳定转化的转基因玉米植株的生产和再生
将II型愈伤组织样品约200mg放于渗透培养基中并保温4小时。然后将愈伤组织加入17×100mm培养管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中并在每管中加入200uL液体渗透培养基、20uLDNA溶液(1.0ug/uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)和40ug/uL(Alfa)触须悬浮液100uL。各管用Vortex-Genie 2TM混匀20秒，将愈伤组织转移回用2.5g/L GELRITE凝固的渗透培养基上并在选择前恢复约48小时。
将经触须处理的愈伤组织置于选择培养基[含30mg/LBastaTM(Hoechst，Frankfurt，Germany)的维持培养基，无酶促酪蛋白水解物或L-脯氨酸]上并在约3-4个月的期间内每4周转移到新鲜的选择培养基中。10-20周后，每两周分离活跃生长的集落并传代培养至新鲜的选择培养基中以便在再生前扩大培养愈伤组织。
为进行植物再生，将愈伤组织转移到诱导培养基中，见下文，保温于28℃中16小时/8小时的光/暗光周期，低亮度光(13mE/m2/sec)，持续一周，然后28℃中16小时/8小时的光/暗光周期，高亮度光(40mE/m2/sec)中，持续一周，光照由凉白荧光灯提供。诱导培养基包含MS盐和维生素(Murashige和Skoog，1962，植物生理学15：473-497)、30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、5mg/L苄氨基嘌呤、0.025mg/L2，4-D、2.5g/L GELRITE并调到pH5.7。在此两周的诱导期后，将愈伤组织转移到再生培养基上并于高亮度光(40mE/m2/sec)中28℃保温。再生培养基包含MS盐和维生素、30g/L蔗糖和2.5g/L GELRITE并调到pH5.7。将愈伤组织每约两周传代培养一次至新鲜再生培养基中直到小植株出现。诱导和再生培养基均含30mg/L BastaTM。将小植株转移到含约0.1kg干Metro-Mix 360(The Scotts Co，Marysville，OH)的10cm花盆中，放在温室，保持彻底潮湿，并用透明塑料杯盖2-4天。待有3-5片叶片时，将植物移植到装有土壤的5加仑花盆中并生长至成熟。
实施例6
转化的愈伤组织和植物组织的DNA印迹分析
用特异于目的基因编码区的DNA探针，通过DNA印迹分析鉴定BASTA抗性品系，以确认转基因的存在。对来自愈伤组织和叶片材料的DNA均进行分析。
对于愈伤组织，冻干前将材料在蒸馏水中浸泡30分钟并转移到新培养皿上。在6-8片叶片期收获植物的叶片材料。如Saghai-Maroof等所述从冻干组织中制备基因组DNA((1984)美国国家科学院院报81：8014-8018)。在制造商(Bethesda Research，Gaithersburg，MD)推荐条件下用特异于各质粒构建体的限制性酶消化DNA各8ug，并在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳分离。然后如Southern((1975)分子生物学杂志98：503-517)所述将  DNA  印迹到尼龙膜上。用50mCi[a-32P]dCTP(Amersham Life Science，Arlington Heights，IL)，使用Oligolabelling Kit(Pharmacia LKB，Piscataway，NJ)制备特异于GUS编码区的1.9kb DNA探针。然后将放射性探针与印迹上的基因组DNA在45mL的基本杂交缓冲液(10％聚乙二醇、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.6×SSC(其中1×SSC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、10mM磷酸钠、5mM EDTA和100ug/mL变性鲑精DNA)中60℃杂交过夜。杂交后，将印迹用0.25×SSC和0.2％SDS在60℃洗45分钟，印干并在两增强屏(DuPont，Newark，DE)上对XAR-5胶片(Koda k，Rochester， NY)曝光过夜。
通过Southern分析检测再生自转基因愈伤组织系的植物，发现所有这些植物均具4.2kb杂交产物。预期杂交产物含遍在蛋白-1启动子/内含子、GUS编码序列和nos 3’非翻译区。由所给培养物再生的各植物均展示相同的杂交模式。
实施例7
胚发生性I型稻愈伤组织的建立
为了引发稻胚发生性I型愈伤组织培养物，将稻栽培品种Japonica，Taipei 309的成熟种子脱壳并用70％(v/v)酒精表面消毒分钟，随后浸泡于含几滴LIQUI-NOX(Alconox，Inc.，New YorK，NY))的市售50％(v/v)漂白液中。在转移到诱导培养基[N6常量营养物(Chu，1978，植物组织培养进展研讨会，Peking Press，第43-56页)、B5微量营养物和维生素(Gamborg等，Exp.Ceu Res.50：151-158)、30mg/L酪蛋白水解物、500mg/L L-脯氨酸、500mg/L L-谷氨酰胺、30g/L蔗糖、2mg/L 2，4-D和2.5g/L GELRITE，pH5.8]中前将种子用无菌水洗3次并置于滤纸上。种子培养于诱导培养基上并于黑暗中28℃保温3周。之后，将诱发自盾形区的新初级愈伤组织转移到新鲜的诱导培养基中以便进一步的维持。一般说来，在各次传代培养后以其形态为基础选择胚愈伤组织。稻I型胚发生性愈伤组织的一般形态是硬的致密结节状结构，有时显示类胚形，在某些情况下不显示这种形态。该材料被称为I型。
实施例8
触须制备、优化和稻I型愈伤组织转化
临送递DNA前，如前所述在水中制备50ug/uL无菌碳化硅触须(Silar SC-9)悬液。选择不到4个月大的I型稻胚发生性愈伤组织约125-500mg，并转移至已装入约250uL液体起始培养基(无GELRITE的起始培养基)的15mL Corning圆锥离心管或1.5mL微量离心管中。然后，加入约10-160uL 50ug/uL触须溶液和约25uL 1ug/uL pDAB418DNA溶液，立即用Vortex Genie 2TM以尽可能高的速度混匀15-120秒。之后，将愈伤组织转移到有或无高渗透剂(0.2M甘露醇和0.2M山梨醇；Vain等，1993，Plant Cell Rep.12：84-88)的起始培养基中，28℃黑暗中保温约24小时，检测GUS活性。
按照Jefferson等(1987，EMBO J 6：3901-3907)和本文所述进行GUS组织化学检验。将组织置于24-孔微量滴定板(Corning，New York，NY)上，每孔中含500uL检验缓冲液。检验缓冲液由以下成分组成：0.2M磷酸钠(pH8.0)、0.1mM铁氰化钾、0.1mM亚铁氰化钾、1.0MNaEDTA、1.9mM 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸和0.06％tritonX-100。在用显微镜检测组织表达前将平板于黑暗中37℃保温1-2天。检测碳化硅触须介导的DNA送递，以GUS瞬时表达表示，即GUS表达单位(蓝点)/样品。
检测许多不同的转化参数以确定转化所需的最佳条件。一些检测参数包括：混匀时间、加入50ug/uL触须溶液的量、在触须处理前和/或后用高渗透剂处理、每次转化所用组织量和容器大小。在所有这些实验中，除非另外提及，否则与本文所述流程基本相同。
研究混合时间(15-60秒)对于DNA送递入稻胚发生性I型愈伤组织的影响。此实验中，在用触须转化前用高渗透剂处理愈伤组织约4小时，在用触须处理后再用高渗透剂处理愈伤组织约16小时。将250mg愈伤组织放入15mL Corning圆锥离心管中，加入1000uL液体起始培养基、25uL 1ug/uL DNA溶液(pDAB418)和100uL 50ug/uL触须溶液，转化愈伤组织。多套样品分别混合15、30、60和120秒，结果定量显示于表9中。
表9混合时间对稻I型胚发生性愈伤组织转化的影响
    混合时间(秒)     GUS表达单位/样品
    153060120     113.5107.590.572.5
可见，尽管稻I型胚发生性愈伤组织的形态坚硬致密，混合时间少至15秒时DNA送递和愈伤组织转化仍是可能的。
在保持恒定体积(1000uL)液体起始培养基的条件下测定改变加入触须的量对表达的影响。在触须介导转化前和后用高渗透剂处理愈伤组织样品。选择约250mg愈伤组织并转移到已加入无GELRITE之1000uL液体起始培养基的15mL Corning圆锥离心管中。加入不同量的50ug/uL触须溶液(10、20、40、80和160uL)和25uL 1ug/uL DNA溶液(pDAB418)，之后用Vortex Genie 2TM混匀60秒。然后将样品转移回含高渗透剂的起始培养基中过夜，再进行组织化学GUS检验。结果见表10。发现GUS表达与加入触须量的增加相关。
表10在保持起始培养基体积恒定的条件下增加触须量的影响
    加入的触须溶液(uL)     GUS表达单位/样品
    10204080160     21966.5
研究高渗透剂对转化效率的影响，结果总结于表11。此实验中，在触须介导转化后用高渗透剂处理愈伤组织或不用高渗透剂处理。将约250mg愈伤组织转移到1.5mL微量离心管中。加入约250uL液体起始培养基，然后加入125uL 50ug/uL触须溶液和25uL 1ug/uL DNA溶液(pDAB418)。将样品混合60秒，转移回含或不含高渗透剂的起始培养基中过夜，再进行GUS检验。与用高渗透剂处理的样品相比，触须转化后不用高渗透剂处理的愈伤组织表达水平较高。
表11混匀后用渗透剂处理及混合时间对稻I型胚发生性愈伤组织转化和转基因表达的影响
转化后加渗透剂 mg组织 混合时间(秒) GUS表达单位/样品
    ++++     250250500500     30603060     48443744
    ----     250250500500     30603060     8710796120
研究加入的愈伤组织量和容器大小(1.5mL微量离心管和2.0mL微量离心管)。此实验中，在保持恒定体积液体起始培养基，即250uL的条件下使用125或250mg愈伤组织。所有各例中均加入125uL50ug/uL触须溶液和25uL 1ug/uL DNA溶液(pDAB418)，再用VortexGenie 2TM混匀60秒。转化后，将愈伤组织样品在含高渗透剂的起始培养基中保温过夜，再进行GUS检验。结果总结于表12。
表12容器大小和加入的组织量对稻I型愈伤组织经触须介导的转化的影响
    mg组织 容器尺寸(mL) GUS表达单位/样品
    125125250250     1.52.01.52.0     86249.5
每管使用1.5mL微量离心管和250mg愈伤组织产生最高的瞬时表达。
实施例9
pUbiHyg的质粒描述
如Gritz和Davies，(1983)基因25：179-188中所述，稻表达载体pUbiHyg包含驱动潮霉素B磷酸转移酶(抗性)基因的来自遍在蛋白基因(Ubil)调节元件的玉米遍在蛋白启动子和第一内含子。质粒pUbiHyg是5991个碱基对的双链植物转化载体，包括顺时针方向的以下序列。第1-42位核苷酸具有序列AAGCTTGCAT GCCTGCAGATCTGCGGCCGC AAGCTTCCGC GG。pUbiHyg的第43-2034位核苷酸是玉米遍在蛋白启动子和第一内含子，由PCR扩增自玉米基因型B73的基因组DNA(Christensen等，(1992)植物分子生物学18：675-689)。pUbiHyg的第2035-2052位核苷酸具有序列GGTACCCCCG GGTAGACC。pUbiHyg的第2053-3078位核苷酸相应于潮霉素B磷酸转移酶(抗性)基因序列(接收号K01193)的第211-1236位核苷酸，只是pUbiHyg中第2056和2057位核苷酸从AA修饰成了GT，以方便将来的克隆。第3079-3097位碱基含接头TAAGAGCTCG AATTTCCCC。第3098-3351位碱基相应于质粒pBI101(Clontech，Palo Alto，CA)的第4430-4683位核苷酸。pUbiHyg的剩余序列(第3352-5991位核苷酸)相应于质粒骨架的核苷酸(Yanish-Perron等，(1985)基因33：103-119)。
实施例10稳定转化的稻I型愈伤组织的生产和转基因植物的再生
为了生产稳定的稻转基因植物，如本文所述产生稻I型愈伤组织并进行触须介导转化。一般地，将经过或未经过高渗透剂处理4小时的250mg稻I型愈伤组织加入1.5mL微量离心管中。还加入250uL液体起始培养基、125uL 50ug/uL触须溶液和25uL 1ug/uL DNA溶液(pDAB305和pUbiHyg，比例1∶1)。如前所述混匀60秒以保证DNA的送递。触须介导DNA送递后，如前所述将愈伤组织转移到含高渗透剂的起始培养基中24小时，然后转移到选择培养基中。选择培养基由起始培养基和30mg/L潮霉素(CalBiochem-NovabiochemCorporation，La Jolla，CA)组成。两周后将培养物转移到含50mg/L潮霉素的选择培养基中(Li等，1993，Plant Ceu Rep.12：250-255)。将培养物置于选择培养基上，30-45天后形成致密的白黄色胚发生性愈伤组织培养物。然后将这些培养物转移到含50mg/L潮霉素的预再生(PR)培养基中并在黑暗中保持于28℃条件下。PR培养基由起始培养基和2mg/L苄氨基嘌呤(BAP)、1mg/L萘乙酸(NAA)和5mg/L脱落酸(ABA)组成。两周后，将培养物转移到再生(RN)培养基中，其中RN培养基是起始培养基加3mg/L BAP和0.5mg/L NAA。RN培养基中的培养物在高荧光灯(325英尺烛光(ft-candle))下28℃保温直到小植株出现。当小植株芽长到约2cm时，将它们转移到含以下成分培养基的Magenta GA7盒(Magenta Corp.，Chicago，IL)中：MS常量和微量营养物、1∶1稀释于水中的B5维生素(Gamborg等，1968，Exp.CenRes.50：151-158)、10g/L蔗糖、0.05mg/L NAA、50mg/L潮霉素、2.5g/LGELRITE并调到pH5.8。当小植株建立了发育良好的根系后，将它们转移到土壤/metromix360(1∶1)中并在温室内(29℃/24℃白天/黑夜循环、50-60％湿度、12小时光周期)培养直到成熟。这些植物的DNA印迹分析显示有潮霉素基因存在，表明它们确实被转化了。这些植物在温室中成功地长到成熟。
实施例11
pSMGN179-3的质粒描述
表达载体pSMGN179-3包含驱动β-葡糖醛酸糖苷酶基因、由Gelvin和Hauptmann，(1995)专利WO95/14098中描述的根癌农杆菌冠瘿碱合酶基因嵌合调节区的修饰衍生物。质粒pSMGN179-3是5541个碱基对的双链植物转化载体，包括以下顺时针方向的序列：第1-16位核苷酸具有pUC19(Yanish-Perron等，(1985)基因33：103-119)的质粒骨架多克隆序列AATTCGAGCT CGGTAC。pSMGN179-3的第17-57位核苷酸含接头片段序列CGGGCCCCCC CTCGAGGTCGACGGTATCGA TAAGCTTGAT C。pSMGN179-3的第58-277位碱基相应于根癌农杆茵Ti质粒pTi15955 T-DNA(Barker等(1983)植物分子生物学2：335-350)第13774-13993位碱基的反向互补物。这些碱基相应于来自章鱼碱合酶(ocs)基因的上游活化序列。第278-304位碱基相应于接头DNA序列CGAATTCCAA GCTTGGGCTG CAGGTCA。第305-350位碱基相应于根癌农杆菌Ti质粒pTi15955 T-DNA(Barker等(1983)植物分子生物学2：335-350)第21475-21520位碱基的反向互补物。pSMGN179-3的第351-737位碱基含根癌农杆菌Ti质粒pTi15955T-DNA(Barker等(1983)植物分子生物学2：335-350)β-葡糖醛酸糖苷酶基因第20128-20514位碱基的反向互补物。pSMGN179-3的第305-737位序列包括Gelvin和Haupman，(1995)专利WO95/14098所述的△MAS启动子。pSMGN179-3的第738-763位碱基包含接头序列CTCTAGAACT AGTGGATCCG TCGACC。pSMGN179-3的第58-763位碱基包含SEQ ID NO：1中所给的启动子和非翻译前导序列调节融合序列。pSMGN179-3的第764-2615位核苷酸相应于质粒pBI101(Clontech，Palo Alto，CA)编码β-葡糖醛酸糖苷酶基因的第2551-4402位核苷酸(Jefferson等，(1986)PlantMol.Biol.Rep.83(22)：8447-8451)。第767-769位碱基从TTA改变成GTC。β-葡糖醛酸糖苷酶基因之后是多接头序列TGGGGAATTG，相应于pSMGN179-3的第2616-2625位碱基。第2626-2895位碱基相应于pBI101(Clontech，Palo Alto，CA)的第4414-4683位，其中包含来自胭脂碱合酶3’非翻译区的序列(Jefferson等，(1986)PlantMol.Biol.Rep.83(22)：8447-8451)。pSMGN179-3的剩余序列(第4684-5541位核苷酸)相应于来自pUC19之质粒骨架核苷酸的反向互补物(Yanish-Perron等，(1985)基因33：103-119)。
实施例12
胚发生棉花愈伤组织的转化
将约250mg来自不同幼苗衍生株系的棉花愈伤组织置于渗透培养基(维持培养基加36.4g/L山梨醇和36.4g/L甘露醇)上并于黑暗中保温4小时。然后将愈伤组织加入17×100mm培养管(Falcon2059，BectonDickinson，Lincoln Park，NJ)中，并在每管中加入250uL液体渗透培养基(无GELRITE)、20uL DNA溶液(1.0ug/uL pSMGN179-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)和40mg/mL(Alfa)触须悬浮液50uL。各管用Vortex-Genie 2TM(Scientific Industries，Bohemia，NY)混匀40、80或160秒。将愈伤组织转移回用2.5g/L GELRITE凝固的渗透培养基上并于黑暗中28℃保温16小时，之后如前所述检测愈伤组织的GUS表达。结果显示于表13。
表13使用不同搅拌时间的触须介导转化棉花愈伤组织后GUS的表达
搅拌时间              GUS表达单位/样品
 40秒                   41±2180秒                   59±38160秒                  37±28
在触须处理的棉花愈伤组织中观察到GUS表达。将搅拌时间从40秒延长到160秒未显示能显著增加表达量。
实施例13
质粒pDAB305的产生
质粒pDAB305是5800bp的质粒，含有具串联拷贝花椰菜花叶病毒35S增强子(35S)的启动子、Adh1内含子1的缺失变体和与β-葡糖醛酸糖苷酶基因融合之玉米条斑花叶病毒衣壳蛋白的非翻译前导序列，其后是nos 3’UTR。制备如下：原始材料是Odell等(1985自然313：810-812)所述的质粒pUC13/35S(-343)。起始于pUC13之SmaI位点的3’末端(Messing，1983酶学方法，Wu，R.编，101：20-78)，并按紧邻pUC13之lacZ基因非编码链的链阅读，该质粒包含CaMV的第6495-6972位核苷酸，其后是接头序列CATCGATG(编码ClaI识别位点)，之后是CaMV的第7089-7443位核苷酸，再之后是接头序列CAAGCTTG，后一序列包含HindIII的识别位点，之后是pUC13质粒DNA的剩余序列。
用ClaI和NcoI消化质粒pUC13/35S(-343)DNA，用琼脂糖凝胶电泳将3429个碱基对(bp)的大片段与66bp的小片段分离，然后用标准方法纯化。用CIaI消化DNA，然后通过T4 DNA聚合酶处理补平突出端。将平端DNA与含NcoI识别位点的合成寡核苷酸接头序列CCCATGGG连接。将连接反应物转化入感受态大肠杆菌细胞，鉴定出所含质粒(称pOO#1)具有位于原ClaI位点处的NcoI位点的转化子。用NcoI消化pOO#1的DNA并将大片段的匹配端再连接，导致从pOO#1中缺失70bp，从而产生中间质粒pOO#1 Nco*。
用EcoR V消化质粒pOO#1 Nco*DNA，并将平端与具序列CATCGATG的ClaI接头连接。鉴定所含质粒在原EcoR V位点处有一新ClaI位点的大肠杆菌转化子，该质粒被称为pOO#1 Nco*RV＞Cla。然后用ClaI和NcoI消化此DNA，从琼脂糖凝胶上纯化小片段(268bp)。然后将此片段与前面制备的pUC13/35S(-343)的3429bpClaI/NcoI片段连接，鉴别出所含质粒具3429和268bp ClaI/NcoI片段的大肠杆菌转化子。该质粒被称为pUC13/35S En。
用NcoI消化质粒pUC13/35S En DNA，通过T4 DNA聚合酶处理补平突出端。然后用SmaI切割处理过的DNA，并与具序列CAGATCTG的BglII接头连接。鉴别出所含质粒中416bp SmaI/NcoI片段已被至少两拷贝BglII接头置换的大肠杆菌转化子，称为p35SEn2。p35S En2的DNA结构如下：由pUC13之lacZ基因非编码链的紧邻链上SmaI位点第三个C残基后的核苷酸开始；后是接头序列CAGATCTGCA GATCTGCATG GGCGATG，  然后是CaMV的第7090-7344位核苷酸，之后是ClaI接头序列CATCGATG，然后是CaMV的第7089-7443位核苷酸，后面是HindIII接头序列CAAGCTT，再之后是pUC13的剩余序列。此结构的特征是位于病毒基因组EcoRV位点上游区内的CaMV 35S启动子的增强子序列(第7090-7344位核苷酸)已被加倍。此启动子构建体掺入了天然35S转录起始位点，位于HindIII位点第1个A残基上游11个核苷酸处。
对于利用35S启动子和农杆茵NOS PolyA序列的质粒，用于第一个构建体的原材料是质粒pBI221，购自CLONTECH(Palo Alto，CA)。该质粒含稍改变的CaMV 35S启动子拷贝。由pUC19的PstI位点3’端开始(Yanish-Perron等，(1985)基因33：103-119)，按pUC19之编码lacZ基因的同一链阅读，序列依次是接头核苷酸GTCCCC，其后是CaMV的第6605-7439位核苷酸，后面是接头序列GGGGACTCTAGAGGATCCCC GGGTGGTCAG TCCCTT。这些碱基之后是包含编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)蛋白质之大肠杆菌UidA基因编码序列的1809bp和来自大肠杆菌基因组的55bp 3’侧翼碱基(Jefferson，1986美国国家科学院院报83：8447-8451)，然后是SacI接头序列GAGCTC，其后是接头序列GAATTTCCCC。这些碱基后面是来自根癌农杆茵胭脂碱合酶(NOS)基因的RNA转录终止/聚腺苷酸化信号序列，包括相应于DePicker等(1982 J.Molec.Appl.Genet.1：561-573)所述之第1298-1554位核苷酸的256bp Sau3AI片段，之后是两个C残基、EcoRI识别序列GAATTC和pUC19的剩余序列。
用EcoRI和BamHI消化质粒pBI221 DNA，从琼脂糖凝胶上纯化3507bp的片段。用EcoRI和SalI消化质粒pRAJ275(CLONTECH)DNA，从琼脂糖凝胶上纯化1862bp的片段。将这两片段混合，加入序列为GATCCGGATC CG和TCGACGGATC CG的互补合成寡核苷酸。将这些片段连在一起并通过限制酶分析鉴定所含质粒具有正确DNA结构的大肠杆菌转化子。用BalI和EcoRI消化被称为pKA881的该质粒DNA，从琼脂糖凝胶上分离4148bp的片段。同样地消化pBI221的DNA，凝胶纯化1517bp的EcoRI/BalI片段并与上述pKA881片段连接，产生质粒pKA882。然后用SacI消化pKA882 DNA，用T4 DNA聚合酶处理补平突出端，将片段与序列为CGGATCCG的合成BamHI接头连接。鉴定出所含质粒具有3784和1885bp BamHI片段的大肠杆菌转化子并称之为pKA882B。然后用BamHI消化pKA882B的DNA，连接混合物片段。鉴定出所含质粒用BamHI消化时具有单条带3783bp片段的大肠杆菌转化子并称之为p35S/NOS。该质粒除了缺失GUS基因的编码序列外，具有pBI221的基本DNA结构。因此，CaMV第6605-7439位核苷酸之后是接头序列GGGGACTCTA GAGGATCCCG AATTTCCCC。接头序列后面是NOS聚腺苷酸化序列和pBI221的剩余序列。
用EcoRV和PstI消化质粒p35S/NOS DNA，纯化3037bp片段并与用EcoRV和PstI消化p35S En2 DNA获得的534bp片段连接。鉴定出所含质粒用EcoRV和PstI消化产生3031和534bp片段的大肠杆茵转化子并将此质粒称为p35S En2/NOS。该质粒包含对p35S En2描述过的重复35S启动子增强子区，此启动子序列通过含唯一XbaI和BamHI位点的接头序列与NOS多聚腺苷酸化序列隔开。
MSV基因组序列已由Mullineaux等(1984 EMBO J.3：3063-3068)和Howell(1984核酸研究12：7459-7375)公布，转录物由Fenoll等(1988EMBO J.7：1589-1596)描述过。全部序列包括154bp，通过装配合成寡核苷酸块分三阶段进行构建。首先合成具下述序列的互补寡核苷酸并用标准方法纯化：GATCCAGCTG AAGGCTCGAC AAGGCAGATCCACGGAGGAG CTGATATTTG GTGGACA and AGCTTGTCCA CCAAATATCAGCTCCTCCGT GGATCTGCCT TGTCGAGCCT TCAGCTG
将这些核苷酸退火产生两端4个碱基为单链突出端的双链结构，其中一端与BamHI产生的末端(GATC)匹配，另一端与HindIII产生的单链端(AGCT)匹配。将该退火分子连入已用BamHI和HindIII消化的质粒pBluescript SK(-)[以下称pBSK；Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA]。这些寡核苷酸的序列使得当它们分别与相应BamHi和HindIII突出端连接后，将保持各自的识别位点序列。通过限制酶分析鉴定出所含质粒包括所说寡核苷酸序列的大肠杆茵转化子，该质粒称为pMSVA。
合成具有下述序列的互补寡核苷酸并用标准方法纯化：
AGCTGTGGAT AGGAGCAACC CTATCCCTAA TATACCAGCA CCACCAAGTC
AGGGCAATCC CGGG and TCGACCCGGG ATTGCCCTGA CTTGGTGGTG
CTGGTATATT AGGGATAGGG TTGCTCCTAT CCAC
将这些核苷酸退火产生两端4个碱基为单链突出端的双链结构，其中一端与HindIII产生的分子端(AGCT)匹配，另一端与SalI产生的突出端(TCGA)匹配。这些寡核苷酸的序列使得当它们与HindIII突出端连接后HindIII的识别序列被破坏。
用HindIII和SalI消化pMSV A的DNA并将其与上述退火寡核苷酸连接。通过限制酶位点作图鉴定出所含质粒包括新寡核苷酸的大肠杆菌转化子，该质粒称为pMSVAB。
合成具有下述序列的互补寡核苷酸并用标准方法纯化：
CCGGGCCATT TGTTCCAGGC ACGGGATAAG CATTCAGCCA TGGGATATCA
AGCTTGGATC CC and TCGAGGGATC CAAGCTTGATATCCCATGGC
TGAATGCTTA TCCCGTGCCT GGAACAAATG GC
这些寡核苷酸掺入的碱基中包含NcoI、EcoRV、HindIII和BamHI的识别位点。将这些核苷酸退火产生除两端4个碱基为单链突出端的双链结构，其中一端与XmaI产生的分子末端(CCGG)匹配，另一端与XhoI产生的突出端(TCGA)匹配。将该退火分子连入已用XmaI和XhoI消化的质粒pMSV AB DNA中。通过限制酶分析鉴定出所含质粒包括该寡核苷酸序列的大肠杆茵转化子，序列分析证实了DNA结构。该质粒称为pMSV CPL。总的来说，它们包含MSV衣壳蛋白(“CP”)基因的5’非翻译前导序列(“L”)。这些相应于Mullineaux等(1984)公布的MSV序列第167-186和188-317位核苷酸，5’端旁侧是BamHI接头序列GGATCCAG，而3’端旁侧是接头序列GATATCAAGC TTGGATCCC。相应于野生型MSV序列第187位碱基的A残基在克隆过程中被不小心地丢失了。
在相应于MSV基因组第277位碱基的SmaI位点处消化质粒pMSV CPL DNA，将该DNA与序列为CAGATCTG的BglII接头连接。鉴定出所含质粒在原SmaI位点处具有唯一BglII位点的大肠杆菌转化子并通过DNA序列分析证实，该质粒称为pCPL-Bgl。
在玉米乙醇脱氢酶1(Adh1)内含子1的缺失变体构建中所用的原材料是获自V.Walbot，Stanford University，Stanford，CA的质粒pVW119。该质粒含玉米Adh1.S基因的DNA序列，包括第119-672位核苷酸[Dennis等人(1984核酸研究12：3983-4000)的编号]的内含子1，Callis等人对此也有描述(1987基因和发育1：1183-1200)。在pVW119中，Dennis等人(1984)编号的第672位碱基之后的序列是GACGGATCC。用BclI和BamHI消化，从该质粒得到556bp片段，上有完整的内含子1序列以及外显子1的14个碱基和外显子2的9个碱基。
用BamHI和BclI消化质粒pSG3525a(Pst)DNA，从琼脂糖凝胶上纯化3430bp的片段。用BamHI和BclI消化质粒pVW119 DNA，凝胶纯化546bp的片段并与该3430bp片段连接。鉴定出所含质粒在用BamHI和BclI消化时产生3430和546bp片段的大肠杆菌转化子。该质粒称为pSG AdhA1。
用HindIII和StuI消化pSG AdhA1的DNA。通过T4 DNA聚合酶处理补平末端然后连接。鉴定出所含质粒缺少HindIII和StuI位点的大肠杆菌转化子并通过序列分析确认DNA结构。该质粒称为pSGAdhA1*。在此构建体中，已从内含子1内部缺失了344bp的DNA。这些碱基的丢失不影响该内含子的剪接。有功能的内含子序列可获自用BclI和BamHI消化后的213bp片段上。
用BglII消化质粒pCPL-Bgl的DNA，并将此线性化DNA与来自pSG AdhA1*的含Adh1.S内含子1缺失变体的213bp BclI/BamHI片段连接。通过限制酶位点作图鉴定出所含质粒包含有于BglII位点处连入内含子序列的大肠杆菌转化子，其中内含子的连入方向是BglII/BclI接合点离MSV CPL前导序列的5’端最近，而BglII/BamHI接合点离CPL的3’端最近。此方位通过DNA序列分析证实。该质粒称为pCPL A111*。用BamHI和NcoI消化该质粒，并纯化373bp片段得到MSV前导/内含子序列。
以增强的35S启动子、MSV CPL和Adh1内含子1缺失变体为基础的植物表达载体构建如下。用BamHI消化质粒p35S En2/NOS的DNA，将3562bp线性片段与用BamHI消化pMSV CPL DNA而制备的171bp片段连接。该片段包含完整的MSV CPL序列。通过限制酶位点作图鉴定出所含质粒包括这些序列的大肠杆菌转化子，其中这些序列的方位为NcoI位点位于NOS PolyA序列附近。该质粒称为p35SEn2 CPL/NOS。它包括与MSV前导序列直接紧邻的35S启动子增强变体，从而衍生的转录物在其5’非翻译部分包含MSV序列。
用HindIII和NcoI消化质粒pKA882的DNA，并将4778bp的大片段与含来自p35S En2 CPL/NOS之增强35S启动子序列和MSV前导序列的802bp HindIII/NcoI片段连接。鉴定出所含质粒用HindIII和NcoI消化后具有4778和802bp片段的大肠杆菌转化子，称为pDAB310。在此质粒中，35S启动子的增强变体用于控制GUS基因的表达。转录物的5’非翻译前导序列部分含有MSV衣壳蛋白基因的前导序列。
用NcoI和SacI消化质粒pDAB310的DNA。从琼脂糖凝胶上纯化3717bp的大片段并与序列为CGGTACCTCGAGTTAAC和CATGGTTAACTCGAGGTACCGAGCT的互补合成寡核苷酸连接。当这些寡核苷酸退火形成双链结构时，产生的分子具有粘性末端，其中一端与ScaI切点、另一端与NcoI切点的末端匹配。除恢复这两种酶的识别位点序列外，形成了新的酶识别位点：KpnI(GGTACC)、XhoI(CTCGAG)和HpaI(GTTAAC)。鉴定出所含质粒包括这些酶的识别位点的大肠杆菌转化子，并用序列分析确认DNA结构。该质粒称为pDAB1148。
用BamHI和NcoI消化质粒pDAB1148的DNA，从琼脂糖凝胶上纯化3577bp的大片段，并与纯化自用BamHI和NcoI消化后的pCPLA1I1*的373bp片段连接。鉴定出所含质粒用BamHI和NcoI消化后产生3577和373bp片段的大肠杆菌转化子，该质粒称为pDAB303。该质粒DNA构成如下：由pUC19之PstI位点最后的G残基之后的碱基(第435位碱基)开始，按lacZ基因编码链的紧接链方向阅读，依次是接头序列ATCTGCATGG GTG，CaMV DNA的第7093-7344位核苷酸，接头序列CATCGATG，CaMV DNA的第7093-7439位核苷酸，接头序列GGGGACTCTA GAGGATCCAG，MSV的第167-186位核苷酸，MSV的第188-277位核苷酸，一C残基，之后是Adh1.S的第119-209位核苷酸，玉米Adh1.S的第555-672位核苷酸，接头序列GACGGATCTG，MSV的第278-317位核苷酸，具有HpaI、xhoI、KpnI和SacI识别位点的多位点接头序列GTTAACTCGAGGTACCGAGC TCGAATTTCC CC，NOS的第1298-1554位核苷酸和一G残基，之后是pUC19的剩余序列(包括EcoRI位点)。
用NcoI和SacI消化质粒pDAB303的DNA，将3939bp片段与制备自同样消化之pKA882 DNA、含GUS编码区的1866bp片段连接。通过限制酶位点作图鉴定出正确的质粒，称为pDAB305。该质粒具有pDAB303的增强启动子、MSV前导序列和Adh1内含子排列，定位于一定的位置以控制GUS基因的表达。
质粒pDAB305包含带附加3’序列的增强35S启动子和CaMVDNA的第7093-7344位核苷酸，接头序列CATCGATG，CaMV DNA的第7093-7439位核苷酸，接头序列GGGGACTCTAGAGGATCCAG，MSV的第167-186位核苷酸，MSV的第188-277位核苷酸，-C残基，之后是玉米Adh1.S的第120-210位核苷酸，玉米Adh1.S的第555-672位核苷酸，接头序列GACGGATCTG，MSV的第278-317位核苷酸，及代表NcoI识别序列CCATGG最后一个碱基的G残基。如上所述，GUS翻译起始密码子是NcoI位点的一部分。由此启动子得到的转录物包含基本上作为5’非翻译前导序列的MSV衣壳蛋白前导序列，其中已插入了玉米Adh1.S内合子1的缺失变体。
                              序列表
<110>Petolino，Joseph F
       ceddy，Dayakar R
     nopkins，Nicole L
     Armstrong，Katherine
<120>植物细胞聚集体和植物组织的触须介导转化及其植物的再生
<130>50518
<140>
<141>
<160>1
<170>PatentIn Vet. 2.0
<210>1
<211>706
<212>DNA
<213>Agrobacterium tumefaciens
<400>1
ctacaggcca aattcgctct tagccgtaca atattactca ccggtgcgat gccccccatc 60
gtaggtgaag gtggaaatta atgatccatc ttgagaccac aggcccacaa cagctaccag 120
tttcctcaag ggtccaccaa aaacgtaagc gcttacgtac atggtcgata agaaaaggca 180
atttgtagat gttaacatcc aacgtcgctt tcagggatcc cgaattccaa gcttgggctg 240
caggtcaatc ccattgcttt tgaagcagct caacattgat ctctttctcg agggagattt 300
ttcaaatcag tgcgcaagac gtgacgtaag tatccgagtc agtttttatt tttctactaa 360
tttggtcgtt tatttcggcg tgtaggacat ggcaaccggg cctgaatttc gcgggtattc 420
tgtttctatt ccaacttttt cttgatccgc agccattaac gacttttgaa tagatacgct 480
gacacgccaa gcctcgctag tcaaaagtgt accaaacaac gctttacagc aagaacggaa 540
tgcgcgtgac gctcgcggtg acgccatttc gccttttcag aaatggataa atagccttgc 600
ttcctattat atcttcccaa attaccaata cattacacta gcatctgaat ttcataacca 660
atctcgatac accaaatcga ctctagaact agtggatccg tcgacc                706

Claims (4)

1.一种生产可育转基因陆地棉(Gossyphium hirsutum)植物的方法，包括以下步骤：(i)由待转化陆地棉植物建立可再生的愈伤组织培养物，其中所说的愈伤组织培养物选自下胚轴来源或子叶来源的愈伤组织培养物；(ii)由其选择出植物细胞聚集体用于转化；(iii)通过触须介导的转化用DNA转化所说的植物细胞聚集体；(iv)由其鉴定出转化细胞系；并(v)由其再生出可育的转基因植物。
2.权利要求1的方法，其中所说的培养物是下胚轴来源的培养物。
3.权利要求1的方法，其中所说的培养物是子叶来源的培养物。
4.权利要求1的方法，其中所说的培养物在固体培养基上引发。
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