CN1276014A

CN1276014A - 甘蔗杆状病毒启动子

Info

Publication number: CN1276014A
Application number: CN97182383A
Authority: CN
Inventors: 尼尔·奥尔谢夫斯基; 艾丽斯·查夫里尔; 大卫·A·索默斯; 班汉姆·洛克哈特; 金伯利·A·托伯特
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1996-08-09
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2000-12-06
Anticipated expiration: 2017-08-13
Also published as: US5994123A; WO1999009190A1; ATE239794T1; AU4569497A; EP1304383A3; CA2380621A1; US6093569A; DE69721840D1; BR9714819A; CA2301204A1; DE69721840T2; CA2301204C; EP1304383A2; EP1007705B1; EP1007705A1; CN1197970C; AU737966B2

Abstract

本发明提供了含有甘蔗杆状病毒启动子和含有所述启动子的表达盒的分离和纯化的DNA分子。同时提供的是在转基因植物中利用甘蔗杆状表达启动子表达蛋白质,RNA转录物,或它们的混合物的方法。

Description

甘蔗杆状病毒启动子

植物遗传工程的一个最主要的目的是获得具有改良的特性或性状的植物。这些特性或性状包括病毒抗性，昆虫抗性，除草剂抗性，增强的稳定性和改良的营养价值等。遗传工程的最新进展已经能够在植物细胞中掺入预选定的基因，以便赋予选择的植物需要的特性。然后，在再生植物的细胞中表达导入的基因，即“转化基因”，从而使植物表现出转化基因编码的特性或性状。

为了在植物细胞中表达转化基因，必须存在适当的调节信号并且处于与转化基因相关的适当位置。这些调节信号通常包括启动子区域，5’一非翻译引导序列和3’多聚腺苷酸化序列。启动子区影响生产转化基因的RNA产物，和转化基因产生的蛋白质产物的速度。启动子活性也可以依赖于其它几个顺式作用的调节元件的存在，这些元件与细胞因子一起决定强度，特异性和转录起始位点(综述参见Zawel和Reinberg，当代细胞生物学评论，4，488(1992))。强启动子能够以比弱启动子更高的速度引导RNA的合成。组成型启动子在许多或所有细胞类型中引导RNA的产生。

花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)在植物中是强的组成型启动子(Odell等人，自然，313，810(1985)；Jensen等人，自然，321，669(1986)；Jefferson等人，EMBO杂志，6，3901(1987)；Kay等人，科学，236，1299(1987)；Sanders等人，核酸综述，4，1543(1987))。通过从转基因植物的叶子，茎，根和花制备的提取物中检测报道基因蛋白质或mRNA的高的水平已经表明了这一点。结果，在植物遗传工程领域广泛使用了CaMV35S启动子。虽然CaMV35S启动子在涉及细胞提取物的测试中似乎是强的组成型启动子，但是在细胞和组织水平的详细的报道基因产物的组织学分析显示出在植物的组织中基因产物的表达具有高度的变化。

虽然CaMV35S启动子在单子叶植物中是强启动子，CaMV是花椰菜花叶病毒，是一个类逆转录病毒(pararetrovirus)的亚类，具有二十面体外壳，并且只感染双子叶植物。甘蔗杆状病毒(ScBV)，鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和水稻tungro杆状病毒(RTBV)是badnaviruses，它们是具有杆状外壳并且主要感染单子叶植物的雷尼转录病毒的一个亚类。从CoYMV分离的启动子片段具有的表达组织特异性类型不同于CaMV35S启动子所具有的类型。含有与β-葡糖醛酸糖苷酶报道基因(_iGUS_i，±uidA)连接的CoYMV启动子的转化烟草植物显示虽然CoMYV启动子在所有器官中是活性的，β-葡糖醛酸糖苷酶活性主要存在于韧皮，韧皮相关细胞，根，茎，叶子和花的轴薄壁组织(Medberry等人，植物细胞，4，185(1992)；Medberry和Olszewski，植物杂志，3，619(1993))。相反，CaMV35S启动子在大多数细胞类型中是活性的(Medberry等人，植物细胞，4，185(1992)；Medberry和Olszewski，植物杂志，3，619(1993))。另外，与重复的CaMV35S启动子相比，CoYMV启动子在烟草悬浮细胞中有30％活性，并且在玉米悬浮细胞中有25％活性(Medberry等人，植物细胞，4，185(1992))。

含有与GUS基因连接的RTBV启动子的转基因水稻显示了强的韧皮特异的启动子活性。这与这一启动子在水稻原生质体中的表达一致。但是，RTBV启动子在玉米原生质体中只显示了弱的活性(Bhattacharyya-Pakrasi等人，植物杂志，4，71(1993)；Yin等人，植物杂志，7，969(1995))。相反，对应的CaMV启动子在原生质体中，和在转基因植物的差不多所有组织中显示了强启动子活性(Hohn和Futterer综述，Curr.Opin.Genet.Dev.2，90(1992))。

所以，需要的是高表达的组成型启动子，以在可育的转基因单子叶和双子叶植物中表达转化基因。

本发明提供了一种分离和纯化的DNA分子，它含有预选定的DNA区段，该预选定DNA区段含有一种甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子，或其生物活性亚单位，它在单子叶和双子叶植物，植物组织，植物部分或植物细胞中赋予可操纵连接的预选定DNA区段的组成型高水平表达。虽然ScBV的基因组核苷酸序列是已知的(Bouhida等人，病毒遗传学杂志，74，1(1993))，即使在ScBV基因组与密切相关的病毒，如CoYMV和RTBV的启动子序列进行核苷酸序列比较后，对于基因组长度病毒RNA的启动子的定位仍然没有明确。令人意外的是，不象对CoMYV和RTBV启动子观察到的强的组织特异表达，ScBV启动子在许多细胞类型中是强的和组成型的启动子。本发明的优选的实施方案是含有ScBV启动子的预选定DNA区段，该启动子含有SEQ ID NO：3，即对应于ScBV基因组的核苷酸位置5999-7420的预选定DNA区段。如下文所述，ScBV启动子在A.sativa和A.thaliana中赋予组成型和微管基因表达。所以，ScBV启动子可以用于在单子叶和双子叶植物中的组成型或组织特异性植物和非植物基因表达。例如，ScBV启动子可以连接给予庄稼抵抗在茎攻击庄稼禾本科植物的害虫例如携带大麦黄矮病毒的蚜虫的抗性的基因，或给予双子叶植物宿主组织特异抗性的基因，其中，致病原例如大豆孢囊线虫靶击诸如根的器官。

本文所用的“ScBV_i包括任何能够系统地感染Saccharum或相关属的非包被的，杆状的，含有DNA的badnavirus。Lockhart和Olszewski在病毒学百科全书中，Webster和Granoff编辑，学术出版社，纽约，NY(1994)中叙述了badnaviruses的其它区别性的特征。

本文所用的术语“ScBV启动子”是指一种核苷酸序列，当该序列与编码蛋白质，RNA转录物，或其混合物的预选定DNA区段可操纵地连接时，导致连接的预选定DNA区段，即编码的RNA和/或蛋白质的表达。优选的ScBV启动子与SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5至少具有60％，优选地至少约80％，更优选地至少约90％，和甚至更优选地至少约95％的核苷酸同一性。本发明的另一个优选的实施方案是含有启动RNA转录的最小数目的邻接核苷酸的ScBV启动子。

本文所使用的“生物活性的”指具有至少约0.1％，优选地至少约10％，和更优选地至少约25％，的含有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的ScBV启动子的活性。通过本领域已知的方法可以确定启动子的活性。例如，参见Medberry等人，植物细胞，4，185(1992)；Medberry等人，植物杂志，3，619(1993)；Sambrook等人，在分子克隆：实验室手册(1989)；McPherson等人，美国专利号5,164,316。

本发明还提供了一种表达盒，包括一种含有在宿主细胞中具有功能的SCBV启动子的第一个预选定的DNA片段，它与编码一种蛋白质、RNA转录物、或它们的联合物的第二个预选定的DNA片段可操纵连接。优选的宿主细胞是植物细胞，例如单子叶或双子叶植物细胞。本发明的另一个优选的实施方案是含有可操纵地连接可选择标记基因的ScBV启动子的表达盒。本发明的另一个优选的实施方案是含有包括SEQ IDNO：3的ScBV启动子的表达盒。

本发明也提供了从转化植物细胞选择稳定遗传转化体的方法和从所述的转化的植物细胞生产可育的转基因植物的方法。生产转化的植物细胞的方法包括在可再生植物细胞中导入含有第一个预选定的DNA区段的重组DNA区段，以生产转化细胞，第一个预选定的DNA区段含有可操纵地连接第二个预选定DNA区段的ScBV启动子。然后，鉴定或选择转化细胞系。的转化方法的例子包括利用微粒轰击以便在再生单子叶植物细胞中导入可操纵地连接ScBV启动子的编码在表现型上可观察或可检测的特性的预选定DNA区段。本发明的优选的实施方案是转化细胞中的重组DNA区段的表达给予转化细胞表现型特征如除草剂或抗生素抗性的方法。

如本文所用，术语“重组DNA区段”指已经从任何适当的组织来源衍生或分离和从与其它的细胞成分如核酸或蛋白质的结合物分离的核酸，即DNA。随后在体外可以化学地改变该DNA，使它的序列不是天然存在的，或对应于其定位不同于在没有转化外源DNA的基因组中的定位的天然存在的序列，使它们可以被测序，复制和/或表达。

优选的分离的重组DNA区段包括一个第一预选的DNA片段，该第一预选的DNA片段含有一种在植物细胞中具有功能的ScBV启动子，它与第二预选的DNA片段可操纵连接，该第二预选的DNA片段含有一种可选择标记基因。另一个优选的分离的重组DNA区段包括对应于已经存在于植物基因组的基因，或通常不存在于植物基因组的基因的第二个预选定DNA区段，它给予植物农业上有用的表现型例如昆虫抗性。如果预选定DNA区段通常存在于植物基因组中，它可能不表达或不高度表达。所以，导入预选定的DNA区段以改变植物细胞中预选定的DNA区段编码的蛋白质或RNA转录物的表达。

本发明也提供了生产可育转基因植物的方法。该方法包括在可再生植物细胞中导入含有第一个预选定DNA区段的重组DNA区段以生产可再生转化细胞，该第一个预选定DNA区段含有可操纵地连接第二个预选定的DNA区段的ScBV启动子。选择或鉴定转化细胞的群体，并且从中再生可育的转基因植物。通过所述转基因植物的完整的有性过程将重组的DNA区段转移到它的子代，使子代植物表达这一DNA区段。所以，本发明也提供了转基因植物，和起源于其中的种子，其它植物部分，组织和子代植物。

本发明的转基因植物包括但不限于转基因T0或R0植物，即从转化植物细胞再生的第一个植物，转基因T1或R1植物，即第一代子代植物，和起源于它们的含有和表达重组DNA区段的更加后代的子代植物。微粒轰击可以用于在再生单子叶植物细胞中导入重组DNA区段，而农杆菌介导的DNA转移可以用于在可再生双子叶植物细胞中导入重组DNA。

本发明也提供了一种转化的单子叶植物或双子叶植物，它们的细胞含有一种重组的DNA区段，该区段含有一种第一预选的DNA片段，该第一预选的DNA片段含有一种与第二个预选定DNA区段有效连接的甘蔗杆状病毒启动子。在转化细胞中，第二个预选定的DNA区段的表达量不同于与转化细胞的区别仅限于缺乏该重组DNA区段的植物细胞中的表达量。在一些情况中，这样的细胞可以包括转化的，或转基因植物的相同部分的未转化的细胞。第二个预选定DNA区段的表达使转化植物或其部分从相应的未转化植物或其部分中鉴定出来。

通过转化植物的完整的正常的有性过程将重组DNA区段转移到下一代。

本发明也提供了包括从本文叙述的方法获得可育转基因植物子代的方法。

本文中，对于植物细胞，植物部分(包括种子)，植物组织或植物来说，术语“转基因的”或“转化的”是指含有通过“遗传工程”转化方法已经在植物细胞，植物部分，植物组织或植物的基因组中导入分离的，纯化的预选定DNA区段的植物细胞，植物部分，植物组织或植物。即，转基因植物细胞，植物部分，植物组织或植物的基因组增加了至少一种预选定的DNA片段。术语“野生型”，“天然”或“非转基因”指未转化的植物细胞，植物部分，植物组织或植物，即没有通过预选定的DNA区段的存在而被改变基因组的植物细胞，植物部分，植物组织或植物。

植物分子生物学领域的普通技术人员可以获得的各种方法中的任何一种均可进行本发明的植物的转化。这些方法包括但不限于微粒轰击，微注射，原生质体或含有部分细胞壁的细胞的电穿孔，碳化硅纤维介导的DNA转移和农杆菌介导的DNA转移。用于实施本发明的植物包括但不限于，燕麦，小麦，大豆，玉米，烟草，水稻，大麦，土豆，西红柿，莴笋，油菜，棉花，亚麻，甜菜，高粱，向日葵，苜蓿，小米和黑麦。

附图的简要说明

图1描述了甘蔗杆状病毒的推测的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2描述了甘蔗杆状病毒的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3描述了含有用于植物转化的ScBV启动子的表达盒。

图4描述了(A)用于测试A.sativa中ScBV启动子活性的构建体的图谱。将得到的含有ScBV盒1，2或3的pMON755i衍生物分别命名为pScBV-1，pScBV-2，或pScBV-3；和(B)用于测试A.thaliana中的ScBV-3盒启动子活性的双重载体中的报道基因区的图谱。在pOCA101的SalI和XbaI位点中克隆了ScBV-3盒。克隆的步骤导致除去了SpeI/StuI位点和SalI/XhoI位点。

图5检测GUS活性的A.sativa和A.thaliana组织染色：(A)A.sativa花药；(B)A.sativa子房；(C)A.thaliana花器官；(D)A.sativa小穗；(E)A.sativa茎；(F)A.sativa叶子；(G)A.thaliana叶子。

本发明的详细说明

在植物中导入外源基因(转化基因)以便提供含有改良的农业特性的可育转基因植物对于农业在世界范围内的长期改良和扩展具有潜力。本发明提供转化基因的组成型和强表达，例如编码在植物中产生改变的农业或生理特性的物质。这样的起源于此的转基因植物和种子可以有性地转移这一特性到它们的子代。转基因植物的特性的例子包括增强的抗逆性，昆虫抗性，疾病抗性(例如，细菌，病毒和真菌)，提高的产量，提高的营养值，和提高的谷粒组成或质量。

为了在植物，植物细胞，植物组织或植物部分中提供组成型和强的转化基因的表达，例如含有SEQ ID NO：3的甘蔗杆状病毒启动子可操纵地连接特定的转基因，即预选定的DNA区段，并且导入可再生的植物细胞中。得到的再生转基因植物以高的和均一的水平，优选地在转化植物的全部组织和细胞中表达由预选定的DNA区段编码的蛋白质或RNA转录物。优选的ScBV启动子序列定位于ScBV基因组(SEQ ID NO：2)的核苷酸5999和7420(SEQ ID NO：3)之间。优选地，5’非翻译引导序列与启动子偶联。引导序列可以是来自ScBV基因组本身或可以不是来自ScBV，例如，玉米乙醇脱氢酶第一个内含子，和来自矮牵牛HSP70(Winter等人，分子遗传学，211，315(1988)；大豆HSP17.9(Raschke等人，分子生物学杂志，199，549(1988)；或玉米HSP70(Rochester等人，EMBO杂志，5，541(1986))的5’非翻译引导序列。

1.受体细胞

本发明使用了易于转化，并且随后易于再生成稳定的可育植物的受体。对于单子叶植物的转化，例如，可以利用不成熟的胚，分生组织，配子组织，胚发生悬浮培养物或胚发生愈伤组织作为用于本发明的实践的受体细胞的来源。燕麦的转化的优选的受体细胞是从不成熟的胚起源的燕麦愈伤组织培养物。为了提供这样的受体燕麦细胞的培养物，将燕麦的不成熟的胚去除外壳并灭菌。将这种胚在液体培养基中过夜温浴，然后切出胚，并将胚麟一侧朝下放置于固体培养基产生愈伤组织。产生愈伤组织培养基的优选的固体培养基是MS2D(参见，Torbert等人，植物细胞报道，14，635(1995))。

对于双子叶植物转化，可以利用器官和组织培养物可被用作受体细胞。所以，双子叶植物的组织，例如，叶子，种子和根可以提供用于实施本发明的受体细胞的来源。

优选在固体支持物上生长培养的敏感受体细胞。以培养基的形式提供培养物的营养物质，并且控制培养物的环境条件。支持再生植物培养物的生长的培养基和环境条件是本领域已知的。

II.DNA序列

事实上，可以将任何DNA成分投送到受体植物细胞以最终产生本发明的可育转基因植物。选择的用于细胞导入的DNA区段或基因通常编码一种蛋白质并且可以在得到的转化细胞中表达，以产生可筛选或可选择的特性和/或给予再生植物改良的表型。选择的用于细胞导入的DNA区段或基因也可以编码反义RNA，即在未转化的植物细胞中表达的预定的RNA分子，或其部分的互补物。反义RNA的转录抑制了互补的RNA，例如，编码不需要的特性的RNA。所以，可以利用以载体和质粒形式、或线状DNA片段、在某些情况下仅含有有待在植物中表达的DNA元件的预选择的DNA片段。但是，这并不总是这样的，本发明也包括掺入非表达转化基因的转基因植物。在Weising等人(Ann.Rev.Genet.22，421(1988))，和Lundquist等人(美国专利号5,484,956)(全部引入本文作为参考)的表1，2和3中提供了举证的DNA序列。

在一些实施方案中，人们可能希望在植物转化中利用能复制的病毒载体，如可以用于作物转化的那些，以便将预选定的DNA区段转移进入植物。这样的载体包括例如小麦矮小病毒(WDV)“穿梭”载体，如pW1-11和PW1-GUS(Ugaki等人，核酸综述，19，391(1991))。这些载体能够在作物细胞以及大肠杆菌中自我复制，这样可以增强检测递送到转基因非作物植物细胞的DNA的敏感性。

复制载体也可以用于递送与来自可转座元件如Ac，Ds，或Mu的DNA序列侧接的基因，因为这些元件将促进需要的DNA的整合，并且因而增强稳定转化的频率。可转座元件也可以用于在细菌中导入缺乏选择和维持质粒载体所需要的元件的DNA片段，如抗生素抗性基因和DNA复制原点。

用于在植物细胞中导入的DNA包括起源于或分离于任何来源的DNA，随后可以对它们的结构，大小和/或功能进行表征，进行化学改变，并随后导入植物。从一个来源“分离”的这样的DNA的例子将是通过化学手段，例如通过利用限制性内切酶从所述的来源切出或除去的有用的DNA序列，能够对它进行进一步操作，例如通过聚合酶链式反应(PCR)分离或扩增，并且通过遗传工程的方法用于本发明。从限制酶消化物对给定的DNA片段的回收和分离可以利用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，并将其迁移率和已知分子量的标记DNA片段进行比较鉴定出需要的片段，切去含有需要的片段的凝胶部分，将DNA于凝胶分离。参见Lawn等人，核酸综述，9，6103(1981)，和Goeddel等人，核酸综述，8，4057(1980)。所以，DNA是“分离的”因为它不含有至少一种在天然状态下通常与该RNA或DNA相结合的污染的核酸，并且优选基本上不含有其它的哺乳动物的RNA或DNA。短语“不含有至少一种通常与之结合的污染的核酸”包括核酸被再导入源细胞或天然细胞中，但是在不同的染色体定位，或侧接源细胞中通常不存在的核酸序列的情况。

“衍生”于一种来源的DNA的例子是一种DNA序列或片段，它在给定的生物体中被认为是有用的片段，并且它是通过化学合成的基本上纯净的形式。所以，“重组或预选定的DNA”包括完全合成的DNA序列，半合成的DNA序列，从生物来源分离的DNA序列，和从RNA衍生的DNA序列，以及它们的混合物。

导入的DNA包括，但不限于，来自植物基因的DNA，非植物基因如那些来自细菌，酵母，动物或病毒的那些。另外，从给定的植物基因型分离预选定的DNA片段并且随后在同样的基因型中导入多拷贝预选定的DNA区段，例如增强给定的基因产物的生产是在本发明的范围内的。导入的DNA可以包括修饰的基因，基因的部分，嵌合基因，包括来自同样或不同植物基因型的基因。将术语“嵌合基因”或“嵌合DNA”定义为至少含有两个DNA序列或区段的基因或DNA序列或区段，这两个DNA序列或区段在天然条件下不结合DNA，或该DNA序列或区段的连接和定位的方式通常不存在于未转化的植物的天然基因组中。

本发明中用于转化的导入的DNA可以是环状或线性，双链或单链。通常，DNA是嵌合DNA的形式，如质粒DNA，也可以含有由调节序列侧接的编码区域，该调节序列促进存在于得到的植物中的重组DNA的表达。

通常，导入的DNA是相对较小的，即，小于约30kb，以便使已知的随着DNA大小的增加而增强的对物理、化学或酶的降解的任何敏感度降低。如上文所述，由被导入植物基因组的DNA分子编码的蛋白质，RNA转录物或它们的混合物的数量最好事先确定，例如被导入的DNA可以形成从一个到约5-10个这样的产物。

A.制备表达盒

本发明的表达盒可以含有重组DNA分子，该DNA分子含有可操纵地连接在宿主细胞中，最好是植物细胞中具有功能的ScBV启动子的预选定DNA区段。表达盒本身最好是嵌合的，即，该表达盒含有来自至少两个不同种类的DNA，或含有来自相同种类的DNA，它是以“天然”或野生型种类中不存在的方式连接或结合。

1.本发明的含有ScBV启动子的DNA分子

启动子是调节基因表达的DNA区。通常在病毒以及原核生物和真核生物细胞的编码序列的上游的侧接DNA序列中发现了启动子区。启动子序列提供了下游基因序列的转录的调节，并且通常包括从约50到约2,000个核苷酸碱基对。启动子序列也可以含有调节序列如可以影响基因表达水平的增强子序列。一些分离的启动子序列可以提供异源DNA的基因表达，异源DNA是不同于天然或同源DNA的DNA。已知启动子序列是强的或弱的或可诱导的。强启动子提供了高水平的基因表达，而弱启动子提供了非常低水平的基因表达。可诱导启动子是提供应答外源加入试剂或对环境或发育的刺激的基因表达的启动和关闭。启动子也可以提供组织特异或发育的调节。对于异源DNA是强的启动子的分离的启动子序列是非常有用的，因为它提供了足够的基因表达的水平，从而可容易地检测和选择转化细胞，并且当需要时可提供高水平的基因表达。

本发明的DNA分子包括含有甘蔗杆状病毒(ScBV)启动子的预选定DNA区段。ScBV是一种拟逆转录病毒。通常，拟逆转录病毒具有引导RNA转录物进行转录的启动子，该RNA转录物的作用是病毒基因组复制的模板和作为mRNA。在环状双链病毒DNA复制的过程中，宿主tRNA的3’末端结合在ScBV转录物的5’末端附近，以便通过病毒编码的逆转录酶引导DNA合成。所以，通常，ScBV启动子在病毒基因组中定位于tRNA结合位点的5’端和第三个开放读码框架(ORF III)的5’一半的3’端。通过Bouhida等人(出处同上)叙述的方法，通过纯化病毒粒子和/或病毒DNA可以制备来自ScBV分离物的启动子，并且利用本领域已知的方法克隆启动子区，例如筛选连接ScBV病毒DNA片段与可筛选的标记基因产生的DNA表达文库。在替代方案中，利用简并引物，例如，BADNAT(Lockhart和Olszewski，培育香蕉和车前草用于昆虫和疾病的INIBAP会议，105-113(1994))和与病毒基因组的保守区例如，tRNA结合位点或编码病毒复制酶的DNA的引物可以从病毒DNA扩增ScBV启动子。

本发明的优选的实施方案是含有预选定DNA区段的分离的和纯化的DNA分子，该DNA区段含有包括SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或其核苷酸序列突变体的ScBV启动子(参见下面)。同样优选的是含有抑制或干扰ScBV启动子产生的RNA转录物，例如，具有高级别的二级结构或编码潜在的起始(ATG)密码子的RNA转录物的DNA排外序列的ScBV启动子。

通过Sambrook等人，在分子克隆：实验室手册，冷泉港(1989))中叙述的标准方法，预选定的DNA区段可以结合ScBV启动子。简要地说，利用限制酶可以将预选定的DNA区段亚克隆在启动子的下游以便保证DNA插入在与启动子相关的适当方向，使DNA可以表达。一旦预选定的DNA区段可操纵地连接启动子，可以将这样形成的表达盒亚克隆进质粒或其它载体。

2.本发明的DNA分子的变异体

通过本领域已知的各种方法可以制备编码含有SEQ ID NO：3，SEQID NO：4或SEQ ID NO：5的ScBV启动子的核苷酸序列变异体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在的核苷酸序列变异体的情况中，例如来自ScBV的其它分离物，从感染的植物物质分离)或通过低聚核苷酸介导的(位点特异)诱变制备，PCR诱变，和较早制备的ScBV启动子的变异体或非变异体的表达盒诱变。

低聚核苷酸介导的诱变是制备ScBV启动子的核苷酸替换变异体的优选的方法。这一技术如Adelman等人，DNA，2，183(1983)叙述是本领域已知的。简要地说，通过将编码需要的突变的低聚核苷酸与DNA模板杂交来改变ScBV启动子DNA，其中模板是含有未改变的或天然的ScBV启动子的DNA序列的质粒或噬菌体的单链形式。在杂交后，利用DNA聚合酶合成模板的整个第二个互补链，从而掺入低聚核苷酸引物，并且编码ScBV启动子中的选定的变化。

通常使用至少25个核苷酸长度的低聚核苷酸。最佳的低聚核苷酸具有12到15个与模板在编码突变的核苷酸的两侧完全互补的核苷酸。这保证了低聚核苷酸将适当地与单链DNA模板分子杂交。利用本领域已知的技术如Crea等人，美国科学院院刊75：5765(1978)所述可容易地合成低聚核苷酸。

通过那些起源于噬菌体M13载体的载体(可使用可通过商业途径获得的M13mp18和M13mp19载体)或如Viera等人，酶学方法，153，3(1987)所述含有单链噬菌体复制原点的那些载体，可以产生DNA模板。所以，可以在这些载体中的一个中插入突变的DNA以便产生单链模板。在Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(冷泉港实验室出版，N.Y1989)中叙述了单链模板的生产。

或者，利用标准技术通过变性双链质粒(或其它)DNA可以产生单链DNA模板。

为了改变天然DNA序列，将低聚核苷酸在适当的杂交条件下与单链模板杂交。然后加入DNA聚合酶，通常的DNA聚合酶I的Klenow片段以便利用低聚核苷酸作为合成的引物合成模板的互补链。这样形成了杂合双链分子，DNA的一个链编码ScBV启动子的突变形式，并且其它链(原始模板)编码天然的，未改变的ScBV启动子的序列。然后，在适当的宿主细胞，通常原核生物如大肠杆菌JM101中转化该杂合双螺旋分子。在细胞生长后，将它们涂布在琼脂糖平板上，并且利用32磷酸放射性标记的低聚核苷酸引物筛选，鉴定出含有突变DNA的细菌克隆。然后除去突变区，并将其放置于适当的载体进行蛋白质的生产，通常使用这种类型的表达载体转化适当的宿主。

可以对上述的方法进行修改，以产生同源双链分子，其中质粒的两条链含有突变。对该方法的修改如下：将单链低聚核苷酸与如上所述的单链模板退火。三个脱氧核糖核苷酸，脱氧核糖腺苷(dATP)，脱氧核糖鸟苷(dGTP)，和脱氧核糖胸苷(dTTP)的混合物与修饰的硫代脱氧胞苷称为(dCTP-(aS)(可以从Amersham公司得到)组合。在模板低聚核苷酸混合物中加入这一混合物。在这一混合物中加入DNA聚合酶后，产生了与模板除了突变的碱基以外相同的DNA链。另外，这一新的DNA链将含有d(CTP-(aS)而不是dCTP，其作用是保护它不受限制性内切酶的消化。

在利用适当的限制性酶对该双链异源双链的模板链产生缺口后，利用ExoIII核酸酶或另一个适当的核酸酶，在含有待诱变的位点的区域之后消化模板链。然后，终止反应，留下只是部分单链的分子。然后，在存在所有四个脱氧核糖核苷酸三磷酸，ATP和DNA连接酶时，利用DNA聚合酶形成完全的双链DNA同源双链。然后，可以将这一同源双链分子转化进入适当的宿主细胞如大肠杆菌JM101。

本发明的实施方案包括含有预选定的DNA区段的分离的和纯化的DNA分子，该预选定DNA区段含有包括SEQ ID NO：3，或没有减少启动子的生物学活性的SEQ ID NO：3的核苷酸序列的变异体的ScBV启动子。

3.优选的预选定DNA区段

本发明的优选的实施方案提供了当在植物中从ScBV启动子表达预选定的DNA区段时，在可育植物中导入预选定DNA区段给予植物需要的农业特性的方法。例如，在Lundquist等人(美国专利号，5,484,956)，Lundquist等人(美国专利号，5,508,468)，Dobres(国际申请PCT/US95/11231)和通过K.Weising等人(Ann，.Rev.Genet.22，421(1988)，参见表1，2和3)，所有引入本文作为参考中公开了这样的DNA区段或“基因”。但是，本发明没有限制编码需要的农业特性的预选定DNA区段范围，因为许多其它编码给予植物需要的特征的蛋白质或RNA转录物的预选定DNA区段是在本发明的范围内的。

预选定DNA区段编码的优选的农业特性包括但不限于，昆虫抗性或耐性，除草剂抗性或耐性，疾病抗性或耐性(例如对病毒或真菌致病原的抗性)，压力耐性(增强的盐耐受性)，增强的食物含量或增加的产量。例如，遗传研究已经表明，对于抵抗特别植物致病原感染的植物，植物必须具有与存在于致病原基因组中的单无毒(avr)基因直接或间接反应的抗性基因(R)。所以，在缺乏R基因的植物中导入含有R基因的预选定DNA区段可以给予植物表达对应的avr基因的致病原的抗性。

通过在植物中导入编码病理相关(PR)的蛋白质的预选定DNA区段可以获得增强的真菌感染的抗性。PR蛋白质是谷类应答一些致病原真菌的感染合成的蛋白质(Scott，Australasian Plant Path，23，154(1994))。

通过在植物中导入编码病毒包衣蛋白质的预选定DNA区段可以获得增强的病毒感染的抗性。例如，Nelson等人(生物/技术。6，403(1988))公开了在西红柿植物中烟草花叶病毒(TMV)的病毒给予植物对TMV和对西红柿花叶病毒(ToMV)，与TMV相关的病毒的抗性。Clark等人(国际申请PCT/EP92/03001)公开了当与病毒接触时在玉米中表达玉米矮化花叶病毒包衣蛋白质导致了展示减弱的疾病症状。

Vaeck等人(自然，328，33(1987))公开了在烟草中Bacillusthurigenesis(Bt)内毒素基因的表达给予那些植物对昆虫感染更大的耐性。Lundquist等人(美国专利号5484,956)公开了编码Bt内毒素的基因的表达可以给予转基因玉米的昆虫抗性。

另外，可以想象在植物中可以导入不止一个预选定DNA区段。例如，在可再生植物细胞中可以导入含有可选择标记基因(参见下面)和给予特定的病毒如大麦黄矮病毒抗性的基因的质粒。

4.在表达盒中的可任意选择的序列

表达盒可以非强制性地含有其它DNA序列。

a.标记基因

为了提高鉴定转化体的能力，除了可表达预选定DNA区段外还具有可选择或可筛选标记基因。“标记基因”是给予表达标记基因的细胞明显不同的表现型，并且所以允许这样的转化细胞区别于没有标记的细胞的基因。根据是否标记给予可通过化学手段“选择”即，通过利用选择试剂(如除草剂，抗生素，或诸如此类)的特性，或是否它可简单地通过观察或测试即通过“筛选”(例如，β-葡萄糖苷酶)鉴定特征，这样的基因可以编码可选择或可筛选的标记。当然，许多适当标记基因的例子是本领域已知的，并且可以用于本发明的实践中。

包括在可选择或可筛选标记基因的术语中的也有编码其分泌可以检测为鉴定或选择转化细胞的手段的“可分泌标记”的基因。例子包括编码可以通过抗体相互反应鉴定的可分泌抗原，或甚至可以通过它们的催化活性检测的可分泌酶的标记。可分泌蛋白质有许多类别，包括，小的，例如通过ELISA可检测的可扩散蛋白质，在细胞外溶液中可检测的小的活性酶(例如，α-淀粉酶，β-内酰胺酶，膦丝菌素，乙酰转移酶)；和插入或陷入细胞壁的蛋白质(例如，包括引导序列的蛋白质如在扩展的表达单位或烟草PR-S中发现的)。

本发明公开的元件通过使用特定的标记基因进行详细举证，但是在本公开物中，除了下面阐述的一个，本领域的技术人员将明了许多其它的可能的可选择和/或可筛选的标记基因。所以，能够理解的是下面的讨论是例证而不是详尽的说明。在本领域已知的本文公开的技术和常用的重组技术中，本发明给予在受体细胞中导入任何基因，包括标记基因以便生成转化的单子叶植物的可能性。

1.可选择标记

用于本发明的关系中的可能的可选择标记包括但不限于，编码卡那霉素抗性并且可以利用卡那霉素G418和诸如此类选择的neo基因(Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.199，183(1985))；编码巴龙霉素抗性的nptII基因；编码潮霉素B抗性的hyg基因；编码bialapho抗性的bar基因；编码改变的EPSP合成酶蛋白质(Hinchee等人，生物技术，6，915(1988))所以给予glyphosate抗性的基因；给予bromoxynil抗性(Stalker等人，科学，242，419(1988))的腈水解酶基因如来自Klebsiella ozaenae的腈水解酶基因；给予咪唑啉，磺酰脲类，或其它ALS抑制化学物(欧洲专利申请，154,204，1985)的突变体乙酰乳酸合成酶基因(ALS)；氨甲喋呤抗性DHFR基因(Thillet等人，生物化学杂志，263，12500(1988))；给予除草剂茅草枯抗性的茅草枯脱卤酶基因；或给予5-甲基色氨酸抗性的突变的邻氨基苯甲酸合成酶基因。当利用突变EPSP合成酶基因时，通过掺入适当的叶绿体转移肽，CTP可以明了其它优点(欧洲专利申请，0,218,571，1987)。同时参见Lundquist等人的表1(美国专利号，5,484,956)。

能够用于选择转化体的可选择标记基因的说明性实施方案是编码膦丝菌素乙酰转移酶，如bar基因(参见Somers等人，出处同上，(1992))的酶的基因。膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)在除草剂bialaphos，膦丝菌素(PPT)中失活活性成分。PPT抑制谷氨酸合成酶(Murakami等人，Mol.Gen.Genet.205，42(1986)；Twell等人，植物生理学，91，1270(1989))引起氨的快速积累和细胞死亡。

2.可筛选标记

可以利用的可筛选标记包括但不限于编码各种色原底物是已知的酶的β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)；编码在植物组织中调节花青苷色素(红色)的生产的产物(Dellaporta等人，在染色体结构和功能，263-282(1988))；编码各种色原底物已知的酶的β内酰胺酶基因(Sutcliffe，PNASUSA，75，3737(1978))；编码可以转化色原儿茶酚的儿茶酚过氧化物酶的xylE基因(Zukowsky等人，PNSA USA，80，1101(1983))；α-淀粉酶基因(Ikuta等人，生物技术，8，241(1990))；编码能够氧化酪氨酸成DOPA和依次浓缩形成容易检测的化合物黑素的多巴醌的酶的酪氨酸酶基因(Katz等人，微生物学遗传杂志，129，2703(1983))；编码存在色原底物的酶的β-半乳糖苷酶基因；允许生物荧光检测的荧光素酶(lux)基因(Ow等人，科学，234，856(1986))；或甚至可以用于钙敏感生物荧光检测的水母发光蛋白基因(Prasher等人，Biochem.Biophys，Res.Comm.126，1259(1985))，或绿荧光蛋白质基因(Niedz等人，植物细胞报道，14，403(1995))。

可用于本发明的其它可筛选标记是lux基因编码的火荧光酶。利用例如，X射线胶片，闪烁计数，荧光光谱学，低光摄像机，光子计数照相机或多孔荧光计可以检测转化细胞中lux基因的存在。也可以想象可以开发这一系统用于生物荧光的群体筛选，如在组织培养平板上，甚至筛选整个植物。

b.其它序列

转录增强子或增强子的增倍可以用于从特定的启动子增强表达。这样的增强子的例子包括但不限于来自CaMV35S启动子和章鱼氨酸合成酶基因的元件(Last等人，美国专利号，5,290,924，1994年3月1日公开)。建议当用于植物转化时，利用增强子元件如ocs元件，特定的多拷贝元件，将是增强从邻接启动子的转录。

由于在转录起始位点或编码序列的起始位点即未翻译的引导序列之间插入的DNA序列可以影响基因表达，也可以利用特定的引导序列。优选的引导序列包括含有选择指导附着基因的最佳表达的序列的那些，即包括可以增强或维持mRNA稳定性和预防不恰当的翻译的起始的优选的同感引导序列(Joshi，核酸综述，15，6643(1987))。这样的序列是本领域技术人员已知的。但是，一些引导序列，例如RTBV的引导序列，具有预期降低mRNA稳定性和/或降低mRNA的翻译的高度的次级结构。所以，不具有高度次级结构或具有不抑制mRNA稳定性和/或降低翻译的高度次级结构的引导序列，或起源于在植物中高度表达的基因的引导序列将是最优选的。

当需要时，也可以包括调节元件如Adh内含子1(Callis等人，基因发展，1，1183(1987))，蔗糖合成酶内含子(Vasil等人，植物生理学，91，5175(1989))或TMVΩ元件(Gallie等人，植物细胞，1，301(1989))。其它用于本发明的实践的这样的调节元件是本领域技术人员已知的。

另外，可以构建表达盒，并且用于将预选定的DNA区段的基因产物靶击到植物细胞内的细胞内部分，或指导蛋白质到细胞外环境。通常通过连接编码转移或信号肽序列的DNA序列与预选定的DNA区段的编码序列可以完成。得到的转移或信号肽将运输蛋白质到特定的细胞内，或细胞外目的地，并且然后可以翻译后除去。转移或运输肽通过简化蛋白质运输通过细胞内膜，例如，液泡，泡囊，质体和线粒体膜起作用，而信号肽指导蛋白质通过细胞内膜。通过简化蛋白质运输进入细胞的内部或外部的部分，这些序列可以增强基因产物的积累。

可以指导预选定DNA区段编码的转移或信号肽到特定的细胞器，如叶绿体而不是细胞质。所以，表达盒可以进一步含有编码在ScBV启动子和预选定DNA区段之间可操纵地连接的叶绿体转移肽编码DNA序列(综述看质体靶击肽，参见HeiJne等人，当前生物化学杂志，180，535(1989)；Keegstra等人，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，40，471(1989))。例子有利用特异地靶击蛋白质到质体的rbcS(RuBISCO)转移肽。例如，参见Glassman等人，美国专利号，5,258,300。

在细胞内靶击DNA本身可能是有用的。例如，靶击导入的预选定DNA到核可能是有用的，因为这可以增强转化的频率。在核本身内，为了获得位点特异整合，靶击基因可能是有用的。例如，使通过转化导入的基因取代细胞内现存的基因将是有用的。

当将表达盒导入植物细胞中时，表达盒也可以非强制性地包括作为信号作用于终止转录和允许得到的mRNA多聚腺苷酸化的3’非翻译植物调节DNA序列。3’非翻译调节DNA序列优选地包括300到1,000核苷酸碱基对，并且含有植物转录和翻译终止序列。优选的3’元件起源于来自土壤农杆菌的胭脂碱合成酶基因(Bevan等人，核酸综述，11，369(1983))，T转录物的终止子起源于土壤农杆菌的章鱼氨酸合成酶基因，并且蛋白酶抑制剂I或II基因的3’末端起源于土豆和西红柿，虽然本领域已知的其它3’元件也可以利用。如酶学方法，153，292(1987)中所述可以获得3’未翻译调节序列，并且已经存在于从商业来源，如Clontech，Palo Alto，加里弗尼亚获得的质粒中。3’未翻译调节序列可以可操纵地连接预选定的DNA区段的3’末端。

可以将表达盒导入表达载体，如质粒中。质粒载体包括了在原核生物和真核生物细胞中容易选择扩增，转化表达盒的其它DNA序列，如pUC起源的载体，pSK起源的载体，pGEM起源的载体，pSP起源的载体，或pBS起源的载体。所以，其它DNA序列包括提供载体自我复制的复制原点，优选地编码抗生素或除草剂抗性的可选择标记基因，提供表达盒中编码的插入DNA序列或基因的多倍位点的多克隆位点，和增强原核生物和真核生物细胞转化的序列。

用于植物和原核生物细胞中表达的另一个载体是如载体pGA582举证的双重Ti质粒(正如Schilperoort等人，美国专利号4,940,838，1990年7月10日公开)。An已经在前面鉴定了这一双重Ti质粒载体，并且从An博士处得到(参见酶学方法，153，292(1987))。在原核细菌如大肠杆菌和农杆菌中可以复制这一双重Ti载体。可以利用农杆菌质粒载体将表达盒转移到植物细胞。双重Ti载体优选地包括胭脂碱T DNA右和左边界，提供了有效地植物细胞转化，可选择标记基因，在T边界区的独特的多倍克隆位点，colE1复制原点和广谱宿主范围的复制子。可以利用携带本发明的表达盒的双重Ti载体转化原核生物和真核生物细胞，但优选地用于转化植物细胞。

III.DNA递送

然后，将表达盒或载体导入受体细胞产生转化细胞。为了在植物细胞中导入表达盒，确认接受DNA的植物细胞的出现频率是低的，另外，最有可能的是并非所有接受DNA区段或序列的受体细胞将产生DNA稳定整合进植物基因组和/或表达的转化细胞。一些可能只显示初始和短暂的基因表达。但是，真正来自任何植物的一些细胞都可以稳定地转化，并且这些细胞再生了转基因植物。

通过目前可得的方法，包括，但不限于原生质体转化，钨丝(Coffee等人，美国专利号5,302,523，1994年3月12日公开)，直接利用含有感染的质粒，感染的病毒的微生物，利用脂质体，利用机械或激光束微注射方法，利用整个染色体或染色体片段，电穿孔，碳化硅纤维，和微粒轰击，在植物细胞或组织，或原核生物或真核非植物细胞中可以递送预选定的DNA区段。本发明的优先实施方案完成了利用包括但不限于微粒轰击的特别有效的单子叶植物转化的方法，在单子叶细胞中导入预选定的DNA区段(参见Lundquist等人，美国专利号，5,538,877)。在双子叶(宽叶)植物如烟草，土豆和苜蓿中导入和表达外源基因已经表明利用土壤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的T-DNA是可能的(参见，例如，Umbeck，美国专利号5,004,863，和国际申请PCT/US93/02480)。利用重组DNA技术和细菌遗传学，可以将各种外源DNA插入到农杆菌的T-DNA中。在利用含有重组Ti质粒的细菌感染后，将外源DNA插入到宿主植物染色体，这样产生了遗传工程细胞，并且最终产生了遗传工程植物。第二条途径是导入作为基因载体的根诱导(Ri)质粒。

双子叶植物对农杆菌的转化是敏感的。最近，单子叶的水稻和玉米显示了也对农杆菌的转化敏感。但是，其它许多重要的单子叶农作物包括小麦，大麦，燕麦，高粱，小米，和黑麦还没有成功地利用农杆菌转化。但是，在将来，作为载体，Ti质粒可以在上述其它单子叶植物中进行操作。另外，利用Ti质粒作为模型系统，人工构建这些植物的转化载体是可能的。利用人工方法如微注射，或单子叶原生质体和含有然后可以整合进入植物核DNA的T区的细菌原生质球之间的融合也可以将Ti质粒导入单子叶植物。

双子叶植物的其它转化方法包括Horsch等人的叶盘方法(科学，227，1229(1985))和Fry等人采用的用于Brassica napus的(植物细胞报道，6，321(1987))。

IV.生产和鉴定稳定的转基因植物

在利用如上所述的任何方法将预选定的DNA区段递送到受体细胞后，通常本发明的下一步骤包括鉴定用于进一步培养和再生植物的转化细胞。如上所述，为了提高鉴定转化体的能力，可以利用如或除了可表达的预选定DNA区段的可选择或可筛选的标记基因。在这种情况中，然后，通常利用细胞与选择的试剂或各种试剂接触测试潜在的转化细胞群体，或者将可以筛选细胞的需要的标记基因特征。

A.选择

鉴定转化细胞的方法的例证实施方案包括将目标培养物与选择的试剂，如代谢抑制剂，抗生素，除草剂或如上所述的诸如此类接触。在培养中，已经转化和已经稳定整合给予利用的选择试剂抗性的标记基因的细胞将生长和分裂。敏感细胞将不能经受进一步的培养。

还可以看到，可筛选和可选择标记的联合将可用于转化细胞的鉴定。在一些细胞或组织类型中，选择试剂如抗生素卡那霉素或G418可能不提供足够的选择性杀死以便明显地鉴定转化细胞，或引起转化体和非转化体的真正非选择性抑制，从而导致选择技术失败。因此，建议利用生长抑制化合物，如抗生素，浓度低于导致100％抑制的选择，接着筛选表达可筛选的标记基因，如gus(β-葡糖醛酸酶)或lux(荧光酶)的生长组织将允许人们从经受不住单独的选择的细胞或组织类型恢复转化体。所以，选择和筛选的联合可以在各种细胞和组织类型鉴定转化体。

B.再生和种子生产

在支持植物再生的培养基中可以培养接触选择试剂中生存的细胞，或在筛选测试中得分阳性的细胞。然后允许选择或筛选鉴定并且在支持再生的适当培养基中培养的转化细胞以便再生成成熟的植物。在植物已经达到茎和根发育时期，可以将它们转移到温室进一步生长和测试。

然后，从鉴定为表达预选定的DNA区段的细胞系获得成熟植物。如果可能，再生植物是自花授粉的。另外，将从再生植物获得的花粉杂交播种到具有重要农业植物表现型的生长植物上。在一些情况中，利用来自这些基因型的植物的花粉对再生植物授粉。首先评估特征的分离，再评估产生的子代遗传性地鉴定这一特征。如果将商业利用这些特征，在组织培养中选定的特征在植物中的遗传率和表达是特别重要的。

为了在其它植物的基因组中渐渐掺入预选定的DNA区段，再生植物可以重复地与其它植物基因型杂交。这一过程称为回交转换。当为了生产与再现亲本除了存在导入的预选定DNA区段基本等基因的回交过程的产物，已经完成了再现亲本的足够次数的杂交时，为了生产含有预选定的DNA区段的纯合回交转换植物，至少自花授粉植物一次。这些植物的子代是真正的繁殖育种。

可取代地，在田间生长来自从转化的组织培养再生的转化植物的种子，并且自花授粉产生真正的育种植物。来自这些植物的子代成为真正的育种系。

一旦选择了最初的育种系，进行测试杂交，并且产生杂交种子。在田间，在几个不同的排列种植测试杂交品种和育种群体。一个评估方案是在许多不同的位置生长含有预选定的DNA区段的杂交植物的群体，并且在那些不同位置测量植物的表象。产生了田间信息以及植物健康，优势和生活力的其它量值。将关于这些杂种的特性以及非转化杂种的特性的情况进行了比较。

在鉴定了转基因植物的优越特性后，通过传统的育种技术改进了亲本选择并且产生了近交系。在商业测试和评估程序中测试了具有含有预选定DNA区段的一个或多个亲本的杂交植物并且记录特性。这一测试包括在广泛的地理区域进行的特性的评估，以及利用拥有的特征表明特性优势和因此的值。

表达预选定DNA区段的其它优点是生产杂种中亲本系的优越特性。

C.鉴定

为了证实再生植物中预选定DNA区段或“转基因”的存在，可以进行各种测试。这样的测试包括本领域技术人员已知的“分子生物学”测试，如Southern和Northern影印和PCR；“生物化学”测试，如利用免疫学手段(ELISA和Western影印)或酶功能检测蛋白质产物的存在；利用分析整个再生植物的表现型的植物部分测试如叶或根测试等等。

1.DNA整合，RNA表达和遗传特征

利用本领域技术人员已知的技术，从愈伤细胞系或任何植物部分可以分离基因组DNA以便确定预选定的DNA区段的存在。注意到，假定由于细胞中序列的重排或缺失，并不总存在完整的序列。

利用聚合酶链式反应(PCR)可以确定利用本发明的方法导入的DNA元件的存在。利用这一技术，扩增了DNA的分离的片段，并且利用凝胶电泳检测。这一类型的分析允许人们确定是否稳定的转化体中存在预选定的DNA区段，但并不证明在宿主细胞基因组中整合了导入的预选定DNA区段。另外，利用PCR技术确定是否转化体具有在基因组中的不同位点导入的外源基因，即是否转化体是独立起源的是可能的。注意到，利用PCR技术，克隆宿主基因组DNA邻接到导入的预选定DNA区段是可能的。

利用Southern杂交技术可以确定在宿主基因组中整合了DNA的阳性证据和转化体的独立特性。利用这一技术，可以鉴定导入宿主基因组和侧接宿主DNA序列的特异的DNA序列。所以，给定转化体的Southern杂交图谱的作用是鉴定该转化体的特征。另外，利用Southern杂交证实导入的预选定DNA区段以高分子量DNA存在，即证实导入的预选定DNA区段已经整合进入宿主细胞基因组。Southern杂交的技术提供了利用PCR获得的信息，例如，预选定DNA的存在，但也证实了在基因组中的稳定整合，并且鉴定了各个单独的转化体。

注意到，利用Southern杂交技术的修饰技术，点或片影印杂交的技术，可以获得源自PCR的相同信息，例如预选定的DNA区段的存在。

可以利用PCR和Southern杂交技术证实预选定DNA区段转移到子代了。在大多数情况中，给定转化体的鉴定性的Southern杂交图谱将在子代中作为一个或多个Mendelian基因分开(Spencer等人，植物分子生物学，18，201(1992)；Laursen等人，植物分子生物学，24，51(1994))表明了基因稳定地遗传了。

当利用从植物的任何部分分离的DNA进行DNA分析技术时，在特定的细胞或组织类型中只能表达RNA，并且所以必须制备从这些组织制备用于分析的RNA。PCR技术也可以用于检测和定量从导入的预选定DNA区段产生的RNA。在PCR的这一申请中，首先必须利用如逆转录酶逆转录RNA成DNA，然后利用常规PCR技术扩增DNA。在大多数情况中，PCR技术，当利用时，将不证实RNA产物的整合。通过Northern影印可以获得关于RNA产物的特性的其它信息。这一技术将证明RNA种类的存在，并且给出关于那个完整的RNA的信息。利用点或片影印Northern杂交也可以证明RNA种类的存在或缺乏。这些技术是Northern影印的修饰，并且将只证明RNA种类的存在或缺乏。

2.基因表达

当可以利用Southern影印和PCR检测争论的预选定DNA区段，它们没有提供关于是否预选定的DNA区段正在表达的信息。通过特定地鉴定导入的预选定DNA区段的蛋白质产物或评估它们的表达产生的表现型变化可以评估表达。

生产和鉴定特异的蛋白质的测试可以利用蛋白质的物理化学，结构，功能或其它特性。独特的物理化学或结构特性允许利用电泳方法，如天然或变性凝胶电泳或等电点聚焦，或利用色谱技术如离子交换或凝胶排除层析分离和鉴定蛋白质。可以利用特异的抗体通过格式如ELISA测试检测蛋白质的独特结构，例如检测nptII。可以利用各途径的联合获得甚至更高的特异性，如Western影印，其中利用抗体结合已经利用电泳技术分离的个别基因产物。可以利用其它技术绝对地证明需要的产物的特征。如在纯化之后利用氨基酸测序评估。虽然这些方法是最通常利用的。另外可以利用其它方法。

通过它们的功能性，特别是催化参与特异底物和产物的特异化学反应的酶的能力，也可以利用测试方法鉴定蛋白质的表达。这些反应可以接着提供和定量底物的损失，或物理或化学方法产生反应的产物。

通过评估它的表达的表现型结果经常可以确定基因产物的表达。这些测试也可以采取许多形式包括但不限于分析植物的化学组合物，形态学，或生理特性的变化。通过表达影响植物部分的色素的预选定DNA区段编码蛋白质可以改变和在表现型上或利用当表达预选定的DNA区段编码的蛋白质时，可以利用高效液相色谱或ELISA可以分析的增加的产物(例如nptII)可以检测化学组合物。

D.在其它植物种类中确立导入的DNA

为了在需要的系或种类中掺入预选定的DNA区段，然后可以在常规植物育种过程中利用转基因植物。

通常，如果在许多不同的杂种联合中可以导入预选定的DNA区段，本文产生的转化植物的商业价值将是最大的。根据成熟性，稳定性，和其它农业特性中的差异，农民通常种植几种杂种。同样，根据他或她的地理位置，农民必须选择杂种，因为由于这样的特性如成熟性，疾病，干旱和昆虫抗性中的不同，适于一个区域的杂种通常不适于另一区域。因为如此，必须在大量的亲本系中掺入基因，以致可以生产含有预选定DNA区段的许多杂种联合。

从一个系或种类到另一个之间转移基因需要的植物育种和技术是本领域技术人员已知的。所以，优选地以重组DNA的形式，在任何其它系或种类中导入预选定的DNA区段可以利用这些育种方法完成。

E.利用转基因植物

期望本文产生的转基因植物可用于各种商业和研究目的。可以产生转基因植物用于传统农业上，以便具有有益于种植者(例如，农业特性如水缺乏的抗性，昆虫抗性，除草剂抗性或增加的产量)，有益于从植物收获的谷粒的消费者(例如，在人食物或动物食物中增高的营养含量)的特性。在这样的用途中，通常在人或动物食物中为了它们的谷粒的用途生长植物。但是，植物的其它部分包括轴，外皮，蔬菜部分和诸如此类也可以具有用途，包括用作动物箐饲料部分或用于装饰目的。经常，为了工业用途提取作物的化学组成，可以产生已经增强或改变这样的成分的水平的转基因植物。

也可以发现转基因植物用于蛋白质或其它化合物的商业制造，其中从植物部分，种子和诸如此类提取或纯化需要的化合物。也可以培养，体外生长，或发酵来自这些植物的细胞或组织以便制造这样的分子。

转基因植物也可以用于商业育种程序，或可以与相关作物种类的植物杂交或育种。例如，通过原生质体的融合，预选定DNA区段的改进可以例如从一个植物种类的细胞转移到另一个植物种类的细胞。

在研究或育种中转基因植物可以具有许多用途，包括为了鉴定可以利用传统突变和选择后来产生的有益的突变，通过插入诱变产生新的突变植物。例子有导入可以用于生产遗传变异的编码转座元件的重组的DNA序列。本发明的方法也可以用于生产具有可以用于鉴定专有系或种类的独特的“署名序列”或其它标记序列。

通过下面的实施例将进一步叙述本发明。实施例I

植物转化的表达盒

为了制备含有ScBV启动子的表达盒，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增了三个ScBV基因组的区域。这些区域是开放读码框架的上游，推测的tRNA结合位点的上游，并且不包括AUG密码子。PCR中使用了BamHI线性化的pScBV-20作为模板(Bouhida等人，J.Gen.Virol.，74，1(1993))。表l显示了PCR中利用的引物对。扩增反应使ScBV的下列区域得到扩增：核苷酸位点5999到7205(利用引物SCBV-PRO FORW-5999，SEQ ID NO：6，引物SCBV-PRO REV-7205，SEQ ID NO：7扩增)，5999-7299(利用引物SCBV-PRO FORW-5999，SEQ ID NO：6和引物SCBV-PRO REV-7299，SEQ ID NO：8扩增)，和5999到7420(利用引物SCBV-PRO FOPW-5999；SEQ ID NO：6和引物SCBV-PROREV-7420，SEQ ID NO：9扩增)(根据Bouhida等人的编号系统，出处同上)。合成的SCBV-PRO FORW-5999包括PstI位点。合成的SCBV-PRO REV-7205，SCBV-PRO REV-7299和SCBV-PRO REV-7420包括StuI位点。在扩增后，用PstI和StuI消化PCR产物，然后凝胶纯化。

为了制备单子叶表达载体，将凝胶分离的片段连接到pMON755I(Medberry和Olszewski，植物杂志，3，619(1993))，该质粒已经利用PstI和StuI消化，除去了CaMV35S启动子片段。pMON755i是通过在GUS基因的5’端插入修饰的玉米乙醇脱氢酶第一个内含子区段从pMON755衍生的(Medberry等人，植物细胞，4，185(1992))。将得到的质粒命名为ScBV-1(5999-7205)，ScBV-2(5999-7299)和ScBV-3(5999-7420)。

表1引物名称序列5’-3’SCBV-PRO FORW 5999 CTCTAGCTGCAGGAAGTTGAAGACAAAAGAAG

(SEQ ID NO： 6)SCBV-PRO REV-7205 GTACGTAGGCCTCACTGAATGGGCCCAGTAC

(SEQ ID NO：7)SCBV-PRO REV-7299 TACGATAGGCCTTGGCAGACAAGGAATAAAG

(SEQ ID NO：8)SCBV-PRO REV-7420 GCACGAAGGCCTTGGTGAACTACCGATGATC

(SEQ ID NO：9)MAP-SCBV-GUS CAGGACGGACCATGGATATATCTCC

(SEQ ID NO： 10)

为了制备用于农杆菌介导的转化的表达载体，构建一种双重表达载体。利用PstI和StuI消化ScBV-3，将1.4kb的含有ScBV的片段连接到已经利用SpeI消化，利用Klenow片段填平了突出末端，然后利用PstI消化的pBluscript KS⁺(Stratagene，La Jolla，CA)。从得到的构建体，分离Xho-XbaI片段并且连接到已经利用SalI和XbaI消化的pOCA101。pOCA101是其中含有GUS基因的HindIII-EcoRI片段替代了多接头的pOCA28的衍生物(Medberry等人，核酸综述，18，5505(1990))。pOCA28(Olszewski等人，核酸综述，16，10765(1988))具有来自pHP45omega的Smr/Spcr基因(Prenti和Kritsch，基因，28，303(1984))，它取代了含有四环素抗性基因的BgIII/SmaI片段。

为了定位ScBV启动子的转录起始位点，在引物延伸反应和/或S1核酸酶反应中利用了标记引物或DNA片段或从ScBV启动子产生的RNA。表1显示了用于定位ScBV启动子的转录起始位点的引物(MAP-SCBV-GUS：SEQ ID NO：10)。实施例II利用ScBV启动子构建体转化单子叶植物(燕麦)

在玉米中的短暂表达分析(利用黑墨西哥甜细胞，“BMS”细胞)和燕麦悬浮培养显示ScBV-3具有最高水平的表达。具体地说，在BMC细胞中，ScBV-3具有的表达比ScBV-2或pScBV给予的表达产生约25-800倍更独立的生产GUS表达细胞的事件。

利用不成熟的燕麦胚(Avena sativa L.种类GP-1)启动愈伤组织。利用低倍显微镜肉眼选择易碎的胚愈伤组织(6.6×)并且在含有MS盐的MS2D培养基上亚培养2星期(Torbert等人，出处同上)。在如Vain等人描述的微粒轰击之前4小时(植物细胞报道，12，84(1993))，在含有0.2摩尔/升山梨醇和0.2摩尔/升的甘露醇作为等渗渗透的固体MS2D培养基上涂布来源于愈伤组织的组织。

通常，可以利用钨(1.1微米，M-17；Biorad实验室，Hercules，CA)或金(1.0微米，M-17；Biorad实验室，Herculis，CA)颗粒微粒轰击。将约60毫克干的钨或金颗粒放置于微管中的1毫升100％的乙醇中。高速旋转管子1-2分钟，或利用标准尖头在低功率下超声波处理30秒。旋转重复3次。然后将微管在10000rpm离心1分钟。除去上清液，加入1毫升无菌蒸馏水，再悬浮颗粒，离心或除去上清液。重复这一过程1次。然后在1毫升无菌蒸馏水中再悬浮颗粒。在旋转的同时，将足够4-8次轰炸的50微升在微管中等分。将钨或金等分试样储藏在-20℃。

在连续搅拌后，在单个的50微升颗粒等分试样中，以下面的顺序加入下面物质：5微升DNA(1微克/微升)，50微升，2.5摩尔/升CaCl₂和20微升0.1摩尔/升精胺(游离碱，组织培养级，西格玛化学公司)。旋转混合物3分钟，在10000rpm进行离心10秒，除去上清液。利用250微升100％的乙醇旋转洗涤DNA包衣颗粒，然后进行离心，除去上清液。然后在60微升100％乙醇中再悬浮颗粒。然后在大的运载器的中心加入5-10微升悬浮液。将悬浮液在低潮湿度和无振动环境中干燥1分钟。

将约800毫克组织放置于培养皿的中央。在制动平板下5厘米放置平板，根据制造商的说明，利用Biolistic^PDS-1000/He颗粒递送系统(BioRad实验室，Hercules，CA)利用pScBV-3和含有连接CaMV35S启动子的nptII植物可选择标记的质粒包衣的金颗粒轰炸组织(pH2.4，参见Torbert等人，出处同上)(0.6微克/轰炸)。

组织保留在等渗培养基(MS2D加0.4摩尔/升渗透剂)上过夜，并且转移到黑暗中20℃的MS2D保持培养基上7天。将转化组织转移到含有50毫克/升巴龙霉素，利用0.35％低EEOI型琼脂固体化的选择培养基(西格玛化学公司)，并且亚培养2星期(Torbert等人，出处同上)。在约6-8星期分离生长的菌落，并且使其再生长约4星期。在茎再生培养基(MS盐家盐酸硫氨素，20克/升蔗糖，2毫克/升NAA，0.2毫克/升BAP，50毫克/升巴龙霉素，pH5.8，利用0.35％低EEOI型琼脂固体化)中再生茎。在根再生培养基(MS盐加盐酸硫胺素，利用0.35％低EEO I型琼脂固体化)上再生根。然后将植物放置于土壤中，并且生长至成熟。

表2

组织	表达²的相对¹水平	具有可检测表达的行数
组织	表达²的相对¹水平	具有可检测表达的行数	叶	+	21·/23#(91.3％)
茎	+++	21/23(91.3％)	叶	+	21·/23#(91.3％)
茎	+++	21/23(91.3％)	花梗	++	20/23(86.9％)
叶轴	++	21/23(91.3％)	花梗	++	20/23(86.9％)
叶轴	++	21/23(91.3％)	颖苞	++	23/23(100％)
小穗轴	++	21/23(91.3％)	颖苞	++	23/23(100％)
小穗轴	++	21/23(91.3％)	托苞	+++	22/23(95.6％)
鞘膜	+++	22/23(95.6％)	托苞	+++	22/23(95.6％)
鞘膜	+++	22/23(95.6％)	花药	++	20/23(86.9％)
子房	+++	19/23(82.6％)	花药	++	20/23(86.9％)
子房	+++	19/23(82.6％)	成熟种子	+++	2/2(100％)

1可检测表达的相对水平，用(+)号表示：(+)，(++)，和(+++)分别对应于低-中等，中等-高，和高-非常高的相对的组织化学染色2基于23个稳定转化的独立系的ScBV启动子的一般化的表达方式·包括可检测表达的系的数目，#检测的系的数目*微管表达

在稳定转化的A.sativa组织中，在蔬菜器官中ScBV-3给予组成型GUS表达，最明显的是茎(图5E)。但是，在叶子中，ScBV给予几乎是，但不绝对地限制于微管组织的表达方式(图5F)。ScBV-3也在花器官如托苞，鞘膜和子房中组成型地GUS表达(图5D和图5B)。

筛选再生植物(T0代)的GUS活性。得到56个植物，在一些情况下，从同样的愈伤组织得到几个植物。将起源于相同的愈伤组织的植物定义为一个系。因为起源于相同的愈伤组织的植物可以潜在地表示为单独的事件，归结从单个愈伤组织恢复的植物的数据。从含有花器官和绿色蔬菜组织的植物手切下燕麦组织。

分析23个稳定转化的独立细胞系的GUS表达。在存在1∶5000(v/v)稀释度的去垢剂SilwetL-77(OSI Specialties，Charleston，WV)时，利用GUS组织化学染色缓冲液染色植物组织，并且进行抽真空20分钟。在室温染色组织8-48小时，脱色24小时，在70％乙醇中储藏用于分析。在解剖显微镜下评估GUS表达。表2显示了GUS分析的结果。在几乎所有的测试的A.sativa器官中检测GUS活性，在一个器官中含有GUS活性的系趋向于在所有测试的器官中具有活性。茎，托苞，鞘膜和子房具有最高的表达水平。另外，在测试的23个独立的系中，80％以上在叶子，茎，花梗，叶轴，颍片，小花轴，托苞，鞘膜，花药和子房中具有可检测的GUS表达水平。也如Torbert等人(出处同上)所述，利用NPTII ELISA测试(5’-3’，Boulder，CO)确定植物细胞，部分或组织中的NptII水平。在表达GUS的所有系中检测NptII。

从成熟的植物收集A.sativa小花(没有植物组织)。通过T0植物的自花授粉产生T1种子。将这些种子去壳，然后首先在95％的乙醇中浸泡，然后在2.5％的漂白剂和1-2滴Tween-20/100毫升浸泡5分钟灭菌，然后用无菌水洗涤3次。在缺乏激素的MS培养基上的品红盒中萌发种子，生长10-20天，转移到土壤中。在转移到土壤之前，对如上所述的T1植物的切下的根的GUS基因表达进行染色。进行分析A.sativa子代(T1)植物，和T1幼苗的GUS基因表达。

表3在A.sativaT1幼苗中GUS基因表达

组织表达²的相对¹水平含有可检测表达的系号
组织表达²的相对¹水平含有可检测表达的系号	叶子^& ++ 8^*/9^{#^}(88.9％)
根 ++ 4/9(44.4％)	叶子^& ++ 8^*/9^{#^}(88.9％)
根 ++ 4/9(44.4％)	胚乳 + 9/9(100％)

1表达的相对水平用+的个数表示：(+)，(++)，和(+++)对应于低—中等，中等—高，和高—非常高的组织化学染色。

2基于9个稳定转化的独立系的ScBV基因组区的一般化的表达类型。

*含有可检测的表达的系的数目/#检测的系的数目

&微管表达

^在T1代中得到来自9个系的幼苗

种子和T1植物显示了GUS活性，因此证明了GUS基因是可遗传的。表4显示了T1植物的GUS分析的结果。相对于T0植物，在大多数器官中T1中的表达水平似乎是减弱了(表2和表4)。这一结果表明表达在子代中减弱了。

表4.在成熟的A.sativa T1植物中GUS基因的表达

组织表达²的相对¹水平含有可检测表达的系号
组织表达²的相对¹水平含有可检测表达的系号	叶子^& + 5^*/7^{#^}(71.4％)
茎 ++ 5/7(71.4)	叶子^& + 5^*/7^{#^}(71.4％)
茎 ++ 5/7(71.4)	花梗 + 3/7(42.8％)
叶轴 + 3/7(42.8％)	花梗 + 3/7(42.8％)
叶轴 + 3/7(42.8％)	小花轴 + 6/7(85.7％)
颍片 ++ 7/7(100％)	小花轴 + 6/7(85.7％)
颍片 ++ 7/7(100％)	托苞 ++ 6/7(85.7％)
鞘膜 ++ 6/7(85.7％)	托苞 ++ 6/7(85.7％)
鞘膜 ++ 6/7(85.7％)	花药 ++ 3/7(42.8％)
子房 ++ 6/7(85.7％)	花药 ++ 3/7(42.8％)
子房 ++ 6/7(85.7％)	芒 - 0/0(0％)

1表达的相对水平用+的个数表示：(+)，(++)，和(+++)对应于低—中等，中等—高，和高—非常高的组织化学染色。2基于9个稳定转化的独立系的ScBV基因组区的一般化的表达类型。*含有可检测的表达的系的数目/#检测的系的数目&微管表达^9个T1系中的7个系的植物生长到成熟。

实施例III

利用ScBV启动子构建体转化双子叶植物(Arabidopsis)

利用基本上如van Hoof和Green，植物杂志，10，41591996)；Bechtold等人，C.rAcad.Sci.，316，1194(1993)所述的真空渗滤方法，将含有连接到GUS基因的ScBV启动子的表达载体转化进Arabidopsis thaliana(Columbia ecotype)中，对该方法的修改如下：在渗滤溶液中利用200微升/升的Silwet L-33，并且利用土壤农杆菌菌株C58C1(pMP90)作为表达载体的非真核宿主。

如Feldmann所述(在“Arabidopsis研究中的方法”(C.Koncz，N.H.Chua，和J.Schell，编辑，世界科学出版社，新加坡，271-289(1992)))，在含有卡那霉素的平板上播种来自进行真空渗滤方法(命名为T1种子)的植物的种子。将携带卡那霉素标记的基因的单个植物(T₁植物)转移到土壤中。如上文中对A.sativa组织的描述对这些植物组织进行GUA活性染色，只是对Silwet L-77去垢剂的稀释度为1∶10000(v/v)，并且将组织进行真空处理5分钟将染色的溶液真空渗滤到组织中。收集T₁植物(T₂植物)的种子，同样染色子代植物(T₂植物)的GUS活性。

表5和6显示了在T1和T2 A.thaliana植物中表达ScBV启动子的一般化类型。检测起源于7个渗滤植物的29个T1植物。将所有起源于单一渗滤植物的转化的幼苗归结为一个系。

在A.thaliana花中，表达方式大多数是微管的，在一些花中的雄蕊仍然展示了组成型的GUS基因表达(图5C)。当染色A.sativa的根时，在检测的44％的系中检测到了GUS表达，而对于A.thaliana根，在86％的检测的系中发现了组成型的GUS基因表达。

表5.在A.thaliana T1植物中的GUS基因的表达

组织表达²的相对¹水平含有可检测表达的系号
组织表达²的相对¹水平含有可检测表达的系号	玫瑰花型叶柄 +++ 4^*/7#(57％)
玫瑰花型叶子 ++ 7/7(100％)	玫瑰花型叶柄 +++ 4^*/7#(57％)
玫瑰花型叶子 ++ 7/7(100％)	花序的茎 +++ 3/7(43％)
花梗 ++ 4/7(57％)	花序的茎 +++ 3/7(43％)
花梗 ++ 4/7(57％)	花萼片& ++ 4/7(57％)

1表达的相对水平用+的个数表示：(+)，(++)，和(+++)对应于低—中等，中等—高，和高—非常高的组织化学染色。2基于7个稳定转化的独立系的ScBV基因组区的一般化的表达类型。*含有可检测的表达的系的数目/#检测的系的数目&微管表达

表6.在A.thaliana T1植物的GUS基因表达

组织表达²的相对¹水平含有可检测的表达的系号
组织表达²的相对¹水平含有可检测的表达的系号	玫瑰花型叶柄 +++ 7^*/7#(100％)
玫瑰花型叶子 +++ 7/7(100％)	玫瑰花型叶柄 +++ 7^*/7#(100％)
玫瑰花型叶子 +++ 7/7(100％)	茎上的叶 ++ 7/7(100％)
花序茎 ++ 7/7(100％)	茎上的叶 ++ 7/7(100％)
花序茎 ++ 7/7(100％)	根 +++ 6/7(86％)
花萼片^& +++ 7/7(100％)	根 +++ 6/7(86％)
花萼片^& +++ 7/7(100％)	长角^& +++ 6/6(100％)
种子^@ +++ 4/6(67％)	长角^& +++ 6/6(100％)

1表达的相对水平用+的个数表示：(+)，(++)，和(+++)对应于低—中等，中等—高，和高—非常高的组织化学染色。2基于7个稳定转化的独立系的ScBV基因组区的一般化的表达类型。* 含有可检测的表达的系的数目/#检测的系的数目& 微管表达@ T₃种子实施例IV在大豆细胞中ScBV启动子构建体的导入，转化R0植物的再生和子代生产

大豆外植体起源于从不成熟的种子的胚轴切下的分生组织。在转化之前，在含有高细胞分裂素的培养基中预温育分生组织外植体(Barwhale等人，植物学，176，473(1986))。利用1％水琼脂填充60毫米的培养皿的底部。将胚进行表面灭菌，并植入培养皿的琼脂中。

将一定量的1-3微米金小珠(Alfa化学公司)通过在0.02％聚赖氨酸中漂洗进行聚赖氨酸预包衣，并空气干燥。制备含有ScBV启动子序列的线性表达载体，例如含有ScBV启动子序列的线性表达载体，例如可操纵地连接预选定的DNA区段的SEQ ID NO：3。优选地，表达载体进一步含有标记基因，如neo基因(APT3’II)。在35毫克包衣的金小珠中加入水溶液中的225微克表达载体，然后顺序加入在N₂中干燥时形成精微沉淀的22微升10毫摩尔/升Na₂HPO₄和22微升10毫摩尔/升CaCl₂。通常，制备了每毫克金小珠1.0到0.001毫克DNA。然后，在100％乙醇中再悬浮干燥沉淀包衣的小珠，并沉淀在长11毫米宽9毫米的2.0微米塑料包衣的铝化聚酯薄膜片上。将包衣的小珠放置在聚酯薄膜承载片，最终密度为0.2毫克/厘米²。通常，以每平方厘米0.05-40毫克将小珠加载到承载片上。

应用500毫米汞柱的真空。通过电极从2微法的电容器产生一个24千伏的放电，加速大豆胚中的颗粒。从靶表面除去被轰击的胚，涂布在平板上以便产生器官。例如，参见Barwhale等人，植物学，176，473(1986))。

按照Barwhale等人改良的方法(出处同上)，在MS基本培养基上在暗中涂布外植体。在暗中温育1到2星期后，将组织转移到含有低水平的细胞分裂素的相同的基本培养基(1.7微摩尔)，以便促进茎延长。在0.5到1.0厘米高度时收获茎。在2-4个月每个外植体回收3到8个茎。

在茎达到0.5-1.0厘米高度后，将它们嫁接到萌发约10天的老大豆幼苗的根上。在嫁接之前，它们在1/2 MS培养基上硬化1星期。当获得足够的植物组织后立即测试组织中标记基因的存在。例如，如果将neo基因用作标记基因，在植物组织中测试APH3’II活性。

通过Southern印迹分析检测例如编码病毒包衣蛋白质的所必需的预选定DNA分子的存在。利用适当的限制酶消化来自植物组织的10微克基因组DNA。然后，酚：氯仿提取DNA，并利用乙酸铵和乙醇沉淀。在琼脂糖凝胶上通过电泳分级分离消化的DNA。利用对应于所必需的DNA分子的至少一部分的³²P标记探针。在洗涤滤纸后，通过放射自显影观察杂交的DNA片段。这样，植物显示了携带所必需的DNA分子。

将其组织已被证实具有标记基因的酶活性或Southern影印分析需要的DNA分子或标记基因是阳性的植物生长到成熟。自花授粉植物，回收种子。利用幼苗生长植物，测试植物的叶子的标记基因相关的酶活性，或通过Southern影印分析需要的DNA分子。实施例V

在烟草细胞中导入ScBV启动子构建体，再生转化的R0植物和产生子代

从表面灭菌的烟草叶子取直径约6毫米的烟草(Nicotiani tabacumvar.samsun)的叶子盘。将这些培养在MS104琼脂培养基上两天促进在受伤的表面形成部分细胞壁。然后，在含有具有可操纵地连接预选定DNA区段例如编码GUS的质粒和另一个编码卡那霉素抗性的表达盒和pMP90RK辅助质粒的土壤农杆菌细胞的培养物中将它们浸没。在Luria培养液中过夜生长28℃，温和振摇。从细菌悬浮液中除去细胞，影印干燥，如Horsch所述，在烟草细胞的“护士”培养基上放置的滤纸上上面朝下温育(体外，16，103(1980))。在2或3天后，将叶盘转移到含有500微克/毫升羧苄青霉素，没有护士培养基的MS培养基的培养皿上。

利用含有辅助质粒pMP90RK的土壤农杆菌细胞和含有包括NOS/NPTII/NOS卡那霉素抗性基因和可选择标记基因的T-DNA区的不同的植物转化载体，pMON505的土壤农杆菌细胞产生对照组织。

在转移到MS培养基上10天后，活性生长愈伤组织在对照和转化平板上似乎是在所有叶盘的周边。然后，利用Horsch等人所述的过程，从如上所述的转化的叶盘再生生产转化的烟草植物(科学，227，1229(1985))。获得的转化植物含有包括与β-葡糖醛酸酶基因融合的ScBV启动子的表达盒。

利用同样的方法获得含有与相同的预选定DNA区段即，GUS融合的CaMV35S启动子的转化的烟草。

利用组织学染色方法测试含有ScBV启动子或CaMV35S启动子驱动GUS基因的转化的植物以便确定转化细胞中GUS活性。将对利用ScBV/GUS/NOS转化的植物的这些测试的结果与对利用CaMV35S/GUS/NOS转化的植物进行相同的测试的结果比较。

含有ScBV/GUS/NOS和CaMV35S/GUS/NOS构建体的烟草植物的组织化学测试包括检测转化植物的植物器官和/或组织切片以便确定GUS活性。利用剃刀刀片徒手切片植物组织制备转化植物的组织或器官切片成小于0.5毫米厚度的切片。然后，将切片放置于过量的X-gluc溶液中以致完全覆盖切片。在切片上抽真空可以辅助X-gluc溶液渗透。利用合并25毫升0.2摩尔/升NaPO₄缓冲液pH7.9，24.0毫升dH₂O，0.25毫升0.1摩尔/升K₃[Fe(CN)₆]，0.25毫升0.1摩尔/升K₄[Fe(CN)₆]和0.5毫升1摩尔/升EDTA，pH7.0制备50毫升X-gluc溶液。在这一溶液中，加入来自Research Organics(Cleveland，Ohio)的50毫克X-gluc(5溴-4氯-3idilyl-β-葡糖苷酸)，搅拌直到溶解。然后，通过过滤优选地灭菌溶液。然后将X-gluc溶液中的切片放置于37℃2-4小时。小心防止溶液蒸发。在温育期后，利用磷酸缓冲液或蒸馏H₂O漂洗切片，利用解剖范围或化合物显微镜立即检测切片。如果存在来自色素的干扰，可以在FAA溶液(85毫升50％乙醇，5毫升冰乙酸和10毫升福尔马林)固定组织24小时。刚刚在染色之前，在染色溶液中加入偏亚硫酸氢钠到20毫摩尔/升可以缓和酚的问题。出现在测试植物切片的组织中的蓝色表明存在GUS活性的阳性测试。

在利用CaMV35S启动子或ScBV启动子驱动的β-葡糖醛酸酶基因转化的切片上进行组织学染色测试。由于在单个转基因植物中，在一些组织染色和在其它组织没有染色，对CaMV35S启动子驱动的GUS基因观察到的典型的染色图谱。但是，来自利用GUS基因驱动的ScBV启动子转化的植物的组织显示转化的植物展示了公平的，优选地比利用CaMV35S/GUS转化的植物中的组织观察到的更高的GUS表达水平，和更均一的整个组织和细胞的表达方式。整个切片占主要的蓝色说明了这一点。

当比较CaMV/GUS植物时，表达的分布和获得的许多高表达转基因植物显示ScBV启动子在组织分布和表达的均一性中占优势。含有转化植物的90％以上的ScBV/GUS显示了相当大的，优选地非常强的GUS表达，并且来自植物到植物和组织到组织的染色是均一的。在CaMV/GUS植物中，这一染色始终与含有ScBV的植物一样好。

为了提供ScBV启动子是强的和组成型表达的启动子的其它证据，在提取的叶子，花，茎和根中，利用Jefferson等人(EMBO J.6，3901(1987))的荧光测试测试含有构建体的转基因Nicotiana tabacum植物的GUS活性。在37℃进行温育15分钟。切出1克第四个节间叶，花，4厘米长茎切片或根。在液氮中冷冻提取选择的组织，利用研钵和研杵研磨，再悬浮于0.1摩尔/升K₃PO₄pH7.8，EDTA，10毫摩尔/升DT，0.8好摩尔/升PMSF，和5％甘油。在2毫摩尔/升4-甲基-umbelliferyl glucuromide进行荧光反应。利用Hoechst DNA荧光计(TKO100型)测量荧光。通过Bradford测试确定植物提取物的蛋白质浓度。

对分析的每种组织，任意地给出CaMV35S启动子的表达水平为“1”，然后确定ScBV启动子的相对表达水平。发现ScBV启动子获得的GUS表达比利用CaMV35S启动子获得的占优势。

本发明不限于所详细描述的内容，应当理解，可以对其进行许多变化和修饰而不脱离权利要求所限定的本发明的精神和范围。

序列表(1)总信息：(i)申请人：明尼苏达大学校董事会(ii)发明名称：甘蔗杆状病毒启动子(iii)序列数目：10(iv)通信地址：

(A)收信人：Schwegman，Lundberg，Woessner & Kluth，P.A.

(B)街道：P.O.Box 2938

(C)城市：Minneapolis

(D)州：MN

(E)国家：USA

(F)邮编：55402(V)计算机可读形式

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：DOS

(D)软件：FastSEQ Version 2.0(Vi)目前申请资料：

(A)申请号：PCT/IB97/01338

(B)申请日：1997年8月13日

(C)分类号：(Vii)在先申请资料：

(A)申请号：08/694869

(B)申请日：1996年8月9日(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：Woessner，Warren D

(B)登记号：30440

(C)案号：600.369WO1(ix)通讯号码：

(A)电话：612-373-6900

(B)传真：612-339-3061(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征

(A)长度：1871氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(Xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Thr Gln Arg Val Arg Gly Thr Gly Ser Ser Thr Ile Thr Glu Asp1 5 10 15Gly Ala Leu Leu Asp His Gln Ile Arg Asp Tyr Arg Arg Ala Gln His

20 25 30Ala Lys His Glu Ala Gln Arg Ile Ala Gly Gln Ala Leu Ala Phe Leu

35 40 45Arg Val Thr Ser Asp Asp Pro Arg Glu Lys Thr Leu Glu Met Leu Met

50 55 60Gln Pro Asp Val Glu Leu Thr Arg Ser Met Lys Lys Arg Ala Arg Ala65 70 75 80Phe Pro Ala Glu Val Leu Tyr Gly Pro Arg Ser Asp Asp Ile His His

85 90 95Lys Val Phe Gln Gly Ser Ser Ser Gln Asp Ile Leu Leu Ile Asp Asp

100 105 110Asn Gln Leu Asp Met Thr Phe Ile Lys Glu Glu Thr Phe Glu Gln Leu

115 120 125Glu Gln Ala Gly Leu Arg Tyr Ile His Pro Gly Ile Leu Ala Val Arg

130 135 140Ile Gln Pro Leu His Pro Asp Trp Ser Gly Lys Leu Val Phe Ile Val145 150 155 160Phe Arg Asp Ile Arg Asp Asn Pro Pro Arg Val Leu Gly Ala Met Glu

165 170 175Ile Asp Leu Ser Lys Gly Pro Gln Met Val Tyr Val Ile Asn Ser Phe

180 185 190Met Thr Thr Ile Lys Asp Phe Phe His Gly Ile Gln Leu Thr Val Lys

195 200 205Val Lys Gly Tyr Glu Gly Trp Gln Gly Glu Ala Asn Leu His Ile Glu

210 215 220Arg Leu Ile Thr Ala Arg Leu Ser Asn Thr Thr Asn Val Tyr Phe Lys225 230 235 240Tyr Lys Val Glu Gly Val Ala Ser Phe Ile Lys Thr Lys Gly Ile Lys

245 250 255Ala Ile Glu Ala Thr Lys Lys Ser Val Lys Gly Ile Arg Gly Gly Glu

260 265 270Trp Asn Ile Leu Pro Ser Lys Leu Glu Val Val Met Gln Pro Thr Lys

275 280 285Val Gln Thr Thr Glu Asn Tyr Asp Gly Thr Thr Ser Phe Arg Phe Thr

290 295 300Asn Tyr Glu Gly Ala Ser Ser Ser Lys Pro Val Glu His Asn Ser Asp305 310 315 320Asp Glu Ala Tyr Met Ala Leu Phe Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp

325 330 335Ile Thr Phe Leu Asn Arg Ile Leu Ser Lys Tyr Ser Thr Gln Gln Lys

340 345 350Val Val Gly Glu Glu Glu Phe Ser Pro Glu Glu Asp Gln Ile Ile Ser

355 360 365Asp Phe Leu Gly Lys Thr Glu Glu Ala Tyr Pro Ala Glu Ile Glu Glu

370 375 380Glu Tyr Pro Ala Leu Arg Arg Leu Glu Gln Leu Met Lys Thr Lys Val385 390 395 400Val Val Gln Glu Ile Glu Glu Pro Ser Gln Pro Val Glu Ala Lys Met

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(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：基因组DNA(Xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GAAGTTGAAG ACAAAAGAAG GTCTTAAATC CTGGCTAGCA ACACTGAACT ATGCCAGAAA 60CCACATCAAA GATATGGGCA AGCTTCTTGG CCCATTATAT CCAAAGACCT CAGAGAAAGG 120TGAGCGAAGG CTCAATTCAG AAGATTGGAA GCTGATCAAT AGGATCAAGA CAATGGTGAG 180AACGCTTCCA AATCTCACTA TTCCACCAGA AGATGCATAC ATTATCATTG AAACAGATGC 240ATGTGCAACT GGATGGGGAG CAGTATGCAA GTGGAAGAAA AACAAGGCAG ACCCAAGAAA 300TACAGAGCAA ATCTGTAGGT ATGCCAGTGG AAAATTTGAT AAGCCAAAAG GAACCTGTGA 360TGCAGAAATC TATGGGGTTA TGAATGGCTT AGAAAAGATG AGATTGTTCT ACTTGGACAA 420AAGAGAGATC ACAGTCAGAA CTGACAGTAG TGCAATCGAA AGGTTCTACA ACAAGAGTGC 480TGAACACAAG CCTTCTGAGA TCAGATGGAT CAGGTTCATG GACTACATCA CTGGTGCAGG 540ACCAGAGATA GTCATTGAAC ACATAAAAGG GAAGAGCAAT GGTTTAGCTG ACATCTTGTC 600CAGGCTCAAA GCCAAATTAG CTCAGAATGA ACCAACGGAA GAGATGATCC TGCTTACACA 660AGCCATAAGG GAAGTAATTC CTTATCCAGA TCATCCATAC ACTGAGCAAC TCAGAGAATG 720GGGAAACAAA ATTCTGGATC CATTCCCCAC ATTCAAGAAG GACATGTTCG AAAGAACAGA 780GCAAGCTTTT ATGCTAACAG AGGAACCAGT TCTACTCTGT GCATGCAGGA AGCCTGCAAT 840TCAGTTAGTG TCCAGAACAT CTGCCAACCC AGGAAGGAAA TTCTTCAAGT GCGCAATGAA 900CAAATGCCAT TGCTGGTACT GGGCAGATCT CATTGAAGAA CACATTCAAG ACAGAATTGA 960TGAATTTCTC AAGAATCTTG AAGTTCTGAA GACCGGTGGC GTGCAAACAA TGGAGGAGGA 1020ACTTATGAAG GAAGTCACCA AGCTGAAGAT AGAAGAGCAG GAGTTCGAGG AATACCAGGC 1080CACACCAAGG GCTATGTCGC CAGTAGCCGC AGAAGATGTG CTAGATCTCC AAGACGTAAG 1140CAATGACGAT TGAGGAGGCA TTGACGTCAG GGATGACCGC AGCGGAGAGT ACTGGGCCCA 1200TTCAGTGGAT GCTCCACTGA GTTGTATTAT TGTGTGCTTT TCGGACAAGT GTGCTGTCCA 1260CTTTCTTTTG GCACCTGTGC CACTTTATTC CTTGTCTGCC A 1301(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征(A)长度：11422碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：基因组DNA(Xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GAAGTTGAAG ACAAAAGAAG GTCTTAAATC CTGGCTAGCA ACACTGAACT ATGCCAGAAA 60CCACATCAAA GATATGGGCA AGCTTCTTGG CCCATTATAT CCAAAGACCT CAGAGAAAGG 120TGAGCGAAGG CTCAATTCAG AAGATTGGAA GCTGATCAAT AGGATCAAGA CAATGGTGAG 180AACGCTTCCA AATCTCACTA TTCCACCAGA AGATGCATAC ATTATCATTG AAACAGATGC 240ATGTGCAACT GGATGGGGAG CAGTATGCAA GTGGAAGAAA AACAAGGCAG ACCCAAGAAA 300TACAGAGCAA ATCTGTAGGT ATGCCAGTGG AAAATTTGAT AAGCCAAAAG GAACCTGTGA 360TGCAGAAATC TATGGGGTTA TGAATGGCTT AGAAAAGATG AGATTGTTCT ACTTGGACAA 420AAGAGAGATC ACAGTCAGAA CTGACAGTAG TGCAATCGAA AGGTTCTACA ACAAGAGTGC 480TGAACACAAG CCTTCTGAGA TCAGATGGAT CAGGTTCATG GACTACATCA CTGGTGCAGG 540ACCAGAGATA GTCATTGAAC ACATAAAAGG GAAGAGCAAT GGTTTAGCTG ACATCTTGTC 600CAGGCTCAAA GCCAAATTAG CTCAGAATGA ACCAACGGAA GAGATGATCC TGCTTACACA 660AGCCATAAGG GAAGTAATTC CTTATCCAGA TCATCCATAC ACTGAGCAAC TCAGAGAATG 720GGGAAACAAA ATTCTGGATC CATTCCCCAC ATTCAAGAAG GACATGTTCG AAAGAACAGA 780GCAAGCTTTT ATGCTAACAG AGGAACCAGT TCTACTCTGT GCATGCAGGA AGCCTGCAAT 840TCAGTTAGTG TCCAGAACAT CTGCCAACCC AGGAAGGAAA TTCTTCAAGT GCGCAATGAA 900CAAATGCCAT TGCTGGTACT GGGCAGATCT CATTGAAGAA CACATTCAAG ACAGAATTGA 960TGAATTTCTC AAGAATCTTG AAGTTCTGAA GACCGGTGGC GTGCAAACAA TGGAGGAGGA 1020ACTTATGAAG GAAGTCACCA AGCTGAAGAT AGAAGAGCAG GAGTTCGAGG AATACCAGGC 1080CACACCAAGG GCTATGTCGC CAGTAGCCGC AGAAGATGTG CTAGATCTCC AAGACGTAAG 1140CAATGACGAT TGAGGAGGCA TTGACGTCAG GGATGACCGC AGCGGAGAGT ACTGGGCCCA 1200TTCAGTGGAT GCTCCACTGA GTTGTATTAT TGTGTGCTTT TCGGACAAGT GTGCTGTCCA 1260CTTTCTTTTG GCACCTGTGC CACTTTATTC CTTGTCTGCC ACGATGCCTT TGCTTAGCTT 1320GTAAGCAAGG ATCGCAGTGC GTGTGTGACA CCACCCCCCT TCCGACGCTC TGCCTATATA 1380AGGCACCGTC TGTAAGCTCT TACGATCATC GGTAGTTCAC CA 1422(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征

(A)长度：32碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(Xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CTCTAGCTGC AGGAAGTTGA AGACAAAAGA AG 32(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性GTACGTAGGC CTCACTGAAT GGGCCCAGTA C 31(ii)分子类型：cDNA(Xi)序列描述：SEQ ID NO：7：(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(Xi)序列描述：SEQ ID NO：8：TACGATAGGC CTTGGCAGAC AAGGAATAAA G 31(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(Xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GCACGAAGGC CTTGGTGAAC TACCGATGAT C 31(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征

(A)长度：25碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：cDNA(Xi)序列描述：SEQ ID NO：10：CAGGACGGAC CATGGATATA TCTCC 25

Claims

1.一种分离和纯化的DNA分子，它含有预选定的DNA区段，该预选定的DNA区段含有甘蔗杆状病毒启动子，或其生物学活性亚单位。

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其中该预选定的DNA区段含有SEQ ID NO：3。

3.根据权利要求1所述的DNA分子，其中该预选定的DNA区段含有SEQ ID NO：4。

4.根据权利要求1所述的DNA分子，其中该预选定的DNA区段含有SEQ ID NO：5。

5.一种表达盒，含有第一预选定的DNA区段，该第一预选定的DNA区段含有一种在宿主细胞中具有功能的甘蔗杆状病毒启动子或其生物活性亚单位，它与一种第二预选定的DNA区段可操纵连接，该第二预选定的DNA区段编码一种蛋白质，RNA转录物，或它们的组合。

6.根据权利要求5所述的表达盒，还含有一个第三预选定的DNA区段，该第三预选定的DNA区段编码一种氨基末端叶绿体瞬间肽，它与该第二预选定DNA区段可操纵连接。

7.根据权利要求5所述的表达盒，其中该第一预选定的DNA区段含有SEQ ID NO：3。

8.根据权利要求5所述的表达盒，其中该第一预选定的DNA区段含有SEQ ID NO：4。

9.根据权利要求5所述的表达盒，其中该第一预选定的DNA区段含有SEQ ID NO：5。

10.根据权利要求5所述的表达盒，还含有一种增强子元件。

11.根据权利要求5所述的表达盒，其中该第二预选定DNA区段含有一种可选择标记基因或报道基因。

12.根据权利要求5所述的表达盒，其中该启动子在宿主中是组成型表达的。

13.根据权利要求5所述的表达盒，其中该宿主细胞是植物细胞。

14.根据权利要求13所述的表达盒，其中该宿主细胞是双子叶植物细胞。

15.根据权利要求13所述的表达盒，其中该宿主细胞是单子叶植物细胞。

16.一种生产转化植物细胞的方法，包括：(I)向可再生植物细胞中导入一种重组DNA片段，该重组DNA片段含有一种第一预选定DNA片段，该第一预选定的DNA片段含有一种甘蔗杆状病毒启动子，它与一种第二预选定的DNA片段可操纵连接，从而产生转化的细胞，和(ii)识别并选择转化的细胞系。

17.一种生产可育的转基因植物的方法，包括：(I)向可再生植物细胞中导入一种重组DNA片段，该重组DNA片段含有一种第一预选定DNA片段，该第一预选定的DNA片段含有一种甘蔗杆状病毒启动子，它与一种第二预选定的DNA片段可操纵连接，从而产生转化的细胞，(ii)识别或选择转化的细胞的群体，和(iii)从中再生可育的转基因植物，其中所说的重组DNA片段通过所述转基因植物的完整的有性繁殖循环被传递到它的子代。

18.根据权利要求16或17的方法，其中可再生植物细胞是单子叶植物细胞。

19.根据权利要求16或17所述的方法，其中可再生植物细胞是双子叶植物细胞。

20.根据权利要求16或17所述的方法，其中该重组DNA分子是通过选自下组的方法被导入植物细胞中的：农杆菌介导的DNA转移，电穿孔，原生质体转化，和微粒轰击。

21.根据权利要求16或17所述的方法，其中该第一预选定的DNA含有SEQ ID NO：3。

22.根据权利要求16或17所述的方法，其中该第一预选定的DNA区段含有SEQ ID NO：4。

23.根据权利要求16或17所述的方法，其中该第一预选定的DNA区段含有SEQ ID NO：5。

24.根据权利要求16或17所述的方法，其中该重组NDA区段被表达，从而给予转化细胞一种表型特征。

25.根据权利要求17所述的方法，其中该重组DNA片段在该可育转基因植物中被表达，从而给予该植物一种表型特征。

26.根据权利要求16或17所述的方法，其中该第二预选定的DNA区段含有可选择的标记基因或报道基因。

27.一种包括从权利要求17的方法得到的、含有所说的重组DNA的可育转基因植物获得子代的方法。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所说的子代是通过将所述的可育转基因植物与相同种类的植物杂交获得的。

29.根据权利要求27所述的方法，包括从所述的子代获得种子和从所述的种子获得含有所述的重组DNA的后续的子代植物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中将获得的子代与相同种类的植物回交，以便获得含有所述的重组DNA的后续的子代。

31.根据权利要求30所述的方法，其中从所述的后续的子代植物获得种子，并且从所述的种子产生含有所述的重组DNA的植物。

32.根据权利要求30所述的方法，其中将所述的后续的子代与相同种类的植物回交，获得含有所述的重组DNA的子代。

33.从权利要求16的方法获得的转化植物细胞再生的转化植物。

34.权利要求33所述的转化植物的转化种子。

35.含有所述的重组DNA区段的、根据权利要求17所述的方法生产的T0转基因植物。

36.含有所述的重组DNA区段的、根据权利要求35所述的转基因T0植物生产的种子。

37.来自权利要求35所述的植物的T1转基因植物，其中所述的T1植物含有所述的重组DNA区段。

38.来自权利要求37所述的植物的子代转基因植物，其中所述的子代植物含有所述的重组DNA区段。

39.根据权利要求35，37或38所述的植物，其中该重组DNA区段被表达，从而使该转基因植物表现出一种表性特征，使该转基因植物可以从相应的非转化的植物中识别出来。

40.一种转化的单子叶植物，其细胞含有一种重组DNA片段，该重组DNA片段含有一种第一预选定DNA片段，该第一预选定的DNA片段含有一种甘蔗杆状病毒启动子，它与一种第二预选定的DNA片段可操纵连接，其中，该第二预选定的DNA片段被表达，从而使该转化的植物可以从对应的非转化植物中识别出来。

41.一种转化的单子叶植物，其细胞含有一种重组DNA片段，该重组DNA片段含有一种第一预选定DNA片段，该第一预选定的DNA片段含有一种甘蔗杆状病毒启动子，它与一种第二预选定的DNA片段可操纵连接，其中，该第二预选定的DNA片段被表达，从而使该转化的植物可以从对应的非转化植物中识别出来。

42.一种可育的转基因植物，它含有一种重组DNA片段，该重组DNA区段含有一种第一预选定的DNA区段，该第一预选定的DAN区段含一种甘蔗杆状病毒启动子，它与一种第二预选定的DNA片段可操纵连接，其中该第二预选定的DNA区段在转基因植物的细胞中的表达量不同于与转基因植物的细胞的区别仅在于不存在重组DNA区段的植物细胞中的表达量，并且其中该重组DNA片段通过该转基因植物的完整的正常的有性生殖循环被传递到下一代。

43.由权利要求40，41，或42的植物生产的种子。

44.来自权利要求43所述的种子的子代植物。

45.起源于权利要求40，41，或42所述的植物的子代种子。

46.权利要求42所述的可育转基因植物，它是单子叶植物。

47.权利要求42所述的可育转基因植物，它是双子叶植物。

48.根据权利要求40，41或42所述的植物，其中该第一预选定DNA区段含有SEQ ID NO：3。

49.根据权利要求40，41，或42所述的植物，其中该第一预选定DNA区段含有SEQ ID NO：4。

50.根据权利要求40，41或42所述的植物，其中该第一预选定DNA区段含有SEQ ID NO：5。