JP2003523724A - 形質関連遺伝子の同定方法 - Google Patents

形質関連遺伝子の同定方法

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ヘレナ マシューズ，
シン リャン リュ，
ウェンディ ジェイ． ワッゴナー，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子の同定および特徴付けをするための方法を提供し、改変された遺伝子の発現は、果実のなる植物における所望の形質と関連する。この方法は、以下の工程を包含する：植物細胞を植物細胞発現ベクターを用いて形質転換する工程であって、上記発現ベクターは、ネイティブな植物遺伝子の発現を増強するのに効果的な様式で、遺伝子発現を増強するように機能しかつ植物ゲノム中組み込まれる能力を有するエレメントを含む、工程、形質転換された植物細胞を選択する工程、成熟植物を産生するように形質転換された植物細胞を再生する工程、所望の形質を有する植物を選択する工程、遺伝子を同定、単離および特徴付ける工程（ここで、この遺伝子の転写が増強されている）ならびに所望の形質に対する各同定された遺伝子の改変された発現の寄与を確認する工程。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、増強された発現によって所望の形質を有する植物を引き起こす遺伝
子を同定する方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 所望の形質（例えば、改善された収量、病害耐性、改善された果実成熟特徴、
改善された食物品質および改善された外見）を有する実のなる植物の開発は、長
年、植物栽培者および農業関連産業の注目であった。
【０００３】 植物の改善された変種を開発するために使用される伝統的な方法は、交雑受粉
および根茎への移植を含み、これらは、遅くかつ労働集約的である。現在、新規
および／または改善された農学特徴ならびに組換えＤＮＡ技術を用いた作物プロ
セス重要性を有する植物を産生することは可能である。一般的に、組換えＤＮＡ
技術の植物改善に対する適用は、（１）変異誘発物質（例えば、ＥＭＳ（エチル
メタンスルホネート）ジエポキシオクタン、ジエポキシブタンまたはγ線）を用
いた植物または種子の処理による無作為な変異の生成、（２）特定の植物遺伝子
の選択的変異（３）改変されたネイティブ遺伝子または異種遺伝子をコードする
異種遺伝子構築物の植物への導入、および／または（４）種々の遺伝子制御エレ
メントを用いたネイティブな植物遺伝子の改変された発現、に焦点が当てられて
きた。
【０００４】 ネイティブな植物遺伝子は、ノックアウトであり得るか、または、新規な植物
改変体を開発するために使用される種々の技術によって改変されたそれらの発現
であり得る。内因性植物遺伝子の改変された発現は、植物遺伝子の上方制御また
は下方制御のいずれかの形態をとる。そのような植物遺伝子の上方制御または下
方制御は、植物遺伝子の転写および／もしくは翻訳を制御する調節エレメントを
操作することによってか、または核酸構築物（センスまたはアンチセンス）の導
入によって達成され、これらは、この遺伝子の転写および／もしくはその遺伝子
によってコードされるｍＲＮＡの翻訳を改変することによって所定の遺伝子の発
現を増強または減少させる。
【０００５】 挿入変異誘発技術がまた使用され、ネイティブな植物遺伝子の無作為な改変を
作製する。例えば、Ｔ−ＤＮＡ挿入技術（「Ｔ−ＤＮＡタグ付け（Ｔ−ＤＮＡ
ｔａｇｇｉｎｇ）」または「活性化タグ付け（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔａｇｇ
ｉｎｇ）」といわれる）を使用して、多数の形質転換された植物細胞系統（例え
ば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｓ．ら、９th、ＩＮＴ
Ｌ．ＣＯＮＦ．ＯＮ ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ ＲＥＳ．１９９８年６月２４〜
２８日、１６５頁、Ｕｎｉｖ．Ｏｆ．Ｗｉｓ）ならびにマメ科植物のＭｅｄｉｃ
ａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（Ｋａｒｄａｉｌｓｋｙ，Ｉ．ら、９th、ＩＮＴ
Ｌ．ＣＯＮＦ．ＯＮ ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ ＲＥＳ．１９９８年６月２４〜
２８日、１８７−１８８頁、Ｕｎｉｖ．Ｏｆ Ｗｉｓ．）において）が開発され
た。この技術において、種子は、植物ゲノム中に無作為に挿入されるＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ由来のＴｉプラスミドを用いて形質
転換される［例えば、Ｆｅｌｄｍａｎｎ，ＫＡ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１：７１，１
９９１；Ｈａｙａｓｈｉ Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８（５０８６）：１３
５０−３、１９９２；Ｗａｌｄｅｎ，Ｒ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：１５２１，１９９４を参照のこと］。花の誘導物質Ｆ
ＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｔ（ＦＴ）（これは、活性化タグ付けを用いて
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中に開花を誘導するように、分裂組織同一性遺伝子ＬＥ
ＡＦＹ（ＬＦＹ）と並行して作用する）の単離が、最近記載された（Ｋａｒｄａ
ｉｌｓｋｙ Ｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（５４４６）：１９６２−５、１９
９９）。
【０００６】 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａは、植物改良のモデルとして、例
えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ種（これは、長角果型の果実を有する）における挿入変
異誘発に対して、慣用的に使用される。しかし、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓは、多
肉果果実を有する植物に対するモデルとして提供されない（Ｍｅｉｓｓｎｅｒら
、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １２（６）１４６５−１４７２、１９
９７）。
【０００７】 トランスポゾンを使用した挿入変異誘発がまた記載され、ここで、天然または
導入されたトランスポゾンを含む核酸配列は、植物ゲノムを介して新規な位置に
移動するように誘導される（例えば、米国特許第４，７３２，８５６号を参照の
こと）。
【０００８】 現在までに、活性化タグ付けは、実のなる植物（例えば、トマトのような多肉
果果実を有する植物）における実施には見出されなかった。一方トランスポゾン
タグ付けにより、変異誘発およびＡｃ／Ｄｓトランスポゾンエレメントファミリ
ーを用いたトマトにおける遺伝子タグ付けに対する有望なアプローチが証明され
た（Ｙｏｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１３：２９１−１９６、１
９８８）。トランスポゾンタグ付けによる挿入変異誘発はまた、Ａｃ／Ｄｓ転移
性エレメント系を用いて、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいて
改変された特徴を有する植物を開発するためにうまく利用された（Ｖａｎ Ｓｌ
ｕｙｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３８８１、１９８７）。
【０００９】 近年利用可能な挿入変異誘発技術は、植物中の遺伝子機能に関する重要な情報
を産生する能力を有するが、多くの場合、この方法は時間がかかり、高価であり
そして／または改善された植物特徴と関連する遺伝子に関する所望の情報を提供
しない。このような技術の有用性は、多数の形質転換事象を形質転換しかつスク
リーニングする能力に依存し、ならびにそのような形質転換事象から生じる目的
の形質と関連する遺伝子を同定する能力に依存する。
【００１０】 植物形質転換の最適な方法は、植物の型に依存して変化する。例えば、Ｂｒａ
ｓｓｉｃａ種のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換は、胚軸組織を用いて
最適化される（例えば、米国特許第５，７５０，８７１号および同第５，４６３
，１７４号を参照のこと）。対照的に、ダイズにおいて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ媒介形質転換に対する好ましい方法は、胚軸組織の除去を必要とする（例
えば、米国特許第５，８２４，８７７号および同第５，５６９，８３４号を参照
のこと）。
【００１１】 遺伝子発現の増強は、新規な特徴を有する植物を開発するための手段を提供す
る。従って、植物中の目的の植物形質または特徴に関連する遺伝子を同定し、そ
してそのような形質を有する改変された植物を発達させるために、産業および学
術機関の両方によって、植物中の多数の遺伝子活性化事象を同定しそしてスクリ
ーニングするような手段を開発するための努力がなされてきた。
【００１２】 （発明の要旨） 本発明は、実のなる植物における目的の「結果の形質（ｏｕｔｐｕｔ ｔｒａ
ｉｔ）」と関連する遺伝子を同定、単離および特徴付ける際の使用のための、「
形質関連遺伝子の同定方法」を提供する。
【００１３】 本発明の好ましい方法において、実のなる植物を、遺伝子発現を増強しかつ植
物ゲノム中に安定に組み込まれるように機能するエレメントを含む異種核酸構築
物（発現ベクター）を用いて形質転換する。ベクター配列のある部分が配置のた
めに使用され得、それによって、エンハンサーエレメントの近傍におけるネイテ
ィブな植物ゲノムの領域を同定しそして特徴付ける。
【００１４】 本発明の方法に使用されるベクターは、（１）ネイティブな植物ゲノムに挿入
されかつ安定に組み込まれる能力、（２）５０００ｂｐ以上の挿入部位内でネイ
ティブな植物遺伝子の転写を増強する能力、および（３）植物に組みこまれそし
て発現された際に植物の表現形を改変する能力を含む特性を有する。
【００１５】 本発明の形質関連遺伝子の同定方法における使用のための好ましいベクターは
、以下の成分を含む：Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製および選択を容易にする核酸配
列；遺伝子発現を増強するように機能するエレメント（例えば、縦列２重のＣａ
ＭＶ ３５Ｓエンハンサー）；選択可能なマーカーをコードする配列を発現する
のに効果的なプロモーターに作動可能に連結された、選択可能なマーカーをコー
ドするヌクレオチド配列；上記の選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド
配列のための終了エレメント；およびエンハンサー配列の植物ゲノムへの安定な
組み込みのための機構（例えば、Ｔ−ＤＮＡ配列）。
【００１６】 例示的なベクターとしては、ｐＳＫＩ１５、ｐＡＧ３２０１、ｐＡＧ３２０２
およびｐＡＧ４２０１が挙げられる。
【００１７】 本発明の方法において、果実のなる植物は、異種遺伝子構築物を植物に安定に
導入することが公知の任意の方法によって形質転換され得る。
【００１８】 好ましい植物は、萎縮植物（例えば、トマト）のような短い世代時間を有する
植物である。
【００１９】 核酸配列を植物細胞に導入する好ましい方法は、植物細胞、外植片、分裂組織
または種子を改変されたＴｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いて感染することであり、この改変されたＴｉプラス
ミドは、内因性プロモーターに作用することによってネイティブな植物遺伝子の
増強された発現を容易にしかつ腫瘍原因遺伝子を欠くＴ−ＤＮＡ配列を有する。
【００２０】 本発明の好ましい実施形態において、支持細胞もしくは保育培養の使用を必要
としない胚軸または苗条先端（ｓｈｏｏｔ ｔｉｐ）の形質転換方法が、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクターを植物細胞に導入するための使用される。
【００２１】 形質転換された外植片細胞は、形質転換されていない植物細胞に対して毒性で
ある閾値濃度の選択剤を有する選択培地において培養される能力についてスクリ
ーニングされ、続いて、再生された植物苗条を産生するための再生条件下で培養
し、そして選択的発根培地に移し、成熟な植物を産生するように増殖する完全な
小植物を得た。
【００２２】 ネイティブな遺伝子の発現が増強される成熟植物の画分は、所望の形質を示す
。そのような所望の形質を示す植物が選択され、そして活性化タグ付け核酸構築
物の挿入部位に隣接する植物ゲノムＤＮＡが同定され、そして特徴付けられる。
好ましい実施形態において、配列は、プラスミドレスキュー（ｐｌａｓｍｉｄ
ｒｅｓｃｕｅ）およびコスミドベクター中にクローン化された伸長された配列を
用いて同定される。
【００２３】 所望の表現型に対して同定された遺伝子の寄与は、目的の形質と関連する挿入
されたエンハンサーの近傍である核酸配列を含む、別々のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍの二元性発現ベクターを用いて植物細胞を形質転換することならびに各別
々の二元性発現ベクターを用いて植物を形質転換することによって確認される。
【００２４】 次いで、そのようなトランスジェニック植物細胞を、選択培地中で培養される
能力に対してスクリーニングし、再生された植物苗条を産生するような再生条件
下で培養し、そして所望の形質に対してスクリーニングされる成熟植物に成長さ
せる。
【００２５】 いくつかの場合、遺伝子の改変された発現により、植物および／または果実の
生化学的改変（例えば、ビタミンレベルにおける変化、ミネラルまたは元素レベ
ルにおける変化、アミノ酸レベルにおける変化、炭水化物における変化、脂質レ
ベルにおける変化、窒素塩基のレベルにおける変化、イソプレノイドレベルにお
ける変化、フェニルプロパノイドのレベルにおける変化およびアルカロイドのレ
ベルにおける変化）が生じる。
【００２６】 別の場合、遺伝子の改変された発現によって、真菌、細菌またはウイルス病原
体に対する増加した耐性、昆虫に対する増加した耐性、改変された花のサイズ、
改変された花の数、改変された花の色素沈着および形、改変された葉の数、改変
された葉の色素沈着および形、改変された種子の数、葉および花の改変されたパ
ターンもしくは分布、節の間の改変された幹の長さ、改変された根の質量もしく
は根の発達特徴、および増加した乾燥、塩および抗生物質耐性のような形質を生
じる。
【００２７】 本発明のこれらの特徴は、以下の詳細な説明を添付の図および実施例と組み合
わせて読んだ場合、より完全に明らかになる。
【００２８】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 他に示されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者に
対してそれらが意味するものと同じ意味を有する。実施者は、当該分野の定義お
よび用語に関して、詳細には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｃ
ｏｌｄ，Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．
Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙお
よびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を指向する。本発明が、記載される
特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されない（それらが変化しうる場
合）ことが理解される。
【００２９】 本明細書中で使用される場合、用語「トランスジェニック植物」は、外因性核
酸配列（すなわち、ネイティブな（「形質転換されていない」）植物または植物
細胞の中に存在しない核酸配列）が組み込まれた植物をいう。
【００３０】 本明細書中で使用される場合、用語「活性化タグ付け（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｔａｇｇｉｎｇ）」は、核酸制御配列（例えば、エンハンサー）を有するベク
ターが植物ゲノム中に挿入されるプロセスをいう。「タグ」は、ベクターに由来
する核酸配列の領域であり、このベクターは、（「タグ」を）位置付けるために
使用され、そしてそれによって植物ゲノム中の挿入の部位が同定される。
【００３１】 本明細書中で使用される場合、用語「Ｔ−ＤＮＡ配列」は、核酸配列を含むＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド由来の配
列をいい、この核酸配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる感染の間に植物
細胞宿主に移入される。
【００３２】 本明細書中で使用される場合、用語「エンハンサー」および「遺伝子発現を増
強するように機能するエレメント」は、交換可能に使用され得、そして近接する
プロモーターから植物ＤＮＡの転写を活性化する任意の配列をいう。本発明の活
性化タグ付け方法において、エンハンサーは、一般的に、１０００〜約５０００
ｂｐ以上の挿入部位内で遺伝子の転写に影響を与えるように作用する。
【００３３】 本明細書中で使用される場合、用語「近傍」は、植物転写開始領域およびエン
ハンサー配列の相対的な位置に関して、一般的に、それらの配列が互いに約５０
００ｂｐ内であることを意味するが、いくつかの場合、エンハンサーは５０００
ｂｐより大きく離れて作用し得る。
【００３４】 本明細書中で使用される場合、用語「選択可能なマーカーをコードするヌクレ
オチド配列」は、植物細胞の中で発現し得るヌクレオチド配列をいい、そしてこ
こで、選択マーカーの発現は、発現された遺伝子を含む植物細胞に、選択剤の存
在下で増殖する能力を与える。
【００３５】 本明細書中で使用される場合、用語「Ｂａｒ遺伝子」は、ホスフィノスレシン
アセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｅｃｉｎ ａｃｅｔｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素をコードするヌクレオチド配列をいい、発現の
際に、除草剤グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ−ａｍｍｏ
ｎｉｕｍ）（「Ｂａｓｔａ」）に対する耐性を与える。
【００３６】 本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、下流遺伝子の転写を
指向するように機能する核酸配列をいう。プロモーターは、一般的に、標的遺伝
子が発現される宿主細胞に適する。プロモーターは、他の転写および翻訳調節核
酸配列（「制御配列」ともまたいわれる）と一緒に、所定の遺伝子を発現するの
に必要である。一般的に、転写および翻訳調節配列としては、限定されないが、
プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始お
よび終止配列、ならびにエンハンサーもしくは活性化配列が挙げられる。
【００３７】 本明細書中で使用される場合、組み換えＤＮＡ構築物またはベクターに関する
、用語「作動可能に連結された」は、選択されたコード配列の作動可能な制御の
ために互いに直接連結した、組み換えＤＮＡ構築物またはベクターのヌクレオチ
ド成分を意味する。
【００３８】 本明細書中で使用される場合、用語「境界配列」は、Ｔ−ＤＮＡ配列の左端お
よび右端（「境界」）に対応する核酸配列をいう。
【００３９】 本明細書中で使用される場合、用語「プラスミド」は、クローニングベクター
として使用される環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物をいい、これは、多くの細菌
およびいくつかの真核生物における染色体外の自己複製遺伝エレメントを形成す
る。
【００４０】 本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、異なる宿主細胞間の移動
のために設計された核酸構築物をいう。「発現ベクター」は、外来細胞中に組み
込まれ、異種ＤＮＡフラグメントを発現する能力を有するベクターをいう。多く
の原核生物および真核生物発現ベクターが市販される。適切な発現ベクターの選
択は、当業者の知識の範囲内である。
【００４１】 「異種」核酸構築物または配列は、それが発現される植物細胞に対してネイテ
ィブでない配列の部分を有する。制御配列に関して、異種は、制御配列がその発
現を現在制御する遺伝子を調節するように全く機能しない制御配列（すなわち、
プロモーターまたはエンハンサー）をいう。一般的に、異種核酸配列は、異種核
酸配列が存在する細胞またはゲノムの部分に対して内因性でなく、そして、異種
核酸配列は、感染、トランスフェクション、μインジェクション、エレクトロポ
レーションなどによって細胞に添加される。
【００４２】 本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関
与するＤＮＡのセグメントを意味し、これは、コード領域（例えば、５’非翻訳
（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」
配列）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イント
ロン））に、先行ならびに続いて、領域を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４３】 本明細書中で使用される場合、用語「配列同一性」は、配列整列プログラムを
用いて整列された、２つ以上の整列配列における核酸またはアミノ酸配列の同一
性を意味する。配列検索は、好ましくは、所定の核酸配列をＧｅｎＢａｎｋ Ｄ
ＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公共のデータベースにおける核酸配列と比
較して評価する場合、ＢＬＡＳＴＮプログラム用いて実行される。ＢＬＡＳＴＸ
プログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他
の公共のデータベースにおけるアミノ酸配列に対する、全ての読み取り枠で翻訳
された核酸配列の検索に好ましい。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸの両方は、
１１．０のオープンギャップペナルティ、および１．０の拡張ギャップペナルテ
ィのデフォルトパラメーターを使用して実行され、そしてＢＬＯＳＵＭ−６２マ
トリックスを使用する。［Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．２５（１７）３３８９−３４０２（１９９７）を参照のこと］。
【００４４】 ２つ以上の配列間の「％同一性」を決定するための選択された配列の好ましい
整列は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ中のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを用いて実行さ
れ、このプログラムは、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１の拡張
ギャップペナルティおよびＢＬＯＳＵＭ ３０類似性マトリックスを含むデフォ
ルトパラメーターを用いて作動される。
【００４５】 核酸配列は、２つの配列が高いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション
および洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に対
して「選択的にハイブリダイズ可能」であるとみなされる。そのような条件は、
Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら（１９９３）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ Ｉ
Ｎ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｓｕｐｐｌ ２１，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，に説明される（これは、
本明細書中に参考として明確に援用される）。
【００４６】 本明細書中で使用される場合、用語「発現」は、ポリペプチドが遺伝子の核酸
配列に基づいて産生されるプロセスをいう。このプロセスは、転写および翻訳の
両方を含む。
【００４７】 本明細書中で使用される場合、植物細胞に関して、用語「形質転換された」、
「安定に形質転換された」または「トランスジェニック」は、植物細胞が、２世
代以上に渡って保持される植物細胞のゲノム中に組み込まるネイティブでない（
異種）核酸配列を有することを意味する。
【００４８】 一般的に、「改変体」ポリヌクレオチド配列は、参照ポリペプチド配列から１
つ以上のアミノ酸が変化された「改変体」アミノ酸配列をコードする。改変体ポ
リヌクレオチド配列は、「保存的」または「非保存的」置換を有する改変体アミ
ノ酸配列をコードし得る。改変体ポリヌクレオチドはまた、アミノ酸挿入もしく
は欠失またはその両方を有する改変体アミノ酸配列をコードし得る。
【００４９】 本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドまたは遺伝子に関して、用語
「変異体」は、配列もしくは発現にのいずれかの点で、対応する野生型ポリヌク
レオチド配列または遺伝子から異なり、ここで、この差異は、改変された植物表
現型もしくはは形質に寄与する。植物または植物株に関して、用語「変異体」は
、改変された植物表現型または形質を有する植物または植物株をいい、ここで、
改変された表現型または形質は、野生型ポリヌクレオチド配列または遺伝子の改
変された発現に関連する。
【００５０】 本明細書中で使用される場合、「植物細胞」は、植物由来の任意の細胞をいい
、未分化組織（例えば、カルス）ならびに植物の種子、花粉、前配偶子および胚
を含む。
【００５１】 本明細書中で使用される場合、用語「成熟植物」は、完全に分化した植物をい
う。
【００５２】 本明細書中で使用される場合、所定の植物形質または表現型に関して、用語「
ネイティブ」および「野生型」は、形質または表現型が天然の同じ変種の植物に
見いだされる形態をいう。
【００５３】 本明細書中で使用される場合、植物形質に関して、用語「改変された」は、天
然に見いだされるような非トランスジェニック植物と比較した、トランスジェニ
ック植物の表現型における変化をいう。
【００５４】 本明細書中で使用される場合、用語「表現型」は、用語「形質」および「結果
の形質」と交換可能に使用され得る。この用語は、容易に観察され得るかまたは
容易に評価される植物の特徴をいい、そして植物の遺伝子構成と植物が生長する
環境との相互作用から生じる。そのような表現型は、増強された遺伝子発現から
生じる植物構成における化学変化を含み、増強された遺伝子発現は、植物におけ
る形態学的変化を生じてもよいし生じなくてもよいが、これは、当業者に公知の
分析的技術を使用して容易に評価され得る。
【００５５】 本明細書中で使用される場合、用語「植物構造」は、可溶性固体、固体全体お
よび細胞壁成分の量を反映する。
【００５６】 （ＩＩ．発明の方法） （Ａ．遺伝子発現の増強） 本発明は、「活性化タグ付け」の概念の基づく形質関連遺伝子の同定方法を提
供する。活性化タグ付けは、核酸制御配列（例えば、エンハンサー）を含む異種
核酸構築物が植物ゲノムに挿入されるプロセスである。エンハンサー配列は、単
一遺伝子の発現を増強するように作用し得るか、または、２つ以上の遺伝子の転
写を同時に増強し得る。エンハンサー配列は、ネイティブな植物遺伝子内に挿入
され得、遺伝子のイントロン内または遺伝子間の遺伝子を「ノックアウト」する
。
【００５７】 「タグ」は、異種核酸構築物（すなわち、ベクター）の領域であり、この異種
核酸構築物は、位置付けるために使用され得、そしてそれによって、植物ゲノム
中に組み込まれた導入核酸配列を同定しかつ特徴付ける。そのような活性化タグ
付けの核酸構築物は、発現（活性化）ネイティブ（内因性）植物遺伝子を増強す
るために、植物ゲノムの中に安定に導入され得る。（例えば、Ｗａｌｄｅｎ Ｒ
ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６（５），１５２１−８，１９９４を参
照のこと）。
【００５８】 一般的に、本発明の形質関連遺伝子の同定方法において有用なベクターは、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドの領域を
含み、優先的に、植物ゲノムの強力に転写される領域中に挿入する。このベクタ
ーは、挿入部位から離れた部位で遺伝子発現を活性化し得る転写エンハンサー配
列をさらに含む。
【００５９】 本発明の形質関連遺伝子の同定方法における使用ための適切なベクターが以下
にさらに記載される。
【００６０】 ネイティブな遺伝子の発現が増強される植物の画分は、所望の形質を示す。そ
のような所望の形質を示す植物が選択され、そして、活性化タグ付け核酸構築物
のエンハンサー配列の挿入部位に隣接する植物ゲノムが同定されかつ特徴付けら
れる。目的の遺伝子の同定および特徴付けに関して、当業者によって慣用的に使
用される技術は、プラスミドレスキュー［Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｆ．ＪおよびＭ
ｅｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｉ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ
１０：１９０−１９８（１９９２）］、およびゲノムウォーキング（例えば、Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡからのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒTM ）である。
【００６１】 「タグ」を用いて、所定の所望の形質と関連する遺伝子が、例えば、エンハン
サー挿入部位のいずれかの側（隣接）における約１００〜３０００ｂｐの配列を
回復するためのプラスミドレスキューを用いて、クローニングされ得る。
【００６２】 いくつかの場合、インバースＰＣＲが、ゲノムＤＮＡ中のＤＮＡ隣接既知配列
を単離するために使用され得、これは、反対の向きにプライムする既知の配列に
１つの末端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの使用により、そして、例
えば、左の境界のＴｉ配列または右の境界のＴｉ配列の間に特定の制限酵素部位
を有する。この方法おいて、染色体ＤＮＡが、制限エンドヌクレアーゼを用いて
消化され、そして環状化ＤＮＡ分子の中に連結される。生じる連結された分子の
集団は、染色体ＤＮＡおよび染色体−ベクターＤＮＡハイブリッドの複合混合物
からなる。このハイブリッド分子のプラスミド誘導された領域は、ＰＣＲ増幅の
ための下流のプライミング部位を提供する。上流プライマーは、ベクターに対し
て特異的であり得るか、または遺伝子特異的プライマーであり得る［例えば、Ｎ
ｏｖａｋ，ＪおよびＮｏｖａｋ，Ｌ，Ｐｒｏｍｅｇｅ Ｎｏｔｅｓ Ｍａｇａｚ
ｉｎｅ第６１番：２７，１９９７を参照のこと］。
【００６３】 本発明の方法の例示的な適用において、「活性化タグ付け」ベクターの植物細
胞への導入および所望の形質を有する植物の同定に続いて、エンハンサー挿入部
位に隣接する約１００〜３０００ｂｐの配列が、プラスミドレスキューによって
回復される。レスキューされた配列を使用して、エンハンサー挿入部位の両末端
における約２０ｋｂからのより長いネイティブな植物ＤＮＡ配列を引き出し、そ
して、約２０〜４０ｋｂのネイティブな植物ＤＮＡを含むコスミドクローンを構
築する。コスミドクローン中の配列を読み取り枠に対してスクリーニングし、そ
して特定の植物（例えば、トマト）に由来するゲノムＤＮＡのノーザンブロット
をプローブするために使用する。形質転換されていない植物と比較した、形質転
換された植物において変化した発現を有する遺伝子を、このような様式で同定す
る。（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩ
ＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍ
ｐｓｏｎ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，６７−７３および８９−１０６頁
を参照のこと）。コスミドクローンの構築のための方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら
、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ、第２版（１９８９）（これは、本明細書中に参考として明確に援用される
）の第３章に提供される。
【００６４】 一旦遺伝子が同定されると、制御および／または調節領域を含む核酸配列が単
離され、クローン化され、そして特徴付けられる。
【００６５】 ノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ（逆トランスクリプターゼポリメラーゼ
連鎖反応）を使用して、所望の形質と関連する遺伝子の発現を確認する。
【００６６】 次いで、各同定された遺伝子の発現を増強しかつ所望の表現型（形質）に対す
る各遺伝子の寄与を独立して確認するために、制御および／または調節領域を含
む同定された遺伝子の核酸配列をクローン化し、そして、別々の異種核酸構築物
（例えば、通常のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ二重ベクター）中の植物中に再導
入し得る。さらに、所望の形質を有する植物が選択され、そしてこれらの形質を
関連する遺伝子を使用して、所望の特性を有する改善された植物を開発する。
【００６７】 いくつかの場合、一旦所望の形質と関連する遺伝子が同定され、特徴付けられ
（すなわち、配列決定される）、そしてその機能が確認されると、その遺伝子の
配列は、所望の表現型を有するトランスジェニック植物の開発に使用するために
改変され得る。
【００６８】 改変された表現型がタグ付けされた遺伝子の増強された発現から生じる多くの
場合、表現型が優勢であることが理解される。
【００６９】 いくつかの場合、所定のネイティブな植物遺伝子の増強された発現は、所望の
形質に影響を与える別のネイティブな植物遺伝子の減少した発現または不活性化
を引き起こし得る。
【００７０】 ネイティブな遺伝子の無作為な発現はまた、トランスポゾンを含む核酸構築物
の目的のゲノム中への導入によって達成され得る。例示的なトランスポゾン（例
えば、Ａｃ、Ｄｓ、ＭｕまたはＳｐｍ）は、それ自身が遺伝子中に挿入されそし
て不安定な変異を引き起こし得るエレメントである。この変異は、植物または種
子発達の間の、トランスポゾンの変異座位からの引き続く切除に起因して、不安
定である。（例えば、Ｄｏｒｉｎｇ，Ｈ．Ｐ．およびＳｔａｒｌｉｎｇｅｒ（１
９８６），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１７５−２００；Ｆｅｄｅｒｏ
ｆｆ，Ｎ．（１９８９），「Ｍａｉｚｅ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ Ｅｌｅｍ
ｅｎｔｓ」Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ．Ｗｏｗｅ，Ｍ．Ｍ．およびＢｅｒｇ、Ｄ．Ｅ
．編、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，３７
７−４１１頁を参照のこと）。植物の高さ、胚軸伸長、および不稔性に影響を与
える半優性な変異体を同定するために使用された例示的なトランスポゾンタグ付
け戦略が記載される［Ｗｉｌｓｏｎ Ｋら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８（４）：
６５９−７１，１９９６を参照のこと］。
【００７１】 トランスポゾン（特に、Ａｃ）を含むベクターは、不活性化（または活性化）
するために導入され得、それによって特定の形質を制御する遺伝子をタグ付けす
る。一旦タグ付けされると、その形質に関連する遺伝子が、例えば、トランスポ
ゾン配列をＰＣＲプライマーとしてＰＣＲ遺伝子クローニング技術と共に使用し
て、クローニングされ得る。一旦同定されると、特定の形質に関する全体の遺伝
子（所望される制御または調節配列領域を含む）が、単離され、クローン化され
、そして植物への再導入の前に所望されるように操作され得る。従って、Ａｃ、
Ｄｓ、ＭｕまたはＳｐｍのような転移エレメントは、植物ゲノムの周りのエンハ
ンサーを移動させるために、本発明の方法における使用のための活性化タグ付け
核酸構築物中に組み込まれ得る。トランスポゾン含有活性化タグ付け核酸構築物
は、選択可能なマーカーをコードする配列を含んでもよいし含まなくてもよい。
【００７２】 Ａｃ／Ｄｓトウモロコシ転移エレメントに基づくエンハンサートラップおよび
遺伝子トラップ系が、トマトの中に移入され、そして活性であることが見いださ
れた（例えば、Ｙｏｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１３：２９１−
２９６，１９８８を参照のこと）。さらに、Ｄｓの連結されずかつ安定化された
転移を作製するための方法ならびに切除および再挿入の選択のための方法（ここ
で、連結された転移事象が最も頻繁に回復される）が、記載される（例えば、Ｓ
ｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１：１８４−１９０
，１９９６；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １２
（６）１４６５−１４７２，１９９７を参照のこと）。
【００７３】 本明細書中で記載される方法の１つの好ましい実施形態において、活性化付け
タグベクターは、エンハンサーの条件付き破壊を可能にする様式で改変される。
【００７４】 （Ｂ．植物形質転換） 植物細胞において内因性遺伝子の増強された発現に影響を与えるベクターを導
入するための方法は、本発明の重要な局面である。ベクター配列が、宿主ゲノム
中に安定に組み込まれることが好ましい。
【００７５】 本発明の形質関連遺伝子の同定方法における植物細胞の形質転換のための例示
的な方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、エレクトロポレーショ
ン、μインジェクションおよび微粒子銃ボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊ
ｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）である。
【００７６】 好ましい実施形態において、植物細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｍｉｆａｃｉｅｎｓを用いた感染によって形質転換される。しかし、理解される
ように、形質転換のための最適な形質転換方法および組織は、形質転換される植
物の型に依存して変化する。
【００７７】 （Ｃ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクターを用いた形質転換） 核酸配列を植物細胞に導入する好ましい方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（広範な植物を感染する遍在性土壌細菌）を用いて植
物細胞、外植片、分裂組織または種子を感染する方法である。Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍは、その腫瘍誘導Ｔｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡによる感染された
細胞へ異種ＤＮＡ配列を移入することが可能である。腫瘍を引き起こす遺伝子を
それらがもはや妨害しないように除去することによって、改変されたＴｉプラス
ミドが、選択された核酸配列を植物細胞に移入させるためのベクターとして使用
される。これらのＴｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡに隣接する短い直接的な反復配
列（左の境界の配列および右の境界の配列と称される）を含み、Ｔ−ＤＮＡ組み
込みにおいて重要な役割をはたす。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓによる感染の際に、異種ＤＮＡ配列が、植物ゲノムの１つ以上の部位
に安定に組み込まれる。
【００７８】 一般的に、選択された核酸配列は、ベクターの中の適切な制限エンドヌクレア
ーゼ部位に挿入される。切断、連結およびＥ．ｃｏｌｉ形質転換に関する標準的
な方法は、当業者に公知であり、そして本発明に使用されるベクターを構築する
際に使用される。
【００７９】 二元性Ｔｉベースのベクター系を使用して移動させ、そして所定の遺伝子の増
強された発現と植物の改変された形質または表現型の関連を確認する。本発明の
この局面に対する適切なベクターは、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡの境界の配列
（左、右または両方）、１つ以上の異種核酸配列の添加のための制限エンドヌク
レアーゼ部位［隣接Ｔ−ＤＮＡの境界の配列に隣接する］、異種核酸配列（すな
わち、同定されかつ単離された遺伝子のコード配列）、適切な調節配列および方
向性Ｔ−ＤＮＡの境界の配列に対して作動可能であり、植物細胞で機能する選択
マーカー、異種Ｔｉプラスミドプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点を含むプ
ラスミドを含む。
【００８０】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの二元性植物形質転換ベクターを、エレクトロポ
レーションによってＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの無害な（ｄｉｓａｒｍｅｄ）
菌株中に導入し（Ｎａｇｅｌ，Ｒ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．６７：３２５，１９９０）、続いて、キメラ植物を植物細胞に移入させるた
めにトマト植物細胞を用いて共培養する。
【００８１】 一般的に、共培養は、実施例１にさらに記載されるように、支持細胞または哺
育培養の非存在下で２〜３日間実行される。
【００８２】 標準的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの二元性ベクターは、当業者に公知であ
り、多くは市販され、その例は、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。
【００８３】 （ＩＩＩ．ネイティブな植物遺伝子の増強された発現のためのベクター） 本発明の形質関連遺伝子の同定方法における使用に適した好ましいベクターは
、以下の成分：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるの複製および選択を容易にする核酸配列；
遺伝子発現を増強するように機能するエレメント（例えば、縦列二重のＣａＭＶ
３５Ｓエンハンサー）；選択可能なマーカーをコードする配列を効果的に発現
するプロモーターに作動可能に連結された、選択可能なマーカーをコードするヌ
クレオチド配列；選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列のための終
了エレメント；および植物ゲノム中へのエンハンサー配列の安定な組み込みのた
めの機構（例えば、Ｔ−ＤＮＡ配列）を含む。
【００８４】 いくつかの場合、転移性エレメントは、エンハンサー配列の植物ゲノム中への
安定な介入に影響を与えるために使用され得る。
【００８５】 Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製および選択を容易にする核酸配列は、当業者に周知
である。例示的なＥ．ｃｏｌｉ配列は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって販売され
るＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMＫＳ＋プラスミドのｐＢｓｔＫＳ＋セグメントである
。
【００８６】 本発明の方法における使用に対して好ましいベクターは、ネイティブなエンハ
ンサーの配列領域に似た配列領域を有するエンハンサー配列を含む。エンハンサ
ードメインは、ネイティブなエンハンサーと少なくとも同じ数の反復（反復ヌク
レオチド単位）を含み、発現に必要な最低な数より多くの反復を有する必要はな
い。１つの実施形態において、このベクターは、少なくとも１つの天然のエンハ
ンサー配列を有する。好ましい実施形態において、エンハンサードメインは、２
つ以上、そして一般的には４つの天然のエンハンサー配列の反復単位を、いずれ
かの配向で縦列に有する。
【００８７】 エンハンサードメインは、シス活性であり、そして好ましくは増強される転写
開始ドメインの約５０００ｂｐ内に位置する。いくつかの場合において、エンハ
ンサードメインが、エンハンサー配列の位置から５０００ｂｐより多く離れてい
る転写開始ドメインに作用することが理解される。エンハンサーは、順配向また
は逆配向であり得、転写開始ドメイン（プロモーター）に関して、エンハンサー
が増強するプロモーターに対して上流または下流に位置され得る（一般的に上流
）。いくつかの場合、エンハンサーは、イントロン内に組み込まれる。
【００８８】 エンハンサードメインおよびプロモーターは、同じまたは異なる種由来であり
得る。しかし、エンハンサー配列は、必然的に、植物で効果的に機能する供給源
から由来する。通常、エンハンサーは、ウイルスまたは（高等）真核生物起源の
エンハンサーである。
【００８９】 プロモーター配列は、エンハンサーとして機能し得る。例えば、β−ファゼオ
リンプロモーターの６８ｂｐエレメントは、種子特異的エンハンサーとして機能
することが実証された（ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｓｔ ＡＨおよびＨａｌｌ Ｔ
Ｃ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２（４）：５７９−８８、１９９６）。
【００９０】 １つの好ましいエンハンサードメインは、ウイルス由来のエンハンサー（例え
ば、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー）であり、そして植物中の構造遺伝子の転写
開始領域からの転写を増強し得る。ＣａＭＶに関する例示的な配列は、ＧｅｎＢ
ａｎｋ登録番号Ｘ０２６０６に見出され得る。この配列は、エンハンサーおよび
プロモーター配列を含む、遺伝子の５’領域を示す。
【００９１】 １つの実施形態において、本発明の方法における使用のためのベクターは、少
なくとも１つの天然のＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー配列を有するエンハンサー
ドメインを有し、このドメインは、ネイティブなＣａＭＶ ３５Ｓゲノムから誘
導され、長さが１００ｂｐより大きく、好ましくは２００ｂｐ〜約８００または
８５０ｂｐの長さである。
【００９２】 図５は、本発明の方法および組成物における使用のための、１つの好ましい４
×ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー配列（配列番号１）を示し、この配列は、縦列
の４Ａｌｕ１−ＥｃｏＲＶフラグメント（各々２０２ｂｐの長さ、配列番号２）
、１２９ｂｐのＣａＭＶ配列（配列番号３）（各縦列Ａｌｕ１−ＥｃｏＲＶ反復
と関連し）およびさらなる７ｂｐ反復配列（配列番号４）（これは、ネイティブ
なＣａＭＶゲノムの３５Ｓエンハンサー領域中には表れない）を含む。
【００９３】 エンハンサーとして機能し得るさらなる例示的な配列は、ゴマノハグサモザイ
クウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）由来の配列を含み（
ＦＭＶ，Ｍａｉｔｉら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６：１４２−１５６、
１９９７）、Ｍａｉｔｉら（１９９７）は、強力なプロモーター活性を有するＦ
ＭＶ配列を記載し、これは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６１６６に見出される
完全ＦＭＶゲノム配列の位置６６９１〜７００３に対応する（配列番号５））。
エンハンサー領域は、同じ配列のヌクレオチド６６７８〜６８８５に見出される
（配列番号６）。
【００９４】 別の例示的なエンハンサー配列は、ピーナッツ萎黄病線条カリモウイルス（ｐ
ｅａｎｕｔ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｒｅａｋ ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）
（ＰＣＩＳＶ）から誘導される。ＰＣＩＳＶの全長転写物（ＦＬｔ）に対するプ
ロモーターは、米国特許第５，８５０，０１９号およびＭａｉｔｉおよびＳｈｅ
ｐｈｅｒｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４４
：４４０（１９９８）に記載され、そしてＰＣＩＳＶの完全ゲノム配列（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号Ｕ１３９８８に見出される）の位置５８５２〜６１０１に対応
する。エンハンサー領域は、同じ配列の５８５２〜６０２９であり、そして配列
番号７に示されるような配列を有する。
【００９５】 さらなる例示的なエンハンサー配列は、ミラビリスモザイクウイルス（ｍｉｒ
ａｂｉｌｉｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＶ）から誘導され、このウイ
ルスは、カルモウイルスファミリーに属する２本鎖ＤＮＡ植物パラレトロウイル
スである。ＭＭＶの完全ゲノム配列は公表されていない。特徴付けられたＭＭＶ
プロモーターフラグメントの配列は、ＤｅｙおよびＭａｉｔｉ、Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：７７１（１９９９）によって記載された（図１）。最も
高いプロモーター活性を有するフラグメントは、公表された配列のヌクレオチド
−２９７から＋６３に広がり、そして配列番号８に示されるような配列を有する
。プロモーターフラグメント内において、エンハンサー領域が同定され、この領
域は公表された配列の転写開始部位（配列番号８のヌクレオチド１〜２６０）に
対してヌクレオチド−２９７〜−３８に広がる。
【００９６】 形質転換体の選択を容易にするマーカー遺伝子は、マーカーが化学手段によっ
て（すなわち、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質など）の使用を介して）選択
し得る形質を与えるか否か、あるいは、観察または試験を介して単純に同定し得
る形質であるか否かに依存して、植物細胞における使用に対して選択可能または
スクリーニング可能かのいずれかであるマーカーをコードし得る。当該分野で公
知の多数の適切なマーカー遺伝子が、本発明の実施に使用され得る。
【００９７】 本発明のベクター中の使用のための例示的な選択可能なマーカーは、限定され
ないが、例えば、カナマイシン（ｎｐｔＩＩ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハ
イグロマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、テトラサイクリンなど
の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。さらなる選択可能なマーカーとしては、バ
イアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）耐性をコードするバー遺伝子（ｂａｒ ｇ
ｅｎｅ）；グリホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）耐性をコードする変異体ＥＰ
ＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する耐性を与えるニトリラーゼ（ｎ
ｉｔｒｉｌａｓｅ）遺伝子；イミダゾリノン（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ）ま
たはスルホニル尿素（ｓｕｌｐｈｏｎｙｌｕｒｅａ）耐性を与える変異体アセト
ラクテートシンターゼ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子
（ＡＬＳ）；またはメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子が挙げられる。
【００９８】 １つの実施形態において、本発明の方法は、カナマイシン耐性遺伝子を保有す
るベクターを用いて実行される。別の実施形態において、本発明の方法は、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のバー遺伝子（これは、除草剤バイアラフォス中の活
性化成分（ホスフィノスリシン（ＰＰＴ））を不活性化するホスフィノスリシン
アセチルトランスフェラーゼをコードする（ＰＡＴ，Ａｋａｍａら、１９９５）
）を含むベクターを用いて実行される。ＰＰＴは、グルタミンシンテターゼを阻
害し、迅速なアンモニアの蓄積および細胞死を引き起こす。この遺伝子を含むト
ランスジェニック植物は、除草剤に対する耐性を示す（「ＢＡＳＴＡ」）。この
遺伝子はまた、バー遺伝子を保有する外植片が、ホスフィノスリシン（ＰＰＴ）
（これは、バイアラフォスの活性成分である）を含む選択培地上で増殖し得るの
で、選択可能なマーカー遺伝子として使用され得る。
【００９９】 さらなる実施形態において、本発明の方法は、除草剤耐性遺伝子を含むベクタ
ーを用いて実行され、グリホセート含有除草剤に対する耐性を与える。グリホセ
ートは、Ｎ−ホスホノメチルグリシンといわれ、酸性または陰イオン性形態のい
ずれかである。この活性成分を含む除草剤は、「ＲＯＵＮＤＵＰ」および「ＧＬ
ＥＡＮ」を含む。グリホセート耐性を与える例示的な遺伝子は、ＥＰＳＰシンタ
ーゼ遺伝子（５−エノールピルビル−３−ホスホシキメートシンターゼ（５−ｅ
ｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｓｓｈｉｋｉｍａｔｅ ｓｙｎｔｈ
ａｓｅ）（Ｄｅｌａｎｎｅｙら、１９９５；Ｔｉｎｉｕｓら、１９９５）または
、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（Ｙａｏら、１９９５）を含む。
【０１００】 使用される特定のマーカー遺伝子は、導入されたＤＮＡを欠く細胞と比較した
場合に形質転換された細胞の選択を可能にする遺伝子である。好ましくは、選択
可能なマーカー遺伝子は、本発明の形質関連遺伝子の同定方法の組織培養段階に
おける選択を容易にする遺伝子である（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシ
ンまたはアンピシリン耐性遺伝子）。
【０１０１】 選択可能なマーカーをコードする配列および選択可能なマーカーをコードする
配列に対する終了配列の発現に効果的な適切なプロモーターの選択は、周知の使
用および／または市販される配列によって達成され得る。
【０１０２】 本発明の方法における使用のための例示的なベクターは、ｐＳＫＩ１５プラス
ミドである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｕｎ．ａｓａｌｋ．ｅｄｕ／ＬＡ
ＢＳ／ｐｂｉｏ−ｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；Ｈａｙａｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５８：１３５０−１３５３、１９９２；Ｗａｌｄｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ Ｂｉｏｌ ２６：１５２１−１５２８を参照のこと）。
【０１０３】 ｐＳＫＩ１５の重要なエレメントは、以下である（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点
を有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMプラスミド由来のｐＢｓｔＫＳ＋セグメント（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、（ｂ）Ｔ−ＤＮＡの左の境界および右の境界の間に位
置するＲＫ２プラスミド由来の骨格であって、これは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ中の安定な複製の原因であるｏｒｉＶおよびｏｒｉＴ領域を含む、（ｃ）ホ
スフィノスレシンアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするバイアラフォス
耐性（ＢＡＲ）遺伝子；（ｄ）ＢＡＲ遺伝子の上流に作動可能に連結されたマン
ノピンシンターゼ（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ｍａｓ）プロモ
ーター；（ｅ）プラスミドの左の境界に隣接するＢＡＲ遺伝子の下流に位置する
オクトピン（ｏｃｔａｐｉｎ）シンターゼ（ｏｃｓ）ポリＡ終了配列、および（
ｆ）縦列二重の３５Ｓエンハンサーエレメント（３×）。
【０１０４】 一般的に、本発明の実施における使用のためのベクターの構築物は、当業者に
公知である（一般的に、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩ
ＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）およびＡ
ｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ．Ｉ
ｎｃ．，著作権（ｃ）１９８７、１９８８、１９８９、１９９０、１９９３、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｃｈｉｌｐｅ
ｒｏｏｒｔ，Ｒ．Ａ．，Ｖａｒｍａ，Ｄ．Ｐ．Ｓ．編、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）を参照のこと（これら３
つ全ては、本明細書中に参考として明確に援用される）。
【０１０５】 本発明の形質関連遺伝子の同定方法における使用のための好ましいベクターは
、宿主ゲノム中への挿入のためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの左および右の境
界配列および内因性プロモーターを活性化することによってネイティブな植物遺
伝子の増強された発現を容易にするエンハンサー配列を提供する。
【０１０６】 例示的な形質転換は、二元性プラスミド（例えば、ｐＡＧ３２０１（４×２重
の３５ＳエンハンサーおよびＣｓＶＭＶプロモーターの制御下のｎｐｔＩＩ遺伝
子を有するｐＳＫＩ骨格）、ｐＡＧ３２０２（４×２重の３５Ｓエンハンサーお
よびＲＥ４プロモーターの制御下のｎｐｔＩＩ遺伝子を有する、ｐＳＫＩ骨格、
図６）またはｐＡＧ４２０１（４×２重の３５ＳエンハンサーおよびＲＥ４プロ
モーターの制御下のｎｐｔＩＩ遺伝子を有するｐＰＺＰ−２００骨格））を含む
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＥＨＡ １０５、Ｅ
ＨＡ １０１またはＧＶ３１０１のコロニーを用いて実施される。
【０１０７】 植物において増強された転写は、内因性（ネイティブ）または改変された内因
性（すなわち、非ネイティブ）遺伝子の発現を増強する際の使用を見出し得る。
【０１０８】 （ＩＶ．植物を形質転換する方法） 本発明の形質関連遺伝子の同定方法を実施する際に使用のための植物は、以下
の特徴を有さなければならない；（１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．を
用いて感染される能力、（２）短期間で多量に増殖する能力、（３）多肉果果実
を産生する能力、および（４）観察可能かまたは容易に評価される形質または表
現型。
【０１０９】 本発明の方法は、果実のなる植物を指向する。しかし、本明細書中に記載され
る方法の使用が、任意の特定の果実のなる植物に限定されないこと、そして一般
的に多肉果果実を産生する植物（例えば、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（トマト）
、Ｖｉｔａｓ（ブドウ）、Ｆｒａｇａｒｉａ（イチゴ），Ｒｕｂｕｓ（キイチゴ
、クロイチゴ、ローガンベリー）、Ｒｉｂｅｓ（干しブドウおよびグーズベリー
），Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ（ブルーベリー、コケモモ、ハイデルベリー、クランベ
リー）、Ａｃｔｉｎｉｄａ（キウイフルーツおよびチャイニーズグーズベリー）
、小核果果実（限定されないが、Ｍａｌｕｓ（リンゴ）およびＰｙｒｕｓ（ナシ
））、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓｐ．（メロン）、Ｐｒｕｎｕｓ属のほとんどのメンバ
ー、アカテツ科、マンゴ、アボガド、アプリコット、モモ、サクランボ、プラム
およびネクタリンを含む）に対して適用可能であることが理解される。
【０１１０】 果実のなる植物の萎縮変種が、本発明の方法の実行に対して好ましい。特に、
トマト（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ、Ｆｌｏｒｉｄａ Ｐｅｔｉｔｅ、Ｔｉｎｙ Ｔｉ
ｍおよびＳｍａｌｌ Ｆｒｙを含むがこれらに限定されない）の萎縮変種が好ま
しい。
【０１１１】 萎縮トマトは、植物に小型の外見を与える短い節間によって特徴付けられる。
小型のＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ品種、Ｍｉｃｒｏ−Ｔ
ｏｍ（Ｍｉｃｒｏトマト）は、高密度（１３５７植物／ｍ-2まで）で増殖し、短
いライフサイクル（蒔いてから果実が成熟するのに７０〜８０日）を有する比較
的萎縮された植物であり、そして、そのために果実のサイズおよび葉のサイズは
、遺伝的に縮小されている。（Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ １２（６）１４６５−１４７２、１９９７；Ｓｃｏｔｔ，ＪＷおよ
びＨａｒｂａｕｇｈ、ＢＫ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌａ．Ｃｉｒｃｕ
ｌａｒ Ｓ−３７０，１９８９年１２月）。さらに、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍは、多
くの病害に対して耐性であることが示され、そして、子葉のＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ媒介形質転換を介して８０％までの頻度で形質転換され得る（ｍｅｉｓ
ｓｎｅｒら、１９９７）。
【０１１２】 Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍに類似して、Ｆｌｏｒｉｄａ Ｐｅｔｉｔｅ（Ｆｌａ．Ａ
ｇｒ．Ｅｘｐｔ．Ｓｔａ．Ｃｉｒｃ．Ｓ−２８５）、Ｔｉｎｙ ＴｉｍおよびＳ
ｍａｌｌ Ｆｒｙは、短いライフサイクルを有するトマトの萎縮変種であり、そ
してそのために、果実のサイズおよび葉のサイズが遺伝的に縮小されている。
【０１１３】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクターを用いた植物形質転換に関する最適な手
順は、形質転換される植物の型とともに変化する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
媒介形質転換の例示的な方法としては、不稔実生および／または小植物に由来す
る、胚軸、苗条先端、幹または葉の組織の外植片の形質転換が挙げられる。その
ような形質転換植物は、性的に再産生され得るか、または、細胞もしくは組織培
養によって再産生され得る。
【０１１４】 一般的に、トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の形質転換は、損傷された子
葉組織、詳細には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよ
び支持細胞と共に共培養（「哺育培養」ともいわれる）された子葉組織を用いて
達成された。（米国特許第５，５６５，３４７号；Ｆｉｌｌａｔｉ Ｊ，ら、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：７２６−７３０、１９８７を参照のこと）。子
葉組織のような外植片（これは、インビトロにおいて誘導されない）は、使用の
前に表面滅菌されなければならず、これが、細胞に損傷を与え、それによって組
織の再生能力を阻害する。
【０１１５】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いたトマトの葉の
ディスクの形質転換が報告された（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ
ｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ：５：８１−８４，１９８６）。
【０１１６】 胚軸組織のようなインビトロ成長外植片の形質転換に関する方法は、トマトの
形質転換に関する他の方法に対して有利な点を提供し、その結果、この組織は、
成長チャンバーまたは温室の成長植物と対照的に、均質かつ不稔であり、そして
、感染の前に損傷または表面滅菌される必要はない。
【０１１７】 胚軸形質転換は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．に関して記載された（米国特許第
５，７５０，８７１号および５，４６３，１７４号、これらは、タバコ支持細胞
（これは、Ｂｒａｓｓｉｃａ外植片に対する哺育培養として作用する）を含む方
法に関する）。
【０１１８】 支持細胞または哺育培養の使用に依存するトマト由来の胚軸外植片の形質転換
に関する方法は、Ｆｒａｒｙ ＡおよびＥａｒｌｅ ＥＤ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ
ｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １６：２３５−２４０、１９９６に記載される。
【０１１９】 本発明の１つの好ましい実施形態において、支持細胞または哺育培養の使用が
一般的に必要でない改善された胚軸形質転換方法を使用して、植物細胞の中にＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクターを導入する（実施例１を参照のこと）。
【０１２０】 苗条先端の形質転換による、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクターの植物細胞
への導入がまた、好ましい。苗条先端の形質転換に関する好ましい方法は、支持
細胞または哺育培養を必要とせず、そしてまた実施例１に示される。
【０１２１】 本発明のさらに好ましい実施形態において、花の組織は、Ｃｏｕｇｈ，ＳＪお
よびＢｅｎｔ，ＡＦ，ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １６（６）：７３
５−７４３（１９９８）に記載されるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、５％スクロースおよび界面活性剤Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７
７を含む溶液中に供給される。
【０１２２】 形質転換された外植片細胞は、閾値濃度の選択剤を有する選択培地中で培養さ
れる能力に対してスクリーニングされる。選択培地上で増殖し得る外植片は、代
表的に、同じ培地の新鮮な供給物に移され、そして再び培養される。次いで、外
植片を再生条件下で培養し、再生された植物の苗条を産生する。苗条が形成され
た後、苗条を選択的発根培地に移し、完全な小植物を得る。次いで、この小植物
を増殖し得、形質転換された植物の伝播のために種子、切り枝などを得る。この
方法は、ネイティブな植物遺伝子の増強された発現を用いた植物細胞の高効率性
形質転換および特定のネイティブな植物遺伝子の増強された発現と関連する改変
された形質または表現型を有する植物の再生を提供する。
【０１２３】 （Ｖ．増強された遺伝子発現の検出および特徴付け） 選択的条件下で増殖された形質転換植物細胞は、所望の形質に対してスクリー
ニングされる成熟植物を産生する。そのような形質転換植物から由来する種子が
発芽し、そして増殖し、所望の形質に対してまたスクリーニングされ得る成熟植
物を産生するように増殖され得ることが、理解される。
【０１２４】 特定の目的は、ビタミン、ミネラル、元素、アミノ酸、炭水化物、脂質、窒素
塩基、イソプレノイド、フェニルプロパノイドまたはアルカロイドのレベルの変
化を引き起こす、植物または果実の生化学的変化である。
【０１２５】 目的の植物の結果の形質としては、真菌、細菌およびウイルス病原体に対する
耐性、植物昆虫耐性；改変された花の大きさ、改変された花の数、改変された花
の色素沈着および形、改変された葉の数、改変された葉の色素沈着および形、改
変された種子の数、改変された葉および花のパターンまたは分布、節の間の改変
された幹の長さ、改変された根の質量および根の発達特徴、ならびに増加した乾
燥、塩および抗生物質耐性が挙げられる。
【０１２６】 目的の果実特異的な結果の形質としては、改変されたリコピン含量、カロチン
、アントシアニンおよびキサントフィルを含むリコピンから誘導される代謝産物
の改変された含量、改変されたビタミンＡ含量、改変されたビタミンＣ含量、改
変されたビタミンＥ含量、改変された果実の色素沈着および形、改変された果実
の成熟特徴、真菌、細菌およびウイルス病原体に対する果実の耐性、昆虫に対す
る果実の耐性、改変された植物の大きさ、ならびに改変された果実の構造（例え
ば、可溶性固体、固体全体および細胞壁成分）。
【０１２７】 本発明はさらに、１つ以上のネイティブな植物遺伝子の増強された発現に対応
した植物によって産生され、目的の表現型または形質を生じる植物代謝産物（化
学物質）を含む。一旦同定されそして特徴付けられると、そのような化学物質は
、組み換えＤＮＡ技術を用いて植物によって産生され得るか、または当業者に公
知の化学合成に関する標準的な技術を用いて合成的に産生され得る。
【０１２８】 （Ａ．所望の表現型と関連する遺伝子の同定） 目的の表現型または「形質」と関連する遺伝子を、Ｔｉタグ付け構築物への接
近によって同定した。Ｔ−ＤＮＡ挿入物によってタグ付けされた遺伝子は、野生
型遺伝子のクローニングにプローブとして使用されるＴ−ＤＮＡ配列に隣接する
、宿主ゲノム中にクローン化され、そして配列決定され得る。これらの技術は、
Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３５１−１３５４，１９８９；
ＭａｒｋｓおよびＦｅｌｄｍａｎ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１０５３−１０
５０、１９８９；およびＨａｙａｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１３５０
−１３５２、１９９２によって記載される。
【０１２９】 目的の遺伝子が同定され、そして、プラスミドレスキューおよび／または従来
のゲノムウォーキング技術によって、目的のＤＮＡ配列が、単離された。プラス
ミドレスキューは、ＢｅｈｒｉｎｇｅｒおよびＭｅｄｆｏｒｄ，Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１０（２）：１９０−１９８（１９９２）中にさらに
記載される。ゲノムウォーキングのための試薬は、市販されている（例えば、Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ，Ａｌｔｏ，ＣＡからのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒTM ）。
【０１３０】 上記に記載したように、選択された表現型において同定された遺伝子の役割は
、各同定された遺伝子に対して、別々の従来の植物遺伝子発現ベクターを用いて
トランスジェニック植物を調整することによって確認される。 （ＶＩ．形質転換の評価） 本発明の形質関連遺伝子の同定方法を用いた植物細胞へのＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍベクターの導入に続いて、植物組織の形質転換ならびに目的の形質に関
連する遺伝子および遺伝子産物の分析を、種々の方法によって確認し得た。例示
的な方法としては、以下に記載されるような発現された遺伝子と関連する核酸、
タンパク質および代謝産物の分析が挙げられる。
【０１３１】 （Ａ．ＰＣＲ分析） ＤＮＡを種々の植物組織から抽出し、そして当業者に慣用的に使用されるポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順によって目的の遺伝子の存在に関して分析した
。ＰＣＲは、目的の遺伝子に隣接するかまたはその遺伝子自身に対して特異的な
、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター配列に特異的なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用して実行し、この配列は一旦決定された（例えば、Ｊｅｎｓｅｎ，
Ｌ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３４８７
−３４９１，１９９６を参照のこと）。
【０１３２】 （Ｂ．ＲＴ ＰＣＲ分析） ＲＮＡをまた、種々の植物組織から抽出し、続いてｍＲＮＡの逆転写をし、そ
してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて部分ｃＤＮＡ配列の増幅をした。
【０１３３】 （Ｃ．サザン分析） 各植物の形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を用いて確認し得た
。代表的には、総ＤＮＡが、各形質転換体から単離する（例えば、Ｓｃｈｗａｒ
ｚ−Ｓｏｍｍｅｒら、１９８４）。次いで、ＤＮＡを、標準的な技術に従って、
制限酵素で消化し、アガロースゲル中で分画化し、そしてニトロセスロースフィ
ルター（例えば、ＨＹＢＯＮＤ−Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。次いで、こ
のブロットを、例えば、32Ｐ−標識した標的ｃＤＮＡを用いてプローブ化した。
制限消化、ゲル電位泳動、サザントランスファーおよびハイブリダイゼーション
に関する手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９（これは、本明細書中に参考と
して明確に援用される）によって記載されるような手順である。
【０１３４】 （Ｄ．ノーザン分析） ＲＮＡを、当該分野で慣用的に使用される標準的な手順に従って、特定の植物
細胞組織から単離し、例えば２．２Ｍ ホルムアミドを含む１．２％アガロース
ゲル中に分離し、そしてナイロン（登録商標）フィルター（例えば、Ｈｙｂｏｎ
ｄ−Ｎ）にブロットした。鎖特異的ＲＮＡプローブを、所望の形質と関連するｃ
ＤＮＡクローンからファージＴ７およびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼによって合成
し、そしてフィルター上のＲＮＡにハイブリダイズさせた。これによって、標的
遺伝子の発現から生じるｍＲＮＡの存在の決定ならびにその量の概算が可能とな
る。レスキューされた植物ＲＮＡのノーザン分析を使用して、過剰発現を検索し
得、そして発現された遺伝子の特徴付けをする（例えば、組織または発達段階特
異的発現）。ノーザン分析に関する手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９）に
よって記載されるような手順である。
【０１３５】 （Ｅ．ウエスタンブロットおよびイムノアッセイなど） ウエスタンブロット分析を、遺伝子によってコードされるタンパク質の存在を
検出するために推定形質転換体に対して実施し得、これは、ウエスタンブロット
に関する標準的な技術（例えば、Ｇｌｉｃｋ，ＢＲおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ．Ｊ
Ｅ編、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧ
Ｙ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，２１３−２２１頁、ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９９３）に記載されるプロトコール）を使用した。
【０１３６】 （ＶＩＩ．発明の実施の型） 本発明の形質関連遺伝子の同定方法における使用に対するＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍベクターの重要な局面は、ベクターの３５Ｓエンハンサー成分は、エン
ハンサー挿入部位の５０００ｂｐ以上内に位置するネイティブな植物遺伝子の転
写を増強するように作用するが、ネイティブな植物遺伝子は、遺伝子プロモータ
ーを介してＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー配列に直接連結される必要はないとい
うことである。
【０１３７】 本発明の方法の好ましい局面は、本明細書中で記載されるように、胚軸または
苗条先端の形質転換法による、多くの植物細胞の効果的な形質転換である。
【０１３８】 本発明のさらに好ましい局面は、トマトの萎縮変種によって例示されるような
短いライフサイクルを有する植物の形質転換であり、その結果、目的の形質と関
連する遺伝子の同定が、短期間に達成され得る。
【０１３９】 （ＶＩＩＩ．方法の適用） 前述より、本発明の方法が、改変された形質を有する果実のなる植物を成長さ
せることが好ましい状況に対して、広い適用性を提供することが理解され得る。
【０１４０】 ネイティブな植物遺伝子の増強された発現と関連する改変された形質に対する
植物の慣用的なスクリーニングにおける使用のためのキット形式に、本明細書中
で記載される任意の方法が、容易に適用可能であることが理解される。
【０１４１】 本明細書中に引用される全ての特許および引用文献は、本明細書によってその
全体が参考として援用される。
【０１４２】 本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載されるが、種々の改変お
よび変化が、本発明から離れることなくなされ得ることは、理解される。
【０１４３】 （材料および方法） （Ｍｉｃｒｏ−ＴｏｍトマトのゲノムＤＮＡの抽出） ＡｍｅｒｃｈａｍTMからのＮｕｃｌｅｏｎTM ＰｈｙｔｏＰｕｒｅＴＭ系を、
ゲノムＤＮＡの抽出のために、Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ、植物およ
び真菌ＤＮＡ抽出キットを用いて使用した。
【０１４４】 １．０ｇの新鮮な植物組織を液体窒素中に置き、フリーの豊富な（ｆｒｅｅ
ｆｌｏｗｉｎｇ）粉末を産生し、次いで、１５ｍｌのポリプロピレン遠心管に移
した。Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅキットからの４．６ｍｌの試薬１を
、完全に混合して添加し、続いて、Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅキット
からの１．５ｍｌの試薬２を添加し、均質な混合物が得られるまで転回をした。
この混合物を、振とうしている温浴中、６５℃で１０分間インキュベートし、そ
して氷上に２０分間置いた。このサンブルを氷から取り、２ｍｌの−２０℃のク
ロロホルムを添加し、混合し、そして１３００ｇで１０分間遠心分離した。上清
を新しい管に移し、２ｍｌの冷クロロホルム、２００μｌのＮｕｃｌｅｏｎ Ｐ
ｈｙｔｏＰｕｒｅ ＤＮＡ抽出樹脂懸濁物を添加し、そしてこの混合物を室温で
１０分間、傾斜シェイカー上で振とうし、次いで１３００ｇで１０分間遠心分離
した。Ｎｕｃｌｅｏｎ樹脂懸濁層を分布させることなく、上のＤＮＡ含有相を新
しい管に移し、上の相が濁っているように見える場合、移される水相が澄むよう
に９５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、等量の冷イソプロパノールを添加し、
そしてこの管を、ＤＮＡが沈降するまで穏やかに転回し、次いでこれを遠心分離
によってペレットにし、次いで、７０％の冷エタノールで洗浄し、ペレットにそ
して風乾させた。
【０１４５】 ＤＮＡを、ＲＮａｓｅを含むＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス．ＨＣｌ、ｐＨ７
．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、５５℃で１５分間インキュベートし、
さらに、フェノール／クロロホルム、次いでクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ品質
を調べるために１％アガロースゲルで泳動し、ＤＮＡ濃度を、ＤＮＡフルオロメ
ーター（Ｈｏｅｆｆｅｒ ＤｙＮＡ Ｑｕａｎｔ ２０００）によって測定した
。
【０１４６】 （プラスミドレスキュー） サザンハイブリダイゼーションによって同定された単一コピーＴ−ＤＮＡ挿入
株由来のゲノムＤＮＡを、サザンハイブリダイゼーションに使用した制限酵素に
よって消化した。次いで、制限フラグメントを自己連結させ、そしてＥ．ｃｏｌ
ｉ細胞の形質転換に使用した。全長ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、４×３５
Ｓエンハンサー、および右の境界のＴ−ＤＮＡ隣接ゲノムＤＮＡフラグメントを
含むプラスミドをレスキューした。
【０１４７】 ゲノムＤＮＡを、標準的な反応条件下で選択された制限酵素を用いて消化した
。簡単に言うと、制限酵素を、６５℃で２０分間加熱して不活性化し、フェノー
ル／クロロホルムおよびクロロホルムイソアミル（２４：１）各々で１回抽出し
、次いで、以下： 消化されたゲノムＤＮＡ ４０μｌ ５×連結緩衝液 ５０μｌ リガーゼ（Ｇｉｂｃｏｌ．１Ｕ／μｌ １０μｌ ｄｄＨ２Ｏ １５０μｌ を含む連結反応物中に入れた。
【０１４８】 この連結反応物を１６℃で一晩放置し、連結したＤＮＡを沈澱させ、ｄｄＨ２
Ｏ中に再懸濁し、１０ｐｇのｐＵＣ１８プラスミドをコントロールとして用いる
エレクトロポレーションを介してＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）を形質転換するために使用した。
【０１４９】 形質転換混合物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２枚のＬＢプレー
トに広げ、そして３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーをプレートか
ら拾い上げ、そして、それぞれ３７℃で一晩の５ｍｌのＬＢアンピシリンブロス
培養を開始するために使用した。このプラスミドを培養物から抽出し、そして制
限消化し、ゲノム挿入のサイズを確認した。
【０１５０】 （レスキューされたプラスミドの配列決定） 配列決定は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（
ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＡＢＩ ＰｒｉｓｍTM３１０ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）および配列分析ソフ
トウエア（例えば、ＳｅｑｕｅｎｃｅｒTM３．１．１またはＭａｃ Ｖｅｃｔｏ
ｒ ６．５．３．）を用いて達成した。
【０１５１】 配列決定のためのプライマーは、プラスミドの左末端の配列に基づいて設計さ
れ、（ａ）内部のＨｉｎｄ ＩＩＩまたはＫｐｎ Ｉ部位（例えば、Ｍ１３逆プ
ライマー（配列番号９）；（ｂ）内部のＸｈｏＩ部位（例えば、配列番号１０）
；または（ｃ）内部のＥｃｏ ＲＩ部位（例えば、配列番号１１）からの配列に
よって例示される。
【０１５２】 ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、製
造者らからのプロトコールに従って、ＡＢＩ ＰｒｉｓｍTM３１０ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてプラスミドの配列決定をした。
【０１５３】 同定されたゲノム挿入配列を使用して、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ」に提供されるインターフェースを使用し
てＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴTM類似性検索を行う。ＢＬＡＳＴ検索の結果より、検索
される公共のデーターベース（すなわち、検索のデータ）中に寄託された関連す
る配列の存在または非存在が示される。
【０１５４】 一般的に、最も大きいレスキューされたプラスミドを使用して、新規のプライ
マーを設計し、全長ゲノム挿入を配列決定する。そのようなプライマーは、コン
ピュータープログラム（例えば、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ
．ｍｉｔ．ｅｄｕ／／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｒｅ／ｐｒｉｍｅｒ３ ｗｗｗ
．ｃｇｉ／」に見いだされるＰｒｉｍｅｒ３プログラム）を使用して設計され得
る。
【０１５５】 レスキューされたプラスミドの制限欠失を適用して、この手順における配列決
定の加速化させ得る。これは、レスキューされたプラスミドの制限消化および異
なる制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｂｓｔ ＸＩおよびＥｃｏＲ
Ｖ（これらは、４×３５Ｓエンハンサーを含むＴ−ＤＮＡの右の境界を切断する
））を使用して消化されたプラスミドの自己連結を調整することによって達成さ
れる。自己連結されたプラスミドの制限消化を使用して、Ｔ−ＤＮＡの右の境界
の欠失およびゲノム挿入を確認し、次いで、ゲノム挿入物の欠失された右の境界
を、Ｔ７プライマーを使用して配列決定する。
【０１５６】 次いで、読み取り枠の存在を、ＭＩＴ：ｈｔｔｐ：／／ＣＣＲ−０８１．ｍｉ
ｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＥＳＣＡＮ．ｈｔｍｌにおけるＧＥＮＳＣＡＮ Ｗｅｂ Ｓ
ｅｒｖｅｒによって例示されるようなコンピュータープログラムを使用して決定
する。
【０１５７】 レスキューされたゲノムフラグメントの配列に基づいて読み取り枠が予想され
ない場合、ＢＡＣライブラリーをスクリーニングして、Ｔ−ＤＮＡの右の境界お
よび左の境界に隣接するより大きなフラグメントをクローン化し得る。そのよう
なスクリーニングを実行する場合、レスキューされたゲノムフラグメントをプロ
ーブとして使用して、変異体植物における活性化遺伝子を同定するためのより大
きなＴ−ＤＮＡ隣接配列を含む陽性クローンを同定するために、全トマトＢＡＣ
ライブラリー（ＲＧＬＥＭＯＧＩ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用
いてスポットされた高密度膜（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．
）をスクリーニングする。
【０１５８】 レスキューされたゲノムフラグメントの配列に基づいて読み取り枠が予想され
る場合、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザンブロットを使用して、同定された
読み取り枠の存在と観察された表現型を有する植物から単離されたＲＮＡを相関
付けた。
【０１５９】 一旦確認されると、同定された遺伝子（コード配列）が、遺伝子機能を確認す
るために野生型植物の中に、再び導入して戻される。
【０１６０】 以下に実施例が示されるが、本発明の制限するために意図されるものでは全く
ない。
【０１６１】 （実施例１） （Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍトマトにおける活性化タグ付けを用いた変異体の産生） 活性化タグ付け変異体を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を用いて
、トマトｃｖ．Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ中に作製した。不稔の実生および小植物を外
植片の供給源として使用した。より詳細には、胚軸、苗条先端、幹および葉を形
質転換した。
【０１６２】 （Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの）種子を、ｔｗｅｅｎ−
２０を用いて２５％漂白剤中で１５分間表面滅菌し、種子発芽培地（ＭＳ塩、Ｎ
ｉｔｓｃｈビタミン、３％スクロースおよび０．７％寒天（ｐＨ５．８））上に
プレートする前に滅菌水を用いてリンスした。基本の発芽培地は、必要な場合、
オーキシンおよび／またはサイトカインおよびジベレリン酸（ｇｉｂｅｒｒｅｌ
ｉｃ ａｃｉｄ）の添加によって改変され得た。培養は、２４℃で１６時間の光
期間（ｐｈｏｔｏ ｐｅｒｉｏｄ）（５０〜６０μｍｏｌ．ｍ-2ｓ-1）でインキ
ュベートした。７〜１０日の実生および１ヶ月のインビトロ植物を、それぞれ、
胚軸／苗条先端および幹／葉の外植片に対して使用した。
【０１６３】 二元性プラスミドｐＡＧ３２０２（図６）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＥＨＡ １０５／ＥＨＡ １０１／ＧＶ３１０１
の単一コロニーを、ＭＧＬ培地（ｐＨ ５．４）で一晩増殖させ、そして、ＭＧ
Ｌまたは液体植物共培養培地を用いて５×１０8細胞／ｍｌに希釈した。
【０１６４】 胚軸および幹を３〜５ｍｍのセグメントに切断し、次いで、細菌懸濁液中に浸
し、滅菌フィルター紙にブロットし、そして共培養培地に置いた。インビトロで
育てた実生（７〜８日）を、苗条先端の外植片の供給源として使用した。３〜６
ｍｍの苗条先端を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁物の存在下、ペトリプレー
ト上で解剖顕微鏡を用いて縦方向にセグメントにした。葉の外植片の場合、中央
部分を、葉柄末端および葉の先端を除去した後に、２〜４ｍｍ断面に切断した。
古い葉は、培養において形態形成的でない傾向を示すため、最も若い２〜３枚の
葉が好ましい。
【０１６５】 各場合において、外植片を細菌懸濁液中に浸し、滅菌フィルター紙にブロット
し、そして共培養培地（ＭＳ塩、ＬＳビタミン、３％ スクロース、０．１ｍｇ
／ｌ キネチン、０．２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、２００ｍｇ／ｌ リン酸カリウ
ム、５０μＭ アセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）および０．
７％ 寒天、ｐＨ ５．４）に２〜３日間置いた。
【０１６６】 共培養の２〜３日後、外植片を、ＭＳ塩、Ｎｉｔｓｃｈビタミン、３％ スク
ロース、２ｍｇ／ｌ ゼアチン、５００ｍｇ／ｌ カルベニシリン、２００ｍｇ
／Ｌチメチン（ｔｉｍｅｔｉｎ）および０．７％ 寒天（ｐＨ ５．４）（抗生
物質（ｍｐｔＩＩに対するプロモーターに依存して７５〜４００ｍｇ／ｌのカナ
マイシン）を備える）を含む苗条の再生培地に移した。抗生物質の選択レベルは
、組織応答に基づいて８週間の期間に渡って徐々に増加させた。
【０１６７】 外植片は、２週間毎に新鮮な培地に移した。苗条初期の徴候を伴うカルスの開
始は、外植片の型に依存して３〜６週間で観察された。脱分化および苗条再生は
、約４ヶ月に渡って続くことが観察され、その後、外植片組織は衰退する。緑色
および脱色された苗条の混合物が、再生の間に観察された。明らかな苗条分裂組
織を有する約１ｃｍサイズの緑色苗条を、カルスから切除し、そして根の誘導培
地（ＭＳ塩、Ｎｉｔｓｃｈビタミン、３％スクロース、１ｍｇ／ｌ ＩＢＡ、５
０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１００ｍｇ／ｌ カルベニシリンまたは、１００ｍ
ｇ／Ｌチメチンおよび０．７％寒天（ｐＨ５．８））に移した。値の生えた植物
を、生物的に安全な（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ）温室中の土壌に植えた。
【０１６８】 形質転換の頻度は、外植片の全数に対する、選択（カナマイシン）の存在下に
おける根の生えた植物の数として計算した。観察された形質転換頻度の平均は、
８〜５４％の範囲であった。
【０１６９】 植物を温室施設に移し、植物識別のためにタグ付けされた３．５’’ポットに
植えた。
【０１７０】 植物を温室で確立した後、それらを、野生型Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ植物に対する
表現形多様性について観察した。これを達成するために、いくつかの野生型植物
は、トランスジェニック植物のすぐ近くに維持した。各植物は、写真によって示
しかつ記録する観察を用いて、１週間にきっちり２回観察する。
【０１７１】 活性化タグ付けによって産生された約２０００個の植物の形態学的特徴の観察
により、多数の目的の形態学的変異体の存在が示され、例示的な表現型は、表１
に要約する。
【０１７２】 （表１．Ｍｉｃｔｏ−Ｔｏｍトマト活性化タグ付け変異体）
【０１７３】
【表１】 （実施例２） （遅延した開花表現型を有する例示的変異体） 「Ｌ０００００００２３」として識別され、葉の外植片から誘導され、そして
実施例１に記載されるように作製された、例示的活性化タグ付け変異体を、「Ｌ
２３」と名付けた（図７ＡおよびＢを参照のこと）。
【０１７４】 再懸濁されたＤＮＡをさらにフェノール／クロロホルムを用いて抽出する以外
は製造者らによって提案されるプロトコールに従って、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍゲノ
ムＤＮＡを、ＮｕｃｌｅｏｎTMＰｈｙｔｏＰｕｒｅTM系（ＡｍｅｒｓｈａｍTMよ
り）を用いて活性化タグ付け植物株のプラスミドレスキューのために、十分な収
量および品質で抽出した。
【０１７５】 花の変異体（Ｌ２３）を、２００未満の個々のＭｉｃｒｏ−ＴｏｍトマトＡＣ
ＴＴＡＧ株から同定し、この株は、Ｔ−ＤＮＡ中に４コピーの３５Ｓエンハンサ
ーおよび全長ｐＢｓｔＫＳ＋ベクターを含む（図６）。
【０１７６】 （Ｍｉｃｒｏ−ＴｏｍトマトのＰＣＲ特徴付け） ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびｐＡＧ３２０２の３５Ｓエンハンサー領域に特
異的なプライマーを使用して、ＰＣＲによって制御およびＴ１またはＴ２活性化
タグ付け植物株を特徴付けた。
【０１７７】 ＰＣＲは、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼキット、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡ、１０×ＰＣＲバッファー、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰ（１
０ｍＭ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、１５ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡおよびＤ
ＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）を使用して実施した。
【０１７８】 以下のプライマー配列を使用した。
【０１７９】
【化１】 代表的なサーマルサイクルプログラムを実行した。例えば： ９４℃で２分間；９４℃で３０秒、５７℃で１分および７２℃で１分を３０サ
イクル；続いて、７２℃で７分間、そして４℃で非制限の時間。
【０１８０】 ＰＣＲに続いて、この産物を電気泳動によって１％アガロースゲル上で分離し
、そして臭化エチジウムを用いた染色によって可視化した。
【０１８１】 ＰＣＲをｐ３２０２、野生型Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ ＤＮＡ、Ｌ２３ Ｍｉｃｒ
ｏ−Ｔｏｍ ＤＮＡおよびＤＮＡを欠くコントロールを用いて、３５Ｓエンハン
サーまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳのいずれかに特異的なプライマーと共
に実行した。結果により、３つのフラグメントが、ｐＡＧ−３２０２プラスミド
および変異体ＤＮＡの両方から、それぞれ、３５Ｓプライマーを用いて約３００
ｂｐ、６００ｂｐおよび９００ｂｐのサイズで増幅され、そして、１．５ｋｂの
フラグメントが、ｐＢｓｔＫＳ＋プライマーを使用してｐＡＧ−３２０２プラス
ミドおよび変異体ＤＮＡにおいて増幅されたことが示された。３５Ｓエンハンサ
ーに特異的なプライマーを用いたＰＣＲの結果により、ｐ３２０２およびＬ２３
Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ ＤＮＡにおいて３５Ｓエンハンサー配列の存在が示された
が、野生型Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ ＤＮＡまたはＤＮＡを有さないネガティブコン
トロールでは示されなかった。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳに対して特異的な
プライマーを用いたＰＣＲの結果により、ｐＡＧ３２０２プラスミドＤＮＡおよ
びＬ２３Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ ＤＮＡ中にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ配列の
存在が示されたが、野生型Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ ＤＮＡまたはＤＮＡを有さない
ネガティブコントロールでは示されず、これは、活性化タグ付けＤＮＡのゲノム
組み込みがＬ２３変異体の中で生じ、そして３５Ｓエンハンサー配列またはｐＡ
Ｇ３２０２プラスミドＤＮＡのいずれもが野生型Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍまたはネガ
ティブコントロール中に存在しないことを示唆する。
【０１８２】 ＡＣＴＴＡＧ株のゲノムＤＮＡを、ｐＡＧ−３２０２ Ｔ−ＤＮＡの左の境界
のみを切断する特定の制限酵素によって消化し、そしてゲル電気泳動によって分
離した。次いで、分画化されたＤＮＡをナイロン（登録商標）膜に移し、そして
、各活性化タグ付け株におけるＴ−ＤＮＡ挿入の数を決定するために、Ｅｃｏ
ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｈｏ Ｉ消化された野生型および変異体ゲノム
ＤＮＡをプローブするために32Ｐ標識したｐＢｓｔＫＳ＋フラグメントを用いて
プローブ化した。
【０１８３】 結果により、Ｌ２３変異体植物由来のＤＮＡの各制限消化由来のサザンブロッ
ト上に、１つのハイブリダイゼーションのバンドが存在し、そして野生型植物由
来のＤＮＡのサザンブロット上にハイブリダイゼーションのシグナルがなかった
ことが示され、これは、Ｌ２３が、Ｔ−ＤＮＡ挿入株であることを示す。
【０１８４】 Ｌ２３由来のゲノムＤＮＡは、上記に詳説されるプロトコールに従ってプラス
ミドレスキューされ、そして隣接配列を分析した。
【０１８５】 ３．７ｋｂおよび４．５ｋｂゲノム挿入フラグメントを有する２つの異なるサ
イズのプラスミドを、それぞれ、Ｌ２３ゲノムＤＮＡのＨｉｎｄ ＩＩＩおよび
Ｘｈｏ Ｉ消化からレスキューした（図８Ａおよび８Ｂ）。レスキューされたゲ
ノム挿入の大きなフラグメントを、ＡＢＩ ＰｒｉｓｍTM３１０ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて上記に詳説される
プロトコールに従って配列決定した。さらに、Ｘｈｏ Ｉレスキューされたプラ
スミドのＢｓｔＸＩ部分消化を実施し、自己連結させ、そして、ｐＢｓｔＫｓｔ
の右の境界を増幅する用に設計されたＴ７プライマー（配列番号２２）を用いて
配列決定した。
【０１８６】 配列決定に使用されたプライマーは、配列番号９および配列番号１６〜配列番
号２５として示される。
【０１８７】 配列決定により、４４３７ｂｐのＤＮＡ配列を同定した（図９Ａ−９Ｂ、配列
番号２６）。豊富でない核酸配列のデーターベースのＢａｓｉｃ ＢＬＡＳＴＮ
検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ
）を、図９Ａ−９Ｂに示されるヌクレオチド配列を用いてＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を介
して２０００年２月２９日に実施し、ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能な配列と
配列番号２６の核酸１〜４４３７との間に有意な配列同一性がないことが明らか
となった。
【０１８８】 ２つの読み取り枠を、「ＭＩＴ ｈｔｔｐ：／／ＣＣＲ−０８１．ｍｉｔ．ｅ
ｄｕ／ＧＥＮＥＳＣＡＮ」に見いだされるＧＥＮＥＳＣＡＮコンピュータープロ
グラムを用いてレスキューされた配列中で予想し、それぞれ、約１２４および８
５アミノ酸のポリペプチドをコードする遺伝子の存在が示された（それぞれ、図
１０Ａ、配列番号２７および図１０Ｂ、配列番号２８）。
【０１８９】 （配列列挙の表）
【０１９０】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、例示的なｐＳＫＩ１５ベクターの模式図である。
【図２】 図２は、活性化タグ付け技術による遺伝子の過剰発現に関与する工程の模式図
である。
【図３】 図３は、目的の性質に関連するタグ付けされた遺伝子の同定、同定された遺伝
子の特徴付けおよび標的作物への同定された遺伝子の再導入に関与する工程の模
式図である。
【図４】 図４は、２つの遺伝子上で同時に両方向へ作用する４×ＣａＭＶ ３５Ｓエン
ハンサーの模式図、および４×ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーを含む遺伝子構築
物を用いて形質転換された２５，０００個の植物のスクリーニング結果である。
【図５】 図５は、縦列の４Ａｌｕ１−ＥｃｏＲＶフラグメント（各々２０２ｂｐの長さ
、配列番号２）、イタリックで示されかつ各縦列Ａｌｕ−ＥｃｏＲＶ反復と連結
する、ＣａＭＶ配列のさらなる１２９ｂｐ（配列番号３）、および反復されかつ
下線で示されるさらなる７ｂｐ配列（配列番号４）を含む、ＡＣＴＴＡＧベクタ
ー（配列番号１）における使用のための４×ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー配列
を示し、ここで、Ａｌｕ１（ＡＧＣＴ）およびＥｃｏＲＶ（ＧＡＴＡＴＣ）に対
する制限部位は太字で示される。
【図６】 図６は、例示的なｐＡＧ３２０２の二元性プラスミドの模式図であり、このプ
ラスミドは、４×３５エンハンサーおよびＲＥ４プロモーターの制御下にあるｎ
ｐｔＩＩ選択マーカーを有するｐＳＫＩ骨格を有する。
【図７】 図７Ａは、野生型Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ植物由来の花に対して「Ｌ２３」と示さ
れる、例示的な活性化タグ付けＭｉｃｒｏ−Ｔｏｍ変異体由来の花の写真を示す
。 図７Ｂは、野生型Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ植物に対して「Ｌ２３」と示される、例
示的な活性化タグ付けＭｉｃｒｏ−Ｔｏｍ変異体植物の写真を示す。
【図８】 図８Ａおよび８Ｂは、３．７ｋｂおよび４．５ｋｂゲノム挿入フラグメントを
有する２つの異なるプラスミドの模式図であり、これらは、それぞれ、Ｘｈｏ
Ｉ（９Ａ）およびＨｉｎｄ ＩＩＩ（９Ｂ）消化のＬ２３ゲノムＤＮＡを用いた
プラスミドレスキューによって誘導された。
【図９】 図９Ａおよび９Ｂは、Ｌ２３におけるプラスミドレスキューによって得られた
４４３７ｂｐのＤＮＡ配列を示す。
【図１０】 図１０Ａは、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ変異体Ｌ２３からのプラスミドレスキューに
よって得られた４４３７ｂｐのＤＮＡ配列に基づく、１２４アミノ酸のポリペプ
チドに対する推定アミノ酸配列を示す。 図１０Ｂは、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ変異体Ｌ２３からのプラスミドレスキューに
よって得られた４４３７ｂｐのＤＮＡ配列に基づく、８５アミノ酸のポリペプチ
ドに対する推定アミノ酸配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マシューズ， ヘレナ アメリカ合衆国 オレゴン 97229， ポ ートランド， エヌ．ダブリュー．ジョセ フ コート 14546 (72)発明者 リュ， シン リャン アメリカ合衆国 オレゴン 97402， ユ ージェーン， ダブリュー． 16ティーエ イチ アベニュー 2061 (72)発明者 ワッゴナー， ウェンディ ジェイ． アメリカ合衆国 オレゴン 97223， テ ィガード， エス．ダブリュー． サマー クレスト ドライブ 11915 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD10 CD13 CD17 CG01 4B024 AA07 AA11 CA02 CA09 DA01 DA05 EA04 FA02 FA06 FA10 GA11 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ04 QQ13 QQ42 QR56 QR60 QR62 QR69 QS05 QS12 QS25 QS34

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 果実のなる植物において所望の形質と関連する遺伝子を同定
    するための方法であって、該方法は、以下： （ｉ）植物の細胞を植物細胞発現ベクターを用いて形質転換する工程であって
    、該発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、エンハンサー、選択可能なマーカ
    ーをコードするヌクレオチド配列の発現に効果的なプロモーターに作動可能に連
    結された該選択可能なマーカーをコードする配列、該選択可能なマーカーをコー
    ドするヌクレオチド配列に対する転写終了エレメント、およびＴ−ＤＮＡ配列を
    有し、ここで、該形質転換された細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
    ｉｆａｃｉｅｎｓの、支持細胞の非存在下における該植物由来の胚軸または苗条
    先端組織への、該選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を効果的に
    発現する様式での導入によるものである、工程； （ｉｉ）形質転換された植物細胞を、該形質転換された植物細胞が、非形質転
    換植物細胞に対して毒性である量の選択剤の存在下で増殖する能力によって選択
    する工程； （ｉｉｉ）形質転換された植物細胞を再生して、成熟植物を産生する、工程； （ｉｖ）所望の形質を有する植物を選択する工程；ならびに （ｖ）遺伝子発現を増強するように機能する前記されているエレメントによっ
    て転写が増強された遺伝子を、同定、単離および特徴付けする工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、以下： （ｖｉ）各単離された遺伝子に対して別々の異種遺伝子構築物を調製する工程
    ； （ｖｉｉ）該別々の異種遺伝子構築物を用いて植物を形質転換する工程であっ
    て、ここで、該単離された遺伝子の発現が、該植物中で増強される、工程； （ｖｉｉ）前記所望の形質を有する植物を選択する工程 をさらに包含する、方法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記遺伝子発現を
    増強するように機能するエレメントが、ＣａＭｖ ３５Ｓエンハンサーエレメン
    ト、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）プロモーター配列、ピーナッツ萎
    黄病線条カリモウイルス全長転写物（ＰＣＩＳＶＦＬｔ）配列およびミラビリス
    モザイクウイルス（ＭＭＶ）、プロモーター配列（配列番号８）からなる群より
    選択される、方法。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、前記ＣａＭＶ ３５Ｓエン
    ハンサーエレメントが、配列番号１として示される配列を有する、４×縦列の２
    重のＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーエレメントである、方法。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載の方法であって、前記ゴマノハグサモザイク
    ウイルス（ＦＭＶ）プロモーター配列が、配列番号５として示されるプロモータ
    ー配列か、または配列番号６として示されるエンハンサー配列である、方法。
  6. 【請求項６】 請求項３に記載の方法であって、前記ピーナッツ萎黄病線条
    カリモウイルス全長転写物（ＰＣＩＳＶＦＬｔ）配列が、配列番号７として示さ
    れるエンハンサー配列である、方法。
  7. 【請求項７】 請求項３に記載の方法であって、前記ミラビリスモザイクウ
    イルス（ＭＭＶ）プロモーター配列が、配列番号８として示されるプロモーター
    配列である、方法。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の方法であって、前記選択可能なマーカーを
    コードするヌクレオチド配列が、該マーカーを発現する形質転換された細胞に対
    して除草剤耐性を与えるポリペプチドをコードする、方法。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、前記選択可能なマーカーを
    コードするヌクレオチド核酸配列が、抗生物質耐性遺伝子をコードし、該遺伝子
    は、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフ
    ェニコール、アンピシリンおよびテトラサイクリンからなる群より選択される抗
    生物質に対して耐性を与える、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法であって、ここで、前記抗生物質が
    、カナマイシンである、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、前記果実のなる植物が、
    萎縮植物である、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の方法であって、前記萎縮植物が、トマ
    ト植物である、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、前記形質転換される細
    胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓの、前記萎縮トマ
    ト植物由来の胚軸組織への導入によるものである、方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の方法であって、前記形質転換される細
    胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓの、前記萎縮トマ
    ト植物由来の苗条先端組織への導入によるものである、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１に記載の方法であって、前記所望の形質が、ビタ
    ミン、ミネラル、元素、アミノ酸、炭水化物、脂質、窒素塩基、イソプレノイド
    、フェニルプロパノイドおよびアルカロイドのレベルの変化からなる群より選択
    される、植物ならびに果実の生化学的改変である、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載の方法であって、前記所望の形質が、以下
    ：真菌病原体に対する増加した耐性、細菌病原体に対する増加した耐性、ウイル
    ス病原体に対する増加した耐性、昆虫に対する増加した耐性、改変された花の大
    きさ、改変された花の数、改変された花の色素沈着、改変された花の形、改変さ
    れた葉の数、改変された葉の色素沈着、改変された花の形、改変された種子の数
    、葉および花の改変されたパターン、葉および花の改変された分布、節の間の改
    変された幹の長さ、改変された根の質量、増加した乾燥耐性、増加した塩耐性お
    よび増加した抗生物質耐性からなる群より選択される、果実のなる植物の特定の
    形質である、方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１に記載の方法であって、前記植物細胞発現ベクタ
    ーが、ｐＳＫＩ１５、ｐＡＧ３２０１、ｐＡＧ３２０２およびｐＡＧ４２０１か
    らなる群より選択される、方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１に記載の方法によって同定された遺伝子の増強さ
    れた発現を含む、果実のなるトランスジェニック植物であって、該遺伝子が、小
    葉の大きさ、葉の大きさ、葉の色、葉の形、小葉の数、葉の数、節間の長さ、植
    物の高さ、花の器官の特徴および果実の特徴からなる群より選択される形態学的
    な特徴と関連する、植物。
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