KR100443490B1 - 토바코 레트로트랜스포손을 이용한 유전자 파열 방법 - Google Patents

토바코 레트로트랜스포손을 이용한 유전자 파열 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 내로 레트로트랜스포손을 도입시키고, 형질전환된 식물을 생성하기 위해 레트로트랜스포손이 도입된 식물을 배양시키고, 재생시키는 단계로 구성된, 토바코 레트로트랜스포손을 이용하여 식물 내에서 유전자를 파열시키기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

토바코 레트로트랜스포손을 이용한 유전자 파열 방법{Gene disruption method by using tobacco retrotransposon}
트랜스포즈가능한(transposable) 요소에 의한 유전자 파열은 유용한 유전자를 분리하고, 그의 기능을 분석하기 위한 중요한 수단이다. 아라비돕시스는 T-DNA 및 트랜스포손이 삽입 요소로 사용되는 모델 식물로 연구되어왔다.
T-DNA의 경우 Ti 플라스미드가 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 식물 내로 도입될 때 Ti 플라스미드의 일부분인 T-DNA 유전자가 식물 염색체 내로삽입되어 유전자를 파열시킨다. 그러나 T-DNA를 이용한 유전자 파열 실험에서 T-DNA는 성공적으로 통합되지 않고 T-DNA가 50∼60%의 돌연변이 내에서 태그(tag)로서 실질적인 기능을 하지 않게 된다.
트랜스포손의 경우 유전자 파열은 형질전환의 과정에서 또는 트랜스포지션(transposition)의 하위 과정에서 발생한다. 트랜스포손은 동물, 효모, 박테리아 및 식물의 게놈 내에서 편재하는 돌연변이유발성 유전자이다. 트랜스포손은 그들의 트랜스포지션의 메카니즘에 따라 2개의 카테고리로 분류된다. 클래스Ⅱ의 트랜스포손은 복제없는 DNA의 형태로 트랜스포지션을 행한다. 클래스Ⅰ의 트랜스포손은 또한 레트로트랜스포손이라고 불린다. 레트로트랜스포손은 중간체로서 RNA를 통해 복제적 트랜스포지션을 행한다.
클래스Ⅱ 트랜스포손의 예는 옥수수(Zea mays)의 Ac/Ds, Spm/dSpm 및 Mu 요소(Fedoroff, 1989, Cell 56:181-191; Fedoroff et al., 1983, Cell 35:235-242; Schiefelbein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4783-4787) 및 안티리눔(Antirrhinum)(Antirrhinum majus)의 Tam 요소(Bonas et al., 1984, EMBO J., 3:1015-1019)를 포함한다. 클래스Ⅱ 트랜스포손은 트랜스포손 태깅에 의한 유전자 분리에 널리 사용된다. 이러한 기술은 트랜스포손의 특성을 이용한 것이다. 트랜스포손이 게놈 내에서 트랜스포즈(transpose)하고, 특정 유전자 내로 들어가면 이러한 유전자는 물리적으로 또는 구조적으로 변형되어 그 유전자에 의해 조절되는표현형이 변화된다. 이러한 표현형적 변화가 검출될 수 있는 경우 영향받은 유전자는 분리된다(Bancroft et al., 1993, The Plant Cell, 5:631-638; Colasanti et al., 1998, Cell, 93:593-603; Gray et al., 1997, Cell, 89:25-31; Keddie et al., 1998, The Plant Cell, 10:877-887; Whitham et al., 1994, Cell, 78:1101-1115). 그러나 트랜스포손이 DNA 트랜스포손 태깅 동안 삭제된 태그되지 않은 돌연변이가 보고되었다(Bancroft et al., 1993, The Plant Cell, 5:631-638). 트랜스포손은 염색체의 삽입 사이트에 근접하여 트랜스포즈되는 경향이 있다(Bancroft and Dean, 1993, Teor. Appl. Genet, 86:585-588). 모든 유전자를 포함하는 파열 라인(line)을 생성하기 위해 염색체 내에 무작위로 트랜스포즈될 수 있는 트랜스포손이 요구된다. 그러나 이러한 요소는 특정한 타겟 사이트 내로 통합된다. 상기-기술된 요소와 다른 요소를 이용한 유전자 파열 시스템이 요구된다.
클래스Ⅰ 트랜스포손은 처음부터 증명되었고, 초파리 및 효모 내에서 특성화되었다. 최근의 연구는 레트로트랜스포손이 식물 게놈 내에서 편재하고, 우세하다는 것을 나타내었다(Bennetzen, 1996, Trends Microbiol., 4:347-353; Voytas, 1996, Science, 274:737-738). 이는 대부분의 레트로트랜스포손이 통합가능하나 비-트랜스포즈가능한 유니트(unit)라는 것을 나타낸다. 레트로트랜스포손은 양쪽 말단에서 앞 방향으로 LTRs을 지니고, gag 단백질을 인코딩하는 구역은 2개의 LTRs 사이에서 바이러스-유사한 입자 및 역전사효소 pol 단백질을 구성한다. LTR 프로모터로부터 전사된 RNA는 pol 단백질에 의해 숙주 염색체 내로 삽입될 cDNA 내로역-전사된다. 레트로트랜스포손의 트랜스포지션은 레트로트랜스포손 그 자체에 의해 인코드된 단백질에 의해 수행되고, 삭제 메카니즘은 없다. 따라서 레트로트랜스포손은 유전자 파열 기술로서 우수하다.
최근에 일부 이러한 타입의 레트로트랜스포손이 상처, 병원균 공격 및 배양과 같은 스트레스 조건 하에서 활성화된다(Grandbastien, 1998, Trends in Plant Science, 3:181-187; Wessler, 1996, Curr. Biol., 6:959-961; Wessler et al., 1995, Curr. Opin. Genet. Dvelp., 5:814-821). 예를 들어 이러한 스트레스 조건 하의 활성화는 토바코 Tnt1A 및 Tto1의 레트로트랜스포손(Pouteu et al., 1994, Plant J., 5:535-542; Takeda et al., 1998, Plant Mol. Biol., 36:365-376) 및 쌀 Tos17의 레트로트랜스포손(Hirochika et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7783-7788) 내에서 발견되었다.
쌀에서 쌀 레트로트랜스포손 Tos17은 배양에 의해 활성화되고, 유전자 내로 트랜스포즈될 수 있다(Hirochika et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7783-7788). 따라서 Tos17은 쌀의 대량의 유전자 파열을 위한 수단으로 이용되었다.
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 내에서는 트랜스포지션 활성을 지닌 어떤 레트로트랜스포손도 분리되지 않았다. Grandbastien et al.,에 의해 분리된 토바코 레트로트랜스포손 Tnt1은 형질전환에 의해 아라비돕시스 내로 Tnt1을 도입시키는 과정 내에서 트랜스포즈된다고 보고되었다. 그러나 Tnt1이 유전자 내로 트랜스포즈될 수 있는지 없는지는 명백하게 설명되지 않았다(Lucas et al., 1995, EMBO J., 14:2364-2393). 토바코 레트로트랜스포손 Tto1은 아라비돕시스의 형질전환 과정에서 트랜스포즈된다고 알려졌다(Hirochika and Kakutani, in preparation). Tto1은 또한 배양에 의해 쌀 내로 트랜스포즈되고(Hirochika et al., 1996, Plant Cell, 8:725-734), Tto1이 광범위한 숙주 내에서 트랜스포즈가능하다는 것을 나타낸다. 그러나 트랜스포지션의 빈도는 라인(line) 별로 다르고, 트랜스포지션의 높은 빈도가 항상 재생가능한 것은 아니다.
발명의 요약
토바코 레트로트랜스포손 Tto1은 토바코 레트로트랜스포손 Tto1이 트랜스포즈되어 아라비돕시스 내에서 유전자 파열을 유발할 수 있는지 여부가 연구되었다. Tto1의 낮은 복제수를 지닌 아라비돕시스가 배양되었고, 재생되었다. Tto1의 전사 수준 및 Tto1 타겟 사이트의 측면에 위치한 서열이 조직적으로 분석되었다. 그 결과로 Tto1은 배양된 세포 내로 트랜스포즈되었고, 클론된 세포는 형질전환된 식물 내로 재생되었다. Tto1의 측면에 위치한 서열은 증폭되었고, 서열화되고 상동성 분석되었다. 그 결과로 Tto1이 다양한 유전자 내로 삽입되었다는 것을 인지되었다.
상기-기술된 결과는 Tto1이 활성적인 레트로트랜스포손을 지닌다고 믿어지지 않는 아라비돕시스 내에서의 트랜스포손 태깅에 의한 유전자 분리를 위한 신규한 수단을 제공한다는 것을 나타낸다. 본 발명은 아라비돕시스 내에서의 레트로트랜스포손을 이용한 유전자 파열 및 유전자 분리의 가능성을 나타내는 첫 번째 연구이다. 또한 본 발명은 트랜스포손 태깅에 의한 유전자 파열 및 유전자 분리가 이형적이나 내생적이지 않은 레트로트랜스포손을 이용하여 수행될 수 있다는 것을 나타내었다.
본 발명은 : 식물 내로 레트로트랜스포손을 도입시키고; 형질전환된 식물을 생성하기 위해 레트로트랜스포손이 도입된 식물을 배양시키고, 재생시키는 단계로 구성된, 토바코 레트로트랜스포손을 이용한 식물 내에서 유전자를 파열시키기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 레트로트랜스포손은 Tto1이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 식물은 토바코 외의 식물이다. 바람직하게는 식물은 농작물 식물이다. 바람직하게는 식물은 아라비돕시스이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 레트로트랜스포손이 도입된 식물은 레트로트랜스포손의 적은 복제수를 지닌다. 적은 복제수는 1 내지 5개의 복제, 바람직하게는 1 내지 3개의 복제, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개의 복제, 가장 바람직하게는 하나의 복제를 의미한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 방법은 : 형질전환된 식물로부터 자손 식물을 수득하고; 식물체 내로 자손 식물의 조직을 배양하고 재생하는 단계로 더욱 구성된다.
본 발명은 트랜스포손(transposon) 태깅(tagging)에 의한 유전자 파열 및 유전자 분리에 관한 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명은 토바코 레트로트랜스포손(retrotransposon)을 이용한 이형적 식물(즉 아라비돕시스(Arabidopsis)) 내에서의 유전자 파열에 관한 것이다.
도 1은 pBITto1(-36)의 구조를 나타내는 도식이다.
도 2는 아라비돕시스 내의 Tto1 트랜스포지션의 DNA 겔 블럿(gel blot) 분석을 나타내는 사진이다. 별도의 재생된 식물로부터 분리된 게노믹 DNA 1.0㎍이 XbaI과 함께 분해되었고, 전기영동이 수행되었다. 블럿은 Tto1의32P-표지된 0.3 kb XbaI/PatI 단편(4284∼4688에 상응함)으로 프로브(probe)되었다. 원래의 T-DNA 복제에 상응하는 밴드(band) 및 선형 분자에 상응하는 밴드가 나타나 있다. 레인 1 내지 12는 잎 외식편(explant)으로부터 재생된 식물로부터 분리된 DNA를 나타내고, 레인 13 내지 24는 뿌리 외식편으로부터 재생된 식물로부터 분리된 DNA를 타나낸다.
도 3은 Tto1의 트랜스포지션 타겟 사이트의 지도화를 나타내는 도식이다. Tto1 삽입을 지닌 지도화된 유전적 로커스(locus)는 RI 지도로 정렬되고(Lister and Dean, Plant J. 4:745-750 1993), 화살표에 의해 표시된다. 각각의 화살표는 개별적인 삽입 이벤트(event)를 나타낸다. 염색체 길이의 규모는 오른쪽에 나타나 있다. 일부 염색체 마커(marker)는 지도 내에 나타나 있다.
본 발명에 따라 토바코 레트로트랜스포손을 이용하여 식물 내에서 유전자를 파열시키기 위한 방법이 제공된다.
여기서 사용된 바와 같은 "유전자를 파열시킨다"라는 용어는 DNA를 세포 내로 도입시키고, 특정한 타겟 유전자 내로 돌연변이를 도입시키는 트랜스포지션에 의해 수득된 재조합 세포를 스크린하고 유전자를 파열시키는 것을 나타낸다. 따라서 본 발명의 유전자 파열을 달성하기 위해 레트로트랜스포손은 식물 세포 내로 간단히 도입될 뿐만 아니라 레트로트랜스포손인 식물 세포의 게놈 내로 통합되어야 한다. 여기서 사용된 바와 같은 "트랜스포즈"라는 용어는 통합된 레트로트랜스포손이 게놈의 다른 사이트 내로 더욱 통합되는 것을 나타낸다.
여기서 사용된 바와 같은 토바코 레트로트랜스포손 바람직하게는 Tto1이다. Tto1은 1338 아미노산의 ORF를 지닌 Ty1/복제의 레트로트랜스포손이고, 이는 5.3 kb의 전체 길이를 지니고, 각각의 말단에서 574 bp LTR을 지닌다. Tto1은 토바코 내에서 배양, 상처, 쟈스모닉 애시드(jasmonic acid) 및 감염과 같은 스트레스에 의해 활성화된다. Tto1의 트랜스포지션은 배양에 의해 토바코 내에서 활성화된다고 알려졌다. 본 발명에서 Tto1은 토바코에 이형적이 식물인 아라비돕시스 내에 트랜스포즈되었고, 유전자 파열이 아라비돕시스 내에서 발생하였다.
여기서 사용된 바와 같은 "식물"이라는 용어는 유전자가 도입될 수 있는 식물을 나타낸다. "식물"은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 이러한 식물은 아라비돕시스(모델 식물) 및 농작물 식물을 포함한다. 농작물 식물의 예는 쌀, 호밀, 옥수수, 감자, 레이프(rape)(Brassica), 토바코 및 대두를 포함한다.
본 발명에 따른 토바코 레트로트랜스포손을 이용하여 유전자를 파열시키기 위한 방법은 : 식물 내로 레트로트랜스포손을 도입시키고; 레트로트랜스포손이 도입된 식물을 배양시켜 식물이 재생되도록 하고 이에 따라 형질전환된 식물을 생성하는 단계로 구성된다.
레트로트랜스포손은 당 분야의 숙련자에게 알려진 방법을 이용하여 식물체내로 도입된다. 잘-알려진 방법의 예는 아라비돕시스에 의해 매개된 방법 및 세포 내로 유전자를 직접 도입시키는 방법을 포함한다. 아그로박테리움에 의해 매개된 방법의 예는 Nagel et al.의 방법이다(FEMS Microbiol. Lett., 67:325(1990)). 이러한 방법에서 예를 들어 발현 벡터는 먼저 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 아그로박테리움 내로 도입되고, 그 후 형질전환된 아그로박테리움은 Plant Molecular Biology Mannual(S.B. Gelvin et al., Academic Press Publishers) 내에 기술된 방법에 따라 식물 세포 내로 도입된다. 유전자를 세포 내로 직접 도입시키기 위한 알려진 방법의 예는 일렉트로포레이션 방법 및 유전자 총(gene gun) 방법이다.
유전자가 도입된 세포는 하이그로마이신(hygromycin) 저항성과 같은 약물 저항성에 의해 선택되어 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 식물체 내로 재생된다. 식물체 내로의 재생을 위한 배양 배지로서 일반적으로 당 분야에서 사용되는 고형 배지 또는 액체 배지가 사용된다. 고형 배지 내에서의 배양의 경우 캘러스(callus), 슈트(shoot) 및 뿌리가 유도를 위한 배지 내의 식물 호르몬(옥신(auxin) 및 시토키닌(cytokinin)의 양을 조절함으로서 유도된다. 액체 배지를 이용한 현탁액 배양의 경우 캘러스는 외래 배(embryo) 내로 재생되고, 그 후 더욱 완벽한 식물체를 완성한다. 외래 배를 생성하기 위해 하이포코틸(hypocotyl) 및 잎과 같은 조직은 처음에 옥신-함유 배지 내에서 배양된다. 황색 미립성 캘러스(EC)는 생장하고, 서브클론(subclone)이 더욱 진행될 수있다. 그 후 캘러스는 외래 배가 생성되는 옥신이 없는 배지로 트랜스퍼(transfer)된다. 상기-기술된 유도 배지의 예는 일반적인 고형 또는 액체 Murashige-Skoog 기초 배지(Murashige T, Skoog F. 1962, Physiol. Plant. 15:473-497)를 포함한다. 이러한 식물 호르몬으로서 호르몬 활성을 지닌 인공적으로-합성된 화합물은 자연적으로-발생한 호르몬 보다 더 바람직하다. 식물체 내로의 재생에 사용된 배지의 바람직한 예는 Valvekens et al., PNAS, 85:5536-5540(1998)에 기술된 재생 배지를 포함한다. 배양은 미리결정된 조건 즉, 4주 동안 22℃의 온도 하에서 수행된다.
그 후 재생된 식물체는 레트로트랜스포손의 트랜스포지션에 대해 분석된다. 이러한 분석에 사용되는 기술의 예는 DNA를 측정하기 위한 서던(Southern) 하이브리디제이션(hybridization) 및 RNA를 측정하기 위한 노던(Northern) 하이브리디제이션을 포함한다. 분석에 있어서 예를 들어 역 방향으로 인트론(intron)을 지닌 마커 유전자가 전사에 역 방향으로 통합되는 변형된 레트로트랜스포손을 이용한 기술이 사용된다. 상기 분석은 또한 재생된 식물을 번식시킴으로서 수득된 자손 식물에 대해서도 수행될 수 있다. 이는 여기서 사용된 바와 같이 Tto1이 멘델(Mendel)의 법칙으로 다음 세대에 안정하게 넘어가기 때문이다. Tto1의 트랜스포지션은 Tto1의 도입에서 형질전환된 식물(현재 세대)의 생성까지의 동안에 발생한다 .
Tto1의 트랜스포지션은 토바코 내에서의 배양에 의해 활성화된다고 알려졌다(Hirochika, EMBO J. 12:2521-2528(1993)). 따라서 아라비돕시스 내에서 Tto1은 트랜스포지션이 배양에 의해 활성화되었는지 여부에 대해 측정되었다. 트랜스포지션은 많은 트랜스포지션 복제수를 지닌 형질전환된 식물 내에서 높게 활성화된다고 추정되어 왔었다. 상기 추측과는 반대로 트랜스포지션의 높은 활성 수준은 트랜스포지션을 지니지 않거나 또는 거의 지니지 않는 형질전환된 식물이 사용될 경우에만 관찰되었다.
본 발명에 따른 유전자 파열에 이용된 식물은 레트로트랜스포손의 적은 복제수를 지닌다. 여기서 사용된 바와 같은 "적은 복제수"라는 용어는 1 내지 5개의 복제, 바람직하게는 1 내지 3개의 복제, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개의 복제, 가장 바람직하게는 하나의 복제를 나타낸다. 적은 복제수를 지닌 형질전환된 식물은 선택되고, 그 후 조직 배양 내에서 재생되어 유전자 파열을 수행하는 트랜스포지션을 효과적으로 생성한다. 스크리닝은 상기-기술된 분석을 이용하여 수행된다.
파열된 유전자를 분석하기 위해 트랜스포즈된 레트로트랜스포손은 레트로트랜스포손의 측면에 위치한 서열을 복구하는 재생된 식물 내에서 프로브된다. 측면에 위치한 서열은 PCR에 의해 증폭된다. PCR 증폭 방법은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다(PCR Technology: Principles and Applications for DNAAmplification, Edited by HA Erlich, Freeman Press, New York, NY(1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Edited by Innis, Gelfland, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA(1990); Mattila et al.(1991) Nucleic Acids Res. 19:4967; Eckert, K.A. and Kunkel, T.A.(1991) PCR Methods and Applications 1:17; PCR, McPherson, Quirkens, and Taylor, IRL Press, Oxford, 이들은 참고문헌에 포함되어있다). 본 발명에 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로 여기에 기술된 방법에 의해 수득된다. 또한 본 발명에 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 여기 공개된 서열에 기초한 화학적 합성에 의해 수득된다. 예를 들어 본 발명에 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 제조사에 의해 제공된 설명서에 따라 올리고뉴클레오타이드 합성기(Applied Bio Systems에 의해 제조됨)을 이용하여 합성된다. 그 후 측면에 위치한 서열은 당 분야에서 잘-알려진 방법을 이용하여 서열화된다. 결정된 서열은 당 분야에서 잘-알려진 상동성 검색 프로그램을 이용하여 증명된다.
본 발명의 방법에 따라 파열되는 유전자는 하기의 표 1에 예시되었으나 이에 한정적인 것은 아니다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 본 발명의 방법은 : 상기-기술된 형질전환된 식물로부터 자손 식물을 수득하고; 식물체 내로 재생되는 자손 식물의 조직을 배양하는 단계로 더욱 구성된다. 상기에 기술된 바와 같이 레트로트랜스포손 Tto1은멘델의 법칙으로 유전되기 때문에 트랜스포즈된 레트로트랜스포손을 지닌 종속 식물로의 다음 세대교번의 식물은 유전자 파열을 수행하는데 이용된다.
Tto1은 활성적인 레트로트랜스포손을 지닌다고 믿지 않는 아라비돕시스 내에서의 트랜스포손 태깅에 의한 유전자 분리를 위한 수단에 이용될 수 있다고 알려졌다. 레트로트랜스포손을 이용한 배양 및 재생에 의해 개별적인 유전자 파열 라인을 수득하는 방법은 쌀의 Tos12와 같은 내생적 레트로트랜스포손에 효과적인 것으로 알려져 있다. 본 발명은 이형적 레트로트랜스포손에 적용가능한 방법을 처음으로 설명하였다.
또한 DNA 타입 트랜스포손과 달리 레트로트랜스포손은 염색체 내에 무작위로 트랜스포즈될 수 있다고 알려졌다. 이러한 시스템을 이용하여 아라비돕시스의 모든 유전자를 포함하는 파열 라인은 효과적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 유전자 파열 방법은 아라비돕시스 뿐만 아니라 유전자가 도입될 수 있는 어떤 식물에도 적용가능하다.
상기에 기술된 바와 같이 레트로트랜스포손을 이용한 유전자 파열 방법이 성립되면 식물 내의 유전자의 기능적 분석 및 알려지지 않은 유전자의 분리 가능성이 확대된다.
하기에서 본 발명은 실시예에 의해 기술될 것이다. 하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위함이다. 본 발명은 실시예에 한정적인 것은 아니다.
(실시예 1) 이원(binary) 플라스미드 pBITot1(-36)의 구조(construction) 및 아그로박테리움 내로의 도입
도 1은 pBITot1(-36)의 구조를 나타낸다. 이전에 보고된 바와 같이 Tto1의 클론인 pSKTto1(-36)의 5' 부분(Hirochika et al., 1996, Plant Cell, 8:725-734)이 HidⅢ 및 PstⅠ으로 삭제되었고, 3' 부분은 PstⅠ 및 XhoⅠ으로 삭제되었다. 결과적 Tot1 단편은 HindⅢ 및 SalⅠ으로 분해된(Akama et al., Plant Cell Rep. 12:7-11(1992)) 이원 벡터 pB1101-Hm 내로 삽입되어 Tto1이 통합된 이원 벡터 pBITot1(-36)를 구조하였다. 이렇게-구조된 플라스미드는 일렉트로포레이션에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA101 균주 내로 도입되었다(Hood et al., J. Bacteriol. 168:1291-1301(1986)). Tto1이 도입된 균주는 10g/L의 박토 트립톤(Bacto Trypton)(Difco에 의해 제조됨), 5g/L의 박토 효모 추출물(Difco에 의해 제조됨), 10g/L의 NaCl, 15g/L의 박토 한천(Difco에 의해 제조됨), 황산카나마이신 및 하이그로마이신 B(Sigma)를 포함한 50㎍/ml의 카나마이신 및 50㎍/ml의하이그로마이신(pH 7.0)을 함유하는 LB 한천 배지 내에서 스크린되었다.
(실시예 2) 식물의 감염
아라비돕시스 생태형 Wessilewskija(WS)는 하기의 모든 실험에 사용되었다. 아라비돕시스의 뿌리 또는 하이포코틸은 Akama et al.,의 방법(Plant Cell Rep., 12:7-11(1992))에 따라 아그로박테리움으로 감염되었다. 이러한 실험에서 사용된 배지는 Valvekens et al., PNAS, 85:5536-5540(1988) 내에 기술되어 있다. 간단히, 불임으로 생장된 아라비돕시스 식물의 하이포코틸 및 뿌리의 조각은 CIM배지(캘러스 유도 배지, 3.1g/L의 Gamborg's B5, 20g/L의 포도당, 0.5g/L의 MES-KOH(pH 5.7), 0.5mg//L의 2,4-D 및 0.05mg/L 키네틴(kinetin)를 포함하고, 5g/L의 Gellan Gum으로 응고됨) 내에서 10일 동안 22℃에서 배양되었다(광조건 하에서 16시간 동안 및 암조건 하에서 8시간 동안). 그 후 하이포코틸 및 뿌리 조각은 아그로박테리움으로 감염되었다. 배지는 새로운 CIM으로 대치되었다. 하이포코틸 및 뿌리 조각은 3일 동안 아그로박테리움으로 동시-배양되었다.
아그로박테리움이 세척되어 나간 후, 상기-기술된 뿌리 또는 하이포코틸 조각은 SIM(슈트 유도 배지)(3.1g/L의 Gamborg's B5, 20g/L의 포도당, 0.5g/L의 MES-KOH(pH 5.7), 0.15mg/L의 IAA(인돌(indole)-3-아세트산), 5mg/L의 3-iPN6-(2-이소펜테닐(isopentenyl)아데닌(adenine)을 포함하는 50㎍/ml의 하이그로마이신을 함유하고, 5g/L의 Gellan Gum으로 응고됨) 내에서 4주 동안 22℃에서 배양되었다(광조건 하에서 16시간 동안 및 암조건 하에서 8시간 동안). 단편은 매주 새로운 배지로 트랜스퍼되었고, 배양이 지속되었다. 그 결과로서 형질전환된 식물(T0)이 수득되었다. 재생된 슈트는 GM(발아 배지)(4.4g/L의 Murashige and Skoog Salt, 10g/L의 슈크로즈(sucrose) 및 0.5g/L의 MES-KOH(pH 5.7)를 포함하고, 5g/L의 Gellan Gum으로 응고됨)으로 트랜스퍼 되었고, 배양되었다. 그 후 슈트는 RIM(뿌리 유도 배지)(4.4g/L의 Murashige and Skoog Salt, 10g/L의 슈크로즈, 0.5g/L의 MES-KOH(pH 5.7) 및 20㎍/ml의 IBA(인돌-3-부틸산)를 포함하고, 5g/L의 Gellan Gum으로 응고됨) 내로 트랜스퍼 되었고, 배양되었다.
(실시예 3) 서던 하이브리디제이션에 의한 트랜스포지션의 확인
DNA는 세틸트리메틸암모니움브로마이드 (cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)) 침전 방법(Murray and Thompson, Nucleic Acids Res. 8:4321-4325(1980))을 이용하여 실시예 2에서 수득된 형질전환된 식물로부터 준비되었다. 분리된 DNA는 제한효소 EcoRV로 분해되었고, 아가로즈 겔 전기영동이 행해졌다. DNA는 나일론(nylon) 멤브레인(membrane)으로 트랜스퍼되었다. 플라스미드 pSKTto1 (-36)으로부터 준비된 Tto1 구역으로부터 유도된 DNA 단편은32P-CTP로 표지되었고,Hirochika, EMBO J., 12:2521-2528(1993) 내에서 기술된 바와 같이 서던 하이브리디제이션이 행해졌다. 단편은32P-CTP로 표지된 하이그로마이신-저항성 유전자를 이용하여 서던 하이브리디제이션에 의해 T-DNA의 복제수가 측정되었다(Multiprime DNA labelling system, Amersham Pharmacia Biotech)(Hirochika, EMBO J., 12:2521-2528(1993)).
트랜스포지션이 발생하면 Tto1의 복제수는 도입된 유전자의 복제수 보다 더 많아질 것이라고 추정되었다. 분석 결과는 트랜스포지션이 없는 것에서부터 15개의 트랜스포즈된 복제수를 지닌 형질전환된 식물이 수득되었음을 나타낸다.
형질전화된 식물의 다음 세대(T1)가 유사하게 분석되었다. 그 결과로 Tto1 서열이 멘델의 법칙으로 다음 세대로 유전되었고, 트랜스포지션이 발생하지 않았음을 나타내었다. 이는 형질전환된 식물(T0) 내에서 관찰된 Tto1 트랜스포지션이 형질전환된 식물의 생성 과정에서 발생한다는 것을 나타낸다.
(실시예 4) 배양에 의한 트랜스포지션의 활성화
Tto1이 토바코 내에서 배양에 의해 활성화된다고 알려져 있다(Hirochika, EMBO J., 12:2521-2528(1993)). 따라서 본 실시예에서 배양에 의한 Tto1 트랜스포지션의 활성화가 측정되었다.
아그로박테리움 감염의 단계를 제외한 실시예 2에 기술된 방법을 이용하여 불임으로 생장된 형질전환된 식물(T2)의 잎 및 뿌리 조각이 배양되어 298 재생된 식물체(R0)를 수득하였다. 이러한 결과 식물은 화분에 심어졌다. 또한 동시에 식물은 DNA 추출을 위해 모아졌다. 종자는 255 재생된 식물체로부터 수득되었고, 잔여 식물체는 불임이었다. DNA는 실시예 3과 유사한 방식으로 R0 식물의 슈트로부터 준비되었다. 그 후 Tto1의 트랜스포지션 활성(복제수의 증가)를 측정하기 위해 서던 하이브리디제이션이 수행되었다.
도 2는 Tto1의 하나의 복제가 도입된 형질전환체(T1)에 이은 T2 세대인 묘목의 잎 및 뿌리를 이용한 실험의 결과를 나타낸다. 트랜스포지션의 높은 수준의 활성화는 큰 트랜스포지션 복제수를 지닌 형질전환된 식물 내에서 발생한다고 추정되어 왔다(나타내지 않음). 이러한 추정과는 대조적으로 트랜스포지션의 높은 수준의 활성화는 트랜스포지션을 지니지 않은 형질전환된 식물이 이용되는 경우에만 관찰되었다(도 2).
(실시예 5) 유전자 파열의 분석
DNA는 Tto1 트랜스포지션이 배양에 의해 활성화된 실시예 4 내에서 증명된 재생된 식물로부터 준비되었고, 복제수는 실시예 3 내에 기술된 CTAB 방법에서 증가되었다. 이러한 DNA는 Tto1의 측면에 위치한 서열을 TAIL-PCR에 의해 증폭시키는 주형으로서 사용되었다. 반응 조건 및 써말 사이클링 세팅(thermal cycling setting)은 기술된 바와 같다(Liu et al., Plant J. 8:457-463(1995)). 간단히 LA-Taq(Takara Shuso)가 Taq 중합효소로 사용되었다. Tto1-특이적 프라이머의 서열은 하기와 같았다 :
Tto1-R1, 5'-TGGATATGAATAGTGCCCGTATGG-3'(아웃사이드 네스티드(outside nested) 프라이머 (Tto1의 652∼629에 상응함);
Tto1-R1, 5'-TACTCTAACCAAAGCTCTGATACC-3'(인사이드 네스티드(inside nested) 프라이머 (Tto1의 601∼578에 상응함)
더욱이 3개의 다른 정해지지 않은 프라이머가 사용되었다. 서열은 하기와 같았다 :
AD1, 5'-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3';
AD2, 5'-GTNCGA(G/C)(A/T)CANA(A/T)GTT-3';
AD3, 5'-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3'
두 번째 TAIL-PCR 생성물은 1.2% 낮은-녹는점 아가로즈 겔을 이용한 전기영동에 의해 분리되었다(SeaPlaque GTC, FMC, Rockland, ME). PCR 생성물은Qiaquick 겔 추출 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용한 아가로즈 겔 틴 스트립(thin strip)으로부터 정제되었다. 정제된 생성물은 큰 염색 종결자 사이클 서열화 반응 키트(Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit)(Perkin Elmer/Applied Biosystems, Foster City, USA)를 이용한 ABI 377 DNA 서열기(Perkin Elmer/Applied Biosystems)로 직접 서열화되었다. 사용된 서열화 프라이머는 하기와 같다 :
Tto1-R1, 5'-CTCACTAAGGAGAGTTGCATC-3'(Tto1의 69∼49에 상응함)
상동성 검색은 Tto1의 측면에 위치한 서열에 대해 BLAST(Altrschal et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997))를 이용하여 수행되었다. 그 결과는 하기의 표 1에 특별히 나타나 있다.
(표 1)
Tto1의 트랜스포지션 사이트의 상동성 검색 및 지도화
표 1에서 Tto1은 다양한 유전자 내로 삽입되었음이 확인되었다.
(실시예 6) Tto1 트랜스포지션의 타겟 사이트의 지도화
BLAST를 이용한 상동성 분석은 Tto1이 분석된 날짜가 기입되어야 하는 다양한 서열 내로 삽입되었음을 나타내었다. 일부 서열은 염색체 상에서 지도화되었다. 이러한 정보에 기초한 Tto1의 포인트 타겟 사이트를 지도화하는 것이 가능하다(도 3). 도 3에 나타난 바와 같이 토바코 레트로트랜스포손 Tto1은 Tto1이 염색체 내에 무작위로 트랜스포즈될 수 있다는 점에서 옥수수 트랜스포손과는 다르다. Tto1이 세 번째 염색체 상에서 지도화되는 경우는 없고, 이는 데이터베이스가 세 번째 염색체의 염기 서열에 대한 정보를 거의 갖고 있지 않기 때문이다. *표시는 다수의 트랜스포지션이 동일한 BAC 클론의 염기 서열 내에서 증명된 사이트를 나타낸다.
상기-기술된 실시예에서 본 발명의 다양한 관점 및 본 발명의 특이적인 올리고뉴클레오타이드가 준비되는 방법이 나타나 있고, 기술되어 있다. 본 발명은 이들에 한정적인 것은 아니다.
트랜스포손 태깅에 의한 유전자 파열 및 유전자 분리를 위한 신규한 수단이 활성적인 레트로트랜스포손이 존재하지 않는 것으로 여겨지는 아라비돕시스에 대해 제공된다. 배양에 의한 개별적 유전자 파열 라인을 수득하고, 레트로트랜스포손을 이용한 재생 방법이 이형적 레트로트랜스포손에 적용가능하다고 발견되었다. 본 발명의 유전자 파열 방법은 아라비돕시스 뿐만 아니라 유전자가 도입될 수 있는 어떤 식물에도 적용가능하다.
본 발명에 사용된 레트로트랜스포손 Tto1은 DNA 타입 트랜스포손과 다르고, 염색체 내에 무작위로 트랜스포즈될 수 있다. 이러한 시스템을 이용하여 아라비돕시스(모델 식물)의 모든 유전자를 포함하는 파열 라인이 효과적으로 생성될 수 있다.
본 발명은 출원전 발명자들의 불가피한 사정에 의해 공지되었는바 이에 대한 신규성 상실의 예외 규정의 적용을 요구합니다. 본 발명은 제21회 일본 분자생물학회 연회 프로그램 및 강연 요지집에 일부 개시되어 있고, 동 학회는 1998년 12월 16일부터 1998년 12월 19일까지 파시피코 요코하마에서 개최되었으며 이러한 프로그램과 강연 요지의 간행은 1998년 11월 25일자로 발간되었습니다. 동 간행은 제21회 일본 분자생물학회 편집위원회와 동경대학 의과학연구소에서 간행하였으며 그 연락처는 재단법인 학회센터 간사이 오피스이고, 그 주소는 일본국 도요나가시 신센리 히가시마치 1-4-2의 센리라이프사이언스센터빌딩 14층이며 전화번호는 (06)873-2301이며 팩시밀리번호는 (06)873-2300입니다.
<110> National Institute of Agrobiological Sciences <120> Gene disruption method by using tobacco retrotransposon <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: Tto1-specific primer <400> 1 tggatatgaa tagtgcccgt atgg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: Tto1-specific prime <400> 2 tactctaacc aaagctctga tacc 24 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: arbitrary primer for amplification of genomic sequence flanking Tto1 <400> 3 ngtcgaswga nawgaa 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: arbitrary primer for amplification of genomic sequence flanking Tto1 <400> 4 gtncgaswca nawgtt 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: arbitrary primer for amplification of genomic sequence flanking Tto1 <400> 5 wgtgnagwan canaga 16 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: sequencing primer <400> 6 ctcactaagg agagttgcat c 21

Claims (8)

  1. 식물 내로 레트로트랜스포손을 도입시키고; 형질전환된 식물을 생성하기 위해 레트로트랜스포손이 도입된 식물을 배양시키고, 재생시키는 단계로 구성된 토바코 레트로트랜스포손을 이용하여 식물 내에서 유전자를 파열시키기 위한 방법에 있어서, 상기 토바코 레트로트랜스포손은 Tto1임을 특징으로 하는 방법
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 식물은 토바코 외의 식물임을 특징으로 하는 방법
  4. 제 3항에 있어서, 상기 식물은 농작물 식물임을 특징으로 하는 방법
  5. 제 3항에 있어서, 상기 식물은 아라비돕시스(Arabidopsis)임을 특징으로 하는 방법
  6. 제 1항에 있어서, 레트로트랜스포손이 도입된 상기 식물은 적은 복제수의 레트로트랜스포손을 지님을 특징으로 하는 방법
  7. 제 6항에 있어서, 상기 복제수는 1 내지 3 복제임을 특징으로 하는 방법
  8. 형질전환된 식물로부터 자손 식물을 수득하고; 식물체 내로 자손 식물의 조직을 배양시키고 재생시키는 단계로 더욱 구성된 제 1항에 따른 방법
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