BRPI0616416A2

BRPI0616416A2 - protoporfirinogênio oxidase tendo atividade de conferir resistência contra acifluorfen e gene da mesma

Info

Publication number: BRPI0616416A2
Application number: BRPI0616416-1A
Authority: BR
Inventors: Tanaka Ayumi; Tanaka Ryouichi; Kato Kazushige; Fukagawa Takako
Original assignee: Nippon Soda Co; Univ Hokkaido Nat Univ Corp
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2011-06-21
Also published as: WO2007034953A1; US8580940B2; CN102021189A; US8129589B2; CN101278049A; US20090216004A1; EP1930434A4; EP1930434A1; CN102021189B; EP1930434B1; CN101278049B; JPWO2007034953A1; US20120184727A1; KR20080050618A

Abstract

PROTOPORFIRINOGENIO OXIDASE TENDO ATIVIDADE DE CONFERIR RESISTêNCIA CONTRA ACIFLUORFEN E GENE DA MESMA. A presente invenção refere-se a protoporfirinogênio oxidase tendo uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen e gene do mesmo são proporcionados. O gene de protoporfirinogênio oxidase de cianobactéria é identificado através de introdução de um gene de protoporfirinogênio oxidase de Arabidopsis em cianobactéria, ruptura de um gene de cianobactéria com um transposon, seleção de uma cepa mutante na qual o gene de protoporfirinogênio oxidase está rompido, identificação do gene de protoporfirinogênio oxidase rompido e isolamento do gene de protoporfirinogênio oxidase rompido. Esse procedimento é eficaz como uma técnica de isolamento de gene quando uma proteína derivada de outra espécie de organismo que é homóloga a uma proteína conhecida (por exemplo, protoporfirinogênio oxidase de cianobactéria) pode não ser encontrada em um banco de dados de gene de outra espécie.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTOPOR-FIRINOGÊNIO OXIDASE TENDO ATIVIDADE DE CONFERIR RESISTÊN-CIA CONTRA ACIFLUORFEN E GENE DA MESMA".

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a protoporfirinogênio oxidasestendo uma atividade de conferir resistência contra acifluorfen e se refere,particularmente, a protoporfirinogênio oxidases de cianobactérias, genes dasmesmas, transformantes nos quais o gene é incorporado, etc.

Técnica Antecedente

A protoporfirinogênio oxidase é uma enzima que catalisa a rea-ção em estágio final de síntese de heme e síntese de clorofila, isto é, catali-sa a reação que remove seis elétrons de protoporfirinogênio IX para sinteti-zar protoporfirina IX. Heme é um co-fator de heme proteínas, tais como he-moglobina e citocroma, e é uma molécula essencial para respiração, meta-bolismo de energia e defesa contra estresse por oxigênio. A via sintética deheme comumente existe em microorganismos, plantas e animais e sintetizaheme a partir de um ácido δ-aminolevulínico precursor. Ainda, em plantas,vias sintéticas de heme e clorofila compartilham etapas comuns do ácido δ-aminolevulínico precursor em protoporfirina IX. Protoporfirinogênio oxidase éconsiderada como exercendo um papel regulatório nessa via sintética. Emplantas terrestres, a enzima protoporfirinogênio oxidase, a qual é responsá-vel pelo sistema metabólico de clorofila, pode ser uma enzima-alvo paraherbicidas de difenil éter (aqui depois referido como DPE em alguns casos).Quando herbicidas de DPE inibem a atividade de protoporfirinogênio oxida-se, protoporfirinogênio IX, um substrato da enzima, se acumulará no cloro-plasto e eventualmente o protoporfirinogênio IX vazará para o citosol, ondeele é oxidado em protoporfirina IX pela peroxidase. Quando exposta à luz eoxigênio, a protoporfirina IX pode produzir oxigênio simples e mesmo outrasespécies de oxigênio reativas. Peroxidação de lipídio e dano conferido àmembrana resultam em rápida morte de células vegetais (Lee et al., 1993,Plant Physiol., 102, 881). Poroutro lado, cianobactérias são bem-conhecidaspor serem capazes de sobreviver na presença de herbicida de DPE, emboraa razão ou mecanismo para tal não seja conhecido em geral.

Genes de protoporfirinogênio oxidase já foram isolados de váriosorganismos. Por exemplo, o gene PPX1 (Acesso ao Genbank Y13465) e ogene PPX2 (Acesso ao Genbank Y13466) de tabaco, o gene PPOX de Ara-bidopsis thaliana (Acesso ao Genbank D83139), o gene HemY de Bacillussubtilis (Acesso ao Genbank M97208), o gene PPX de camundongo (Acessoao Genbank D45185), o gene PPX humano (Acesso ao Genbank D38537), ogene PPX de Saccharomyces cerevisiae (Acesso ao Genbank Z71381), ogene hemG de Escherichia coli (Acesso ao Genbank X68660) são conhecidos.

Como uma aplicação de protoporfirinogênio oxidases, por exem-plo, o Documento de Patente 1 descreve um método para expressar umaprotoporfirinogênio oxidase de Bacillus subtilis, a qual confere resistênciacontra herbicidas de DPE em uma planta e descreve uma planta transgênicaexpressando a referida protoporfirinogênio oxidase. Ainda, por exemplo, noDocumento de Patente 2, um gene de protoporfirinogênio oxidase de 1,7 kbpde comprimento obtenível de Arabidopsis é descrito como um gene de umaproteína enzimática em sistema de biossíntese de porfirina, em que o gene éadequado para cultura de planta e contém a seqüência de nucleotídeo dereconhecimento de enzima de restrição EcoRI (5'-GAATTC-3') no sitio 1,3kbp de sua extremidade 5'. Além disso, por exemplo, o Documento de Pa-tente 3 descreve um método simples para avaliação da atividade inibitóriacontra protoporfirinogênio oxidase derivada de rato ou Chlamydomonas, oreferido método compreendendo as etapas de (1) cultura de transformantes,os quais são gerados através de introdução de um fragmento de DNA com-posto de promotor operavelmente ligado sendo operável em uma célulahospedeira e um gene de protoporfirinogênio oxidase em uma célula hospe-deira que é deficiente em crescimento baseado em atividade de protoporfiri-nogênio oxidase e expressam o gene de protoporfirinogênio oxidase presen-te no fragmento de DNA, no meio na presença ou ausência de um compostode teste e medição da taxa de crescimento dos transformantes sob cadacondição, em que o meio não contém substancialmente um composto quecomplementa a deficiência no crescimento baseado em protoporfirinogêniooxidase; e (2) determinação da atividade inibitória do composto de teste con-tra atividade de protoporfirinogênio oxidase através de determinação do graude inibição sobre o crescimento de transformantes via contato do compostode teste baseado na diferença no crescimento.

Por outro lado, em cianobactérias, um gene análogo ao hemK deE. coli foi especulado como sendo protoporfirinogênio oxidase a partir deanálise de seu banco de dados de gene. Depois, contudo, foi provado que oreferido gene hemK análogo de cianobactérias não era protoporfirinogêniooxidase na verdade. Contudo, proteínas homólogas a protoporfirinogêniooxidases de outras espécies já identificados não foram encontradas em bancosde dados de genes de cianobactérias e protoporfirinogênio oxidase de ciano-bactérias não foi isolada (vide, por exemplo, Documento Não Patenteável 1).

Documento de Patente 1 Pedido de Patente Japonesa N2 09-107833

Documento de Patente 2 Pedido de Patente Japonesa Depositado Aberto àInspeção Pública N2 09-140381

Documento de Patente 3 Pedido de Patente Japonesa N2 11 -346787

Documento Não Patenteável 1 Dmitrii V.Vavilin, Wim F. J. Ver-maas, Regulation of the tetrapyrrole biosynthetic pathway Ieading to hemeand chlorophyll in plants and cyanobacteria, Physiologia Plantarum, Vol. 115,página 9, 2002.

Descrição da Invenção

Objetivo a ser resolvido pela Invenção

Conforme descrito acima, proteínas homólogas a protoporfirino-gênio oxidases conhecidas de outras espécies não foram encontradas nosbancos de dados de gene de cianobactérias e protoporfirinogênio oxidase decianobactérias não foi isolada até agora. Um objetivo da presente invenção éproporcionar uma protoporfirinogênio oxidase tendo uma atividade de confe-rir resistência ao acifluorfen e um gene da mesma e um transformante noqual o referido gene é incorporado etc.

Meios para resolver o objetivo

Os presentes inventores tentaram seleção por complementaçãousando Ε. coli deficiente de protoporfirinogênio oxidase com o objetivo deisolamento de protoporfirinogênio oxidase de cianobactéria. Nesse método,fragmento genômico de cianobactérias é introduzido em E. coli deficiente deprotoporfirinogênio oxidase e um gene que complementa a deficiência ébuscado para identificar o gene relacionado à oxidação de protoporfirinogê-nio IX em cianobactérias. Genes de protoporfirinogênio oxidase derivados deArabidopsis e Tabaco foram isolados através do mesmo método usando umvetor diferente. Um ésboço da seleção por complementação será descritoabaixo.

Primeiro, DNA foi obtido de uma cianobactéria (SynechocystisPCC6803). Um vetor de fago XZaPW (STRATEGENE) foi empregado paraconstrução da biblioteca de DNA. Uma vez que a seqüência de nucleotídeocompleta da referida cianobactéria já foi reportada (aproximadamente 3.500kb), a seqüência do genoma de cianobactéria foi investigada cerca de seisseqüências de enzima de restrição contidas no sítio de multiclonagem dovetor. Três enzimas, Xbal, Spel e EcoRI, foram consideradas apropriadaspara construção da biblioteca. Conseqüentemente, uma biblioteca de fagofoi construída baseada em tratamento com essas três enzimas de restrição.

Experimento de complementação foi realizado através de introdução da bi-blioteca resultante em um E. coli deficiente de protoporfirinogênio oxidase etestagem da atividade de protoporfirinogênio oxidase dos transformantes.

Complementação clara, contudo, não foi observada. Várias possibilidadesforam concebidas a partir desse resultado: por exemplo, o gene de protopor-firinogênio oxidase de cianobactéria infelizmente traz seqüências dessas trêsenzimas de restrição ou um promotor da referida cianobactéria não funcionabem, etc.

Portanto, outra biblioteca foi construída usando digestão limitadacom a enzima de restrição Tsp5091 e foi reexaminada. Tsp5091 é uma en-zima de restrição de reconhecimento com quatro bases. Uma vez que asenzimas de restrição usadas na tentativa anterior de construir a biblioteca(EcoRI, Spel e Xbal) reconhecem seqüências de seis bases, não se podeevitar gerar fragmentos de tamanho muito grande. Além disso, se o sítio dereconhecimento dessas enzimas de restrição existe dentro da seqüência dogene de protoporfirinogênio oxidase de cianobactéria, um gene de protoporfi-rinogênio oxidase de comprimento total não precisa ser clonado. Por outrolado, digestão completa de DNA com uma enzima de restrição de reconhe-cimento com quatro bases produz um número grande de fragmentos curtosde várias centenas de bp. Para resolver esse problema, DNA foi digeridoincompletamente (digestão limitada) com a enzima de restrição de reconhe-cimento com quatro bases para construir uma biblioteca. Mesmo com essabiblioteca, deficiência de protoporfirinogênio oxidase em E. coli não foi com-plementada.

Em seguida, os presentes inventores acreditaram que a formade plasmídeo poderia restaurar o crescimento e excisar uma grande quanti-dade de plasmídeos da biblioteca de fago genômico de cianobactériaTsp5091 para construir a biblioteca de plasmídeo genômico de cianobactériaTsp5091 para investigação. Contudo, restauração de crescimento acentuadanão foi observada em qualquer clone. A partir desse resultado, acredita-seque a protoporfirinogênio oxidase de cianobactéria não complementa a defi-ciência de protoporfirinogênio oxidase de E. coli ou a complementação é, sehouver, muito leve.

Então, os presentes inventores conduziram estudo intensivo pa-ra resolver o objetivo acima. Baseados no conhecimento de que cianobacté-rias têm resistência ao acifluorfen, os presentes inventores empregaram umaseleção de mutante de cianobactéria usando um transposon, levando aoisolamento de protoporfirinogênio oxidase de uma cianobactéria (Syne-chocystis PCC6803) pela primeira vez, descobrindo que a protoporfirinogê-nio oxidase tinha uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen e identi-ficaram o gene da mesma, obtendo a presente invenção. Ainda, a presenteinvenção foi completada com a descoberta de que o procedimento de sele-ção de gene usando o transposon é um método útil para isolamento de umgene quando uma proteína de outra espécie homóloga a uma proteína co-nhecida não pode ser encontrada em um banco de dados de gene de outrasespécies.Em outras palavras, a presente invenção se refere a (1) umaprotoporfirinogênio oxidase tendo uma atividade de conferir resistência aoacifluorfen a um organismo e sendo derivado de cianobactéria; (2) a proto-porfirinogênio oxidase de acordo com (1) acima, em que a cianobactéria éuma cianobactéria pertencendo ao gênero Synechocystis; e (3) a protoporfi-rinogênio oxidase de acordo com (1) ou (2) acima, em que o organismo éuma planta.

A presente invenção também se refere a (4) uma proteína mos-trada em qualquer um de (a) a (c) a seguir: (a) a proteína compreendendo aseqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2; (b) uma proteína ten-do atividade de protoporfirinogênio oxidase, a qual compreende uma se-qüência de aminoácido em que um ou vários aminoácidos são deletados,substituídos ou adicionados na seqüência de aminoácido mostrada em SEQID NO: 2 e a qual tem uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen aum organismo; e (c) uma proteína tendo atividade de protoporfirinogênio oxi-dase, a qual tem 20% ou mais de homologia à seqüência de aminoácidomostrada em SEQ ID NO: 2 e tem uma atividade de conferir resistência aoacifluorfen a um organismo; e (5) a proteína de acordo com (4) acima, emque a proteína é derivada de cianobactéria.

A presente invenção também se refere a (6) um DNA de gene deprotoporfirinogênio oxidase que codifica a protoporfirinogênio oxidase deacordo com qualquer um de (1) a (3) acima ou que codifica a proteína deacordo com (4) ou (5) acima; (7) um DNA de gene de protoporfirinogêniooxidase mostrado em (d) ou (e) a seguir: (d) o DNA de gene de protoporfiri-nogênio oxidase compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada emSEQ ID NO: 1; ou (e) um DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase quecompreende uma seqüência de nucleotídeo em que um ou vários nucleotí-deos são deletados, substituídos ou adicionados na SEQ ID NO: 1 e codificauma proteína tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase e tendo umaatividade de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo; (8) um DNAde gene de protoporfirinogênio oxidase que se hibridiza com um DNA com-preendendo uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeo mos-trada em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes e codifica uma proteínatendo atividade de protoporfirinogênio oxidase e tendo uma atividade de con-ferir resistência ao acifluorfen a um organismo; e (9) o DNA do gene de pro-toporfirinogênio oxidase de acordo com (7) ou (8) acima, em que a proteínatendo atividade de protoporfirinogênio oxidase é derivada de uma cianobac-téria.

A presente invenção também se refere a (10) um vetor recombi-nante no qual o DNA do gene de protoporfirinogênio oxidase de acordo comqualquer um de (6) a (9) acima é incorporado.

A presente invenção também se refere a (11) um transformanteno qual o vetor recombinante de acordo com (10) acima é introduzido; (12) otransformante de acordo com (11) acima em que o transformante tem umaresistência ao acifluorfen; (13) o transformante de acordo com (11) ou (12)acima, em que o transformante é um microorganismo; e (14) o transformantede acordo com (11) ou (12) acima, em que o transformante é uma planta; e(15) o transformante de acordo com (14) acima, em que a capacidade fotos-sintética é aumentada.

A presente invenção também se refere a (16) um método paraavaliação de uma atividade inibitória contra protoporfirinogênio oxidase u-sando o transformante de acordo com qualquer um de (11) a (15) acima; e(17) um método de seleção para um inibidor de protoporfirinogênio oxidaseusando o transformante de acordo com qualquer um de (11) a (16) acima.

A presente invenção também se refere a (18) um método paraisolamento de um gene de protoporfirinogênio oxidase de cianobactéria,compreendendo as etapas (f) a (j) a seguir: (f) introdução de um gene deprotoporfirinogênio oxidase de Arabidopsis em uma cianobactéria; (g) rupturado gene de cianobactéria usando um transposon; (h) seleção de uma cepamutante gene de protoporfirinogênio oxidase-rompido; (i) identificação dogene de protoporfirinogênio oxidase rompido; e (j) isolamento do gene deprotoporfirinogênio oxidase rompido.

A presente invenção também se refere a (19) um método parauso da proteína de acordo com (4) ou (5) acima como protoporfirinogêniooxidase; (20) um método para conversão de protoporfirinogênio IX em proto-porfirina IX através de contato artificial do protoporfirinogênio IX com a prote-ína de acordo com (4) ou (5) acima; (21) um método para uso do DNA deacordo com qualquer um de (6) a (9) acima como um gene de protoporfirino-gênio oxidase; e (22) um método para conversão de protoporfirinogênio IXem protoporfirina IX através de contato do protoporfirinogênio IX com umproduto de expressão artificialmente expresso a partir do DNA de acordocom qualquer um de (6) a (9) acima.

A presente invenção também se refere a (23) um método paraisolamento de um gene que codifica uma proteína tendo uma função exata apartir de um organismo específico, compreendendo as etapas (1) a (5) a seguir:

(1) geração de um transformante através de introdução, no or-ganismo específico, de um gene que codifica uma proteína que complemen-ta a determinada função, em que o gene é derivado de um outro organismoque não o organismo específico;

(2) geração de uma cepa mutante do transformante através deruptura aleatória de um gene do transformante;

(3) seleção de uma cepa mutante rompida no gene que codificaa proteína tendo a determinada função através de uso de um agente queatua sobre a proteína que complementa a determinada função, mas não a-tua sobre a proteína tendo a determinada função ou através de alteraçãodas condições de cultura;

(4) identificação do gene rompido que codifica a proteína tendo adeterminada função; e

(5) isolamento do gene rompido que codifica a proteína tendo adeterminada função.

A presente invenção também se refere ao (24) método para iso-lamento de um gene de acordo com (23) acima, em que a mutagênese éuma mutagênese usando um transposon; (25) o método para isolamento deum gene de acordo com (23) ou (24) acima, em que a proteína que comple-menta a determinada função derivada de um outro organismo que não umorganismo específico é protoporfirinogênio oxidase de Arabidopsis; (26) ométodo para isolamento de um gene de acordo com (25) acima, em que oagente que atua sobre a proteína que complementa a determinada função,mas não atua sobre a proteína tendo a determinada função, é acifluorfen; e(27) o método para isolamento de um gene de acordo com (25) ou (26) aci-ma, em que a proteína tendo uma determinada função no organismo especí-fico é protoporfirinogênio oxidase de cianobactéria.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: alinhamento da seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 2 e seqüências de aminoácido codificadas por genes com função des-conhecida derivados de cianobactérias.

Figura 2: alinhamento da seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 2 e seqüências de aminoácido codificadas por genes com função des-conhecidas derivados de outros organismos.

Figura 3: é uma figura mostrando uma estrutura para ruptura dogene slr1790 de Synechocystis (pslr1790SKM, 6,4 kb).

Figura 4: é uma figura mostrando cromatogramas de: amostrade protoporfirina IX (A), extrato da cepa de gene siri 790 rompido (B) e extra-to do tipo silvestre (C).

Figura 5: é uma figura mostrando uma vista esquemática depBl121.

Figura 6: é uma figura mostrando uma vista esquemática depBlslr1790.

Melhor Modo para Realização da Invenção

Protoporfirinogênio oxidase da presente invenção tem uma ativi-dade de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo. A "protoporfiri-nogênio oxidase tendo uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen aum organismo" aqui significa uma protoporfirinogênio oxidase que aumenta aresistência ao acifluorfen do organismo quando a protoporfirinogênio oxidaseé introduzida em um organismo apropriado e apropriadamente expressa noorganismo. O aumento na resistência ao acifluorfen do organismo pode seravaliado, por exemplo, através de investigação se o valor de LC 50 do aci-fluorfen no organismo é aumentado a 48 horas após a introdução da enzimacomparado com o valor antes de introdução da enzima. Particularmente,quando o organismo é uma planta, o aumento na resistência ao acifluorfenda planta pode ser investigado, por exemplo, confirmando a diminuição nograu de etiolação, amarelamento ou dessecação na planta expressando a-propriadamente a enzima, comparado com a planta antes da expressão a-propriada da enzima quando uma quantidade particular de acifluorfen é apli-cada ao solo de cultura ou pode ser investigado confirmando o aumento naquantidade de aplicação de acifluorfen por unidade de área requerida paracausar o mesmo grau de etiolação, amarelamento ou dessecação na plantaexpressando apropriadamente a enzima, comparado com a planta antes daexpressão apropriada da enzima. Ainda, o grau de aperfeiçoamento na re-sistência ao acifluorfen não está particularmente limitado, mas é preferidoque seja um aumento, de preferência, de 1,1 vez ou mais, mais preferivel-mente 1,5 vez ou mais, ainda mais preferivelmente 2 vezes ou mais, maispreferivelmente 3 vezes ou mais, no valor de LC 50 do acifluorfen contra oorganismo a 48 horas depois ou na quantidade de aplicação de acifluorfenpor área unitária requerida para causar o mesmo nível de etiolação, amare-lamento ou dessecação do que antes da introdução da enzima.

Ainda, a "protoporfirinogênio oxidase tendo uma atividade deconferir resistência ao acifluorfen a um organismo" da presente invençãoinclui o caso onde a protoporfirinogênio oxidase em si tem resistência aoacifluorfen. Aqui, o termo "a protoporfirinogênio oxidase em si tem resistên-cia ao acifluorfen" significa que a atividade específica de protoporfirinogêniooxidase em um solvente apropriado contendo 1 μΜ de acifluorfen permane-ce um qüinquagésimo ou maior, de preferência um vigésimo ou mais ou,mais preferivelmente, um décimo ou mais do que aquela na ausência de aci-fluorfen. O termo "atividade de protoporfirinogênio oxidase" aqui significauma atividade enzimática para oxidar protoporfirinogênio IX em protoporfirinaIX. A atividade específica de protoporfirinogênio oxidase de uma proteínapode ser facilmente verificada, por exemplo, através de contato da proteínacom protoporfirinogênio IX em um tampão apropriado ou solução salina eexame do rendimento de protoporfirina IX. Ainda, o "organismo" na expres-são "tendo uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen a um orga-nismo" não é particularmente limitado e pode ser uma planta ou um microor-ganismo. Contudo, uma planta é preferida. Dentre plantas, Arabidopsis, ta-baco, milho, arroz, a família do trigo (tal como trigo e cevada) e batatas (taiscomo batatas brancas) são preferidos.

A protoporfirinogênio oxidase da presente invenção pode ser oupode não ser de cianobactérias na medida em que tenha uma atividade deconferir resistência ao acifluorfen a um organismo. Exemplos de cianobacté-rias incluem, mas não estão limitados a, cianobactérias bactérias pertencen-do aos gêneros Synechocystis, Anabaena, Gloeobacter, Prochlorococcus,Synechococcus, Rhodopseudomonas e, mais especificamente, Synechocys-tis PCC6803, Anabaena PCC7120, Gloeobacter violaceus PCC7421, Proc-hlorococcus marinus SS120, Prochlorococcus marinus MIT9313, Prochloro-coccus marinus MED4, Synechococcus WH8102 e Rhodopseudomonas pa-lustris. Dentre esses, cianobactérias pertencendo ao gênero Synechocystissão preferidas e Synechocystis PCC6803 é mais preferido.

O termo "protoporfirinogênio oxidase derivada de cianobactéria"aqui inclui, além de protoporfirinogênio oxidase que realmente existe em cia-nobactéria, protoporfirinogênio oxidase expressa em um outro microorga-nismo, etc., que não cianobactéria usando técnicas recombinantes, etc., namedida em que ela seja a mesma que a protoporfirinogênio oxidase que re-almente existe em cianobactéria.

Uma proteína da presente invenção é qualquer uma das seguin-tes proteínas: (1) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidomostrada em SEQ ID NO: 2; (2) uma proteína tendo uma atividade de confe-rir resistência ao acifluorfen a um organismo, tendo atividade de protoporfiri-nogênio oxidase e compreendendo uma seqüência de aminoácido na qualou vários aminoácidos são deletados, substituídos ou adicionados em qual-quer uma de (i) a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2, (ii)as seqüências de aminoácido das posições de aminoácido 1 a 34 e 48 a 176de SEQ ID NO: 2 ou (iii) as seqüências de aminoácido de posições de ami-noácido 1 a 34 e 48 a 193 de SEQ ID NO: 2; e (3) uma proteína tendo umaatividade de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo, tendo ativi-dade de protoporfirinogênio oxidase e tendo uma homologia de 20% ou maisa qualquer uma de (i) a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO:2, (ii) as seqüências de aminoácido das posições de aminoácido 1 a 34 e 48a 176 de SEQ ID NO: 2 ou (iii) as seqüências de aminoácido de posições deaminoácido 1 a 34 e 48 a 193 de SEQ ID NO: 2. Aqui depois, essas proteí-nas da presente invenção podem ser coletivamente referidas como "a(s)presente(s) proteína(s)".

A proteína de (2) acima da presente invenção não está particu-larmente limitada, na medida em que ela seja uma proteína tendo uma ativi-dade de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo, tendo atividadede protoporfirinogênio oxidase e compreendendo uma seqüência de amino-ácido na qual um ou vários aminoácidos são deletados, substituídos ou adi-cionados em qualquer uma de (i) a seqüência de aminoácido mostrada emSEQ ID NO: 2, (ii) as seqüências de aminoácido de posições de aminoácido1 a 34 e 48 a 176 de SEQ ID NO: 2 ou (iii) as seqüências de aminoácido deposições de aminoácido 1 a 34 e 48 a 193 de SEQ ID NO: 2. Contudo, e-xemplos preferidos incluem uma proteína tendo uma atividade de conferirresistência ao acifluorfen a um organismo, tendo atividade de protoporfirino-gênio oxidase e compreendendo uma seqüência de aminoácido na qual umou vários aminoácidos são deletados, substituídos ou adicionados na se-qüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2; uma proteína tendouma atividade de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo, tendoatividade de protoporfirinogênio oxidase, compreendendo uma seqüência deaminoácido na qual um ou vários aminoácidos são deletados, substituídosou adicionados nas seqüências de aminoácido de posições de aminoácido 1a 34 e 48 a 176 e compreendendo uma seqüência de aminoácido consistin-do em quaisquer um de 10 a 16, de preferência quaisquer um de 12 a 14,mais preferivelmente quaisquer 13 aminoácidos entre uma seqüência deaminoácido correspondendo à referida seqüência de aminoácido de posi-ções de aminoácido 1 a 34 e uma seqüência de aminoácido correspondendoà referida seqüência de aminoácido de posições de aminoácido 48 a 176;uma proteína tendo uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen a umorganismo, tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase, compreendendouma seqüência de aminoácido na qual um ou vários aminoácidos são dele-tados, substituídos ou adicionados na seqüência de aminoácido de posiçõesde aminoácido 1 a 34 e 48 a 193 e compreendendo uma seqüência de ami-noácido consistindo em quaisquer 10 a 16, de preferência quaisquer 12 a 14,mais preferivelmente quaisquer 13 aminoácidos entre uma seqüência deaminoácido correspondendo à referida seqüência de aminoácido das posi-ções de aminoácido 1 a 34 e uma seqüência de aminoácido correspondendoà referida seqüência de aminoácido das posições 48 a 193 de aminoácido.

Aqui, uma seqüência de aminoácido correspondendo à seqüência de amino-ácido das posições de aminoácido m a η significa uma seqüência de amino-ácido na qual um ou vários aminoácidos são deletados, substituídos ou adi-cionados na seqüência de aminoácido das posições de aminoácido m a n.

A "seqüência de aminoácido na qual um ou vários aminoácidossão deletados, substituídos ou adicionados" acima significa uma seqüência deaminoácido na qual qualquer número de aminoácidos, por exemplo, 1 a 20,de preferência 1 a 15, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivel-mente 1 a 5, mais preferivelmente 1 a 3 aminoácidos são deletados, substi-tuídos ou adicionados.

O termo "tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase" aquisignifica tendo uma atividade enzimática para oxidar protoporfirinogênio IXem protoporfirina IX. A presença da atividade de protoporfirinogênio oxidaseem uma proteína pode ser facilmente confirmada através de avaliação daprodução de protoporfirinogênio IX após contato da proteína com protoporfi-rinogênio IX em um tampão ou solução salina apropriada.

Ainda, a "proteína tendo uma atividade de conferir resistência aoacifluorfen a um organismo" aqui significa uma proteína a qual aumenta aresistência ao acifluorfen do organismo quando a proteína é introduzida emum organismo apropriado e apropriadamente expressa no organismo. Au-mento na resistência ao acifluorfen do organismo pode ser avaliado, por e-xemplo, investigando se o valor de LC 50 de acifluorfen para o organismo éaumentado em 48 horas após a introdução de proteína, comparado com ovalor antes de introdução da proteína. Ainda, particularmente quando o or-ganismo é uma planta, aumento na resistência ao acifluorfen da planta podeser investigado, por exemplo, confirmando uma diminuição no grau de etio-lação, amarelamento ou dessecação na planta expressando apropriadamen-te a proteína na planta, comparado com a planta antes da expressão apro-priada da proteína quando uma quantidade particular de acifluorfen é aplica-da ao solo de cultura ou pode ser investigado confirmando o aumento naquantidade de aplicação de acifluorfen por unidade de área requerida paracausar o mesmo grau de etiolação, amarelamento ou dessecação na plantaexpressando apropriadamente a proteína, comparado com a planta antes daexpressão apropriada da proteína. Ainda, o grau de aperfeiçoamento na re-sistência ao acifluorfen não está particularmente limitado mas, é preferidoque seja um aumento, de preferência, de 1,1 vez ou mais, mais preferivel-mente 1,5 vez ou mais, ainda mais preferivelmente 2 vezes ou mais, maispreferivelmente 3 vezes ou mais no valor de LC 50 do acifluorfen para o or-ganismo 48 horas depois ou na quantidade de aplicação de acifluorfen porárea unitária requerida para causar o mesmo nível de etiolação, amarela-mento ou dessecação que aquele antes de introdução da proteína.

Ainda, a "proteína tendo uma atividade de conferir resistência aoacifluorfen a um organismo" da presente invenção inclui o caso onde a prote-ína em si tem uma resistência ao acifluorfen. Aqui, a "proteína em si tem re-sistência ao acifluorfen" significa que uma atividade específica (com relaçãoà atividade de protoporfirinogênio oxidase) da proteína em um solvente a-propriado contendo 1 μΜ de acifluorfen é, de preferência, um qüinquagésimoou maior, mais preferivelmente um vigésimo ou mais ou, mais preferivelmen-te, um décimo ou mais do que uma atividade específica (referente à ativida-de de protoporfirinogênio oxidase) da proteína na ausência de acifluorfen. Otermo "atividade de protoporfirinogênio oxidase" aqui significa uma atividadeenzimática para oxidar protoporfirinogênio IX em protoporfirina IX. Atividadeespecífica (referente à protoporfirinogênio oxidase) de uma proteína podeser facilmente confirmada, por exemplo, através de contato da proteína comprotoporfirinogênio IX em um tampão ou solução salina apropriada e exami-nando o rendimento de protoporfirina IX. Ainda, o "organismo" na expressão"tendo uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo"não está particularmente limitado, mas plantas e microorganismos são prefe-ridos. Particularmente preferidas são plantas.

A proteína (3) acima da presente invenção não está particular-mente limitada, na medida em que ela seja uma proteína tendo uma ativida-de de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo, tendo atividade deprotoporfirinogênio oxidase e tendo uma homologia de 20% ou mais a qual-quer uma de (i) a seqüência de aminoácido mostrada em in SEQ ID NO: 2(siri 790), (ii) as seqüências de aminoácido das posições de aminoácido 1 a34 e 48 a 176 de SEQ ID NO: 2 ou (iii) as seqüências de aminoácidó dasposições de aminoácido 1 a 34 e 48 a 193 de SEQ ID NO: 2. Contudo, ahomologia de qualquer uma de (i) a seqüência de aminoácido mostrada emSEQ ID NO: 2, (ii) as seqüências de aminoácido das posições de aminoáci-do 1 a 34 e 48 a 176 de SEQ ID NO: 2 ou (iii) as seqüências de aminoácidodas posições de aminoácido 1 a 34 e 48 a 193 de SEQ ID NO: 2 deverá ser,de preferência, 45% ou mais, mais preferivelmente 54% ou mais, ainda maispreferivelmente 65% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, ainda maispreferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais. O termo"homologia às seqüências de aminoácido das posições de aminoácido o a ρe q a r é X% ou mais" aqui significa que a homologia é X% ou mais a umaseqüência de aminoácido compreendendo seqüências de aminoácido dasposições de aminoácido o a ρ e posições de aminoácido q a r nessa ordem,entre as quais uma seqüência de aminoácido consistindo em quaisquer 10 a16, de preferência 12 a 14 ou, mais preferivelmente, 13 aminoácidos estácontida. A "proteína tendo atividade de conferir resistência ao acifluorfen aum organismo" e "proteína tendo atividade de conferir resistência ao acifluor-fen a um organismo" na proteína de (3) acima e suas modalidades preferí-veis têm o mesmo significado que aquela da proteína de (2) acima.

Além disso, busca baseada no BLAST por proteínas com altahomologia à seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2 revelouvários genes de função desconhecida que codificam seqüências de aminoá-cido tendo alta homologia à seqüência de aminoácido mostrada em SEQ IDNO: 2. Dentre essas, genes derivados de cianobactéria de função desco-nhecida são mostrados na Tabela 1 abaixo. Também mostrada na Tabela 1é a homologia (%) das seqüências de aminoácido codificadas por esses ge-nes à seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2. Essas sãotambém abrangidas pelas presentes proteínas. Enquanto isso, a seqüênciade aminoácido da presente invenção mostrada em SEQ ID NO: 2 é a se-qüência de aminoácido codificada pelo gene slr1790 derivado de Syne-chocystis PCC6803, a qual foi revelada pelos presentes inventores conformedescrito nos Exemplos abaixo.

Tabela 1

<table>table see original document page 17</column></row><table>

Ainda, alinhamento das seqüências de aminoácido codificadaspelos genes apresentados na Tabela 1 é mostrado abaixo na Figura 1.

No alinhamento da Figura 1, um asterisco é adicionado sob osaminoácidos idênticos em todos os 7 genes, enquanto que um traço é adi-cionado sob os aminoácidos idênticos em 4 a 6 genes. Conforme conhecidoda Tabela 1 e Figura 1, essas seqüências de aminoácido de 7 cianobacté-rias (exclusivas de Synechocystis PCC6803) têm alta homologia com a se-qüência de aminoácido codificada pelo gene slr1790 de SynechocystisPCC6803 e determinadas regiões são altamente conservadas. Portanto, asproteínas codificadas por esses genes, além do gene slr1790 de Syne-chocystis PCC6803, são estimadas como sendo protoporfirinogênio oxida-ses tendo uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen a organismos,conforme com a proteína codificada pelo gene slr1790 de SynechocystisPCC6803 (a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2). Além disso, o ali-nhamento da Figura 1 mostra alta conservação da protoporfirinogênio oxida-se da presente invenção nas seqüências de aminoácido das posições deaminoácido 1 a 34 e 48 a 193 da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2(correspondendo às seqüências de nucleotídeo das posições de nucleotídeo1 a 102 e 142 a 582) e, especialmente, as seqüências de aminoácido dasposições de aminoácido 1 a 34 e 48 a 176 da seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 2 (correspondendo às seqüências de nucleotídeo das posiçõesde nucleotídeo 1 a 102 e 142 a 528), dentre a seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 2 ou a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1. Assim, éprovável que essas regiões exerçam um papel importante na propriedadedas referidas enzimas.

Ainda, dentre os genes mostrados, através de busca pelo BLAST,codificar uma seqüência de aminoácido tendo uma alta homologia à seqüên-cia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, genes de outros organismos que nãocianobactérias são mostrados na Tabela 2 abaixo. As presentes proteínastambém incluem produtos da expressão desses genes.

Tabela 2

<table>table see original document page 18</column></row><table>

Ainda, alinhamento das seqüências de aminoácido codificadaspelos genes mostrados na Tabela 2 é mostrado na Figura 2.

No alinhamento da Figura 2, um asterisco é adicionado sob osaminoácidos idênticos em todos os 5 genes, enquanto que um traço é adi-cionado sob os aminoácidos idênticos em 3 genes. Conforme conhecido daTabela 2 e Figura 2, essas seqüências de aminoácido de 4 espécies (exclu-sivas de Synechocystis PCC6803) têm alta homologia com a seqüência deaminoácido codificada pelo gene slr1790 de Synechocystis PCC6803 e de-terminadas regiões são altamente conservadas. Portanto, as proteínas codi-ficadas por esses genes, além do gene de Synechocystis PCC6803, tambémsão estimadas como sendo protoporfirinogênio oxidases tendo uma ativida-de de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo, conforme com aproteína codificada pelo gene slr1790 de Synechocystis PCC6803.

A presente invenção também se refere a um método para usodas presentes proteínas acima como protoporfirinogênio oxidase. O "usocomo protoporfirinogênio oxidase" aqui significa, por exemplo, uso da pre-sente proteína em uma reação na qual o produto da reação, protoporfirinaIX, é produzido através de contato artificial da presente proteína com o subs-trato, protoporfirinogênio IX, in vitro ou in vivo. A descoberta de que as pre-sentes proteínas têm atividade de protoporfirinogênio oxidase é uma desco-berta totalmente nova primeiro mostrada na presente invenção. Ainda, otermo "contato artificial", no método para conversão de protoporfirinogênio IXem protoporfirina IX através de contato artificial de protoporfirinogênio IXcom a presente proteína, significa um contato artificial in vitro ou in vivo enão inclui, por exemplo, um contato não-artificial em uma célula cianobacte-riana.

O DNA do gene de protoporfirinogênio oxidase da presente in-venção é qualquer um dos seguintes DNAs de gene de protoporfirinogêniooxidase: (1) um DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase que codifica aprotoporfirinogênio oxidase da presente invenção ou as presentes proteínas;(2) um DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase compreendendo a se-qüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1; (3) um DNA de gene deprotoporfirinogênio oxidase que codifica uma proteína tendo atividade deprotoporfirinogênio oxidase e tendo uma atividade de conferir resistência aoacifluorfen a um organismo e compreende uma seqüência de nucleotídeo naqual um ou vários nucleotídeos são deletados, substituídos ou adicionadosem qualquer uma de (i) a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ IDNO: 1; (ii) as seqüências de nucleotídeo das posições de nucleotídeo 1 a102 e 142 a 528 de SEQ ID NO: 1 ou (iii) as seqüências de nucleotídeo dasposições de nucleotídeo de 1 a 102 e 142 a 528 de SEQ ID NO: 1; e (4) umDNA de gene de protoporfirinogênio oxidase que codifica uma proteína ten-do uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo etendo atividade de protoporfirinogênio oxidase e se hibridiza com um DNAcomplementar a qualquer uma de (i) a seqüência de nucleotídeo mostradaem SEQ ID NO: 1, (ii) as seqüências de nucleotídeo das posições de nucleo-tídeo 1 a 102 e 142 a 528 de SEQ ID NO: 1 ou (iii) as seqüências de nucleo-tídeo das posições de nucleotídeo de 1 a 102 e 142 a 528 de SEQ ID NO: 1sob condições estringentes. Esses DNAs de gene de protoporfirinogênio o-xidase da presente invenção podem ser coletivamente referidos como "opresente DNA de gene".

O DNA (2) acima da presente invenção não está particularmentelimitado, na medida em que ele seja um DNA de gene de protoporfirinogêniooxidase que codifica uma proteína tendo uma atividade de conferir resistên-cia ao acifluorfen a um organismo e tendo atividade de protoporfirinogêniooxidase e compreende uma seqüência de nucleotídeo na qual um ou váriosnucleotídeos são deletados, substituídos ou adicionados a uma de (i) a se-qüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1; (ii) as seqüências denucleotídeo das posições de nucleotídeo 1 a 102 e 142 a 528 de SEQ IDNO: 1 ou (iii) as seqüências de nucleotídeo das posições de nucleotídeo de1 a 102 e 142 a 528 de SEQ ID NO: 1. Contudo, o seguinte pode ser, de pre-ferência, exemplificado: um DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase quecodifica uma proteína tendo uma atividade de conferir resistência ao acifluor-fen a um organismo e tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase e com-preendendo uma seqüência de nucleotídeo na qual um ou vários nucleotí-deos são deletados, substituídos ou adicionados na seqüência de nucleotí-deo mostrada em SEQ ID NO: 1; um DNA de gene de protoporfirinogêniooxidase que codifica uma proteína tendo uma atividade de conferir resistên-cia ao acifluorfen a um organismo e tendo atividade de protoporfirinogêniooxidase, compreende uma seqüência de nucleotídeo na qual um ou váriosnucleotídeos são deletados, substituídos ou adicionados nas seqüências denucleotídeo das posições de nucleotídeo 1 a 102 e 142 a 528 de SEQ IDNO: 1 e compreende uma seqüência de nucleotídeo consistindo em quais-quer 30 a 48 (múltiplos de três apenas), de preferência 36 a 42 (múltiplos detrês apenas), mais preferivelmente 39 nucleotídeos entre a seqüência denucleotídeo correspondendo à referida seqüência de nucleotídeo das posi-ções de nucleotídeo 1 a 102 e a seqüência de nucleotídeo correspondendo àreferida seqüência de nucleotídeo das posições de nucleotídeo 142 a 528;um DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase que codifica uma proteínatendo uma atividade de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo etendo atividade de protoporfirinogênio oxidase, compreende uma seqüênciade nucleotídeo na qual um ou vários nucleotídeos são deletados, substituí-dos ou adicionados nas seqüências de nucleotídeo das posições de nucleo-tídeo 1 a 102 e 142 a 582 da SEQ ID NO: 1 e compreende uma seqüênciade nucleotídeo consistindo em quaisquer 30 a 48 (múltiplos de três apenas),de preferência 36 a 42 (múltiplos de três apenas), mais preferivelmente 39nucleotídeos entre a seqüência de nucleotídeo correspondendo à seqüênciade nucleotídeo das posições de nucleotídeo 1 a 102 e a seqüência de nucle-otídeo correspondendo à seqüência de nucleotídeo das posições de nucleo-tídeo 142 a 582. Aqui, a seqüência de nucleotídeo correspondendo às se-qüências de nucleotídeo das posições de nucleotídeo m a η significa umaseqüência de nucleotídeo na qual um ou vários nucleotídeos são deletados,substituídos ou adicionados na seqüência de nucleotídeo das posições denucleotídeo m a n.

A "seqüência de nucleotídeo, na qual um ou vários nucleotídeossão deletados, substituídos ou adicionados" acima significa uma seqüênciade nucleotídeo na qual qualquer número de nucleotídeos, por exemplo, 1 a20, de preferência 1 a 15, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferi-velmente 1 a 5, mais preferivelmente 1 a 3 nucleotídeos são deletados,substituídos ou adicionados.

Por exemplo, DNA compreendendo uma seqüência de nucleotí-deo na qual vários nucleotídeos são deletados, substituídos ou adicionados(DNA mutante) pode ser preparado usando quaisquer métodos conhecidospor aqueles habilitados na técnica (por exemplo, síntese química, procedi-mento de engenharia genética, mutagênese, etc.). Especificamente, DNAsmutantes podem ser obtidos através de introdução de uma mutação no DNAcompreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1através de métodos tais como contato com um agente mutagênico, radiaçãode raios ultravioleta ou procedimento de engenharia genética. Mutagênesede sítio específico, a qual é uma técnica de engenharia genética, é útil por-que ela permite a introdução de uma mutação específica em um sítio especí-fico e pode ser realizada de acordo com um método descrito, por exemplo,em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- Ed., Cold Spring Harbor La-boratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (aqui depois referido comoMolecular Cloning 2- ed.) Expressão desse DNA mutante usando um siste-ma de expressão apropriado permite a aquisição de proteínas compreen-dendo uma seqüência de aminoácido na qual um ou vários aminoácidos sãodeletados, substituídos ou adicionados.

O "DNA que se hibridiza sob condições estringentes" significaum DNA obtido através de realização do método de hibridização em colônia,método de hibridização em placa ou método de hibridização de southern blotusando um ácido nucléico, tal como DNA ou RNA, como uma sonda. Especi-ficamente exemplificado é um DNA identificado realizando uma hibridizaçãousando um filtro, ao qual DNAs derivados de placa ou colônia ou fragmentosdos referidos DNAs são fixados, na presença de NaCI a 0,7 a 1,0 M a 65°C esubseqüente lavagem do filtro a 65°C usando cerca de 0,1 a 2 χ solução deSSC (composição de 1 χ solução de SSC é cloreto de sódio a 150 mM e ci-trato de sódio a 15 mM). Hibridizações podem ser realizadas de acordo como método descrito em Molecular Cloning 2- ed., etc.

Exemplos do DNA que se hibridiza sob condições estringentesincluem um DNA tendo homologia, acima de um determinado nível, a umaseqüência de nucleotídeo do DNA sonda. Exemplos do DNA preferido inclu-em, por exemplo, um DNA tendo homologia de 60% ou mais, de preferência70% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, ainda mais preferivelmente90% ou mais, particularmente de preferência 95% ou mais e, ainda mais pre-ferivelmente, 98% ou mais a qualquer uma das seguintes seqüências de nu-cleotídeo: a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1; as se-qüências de nucleotídeo das posições de nucleotídeo 1 a 102 e 142 a 528da SEQ ID NO: 1; ou as seqüências de nucleotídeo das posições de nucleo-tídeo 1 a 102 e 142 a 528 da SEQ ID NO: 1. Aqui, na presente invenção,"homologia de X% ou mais às seqüências de nucleotídeo das posições denucleotídeo sateuav" significa que a homologia é X% ou mais a uma se-qüência de nucleotídeo compreendendo as seqüências de nucleotídeo dasposições de nucleotídeo s a t e das posições de nucleotídeo u a ν nessa or-dem e uma seqüência de nucleotídeo consistindo em quaisquer 30 a 48(múltiplos de 3 apenas), de preferência 36 a 42 (múltiplos de três apenas),mais preferivelmente 39 nucleotídeos entre as seqüências de nucleotídeodas posições de nucleotídeo s a t e das posições de nucleotídeo u a v. Ain-da, exemplos preferidos do DNA que se hibridiza sob condições estringentesincluem um DNA que codifica uma seqüência de aminoácido tendo uma ho-mologia de 20% ou mais, de preferência 45% ou mais, mais preferivelmente54% ou mais, ainda mais preferivelmente 65% ou mais, ainda mais preferi-velmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, ainda mais pre-ferivelmente 95% ou mais a qualquer uma das seguintes seqüências de a-minoácido: a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2; as se-qüências de aminoácido das posições 1 a 34 e 48 a 176 de SEQ ID NO: 2;ou as seqüências de aminoácido das posições de aminoácido 1 a 34 e 48 a193 de SEQ ID NO: 2.

A presente invenção é também dirigida a um método para usodo presente DNA como um gene de protoporfirinogênio oxidase. O termo"uso como um gene de protoporfirinogênio oxidase" se refere, por exemplo,ao uso em uma reação na qual o presente DNA é artificialmente expresso invitro ou in vivo e o produto da expressão de protoporfirinogênio oxidase écolocado em contato com seu substrato, protoporfirinogênio IX, para produzirum produto da reação, protoporfirina IX. A descoberta de que os produtos daexpressão dos presentes DNAs têm atividade de protoporfirinogênio oxidaseé uma descoberta totalmente nova primeiro mostrada na presente invenção.

Com o uso do presente DNA como um gene de protoporfirinogênio oxidase,por exemplo, resistência ao acifluorfen pode ser conferida a um organismonão tendo resistência ao acifluorfen. Ainda, o termo "artificialmente expres-so", no método da presente invenção para conversão de protoporfirinogênioIX em protoporfirina IX através de contato do protoporfirinogênio IX com umproduto da expressão artificialmente expresso a partir do presente DNA", serefere a uma expressão artificial in vitro ou in vivo e não inclui, por exemplo,expressão não-artificial em uma célula cianobacteriana.

Um método para isolamento da presente proteína ou presenteDNA de gene não está particularmente limitado e as presentes proteínas ouos presentes DNAs de gene podem ser obtidos usando um método comu-mente conhecido, tais como métodos de genética molecular ou métodos en-zimáticos. Contudo, para isolar um DNA de gene que codifica uma protopor-firinogênio oxidase tendo baixa homologia a protoporfirinogênio oxidasesconhecidas, é preferido usar um método para isolamento de um gene deprotoporfirinogênio oxidase compreendendo as etapas de: (f) introdução deum gene de protoporfirinogênio oxidase de Arabidopsis em cianobactéria; (g)ruptura de um gene de cianobactéria usando um transposon; (h) seleção deuma cepa mutante de gene rompido de protoporfirinogênio oxidase; (i) identi-ficação do gene de protoporfirinogênio oxidase rompido; e (j) isolamento dogene de protoporfirinogênio oxidase rompido.

Um organismo fonte pode ser um organismo não resistente aoacifluorfen, mas preferido é um organismo resistente ao acifluorfen. Aqui a-baixo, um método usando um organismo resistente ao acifluorfen como umafonte será descrito.

Antes de mutagênese, o gene de protoporfirinogênio oxidase deum organismo relacionado a um organismo fonte é introduzido no organismofonte e o gene de protoporfirinogênio oxidase do organismo relacionado éexpresso no organismo fonte, de modo que o organismo fonte pode crescermesmo quando a protoporfirinogênio oxidase do organismo fonte se tornarompida. Ainda, uma protoporfirinogênio oxidase derivada do organismo re-lacionado que é confirmado não mostrando resistência ao acifluorfen é usa-da. Em seguida, mutagênese usando um transposon é realizada no orga-nismo fonte. Os mutantes obtidos são selecionados com relação ao acifluor-fen (herbicida de difenil éter). O organismo fonte mostra resistência ao aci-fluorfen, mas a protoporfirinogênio oxidase do organismo relacionado não(isto é, sensível). Portanto, a fonte (cepa deficiente de protoporfirinogêniooxidase) na qual o gene de protoporfirinogênio oxidase do organismo rela-cionado é introduzido mostra sensibilidade ao acifluorfen. Assim, cepas mu-tantes mostrando crescimento normal na ausência do tratamento com aciflu-orfen, ao mesmo tempo em que mostram sensibilidade ao acifluorfen quan-do tratadas com acifluorfen, são selecionadas. Por exemplo, o gene podeser identificado através de análise da cepa mostrando sensibilidade ao aci-fluorfen para o sítio de inserção de transposon com um método descrito noExemplo 3, etc. Dessa forma, o gene fonte derivado que codifica protoporfi-rinogênio oxidase que mostra resistência ao acifluorfen pode ser isolado.

Na presente invenção, um organismo usado como uma fonte degene de protoporfirinogênio oxidase é, de preferência, um organismo tendouma enzima mostrando baixa homologia à protoporfirinogênio oxidases co-nhecidas. Na presente invenção, o gene mostrando baixa homologia à pro-toporfirinogênio oxidase conhecida significa, especificamente, por exemplo,um gene tendo uma homologia de menos de 20% ao gene PPX1 de tabaco(Acesso ao Genbank Y13465) a nível de aminoácido. Na presente invenção,um organismo usado como uma fonte do gene de protoporfirinogênio oxida-se é, de preferência, um procariota, mais preferivelmente cianobactéria, ain-da mais preferivelmente uma cepa resistente à glicose de Synechocystis(Synechocystis sp. PCC6803) porque essa cepa é fácil de obter e lidar. Es-sas cepas bacterianas podem ser facilmente obtidas, por exemplo, do Insti-tuto Pasteur. Cultura dessa cepa pode ser realizada de acordo com um mé-todo comumente conhecido. É preferível, contudo, cultivar sob luz contínua a30°C com meio de cultura BG11 (Hihara Y, et al. Plant Physiol(1998) 117:página 1205) ajustado para uma concentração final de 5 mM.

Um método para obtenção ou preparo de um presente DNA degene não está particularmente limitado. O presente DNA de gene pode serisolado, por exemplo, de uma biblioteca de DNA genômico de um organismotal como Synechocystis PCC6803 ou outra cianobactéria usando iniciadoresou sondas apropriadas projetadas baseado na informação de seqüência denucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1 ou na informação de seqüência deaminoácido mostrada em SEQ ID NO: 1 descrita aqui. Alternativamente, elespodem ser preparados através de síntese química de acordo com métodosconvencionais. Além disso, aquisição e clonagem, etc. de DNA genômicopodem ser realizadas de acordo com métodos convencionais. Métodos paraselecionar a biblioteca de DNA genômico para o presente DNA de gene in-cluem, por exemplo, métodos convencionais comumente usados por aquelesversados na técnica (por exemplo, um método descrito em Molecular Clo-ning 2- ed.). Ainda, genes mutantes ou genes homólogos podem ser isola-dos através de seleção de outros organismos, etc., sob condições apropria-das usando um fragmento de DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mos-trada em SEQ ID NO: 1 ou uma parte da mesma para um DNA compreen-dendo uma seqüência de nucleotídeo tendo alta homologia ao referido DNA.Alternativamente, ele também pode ser preparado através do método antesmencionado para geração de um DNA mutante.

O vetor recombinante da presente invenção não está particular-mente limitado, na medida em que ele seja um vetor no qual um presenteDNA de gene é incorporado. O vetor recombinante da presente invençãopode ser construído através de introdução apropriada do presente DNA degene em um vetor de expressão. Por exemplo, uma estrutura trazendo opresente DNA de gene ligado a jusante de um promotor apropriado podeser, de preferência, exemplificado. Como um vetor de expressão, aquelescapazes de se replicar independentemente em sua célula hospedeira ou ca-pazes de ser incorporados em um cromossoma de sua célula hospedeirasão preferidos. Ainda, um vetor de expressão compreendendo genes deuma seqüência regulatória ou um fator de transcrição, tal como um promotorou um terminador, relevante para a expressão de um gene da presente in-venção pode, de preferência, ser usado.

Exemplos de um vetor de expressão para bactérias incluem ve-tores conhecidos ou comercialmente disponíveis, tais como as linhagenspUC (por exemplo, pUC118 (TaKaRa) e pUC19 [Gene 33, 103(1985)]), li-nhagens pGEM (por exemplo, pGEMEX-1 (Promega)), pKK223-2 (Pharma-cia), pBluescriptll SK(+), pBluescriptll SK(-) (Stratagene).

Exemplos de um promotor para bactérias incluem, por exemplo,o promotor de fago 11, promotor trp (P trp), promotor Iac (P lac), promotorrecA, promotor λΡΙ_, promotor ÀPR, promotor Ipp, promotor PSE, promotorSP01, promotor SP02 e promotor penP.

Exemplos de um vetor de expressão para células de planta in-cluem plG121-Hm [Plant Cell Report, 15, 809-814 (1995)], pBI121 [EMBO J.6, 3901-3907 (1987)], pl_AN411 e pLAN421 (Plant Cell Reports 10(1991)286-290). Ainda, exemplos de um promotor para plantas incluem o promotor35S de vírus mosaico da couve-flor (Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392),um promotor de desidrogenase de álcool derivado de milho (Maydica 35(1990) 353-357) e um promotor do gene IRE derivado de Arabidopsis (Pedi-do de Patente Japonesa Depositado Aberto à Inspeção Pública No. 2000-270873).

O transformante da presente invenção não está limitado, na me-dida em que ele seja um transformante no qual o vetor acima da presenteinvenção é incorporado. Exemplos de hospedeiros incluem microorganismos(tais como bactérias), plantas e animais. Dentre os mesmos, microorganis-mos e plantas são preferidos. Exemplos específicos de bactérias incluembactérias pertencendo aos gêneros Escherichia, Pseudonocardia, Strep-tomyces, Bacillus, Streptococcus e Staphylococcus. Ainda, exemplos especí-ficos de plantas incluem Arabidopsis, tabaco, milho, arroz, a família do trigo(tal como trigo e cevada), batatas (tais como batatas brancas).

Exemplos de um método para introdução do vetor recombinanteacima da presente invenção em um microorganismo hospedeiro incluem mé-todos descritos em muitos manuais de laboratório padrão, tal como Molecu-lar Cloning 2- ed. (por exemplo, eletroporação, transdução ou transforma-ção). Ainda, exemplos de um método para introdução do referido vetor re-combinante da presente invenção incluem o método com pistola de partícu-las, o método de eletroporação e o método com Agrobacterium.

Acredita-se que um transformante, de preferência uma plantatransformada, no qual o vetor recombinante da presente invenção é introdu-zido, tenha resistência ao acifluorfen. Aqui, o "transformante tendo resistên-cia ao acifluorfen" significa um transformante cuja resistência ao acifluorfen éaumentada comparado com a resistência antes de introdução do vetor re-combinante da presente invenção. O aumento na resistência ao acifluorfendo transformante pode ser avaliado, por exemplo, investigando se o valor deLC50 do acifluorfen para o transformante está aumentado em 48 horas apósa introdução do vetor recombinante comparado com o valor antes da intro-dução do vetor recombinante. Particularmente, quando o organismo é umaplanta, o aumento na resistência ao acifluorfen da planta pode ser investiga-do, por exemplo, confirmando uma diminuição no grau de etiolação, amare-Iamento ou dessecação na planta expressando apropriadamente o vetor re-combinante na planta, comparado com a planta antes da expressão apropri-ada do vetor recombinante quando uma quantidade particular de acifluorfené aplicada ao solo de cultura ou pode ser investigado confirmando o aumen-to na quantidade de aplicação de acifluorfen por unidade de área requeridapara causar o mesmo grau de etiolação, amarelamento ou dessecação naplanta expressando apropriadamente o vetor recombinante na planta, com-parado com a planta antes da expressão apropriada do vetor recombinante.

Ainda, o grau de aperfeiçoamento na resistência ao acifluorfen não está par-ticularmente limitado, mas é preferido que seja um aumento, de preferência,de 1,1 vez ou mais, mais preferivelmente 1,5 vez ou mais, ainda mais prefe-rivelmente 2 vezes ou mais, mais preferivelmente 3 vezes ou mais no valorde LC50 do acifluorfen para o organismo a 48 horas depois ou na quantida-de de aplicação de acifluorfen por área unitária requerida para causar omesmo nível de etiolação, amarelamento ou dessecação que aquele antesda introdução do vetor recombinante.

A presente proteína pode ser preparada em grande quantidade,por exemplo, através de cultura de um transformante da presente invençãoem um meio de cultura apropriado para produzir e acumular a presente pro-teína na cultura e, então, coleta da presente particularmente da referida cul-tura. Ainda, no caso de uma planta transformada, quando o acifluorfen é pul-verizado como um agroquímico/herbicida, a planta transformada cujo cres-cimento é objetivado pode crescer, mas ervas daninhas sensíveis ao aciflu-orfen são mortas, de modo que a planta transformada cujo crescimento éobjetivado pode crescer seletivamente.

Para uma planta transgênica da presente invenção, aperfeiçoa-mento na capacidade fotossintética é preferida, embora não seja requerido,e aperfeiçoamento na capacidade fotossintética na presença de acifluorfen émais preferido. Espera-se que a planta transformada da presente invençãoseja aperfeiçoada quanto à sua capacidade fotossintética porque ela expres-sa muita protoporfirinogênio oxidase. O aperfeiçoamento na capacidade fo-tossintética pode ser confirmado comparando-se a capacidade fotossintéticada planta hospedeira antes da introdução do vetor recombinante da presenteinvenção e a capacidade fotossintética da planta transformada após a intro-dução. O aperfeiçoamento na capacidade fotossintética pode ser confirma-do, por exemplo, comparando as taxas fotossintéticas calculadas a partir demedições obtidas usando um sistema de medição de transpiração e fotos-síntese ou comparando o peso seco de plantas cultivadas sob as mesmascondições durante um determinado período.

Um transformante de acordo com a presente invenção pode serusado para um método para avaliação da atividade inibitória contra protopor-firinogênio oxidase. Exemplos do referido método incluem, mas não estãolimitados a, um método de avaliação compreendendo as etapas de: (1) cultu-ra do hospedeiro do referido transformante na presença de uma substânciade teste e registro de sua curva de crescimento; (2) cultura do referido trans-formante na presença da mesma substância de teste conforme na etapa (1)e registro de sua curva de crescimento; e (3) comparação das curvas decrescimento obtidas nas etapas (1) e (2).

Além disso, um transformante da presente invenção tambémpode ser usado para um método de seleção para um inibidor de protoporfiri-nogênio oxidase. Exemplos do referido método de seleção incluem o mesmométodo conforme o método de avaliação acima.

Acifluorfen é um dos herbicidas de difenil éter. Uma vez que aspresentes proteínas têm atividade de conferir resistência ao acifluorfen a umorganismo, elas também teriam uma atividade de conferir a um organismouma resistência contra outros herbicidas de difenil éter similar quanto aomecanismo de ação. O mesmo também se aplicaria para a presente proto-porfirinogênio oxidase e os transformantes da presente invenção.

Em seguida, um método para isolamento de um gene que codifi-ca uma proteína tendo uma determinada função (por exemplo, protoporfiri-nogênio oxidase) de um organismo específico (por exemplo, cianobactéria)será explicado.

Esse método para isolamento de um gene compreende as eta-pas (1) a (5) a seguir:

(2) geração de uma cepa mutante do transformante através deruptura aleatória dos genes do transformante;

(3) seleção de uma cepa mutante rompida no gene que codificaa proteína tendo a determinada função usando um agente que atua sobre aproteína que complementa a determinada função, mas não atua sobre a pro-teína tendo a determinada função ou através de troca das condições de cul-tura;

(5) isolamento do gene rompido que codifica a proteína tendo adeterminada função. Esse método é especialmente eficaz com uma técnicade isolamento de gene quando uma proteína de outra espécie que é homó-loga a uma proteína conhecida (por exemplo, protoporfirinogênio oxidasederivada de Arabidopsis) não pode ser encontrada no banco de dados degene da outra espécie (por exemplo, protoporfirinogênio oxidase derivada decianobactéria).

Exemplos da mutagênese acima incluem um tratamento por mu-tagênese de uma célula com um agente, tal como metanossulfonato de etila(EMS), N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), 2,6-diaminopurina (DAP)ou semelhante, e um tratamento por mutagênese de uma célula com raiosultravioleta. Contudo, uma mutagênese usando um transpossoma, o qualpermite a introdução de uma mutação a nível de gene, pode, de preferência,ser exemplificado. Transpossomas são complexos de transposon e transpo-sase e proporcionam fácil introdução de uma mutação a nível de gene emuma variedade de microorganismos (Hoffman, L.M., Jendrisak, J.J., Meis,R.J., Coryshin, I.Y. e Rezhikof, S.W. Genetica, 108, 19-24 (2000)). Por e-xemplo, como um método usando um transpossoma, um método usandotranspossoma EZ::TN®<KAN-2> Tnp (EPICENTRE) etc., é conhecido.

Métodos de mutagênese usando um transposon são conhecidosna técnica como uma ferramenta poderosa para análise de gene. Mutantesgene rompido podem ser selecionados, por exemplo, usando um marcadorde resistência a antibiótico conhecido introduzido por um transposon.

Seleção adicional dos mutantes gene rompido obtidos usandoum agente que atua sobre uma proteína que complementa a determinadafunção, mas não atua sobre uma proteína tendo a determinada função ouatravés de troca das condições de cultura permite seleção de um mutante noqual um gene que codifica uma proteína tendo a determinada função é rom-pido. As seqüências de nucleotídeo adjacentes ao transposon podem serdeterminadas usando, por exemplo, o método de término de cadeia (SangerF.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 5463-5467(1977)). Essa análisede sítio de inserção de tag de transposon permite a identificação do generompido que codifica a proteína tendo a determinada função.Exemplos preferidos do "agente que atua sobre uma proteínaque complementa a determinada função, mas não atua sobre uma proteínatendo a determinada função" acima incluem acifluorfen (tipo difenil-éter), pi-raflufen-etila (tipo fenilpirazola), flumioxázina (tipo dicarboxiimido), o qualatua sobre protoporfirinogênio oxidase de Arabidopsis, mas não atua sobreuma protoporfirinogênio oxidase derivada de cianobactéria.

Incidentalmente, heme e clorofila são sintetizadas a partir de umprecursor em comum, ácido δ-aminolevulínico (ALA). Em plantas, E. coli,etc., o ALA é sintetizado via a reação com três etapas denominada "via C5"compreendendo as etapas de: (1) produção de glutamil-tRNA a partir de áci-do glutâmico através da ação de sintase de glutamil-tRNA; (2) produção de1-semialdeído de glutamato a partir do glutamil-tRNA produzido através daação de reductase de glutamil-tRNA; e (3) produção de ALA a partir do 1-semialdeído de glutamato produzido através da ação de aminomutase de 1-semialdeído de glutamato. Em animais ou bactérias pertencendo ao gêneroAgrobacterium, em contraste, o ALA é sintetizado via uma reação em umaetapa denominada "via C4" a partir de succinila CoA e glicina através da a-ção de sintase de ALA. Conforme descrito acima, bactérias pertencendo aogênero Agrobacterium sintetizam ALA através da "via C4" e se sabe que aenzima sintase de ALA existe, embora o gene da mesma não seja identifica-do. Em tal caso, o gene de sintase de ALA de bactérias pertencendo ao gê-nero Agrobacterium pode ser identificado através de co-infecção das bacté-rias pertencendo ao gênero Agrobacterium com genes que codificam sintasede glutamil-tRNA, reductase de glutamil-tRNA e aminomutase de 1-semialdeído de glutamato derivadas de planta rompendo aleatoriamente umgene nas ,bactérias transformadas pertencendo ao gênero Agrobacteriumusando um transposon ou semelhante para gerar cepas mutantes, selecio-nando as cepas mutantes com relação a uma cepa mutante que cresce naausência de gabaculina, a qual é um inibidor de aminomutase de 1-semialdeído de glutamato e é morta na presença de gabaculina e analisandoo sítio de inserção de tag de transposon na cepa mutante selecionada. Por-tanto, exemplos de "agente que atua sobre uma proteína que complementaa determinada função, mas não atua sobre uma proteína tendo a determina-da função" acima incluem gabaculina, a qual atua sobre aminomutase de 1-semialdeído de glutamato de uma planta ou E. colie não atua sobre a sinta-se de ácido δ-aminolevulínico (ALA) de um animal ou bactéria pertencendoao gênero Agrobacterium.

Além disso, exemplos de um método de seleção via troca decondições de cultura para uma cepa mutante na qual um gene que codificauma proteína tendo uma determinada função é rompido incluem: como ummétodo de seleção baseado em condições de temperatura, por exemplo, ummétodo compreendendo cultura de mutantes gene rompido em temperaturade cultura normal e em alta (ou baixa) temperatura para selecionar mutantesmostrando diferença no crescimento; como um método de seleção baseadoem condições de luz, por exemplo, um método compreendendo cultura demutantes gene rompido sob condições normais de iluminação e sob condi-ções de alta (ou baixa) iluminação para selecionar mutantes mostrando dife-rença no crescimento; e como um método de seleção baseado em condi-ções de pH, por exemplo, um método compreendendo cultura de mutantesgene rompido em condições de pH normal e em condições de alto (ou baixo)pH para selecionar mutantes mostrando diferença no crescimento.

A presente invenção será ainda descrita em detalhes com refe-rência aos Exemplos a seguir. Contudo, o escopo técnico da presente inven-ção não estará limitado por esses Exemplos.

[Exemplo 11

(Introdução de gene de protoporfirinogênio oxidase derivado de Arabidopsisem cianobactéria)

RNA total foi extraído de folhas de roseta de Arabidopsis usandoo kit de extração de RNA RNeasy (Qiagen). mRNA de PoIi(A)+ foi purificadodo RNA total usando um método convencional. O mRNA de PoIi(A)+ foi usa-do como um template para a síntese de cDNA usando o kit ReverTra-PIus(TOYOBO). Um gene de protoporfirinogênio oxidase de Arabidopsis (1,6kbp) foi amplificado através de PCR usando o cDNA sintetizado como umtemplate, um iniciador ATHPPOX.Aself (SEQ ID NO: 3) contendo um sítiode enzima de restrição Asei, um iniciador ATHPPOX.r (SEQ ID NO: 4) e TaqPolimerase TaKaRa LA (TAKARA). Então, o produto de PCR foi digeridocom Asei. A PCR foi realizada com 28 ciclos de desnaturação (94°C, 30 s),anelamento (52°C, 45 s) e extensão (72°C, 120 s).

pFS10, o qual pode ser usado para transformação de cianobac-térias e tem o gene de resistência à canamicina, foi usado como um vetor(Jansson et al. Methods Enzymol (1998) 297: página 166). O vetor pFS10 foidigerido com as enzimas de restrição Ndel e Hindll e ligado ao produto dePCR antes mencionado do gene de protoporfirinogênio oxidase para gerarum vetor recombinante. Esse vetor recombinante foi transformado em E. coli(JM109) através do método de choque térmico, os transformantes foram,então, selecionados sobre lâmina de ágar LB contendo canamicina. A colô-nia que emergiu foi cultivada em meio líquido LB contendo canamicina e oplasmídeo foi purificado da cultura. Em uma etapa posterior de mutagêneseusando transposon, a resistência à canamicina será usada como um marca-dor selecionável. Portanto, remoção do gene de resistência à canamicina eintrodução de outro gene de resistência a antibiótico (gene de resistência aocloranfenicol) são requeridas.

PCR primária foi realizada com os iniciadores Chloram.r (SEQ IDNO: 5) e SPE2Xba1.r (SEQ ID NO: 6) tendo um sítio Xbal, Taq PolimerasePyrobest (TAKARA) e vetor pFS10 como um template. A PCR foi realizadacom 25 ciclos de desnaturação (98°C, 10 s), anelamento (55°C, 45 s) e ex-tensão (72°C, 30 s) e um produto de PCR de aproximadamente 500 bp foiproporcionado. Em seguida, PCR secundária foi realizada usando o gene deresistência ao cloranfenicol como um template, com o produto de PCR obti-do, um iniciador Chloram.Xbal .f (SEQ ID NO: 7) e Taq Polimerase Pyrobest(TAKARA). A PCR foi realizada com 25 ciclos de desnaturação (98°C, 10 s),anelamento (50°C, 45 s) e extensão (72°C, 90 s). O produto de PCR, o qualcontinha um gene de resistência ao cloranfenicol, foi digerido com a enzimade restrição Xbal.

Enquanto isso, o vetor recombinante antes mencionado constru-ído através de ligação do gene de protoporfirinogênio oxidase de Arabidop-sis com vetor pFS10 também foi digerido com Xbal para remover o gene deresistência à canamicina e, então, ligado com o fragmento de gene de resis-tência ao cloranfenicol digerido com Xbal descrito acima para obter um novovetor recombinante. Esse vetor recombinante foi transformado em E. coli(JM109) e os transformantes foram, então, selecionados sobre meio de ágarLB contendo cloranfenicol. A colônia que emergiu foi cultivada em meio lí-quido LB contendo cloranfenicol e o plasmídeo foi purificado da cultura. Sy-nechocystis PCC6803 foi transformado com esse plasmídeo para gerar umacepa de Synechocystis transgênica expressando protoporfirinogênio oxidasederivada de Arabidopsis (aqui depois referida como "cepa AT" em algunscasos). O método de transformação de Synechocystis PCC6803 foi realiza-do de acordo com Williams JG. Methods Enzymol (1998) 167: página 766.[Exemplo 21

(Geração de mutante de cianobactéria usando um transposon)

Genoma extraído de Synechocystis PCC6803 foi parcialmentedigerido com Tsp5091 e uma biblioteca de plasmídeo genômico foi construí-da usando o kit Iambda ZAP Il vector (Stratagene). Um transposon foi inseri-do na biblioteca de plasmídeo genômico usando o kit de InserçãoEZ::TNTM<KAN-2> (Epicentre) de acordo com um manual descrito pela Epi-centre. Com essa biblioteca de plasmídeo genômico tag de transposon-inserida de Synechocystis, a cepa AT foi transformada através de recombi-nação homóloga para gerar mutantes de Synechocystis expressando proto-porfirinogênio oxidase derivada de Arabidopsis.[Exemplo 31

(Seleção de mutantes deficientes em protoporfirinogênio oxidase de ciano-bactéria)

Os mutantes de Synechocystis gerados no Exemplo 2 foram se-lecionados com relação a mutantes deficientes de protoporfirinogênio oxida-se de cianobactéria usando sensibilidade ao acifluorfen como um marcadorselecionável. Procedimentos específicos são descritos abaixo.

Os mutantes de Synechocystis gerados no Exemplo 2 foram co-locados sobre meio de ágar BG11 contendo acifluorfen em uma concentra-ção final de 500 μΜ e cultivados estaticamente sob radiação contínua comuma luz fluorescente branca (intensidade da luz: 30 μιηοΙε s"1 m"2) a 30°Cdurante duas semanas. Cultura sobre meio de ágar BG11 isento de acifluor-fen foi também realizada da mesma forma. Baseado nos resultados dessasculturas, nove mutantes que cresceram na ausência de acifluorfen, mas ain-da morriam na presença de acifluorfen, foram selecionados. Dentre essesnove mutantes, um mutante, o crescimento do qual foi mais inibido, foi de-nominado mutante 3216 e o sítio de inserção de tag de transposon foi anali-sado conforme descrito abaixo. Descobriu-se que a tag de transposon tinhasido inserida dentro de um domínio regulatório transcricional putativo da pro-teína siri 790.

(Análise genética de mutante de cianobactéria)

Dois métodos foram considerados como uma forma de determi-nar o sítio de inserção da tag de transposon.

(1) Uma vez que um gene de resistência à canamicina é introdu-zido como uma tag no transposon usado, essa resistência a antibiótico éusada para seleção.

Especificamente, DNA é obtido de um mutante e fragmentadousando uma seqüência de enzima de restrição não incluída no gene de re-sistência à canamicina. Um vetor não contendo um gene de resistência àcanamicina é digerido com a mesma enzima de restrição conforme usadopara clivagem de DNA. Esses são ligados e transformados em E. coli. Plas-mídeo foi purificado de um clone o qual tinha crescido sobre um meio con-tendo canamicina e, então, a seqüência é analisada.

(2) Uso do método de PCR invertida.

DNA é obtido de um mutante conforme em (1) e fragmentadousando uma seqüência de enzima de restrição não incluída na tag de trans-poson. Esse é autoligado (circularizado) e submetido à reação de PCR cominiciadores projetados ao exterior da tag de transposon. O produto de PCRamplificado é seqüenciado.

Primeiro, o método de (1) usando uma resistência a antibióticofoi empregado para investigação.(1) Investigação usando resistência à canamicina

Extração de DNA de mutante de cianobactéria

Um mutante de cianobactéria (mutante 3216) foi cultivado emmeio líquido BG11 a 30°C sob luz durante 12 dias. Após a cultura, as célulasforam coletadas e DNA foi extraído através do método com SDS. Como umresultado, aproximadamente 800 μρ de DNA de mutante de cianobactériaforam obtidos.

Digestão com enzimas de restrição

Enzimas de restrição EcoRI e Sacl foram usadas para digerir oDNA de mutante de cianobactéria e um vetor (pUC118), respectivamente.Após o tratamento com enzima de restrição, DNA de mutante de cianobacté-ria fragmentado foi purificado usando uma coluna giratória. O vetor foi trata-do com fosfatase alcalina de forma a evitar auto-ligação.

Ligação

O comprimento médio dos fragmentos proporcionados atravésde digestão com as três enzimas de restrição acima é calculado, a partir deum banco de dados, como sendo de 6 kb e 10 kb para EcoRI e Saci, respec-tivamente. Em vista do comprimento médio dos fragmentos, a proporçãomolar de inserto/vetor foi ajustada para 3/1 ou 9/1 e ligada a 12°C durante16 horas.

Transformação em E. coli

Uma alíquota de mistura de ligação foi transformada em E. coli(JM109) através do método de choque térmico a qual foi, então, submetida auma seleção sobre meio de ágar LB contendo canamicina. Como um resul-tado, nenhuma formação de colônia foi observada sobre o meio de ágar LBcontendo canamicina.

Ligação usando uma quantidade muito excessiva do inserto naproporção de inserto/vetor também resultou no mesmo. O método de sele-ção utilizando uma resistência a antibiótico seria teoricamente possível, nes-se caso, contudo, haveria alguns problemas, tais como condições inapropri-adas de proporção de inserto/vetor. Embora haja espaço para estudo dascondições, é determinado investigar usando o método de PCR invertida,conforme mostrado em (2).

(2) Investigação usando o método de PCR invertida

O mutante 3216, o qual mostra um forte fenótipo, foi investigado.DNÂ foi obtido conforme descrito acima e as enzimas de restrição EcoRI eKpnl foram usadas. Após tratamento com as enzimas de restrição, fragmen-to de DNA foi purificado com uma coluna giratória.Auto-liqacão

O fragmento de DNA purificado usando uma coluna giratória foiautoligado a 12°C durante 16 horas.1ae2- PCR

Uma vez que há uma preocupação a respeito da amplificação debandas não-específicas para o método de PCR invertida, a reação de PCRfoi realizada em duas etapas.

Dois conjuntos de iniciadores dirigidos ao exterior da tag detransposon foram projetados. Para a 2- PCR, iniciadores de seqüência inclu-ídos no kit foram usados,(iniciadores para Ii PCR)ΚΑΝ-2-fr (SEQ ID NO: 17)ΚΑΝ-2-rev (SEQ ID NO: 18)(iniciadores para 2- PCR)KAN-2FP1 (SEQ ID NO: 19)KAN-2RP1 (SEQ ID NO: 20)

A λ - PCR foi realizada usando um fragmento genômico autoliga-do como um template. A 1- PCR foi realizada com 30 ciclos de 98°C durantes (desnaturação), 55°C durante 30 s (anelamento) e 72°C durante 7 min(extensão) usando iniciadores com uma concentração final de 0,5 μΜ cada etaq polimerase EX (Takara).

As concentrações finais do template usando a mistura de reaçãode ligação foram investigadas para três diluições (1:50, 1:250 e 1:1250).Uma quantidade de 5 μΙ dos produtos de PCR foi examinada através de ele-troforese em gel de agarose.

A eletroforese mostrou amplificação de uma banda específicaem torno de 7 kb apenas quando o fragmento digerido com EcoRI foi usadocomo um template. O produto da 1- PCR foi purificado com uma coluna gira-tória para remover os iniciadores e, então, usado como um template para a2ê PCR.

A 2- PCR foi realizada com 3 ciclos de 98°C durante 10 s (des-naturação), 60°C durante 30 s (anelamento) e 72°C durante 5 min (exten-são), seguido por 20 ciclos de 98°C durante 10 s (desnaturação), 58°C du-rante 30 s (anelamento) e 72°C durante 5 min (extensão) usando iniciadorescom uma concentração final de 0,5 μΜ cada e taq polimerase EX (Takara).

Uma quantidade de 5 μΙ do produto de PCR foi examinada atra-vés de eletroforese em gel de agarose.

Como um resultado, de acordo com o design de iniciador, ampli-ficação de uma banda foi observada em uma posição inferior àquela do pro-duto de 1a PCR em várias centenas de bp. Ao mesmo tempo, contudo, am-plificação de bandas não-específicas também foi observada.Clonagem de TA e purificação de plasmídeo

A condição da 2- PCR foi investigada. Contudo, a amplificaçãode bandas não-específicas não pôde ser removida. Portanto, a banda emtorno de 7 kb especificamente amplificada na 1- PCR foi recuperada do gel eusada como um inserto para clonagem de TA (vetor pGEM-T Easy, Prome-ga), a qual foi, então, transformada em E. coli(JM109) através do método dechoque térmico e os transformantes foram selecionados sobre meio de ágarLB contendo ampicilina. Quatro colônias foram selecionadas a partir das co-lônias que emergiram sobre a lâmina e foram cultivadas em meio líquido LBcontendo ampicilina e, então, purificação de plasmídeo foi realizada usandoo procedimento "miniprep." Uma vez que o inserto pode ser excisado do ve-tor pGEM-T Easy através de tratamento com EcoRI, os plasmídeos purifica-dos foram tratados com EcoRI e examinados através de eletroforese em gelde agarose.

A eletroforese do plasmídeo 1 e do plasmídeo 2 mostrou bandasem torno de 5 kb, 3 kb (vetor) e 1,8 kb. Uma vez que o tamanho total dasbandas derivadas do inserto era aproximadamente 7 kb, esses clones foramdeterminados como sendo clones de interesse. A possível causa de propor-cionar três bandas clivadas, incluindo a banda derivada de vetor, através detratamento com EcoRI dos plasmídeos 1 e 2 é a formação de um concatâ-mero ao invés da forma circular na etapa inicial de ligação. Isso não podeafetar a análise de seqüência. Portanto, o plasmídeo 1 foi submetido a umareação de seqüência.

Seqüenciamento

A seqüência de nucleotídeo do plasmídeo 1 foi analisada atravésde seqüenciamento de ciclo de acordo com o método com dideóxi. Comoiniciadores de seqüência, KAN-2FP1 e KAN-2RP1 usados na 2- PCR foramempregados. Uma vez que os iniciadores de seqüência se anelam ao DNAda região de tag de transposon, a parte inicial dos dados de seqüência obti-dos é para o DNA da região de tag de transposon. Uma seqüência repetidainvertida é uma seqüência de reconhecimento de Transposase Terminal emMosaico de Transposon de 19 bp encontrada na junção do DNA alvo e datag de transposon dentro do clone transposon-inserido. Essa seqüência po-de ser usada para distinguir o alvo da tag de transposon. Inserção de trans-poson transposase-catalisada gera uma duplicação de seqüência do sítioalvo de 9 bp para proteger os lados do transposon inserido.

Em vista do acima, a seqüência obtida foi analisada e descobriu-se que a tag de transposon estava inserida entre 256677th T e 256685th G(seqüência terminal em mosaico e seqüência de sobreposição de 9 bp). Es-sa posição não está incluída na região de ORF, mas considerada como sen-do um domínio regulatório transcricional da proteína putativa a jusantesiri790 (256698-257279, 193 aa).

Dos nove mutantes os quais cresceram na ausência de acifluor-fen, mas são mortas na presença de acifluorfen, os oito mutantes que não omutante 3216, foram analisados da mesma forma. A tag de transposon esta-va inserida no mesmo gene em todos os mutantes conforme o mutante 3216(slr1790).Exemplo 4

(Geração de mutante gene de proteína slr1790-rompido)

Para determinar se o gene de slr1790 (600 bp a partir de 256698a 257279 do genoma de Synechocystis) codifica protoporfirinogênio oxidaseou não, ruptura do gene de slr1790 em Synechocystis PCC6803 foi realizadausando um vetor recombinante o qual codifica um gene de resistência à ca-namicina inserido dentro da região de codificação do slr1790. Uma vez que acianobactéria pode ser transformada através de recombinação homóloga,iniciadores foram projetados baseado na seqüência entre 700 bp a montantee 600 bp a jusante do gene de slr1790 (1,9 kbp a partir de 255999 a 257920do genoma de Synechocystis). A seqüência incluindo 700 bp a montante e600 bp a jusante do gene de slr1790 foi amplificada através de PCR usandoDNA extraído de Synechocystis PCC6803 como um template, iniciadoresSlrl 790 km EcoRI f (SEQ ID NO: 8) e SIM790 km Hindlll r (SEQ ID NO: 9) eTaq Polimerase TaKaRa EX (Takara) para obter um produto de PCR. A PCRfoi realizada com 28 ciclos de desnaturação (98°C, 10 s), anelamento (55°C,30 s) e extensão (72°C, 120 s). O produto de PCR resultante foi ligado aovetor pGEM-T Easy (Promega).

O vetor incluindo a seqüência contendo o gene de slr1790 foitransformado em E. coli (cepa JM109) através do método de choque térmicoe os transformantes foram selecionados sobre meio de ágar LB contendoampicilina. A colônia que emergiu foi cultivada em meio líquido LB contendoampicilina e um plasmídeo (pslr1790S) foi purificado da cultura. Em seguida,PCR foi realizada usando o gene de resistência à canamicina (1,3 kbp) inclu-ído na tag de transposon como um template, iniciadores os quais continhamum sítio Nhel, Km Nhel f (SEQ ID NO: 10) e Km Nhel r (SEQ ID NO: 11) eTaq Polimerase TaKaRa EX (Takara) para amplificar um produto de PCRcompreendendo o gene de resistência à canamicina. A PCR foi realizadacom 28 ciclos de desnaturação (98°C, 10 s), anelamento (58°C, 30 s) e ex-tensão (72°C, 80 s). O produto de PCR obtido foi digerido com Nhel e ligadoao sítio Nhel no meio do gene de siri 790 do vetor. Esse plasmídeo foi trans-formado em E. coli (JM109) através do método de choque térmico e ostransformantes foram selecionados sobre meio de ágar LB contendo cana-micina. A colônia que emergiu foi cultivada em meio líquido LB contendo ca-namicina e um plasmídeo (pslr1790SKM) foi purificado da cultura. Essa es-trutura para ruptura do gene slr1790 é mostrada na Figura 3. SynechocystisPCC6803 foi transformado com esse plasmídeo pslr1790SKM e mutantes genede slr1790-rompido foram selecionados através de cultura do transformanteresultante sobre meio de ágar BG11 contendo canamicina. A transformação deSynechocystis PCC6803 foi realizada de acordo com um método descrito ante-riormente (Williams JG. Methods Enzymol (1998) 167: página 766).

Exemplo 5

(Análise de mutante gene de proteína slr1790-rompido)

Quando protoporfirinogênio oxidase é rompida, acúmulo de pro-toporfirinogênio IX, o qual é um substrato, é esperado. Contudo, protoporfiri-nogênio IX é tão instável que ele reage facilmente com o oxigênio no ar eoxida facilmente em protoporfirina IX durante o processo de extração. Por-tanto, ruptura de protoporfirinogênio oxidase pode ser determinada atravésde medição da quantidade de protoporfirina IX após operação de extraçãoem ar. Medição da quantidade de protoporfirina IX para o mutante gene deslr1790-rompido foi realizada como segue.

O mutante gene de slr1790-rompido obtido no Exemplo 4 foi cul-tivado em 50 ml de meio líquido BG11 aerado usando um tubo de ensaio sobiluminação contínua com uma luz fluorescente branca (intensidade de ilumi-nação: 30 μιτιοίε s"1 m"2), a 30°C durante 1 semana para obter uma soluçãode cultura. Pigmentos contendo protoporfirina IX foram extraídos da soluçãode cultura obtida usando acetona a 90% para obter uma solução de extratode pigmento. Essa solução de extrato de pigmento foi submetida à HPLC eanálise por HPLC foi realizada usando uma coluna de octilsílica (WatersSymmetry C8 (150 χ 4,6 mm)) e metanol (eluente) sob as condições de umataxa de fluxo de 1,2 ml/min e forno da coluna ajustado a 40°C (bomba LC-10ATVP e AutoSampIer SIL-1OADVP são da Shimadzu Corp.). ProtoporfirinaIX foi monitorada usando o comprimento de onda de excitação de 405 nm ecomprimento de onda de fluorescência de 633 nm (detector de fluorescênciaRF-10AXLé da Shimadzu Corp.). O resultado é mostrado na Figura 4C. Ain-da, ao invés do mutante gene de slr1790-rompido, análise de SynechocystisPCC6803, no qual o gene não é rompido, foi realizada da mesma forma e oresultado é mostrado na Figura 4B. Ainda, cromatograma de uma amostrade protoporfirina IX é mostrado na Figura 4A.

Conforme mostrado na Figura 4, 20 vezes ou mais protoporfirinaIX foi acumulada no mutante gene de slr1790-rompido do que uma cepa naqual o gene não é rompido. A partir disso e do fato de que a enzima não i-dentificada entre as enzimas relacionadas ao metabolismo de cianobactériade protoporfirinogênio IX ou protoporfirina IX é apenas protoporfirinogêniooxidase, foi revelado que o siri 790 codifica protoporfirinogênio oxidase.Também, o slr1790 tem homologia extremamente baixa à protoporfirinogêniooxidases conhecidas. Homologias de protoporfirinogênio oxidases conheci-das ao slr1790 a nível de aminoácido são mostradas na Tabela 3.

Tabela 3

Protoporfirinogênio oxidases conhecidas Homologia ao slr1790 (%)P PX1 de tabaco (Acesso ao Genbank Y13465) 12,2PPX2 de tabaco (Acesso ao Genbank Y13466) 12,5PPOX de Arabidopsis thaliana (Acesso ao Genbank D83139) 12,5HemY de Bacillus subtilis (Acesso ao Genbank M97208) 13,4PPX de camundongo (Acesso ao Genbank D45185) 13,6PPX humana (Acesso ao Genbank D38537) 13,6PPX de Saccharomyces cerevisiae (Acesso ao Genbank Z71381) 11,9hemG de E. coli (Acesso ao Genbank X68660) 14,9Exemplo 6

(Introdução de slr1790 de protoporfirinoqênio oxidase de cianobactéria emArabidopsis)

Como um vetor de expressão para plantas, pBI121 foi usado. AFigura 5 mostra uma vista esquemática do pBI121.

Protoporfirinogênio oxidase de planta é uma enzima que existeem cloroplastas e mitocôndrias. Dessa vez, contudo, o sinal de localizaçãono cloroplasta de derivado de clorofila Arabidopsis, uma oxigênio (CAO, A-cesso ao Genbank BT002075) foi ligada ao gene de slr1790 e introduzida deforma a expressar siri 790 em cloroplasta. Para previsão do sinal de locali-zação, TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) foi usado. O proce-dimento detalhado é como segue.

O vetor pBI121 (14,8 kbp) foi tratado com as enzimas de restri-ção BamHI e Sacl para remover um gene GUS (1,9 kbp) e a parte do vetor(12,9 kbp) foi purificada do gel. Ainda, usando o cDNA de Arabidopsis obtidono Exemplo 1 como um template, o sinal de localização em cloroplasta CAO-derivado (0,2 kbp) foi amplificado através de PCR usando iniciadoresBamSma CAO fr. (SEQ ID NO: 12) e Sac CAO rev. (SEQ ID NO: 13) tendoos sítios de reconhecimento de enzimas de restrição BamBI e Saci, respec-tivamente, e KOD-Plus-polimerase (TOYOBO). A PCR foi realizada com 30ciclos de desnaturação (94°C, 15 s), anelamento (55°C, 30 s) e extensão(68°C, 15 s).

O produto de PCR obtido foi ligado no vetor pTA2 tendo resis-tência à ampicilina (TOYOBO, vetor de clonagem de TA para KOD-PIus, 2,9kbp), então, transformado em E. coli (JM109) através do método de choquetérmico e os transformantes foram selecionados sobre meio de ágar LB con-tendo ampicilina. A colônia que emergiu foi cultivada em meio líquido LB con-tendo ampicilina e, então, um plasmídeo (pTACAO) foi purificado. O plasmí-deo pTACAO foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Sacl paraexcisar o sinal de localização em cloroplasta o qual foi, então, purificado dogel. O sinal de localização em cloroplasta purificado derivado de CAO foiligado como um inserto no vetor pBI121, do qual um gene GUS tinha sidoremovido antecipadamente. Esse foi transformado em E. coli (JM109) e ostransformantes foram selecionados sobre meio de ágar LB contendo cana-micina. A colônia que emergiu foi cultivada em meio líquido LB contendo ca-namicina e, então, um plasmídeo (pBICAO, 13,1 kbp) foi purificado. O pBI-CAO foi digerido com a enzima de restrição Sacl e tratado com CIP para evi-tar a auto-ligação e, então, o fragmento de vetor foi purificado do gel.

Em seguida, o gene de slr1790 (0,6 kbp) foi amplificado atravésde PCR usando genoma extraído de Synechocystis como um template, osiniciadores Sac slr1790fr. (SEQ ID NO: 14) e Sac slr1790 rev. (SEQ ID NO:15), nos quais um sítio de reconhecimento de enzima de restrição Sacl éincluído e KOD-Plus-polimerase (TOYOBO). A PCR foi realizada com 30 ci-clos de desnaturação (94°C, 15 s), anelamento (55°C, 30 s) e extensão(68°C, 35 s). O produto de PCR obtido foi ligado ao vetor pTA2 tendo resis-tência à ampicilina, então, transformado em E. coli (JM109) através do mé-todo de choque térmico e os transformantes foram selecionados sobre meiode ágar LB contendo ampicilina. A colônia que emergiu foi cultivada em meiolíquido LB contendo ampicilina e, então, um plasmídeo (pTAslr1790Sac) foipurificado. O plasmídeo pTAslr1790Sac, foi digerido com a enzima de restri-ção Sacl para excisar o gene de slr1790, o qual foi, então, purificado do gel.O gene de slr1790 purificado foi ligado como um inserto no pBICAO que ti-nha sido digerido com a enzima de restrição Sacl antecipadamente, o qualfoi, então, transformado em E. coli (JM109) através do método de choquetérmico e os transformantes foram selecionados sobre meio líquido LB con-tendo canamicina e um plasmídeo (pBlslr1790, 13,6 kbp) foi purificado. Umavista esquemática do pBlslr1790 é mostrada na Figura 6.

Em seguida, Arabidopsis foi transformado através do método inplanta usando a cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens, no qual pBlslr1790foi introduzido através do método de congelamento.

A cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens abrigando o pBlslr1790foi suspensa em 300 mLde tampão de transformação (5% de sacarose, 0,02%de silwetL-77) em uma densidade bacteriana em torno de OD6OO = 0,8-1,0.Em seguida, a parte acima do solo de Arabidopsis plantada em vaso tendobrotos foi embebida na suspensão acima mencionada durante 30 segundose, então, cada vaso foi coberto com um saco plástico durante dois dias. Apósdescobrir, a cultura foi continuada para obter sementes. A cultura foi realiza-da em uma câmara de crescimento (24 h de luz, temperatura: 22°C, intensi-dade da luz: 70 μηιοίε m"2). As sementes obtidas foram esterilizadas e ino-culadas sobre 1/2 meio de Murashige-Skoog contendo 35 ppm de canamici-na e 0,6% de ágar [T. Murashige e F. Skoog Physiol. Plant (1962) 15: página473] para obter transformantes (linhagem slr). Os transformantes foramtransplantados para a terra e cultivados em uma câmara de crescimento pa-ra obter sementes de segunda geração.

Exemplo 7

(Efeito resistência de transformantes contra acifluorfen)

Para a segunda geração de transformantes nos quais a introdu-ção do gene foi confirmada, resistência ao acifluorfen foi investigada.

Introdução do gene foi confirmada com o método a seguir.

Uma região de aproximadamente 2 mm de diâmetro foi coletadade uma folha de cada linhagem slr de Arabidopsis transformada crescida 1 a2 cm de altura em uma câmara de crescimento e DNA genômico foi extraído.Amplificação por PCR foi realizada usando esse DNA genômico como umtemplate, iniciadores AtCAO-tra-up (SEQ ID NO: 16) e Sac slr1790 rev. (SEQID NO: 15), os quais se anelam ao N término e C término do gene introduzi-do, respectivamente, e Taq DNA polimerase (SIGMA). A presença de bandasfoi examinada através de eletroforese em gel de agarose. A PCR foi realiza-da com 40 ciclos de desnaturação (95°C, 30 s), anelamento (55°C, 45 s) eextensão (72°C, 60 s).

Para transformantes nos quais introdução do gene foi confirma-da, o efeito de resistência ao acifluorfen foi testada. Acifluorfen foi preparadocomo emulsão para conter 4% de componente eficaz através de mistura esolubilização de dimetilformamida e tensoativo polioxietileno sorbitano. Essafoi diluída com água para compor a concentração final de acifluorfen de 10μΜ, 5 μΙ do qual foram gotejados usando uma micropipeta sobre folhas deArabidopsis do tipo silvestre e a linhagem slr de Arabidopsis transformada,na qual introdução do gene foi confirmada, ambos crescido para 1 a 2 cm dealtura em uma câmara de crescimento.

O estudo foi continuado até 7 dias após o tratamento com osprodutos químicos e o grau de necrose foi avaliado pelos olhos (em umaescala de 0 a 5, 0 significa sem efeito). Os resultados em 7 dias após trata-mento são mostrados na Tabela 4. O resultado mostra a resistência ao aci-fluorfen em Arabidopsis slr1790-introduzido em comparação com Arabidopsisdo tipo silvestre.

Tabela 4

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Avaliação foi feita pelo olho em uma escala de O a 5, com 5 sig-

nificando morte completa e O significando nenhum efeito.

Exemplo 8

(Teste da potência inibitória de inibidor de protoporfirinogênio oxidase)

A cepa AT obtida no Exemplo 1 e a cepa ATAsIrI 790, na qual ogene de slr1790 foi rompido através do método descrito no Exemplo 4, foramusadas. Meio líquido BG11 antes descrito foi empregado. Com vista à pre-venção de mutação invertida ou perda do gene, cloranfenicol ou canamicinafoi adicionado ao meio em uma concentração final de 25 μΜ para a cepa ATe a cepa ATAsIrI 790, respectivamente, porque o gene de resistência ao clo-ranfenicol é introduzido com protoporfirinogênio oxidase na cepa AT e umgene de resistência à canamicina é introduzido na cepa ATAsIrI 790 quandode rompimento do gene. A cepa AT e a cepa ATAsIrI 790 foram pré-cultivadas com agitação em meio líquido BG11, coletada durante a fase decrescimento e suspensa em meio líquido BG11 fresco suplementado comum antibiótico, de modo que A720 se tornasse 0,1, o qual foi usado para in-vestigação.Um ingrediente farmacêutico ativo de um produto químico deteste foi dissolvido em DMSO e adicionado às cavidades, de modo que aconcentração final de agente se tornasse de 1,0 χ 10'4 M a 1,0 χ 10"9"5 Mpara cada cavidade (a concentração final de DMSO é de 0,5%). O testecompreende agitação da cultura usando uma lâmina com 96 cavidades emuma escala de 100 μΙ em cada cavidade a 30°C de temperatura de incuba-ção sob 1000 Iux de intensidade de luz. A turvação foi medida 6 dias após oinício do teste e comparado com uma amostra de solvente para calcular ovalor de pl50.

Valor de pl50 = -Iog (concentração para inibir 50% de atividade (M))

(Atividade de tratamento com herbicida)

Sementes de Amaranthus Iividus foram plantadas sobre a super-fície do solo cheio em um vaso (200 cm2), seguido por cobertura com umpouco de solo e, então, crescidas para 5 a 10 cm de altura da planta emuma estufa. Cada uma das soluções químicas de teste diluída em água foipulverizada na parte da folhagem de Amaranthus Iividus com uma pequenapulverização em uma quantidade correspondendo à quantidade pulverizadade 1000 litros/ha para obter uma quantidade predeterminada de agente. Cul-tura foi realizada em uma estufa. Então, o efeito herbicida sobre AmaranthusIividus foi examinado duas semanas após o tratamento de acordo com umcritério de exame abaixo. Os resultados são mostrados no índice de herbici-da na tabela abaixo.

Tabela 5

Critério de Exame

<table>table see original document page 48</column></row><table>Valores de 1, 3, 5, 7 e 9 indicam o valor intermediário de 0 e 2, 2e 4, 4 e 6, 6e8e8e10, respectivamente.

Tabela 6

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Tabela 7

<table>table see original document page 49</column></row><table>

A cepa ATAslr1790 mostrou sensibilidade a outros agentes quenão acifluorfen, o qual é um inibidor do tipo difenil-éter de protoporfirinogêniooxidase. Isso significa que inibidores de protoporfirinogênio oxidase geral-mente mostram um efeito inibitório contra a cepa ATAslr1790. Ainda, a ten-dência do valor de pl50 de cada produto químico de teste para a cepaATAslr1790 reflete as atividades de cada tratamento na folhagem e pode serusado para avaliar o efeito de atividade inibitória contra protoporfirinogêniooxidase.

Exemplo 9

(Método de seleção por um composto inibidor de protoporfirinogênio oxida-se-específico)

A partir do Exemplo acima, a cepa AT não mostra sensibilidadeao inibidor de protoporfirinogênio oxidase, enquanto que a ATAsIrI 790 sim.Por outro lado, inibidor de não-protoporfirinogênio mostrou atividade inibitóriacontra a cepa AT e a cepa ATAsIrI 790 em graus similares. Dessa forma,comparando o efeito inibitório de um produto químico contra a cepa AT e acepa ATAsIrI790, o efeito inibitório de cada composto químico de teste con-tra protoporfirinogênio oxidase é determinado.

Aplicabilidade Industrial

Uma vez que a protoporfirinogênio oxidase da presente invençãotem uma estrutura significativamente diferente daquelas conhecidas, espera-se que ela seja aplicada à seleção de novos herbicidas inibidores de proto-porfirinogênio oxidase. Ainda, espera-se que a protoporfirinogênio oxidaseda presente invenção seja aplicada à produção de plantas fotossintéticastendo resistência a um herbicida inibidor de protoporfirinogênio oxidase ouplantas tendo resistência a um ambiente estressante. Além disso, mesmoem um caso onde uma proteína homóloga a uma proteína conhecida nãopode ser encontrada em um banco de dados de gene de outra espécie, ométodo da presente invenção para isolamento de um gene pode proporcio-nar um método eficaz para isolar o gene de outra espécie.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Nippon Soda Co., Ltd.

National University Corporation Hokkaido University

<120> PROTOPORFIRINOGÊNIO OXIDASE TENDO ATIVIDADE DE CONFE-RIR RESISTÊNCIA CONTRA ACIFLUORFEN E GENE DA MESMA

<130> 00F00753

<150> JP2005-278942<151> 2005-09-26

<160> 20

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> Synechocystis sp. PCC6803

<400> 1 atggcctact actggtttaa agccttccac ttgattggca ttgttgtttg gtttgctgga 60ttattttatt tagtgcgtct ttttgtctat cacgccgagg cagaccagga gccggaacca 120gctaaaacta tcctcaaaaa acagtatgag ttgatggaaa agcggcttta caacatcatc 180actacccccg gcatggtagt tacggtggct atggcgatcg gtctcatttt cacagaaccc 240gaaattctca aatccggctg gctccacatc aaactcacct ttgtggcgtt actgttgctt 300taccatttct attgtggtcg ggtgatgaaa aagctagccc agggggaatc ccaatggagt 360gggcaacagt tccgggcttt aaatgaggca ccgactattt tgctcgtggt gattgtccta 420ctggcggtgt ttaagaataa tttgcccctg gatgcgacca cttggttaat tgtagctttg 480gttattgcca tggctgcttc gattcaactc tacgctaaaa aacgtcgccg ggaccaagca 540ctattaacgg aacagcaaaa agcggcttct gctcagaatt ag 582

<210> 2

<211> 193

<212> PRT

<213> Synechocystis sp. PCC6803

<400> 2

Met Ala Tyr Tyr Trp Phe Lys Ala Phe His Leu Ile Gly Ile Val Val1 5 10 15

Trp Phe Ala Gly Leu Phe Tyr Leu Val Arg Leu Phe Val Tyr His Ala20 25 30

Glu Ala Asp Gln Glu Pro Glu Pro Ala Lys Thr Ile Leu Lys Lys Gln35 40 45Tyr Glu Leu Met Glu Lys Arg Leu Tyr Asn Ile Ile Thr Thr Pro Gly50 55 60

Met Val Val Thr Val Ala Met Ala Ile Gly Leu Ile Phe Thr Glu Pro65 70 75 80

Glu Ile Leu Lys Ser Gly Trp Leu His Ile Lys Leu Thr Phe Val Ala85 90 95

Leu Leu Leu Leu Tyr His Phe Tyr Cys Gly Arg Val Met Lys Lys Leu100 105 110

Ala Gln Gly Glu Ser Gln Trp Ser Gly Gln Gln Phe Arg Ala Leu Asn115 120 125

Glu Ala Pro Thr Ile Leu Leu Val Val Ile Val Leu Leu Ala Val Phe130 135 140

Lys Asn Asn Leu Pro Leu Asp Ala Thr Thr Trp Leu Ile Val Ala Leu145 150 155 160

Val Ile Ala Met Ala Ala Ser Ile Gln Leu Tyr Ala Lys Lys Arg Arg165 170 175

Arg Asp Gln Ala Leu Leu Thr Glu Gln Gln Lys Ala Ala Ser Ala Gln180 185 190

Asn

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador ATHPPOX. Aself

<400> 3

ggggattaat ggagttatct cttctccgt 29

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<22 0>

<223> Iniciador ATHPPOX.r

<400> 4

ttacttgtaa gcgtaccgtg

20<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Chloram.r

<400> 5

gctaaccgtt tttatcacct ggggggcacc ttatttt

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador SPE2Xbal.r

<400> 6

tgtttctaga taatcctggt c

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Chloram.Xbal.f

<400> 7

ggtctagatg atgtccggcg gtgctttt

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Slrl790km EcoRl f

<400> 8

ggggaattct gcttgcatca atatggtggc

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Slrl790km Hind3 r

<400> 9

gggaagctta ccctggagat ccactggtt<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Km Nhel f

<400> 10

ggggctagcg cgaagaactc cagcatgaga

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Km Nhel r

<400> 11

ggggctagca gcttcacgct gccgcaagca ct

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador BamSma CAO fr.

<400> 12

gaggatcccc gggtggtcag tcccttatga acgccgccgt gtttagtc

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Sac CAO rev.

<400> 13

ttacttgtaa gcgtaccgtg

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Sac slrl790fr.

<400> 14ccgagctcgc ctactactgg tttaaagcct tc

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador Sac slrl790 rev

<400> 15

cçgagctcct aattctgagc agaagccgc

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador AtCAO-tra-up

<400> 16

aacgccgccg tgtttagtcc

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> ΚΑΝ-2-fr

<400> 17

ggcctgttga acaagtctgg aa

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> KAN-2-rev

<400> 18

ggcgtttccc gttgaatatg gctc

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> KAN-2 FPl<400> 19acctacaaca aagctctcat caacc

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> KAN-2R P 1

<400> 20

gcaatgtaac atcagagatt ttgag

Claims

1. Protoporfirinogênio oxidase tendo atividade de conferir resis-tência ao acifluorfen a um organismo e sendo derivado de cianobactéria.

2. Protoporfirinogênio oxidase de acordo com a reivindicação 1,em que a cianobactéria é uma cianobactéria pertencendo ao gênero Syne-chocystis.

3. Protoporfirinogênio oxidase de acordo com a reivindicação 1ou 2, em que o organismo é uma planta.

4. Proteína mostrando qualquer um de (a) a (c) a seguir:(a) a proteína compreendendo a seqüência de aminoácido mos-trada em SEQ ID NO: 2;(b) uma proteína tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase,a qual compreende uma seqüência de aminoácido em que um ou vários a-minoácidos são deletados, substituídos ou adicionados na seqüência de a-minoácido mostrada em SEQ ID NO: 2; e a qual tem uma atividade de confe-rir resistência ao acifluorfen a um organismo; e(c) uma proteína tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase,a qual tem 20% ou mais de homologia à seqüência de aminoácido mostradaem SEQ ID NO: 2 e tem uma atividade de conferir resistência ao acifluorfena um organismo.

5. Proteína de acordo com a reivindicação 4, em que a proteínaé derivada de uma cianobactéria.

6. DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase que codifica aprotoporfirinogênio oxidase como definida em qualquer uma das reivindica-ções 1 a 3 ou codifica a proteína como definida na reivindicação 4 ou 5.

7. DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase mostrando (d) ou(e) a seguir:(d) o DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase compreen-dendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1; ou(e) um DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase que com-preende uma seqüência de nucleotídeo em que um ou vários nucleotídeossão deletados, substituídos ou adicionados na SEQ ID NO: 1 e codifica umaproteína tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase e tendo uma ativida-de de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo.

8. DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase que se hibridizacom um DNA compreendendo uma seqüência complementar à seqüência denucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes e codifi-ca uma proteína tendo atividade de protoporfirinogênio oxidase e tendo umaatividade de conferir resistência ao acifluorfen a um organismo.

9. DNA de gene de protoporfirinogênio oxidase de acordo com areivindicação 7 ou 8 em que a proteína tendo atividade de protoporfirinogê-nio oxidase é derivada de cianobactéria.

10. Vetor recombinante no qual o DNA de gene de protoporfiri-nogênio oxidase como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 9 éincorporado.

11. Transformante no qual o vetor recombinante como definidona reivindicação 10 é introduzido.

12. Transformante de acordo com a reivindicação 11, em que otransformante tem resistência ao acifluorfen.

13. Transformante de acordo com a reivindicação 11 ou 12, emque o transformante é um microorganismo.

14. Transformante de acordo com a reivindicação 11 ou 12, emque o transformante é uma planta.

15. Transformante de acordo com a reivindicação 14, em que acapacidade fotossintética é aumentada.

16. Método para avaliação de uma atividade inibitória contra pro-toporfirinogênio oxidase usando o transformante como definido em qualqueruma das reivindicações 11 a 15.

17. Método de seleção por um inibidor de protoporfirinogêniooxidase usando o transformante de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 11 a 16.

18. Método para isolamento de um gene de protoporfirinogêniooxidase de cianobactéria compreendendo as etapas (f) a 0) a seguir:(f) introdução de um gene de protoporfirinogênio oxidase de A-rabidopsis em cianobactéria;(g) ruptura de um gene de cianobactéria usando um transposon;(h) seleção de uma cepa mutante com gene de protoporfirinogê-nio oxidase rompido;(i) identificação do gene de protoporfirinogênio oxidase rompido; e(j) isolamento do gene de protoporfirinogênio oxidase rompido.

19. Método para uso da proteína como definido na reivindicação-4 ou 5 como uma protoporfirinogênio oxidase.

20. Método para converter protoporfirinogênio IX em protoporfiri-na IX através de contato artificial do protoporfirinogênio IX com a proteínacomo definida na reivindicação 4 ou 5.

21. Método para uso do DNA como definido em qualquer umadas reivindicações 6 a 9 como um gene de protoporfirinogênio oxidase.

22. Método para conversão de protoporfirinogênio IX em proto-porfirina IX através de contato do protoporfirinogênio IX com um produto deexpressão artificialmente expresso a partir do DNA como definido em qual-quer uma das reivindicações 6 a 9.

23. Método para isolamento de um gene que codifica uma prote-ína tendo uma determinada função de um organismo específico compreen-dendo as etapas (1) a (5) a seguir:(1) geração de um transformante através de introdução, no or-ganismo específico, de um gene que codifica uma proteína que complemen-ta a determinada função, em que o gene é derivado de um outro organismoque não o organismo específico;(2) geração de uma cepa mutante do transformante através deruptura aleatória de um gene do transformante;(3) seleção de uma cepa mutante que é rompida no gene quecodifica a proteína tendo a determinada função usando um agente que atuasobre a proteína que complementa a determinada função, mas não atua so-bre a proteína tendo a determinada função ou através de troca das condi-ções de cultura;(4) identificação do gene rompido que codifica a proteína tendo adeterminada função; e(5) isolamento do gene rompido que codifica a proteína tèndo adeterminada função.

24. Método para isolamento de um gene de acordo com a reivin-dicação 23, em que a mutagênese é uma mutagênese usando um transposon.

25. Método para isolamento de um gene de acordo com a reivin-dicação 23 ou 24, em que a proteína que complementa a determinada fun-ção derivada de um outro organismo que não o organismo específico é pro-toporfirinogênio oxidase de Arabidopsis.

26. Método para isolamento de um gene de acordo com a reivin-dicação 25, em que o agente que atua sobre a proteína que complementa adeterminada função, mas não atua sobre a proteína tendo a determinadafunção é acifluorfen.

27. Método para isolamento de um gene de acordo com a reivin-dicação 25 ou 26, em que a proteína tendo uma determinada função no or-ganismo específico é protoporfirinogênio oxidase de cianobactéria.