JP2003339386A - 葉緑体光定位運動に係わる遺伝子、それを用いた核酸プローブ、及び葉緑体光定位運動欠損植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 昨今の遺伝子組換技術の発展により作製され
た組換植物の自然界への拡散防止のための葉緑体光定位
運動遺伝子、それを用いた核酸プローブ、及び葉緑体光
定位運動欠損植物を提供する。とりわけ太陽光などの強
光で白化・枯死化する植物を提供する。 【解決手段】 以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコー
ドする遺伝子。（ａ）特定のアミノ酸配列を有する蛋白
質（ｂ）特定のアミノ酸配列において１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
を有し、かつ葉緑体光定位運動活性を有する蛋白質

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、昨今の遺伝子組換
技術の発展により作製された組換植物の自然界への拡散
を防ぐ技術に関し、より詳しく言えば、その自然界への
拡散防止のための葉緑体光定位運動遺伝子、それを用い
た核酸プローブ、及び葉緑体光定位運動欠損植物、とり
わけ太陽光などの強光で白化・枯死化する植物を提供す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】生物にとり光は最も重要な環境因子の一
つである。特に植物は種子発芽から花芽形成に至る成長
過程の全段階が光の制御を受けている。光の波長、強
度、照射方向、照射時間、偏光の振動面の向きなどを受
容・認識し、その情報により生体内の諸機能を調整し
て、植物自体の置かれた環境に適応して生活している。
このような外界の光環境を受容する光受容体には、赤・
近赤外光を受容する色素タンパク質であるフィトクロ
ム、および青色光、ＵＶ−Ａを受容するクリプトクロム
とフォトトロピンが知られている。

【０００３】赤色光により制御を受ける生理反応とし
て、種子発芽、茎の伸長成長、子葉の展開、花芽形成な
どが知られている。近年ではフィトクロムからの情報の
伝達に関わる因子として、ＰＩＦ３（Ni et al, 199
8）、ＮＤＰＫ２（Choi et al, 1999）が同定された。

【０００４】一方、青色光により誘導される現象（Brig
gs and Huala, 1999）としては、シダ胞子の光発芽抑
制、胚軸伸長抑制、子葉の展開、光方向への屈曲、気孔
の開閉運動、葉緑体光定位運動などが知られている。し
かし青色光受容体の情報伝達に関わる因子はほとんど分
かっていなかった。

【０００５】ところで、光合成の場としての葉緑体も外
界の光環境に反応してその位置を変える。弱光下では光
合成効率を上げるために細胞表面に分散し（弱光反
応）、強光下では光ダメージを避けるように細胞壁の脇
に定位する（強光反応）。この現象は、緑藻から高等植
物に至るまで広く知られている（Haupt et al, 1985、Z
urzycki, 1980）。

【０００６】これまで、本発明者らは、その中のシダ植
物Adiantum capillus-veneris Lの配偶世代を用い、細
胞レベルでの葉緑体光定位運動を詳細に調査した（Wada
andSugai, 1994）。弱光反応、強光反応共に赤色光、
青色光の両方が関与し（Yatsuhashi et al, 1985）、光
受容体はフィトクロームと青色光受容体であること（Ya
tsuhashi et al, 1985）を見出した。

【０００７】また、本発明者らは、無核化した細胞でも
運動が起こるので遺伝子の転写を伴わない現象であるこ
と、カルシウムのキレート剤を添加すると運動が阻害さ
れることからカルシウム信号伝達系が関与しているこ
と、さらにアクチン重合阻害剤あるサイトカラシンBで
葉緑体の運動が阻害されること、ローダミンファロディ
ンによるアクチン繊維の染色から葉緑体が定位した後葉
緑体の周辺部に沿ってアクチン微小繊維のフィラメント
が形成され、このアクチンリングが葉緑体と細胞膜の間
に存在すること等を確かめた。

【０００８】これらの事実からシダの葉緑体光定位運動
の情報伝達系では、フィトクロムと青色光受容体が光シ
グナルを受けた後、カルシウム信号伝達系を介してアク
トミオシン系が実際の運動に関与していることが予想さ
れている。

【０００９】しかし、このような葉緑体光定位運動が、
どのような効果を有しているのか具体的には明らかでは
なかった。言い換えると、葉緑体の逃避運動の効果がど
のようなものであるか明らかではなかった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、昨今の遺伝
子組換技術の発展により作製された組換植物の自然界へ
の拡散を防ぐ技術に関し、より詳しく言えば、その自然
界への拡散防止のための葉緑体光定位運動遺伝子、それ
を用いた核酸プローブ、及び葉緑体光定位運動欠損植物
を提供することを目的とする。とりわけ太陽光などの強
光で白化・枯死化する植物を提供することを目的とす
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】以上の実情に鑑み、本発
明者は、突然変異誘導された植物からスリット法を用い
てスクリーニングすることにより葉緑体光定位運動欠損
植物を取得し、該葉緑体光定位運動欠損植物が生長後、
強光下で白化・枯死化することを見出し、本発明を完成
するに至った。すなわち本発明は、（１） 以下の
（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードする遺伝子、 （ａ）配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を
有する蛋白質 （ｂ）配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に
おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列を有し、かつ葉緑体光定位運動
活性を有する蛋白質、（２）（１）に記載の遺伝子の一
部又は全部を用いることを特徴とする、葉緑体光定位運
動遺伝子をスクリーニングするための核酸プローブ、そ
して（３）以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を欠損する
葉緑体光定位運動欠損植物、 （ａ）配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を
有する蛋白質 （ｂ）配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に
おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列を有し、かつ葉緑体光定位運動
活性を有する蛋白質を提供するものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。

【００１３】本発明を適用しうる植物材料はいかなる植
物でもよいが、特にダイコン、キャベツ、ハクサイ、ブ
ロッコリー、カリフラワー、シロイヌナズナなどのアブ
ラナ科植物であることが好ましいものとして挙げられ
る。本発明の葉緑体光定位運動欠損植物の枯死化に用い
る光は、太陽光、白色光であることが好ましい。上記枯
死化に用いる光は、１０Ｗ／ｍ^２以上の強光であること
が特に好ましく、１０Ｗ／ｍ^２以上の白色光であること
が最も好ましい。

【００１４】本発明の葉緑体光定位運動欠損植物を製造
するに当り使用される、植物の突然変異誘導法はＴ−Ｄ
ＮＡ（トランスファーＤＮＡ）の挿入による方法、トラ
ンスポゾンによる方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルフォ
ネート）による方法、又は重イオンビーム、中性子、ガ
ンマー線若しくは紫外線照射による方法などの公知のい
かなる方法でもよいが、特に、Ｔ−ＤＮＡの挿入による
方法が好ましい。

【００１５】葉緑体光定位運動欠損植物をスクリーニン
グするためにスリット法を用いることができる。該スリ
ット法は、本発明者が開発した方法であって、葉緑体の
強光反応が欠損した変異体を得るために用いることがで
きる。

【００１６】葉全体に強光を照射すると葉全体が白化
し、該白化はもとの緑色に対してわずかな程度であるの
で全体に照射した場合は区別し難い。そこで、該スリッ
ト法は、スリットを用いることにより植物の強光反応に
よって生じる葉のわずかな白化を肉眼で確認できるよう
にした方法である。

【００１７】具体的には、複数の植物個体について各々
の個体の葉１枚を切取り、切取った葉各々に幅数ｍｍの
スリットを通してだけ光が照射されるように該切取った
葉を覆い、光照射後、覆いを外し、強光反応に由来する
スリット幅に相当する白色バンドを肉眼観察により確認
し、該白色バンドが生じない強光反応欠損体を選抜する
方法である。また、上記スリットの幅は、該白色バンド
の際立ちに影響する。スリットの幅は１〜３ｍｍである
ことが好ましい。

【００１８】次に、葉緑体光定位運動欠損植物から原因
遺伝子を獲得する方法について説明する。本発明におい
て、葉緑体光定位運動欠損植物から原因遺伝子を獲得す
るための好ましい１例として、以下の工程からなる方法
を示す：葉緑体光定位運動欠損植物からのＤＮＡ抽出す
る工程、変異体ゲノム内のＴ−ＤＮＡを含め１０〜２０
ｋｂの断片を与えるような制限酵素を探し、葉緑体光定
位運動欠損植物ゲノム内のＴ−ＤＮＡの挿入数を確認す
るためのサザンハイブリダイゼ−ションを行う工程、変
異体の原因遺伝子をタグを用いてスクリーニングするた
めにプラスミドレスキュー法を用いる工程、塩基配列決
定する工程、上記プラスミドレスキュー法で得られた遺
伝子断片の全長ｃＤＮＡ（コンプレメンタリーＤＮＡ）
を獲得するためのｃＤＮＡライブラリースクリーニング
を行う工程、ＲＮＡを抽出する工程、スクリーニングし
たｃＤＮＡの５’側の未知領域をクローニングするため
の５’−ＲＡＣＥ法を用いる工程、及びｃＤＮＡ配列に
対応するゲノムＤＮＡの配列決定する工程。

【００１９】上記葉緑体光定位運動欠損植物からのＤＮ
Ａ抽出は、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブ
ロミド）−ＣｓＣｌ法などの周知の方法によって行うこ
とができる。

【００２０】上述の植物の突然変異誘導にＴ−ＤＮＡ等
の外来遺伝子を用いた場合、該外来遺伝子をタグとして
用い原因遺伝子をスクリーニングする方法は、プラスミ
ドレスキュー法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ チェイン リ
アクション）を用いる方法、ゲノムライブラリーを作製
して単離する方法等特に制限はないが、プラスミドレス
キュー法により行うことが好ましい。

【００２１】上記プラスミドレスキュー法を行うにあた
り、該葉緑体光定位運動欠損植物ゲノム内の該外来遺伝
子の挿入数の確認、挿入外来遺伝子の再編成の有無の推
定、又は該ゲノム内の該外来遺伝子を含め１０〜２０ｋ
ｂの断片を与えるような制限酵素の探索のための方法
は、サザンハイブリダイゼ−ション等周知のいかなる方
法を用いてもよい。

【００２２】上記サザンハイブリダイゼ−ションにおけ
るプローブは、該外来遺伝子上の配列であるのが好まし
い。

【００２３】上記サザンハイブリダイゼ−ション又は上
記プラスミドレスキュー法において用いられる制限酵素
は、上記外来遺伝子上に認識配列がないことが好まし
く、通常の制限酵素を用いてよく、好ましくは、６塩基
認識の制限酵素、さらに好ましくは、ＸｈｏＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＭｌｕＩ、ＮｓｉＩ、Ｓｐ
ｅＩ、もっとも好ましくは、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ、ＰｓｔＩである。

【００２４】変異体の原因遺伝子をスクリーニングする
ための上記プラスミドレスキュー法（モデル植物の実験
プロトコール（秀潤社）参照）について説明する。上記
プラスミドレスキュー法の手順の好ましい１例を以下に
示す。

【００２５】Ｔ−ＤＮＡの内部の抗生物質耐性遺伝子部
位と目的とするＴ−ＤＮＡに隣接する植物ゲノムＤＮＡ
を含むように制限酵素を選択する。例えば、ＸｈｏＩ、
ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ（レフトボーダー側）、ＸｈｏＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ（ライトボーダー側）を選択す
る。２μｇのＤＮＡを６０μｌ中２０ユニットの制限酵
素を用いて１時間、３７℃で処理する。ＤＮＡの切断を
確認した後、１４６μｌのＴＥ（トリスＥＤＴＡ）を加
える。フェノール／クロロホルム処理をしてエタノール
沈澱を行い、１００μｌのＳＤＷ（滅菌脱イオン水）に
融解した後、０．８ｍｌ中１０ユニットのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造社製）を加え、１６℃、１晩インキュベ
ートしてＤＮＡ断片を自己ライゲーション化する。

【００２６】これをエタノール沈澱をし、７０％エタノ
ールで沈澱を２回洗浄した後１／２ＴＥに溶解する。溶
解液５μｌをＤＨ１０Ｂ（登録商標）コンピテント細胞
を用いて４２℃で形質転換した後２分間氷上に置き、Ｓ
ＯＣ培地、０．９ｍｌを加え３７℃で１時間培養したＬ
Ｂ培地＋アンピシリン＋テトラサイクリン（ＸｈｏＩ処
理）、ＬＢ培地＋アンピシリン（その他の酵素処理）培
地にひろげ３７℃、１晩培養する。数コロニーを液体培
養してプラスミド精製機でプラスミドＤＮＡを抽出す
る。また、大量数のレスキューされた産物を分類するた
めに認識塩基数の少ない制限酵素ＡａｔＩＩを用い切断
パターンを確認してもよい。

【００２７】本発明において塩基配列決定法は周知のい
かなる方法を用いて行ってもよい。以下に好ましい手順
の１例を示す。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ビッグ ダイ タ
ーミネーター サイクル シークエンシング レディー
リアクション キットのプロトコールに従い反応を行
う。反応産物をジェネテック解析機ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ
３１０（株式会社パーキンエルマ−ジャパン製）で検出
する。結果は、ＧＥＮＥＴＩＣ−ＭＡＣ ｖｅｒ.８
（ソフトウエアー開発株式会社製）ソフトウエアを用い
て解析し、塩基配列を決定する。

【００２８】上記プラスミドレスキュー法等の原因遺伝
子をスクリーニングする方法で得られた遺伝子部分断片
の全長ｃＤＮＡを獲得するためには、ｃＤＮＡライブラ
リースクリーニング法、ＲＮＡ抽出法、スクリーニング
したｃＤＮＡの５’側の未知領域のクローニング法等を
組合わせて用いてもよい。

【００２９】上記ＲＮＡの抽出方法としては、フェノー
ル／ＳＤＳ法(ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ
ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｗｉｋｅ
ｙ)等周知のいかなる方法を用いてもよい。

【００３０】上記スクリーニングしたｃＤＮＡの５’側
の未知領域をクローニングする方法は特に制限はない
が、５’−ＲＡＣＥ（５’ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法、Ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ−ａｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ法、Ｏｌｉｇｏ−
ｃａｐ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ＰＣＲ法等公知のい
かなる方法を用いてもよいが、５’−ＲＡＣＥ法が好ま
しい。

【００３１】上記５’−ＲＡＣＥ法について説明する
（モデル植物の実験プロトコール（秀潤社）参照）。上
記５’−ＲＡＣＥ法の手順の好ましい１例として、以下
の（１）〜（４）の工程を示す。

【００３２】（１）１ｓｔストランドｃＤＮＡの合成
(逆転写反応) 氷上で植物の全ＲＮＡ（５００ｎｇ）に逆転写用合成プ
ライマー（Ａ）（２．５ｐｍｏｌ）を加えて、ＤＥＰＣ
（ジエチルポリカーボネート）処理水で１５．５μｌに
調整し、７０℃、１０分間インキュベートする。氷上で
１分間冷却した後１０×ＰＣＲバッファー（２．５μ
ｌ）／２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（２．５μｌ）／１０ｍＭ
ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド５’−トリリン酸混合
液）（１μｌ）／０．１Ｍ ＤＴＴ（２．５μｌ）を加
えて２４μｌとし、４２℃、１分間インキュベートす
る。１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ
逆転写酵素を反応液に加え４２℃、５０分間インキュベ
ートをし、続けて７０℃、１５分間インキュベートして
反応を停止する。３７℃、２０秒間軽く遠心分離をかけ
て１μｌのＲＮアーゼ混合液を加えて３７℃、３０分間
インキュベートして氷上に静置する。

【００３３】（２）１ｓｔストランドｃＤＮＡの精製 室温にした１２０μｌのバインディングソリューション
（６ＭＮａＩ）を１ｓｔストランドＤＮＡの反応液に加
え、それをグラス マックス スピン カートリッジに
移し、１，５００ｒｐｍ、２４℃、２０秒間遠心分離を
かけカートリッジを新たな１．５ｍｌチューブに差し込
む。０．４ｍｌの１×洗浄バッファー（４℃）を加え、
１，５００ｒｐｍ、２４℃、２０秒間遠心分離をかけ流
出液を取り除く。同様な操作を３回繰り返した後カート
リッジを４００μｌ（４℃）の７０％エタノールで２回
洗浄した。１，５００ｒｐｍ、２４℃、１分間遠心分離
後カートリッジを新たな１．５ｍｌチューブに移した。
５０μｌのＳＤＷを加えて１，５００ｒｐｍ、２４℃、
２０秒間遠心分離をかけｃＤＮＡを溶出する。

【００３４】（３）ｃＤＮＡのターミナル デオキシヌ
クレオチジル トランスフェラーゼによるテイリング １ｓｔストランドｃＤＮＡ精製サンプル（１０μｌ）に
ＤＥＰＣ処理水（６．５μｌ）／５×テイリングバッフ
ァー（５．０μｌ）／２ｍＭｄＣＴＰ（２．５μｌ）を
加えて２４μｌとする。９４℃、３分間インキュベート
して氷上で１分間冷却する。

【００３５】１μｌのターミナル デオキシヌクレオチ
ジル トランスフェラーゼを加えて３７℃、１０分間イ
ンキュベートし、続けて６５℃、１０分間インキュベー
トして反応を停止させ氷上で冷却する。

【００３６】（４）ＰＣＲ ｄＣでテイルしたｃＤＮＡ（５μｌ）／１０×ＰＣＲバ
ッファー（５μｌ)／２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（３μｌ）
／１０ｍＭｄＮＴＰ混合液（１μｌ）／１０μＭ 逆転
写用合成プライマー（Ｂ）（２μｌ）／１０μＭアダプ
ター付きオリゴｄＧプライマー（２μｌ）にＳＤＷを加
えて４９．５μｌとした。０．５μｌのＥＸ Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを加えて９４℃としたサーマルサイ
クラーにセットして９４℃、１分間／５５℃、１分間／
７２℃、２分間を３５サイクル、最後に７２℃、５分間
でＰＣＲを行う。アガロース電気泳動でＤＮＡの増幅を
確認した後、ＴＡＣｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロ
ジェン社製）を用いてサブクローニングを行う。シーク
エンス反応をして塩基配列を決定する。

【００３７】ｃＤＮＡ配列に対応するゲノムＤＮＡの配
列決定は、周知のいかなる方法を用いて行ってもよい。
以下に好ましい手順の１例を示す。

【００３８】配列の決定されたｃＤＮＡのタンパク質コ
ード領域配列に対応するゲノムＤＮＡの配列を決定する
ためコード領域両端２０ｂｐ外側の位置に５'、３'各々
のＰＣＲプライマーを作成する。正合性の高いｐｆｕ
ＤＮＡ ポリメラーゼ（ストラタジーン社製）等を使い
ＰＣＲを行い、泳動後バンドを確認してＺｅｒｏ Ｂｌ
ｕｎｔ ＴＯＰＯ クローニング キット（インビトロ
ジェン社製）等を使いサブクローニングを行う。プレー
ト上からコロニーを選択して液体培養を行う。プラスミ
ドＤＮＡを抽出して精製後、シークエンス反応を行ない
配列を決定する。以上のようにして配列番号１又は２で
表される葉緑体光定位運動に係わる遺伝子を明らかにす
ることができる。

【００３９】葉緑体光定位運動欠損植物の強光下での枯
死化は、葉の緑度の強光下における経時変化を、同時期
に発芽した野生型と比較評価すること等により証明する
ことができる。また、弱光下では、葉緑体光定位運動欠
損植物も野生型と区別がつかない程同様に生長、開花す
ることを観察することができる。また、葉緑体光定位運
動の欠損は、強光照射による葉の光透過性の変化の評価
や葉切断面の顕微鏡による葉緑体分布の観察から明らか
にすることができる。さらに葉緑体光定位運動欠損植物
の強光下での枯死化に直接的な要因となる光合成系の障
害を、クロロフィル蛍光パラメータ（Ｆｖ／Ｆｍ）につ
いて上記欠損植物と野生型とを比較することにより明ら
かにすることができる。上記Ｆｖ／Ｆｍ値は、光化学系
IIの量子収率に相関があり、光合成系の強光阻害を示す
指標であることが知られている。

【００４０】本発明の葉緑体光定位運動遺伝子の変異体
の組換えにより、植物の強光下での白化・枯死化が可能
となる。さらに、本発明の核酸プローブは遺伝子組換え
技術ないしは遺伝子ノックアウト技術を用いることによ
り、自然環境保全の観点から極めて有用な葉緑体光定位
運動欠損植物の生産の効率化に寄与する。さらに、本発
明の葉緑体光定位運動欠損植物は強光下で白化・枯死化
現象を起こすので、この技術を遺伝子組換植物に適用す
ることによって、その植物の自然界への拡散を避けるこ
とができる。昨今の遺伝子組換技術の発展に伴う組換植
物の自然界への拡散に対する懸念を解消することができ
る。

【００４１】

【実施例】次に、本発明を実施例等により詳しく説明す
るが、本発明はこれらによって制限されるものではな
い。

【００４２】実施例１では、シロイヌナズナ（Arabidop
sis thaliana）（染色体数：２ｎ＝１０、ゲノムサイ
ズ：１．０Ｍｂ）を実験材料に用いて、葉緑体光定位運
動欠損体をスクリーニングし、その変異の原因遺伝子
（変異を受けた、配列番号１で表される遺伝子）を単離
した。実施例１の方法は、配列番号２で表される遺伝子
の単離にも適用することができる。実施例２では、強光
下での枯死化を明らかにした。また、実施例３では、葉
緑体光定位運動欠損を葉の光透過性から評価し、実施例
４ではその欠損により光合成系に支障をきたすことを示
した。

【００４３】 以後の略語は上記の略語表の意とする。

【００４４】実施例 １ ＜植物材料＞実験材料はシロイヌナズナ（Arabidopsis
thaliana L, Heynn）を用いた。野生型種子（Col‐0, g
e-1, Wassilewskija）はレーレ シーズ社から、ＤＮＡ
タグ株はアラビドプシス バイオロジカル リソース
センターから取り寄せたものを用いた。

【００４５】＜培養＞ 培地、滅菌液、培養土 寒天栄養培地として、下記に示すシロイヌナズナ用の改
良型ＧＭ（Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ）培地
を用い、高温高圧滅菌後、角形シャーレ１枚当たり５０
ｍｌの培地を分注し、植物体を生育させた。

【００４６】培地 改良型ＧＭ−３Ｌ用 ４．３１４ｇ ムラシゲアンドスクーグ塩混合液（ラ
イフテクノロジーズ社製） ３０ｇ サッカロース（和光純薬工業社製） ３ｍｌ ムラシゲアンドスクーグビタミン液−Ｘ１０
００（シグマ社製） １．５ｇ ２−モルフォリノエタンスルフォン酸（Ｍ
ＥＳ、同仁堂社製） １Ｎ ＫＯＨを用いてｐＨ５．７とした。 ２４ｇ 植物培地用寒天粉末−０．８％（和光純薬工
業社製）

【００４７】滅菌液として０．６％食塩水（和光純薬工
業社製）、０．１％トリトンＸ−１００を用いた。土壌
は、高温高圧滅菌した培養土に栄養液を添加して鉢に入
れた。培養土としてジフィミックス（株式会社サカタノ
タネ製）を、栄養液はハイポネックス−０．００１％
（株式会社ハイポネックスジャパン製）、鉢は園芸用ポ
ット−直径６センチ（ノバティックＰＰ-日本ポリケム
株式会社製）を用いた。

【００４８】＜植物の培養＞１ｍｌマイクロチューブに
適当数の種子と滅菌液を加え、ミキサー（サーモミキサ
ー モデル−１０８、サーモニクス株式会社製）により
２０秒間撹拌し、滅菌液中で数分あたり１〜２回チュー
ブを上下させながら１０分間種子の滅菌を行った。その
後、小型遠心器（ＩＷＡＫＩ ＣＥＮＴＲＩＦＵＧＥ
Ｍｉｃｒｏ６ＣＥＮＭ−１００、岩城ガラス株式会社
製）での遠心操作により種子を沈澱させて高温滅菌した
パスツールピペット（１．０ｍｌ）を用いて滅菌水で完
全に種子を洗浄した。滅菌した種子を滅菌済みの楊子を
用いてシャーレに１枚あたり５０個まいた。シャーレ
は、通気性のあるサージカルテープ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒ
ｅ（登録商標））でシールした。発芽を同調させるため
に播種を行ったシャーレを４℃で２日間低温処理し、イ
ンキュベータ（ＮＫ−ｓｙｓｔｅｍ、日本医科機器製作
所製）内で２５℃、長日条件（１６時間明、８時間暗）
で、２〜３週間培養し、葉が４〜６枚展開した植物体を
突然変異体のスクリ−ニングに用いた。目的の個体又は
掛け合わせに用いる個体は、寒天培地から土壌培地へ植
え替え、更に培養した。シャーレ内の寒天培地から植物
体を丁寧に抜き取り、寒天を取り去るために根を水道水
で洗浄して、鉢に植えた。バッチに水を張りその中に上
記の様に準備した鉢を置いた。また、植え替え直後は、
バッチ全体をラップで覆った。その後ラップを時間を追
って少しずつとり乾燥状態に順化させた。これを２２
℃、長日条件下（１６時間明、８時間暗）の培養室で生
育させた。

【００４９】＜ＤＮＡ抽出用材料＞大量のゲノムＤＮＡ
を抽出する為に、液体振盪培養した植物(主として根)を
育てた。２０〜５０粒ほどの種子を１．５ｍｌチューブ
に入れ、１ｍｌの７０％エタノールで２分間で表面殺菌
し、続いて、通常の種子の滅菌を行った。４００μｌの
滅菌水に種子を懸濁し、５０ｍｌの液体栄養培地（Ｇａ
ｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ５ 培地、ｐＨ５．０、ＧＩＢＣＯ
社製）の入った３００ｍｌ三角フラスコ（パイレックス
（登録商標）、岩城ガラス株式会社製）に播いた。この
三角フラスコ中の種子を２日間４℃で低温処理した後、
震盪器（ＴＲＩＰＬＥ ＳＨＫＥＲＮＲ−８０、ＴＡＩ
ＴＥＣ社製）を用いて２４℃、２４時間明の条件下で３
週間震盪培養を行った。大量培養した植物体は、総重量
を測定した後、アルミホイルでくるみ液体窒素で冷凍し
た後−８０℃で保存した。

【００５０】＜方法＞ 工程１ 突然変異体のスクリーニング 葉緑体の強光反応が欠損した変異体を得るために本発明
者らが開発したスリット法を用いてスクリーニングを行
った。角形シャーレ中に５０ｍｌ、１％寒天を分注しス
クリーニング用のマットを作る。この寒天上にシロイヌ
ナズナの第１葉〜４葉のうち１枚の葉を切り取り、直線
状に１５０枚ほど並べた。この上から幅２ｍｍのスリッ
トを形成した遮光板を被せ、スリットを通して１５０Ｗ
／ｍ^２の白色光（オーバーヘッドプロジェクター ＨＰ
Ａ３０５ 株式会社エルモ社製）を１時間３０分照射し
た。この間小型送風器（ＯＲＩＸＡＣ ＦＡＮ）で風を
送り、サンプルの温度上昇を避けた。光照射後、スリッ
トを外し、各個体の葉を肉眼観察を行った。野生株同様
に強光反応が起きていれば葉にスリット幅に相当する白
いバンドが現れるのでそのバンドが現れない植物体をス
クリーニングした。

【００５１】工程２（１） ＤＮＡ抽出（根カルチャー
からＤＮＡ単離） 変異体の遺伝子を解析するために全ＤＮＡの抽出を行っ
た。

【００５２】試薬 抽出バッファー １００ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０） ５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ５００ｍＭ ＮａＣｌ １．２５％ ＳＤＳ（ｗ／ｖ） ８．３ｍＮ ＮａＯＨ ０．３８％（ｗ／ｖ）重亜硫酸ナトリウム塩 ５Ｍ 酢酸カリウム ７．４Ｍ 酢酸アンモニウム Ｔ５Ｅ ５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０） １０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ＴＥ １ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０） １ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）

【００５３】冷凍（−８０℃）された根培養サンプル
４．３ｇを液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて充分に破砕
し細粒とした。抽出バッファーを添加して５０ｍｌチュ
ーブ（ファルコン社製）に分抽し、６５℃で１０分間温
めた後、氷上で２０分間静置した。３，５００ｒｐｍ、
４℃、１０分間で遠心分離（Ｈｉｍａｃ ＣＦ−７Ｄ
２、日立製作所社製）した後、上清をミラークロス（カ
ルビオケム社製）に通して残留物を除いた。ここへ０．
７倍量のイソプロピルアルコールを加えて４，０００ｒ
ｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行い上清を捨てた。沈
澱物に０．５４ｍｌのＴ５Ｅを加えて１０秒間撹拌し、
６５℃、５分間インキュベートした後、１．５ｍｌチュ
ーブに移した。０．５ｍｌのＴＥ飽和フェノール（ｐＨ
８．０）を加え、撹拌して１，５００ｒｐｍ、２４℃、
５分間遠心分離後、上清を新しい１．５ｍｌチューブに
移した。０．５ｍｌのクロロホルムを加えて同様な条件
で遠心分離を行ない上清を丁寧に別の１．５ｍｌチュー
ブに取った。５０μｌの５Ｍ酢酸ナトリウムと１ｍｌの
９９．５％エタノールを加えて撹拌し、−８０℃に３０
分間保存した後１，５００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心
分離を行ない上清を除去した。０．７ｍｌの７０％エタ
ノールを加え１，５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離
を行ない上清を除去した。遠心式濃縮機（ＶＣ３６Ｎ、
ＴＡＩＴＥＣ社製）にかけてアルコールを完全に除去し
た。０．２ｍｌのＴＥを加え４℃で保存した。

【００５４】（２） ＤＮＡ簡易抽出法 シロイヌナズナのＤＮＡ迅速単離法（モデル植物の実験
プロトコール、秀潤社）を行った。 試薬 ２×抽出バッファーストック液 ０．６Ｍ ＮａＣｌ ０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５） ４０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） １％ ＳＤＳ １×抽出バッファー ２×ストック液 １ｖｏｌ ５Ｍ 尿素 １０ｍＭ メルカプトエタノール ５％（ｖ／ｖ） ＴＥ飽和フェノール ---------------------------------------------------------- ＳＤＷ ２ｖｏｌ ＰＣＩ：フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）

【００５５】冷凍（−８０℃）した葉組織３〜４枚を
１．５ｍｌチューブに入れ、そこに０．１ｍｌの抽出バ
ッファーを加えた。コンパクトドリルをセットしたペレ
ットミキサーにより、３００ｒｐｍ、２分間で組織を完
全につぶした。０．４ｍｌの抽出バッファーと同量のＰ
ＣＩを加えた。２０秒間、水平に振り、１，５００ｒｐ
ｍ、５分間遠心分離をして、上清を別の１．５ｍｌチュ
ーブに移した。エタノール精製を行ないペレットを乾燥
させた。３５μｌの１／２ＴＥに溶解させた。

【００５６】 工程３ サザンハイブリダイゼ−ション 試薬と器具 ＰＣＩ：フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１ 加水分解液：０．２５Ｍ 塩酸 変性溶液 ：１．５Ｍ ＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌ アルカリトランスファーバッファー：０．４Ｍ ＮａＯＨ ブロッティングメンブレン：ナイロンメンブレン（ハイボンドＮ^＋） ３ｍｍ濾紙 ペーパータオル ブロッティング台１式 ハイブリダイゼーションバッファー １Ｍ チャーチリン酸バッファー ５０ｍｌ ５００ｍＭ ＥＤＴＡ ２００μｌ ＳＤＳ ７ｇ ＳＤＷ トータルボリューム １００ｍｌ

【００５７】変異体ゲノム内のＴ−ＤＮＡを含め１０〜
２０ｋｂの断片を与えるような制限酵素を探し、変異体
ゲノム内のＴ−ＤＮＡの挿入数を確認するためにサザン
ハイブリダイゼ−ションを行った（バイオ実験イラスト
レイテッド、細胞工学別冊、秀潤社）。ゲノムＤＮＡを
切断するために、ゲノムＤＮＡ２００ｎｇに対して制限
酵素ＸｈｏＩ（１００ユニット）、ＳａｌＩ（１００ユ
ニット）、１０×制限酵素バッファーＨ（宝酒造社製）
を添加して、３７℃、２４時間インキュベートして制限
酵素処理をした。精製するために５０μｌのＰＣＩを加
えて撹拌し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分）を
して、上清をマイクロチューブ（１．５ｍｌ）に移し
た。同様の操作を繰り返した後、３Ｍ酢酸ナトリウム５
μｌ、９９．５％エタノール１５０μlを添加して室温
で１０分間静置した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、
４℃、１５分）後、上清を除去して、７０％エタノール
５００μｌで沈澱を洗浄して１５μｌのＴＥに融解させ
た。この切断ＤＮＡ５μｌを０．８％アガロースゲル
（ＳＥＡＫＥＭ ＧＴＧ ＡＧＡＲＯＳＥ、ＦＭＣ Ｂ
ｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）で泳動した。ＤＮＡの変性
とアルカリ変性のために、泳動後のゲルを１０分間０．
２５Ｍ 塩酸処理し、蒸留水による洗浄、３０分間のア
ルカリ変性溶液（１．５Ｍ ＮａＯＨ、０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ）処理を行った。アルカリトランスファーバッファ
ー（０．４Ｍ ＮａＯＨ）でブロティングメンブレン
（ハイボンドＮ^＋）に１６時間かけてＤＮＡを転写して
固定化した。サザンハイブリダイゼ−ション用のプロー
ブは、ＬＢＦ−１（ＣＴＴＣＣＴＡＡＴＧＴＣＴＧＡＴ
ＡＴＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号３））とＬＢＲ−１（Ｔ
ＴＴＡＡＧＡＣＧＣＴＡＴＴＣＣＴＣＡＡＣＴＴＣＣ
（配列番号４））のプライマーを用い、Ｔ−ＤＮＡのレ
フトボーダー側のＤＮＡをＰＣＲ（ＰＣＲ サーマル
サイクラー パーソナル、宝酒造社製）法により作成し
た。プローブのラベルは、Ｐｒｉｍｅｒ−ＩｔＩＩ ラ
ンダム プライマー ラベリング キット（クイックリ
ファレンスプロトコール、ストラタジーン社製）に従い
行った。５０ｎｇＰＣＲ産物にＳＤＷを添加して２４μ
ｌとし、ランダムオリゴヌクレオチドプライマー１０μ
ｌを加え９５℃、５分で反応させ氷上に静置した。１０
μｌの５×バッファー、５μｌのラベルしたヌクレオチ
ド、１μｌのエキソ（−）クレノウを添加して３７℃で
７分間インキュベートした。精製カラム（ＳＵＰＲＥＣ
（登録商標）、宝酒造社製）で遠心分離（３，０００ｒ
ｐｍ、２分）をして精製した。ＤＮＡを熱変性（９５
℃、５分）させた直後に氷上に置きこれをプローブとし
て用いた。メンブレンを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに
よる１次洗浄（６５℃、５分）後、０．１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳによる２次洗浄（６５℃、１５分）を行
った。このメンブレンをラップでくるみＸフィルムを入
れ、−８０℃でオートラジオグラフィを行った。

【００５８】プローブの調製 プローブ調整はＰＣＲ サーマル サイクラー パーソ
ナルを使いＰＣＲ法により目的ＤＮＡの増幅を行った。
反応組成、ＰＣＲサイクルは下記の通りである。泳動後
ゲルから切り出しＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社製）で
精製してプローブを得た。 反応組成 ＳＤＷ ３６．５８ μｌ １０× ＰＣＲ バッファー ５．０ μｌ ｄＮＴＰ 混合液（２．５ｍＭ） ４．０ μｌ ＤＮＡ（ＯＫ００１） ０．５ μｌ ＬＢＦ−１（５０ｐｍ） １．７７ μｌ ＬＢＲ−１（５０ｐｍ） １．６５ μｌ ＥＸ Ｔａｑ（２．５ｕ／ｌ） --------------------------------------------------------- 計 ５０ μｌ プローブの作成に用いた配列プライマー（ＳＰ）の配
列： ＬＢＦ−１：ＣＴＴＣＣＴＡＡＴＧＴＣＴＧＡＴＡＴＡ
ＣＡＧＧＡＴ（配列番号２） ＬＢＲ−１：ＴＴＴＡＡＧＡＣＧＣＴＡＴＴＣＣＴＣＡ
ＡＣＴＴＣＣ（配列番号３） ＰＣＲサイクルは、以下のように設定した。 ×１ ９５℃ ０．５分 ×２５ ９５℃ １．０分 ５５℃ ２．０分 ７２℃ ３．０分 ×１ ７２℃ １０．０分 ---------------------------------------------------------- 保存 ４℃

【００５９】工程４ プラスミドレスキュー法 変異体の原因遺伝子を同定するためにプラスミドレスキ
ュー法を行った。 試薬 抗生物質：アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、（５０μ
ｇ／ｍｌ） 制限酵素：ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ（レフトボー
ダー側）、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ（ライトボ
ーダー側）を選択した。 プラスミド精製機：プラスミド自動分離装置ＲＩ−１０
０（クラボウ社製）

【００６０】Ｔ−ＤＮＡの内部の抗生物質耐性遺伝子部
位と目的とするＴ−ＤＮＡに隣接する植物ゲノムＤＮＡ
を含むように制限酵素を選択した。２μｇのＤＮＡを６
０μｌ中２０ユニットの制限酵素を用いて１時間、３７
℃で処理した。ＤＮＡの切断を確認した後、１４６μｌ
のＴＥを加えた。フェノール／クロロホルム処理をして
エタノール沈澱を行い、１００μｌのＳＤＷに融解した
後、０．８ｍｌ中１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を加え、１６℃、１晩インキュベートし
てＤＮＡ断片を自己ライゲーション化した。これをエタ
ノール沈澱をし、７０％エタノールで沈澱を２回洗浄し
た後１／２ＴＥに溶解した。５μｌをＤＨ１０Ｂ（登録
商標）コンピテント細胞を用いて４２℃で形質転換した
後２分間氷上に置き、ＳＯＣ培地、０．９ｍｌを加え３
７℃で１時間培養したＬＢ培地＋アンピシリン＋テトラ
サイクリン（ＸｈｏＩ処理）、ＬＢ培地＋アンピシリン
（その他の酵素処理）培地にひろげ３７℃、１晩培養し
た。数コロニーを液体培養してプラスミド精製機でプラ
スミドＤＮＡを抽出した。また、大量数のレスキューさ
れた産物を分類するために認識塩基数の少ない制限酵素
ＡａｔＩＩを用い切断パターンを確認した。

【００６１】工程５ 塩基配列決定 ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ビッグ ダイ ターミネーター
サイクル シークエンシング レディー リアクション
キットのプロトコールに従い反応を行った。反応産物
をジェネテック解析機ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０（株式
会社パーキンエルマ−ジャパン製）で検出した。結果
は、ＧＥＮＥＴＩＣ−ＭＡＣ ｖｅｒ.８（ソフトウエ
アー開発株式会社製）ソフトウエアを用いて解析し、塩
基配列を決定した。

【００６２】工程６ ｃＤＮＡライブラリースクリーニ
ング プラスミドレスキュー法で得られた遺伝子断片の全長ｃ
ＤＮＡをとるためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ング（Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ ＬａｍｂｄａＺａｐＩ
Ｉ／ＥｃｏＲＩ／ＣＬＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｖｅｃｔ
ｏｒ Ｋｉｔ、ストラタジーン社製）した。

【００６３】工程６−１ ライブラリーのタイター測定

【００６４】試薬 ＳＭ培地 ５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 食塩水 １０ｍＭ 硫酸マグネシウム ０．０１％ ゼラチン

【００６５】ＳＭ培地で１０００倍希釈したファージ液
を各々１μｌ、１０μｌ、１００μｌとり大腸菌（ＸＬ
−１Ｂｌｕｅ）の培養液（ＯＤ＝０．５）を１００μｌ
ずつ加えた。撹拌して３７℃で１５分間培養した。この
培養液を５５℃で保温された２．５ｍｌの０．７％ソフ
トアガー（ＬＢブロス）に加えた後直径６ｃｍプレート
培地に広げて１５分間静置させた。ソフトアガーが固ま
ったら、４２℃で８時間培養した。プレート上のプラー
ク数からタイターを算出した。

【００６６】工程６−２ プラークリフティング 試薬 変成溶液 ０．５Ｎ ＮａＯＨを１Ｌ×２バット用意した。

【００６７】中和溶液 １．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）を１Ｌ×２バット
用意した。 宿主菌：１０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液に懸濁した大腸
菌（ＯＤ６００＝０．５、ＸＬ−１ＭＲＦ） トランスファーメンブレン（コロニー／プラークスクリ
ーン、ニュー リサーチ プロダクツ社製）

【００６８】５×１０^５ｐｆｕ／ｍｌ ＳＭ培地のファ
ージ液６．４μｌに宿主菌７００μｌを加えて３７℃、
１５分間培養した。あらかじめ５５℃に保温した９ｍｌ
の０．６％ソフトアガロース（アガロースタイプＩＩ、
シグマ社製）に加えて撹拌しプレート培地にまいた。乾
燥後３７℃、８時間培養して４℃に保存した。プレート
上に１枚目のメンブレンは２分、２枚目のメンブレンは
５分間静置しファージＤＮＡを転写した。メンブレンを
変成溶液(２分間２回)、中和溶液(３分間１回、５分間
１回）に順次処理し、ろ紙の上で乾燥させた。さらに真
空オーブンに入れて、８０℃で２時間程加熱した後、４
℃に保存した。

【００６９】工程６−３ 一次スクリーニング プライマー ＃２−９／ＰＲ１ （ＧＴＴＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＡＴ
ＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣ（配列番号５）） ＃２−９／ＰＦ２ （ＡＣＧＡＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＧ
ＡＣＧＴＡＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧ（配列番号６）） ＰＣＲ組成 （μＬ） １０×ＰＣＲ Ｔａｑ バッファー ５ ｄＮＴＰ ２５ｍＭ ４ ＃２−９／ＰＲ１（２０μＬ） １．１ ＃２−９／ＰＦ２（２０μＬ） １．３５ Ｔａｑ ポリメラーゼ（２ユニット） ０．５ ＤＮＡ ０．５ --------------------------------------------------- ＳＤＷを加えて ５０（μｌ）

【００７０】ＰＣＲ法によりライブラリースクリーニン
グのプローブＤＮＡを増幅した。ＰＣＲプライマー（＃
２−９／ＰＲ１、＃２−９／ＰＦ２）を用いてＰＣＲ組
成を調整した。電気泳動後、ゲルから目的のバンドを切
り出し、精製（ＳＵＰＲＥＣ−０１）を行なった。エタ
ノール精製を行った後２００μｌのＴＥに溶解した。エ
タノール精製を行った後２００μｌのＴＥに溶解した。
Ｐｒｉｍｅｒ−ＩｔＩＩ ランダム プライマー ラベ
リング キットに従い、プローブに放射能ラベルをし
た。

【００７１】試薬 ハイブリダイゼーションバッファー（チャーチバッファ
ー） １Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２） ２０％ ＳＤＳ ５００ｍＭ ＥＤＴＡ 洗浄液（１） １×ＳＳＣ（３Ｍ食塩水、３３３ｍＭ クエン酸三ナト
リウム塩・２水和物） ０．１％ＳＤＳ 洗浄液（２） ０．１×ＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ

【００７２】密閉容器にフィルターが充分に浸かるほど
のチャーチバッファーを入れて、プラークリフティング
フィルターを１枚づつ浸した。ハイブリオーブンで６５
℃、２時間振盪しながらプレハイブリダイゼーションを
行った。最終濃度が５×１０ ^５ｃｐｍ／ｍｌになるよう
にプローブを加えた。４２℃で１６時間振盪しながらハ
イブリダイゼ−ションを行った。洗浄液（１）を入れ軽
くリンスした後、充分な洗浄液（１）で２４℃、１５分
間振盪した。充分な量の洗浄液（２）を注ぎ、６５℃で
１５分間振盪した。この操作２回を繰り返した後フィル
ターを濾紙の上で乾燥させた。増感紙と共にＸ線フィル
ムを−８０℃で１５時間露光した。マイクロピペッタ−
チップを用いて、陽性シグナルに対応するプラークを回
収し、５００μｌのＳＭに懸濁した。クロロホルムを１
滴たらしてボルテックスで混合後、軽く遠心分離をし、
４℃に保存した。これを二次スクリーニングに用いた。

【００７３】工程６−４ 二次スクリーニング １プレート当たり１０００ｐｆｕとなるように調整し、
一次スクリーニング同様にクローンを選択した。

【００７４】工程６−５ λファージＤＮＡのプラスミ
ド化（ｉｎ ｖｉｖｏ切り出し） ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’株とＳＯＬＲ株を１０ｍＭ硫
酸マグネシウムにＯＤ６００が１．０となるように再懸
濁した。１５ｍｌポリプロピレンチューブ（ファルコン
社製）に２００μｌのＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’、２５
０μｌの選択した二次スクリーニングファージ液と１μ
ｌ ＥＸ アシストヘルパーファージを加え３７℃で１
５分間培養した。３ｍｌのＬＢ液体培地を加えて３７℃
で３時間振盪培養した。６５℃で２０分間温めた後２，
５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を新しい１５
ｍｌポリプロピレンチューブに移したこのうち１００μ
Ｌ、１０μＬを別々に２００μＬのＳＯＬＲ細胞を入れ
た１．５ｍｌマイクロチューブに分けて３７℃で１５分
間培養した。各々のチューブから２００μＬをＬＢ＋ア
ンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）にまき３７℃で一晩培養
した。

【００７５】工程６−６ ｃＤＮＡ解析 プレート上からコロニーを５つほど選択し液体培養を行
った。プラスミドＤＮＡを抽出して制限酵素ＫｐｎＩ
（１０ユニット）、ＳａｃＩ（１０ユニット）処理し、
挿入されたｃＤＮＡ断片のサイズを確認した。１３％
（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール／１．６Ｍ食塩水、
７０％エタノールで精製してシークエンス反応を行なっ
た。

【００７６】工程７ ＲＮＡの抽出 全ＲＮＡの抽出は、フェノール／ＳＤＳ法(ＣＵＲＲＥ
ＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｗｉｋｅｙ)で行った。 試薬 グリンディングバッファー：０．１８Ｍ トリス 塩酸
／０．０９Ｍ 塩化リチウム／４．５Ｍ ＥＤＴＡ／１
％ＳＤＳ、ｐＨ８．２とした。 ＴＬＥ液：０．２Ｍトリス（ＲＮＡ用）／０．１Ｍ 塩
化リチウム／５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２とした。

【００７７】 フェノール（ＴＬＥ液で平衡化されたもの） クロロホルム（ＲＮＡ用） ８Ｍと２Ｍ 塩化リチウム（ＤＥＰＣ−処理） ３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２、ＤＥＰＣ−処理） ＳＤＷ（ＤＥＰＣ−処理、ＤＥＰＣは、０．２％で使用
した。）

【００７８】長日条件下で培養したシロイヌナズナ（Ｃ
ｏｌｕｍｂｉａ）の全組織８．０ｇに液体窒素を加え、
乳鉢と乳棒を用いて充分に破砕し細粒とした。それを５
０ｍｌポリプレンチューブ（ファルコン社製）に移し、
すぐに１５０ｍｌのグリンディングバッファーと５０ｍ
ｌのフェノールを加え、２分間撹拌した。５０ｍｌのク
ロロホルムを加え、５０℃、２０分間温めて４，５００
ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。水層を別の新し
いチューブに移して５０ｍｌのフェノールを加えて撹拌
し、さらに５０ｍｌのクロロホルムを加えて、４，５０
０ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。水層を１５ｍ
ｌチューブに移し、０．４７ボリュームの８Ｍ塩化リチ
ウムを加えて４℃で一晩沈澱させた後、４，５００ｒｐ
ｍ、４℃で２０分間遠心分離し、沈澱を３ｍｌの２Ｍ塩
化リチウムで洗浄したのち５ｍｌのＤＥＰＣ−処理水を
加えた。再び５０ｍｌのフェノールと、５０ｍｌのクロ
ロホルムを加えて撹拌し、４，５００ｒｐｍ、４℃で２
０分間遠心分離した。水層を移して２００μｌの３Ｍ酢
酸ナトリウムと５．５ｍｌの１００％エタノールを加え
て−２０℃で一晩沈澱させた。４，５００ｒｐｍ、４℃
で１５分間遠心分離して回収したＲＮＡ沈澱を１ｍｌの
ＳＤＷに懸濁して−８０℃に保存した。

【００７９】工程８ ５’−ＲＡＣＥ法 スクリーニングしたｃＤＮＡの５’側の未知領域をクロ
ーニングするために５’−ＲＡＣＥ法を行った（５’−
ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲａｐｉｄＡｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，ｖｅ
ｒｓｉｏｎ２、ライフテクノロジーズ社製）。 試薬 ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素
（２００ユニット／μｌ、ＢＲＬ社製） ＲＮアーゼ混合液（２ユニット／μｌ、ＢＲＬ社製） ５×テイリングバッファー（５０ｍＭトリス−塩酸、ｐ
Ｈ８．４／１２５ｍＭＫＣｌ／７．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム） ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラ
ーゼ（１５ユニット／μｌ、ＢＲＬ社製） ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／μｌ、宝酒造
社製）

【００８０】ｓｓ−ｃＤＮＡの合成用の逆転写プライマ
ーとして、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いた。 ＧＳＰ１：５’−ＧＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＡＣ
ＴＣＣＴ−３’（配列番号７） ＧＳＰ２：５’−ＡＴＧＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＡＡＣＡ
ＧＴＡ−３’（配列番号８） アダプター付きオリゴｄＧプライマー（ＢＲＬ社製）： ５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号９） グラス マックス スピン カートリッジ（ＢＲＬ社
製）

【００８１】工程８−１ １ｓｔストランドｃＤＮＡの
合成 (逆転写反応) 氷上でシロイヌナズナ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の全ＲＮＡ
（５００ｎｇ）にＧＳＰ１（２．５ｐｍｏｌ）を加え
て、ＤＥＰＣ処理水で１５．５μｌに調整し、７０℃、
１０分間インキュベートした。氷上で１分間冷却した後
１０×ＰＣＲバッファー（２．５μｌ）／２５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ_２（２．５μｌ）／１０ｍＭｄＮＴＰ混合液（１
μｌ）／０．１Ｍ ＤＴＴ（２．５μｌ）を加えて２４
μｌとし、４２℃、１分間インキュベートした。１μｌ
のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素
を反応液に加え４２℃、５０分間インキュベートをし、
続けて７０℃、１５分間インキュベートして反応を停止
させた。３７℃、２０秒間軽く遠心分離をかけて１μｌ
のＲＮアーゼ混合液を加えて３７℃、３０分間インキュ
ベートして氷上に静置した。

【００８２】工程８−２ １ｓｔ ストランドｃＤＮＡ
の精製 室温にした１２０μｌのバインディングソリューション
（６ＭＮａＩ）を１ｓｔストランドＤＮＡの反応液に加
え、それをグラス マックス スピン カートリッジに
移し、１，５００ｒｐｍ、２４℃、２０秒間遠心分離を
かけカートリッジを新たな１．５ｍｌチューブに差し込
んだ。０．４ｍｌの１×洗浄バッファー（４℃）を加
え、１，５００ｒｐｍ、２４℃、２０秒間遠心分離をか
け流出液を取り除いた。同様な操作を３回繰り返した後
カートリッジを４００μｌ（４℃）の７０％エタノール
で２回洗浄した。１，５００ｒｐｍ、２４℃、１分間遠
心分離後カートリッジを新たな１．５ｍｌチューブに移
した。５０μｌのＳＤＷを加えて１，５００ｒｐｍ、２
４℃、２０秒間遠心分離をかけｃＤＮＡを溶出した。

【００８３】工程８−３ ｃＤＮＡのターミナル デオ
キシヌクレオチジル トランスフェラーゼによるテイリ
ング １ｓｔストランドｃＤＮＡ精製サンプル（１０μｌ）に
ＤＥＰＣ処理水（６．５μｌ）／５×テイリングバッフ
ァー（５．０μｌ）／２ｍＭｄＣＴＰ（２．５μｌ）を
加えて２４μｌとした。９４℃、３分間インキュベート
して氷上で１分間冷却した。

【００８４】１μｌのターミナル デオキシヌクレオチ
ジル トランスフェラーゼを加えて３７℃、１０分間イ
ンキュベートし、続けて６５℃、１０分間インキュベー
トして反応を停止させ氷上で冷却した。

【００８５】工程８−４ ＰＣＲ ｄＣでテイルしたｃＤＮＡ（５μｌ）／１０×ＰＣＲバ
ッファー（５μｌ)／２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（３μｌ）
／１０ｍＭｄＮＴＰ混合液（１μｌ）／１０μＭ ＧＰ
Ｓ２（２μｌ）／１０μＭアダプター付きオリゴｄＧプ
ライマー（２μｌ）にＳＤＷを加えて４９．５μｌとし
た。０．５μｌのＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを
加えて９４℃としたサーマルサイクラーにセットして９
４℃、１分間／５５℃、１分間／７２℃、２分間を３５
サイクル、最後に７２℃、５分間でＰＣＲを行なった。
アガロース電気泳動でＤＮＡの増幅を確認した後、ＴＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用
いてサブクローニングを行なった。シークエンス反応を
して塩基配列を決定した。

【００８６】工程９ ｃＤＮＡ配列に対応するゲノムＤ
ＮＡの配列決定 配列の決定されたｃＤＮＡのタンパク質コード領域配列
に対応するゲノムＤＮＡの配列を決定するためコード領
域両端２０ｂｐ外側の位置に５'、３'各々の下記ＰＣＲ
プライマーを作成した。 ５Ｒ−１８Ｆ１：ＧＴＣＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴ
ＴＣＴＣ（配列番号１０） Ｃ２Ｆ１：ＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＴＡＡＡＣＧＣＧＡＡ
Ａ（配列番号１１） 正合性の高いｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ストラタ
ジーン社製）を使いＰＣＲ（下表）を行い、泳動後バン
ドを確認してＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯクローニ
ング キット（インビトロジェン社製）を使いサブクロ
ーニングを行った。プレート上から５つほどコロニーを
選択して液体培養を行なった。プラスミドＤＮＡを抽出
して精製後、シークエンス反応を行ない配列を決定し
た。 ＰＣＲ反応 組成 （μｌ） ＳＤＷ ７５ １０×ｐｆｕターボＤＮＡポリメラーゼバッファー １０ ｄＮＴＰ混合液（２．５ｐＭ） ８ ＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ） １ プライマー−１（１００ｎｇ／μｌ） ２．５ プライマー−２（１００ｎｇ／μｌ） ２．５ ｐｆｕターボＤＮＡポリメラーゼ（２．５ユニット／μｌ） １．０ ------------------------------------------------------------------- トータルボリューム １００

【００８７】＜結果＞ １．突然変異体のスクリーニング スリット法を用いて４，９００株のＴ−ＤＮＡ挿入変異
体から、工程１の選抜を行った。スリット幅に合わせて
各々Wassilewskija系統で野生株（ＷＴ）とＴ−ＤＮＡ
挿入変異体（ＯＫ００１）、Columbia系統で野生株とＥ
ＭＳ処理変異体（ＳＮ００１、ＳＮ０７２及びＨＦＲ
３）を等間隔に並べ、その上にスリットのあいた板を被
せた。このスリットを通して強光を照射した。この方法
を用いると野生型の葉では、スリット上に白色のバンド
が形成された。そこで、この白色のバンドが見られない
変異体を選抜したところ、変異体形質を示す個体が４つ
得られた。これと同時に、ＥＭＳ処理種子に由来する変
異体として３種類（ＳＮ００１、ＳＮ０７２及びＨＦＲ
３）を選抜された。マイクロビームを用いて細胞レベル
での葉緑体光定位運動を調べた結果、これらもＴ−ＤＮ
Ａ株から選抜された変異体と同様の形質（強光下及び弱
光下でも葉緑体光定位運動が起きないという形質）を示
した。そこでアレリズムテストを行った。即ち、ＳＮ０
０１(雌）×Ｔ−ＤＮＡ変異体(雄）、ＳＮ０７２（雌）
×Ｔ−ＤＮＡ変異体(雄）、及びＨＦＲ３（雌×Ｔ−Ｄ
ＮＡ変異体（雄）の交配を行い得られた植物の形質を調
べた結果、総ての組み合わせに於いて相補せず（白色の
バンドが形成されず）同一の遺伝子に変異が起きている
ことを確認した。

【００８８】２．ゲノム内におけるＴ−ＤＮＡの挿入数
の確認 −サザンハイブリダイゼ−ション− Ｔ−ＤＮＡ突然変異体ではＴ−ＤＮＡの挿入により遺伝
子が破壊され、葉緑体光定位運動に変異が生じた。そこ
で、まずはじめに変異体ゲノムＤＮＡ内のＴ−ＤＮＡコ
ピー数を確認するためにＴ−ＤＮＡのレフトボーダー側
１．５ｋｂｐをプローブとして工程３のサザンハイブリ
ダイゼ−ションを行った。その結果を図１に示す。

【００８９】図１から分かるように、Ｔ−ＤＮＡ変異体
ではＸｈｏＩ、ＸｈｏＩ＋ＳａｌＩの制限酵素でＴ−Ｄ
ＮＡ変異体のゲノムＤＮＡを切断した場合、ＸｈｏＩ処
理では４本のバンド（１１ｋｂ、７ｋｂ、４ｋｂ、２．
５ｋｂ)が、ＸｈｏＩ＋ＳａｌＩ処理では４本のバンド
（８ｋｂ、５ｋｂ、３ｋｂ、２．５ｋｂ）が確認され
た。従って、この植物ゲノムには、少なくとも４コピー
のＴ−ＤＮＡが挿入されていることがわかった。

【００９０】３．目的遺伝子の単離 −プラスミドレスキュー− 図２に示したようなＴ−ＤＮＡの挿入部位に隣接するゲ
ノムＤＮＡを工程４のプラスミドレスキュー法によりク
ローニングした。図２において、プラスミドレスキュー
に用いたＴ−ＤＮＡのレフトボーダー（ＬＢ）、ライト
ボーダー（ＲＢ）側内部の制限酵素部位と薬剤耐性遺伝
子を示し、矢印は、コードされている向きを示してい
る。

【００９１】ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＰｓｔＩの制限酵素を用いたが、ＳａｌＩで制限酵
素処理をしたＴ−ＤＮＡのＬＢ側を含むゲノム断片のみ
がレスキューされた。図３に、レスキューされたＬＢ側
に続くゲノムＤＮＡを示した。線で囲まれた領域がＴ−
ＤＮＡのＬＢ内部配列を表し、外は、植物側ゲノム配列
を示している。

【００９２】他のクローンは、Ｔ−ＤＮＡの内部配列又
はアグロバクテリウムのベクター配列を含み、植物ゲノ
ムを含んでいなかった。ＳａｌＩ酵素によるレスキュー
で得られたクローンを１００個無作為に選びそれらを、
ＡａｔＩＩによる制限酵素パターンから分類したとこ
ろ、すべて同じ制限酵素パターンを示し、同一のクロー
ンであった。

【００９３】−ｃＤＮＡライブラリースクリーニング− 図４を参照して、プラスミドレスキュー法により得られ
た植物ゲノム断片（８００ｂｐ）をプローブに用い、工
程６のｃＤＮＡライブラリースクリーニングを行ったこ
とを示す。（ａ）は、Ｔ−ＤＮＡ（特にＬＢ）、ゲノム
ＤＮＡ、及びレスキューされたゲノムＤＮＡ上の８００
ｂｐのプローブとしたＤＮＡ断片の関係を示す。３×１
０^５プラークをスクリーニングした結果、（ｂ）に示す
ように、始めに５００ｂｐのｃＤＮＡをスクリーニング
した。つづいて２．１ｋｂｐのｃＤＮＡクローンが得ら
れた。それらの塩基配列を決定した結果、両クローンと
も（ｂ）の網かけで示したように共通配列をもち、ポリ
Ａ配列が３’末端側に認められた。しかし５’側末端に
インフレームのストップコドンは認められなかったの
で、このクローンは全長をカバーしていないことが分か
った。そこでｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定するために
５’ＲＡＣＥを行った。

【００９４】−全長ｃＤＮＡ配列（５’ＲＡＣＥ）− 以下、図５を参照して説明する。図５（ａ）に示したよ
うに２．１ｋｂｐクローンの５’側に２つのＧｅｎｅ−
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ（ＧＰＳ１、ＧＰＳ
２）を設計して工程８の５’ＲＡＣＥを行った。その結
果、反応後の５’側延長ＤＮＡ増幅断片の泳動図を示す
図５（ｂ）のように、５００ｂｐ、８００ｂｐ、１ｋｂ
の５’ＲＡＣＥ産物が得られた。図５（ｂ）において、
各レーンはＭｒ：マーカー、１：８００ｂｐ、２：５０
０ｂｐ、３：１ｋｂｐの得られたｃＤＮＡをそれぞれ表
し、３．９ｂｐのバンドはベクターの大きさを示してい
る。

【００９５】塩基配列を決定した結果、これらは同一の
配列を持つことが分かった。ｃＤＮＡクローンと５’Ｒ
ＡＣＥの結果から目的遺伝子の全長ｃＤＮＡの塩基配列
を決定した。これを図６に示す。このｃＤＮＡの最も長
いＯＲＦ（オープン リーディング フレーム）は、１
０２６個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしてい
た。図６において、矢印は、５’ＲＡＣＥ法に特有な
５’末端のポリＧ（Ｇ）ｎに続く各断片の５’側を示し
ている。

【００９６】４．目的遺伝子の同定 −ゲノムＤＮＡ配列− 次にｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡ（Ｃｏｌｕｍｂｉ
ａ）の塩基配列を工程９に従い決定した。結果を図７及
び図８に示す。図７及び図８において、エクソン領域は
大文字でイントロン領域は小文字で表した。その下のア
ルファベットは翻訳領域のアミノ酸配列を示す。開始コ
ドンを丸で囲み、終止コドンをＳｔｏｐで表した。その
結果、図９に示すようにこの遺伝子は９つのエクソン領
域［ｅｘｏｎ１（３１１ｂｐ）／ｅｘｏｎ２（５６ｂ
ｐ）／ｅｘｏｎ３（７６１ｂｐ）／ｅｘｏｎ４（１４０
０ｂｐ）／ｅｘｏｎ５（１３３ｂｐ）／ｅｘｏｎ６（１
８３ｂｐ）／ｅｘｏｎ７（１０２ｂｐ）／ｅｘｏｎ８
（１４５ｂｐ）／ｅｘｏｎ９（２０２ｂｐ）］と８つの
イントロン領域［ｉｎｔｒｏｎ１（９１ｂｐ）／ｉｎｔ
ｒｏｎ２（６８ｂｐ）／ｉｎｔｒｏｎ３（７７ｂｐ）／
ｉｎｔｒｏｎ４（７４ｂｐ）／ｉｎｔｒｏｎ５（１３３
ｂｐ）／ｉｎｔｒｏｎ６（１８３ｂｐ）／ｉｎｔｒｏｎ
７（１０２ｂｐ）／ｉｎｔｒｏｎ８（１４５ｂｐ）］か
ら成り立つことが明らかとなった。

【００９７】図９において、ｃＤＮＡに示された矢印は
対応するゲノムＤＮＡ遺伝子断片を増幅するためのＰＣ
Ｒプライマーを示し、目的遺伝子内のエクソンは、白抜
きの四角い囲みで表されている。９つのエクソンとその
間の８つのイントロンからなることが分かる。各々の囲
み付近の数値は、各エクソンの塩基数を示す。開始コド
ンは第一エクソンの５’側２０５ｂｐに、終止コドンは
第９エクソンの５’側１３５ｂｐの位置に存在し、Ｔ−
ＤＮＡは、第５エクソンの５’側１００ｂｐの位置に挿
入されていた。２重斜線は、Ｔ−ＤＮＡの塩基配列が未
解読であることを示す。

【００９８】−ＥＭＳ突然変異体（ＳＮ００１、ＳＮ０
７２及びＨＦＲ３）における上記得られた遺伝子の解析
− 図１０、図１１及び図１２を用いて、上記得られた遺伝
子（ＯＫ００１とする）が原因遺伝子か否かを確かめる
ために行ったことを以下に説明する。ＥＭＳ処理により
点変異が誘導された同一遺伝子座を持つ３種類の突然変
異体（ＳＮ００１、ＳＮ０７２及びＨＦＲ３）のＯＫ０
０１遺伝子の塩基配列を決定した。野生型（Ｃｏｌｕｍ
ｂｉａ）遺伝子と配列を比較した結果、図１０（ａ）、
図１１（ａ）及び図１２（ａ）に示したように３種類
（ＳＮ００１、ＳＮ０７２、ＨＦＲ３）とも遺伝子内の
エクソン領域内に点変異が認められた。ＳＮ００１は第
３エクソン５３０番目のＣがＴに変化してグルタミン酸
がストップコドンに、ＳＮ０７２は第３エクソン５１番
目のＣがＴに変化してグルタミン酸がストップコドン
に、ＨＦＲ３は第４エクソン４２８番目のＧがＡに変化
してトリプトファンがストップコドンに変化していた。
つまりすべての変異体でこの遺伝子に変異が生じてお
り、変異体でこの遺伝子が機能していないことが、葉緑
体光定位運動欠損の原因であることが分かった。

【００９９】これらの変異は、それぞれの変異をＣＡＰ
Ｓマーカーとすることによっても、即ち、図１０
（ｂ）、図１１（ｂ）及び図１２（ｂ）に示したように
ＳＮ００１ではＡｌｗＮＩの制限酵素サイトの消失、Ｓ
Ｎ０７２ではＴｓｐＥＩ制限酵素サイトがＨＦＲ３では
ＭｎｌＩ制限酵素サイトが、新しく生じたことによって
も確認された。即ち、図１１（c）において、レーン２
に３００、２２０ｂｐ付近に泳動断片が現れたこと、図
１２（c）において、レーン３、４に３７０、３２０ｂ
ｐ付近に各々泳動断片が現れたことにより確認された。
図１０、１１及び１２における、矢印は、それぞれの点
変異を挟むように設計したＰＣＲプライマーを示し、５
００ｂｐほどの配列をＰＣＲ法により増幅して図１０、
１１及び１２各々の（ｂ）及び（ｃ）の実験に用いた。

【０１００】実施例 ２ 図１６を用いて、突然変異体の強光下での枯死化を野生
型と比較することにより明らかにしたことを示す。具体
的には、同時期に発芽したシロイヌナズナの配列番号１
の遺伝子の変異体（ＳＮ００１）、配列番号２の遺伝子
の変異体及び野生型（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）のそれぞれの
葉の０時間（ｈｒ）における緑度を１００％としたとき
の同条件下（３．６ｋＷの白色キセノンランプ（ＵＸＬ
−３６０１ＨＫ−０、ウシオ社製）を使用し、該光源と
該植物の距離を９０ｃｍとし、その間に光を均一照射に
するための散光フィルターを設置した）における経時変
化をカラーで撮影し、該カラー映像をフォトショップ
（アドビ社製）により赤緑青のチャンネルに分割し、緑
の強度をＮＩＨ ｉｍａｇｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ製）により数値
化することにより測定した。図１６において、野生型は
●で、配列番号１の遺伝子の変異体は〇で、配列番号２
の遺伝子の変異体は▲でプロットした。

【０１０１】図１６から明らかなように、突然変異体は
強光下で時間経過（生長）とともに白化が進む一方、野
生型は時間経過（生長）とともに緑化が進行していた
（野生型の緑化の上昇は、葉緑素及びアントシアンの含
有率の上昇による）。２０時間後には突然変異体の葉は
完全に枯死化した。このことから、本発明の葉緑体光定
位運動欠損植物は強光下で枯死化することが分かった。
また、配列番号１及び２の遺伝子の変異体それぞれを弱
光下にて育成させたところ、どちらも野生型と区別でき
ない程生長し、開花した。

【０１０２】実施例 ３ 図１７を用いて、突然変異体の強光下での葉の透過性を
野生型と比較することにより葉緑体光定位運動欠損を明
らかにしたことを示す。具体的には、同時期に発芽した
シロイヌナズナの配列番号１の遺伝子の変異体（ＳＮ０
７２）、配列番号２の遺伝子の変異体及び野生型のそれ
ぞれを同条件下（グロースチャンバー内２２℃、湿度５
０％）、実施例２と同様な３．６ｋＷの白色キセノンラ
ンプを使用し、様々な白色光強度で１時間照射した。そ
して、様々な光強度に対し、光照射による葉の光透過変
化をプロットした。この際、光強度は、光量子センサー
（ＬＩ−１９０ＳＢ、ＬＩ−ＣＯＲ社製）により測定し
た。また、光透過は、発光ダイオード（ＧＬ５ＵＲ３
Ｋ、シャープ社製）、フォトダイオード（Ｓ１２２７−
６６ＢＲ、浜松ホトニクス社製）、電圧計及び電源から
なる発明者らが作成した装置を用い、葉１枚あたり少な
くとも４回測定した。図１７において、縦軸の光透過の
変化１単位は、光照射前の５％の葉の光透過が照射後で
は６％になったことを示し、野生型は●で、配列番号１
の遺伝子の変異体は×で、配列番号２の遺伝子の変異体
は▲でプロットした。

【０１０３】図１７から明らかなように、野生型は、約
５００μｍｏｌ／ｍ^２／ｓで最大に達する光透過変化が
あった。一方、どちらの突然変異体の葉もいかなる強度
の光を１時間照射しても光透過に変化が見られなかっ
た。また、白色光強度５００μｍｏｌ／ｍ^２／ｓで１時
間照射後、突然変異体及び野生型の葉を顕微鏡観察した
ところ、照射前と比較し、野生型では葉緑体が垂層の細
胞壁側に移動するが、どちらの突然変異体でもそれがみ
られなかった。以上の結果から、野生型シロイヌナズナ
に対し本発明の変異シロイヌナズナは、光透過性が著し
く劣っており、葉緑体光定位運動の欠損によって、太陽
光等の強光下で容易に枯死化することが分かる。

【０１０４】実施例 ４ 図１８を用いて、突然変異体の強光下での枯死化に直接
的な要因となる光合成系の障害を、クロロフィル蛍光パ
ラメータ（Ｆｖ／Ｆｍ）について突然変異体と野生型と
を比較することにより明らかにしたことを示す。すなわ
ち光化学系IIの量子収率に相関があり、光合成系の強光
阻害を示す指標であるＦｖ／Ｆｍ値を測定した。具体的
には、暗黒下に１５分置いた植物（配列番号１の遺伝子
の変異体、配列番号２の遺伝子の変異体及び野生型）
を、クロロフィル蛍光測定装置（ＰＡＭ−２０００、Ｈ
ｅｉｎｚ Ｗａｌｚ社製）を用いて、光照射開始（０ｈ
ｒ）を含めた様々な照射時間におけるＦｖ／Ｆｍ値を測
定した。この際、照射光は、強度１４００μｍｏｌ／ｍ
^２／ｓの白色光とした。光強度は、実施例３と同様な光
量子センサーにより測定した。また、１つの個体につき
５〜６枚の葉について測定し、３回測定して得た値の平
均値を採用した。なお、光照射開始（０ｈｒ）、すなわ
ち照射前のＦｖ／Ｆｍ値は、二つの突然変異体及び野生
型とも０．８１〜０．８３であった。図１８において、
縦軸は上記照射前のＦｖ／Ｆｍ値を１００％とした相対
Ｆｖ／Ｆｍ値で示し、野生型は●で、配列番号１の遺伝
子の変異体は×で、配列番号２の遺伝子の変異体は▲で
プロットした。

【０１０５】図１８から明らかなように、二つの突然変
異体は強光下で時間経過とともに野生型より強光阻害が
進行した。具体的には、野生型は、照射０時間における
Ｆｖ／Ｆｍ値に対し１時間後には約８０％、５時間後に
は約７０％への低下であったが、配列番号１の遺伝子の
変異体では１時間後には約７５％、５時間後には約５５
％への低下で、さらに配列番号２の遺伝子の変異体では
１時間後には約７０％、５時間後には約５２％への低下
で、どちらの変異体でも急激な減少を示した。以上のよ
うに、本発明の変異シロイヌナズナは野生型に比べ著し
い強光阻害を惹起し、太陽光に曝される強光下での生長
・拡散が極めて効果的に防止できることが分かる。

【０１０６】参考例 １ 遺伝子の同定 １．ホモロジー検索 シロイヌナズナはゲノムプロジェクトにより現在までに
全ゲノムの８０％以上の塩基配列が報告されているが、
実施例１で得られた遺伝子のホモロジー検索（ＢＬＡＳ
ＴＩＮ ｓｅａｒｃｈ）を行ったところ、上記遺伝子は
これまでに登録されていない新規の遺伝子であることが
明らかとなった。 ２．アミノ酸構造 また、図１３及び図１４に示すように、モチーフ検索の
結果、上記遺伝子産物（１０３０アミノ酸残基）の１次
構造には幾つか特徴的な領域が存在していることが判明
した。酸性領域、アクチン結合領域、プロリンリッチ領
域、２つのロイシンジッパー領域及び塩基性領域であ
る。図１３において、四角囲みはエクソン領域を示し、
９つのエクソンが存在していた。開始コドン葉第１エク
ソンの５’側２０５ｂｐの位置に、終止コドンは第９エ
クソンの１３５ｂｐの位置に存在した。符号１：酸性部
位、２：ロイシンジッパー（１）、３：アクチニンモチ
ーフ（ＥＥＬＶＹＬＲＷＶＮＡ）、４：塩基性部位、
５：プロリンリッチ領域及び６：ロイシンジッパー
（２）を示した。酸性部位は第３エクソンの６−３２、
ロイシンジッパー（１）は第３エクソンの６４３−７０
８、アクチニンモチーフは第４エクソンの１１１−１４
３、塩基性部位は第４エクソンの７６５−８０８プロリ
ンリッチ領域は第４エクソンの９８９−１１９０、ロイ
シンジッパー（２）は第５エクソンの８８−１３３から
第６エクソン１−４５に渡り存在していた。＊１はＳＮ
０７２の点変異が第３エクソンの５１ｂｐの位置に、＊
２はＳＮ００１の点変異が第３エクソンの５３０ｂｐの
位置に、＊３はＨＦＲ３の点変異が第４エクソンの４２
８ｂｐの位置に、＊４はＴ−ＤＮＡの挿入が第５エクソ
ンの１００ｂｐの位置に各々存在したことを示した。ま
た、図１４においては、アミノ酸配列内での特異的な機
能部位を示した。符号とモチーフとの関係は、図１３に
対応している。図１５に示すように、アミノ酸配列を用
いたホモロジーサーチ（ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ）の
結果、本発明の蛋白質は動物のＷＡＳＰ（Wiskott-Aldr
ich Syndrome Protein）ファミリーの蛋白質とホモロジ
ーを有することが分かった。とりわけプロリンリッチ領
域と高い相当性を示した。ＷＡＳＰファミリーはいずれ
も約５００アミノ酸残基からなる５種類の蛋白質から構
成され、Ｎ末端側の構造によって２つのサブファミリー
（ＷＡＳＰ、Ｎ−ＷＡＳＰ、及びＷＡＶＥ１、２、３）
に分けられている。２つのサブファミリー共通のドメイ
ンとして、Ｎ末端から、分子自身の機能制御をもつ制御
領域、プロリンを多く含む（プロリンリッチ）領域、ア
クチン結合領域であるＶＰＨ（verprolin-homology）領
域、アクチンフィラメントの脱重合に関与しているcofi
lin-homology領域、酸性領域とが順に並んで存在してい
る(Miki et al, 1996、 1998、 Bear et al, 1998)。こ
のＣ末端側の、ＶＰＨ領域・cofilin-homology領域・酸
性領域は、あわせてＶＣＡ領域と呼ばれている。またＷ
ＡＳＰ、Ｎ−ＷＡＳＰのサブファミリーは、ＰＨ（plec
kstrin homology）領域とＧＢＦ（GTPase binding doma
in）／ＶＲＩＢ（cdc42/Rac interactive binding regi
on）モチーフを持っている。一方、ＷＡＶＥはロイシン
ジッパー領域を含むＳＣＡＲ部位をもっている。これら
ＷＡＳＰファミリーの蛋白質は、ＶＣＡ領域でＡｒｐ２
／３蛋白質（Actin-related protein）と結合し、アク
チンフィラメントの脱重合に直接関与していると考えら
れている（Rohatgi et al, 1999、Machsky and Insal,
1998）。また、プロリンリッチ領域では、プロフィリン
と結合し、このプロフィリンはＧ−アクチンがＦ−アク
チンに重合するときにＡＴＰ−ＡＤＰの交換反応を促進
して、重合可能なＡＴＰ結合型アクチン生成を促す。Ｗ
ＡＳＰやＮ−ＷＡＳＰは、Ｒｈｏファミリーの低分子量
Ｇ蛋白質ｃｄｃ４２により直接的に、ＷＡＶＥ１、２、
３はＲａｃ蛋白質に間接的に、その機能が制御されてい
る（Miki et al., 1998）。なお、Ｎ−ＷＡＳＰはＷＡ
ＳＰに対して４６％のホモロジーを示し、ＷＡＶＥ２、
ＷＡＶＥ３はＷＡＶＥ１に対して各４８％のホモロジー
を示した。図１５において、ＰＨ：ｐ１ｅｃｋｓｔｒｉ
ｎ ｈｏｍｏ１ｏｇｙ、Ｂ：塩基性（ｂａｓｉｃ）ドメ
イン、ＧＢＤ／ＣＲＩＢ：ＧＴＰａｓｅ ｂｉｎｄｉｎ
ｇ ｄｏｍａｉｎ／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ ｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｖｅ ｒｅｇｉｏｎ、Ｖ：ｖｅｒｐｒｏｌｉｎ−
ｈｏｍｏｌｏｇｙドメイン、Ｃ：ｃｏｆｉｌｉｎ−ｈｏ
ｍｏｌｏｇｙドメイン、Ａ：酸性（ａｃｉｄｉｃ）ドメ
イン、ＳＨＤ：ＳＣＡＲ ｈｏｍｏｌｏｇｙドメイン、
Ｐｒｏ−ｒｉｃｈ：プロリンリッチ領域、Ｌ（１）、Ｌ
（２）：Ｌｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒドメイン１，２、
Ａ−Ｌ：ａｃｔｉｎｉｎ−ｌｉｋｅ ａｃｔｉｎ ｂｉ
ｎｄｉｎｇモチーフを表わしている。一方、図１３、図
１４及び図１５から分かるように本発明の遺伝子産物は
Ｎ末端側から、酸性領域、ロイシンジッパー構造１、ア
クチン結合領域、塩基性領域、プロリンリッチ領域、ロ
イシンジッパー構造２と並んでいる。

【０１０７】

【発明の効果】本発明の葉緑体光定位運動遺伝子の変異
体の組換えにより、植物の強光下での白化・枯死化が可
能となった。さらに、本発明の核酸プローブは遺伝子組
換え技術ないしは遺伝子ノックアウト技術を用いること
により、自然環境保全の観点から極めて有用な葉緑体光
定位運動欠損植物の生産の効率化に寄与する。さらに、
本発明の葉緑体光定位運動欠損植物は強光下で白化・枯
死化現象を起こすので、この技術を遺伝子組換植物に適
用することによって、その植物の自然界への拡散を避け
ることができる。昨今の遺伝子組換技術の発展に伴う組
換植物の自然界への拡散に対する懸念を解消することが
できる。

【０１０８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TAMA-TLO <120> A gene relating to the mechanism of light-induced chloroplast move ment, a probe of the nucleic acid using the same and a plant lacking lig ht-induced chloroplast movement <130> PT2002020 <140> JP <141> 2002-7-30 <150> JP-2002-75275 <151> 2002-3-18 <160> 11 <170> <210> 1 <211> 1004 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Phe Val Arg Ile Gly Phe Val Val Ala Ala Ser Ile Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Val Lys Arg Leu Asn Val Lys Pro Ser Lys Pro Ser Lys Pro Ser 20 25 30 Asp Asn Gly Glu Gly Gly Asp Lys Glu Gln Ser Val Asp Pro Asp Tyr 35 40 45 Asn Leu Asn Asp Lys Asn Leu Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 50 55 60 Glu Val Lys Leu Ile Asn Ser Val Ile Asn Gln Thr Arg Gly Ser Phe 65 70 75 80 Ser Asp Tyr Leu Asp Asp Asp Ile Leu Pro Glu Phe Glu Asp Leu Leu 85 90 95 Ser Gly Glu Ile Glu Tyr Pro Leu Pro Asp Asp Asp Asn Asn Leu Glu 100 105 110 Lys Ala Glu Lys Glu Arg Lys Tyr Glu Val Glu Met Ala Tyr Asn Asp 115 120 125 Gly Glu Leu Glu Arg Leu Lys Gln Leu Val Lys Glu Leu Glu Glu Arg 130 135 140 Glu Val Lys Leu Glu Gly Glu Leu Leu Glu Tyr Tyr Gly Leu Lys Glu 145 150 155 160 Gln Glu Ser Asp Ile Val Glu Leu Gln Arg Gln Leu Lys Ile Lys Thr 165 170 175 Val Glu Ile Asp Met Leu Asn Ile Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu 180 185 190 Arg Lys Lys Leu Gln Glu Glu Leu Ser Gln Asn Gly Ile Val Arg Lys 195 200 205 Glu Leu Glu Val Ala Arg Asn Lys Ile Lys Glu Leu Gln Arg Gln Ile 210 215 220 Gln Leu Asp Ala Asn Gln Thr Lys Gly Gln Leu Leu Leu Leu Lys Gln 225 230 235 240 His Val Ser Ser Leu Gln Met Lys Glu Glu Glu Ala Met Asn Lys Asp 245 250 255 Thr Glu Val Glu Arg Lys Leu Lys Ala Val Gln Asp Leu Glu Val Gln 260 265 270 Val Met Glu Leu Lys Arg Lys Asn Arg Glu Leu Gln His Glu Lys Arg 275 280 285 Glu Leu Ser Ile Lys Leu Asp Ser Ala Glu Ala Arg Ile Ala Thr Leu 290 295 300 Ser Asn Met Thr Glu Ser Asp Lys Val Ala Lys Val Arg Glu Glu Val 305 310 315 320 Asn Asn Leu Lys His Asn Asn Glu Asp Leu Leu Lys Gln Val Glu Gly 325 330 335 Leu Gln Met Asn Arg Phe Ser Glu Val Glu Glu Leu Val Tyr Leu Arg 340 345 350 Trp Val Asn Ala Cys Leu Arg Tyr Glu Leu Arg Asn Tyr Gln Thr Pro 355 360 365 Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Asp Leu Ser Lys Asn Leu Ser Pro Lys 370 375 380 Ser Gln Ala Lys Ala Lys Arg Leu Met Leu Glu Tyr Ala Gly Ser Glu 385 390 395 400 Arg Gly Gln Gly Asp Thr Asp Leu Glu Ser Asn Tyr Ser Gln Pro Ser 405 410 415 Ser Pro Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asn Ala Ser Met Asp Ser Ser Thr 420 425 430 Ser Arg Phe Ser Ser Phe Ser Lys Lys Pro Gly Leu Ile Gln Lys Leu 435 440 445 Lys Lys Trp Gly Lys Ser Lys Asp Asp Ser Ser Val Gln Ser Ser Pro 450 455 460 Ser Arg Ser Phe Tyr Gly Gly Ser Pro Gly Arg Leu Ser Ser Ser Met 465 470 475 480 Asn Lys Gln Arg Gly Pro Leu Glu Ser Leu Met Ile Arg Asn Ala Gly 485 490 495 Glu Ser Val Ala Ile Thr Thr Phe Gly Gln Val Asp Gln Glu Ser Pro 500 505 510 Gly Thr Pro Glu Thr Pro Asn Leu Pro Arg Ile Arg Thr Gln Gln Gln 515 520 525 Ala Ser Ser Pro Gly Glu Gly Leu Asn Ser Val Ala Ala Ser Phe His 530 535 540 Val Met Ser Lys Ser Val Asp Asn Val Leu Asp Glu Lys Tyr Pro Ala 545 550 555 560 Tyr Lys Asp Arg His Lys Leu Ala Val Glu Arg Glu Lys His Ile Lys 565 570 575 His Lys Ala Asp Gln Ala Arg Ala Glu Arg Phe Gly Gly Asn Val Ala 580 585 590 Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu Lys Glu Lys Arg Val Val Val Pro 595 600 605 Ser Val Ile Thr Ala Thr Gly Asp Gln Ser Asn Glu Ser Asn Glu Ser 610 615 620 Asn Glu Gly Lys Ala Ser Glu Asn Ala Ala Thr Val Thr Lys Met Lys 625 630 635 640 Leu Val Asp Ile Glu Lys Arg Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Pro Pro 645 650 655 Arg Ser Ala Gly Gly Gly Lys Ser Thr Asn Leu Pro Ser Ala Arg Pro 660 665 670 Pro Leu Pro Gly Gly Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Gly 675 680 685 Gly Pro Pro Pro Pro Pro Gly Gly Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 690 695 700 Pro Gly Ala Leu Gly Arg Gly Ala Gly Gly Gly Asn Lys Val His Arg 705 710 715 720 Ala Pro Glu Leu Val Glu Phe Tyr Gln Ser Leu Met Lys Arg Glu Ser 725 730 735 Lys Lys Glu Gly Ala Pro Ser Leu Ile Ser Ser Gly Thr Gly Asn Ser 740 745 750 Ser Ala Ala Arg Asn Asn Met Ile Gly Glu Ile Glu Asn Arg Ser Thr 755 760 765 Phe Leu Leu Ala Val Lys Ala Asp Val Glu Thr Gln Gly Asp Phe Val 770 775 780 Gln Ser Leu Ala Thr Glu Val Arg Ala Ser Ser Phe Thr Asp Ile Glu 785 790 795 800 Asp Leu Leu Ala Phe Val Ser Trp Leu Asp Glu Glu Leu Ser Phe Leu 805 810 815 Val Asp Glu Arg Ala Val Leu Lys His Phe Asp Trp Pro Glu Gly Lys 820 825 830 Ala Asp Ala Leu Arg Glu Ala Ala Phe Glu Tyr Gln Asp Leu Met Lys 835 840 845 Leu Glu Lys Gln Val Thr Ser Phe Val Asp Asp Pro Asn Leu Ser Cys 850 855 860 Glu Pro Ala Leu Lys Lys Met Tyr Lys Leu Leu Glu Lys Val Glu Gln 865 870 875 880 Ser Val Tyr Ala Leu Leu Arg Thr Arg Asp Met Ala Ile Ser Arg Tyr 885 890 895 Lys Glu Phe Gly Ile Pro Val Asp Trp Leu Ser Asp Thr Gly Val Val 900 905 910 Gly Lys Ile Lys Leu Ser Ser Val Gln Leu Ala Lys Lys Tyr Met Lys 915 920 925 Arg Val Ala Tyr Glu Leu Asp Ser Val Ser Gly Ser Asp Lys Asp Pro 930 935 940 Asn Arg Glu Phe Leu Leu Leu Gln Gly Val Arg Phe Ala Phe Arg Val 945 950 955 960 His Gln Phe Ala Gly Gly Phe Asp Ala Glu Ser Met Lys Ala Phe Glu 965 970 975 Glu Leu Arg Ser Arg Ala Lys Thr Glu Ser Gly Asp Asn Asn Asn Asn 980 985 990 Asn Asn Asn Asn Ser Asn Glu Glu Glu Ser Val Asn 995 1000 <210> 2 <211> 915 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Glu Arg Pro Arg Ala Pro Pro Ser Pro Leu Asn Asp Ala Glu Ser 1 5 10 15 Leu Ser Glu Arg Arg Ser Leu Glu Ile Phe Asn Pro Ser Ser Gly Lys 20 25 30 Glu Thr His Gly Ser Thr Ser Ser Ser Ser Lys Pro Pro Leu Asp Gly 35 40 45 Asn Asn Lys Gly Ser Ser Ser Lys Trp Met Glu Phe Gln Asp Ser Ala 50 55 60 Lys Ile Thr Glu Arg Thr Ala Glu Trp Gly Leu Ser Ala Val Lys Pro 65 70 75 80 Asp Ser Gly Asp Asp Gly Ile Ser Phe Lys Leu Ser Ser Glu Val Glu 85 90 95 Arg Ser Lys Asn Met Ser Arg Arg Ser Ser Glu Glu Ser Thr Ser Ser 100 105 110 Glu Ser Gly Ala Phe Pro Arg Val Ser Gln Glu Leu Lys Thr Ala Leu 115 120 125 Ser Thr Leu Gln Gln Thr Phe Val Val Ser Asp Ala Thr Gln Pro His 130 135 140 Cys Pro Ile Val Tyr Ala Ser Ser Gly Phe Phe Thr Met Thr Gly Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Lys Glu Ile Val Gly Arg Asn Cys Arg Phe Leu Gln Gly Pro 165 170 175 Asp Thr Asp Lys Asn Glu Val Ala Lys Ile Arg Asp Cys Val Lys Asn 180 185 190 Gly Lys Ser Tyr Cys Gly Arg Leu Leu Asn Tyr Lys Lys Asp Gly Thr 195 200 205 Pro Phe Trp Asn Leu Leu Thr Val Thr Pro Ile Lys Asp Asp Gln Gly 210 215 220 Asn Thr Ile Lys Phe Ile Gly Met Gln Val Glu Val Ser Lys Tyr Thr 225 230 235 240 Glu Gly Val Asn Asp Lys Ala Leu Arg Pro Asn Gly Leu Ser Lys Ser 245 250 255 Leu Ile Arg Tyr Asp Ala Arg Gln Lys Glu Lys Ala Leu Asp Ser Ile 260 265 270 Thr Glu Val Val Gln Thr Ile Arg His Arg Lys Ser Gln Val Gln Glu 275 280 285 Ser Val Ser Asn Asp Thr Met Val Lys Pro Asp Ser Ser Thr Thr Pro 290 295 300 Thr Pro Gly Arg Gln Thr Arg Gln Ser Asp Glu Ala Ser Lys Ser Phe 305 310 315 320 Arg Thr Pro Gly Arg Val Ser Thr Pro Thr Gly Ser Lys Leu Lys Ser 325 330 335 Ser Asn Asn Arg His Glu Asp Leu Leu Arg Met Glu Pro Glu Glu Leu 340 345 350 Met Leu Ser Thr Glu Val Ile Gly Gln Arg Asp Ser Trp Asp Leu Ser 355 360 365 Asp Arg Glu Arg Asp Ile Arg Gln Gly Ile Asp Leu Ala Thr Thr Leu 370 375 380 Glu Arg Ile Glu Lys Asn Phe Val Ile Ser Asp Pro Arg Leu Pro Asp 385 390 395 400 Asn Pro Ile Ile Phe Ala Ser Asp Ser Phe Leu Glu Leu Thr Glu Tyr 405 410 415 Ser Arg Glu Glu Ile Leu Gly Arg Asn Cys Arg Phe Leu Gln Gly Pro 420 425 430 Glu Thr Asp Gln Ala Thr Val Gln Lys Ile Arg Asp Ala Ile Arg Asp 435 440 445 Gln Arg Glu Ile Thr Val Gln Leu Ile Asn Tyr Thr Lys Ser Gly Lys 450 455 460 Lys Phe Trp Asn Leu Phe His Leu Gln Pro Met Arg Asp Gln Lys Gly 465 470 475 480 Glu Leu Gln Tyr Phe Ile Gly Val Gln Leu Asp Gly Ser Asp His Val 485 490 495 Glu Pro Leu Gln Asn Arg Leu Ser Glu Arg Thr Glu Met Gln Ser Ser 500 505 510 Lys Leu Val Lys Ala Thr Ala Thr Asn Val Asp Glu Ala Val Arg Glu 515 520 525 Leu Pro Asp Ala Asn Thr Arg Pro Glu Asp Leu Trp Ala Ala His Ser 530 535 540 Lys Pro Val Tyr Pro Leu Pro His Asn Lys Glu Ser Thr Ser Trp Lys 545 550 555 560 Ala Ile Lys Lys Ile Gln Ala Ser Gly Glu Thr Val Gly Leu His His 565 570 575 Phe Lys Pro Ile Lys Pro Leu Gly Ser Gly Asp Thr Gly Ser Val His 580 585 590 Leu Val Glu Leu Lys Gly Thr Gly Glu Leu Tyr Ala Met Lys Ala Met 595 600 605 Glu Lys Thr Met Met Leu Asn Arg Asn Lys Ala His Arg Ala Cys Ile 610 615 620 Glu Arg Glu Ile Ile Ser Leu Leu Asp His Pro Phe Leu Pro Thr Leu 625 630 635 640 Tyr Ala Ser Phe Gln Thr Ser Thr His Val Cys Leu Ile Thr Asp Phe 645 650 655 Cys Pro Gly Gly Glu Leu Phe Ala Leu Leu Asp Arg Gln Pro Met Lys 660 665 670 Ile Leu Thr Glu Asp Ser Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Glu Val Val Ile 675 680 685 Gly Leu Glu Tyr Leu His Cys Leu Gly Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys 690 695 700 Pro Glu Asn Ile Leu Leu Lys Lys Asp Gly His Ile Val Leu Ala Asp 705 710 715 720 Phe Asp Leu Ser Phe Met Thr Thr Cys Thr Pro Gln Leu Ile Ile Pro 725 730 735 Ala Ala Pro Ser Lys Arg Arg Arg Ser Lys Ser Gln Pro Leu Pro Thr 740 745 750 Phe Val Ala Glu Pro Ser Thr Gln Ser Asn Ser Phe Val Gly Thr Glu 755 760 765 Glu Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Thr Gly Ala Gly His Thr Ser Ala 770 775 780 Ile Asp Trp Trp Ala Leu Gly Ile Leu Leu Tyr Glu Met Leu Tyr Gly 785 790 795 800 Arg Thr Pro Phe Arg Gly Lys Asn Arg Gln Lys Thr Phe Ala Asn Ile 805 810 815 Leu His Lys Asp Leu Thr Phe Pro Ser Ser Ile Pro Val Ser Leu Val 820 825 830 Gly Arg Gln Leu Ile Asn Thr Leu Leu Asn Arg Asp Pro Ser Ser Arg 835 840 845 Leu Gly Ser Lys Gly Gly Ala Asn Glu Ile Lys Gln His Ala Phe Phe 850 855 860 Arg Gly Ile Asn Trp Pro Leu Ile Arg Gly Met Ser Pro Pro Pro Leu 865 870 875 880 Asp Ala Pro Leu Ser Ile Ile Glu Lys Asp Pro Asn Ala Lys Asp Ile 885 890 895 Lys Trp Glu Asp Asp Gly Val Leu Val Asn Ser Thr Asp Leu Asp Ile 900 905 910 Asp Leu Phe 915 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 cttcctaatg tctgatatac aggat 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 tttaagacgc tattcctcaa cttcc 25 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gttagctggc tagatgaaga gctctccttc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 acgaaagtac gagagacgta gtttgggaag 30 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ggatttgcct ctgcaactcc t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 atgctgctta agcaacagta 20 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg 30 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 gtcagtacct ggaagtttct c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 tgatggactc taaacgcgaa a 21

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、サザンブロット解析を示す電気泳動図
である。

【図２】図２は、Ｔ−ＤＮＡ（レフトボーダー、ライト
ボーダー）の概略を示す図である。

【図３】図３は、プラスミドレスキューで単離されたゲ
ノムＤＮＡ断片の概略を示す図である。

【図４】図４は、ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
解析の概略を示す図である。

【図５】図５は、５’ＲＡＣＥによる５’未解読配列の
決定を示す図である。

【図６】（ｃ）は、得られた各ｃＤＮＡ断片の配列と各
断片の関係を示す図である。

【図７】図７は目的遺伝子の塩基配列を示す図である。

【図８】図８は図７の配列の続きを示す図である。

【図９】図９は目的遺伝子の概略を示す図である。

【図１０】図１０はＳＮ００１とＣｏｌｕｍｂｉａ（Ｗ
１）との点変異の位置の比較を表わす図である。（ａ）
野生株と配列を比較して一塩基の違い（大文字で示し
た）が起きていた箇所を示す図である。（ｂ）点変異が
起きたことにより野生株に存在した制限酵素部位（ＡＩ
ＷＮＩ）が変異体では消失したことを示す図である。
（ｃ）確認されたＯＫ００１遺伝子におけるＳＮ００１
の点変異の位置を示す図である。

【図１１】図１１は、ＳＮ０７２とＣｏｌ（Ｗ１）との
点変異の位置の比較を表わす図である。（ａ）野生株と
配列を比較して一塩基の違い（大文字で示した）が起き
ていた箇所を示す図である。（ｂ）点変異が起きたこと
により野生株に制限酵素部位（Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴＳＰ
ＥＩ）が新たに生成したことを示す図である。（ｃ）実
際に制限酵素処理を行い点変異が起きていることを確認
した電気泳動図である。（ｄ）確認されたＯＫ００１遺
伝子におけるＳＮ０７２の点変異の位置を示す図であ
る。

【図１２】図１２は、ＨＦＲ３とＣｏｌ（Ｗ１）との点
変異の位置の比較を表わす図である。（ａ）野生株と配
列を比較して一塩基の違い（大文字で示した）が起きて
いた箇所を示す図である。（ｂ）点変異が起きたことに
より野生株に制限酵素部位（ＭｎｌＩ）が新たに生成し
たことを示す図である。（ｃ）実際に制限酵素処理を行
って点変異が起きていることを確認した電気泳動図であ
る。（ｄ）確認されたＯＫ００１遺伝子におけるＨＦＲ
３の点変異の位置を示す図である。

【図１３】図１３は、ＯＫ００１遺伝子の持つ機能部位
の位置と変異の位置との関係を示す図である。

【図１４】図１４は、アミノ酸配列における特異的機能
部位を示す図である。

【図１５】図１５は、ＷＡＳＰファミリー蛋白質とＯＫ
００１蛋白質とのドメイン構造を示す図である。（ａ）
ＯＫ００１蛋白質のドメイン構造を示す図である。
（ｂ）ＷＡＳＰ、Ｎ−ＷＡＳＰ蛋白質のドメイン構造を
示す図である。（ｃ）ＷＡＶＥ１、２、３蛋白質のドメ
イン構造を示す図である。

【図１６】図１６は、野生型と二つの突然変異体それぞ
れの葉の緑度の経時変化を示す図である。

【図１７】図１７は、野生型と二つの突然変異体それぞ
れの葉の様々な白色光強度における光透過変化を示す図
である。

【図１８】図１８は、野生型と二つの突然変異体それぞ
れの葉のＦｖ／Ｆｍ値の白色光照射時間による変化を示
す図である。

【符号の説明】

１ 酸性部位 ２ ロイシンジッパー（１） ３ アクチニンモチーフ ４ 塩基性部位 ５ プロリンリッチ領域 ６ ロイシンジッパー（２）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 笠原 賢洋 愛知県岡崎市六名東町９−１ 光マンショ ン402 (72)発明者 末次 憲之 愛知県岡崎市明大寺町中道34 賛栄マンシ ョン304 (72)発明者 及川 和聡 千葉県茂原市下永吉599−８ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD10 CD21 4B024 AA08 BA80 CA04 CA05 CA09 DA01 DA06 EA03 EA04 GA11 GA17 GA21 HA14

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコー
   ドする遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を
   有する蛋白質 （ｂ）配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に
   おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
   付加されたアミノ酸配列を有し、かつ葉緑体光定位運動
   活性を有する蛋白質
2. 【請求項２】 請求項１に記載の遺伝子の一部又は全部
   を用いることを特徴とする、葉緑体光定位運動遺伝子を
   スクリーニングするための核酸プローブ。
3. 【請求項３】 以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を欠損
   する葉緑体光定位運動欠損植物。 （ａ）配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を
   有する蛋白質 （ｂ）配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に
   おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
   付加されたアミノ酸配列を有し、かつ葉緑体光定位運動
   活性を有する蛋白質