CN101278049A - 具有给予对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因 - Google Patents

具有给予对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因 Download PDF

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Abstract

提供了具有给予三氟羧草醚抗性的活性的原卟啉原氧化酶，及其基因等。通过在蓝藻中导入拟南芥的原卟啉原氧化酶基因，用转座子破坏蓝藻的基因，选择出原卟啉原氧化酶基因被破坏的菌株，确定被破坏的原卟啉原氧化酶基因，分离被破坏的原卟啉原氧化酶基因，从而鉴定蓝藻的原卟啉原氧化酶基因。该方法，作为在其它生物种类的基因数据库中无法发现蓝藻来源的原卟啉原氧化酶等与已知蛋白质同源的来源于其它生物种类的蛋白质时的基因的分离方法是有效的。

Description

具有给予对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因
技术领域
本发明涉及具有给予对三氟羧草醚(ACIFLUORFEN)的抗性的活性的原卟啉原氧化酶，尤其是蓝藻的原卟啉原氧化酶及其基因以及组入了该基因的转化体等。
背景技术
原卟啉原氧化酶是催化血红素和叶绿素合成的最终阶段反应，即从原卟啉原IX夺得6个电子合成原卟啉IX的反应的酶。血红素作为血红蛋白、细胞色素等血红素蛋白质的辅助因子，是对于呼吸、能量代谢、氧紧张的防御不可缺少的分子。血红素合成途径在微生物、植物、动物中共通存在，是以δ-氨基乙酰丙酸作为前体合成血红素的途径。而且，认为植物中的血红素和叶绿素，是以δ-氨基乙酰丙酸作为前体直至原卟啉IX的共通的途径来合成的，原卟啉原氧化酶担当着这两种合成途径的调节作用。陆生植物中承担叶绿素代谢系统的这种原卟啉原氧化酶成为了二苯醚(以下有时简称为DPE)系除草剂的目的酶。如果原卟啉原氧化酶的活性受到DPE系除草剂的抑制，作为该酶的底物的原卟啉原IX就渐渐积累于叶绿体中，最终原卟啉原IX漏到细胞质浆液中，于是过氧化酶对其进行氧化生成原卟啉IX。原卟啉IX如果与光和氧作用，原卟啉IX就可生成单线态氧以及其它反应性氧种类。脂质的过氧化以及必然伴随其的膜损伤的结果是植物细胞急速死亡(Lee et al，1993，Plant Physiol.，102，881)。另一方面，已经知道在蓝藻中即使在DPE系除草剂存在下，也可以生长，但是其原因和机制还完全不知道。
原卟啉原氧化酶基因已经在一些生物中获得了分离。例如，已知的有烟草的PPX1基因(Genbank登录号Y13465)、PPX2基因(Genbank登录号Y13466)、拟南芥的PPOX基因(Genbank登录号D83139)、枯草杆菌的HemY基因(Genbank登录号M97208)、小鼠的PPX基因(Genbank登录号D45185)、人的PPX基因(Genbank登录号D38537)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的PPX基因(Genbank登录号Z71381)、大肠杆菌的hemG基因(Genbank登录号X68660)等。
作为原卟啉原氧化酶的利用方法，例如，专利文献1公开了在植物体内使给予对DPE系除草剂的抵抗性的来源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的原卟啉原氧化酶表达的方法，以及表达该原卟啉原氧化酶的转基因植物。此外，例如专利文献2，公开了原卟啉原氧化酶基因，作为适于植物育种的卟啉生物合成系统的酶蛋白质的基因，其是从拟南芥(Arabidopsisthaliana)植物中获得的具有1.7kbp长度的基因，其特征在于，其自5’端起1.3kbp的部位存在限制性内切酶EcoRI识别碱基序列5’-GAATTC-3’。而且，例如专利文献3公开了一种用于评价大鼠或衣藻属(Chlamydomonas)来源的原卟啉原氧化酶活性抑制能力的简便方法，其特征在于，包括(1)在被验化合物存在或不存在下，在基本不含补充基于原卟啉原氧化酶活性的增殖能力的缺失的化合物的培养基中培养表达存在于DNA片段中的原卟啉原氧化酶基因的转化体，在各条件下测定该转化体的增殖度的工序，所述转化体是通过将可以在宿主细胞中起作用的启动子以可以发挥功能的形式与原卟啉原氧化酶基因结合而构成的DNA片段导入到基于原卟啉原氧化酶活性的增殖能力发生缺失的宿主细胞中而成的；(2)基于该增殖度的差异求出由于被验化合物的接触而造成的前述转化体的增殖抑制度，判断被验化合物对原卟啉原氧化酶活性的抑制能力的过程。
另一方面，在蓝藻中，根据其基因数据库的分析，曾推定大肠杆菌hemK类似基因为原卟啉原氧化酶，然而此后渐渐清楚蓝藻的该hemK类似基因不是原卟啉原氧化酶。但是，在蓝藻中还没有发现蓝藻的基因数据库中与目前所鉴定的其它生物种类的原卟啉原氧化酶同源的蛋白质，还没有分离出蓝藻的原卟啉原氧化酶(例如，参照非专利文献1)。
专利文献1：特愿平9-107833号公报
专利文献2：特开平9-140381号公报
专利文献3：特愿平11-346787号公报
非专利文献1：Dmitrii V.Vavilin，Wim F.J.Vermaas“Regulation ofthe tetrapyrrole biosynthetic pathway leading to heme and chlorophyll inplants and cyanobacteria(植物和蓝藻中导向为血红素和叶绿素的四吡咯生物合成途径的调节)”Physiologia Plantarum第115卷，第9页，2002年
发明内容
如上所述，无法在蓝藻的基因数据库中发现与来源于其它生物种类的已知的原卟啉原氧化酶同源的蛋白质，至今为止还没有分离出蓝藻的原卟啉原氧化酶。本发明的课题在于提供具有给予三氟羧草醚抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因，以及组入了该基因的转化体等。
本发明人，以分离蓝藻来源的原卟啉原氧化酶为目的，尝试了采用原卟啉原氧化酶缺损的大肠杆菌的互补筛选。该方法是在原卟啉原氧化酶发生缺损的大肠杆菌中导入蓝藻基因组片段来寻找互补的基因，鉴定与蓝藻的原卟啉原IX的氧化相关的基因的方法。使用的载体不同，使用相同的方法分离拟南芥或烟草来源的原卟啉原氧化酶基因。以下公开了前述互补筛选的概况。
首先，从蓝藻(集胞藻属(Synechocystis)PCC6803)中获得了DNA。在制备DNA文库时，使用λZAPII载体(STRATEGENE公司制)作为噬菌体载体。由于该蓝藻的全碱基序列已经被报道(约3,500kb)，因而研究了该蓝藻的基因组序列，结果认为对于包含于载体的多克隆位点的6种限制性内切酶序列而言，XbaI、SpeI、EcoRI这3种适于制备文库。因此，以这三种限制性内切酶处理为基础制备出噬菌体文库。通过将制备的文库导入到原卟啉原氧化酶缺损的大肠杆菌中，研究该转化体的原卟啉原氧化酶活性，进行互补试验，却没有发现显示出明显的互补性。根据该结果，认为可能是该蓝藻的原卟啉原氧化酶不幸恰好带有这3种限制性内切酶序列，或者该蓝藻的启动子没有很好地发生作用等几种可能性。
因此，通过使用限制性内切酶Tsp5091的限定分解重新制备文库，重新进行了研究。Tsp5091是识别4碱基的限制性内切酶。前次文库制备中使用的3种限制性内切酶(EcoRI、SpeI、XbaI)为6碱基识别，必然会产生尺寸过大的片段。而且，蓝藻原卟啉原氧化酶的基因序列内存在这些限制性内切酶识别序列时，无法克隆全长的原卟啉原氧化酶基因。另一方面，如果使用4碱基识别的限制性内切酶完全切断DNA，就会获得大量的数百bp的细小的片段。为了解决该问题，使用通过4碱基识别的限制性内切酶不完全切断DNA的方法(限定分解)制备了文库。使用了该文库，却无法与大肠杆菌的原卟啉原氧化酶缺失能力互补。
然后，考虑如果是质粒的状态则可能出现生长恢复，对Tsp5091蓝藻基因组噬菌体文库，切出了大量的质粒，制备出Tsp5091蓝藻基因组质粒文库，然后进行了研究，没有发现生长显著恢复的克隆。由此，认为可能是蓝藻原卟啉原氧化酶没有与大肠杆菌的原卟啉原氧化酶缺损互补，或者即使发生了互补也是非常轻微的。
因此，本发明人为了解决上述问题，进行了积极的研究，结果发现，基于蓝藻对三氟羧草醚具有抗性的认识，通过采用利用转座子的蓝藻变异体筛选，首次分离出源于蓝藻(集胞藻属PCC6803)的卟啉原氧化酶，该卟啉原氧化酶具有给予三氟羧草醚抗性的活性，并且通过鉴定该基因，而完成了本发明。而且，得到了如下认识：上述利用转座子的基因筛选法，作为在其它生物种类的基因数据库中无法发现蓝藻来源的卟啉原氧化酶等与已知的蛋白质同源的其它生物种类来源的蛋白质时的基因分离方法是有效的，从而完成了本发明。
也就是说，本发明涉及：(1)原卟啉原氧化酶，其特征在于，具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性并且来源于蓝藻；(2)根据上述(1)记载的原卟啉原氧化酶，其特征在于，所述蓝藻为属于集胞藻属的蓝藻；(3)根据上述(1)或(2)记载的原卟啉原氧化酶，其特征在于，所述生物为植物。
而且本发明还涉及：(4)下述(a)～(c)中任一所示的蛋白质：(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质，其特征在于，由序列号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性；(c)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质，其特征在于，与序列号2所示的氨基酸序列的同源性为20％以上，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性；(5)根据上述(4)记载的蛋白质，其特征在于，来源于蓝藻。
而且本发明还涉及：(6)编码上述(1)～(3)中任一项记载的原卟啉原氧化酶或上述(4)或(5)记载的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，(7)下述(d)或(e)所示的原卟啉原氧化酶基因DNA：(d)由序列号1所示的碱基序列构成的原卟啉原氧化酶基因DNA；(e)编码以具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，其由序列号1所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个碱基的碱基序列构成；(8)编码以具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，其在严谨条件下与由与序列号1所示的碱基序列互补的序列构成的DNA杂交；(9)上述(7)或(8)任一项记载的原卟啉原氧化酶基因DNA，其特征在于，具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质来源于蓝藻。
而且本发明还涉及(10)组入了上述(6)～(9)中任一项记载的原卟啉原氧化酶基因DNA的重组载体。
而且本发明还涉及：(11)转化体，其特征在于，导入了上述(10)记载的重组载体；(12)上述(11)记载的转化体，其特征在于，具有对三氟羧草醚的抗性；(13)上述(11)或(12)记载的转化体，其特征在于，所述转化体为微生物；(14)上述(11)或(12)记载的转化体，其特征在于，所述转化体为植物；(15)上述(14)记载的转化体，其特征在于，光合成能力提高了。
而且本发明还涉及：(16)使用上述(11)～(15)中任一项记载的转化体的评价原卟啉原氧化酶抑制活性能力的方法；(17)使用上述(11)～(16)中任一项记载的转化体的筛选原卟啉原氧化酶抑制剂的方法。
而且本发明还涉及(18)包括以下(f)～(j)工序的蓝藻的原卟啉原氧化酶基因的分离方法：(f)在蓝藻中导入拟南芥的原卟啉原氧化酶基因的工序；(g)使用转座子破坏蓝藻的基因的工序；(h)选择原卟啉原氧化酶基因被破坏的菌株；(i)确定被破坏的原卟啉原氧化酶基因的工序；(j)分离被破坏的原卟啉原氧化酶基因的工序。
而且本发明还涉及：(19)上述(4)或(5)记载的蛋白质作为原卟啉原氧化酶的使用方法；(20)人为地使上述(4)或(5)记载的蛋白质与原卟啉原IX接触转换成原卟啉IX的方法；(21)上述(6)～(9)中任一项记载的DNA作为原卟啉原氧化酶基因的使用方法；(22)人为地使上述(6)～(9)中任一项记载的DNA表达，使其表达产物与原卟啉原IX接触转换成原卟啉IX的方法。
而且本发明还涉及：(23)包括以下的1)～5)工序的分离特定生物中编码具有规定功能的蛋白质的基因的方法：1)在特定生物中导入来源于特定生物以外的其它生物的编码互补规定功能的蛋白质的基因来制备转化体的工序；2)通过变异处理等随机破坏转化体的基因从而制备转化体的变异株的工序；3)通过使用作用于互补规定功能的蛋白质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂，或者改变培养条件，从而选择编码具有规定功能的蛋白质的基因被破坏的变异株的工序；4)确定被破坏的编码具有规定功能的蛋白质的基因的工序；5)分离被破坏的编码具有规定功能的蛋白质的基因的工序。
而且本发明还涉及：(24)上述(23)记载的基因的分离方法，其特征在于，变异处理为使用转座子的变异处理；(25)上述(23)或(24)记载的基因的分离方法，其特征在于，所述来源于特定生物以外的其它生物的互补规定功能的蛋白质为拟南芥的原卟啉原氧化酶；(26)上述(25)记载的基因的分离方法，其特征在于，所述作用于互补规定功能的蛋白质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂为三氟羧草醚；(27)上述(25)或(26)记载的基因的分离方法，其特征在于，特定生物中的具有规定功能的蛋白质为蓝藻的原卟啉原氧化酶。
附图说明
图1：序列号2所示的氨基酸序列和蓝藻来源的功能未知的基因编码的氨基酸序列的比对。
图2：序列号2所示的氨基酸序列和其它生物来源的功能未知的基因编码的氨基酸序列的比对。
图3：表示破坏集胞藻属(Synechocystis)的slr1790基因用的构建体(pslr1790SKM 6.4kb)。
图4：表示原卟啉IX的试样(A)、slr1790基因缺损株的提取液(C)和野生株的提取液(B)中涉及的原卟啉IX的色谱图。
图5：表示pBI121的概略。
图6：表示pBIslr1790的概略。
具体实施方式
本发明的原卟啉原氧化酶具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性。其中，所谓“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶”是指在适当的生物中导入该原卟啉原氧化酶，使该酶在该生物中适当表达时，该生物的对三氟羧草醚的抗性提高了的原卟啉原氧化酶。该生物对三氟羧草醚的抗性是否获得提高，可以通过例如确认与导入该酶前相比，导入该酶后，三氟羧草醚的对该生物的48小时后的LC50值是否提高来研究。而且，尤其是生物为植物时，例如将特定量的三氟羧草醚施用于植物的栽培土壤中时，通过确认与使前述酶在植物中适当表达前的植物相比，使前述酶在植物中适当表达的植物的黄化、褐变或枯化的程度降低，或者确认与使前述酶在植物中适当表达前的植物相比，在使前述酶在植物中适当表达的植物中发生同程度的黄化、褐变或枯化所需要的三氟羧草醚的单位面积的施用量增加等，可以研究该植物对三氟羧草醚的抗性是否提高。对三氟羧草醚的抗性的提高程度没有特别的限制，三氟羧草醚对生物的48小时后的LC50值，或者发生同程度的黄化、褐变或枯化所需要的三氟羧草醚的单位面积的施用量，与在该生物中导入该酶前相比，优选提高到1.1倍以上，更优选提高到1.5倍以上，更为优选提高到2倍以上，最优选提高到3倍以上。
而且，本发明的“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶”中，也包括该原卟啉原氧化酶自身具有对三氟羧草醚的抗性的情况，其中，所谓“原卟啉原氧化酶自身具有对三氟羧草醚的抗性”是指，在含有1μM的三氟羧草醚的适当溶剂中的原卟啉原氧化酶的比活性为三氟羧草醚不存在时的原卟啉原氧化酶的比活性的五十分之一以上，优选二十分之一以上，更优选十分之一以上。其中“原卟啉原氧化酶活性”是指氧化原卟啉原IX生成原卟啉IX的酶活性。某些蛋白质的原卟啉原氧化酶比活性，可以通过在适当的缓冲液或盐溶液中使该蛋白质与原卟啉原IX接触，研究原卟啉原IX的生成量等而容易地进行确认。而且，“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性”中的“生物”没有特别的限制，可以是植物也可以是微生物，但优选植物，其中优选拟南芥、烟草、玉米、稻、麦类(小麦、大麦等)、薯类(马铃薯等)。
本发明的原卟啉原氧化酶，只要具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，可以不来源于蓝藻，也可以来源于蓝藻。蓝藻没有特别的限制，可以例举，例如属于集胞藻属、鱼腥藻(Anabaena)属、粘杆菌(Gloeobacter)属、原绿球藻(Prochlorococcus)属、聚球藻(Synechococcus)属、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)属的蓝藻、更具体可以列举集胞藻属PCC6803、鱼腥藻属PCC7120、无类囊体蓝藻(Gloeobacter violaceus)PCC7421、海洋原绿球藻(Prochlorococcusmarinus)SS120、海洋原绿球藻MIT9313、海洋原绿球藻MED4、聚球藻WH8102、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。这其中，优选属于集胞藻属的蓝藻，更优选集胞藻属PCC6803。
本发明中，所谓“来源于蓝藻的原卟啉原氧化酶”是指除了包括实际存在于蓝藻中的原卟啉原氧化酶，只要是与该原卟啉原氧化酶同一，使用转化等手法由蓝藻以外的微生物表达的原卟啉原氧化酶也包括在其中。
本发明的蛋白质为以下任一项所示的蛋白质：(1)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质；(2)含有在序列号2所示的氨基酸序列、序列号2的氨基酸编号1～34和48～176中记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1～34和48～193中记载的氨基酸序列中的任一氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白质；(3)与序列号2所示的氨基酸序列、序列号2的氨基酸编号1～34和48～176中记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1～34和48～193中记载的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的同源性为20％以上并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。以下，也将这些本发明的蛋白质总称为“本案蛋白质”。
本发明的上述蛋白质(2)如果是序列号2所示的氨基酸序列、序列号2的氨基酸编号1～34和48～176中记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1～34和48～193中记载的氨基酸序列中的任一氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质，则没有特别的限制。但可以优选列举在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，并且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质；由含有在序列号2的氨基酸编号1～34和48～176中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且在对应于该氨基酸编号1～34的氨基酸序列的氨基酸序列和对应于该氨基酸编号48～176的氨基酸序列的氨基酸序列之间具有10～16个、优选12～14个、更优选13个任意的氨基酸序列的氨基酸序列构成的，而且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质；由含有在序列号2的氨基酸编号1～34和48～193中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且在对应于该氨基酸编号1～34的氨基酸序列的氨基酸序列和对应于该氨基酸编号48～193的氨基酸序列的氨基酸序列之间具有10～16个、优选12～14个、更优选13个任意的氨基酸序列的氨基酸序列构成的，而且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。其中，所谓对应于氨基酸编号m～n的氨基酸序列的氨基酸序列是指在氨基酸编号m～n的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
上述所谓“缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列”是指缺失、取代或添加了例如1～20个、优选1～15个、更优选1～10个、更优选1～5个、最优选1～3个任意个数的氨基酸的氨基酸序列。
本发明中，所谓“具有原卟啉原氧化酶活性”是指具有氧化原卟啉原IX生成原卟啉IX的酶活性。某些蛋白质是否具有原卟啉原氧化酶活性，可以通过在适当的缓冲液或盐溶液中使该蛋白质与原卟啉原IX接触，研究原卟啉原IX的生成而容易地进行确认。
而且，所谓“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白质”是指在适当的生物中导入该蛋白质，使该蛋白质在该生物中适当表达时，该生物对三氟羧草醚的抗性提高的蛋白质。该生物对三氟羧草醚的抗性是否提高可以通过例如确认与导入该蛋白质前相比，导入该蛋白质后，三氟羧草醚的对该生物的48小时后的LC50值是否提高来研究。并且，尤其是生物为植物时，例如在植物的栽培土壤中施用特定量的三氟羧草醚时，通过确认与在植物中使前述蛋白质适当表达前的植物相比，使前述蛋白质在植物中适当表达的植物黄化、褐变或枯化的程度降低，或者确认与在植物中使前述蛋白质适当表达前的植物相比，在使前述蛋白质在植物中适当表达的植物中发生同程度的黄化、褐变或枯化所需要的三氟羧草醚的单位面积的施用量增加等，可以研究该植物对三氟羧草醚的抗性是否提高。对三氟羧草醚的抗性的提高程度没有特别的限制，三氟羧草醚对该生物的48小时后的LC50值，或者发生同程度的黄化、褐变或枯化所需要的三氟羧草醚的单位面积的施用量，优选与在该生物中导入该蛋白质前相比，提高到1.1倍以上，更优选提高到1.5倍以上，更为优选提高到2倍以上，最优选提高到3倍以上。
而且，本发明的“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白质”中，也包括该蛋白质自身具有对三氟羧草醚的抗性的情况。其中，所谓“该蛋白质自身具有对三氟羧草醚的抗性”是指，在含有1μM的三氟羧草醚的适当溶剂中的该蛋白质的比活性(与原卟啉原氧化酶活性相关)为三氟羧草醚不存在时的比活性(与原卟啉原氧化酶活性相关)的五十分之一以上，优选二十分之一以上，更优选十分之一以上。其中“原卟啉原氧化酶活性”是指氧化原卟啉原IX生成原卟啉IX的酶活性。某些蛋白质的比活性(与原卟啉原氧化酶活性相关)，可以在适当的缓冲液或盐溶液中使该蛋白质与原卟啉原IX接触，研究原卟啉IX的生成量等来容易地进行确认。而且，“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性”中的“生物”没有特别的限制，优选是植物和微生物，特别优选植物。
本发明的上述蛋白质(3)如果是与序列号2所示的氨基酸序列(slr1790)、序列号2的氨基酸编号1～34和48～176中记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1～34和48～193中记载的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的同源性为20％，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质，则没有特别的限制，但优选与序列号2所示的氨基酸序列、序列号2的氨基酸编号1～34和48～176记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1～34和48～193中记载的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的同源性为45％以上，更优选54％以上，更为优选65％以上，更优选80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上。其中，本发明中所谓“与氨基酸编号o～p和q～r中记载的氨基酸序列的同源性在X％以上”是指与按顺序依次具有氨基酸编号o～p的氨基酸序列和氨基酸编号q～r的氨基酸序列，并且氨基酸编号o～p的氨基酸序列和氨基酸编号q～r的氨基酸序列之间具有10～16个、优选12～14个、更优选13个任意的氨基酸序列的氨基酸序列的同源性为X％以上。上述蛋白质(3)中“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白质”和“具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的蛋白质”和它们的优选方式与上述蛋白质(2)中的那些蛋白质含义相同。
用BLAST检索与本发明的序列号2所示的氨基酸序列同源性高的蛋白质，结果发现了几个编码与序列号2所示的氨基酸同源性高的氨基酸序列的功能未知的基因。其中，蓝藻来源的功能未知的基因示于表1。而且，该基因编码的氨基酸序列与本发明的序列号2所示的氨基酸序列的同源性(％)也示于表1。它们也包含于本案蛋白质中。本发明人清楚了本发明的序列号2所示的氨基酸序列，如后述的实施例中所记载的，为由来源于集胞藻属PCC6803的slr1790基因编码的氨基酸序列。
[表1]
  蓝藻的种名   基因名   与slr1790的氨基酸序列的同源性(％)
  集胞藻属PCC6803   slr1790   -
  鱼腥藻属PCC7120   alr5217   68
  无类囊体蓝藻PCC7421   gll3040   65
  海洋原绿球藻SS120   Pro0955   55
  海洋原绿球藻MIT9313   PMT0725   54
  聚球藻属WH8102   SYNW1243   56
  海洋原绿球藻MED4   PMM0881   46
  沼泽红假单胞菌   RPA0297   27
而且，表1中所示的基因编码的氨基酸序列的比对示于图1中。
图1的比对中，在所有7个基因共同的氨基酸下加上了星号。而且，4～6个基因共同的氨基酸下加上了点。从表1和图1中清楚表明，集胞藻属PCC6803以外的7种蓝藻的这些氨基酸序列与集胞藻属PCC6803的slr1790基因编码的氨基酸同源性高，而且在特定区域很保守。因此，预测集胞藻属PCC6803的slr1790基因之外的这些基因编码的蛋白质，与集胞藻属PCC6803的slr1790基因编码的蛋白质(序列号2的氨基酸序列)同样为具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶。而且，根据图1的比对，本发明的原卟啉原氧化酶，序列号2所示的氨基酸序列或序列号1所示的碱基序列中，序列号2的氨基酸编号1～34和48～193中记载的氨基酸序列(序列号1的碱基编号1～102和142～582中记载的碱基序列)，尤其是序列号2的氨基酸编号1～34和48～176中记载的氨基酸序列(序列号1的碱基编号1～102和142～528中记载的碱基序列)的保守性高，预测它们的部分序列对该酶的性质起到重要的作用。
而且，作为编码与序列号2所示的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列的基因，通过BLAST检索显示的基因中，蓝藻以外的生物来源的基因示于以下的表2中。这些基因的表达产物也包含于本案蛋白质中。
[表2]
生物的种名 基因名   与slr1790的氨基酸序列的同源性(％)
  集胞藻属PCC6803   slr1790
  绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)   PA0661   35
  幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)   O26018   33
  马耳他热布鲁氏菌(Brucella melitensis)   Q8YJT0   29
  根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(菌株C58/ATCC 3397O) Q8UBL7 25
而且，表2中所示的基因编码的氨基酸序列的比对示于以下的图2中。
图2的比对中，在所有5个基因共同的氨基酸下加上了星号。而且，3个基因共同的氨基酸下加上了点。从表2和图2中清楚表明，集胞藻属PCC6803以外的4种生物的这些氨基酸序列与集胞藻属PCC6803的slr1790基因编码的氨基酸同源性高，而且在特定区域很保守。因此，预测集胞藻属PCC6803的slr1790基因之外的这些基因编码的蛋白质，也与集胞藻属PCC6803的slr1790基因编码的蛋白质(序列号2的氨基酸序列)同样为具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶。
本发明还涉及上述的本案蛋白质作为原卟啉原氧化酶的使用方法。其中，所谓“作为原卟啉原氧化酶的使用”是指，例如在体外或体内人为地使本案蛋白质与底物原卟啉原IX接触而生成反应生成物原卟啉IX的反应中使用等，本案蛋白质具有原卟啉原氧化酶活性这个认识是由本发明首次了解清楚的全新的认识。而且，人为地使本发明的本案蛋白质与原卟啉原IX接触而转换成原卟啉IX的方法中所谓的“人为地使......接触”是指在体外或体内人为地使之接触，例如不包括在蓝藻细胞中非人为地接触。
本发明的原卟啉原氧化酶基因DNA为以下基因DNA中的任一种：(1)编码本发明的原卟啉原氧化酶或本案蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA；(2)由序列号1所示的碱基序列构成的原卟啉原氧化酶基因DNA；(3)编码以具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，其含有在序列号1的碱基序列、序列号1的碱基编号1～102和142～528中记载的碱基序列和序列号1的碱基编号1～102和142～582中记载的碱基序列中的任一碱基序列中缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列；(4)编码以具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，其与由与序列号1的碱基序列、序列号1的碱基编号1～102和142～528中记载的碱基序列和序列号1的碱基编号1～102和142～582中记载的碱基序列中的任一碱基序列的互补序列构成的DNA在严谨条件下杂交。这些本发明的原卟啉原氧化酶基因DNA有时总称为“本案基因DNA”。
本发明的上述DNA(2)如果是编码以具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，且含有序列号1所示的碱基序列、序列号1的碱基编号1～102和142～528中记载的碱基序列和序列号1的碱基编号1～102和142～582中记载的碱基序列中的任一碱基序列中缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列，则没有特别的限制。优选可以列举：编码以具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，其由序列号1所示的碱基序列中缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成；编码以具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，其由含有序列号1的碱基编号1～102和142～528中记载的碱基序列中缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列，并且在对应于该碱基编号1～102的碱基序列的碱基序列和对应于该碱基编号142～528的碱基序列的碱基序列之间具有30～48(只限于3的倍数)个、优选36～42(只限于3的倍数)个、更优选39个任意的碱基序列的碱基序列构成；编码以具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性为特征的、具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA，其由含有序列号1的碱基编号1～102和142～582中记载的碱基序列中缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列，并且在对应于该碱基编号1～102的碱基序列的碱基序列和对应于该碱基编号142～582的碱基序列的碱基序列之间具有30～48(只限于3的倍数)个、优选36～42(只限于3的倍数)个、更优选39个任意的碱基序列的碱基序列构成。其中，所谓对应于碱基编号m～n的碱基序列的碱基序列是指在碱基编号m～n的碱基序列中缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列。
上述所谓“缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列”是指例如缺失、取代或添加了1～20个、优选1～15个、更优选1～10个、更优选1～5个、最优选1～3个的任意个数的碱基的碱基序列。
例如，这些缺失、取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列构成的DNA(变异DNA)也可以通过化学合成、基因工程法、突变诱导等本领域技术人员已知的任意方法进行制备。具体的是，可以通过采用使序列号1所示的碱基序列构成的DNA与作为变异原的药剂发生接触作用的方法、照射紫外线的方法、基因工程法等，在这些DNA中导入变异，从而获得变异DNA。作为基因工程法的一种的定点诱变法由于是一种可以在特定位置导入特定变异的方法，因此有用，可以按照分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，1989(以后简称为分子克隆第二版)等中记载的方法进行。通过使用适当的表达系使该变异DNA表达，可以获得由缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质。
上述所谓“在严谨条件下杂交的DNA”是指通过使用DNA或RNA等核酸作为探针，使用菌落杂交法、噬斑杂交法或者Southern杂交法等获得的DNA，具体而言，可以列举通过使用固定有来源于菌落或噬斑的DNA或该DNA的片段的滤膜，在0.7～1.0M的NaCl存在下，于65℃进行杂交后，使用0.1～2倍左右的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在65℃条件下清洗滤膜从而可以鉴定的DNA。杂交可以按照分子克隆第2版等中记载的方法进行。
例如，作为在严谨条件下可以杂交的DNA，可以列举与作为探针使用的DNA的碱基序列具有一定以上的同源性的DNA，例如，可以优选列举与序列号1的碱基序列、序列号1的碱基编号1～102和142～528中记载的碱基序列和序列号1的碱基编号1～102和142～582中记载的碱基序列中任一碱基序列具有60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、更优选90％以上、特别优选95％以上、最优选98％以上的同源性的DNA。其中，本发明中所谓“与碱基编号s～t和u～v中记载的碱基序列的同源性为X％以上”是指与下述碱基序列的同源性为X％以上：按顺序依次具有碱基编号s～t的碱基序列和u～v的碱基序列，并且在碱基编号s～t的碱基序列和碱基编号u～v的碱基序列之间具有30～48(只限于3的倍数)个、优选36～42(只限于3的倍数)个、更优选39个任意的碱基序列的碱基序列。而且，作为在严谨条件下可以杂交的DNA，可以优选例举编码如下氨基酸序列的DNA：与序列号2所示的氨基酸序列、序列号2的氨基酸编号1～34和48～176中记载的氨基酸序列、和序列号2的氨基酸编号1～34和48～193中记载的氨基酸序列中的任一氨基酸序列的同源性为20％以上、优选45％以上、更优选54％以上、更为优选65％以上、更优选80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的氨基酸序列。
本发明还涉及上述的本案DNA作为原卟啉原氧化酶基因的使用方法。其中，所谓“作为原卟啉原氧化酶基因的使用”是指在如下反应中使用等：例如在体外或体内人为地使本案DNA表达，使其表达产物原卟啉原氧化酶与底物原卟啉原IX接触，生成反应生成物原卟啉原IX。本案DNA的表达产物具有原卟啉原氧化酶活性这个认识是由本发明首次了解清楚的全新的认识。通过将本案DNA作为原卟啉原氧化酶基因使用，例如，可以给予对三氟羧草醚不具有抗性的生物以三氟羧草醚抗性。而且，人为地使本发明的本案DNA表达，使其表达产物与原卟啉原IX接触，转换成原卟啉IX的方法中所谓的“人为地使......表达”是指在体外或体内人为地使之表达，例如不包括在蓝藻细胞中非人为地表达。
本案蛋白质、本案基因DNA的分离方法没有特别的限制，但可以是由分子遗传学的方法、酶学方法等一般已知的方法获得的分离方法。分离编码与已知的原卟啉原氧化酶同源性低的原卟啉原氧化酶的基因DNA时，优选使用包括以下工序的原卟啉原氧化酶基因分离方法：(f)在蓝藻中导入拟南芥的原卟啉原氧化酶基因的工序；(g)用转座子破坏蓝藻的基因的工序；(h)选择出原卟啉原氧化酶基因被破坏的菌株的工序；(i)确定出被破坏的原卟啉原氧化酶基因的工序；(j)分离被破坏的原卟啉原氧化酶基因的工序。
作为采取源的生物，可以是对三氟羧草醚不具有抗性的生物，但优选对三氟羧草醚具有抗性的生物。以下，以对三氟羧草醚具有抗性的生物作为采取源时的方法进行描述。
即使作为采取源的生物的原卟啉原氧化酶发生缺损，为了该生物可以生长，在变异原处理前，预先在作为采取源的生物中导入来源于该生物的近源生物等的原卟啉原氧化酶基因，使来源于该近源生物等的原卟啉原氧化酶基因在作为采取源的生物中表达。来源于该近源生物的原卟啉原氧化酶，使用确认了对三氟羧草醚没有显示出抗性者。然后，对于作为采取源的生物进行利用转座子的变异原处理，对获得的变异体使用三氟羧草醚(二苯基醚系除草剂)进行筛选。作为采取源的生物对三氟羧草醚显示出抗性，但是其它近源生物等来源的原卟啉原氧化酶没有显示出对三氟羧草醚的抗性(显示出感受性)。因此，导入了来源于该近源生物等的原卟啉原氧化酶基因的采取源(原卟啉原氧化酶缺损株)显示出对三氟羧草醚的感受性。因此，选择出不进行三氟羧草醚处理时通常生长，在进行三氟羧草醚处理时显示出感受性的变异株。例如，通过实施例3中记载的方法等，对于对三氟羧草醚显示出感受性的菌株，可以通过分析转座子的插入位置来确定基因。这样，可以分离采取源来源的编码对三氟羧草醚显示出抗性的原卟啉原氧化酶的基因。
本发明中作为原卟啉原氧化酶基因的采取源使用的生物，优选为具有与已存在的原卟啉原氧化酶显示出低同源性的酶的生物。所谓本发明的与已存在的原卟啉原氧化酶基因显示出低同源性的基因，具体是指例如与烟草PPX1基因(Genbank登录号Y13465)在氨基酸水平的同源性不足20％的基因。本发明中作为原卟啉原氧化酶基因的采取源使用的生物，优选原核生物，更优选蓝藻，从容易获得、易于操作等考虑，最优选集胞藻属PCC6803的葡萄糖耐性株。这些菌株可以从例如Pasteur研究所容易地获得。该株的培养条件可以按照一般已知的方法进行，但理想的是，通过在一定光存在下，于30℃在BG11培养基[Hihara Y.et al，Plant Physiol(1998)117：pp.1205]中将TES-KOH(pH-8.2)调整成最终5mM来进行。
本案基因DNA的获得方法、制备方法没有特别的限定，可以基于本说明书中公开的序列号1所示的碱基序列信息或序列号2所示的氨基酸序列信息，制备适当的探针、引物，用它们从例如集胞藻属PCC6803、其之外的蓝藻等生物的基因组DNA文库等中分离目的基因，按照常规方法通过化学合成进行制备。而且，基因组DNA的获得和其克隆等均可按照常规方法实施。从基因组DNA文库筛选本案基因DNA的方法，可以列举，例如分子克隆第2版中记载的方法等本领域技术人员常用的方法。而且，作为变异基因或相同基因，可以通过利用具有序列号1所示的碱基序列或其一部分的DNA片段，通过其它生物体等，在适当条件下筛选具有与该DNA的同源性高的碱基序列的DNA来进行分离。此外，也可以通过前述变异DNA的制备方法进行调制。
作为本发明的重组载体，如果是组入了本案基因DNA的重组载体，则没有特别的限制，本发明的重组载体可以通过在表达载体中适当导入本案基因DNA来构建。例如，可以优选列举在适当的启动子下游连接了本案基因DNA的构建体。作为表达载体，优选可以在宿主细胞中自我复制的表达载体，或可以组入到宿主细胞的染色体中的表达载体，而且，可以优选使用含有与本发明的基因的表达相关的启动子、终止子等控制序列或转录控制因子的基因的表达载体。
作为细菌用的表达载体，可以列举例如pUC118(宝酒造社制)、pUC19[Gene，33，103(1985)]等的pUC系统、pGEMEX-1(Promega公司制)等pGEM系统、pKK223-2(Pharmacia公司制)、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII SK(-)(Stratagene公司制)等公知或市售的表达载体。
而且，作为细菌用启动子，可以列举例如T7噬菌体启动子、trp启动子(P trp)、lac启动子(P lac)、recA启动子、λPL启动子、λPR启动子、lpp启动子、PSE启动子、SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等。
作为植物细胞用的表达载体，可以列举例如pIG121-Hm[Plant CellReport，15，809-814(1995)]、pBI121[EMBO J.6，3901-3907(1987)]、pLAN411、pLAN421(Plant Cell Reports 10(1991)286-290)。而且，作为植物用启动子，可以列举例如花椰菜花叶病毒35S启动子(Mol.Gen.Genet(1990)220，389-392)等。而且，可以列举玉米来源的乙醇脱氢酶的启动子(Maydica 35(1990)353-357)，拟南芥来源的IRE基因的启动子(特开2000-270873号公报)等。
作为本发明的转化体，如果是导入了上述本发明的重组载体的转化体，则没有特别的限制，作为宿主，可以列举细菌等微生物、植物、动物等，优选微生物、植物。作为细菌，具体可以例举例如埃希氏杆菌属细菌、假诺卡氏菌属细菌、链霉菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、链球菌属细菌、葡萄球菌属细菌等。而且，作为植物，具体可以例举拟南芥、烟草、玉米、稻、麦类(小麦、大麦等)、薯类(马铃薯等)等。
作为在宿主微生物中导入上述本发明的重组载体的方法，可以通过分子克隆第2版等众多标准实验室手册中记载的方法，例如电穿孔、转导、转化等进行。而且，作为上述在植物中导入本发明的重组载体的方法，可以列举基因枪法、电穿孔法、农杆菌法等。
认为导入了本发明的重组载体的转化体，优选转化植物具有对三氟羧草醚的抗性。其中，所谓“具有对三氟羧草醚的抗性的转化体”是指，与导入本发明的重组载体之前相比，对三氟羧草醚的抗性提高的转化体。该转化体对三氟羧草醚的抗性是否提高，可以通过确认与导入该重组载体前相比，导入该重组载体后，三氟羧草醚对该转化体的48小时后的LC50值是否提高来研究。而且，尤其是生物为植物时，例如在植物的栽培土壤中施用特定量的三氟羧草醚时，通过确认与在植物中使前述重组载体适当表达前的植物相比，使前述重组载体在植物中适当表达的植物黄化、褐变或枯化的程度降低，或者确认与在植物中使前述重组载体适当表达前的植物相比，在使前述重组载体在植物中适当表达的植物中发生同程度的黄化、褐变或枯化所需要的三氟羧草醚的单位面积的施用量增加等，可以研究该植物对三氟羧草醚的抗性是否提高。对三氟羧草醚的抗性的提高程度没有特别的限制，三氟羧草醚对生物的48小时后的LC50值，或者发生同程度的黄化、褐变或枯化所需要的三氟羧草醚的单位面积的施用量，优选与在该生物中导入该重组载体前相比，提高到1.1倍以上，更优选提高到1.5倍以上，更为优选提高到2倍以上，最优选提高到3倍以上。
例如，通过在适当的培养基中培养本发明的转化体，使本案蛋白质在培养物中生成积累，再通过从该培养物中采取本案蛋白质，可以大量制造本案蛋白质。而且，转化植物时，撒播作为农药·除草剂的三氟羧草醚时，栽培目的的转化植物生存，三氟羧草醚感受性的杂草死亡，可以选择性培育栽培目的的转化植物。
本发明的转化植物的光合成能力可以不提高，但优选光合成能力提高，更优选在三氟羧草醚存在下光合成能力提高。本发明的转化植物，由于表达许多原卟啉原氧化酶，因此可期待光合成能力提高。通过比较导入本发明的重组载体前宿主植物的光合成能力与导入后的转化植物的光合成能力，可以确认光合成能力是否提高。其中，可以通过比较根据用光合成蒸散测定装置获得的测定值计算出的光合成速度，或比较一定期间同条件下培养后的植物体的干燥重量等来确认光合成能力是否提高。
本发明的转化体可以在评价抑制原卟啉原氧化酶活性能力的方法中使用。该评价方法没有特别的限定，但可以列举，例如包括以下(1)～(3)的评价方法：(1)在被检物质存在下培养该转化体的宿主，记录生长曲线；(2)在与(1)同样的被检物质存在下培养该转化体，记录生长曲线；(3)比较阶段(1)和阶段(2)中记录的生长曲线。
而且，本发明的转化体也可以在原卟啉原氧化酶抑制剂的筛选方法中使用。作为该筛选方法，可以列举例如与上述评价方法相同的方法。
而且，三氟羧草醚是二苯基醚系除草剂的1种。本案蛋白质由于具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性，因此认为也具有给予生物对作用机制类似的其它二苯基醚系除草剂的抗性的活性。对于本案的原卟啉原氧化酶及本发明的转化体也适用同样的考虑。
接着，对本发明的特定生物(例如，蓝藻)中编码具有规定功能的蛋白质(例如，原卟啉原氧化酶)的基因的分离方法进行说明。该基因的分离方法包括以下1)～5)的工序，其作为在其它生物种类的基因数据库中无法发现与已知蛋白质(例如，来源于拟南芥的原卟啉原氧化酶)同源的其它生物种类来源的蛋白质(例如，蓝藻来源的原卟啉原氧化酶)时的基因分离方法，特别有效：
1)在特定生物中导入来自特定生物之外的其它生物的编码互补规定功能的蛋白质的基因来制备转化体的工序；
2)随机破坏转化体的基因来制备转化体的变异株的工序；
3)通过使用作用于互补规定功能的蛋白质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂，或者改变培养条件，从而选择编码具有规定功能的蛋白质的基因被破坏的变异株的工序；
4)确定被破坏的编码具有规定功能的蛋白质的基因的工序；
5)分离被破坏的编码具有规定功能的蛋白质的基因的工序。
作为上述变异处理，还可以列举使用甲磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、2，6-二氨基嘌呤(DAP)等药剂处理细胞的变异处理、使用紫外线处理细胞的变异处理，可优选列举使用可以导入基因水平的变异的转座体(Transposome)的变异处理。转座体是转座子和转座酶(Transposase)的复合体，可以容易地在许多微生物中导入基因水平的变异(Hoffman，L.M.，Jendrisak，J.J.，Meis，R.J.，Coryshin，I.Y.andRezhikof，S.W.Genetica，108，19-24(2000))。例如，作为使用转座体的方法，已知有使用EZ::TNTM<KAN-2>Tnp转座体(EPICENTRE公司制)等的方法。
使用转座子的突变诱导法，作为基因分析的强大的工具是本领域公知的。基因破坏株可以通过例如用转座子导入的对特定抗生素的抗性标记等进行筛选。
通过对这样获得的基因破坏株进一步使用作用于互补规定功能的蛋白质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂，或者改变培养条件，来进行筛选，从而可以选择编码具有规定功能的蛋白质的基因由于转座子的导入而被破坏的变异株。邻接该转座子的核苷酸序列，可以通过例如链终止法(Sanger F.S.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75：5463-5467(1977))进行测定。这样，通过进行转座子标记的插入位置分析，可以确定出被破坏的编码具有规定功能的蛋白质的基因。
作为上述“作用于互补规定功能的蛋白质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂”，可以优选列举作用于来源于拟南芥的原卟啉原氧化酶，而不作用于蓝藻来源的原卟啉原氧化酶的三氟羧草醚(二苯基醚系)、吡草醚(pyraflufen-ethyl)(苯基吡唑系)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)(二羧酰亚胺系)。
可是，血红素和叶绿素由共同的前体δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合成。植物、大肠杆菌等中ALA由三个阶段的反应“C5型”合成，所述三个阶段的反应“C5型”包括：1)谷氨酰基-tRNA合成酶作用于谷氨酸，生成谷氨酰基-tRNA的步骤；2)谷氨酰基-tRNA还原酶作用于生成的谷氨酰基-tRNA生成谷氨酸1-半醛的步骤；3)谷氨酸1-半醛氨基变位酶作用于生成的谷氨酸1-半醛。但ALA在动物、农杆菌属细菌中经ALA合成酶作用于琥珀酰CoA和甘氨酸生成ALA的1阶段反应“C4型”来合成。如上所述，农杆菌属细菌以“C4型”合成ALA，该酶ALA合成酶的存在本身是已知的，但其基因没被鉴定时，编码植物来源的谷氨酰基-tRNA合成酶、谷氨酰基-tRNA还原酶和谷氨酸1-半醛氨基变位酶的基因共转染农杆菌属细菌，通过转座子等随机破坏转化农杆菌属细菌的基因而制备变异株，从该变异株中，选择在不存在作为谷氨酸1-半醛氨基变位酶抑制剂的gabaculine下生长、在gabaculine存在下死亡的变异株，通过进行该选择的变异株的转座子标记的插入位置的分析，可以鉴定来源于农杆菌属细菌的ALA合成酶基因。因此，作为前述“作用于互补规定功能的蛋白质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂”，可以列举作用于来源于植物、大肠杆菌的谷氨酸1-半醛氨基变位酶而不作用于来源于动物、农杆菌属细菌的δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合成酶的gabaculine。
而且，作为通过改变培养条件，从而选择编码具有规定功能的蛋白质的基因被破坏的变异株的方法，可以列举例如根据温度条件进行选择时，通过在常规培养温度和高温(或低温)下培养基因破坏株，选择出现生长差别的变异株的方法；例如根据光条件进行选择时，通过在通常的光条件和强光下(或弱光下)培养基因破坏株，选择出现生长差别的变异株的方法；例如根据pH条件进行选择时，在常规pH条件和高pH(或低pH)条件下培养基因破坏株，选择出现生长差别的变异株的方法等。
以下，通过实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的技术范围不受这些实施例的限制。
实施例1
(向蓝藻导入拟南芥来源的原卟啉原氧化酶基因)
用RNeasy RNA提取试剂盒(Qiagen公司制)从拟南芥的莲座叶中提取总RNA。按照常规方法从获得的总RNA中纯化Poly(A)+mRNA。以获得的Poly(A)+mRNA作为模板，使用ReverTra-Plus-试剂盒(TOYOBO公司制)，合成cDNA。以合成的cDNA作为模板，使用具有限制性内切酶AseI位点的引物ATHPPOX.Ase1f(序列号3)和引物ATHPPOX.r(序列号4)和TaKaRaLA Taq聚合酶(Takara公司制)，通过PCR扩增拟南芥的原卟啉原氧化酶基因(1.6kbp)后，用AseI切断该PCR产物。PCR进行28个变性(94℃、30秒)、退火(52℃、45秒)、延伸(72℃、120秒)的循环。
载体使用了可以用于对蓝藻的转化、带有卡那霉素抗性的pFS10[Jansson et al，Methods Enzymol(1998)297::pp166]。用限制性内切酶NdeI和HincII切断该pFS10载体，与前述原卟啉原氧化酶基因的PGR产物连接，制备出重组载体。用热激法将该重组载体转化到大肠杆菌(JM109)，用含有卡那霉素的LB琼脂培养基进行选择。在含有卡那霉素的LB液体培养基培养出现的菌落，从其培养物中纯化质粒。在后面的工序，即，使用转座子的变异原处理中，利用卡那霉素抗性作为选择标记。因此必须除去卡那霉素抗性基因，重新导入其它的抗生素抗性基因(氯霉素抗性基因)。
以pFS10载体作为模板，使用具有XbaI位点的引物Chloram.r(序列号5)和引物SPE2Xbal.r(序列号6)和Pyrobest Taq聚合酶(Takara公司制)，进行第一次PCR。PCR进行25个变性(98℃、10秒)、退火(55℃、45秒)、延伸(72℃、30秒)的循环。通过该PCR，获得了约500bp的PCR产物。然后，以氯霉素抗性基因作为模板，使用先前获得的PCR产物和引物Chloram.Xba1.f(序列号7)和Pyrobest Taq聚合酶(Takara公司制)进行第二次PCR。PCR进行25个变性(98℃、10秒)、退火(50℃、45秒)、延伸(72℃、90秒)的循环。用限制性内切酶XbaI切断由该PCR获得的含有氯霉素抗性基因的PCR产物。
另一方面，用限制性内切酶XbaI切断连结了拟南芥的原卟啉原氧化酶基因和pFS10载体的前述重组载体，除去卡那霉素抗性基因后，与前述用XbaI切断的氯霉素抗性基因片段连接，重新获得重组载体。用与前述相同的方法将该重组载体转化到大肠杆菌(JM109)，用含有氯霉素的LB琼脂培养基进行选择。在含有氯霉素的LB液体培养基培养出现的菌落，从其培养物中纯化质粒。用该质粒转化集胞藻属PCC6803，制备使拟南芥来源的原卟啉原氧化酶表达的集胞藻属(以下有时称为“AT株”)。集胞藻属PCC6803的转化方法，按照文献[Williams JG.MethodsEnzymol(1998)167：pp766]的方法进行。
实施例2
(利用转座子制备蓝藻变异体)
用Tsp5091限定分解从集胞藻属PCC6803中提取的基因组，用λZAP载体试剂盒(Stratagene公司制)，制备基因组质粒文库。用EZ::TNTM<KAN-2>Insertion试剂盒(Epicentre公司制)在体外对基因组质粒文库插入转座子。转座子的插入方法按照Epicentre公司公开的手册进行。使用插入了该转座子标记的集胞藻属基因组质粒文库，通过同源重组对AT株进行转化，制备使拟南芥来源的原卟啉原氧化酶表达之后的集胞藻属变异株。
实施例3
(蓝藻原卟啉原氧化酶缺损株的筛选)
使用对三氟羧草醚的感受性作为选择标记，从实施例2制备的集胞藻属变异株中进行蓝藻原卟啉原氧化酶缺损株的筛选。具体而言，按照以下步骤进行。
在含有终浓度为500μM的三氟羧草醚的BG11琼脂培养基中，接种实施例2制备的集胞藻属变异株，用白色荧光灯连续光照射(光强度30μmol s-1m-2)下，30℃下进行两周的静置培养。而且，用不含三氟羧草醚的BG11琼脂培养基进行同样的培养。以这些培养的结果为基础，选择9株在不存在三氟羧草醚下生长但在三氟羧草醚存在下死亡的变异株。这9株中，将三氟羧草醚存在下生长抑制程度最高的菌株命名为3216株，如下述说明，分析转座子标记的插入位置，结果发现转座子标记插入于推定为蛋白质slr1790的转录调节区域的位置。
(蓝藻变异体的基因分析)
设想两种方式作为确认转座子标记插入位置的方法。
(1)由于使用的转座子导入了作为标记的卡那霉素抗性基因，因此利用该抗生素抗性进行选择。
具体而言，从变异株中获得DNA，利用卡那霉素抗性基因中不含的限制性内切酶序列将DNA片段化。用切断DNA的同样的限制性内切酶切断不具有卡那霉素抗性基因的载体。将它们连接然后转化到大肠杆菌，对在含有卡那霉素的培养基上生长的菌落纯化质粒，分析序列。
(2)用反向PCR法。与(1)相同，从变异株中获得DNA，利用转座子标记中不含有的限制性内切酶序列进行片段化。使其自我连结(环状化)，设计朝向转座子标记的外侧的引物，进行PCR反应，分析扩增PCR产物的序列。
首先，用(1)中所示的利用抗生素抗性的方法进行研究。
(1)利用卡那霉素抗性的研究
<蓝藻变异体DNA的提取>
在BG11液体培养基中于30℃在明亮的地方培养蓝藻变异体(3216株)12天。培养终止后，收集菌体，用SDS法进行提取，结果获得了约800μg的蓝藻变异体DNA。
<用限制性内切酶进行切断>
分别使用EcoR1、Sac1作为限制性内切酶，切断蓝藻变异体DNA和载体(pUC118)。限制性内切酶处理结束后，用旋转柱纯化片段化的蓝藻变异体DNA。为了防止载体的自我连结，进行碱性磷酸酶处理。
<连结>
从数据库中可知如果用上述3种限制性内切酶切断，则用EcoR1切断可获得的平均片段长度为6kb，用Sac1切断可获得的平均长度为10kb。参考平均片段长，将插入物/载体的摩尔比调整成3/1和9/1，于12℃连结16小时。
<向大肠杆菌的转化>
用连结液的一部分，通过热激法转化到大肠杆菌(JM109)，用含有卡那霉素的LB琼脂培养基进行选择。其结果是，在含有卡那霉素的LB琼脂培养基中没有发现菌落。
而且，即使将连结时的插入物/载体的混合比率设为插入物过量，也是相同的结果。利用抗生素抗性的选择方法在理论上是可行的，但这次的情况，考虑是例如插入物/载体比的条件不匹配等问题所致。存在对条件进行研究的余地，用(2)中所示的反向PCR法进行了研究。
(2)利用反向PCR法进行的研究
对表现型强的3216株进行了研究。以与上述同样的方法进行了DNA的获得，使用EcoR1、Kpn1作为限制性内切酶。限制性内切酶处理结束后，用旋转柱纯化DNA片段。
<自我连结>
使用经旋转柱纯化的DNA片段，于12℃进行16小时自我连结。
<第1次和第2次PCR>
反向PCR法时，由于担心非特异性的条带的扩增，因此PCR反应分成两个阶段进行。
设计两组朝向转座子标记的外侧的引物。
第2次PCR的引物使用试剂盒附带的测序引物。
(第1次PCR用引物)
KAN-2-fr(序列号17)
KAN-2-rev(序列号18)
(第2次PCR用引物)
KAN-2FP1(序列号19)
KAN-2RP1(序列号20)
将自我连结的基因组片段作为模板进行第1次PCR。第1次PCR条件为30个98℃10秒(变性)、55℃30秒(退火)、72℃7分(延伸)的循环，使用EX taq聚合酶(Takara公司制)，引物浓度为最终各0.5μM。
在上述连结液50倍稀释、250倍稀释、1250倍稀释这三个阶段研究模板的终浓度。取5μl PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行确认。电泳结果，只在使用由EcoR1切断的模板时在7kb附近发现了特异的条带扩增。为了除去引物，用旋转柱纯化第1次PCR产物，作为第2次PCR的模板。
第2次PCR条件为3个98℃10秒(变性)、60℃30秒(退火)、72℃5分钟(延伸)的循环后，20个98℃10秒(变性)、58℃30秒(退火)、72℃5分钟(延伸)的循环，使用EX taq聚合酶(Takara公司制)，引物浓度为最终各0.5μM来进行。
取5μl PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行确认。
其结果，通过引物的设计，在比第1次PCR产物低数百个bp的位置发现了条带的扩增，同时还发现了非特异性的条带的扩增。
<TA克隆和质粒的纯化>
进行了第2次PCR的条件的研究，但无法抑制非特异性条带的扩增，因此对于第1次PCR中特异性扩增的7kb附近的条带进行了凝胶回收。将其作为插入物，进行TA克隆(使用pGEM-T Easy载体，Promega公司制)，通过热激法转化到大肠杆菌(JM109)，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中进行选择。选择4个在培养板上出现的菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，用Miniprep法进行质粒的纯化。由于用EcoR1处理pGEM-T Easy载体，可以切出插入物，因此对纯化的质粒进行EcoR1处理，通过琼脂糖凝胶电泳进行了确认。
电泳的结果，质粒1和2在5kb、3kb(载体)、1.8kb附近发现了条带。插入物来源的条带的合计大小为7kb左右，判断为目的克隆。对于质粒1和2，经EcoR1处理发现了包括载体来源在内的3个被切断的条带，这考虑可能是在最初的连结阶段未形成环状，而形成连环体。由于序列分析中没有问题，因此对质粒1进行测序反应。
<测序>
对质粒1，通过双脱氧法以循环测序分析碱基序列。
使用第2次PCR中使用的KAN-2FP1和KAN-2RP1作为测序引物。使用的测序引物由于与转座子标记的DNA区域退火，因此获得的序列数据的开始部分为转座子标记的DNA区域。反向重复序列为转座子插入克隆的靶DNA和转座子标记的接点处发现的19bp转座子嵌合末端转座酶(Transposon Mosaic End Transposase)识别序列，该序列可以明显地识别靶和转座子标记。
而且，由转座酶催化的转座子插入，生成9-bp的靶位点重复序列以保护插入的转座子的侧面。
如果参考这些内容来分析获得的序列，可以确认转座子标记插入于蓝藻基因组第256677位的T至第256685位的G之间(确认嵌合末端序列和9-bp重复序列)。该位置不包含于ORF区域中，但认为其为存在于下游的推定蛋白质slr1790(256698～257279，193aa)的转录调节区域。
在不存在三氟羧草醚下生长但在存在三氟羧草醚下死亡的9株变异株中，对于3216株之外的8株，也进行了同样的分析，这些株都在与3216株同样的基因(slr1790)中插入了转座子标记。
实施例4
(推定蛋白质slr1790的基因破坏株的制备)
为了确认slr1790基因(集胞藻属基因组256698-257279的600bp)是否编码原卟啉原氧化酶，使用在slr1790的编码区插入了卡那霉素抗性基因的重组载体，对集胞藻属PCC6803的slr1790基因进行基因破坏。由于蓝藻的转化是通过同源重组进行的，以slr1790基因上游的700bp和下游600bp的序列(集胞藻属基因组255999-257920的1.9kbp)为基础设计引物。以从集胞藻属PCC6803中提取的DNA作为模板，通过使用引物Slr1790km EcoR1 f(序列号8)和引物Slr1790km Hind3r(序列号9)和TaKaRa EX Taq聚合酶(Takara公司制)的PCR，扩增含有slr1790基因上游的700bp和下游600bp的序列的序列，获得了PCR产物。PCR，进行28个变性(98℃、10秒)、退火(55℃、30秒)、延伸(72℃、120秒)的循环。将获得的PCR产物连结到pGEM-T Easy载体(Promega公司制)中。
通过热激法将连结了含有slr1790基因的序列的载体转化到大肠杆菌(JM109)，用含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行选择。在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养出现的菌落，从其培养物中纯化质粒(pslr1790S)。然后，以包含于转座子标记中的卡那霉素抗性基因(1.3kbp)为模板，通过使用具有Nhe1位点的引物Km Nhe1 f(序列号10)和引物Km Nhe1r(序列号11)以及TaKaRa EX Taq聚合酶(Takara公司制)的PCR，扩增含有卡那霉素抗性基因的PCR产物。PCR，进行28个变性(98℃、10秒)、退火(58℃、30秒)、延伸(72℃、80秒)的循环。用Nhe1切断获得的PCR产物，将其连结于载体中的slr1790基因中游的Nhe1位点。将其通过热激法转化到大肠杆菌(JM109)，用含有卡那霉素的LB琼脂培养基进行选择。在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养出现的菌落，从其培养物中纯化质粒(pslr1790SKM)。slr1790基因破坏用的这种构建体示于图3。用该pslr1790SKM转化集胞藻属PCC6803，在含有卡那霉素的BG11琼脂培养基中培养该转化体，选择slr1790基因破坏株。集胞藻属PCC6803的转化方法按照文献[Williams JG.MethodsEnzymol(1998)167：pp766]的方法进行。
实施例5
(推定蛋白质slr1790的基因破坏株的分析)
原卟啉原氧化酶被破坏时，预测作为底物的原卟啉原IX积累，但由于原卟啉原IX非常不稳定，因此在提取过程中与空气中的氧反应而容易氧化成原卟啉IX，因而通过测定在空气中进行提取操作后的原卟啉IX量，可以判定原卟啉原氧化酶是否被破坏。对于slr1790基因破坏株的原卟啉IX量的测定按照下述方法进行。
用试管，在白色荧光灯的连续光照射(光强度30μmol s-1m-2)下，在50ml通气的BG11液体培养基中于30℃培养实施例4中获得的slr1790基因破坏株1周，获得培养液。用90％丙酮从获得的培养液中提取含有原卟啉IX的色素，获得色素提取液。将该色素提取液置于HPLC，在1.2ml/分的流速、柱加热器40℃的条件下，使用辛基硅柱(Waters Symmetry C8(150×4.6mm))和甲醇(洗脱剂)进行HPLC分析(泵LC-10ATVP和自动采样器SIL-10ADVP由(株)岛津制作所社制)。在激发波长405nm，荧光波长633nm下进行原卟啉IX的监控(荧光检测器RF-10AXL由(株)岛津制作所社制)。其结果示于图4的C)中。而且，使用不进行slr1790基因破坏的集胞藻属PCC6803代替该基因的破坏株，进行同样的分析，结果示于图4的B)中。而且，原卟啉IX的试样的色谱图示于图4的A)中。
根据图4的结果，与没进行该基因破坏的株相比，在slr1790基因破坏株中发现了20倍以上的原卟啉IX的积累。如果将这种情况与蓝藻的原卟啉原IX或原卟啉IX的代谢相关的酶中，没有鉴定的酶只是原卟啉原氧化酶的情况综合考虑，那么就清楚了slr1790编码原卟啉原氧化酶。slr1790与已知的原卟啉原氧化酶的同源性极低。已知的原卟啉原氧化酶与slr1790的氨基酸水平的同源性示于下表3。
表3
已知的原卟啉原氧化酶   与slr1790的同源性(％)
 烟草PPX1(Genbank登录号Y13465)   12.2
 烟草PPX2(Genbank登录号Y13466)   12.5
 拟南芥的PP0X(Genbank登录号D83139)   12.5
 枯草杆菌的HemY(Genbank登录号M97208)   13.4
 小鼠的PPX(Genbank登录号D45185)   13.6
 人的PPX(Genbank登录号D38537)   13.6
 酿酒酵母的PPX(Genbank登录号Z71381)   11.9
 大肠杆菌的hemG(Genbank登录号X68660)   14.9
实施例6
(蓝藻原卟啉原氧化酶slr1790向集胞藻属的导入)
使用pBI121作为植物用表达载体。pBI121的概略图示于图5中。植物的原卟啉原氧化酶是存在于叶绿体和线粒体中的酶，这次为了使slr1790在叶绿体中表达，将拟南芥来源的叶绿素a加氧酶(CAO，Genbank登录号BT002075)的叶绿体移行信号连结到slr1790基因，进行导入。利用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)进行移行信号的预测。具体用以下步骤进行。
对pBI121载体(14.8kbp)使用限制性内切酶BamH1和Sac1除去GUS基因(1.9kbp)，通过用凝胶回收残留的载体部分(12.9kbp)进行纯化。而且，以实施例1获得的拟南芥cDNA作为模板，使用分别具有限制性内切酶BamH1、Sac1识别位点的引物BamSma CAO fr.(序列号12)和Sac CAO rev.(序列号13)和KOD-Plus-聚合酶(TOYOBO公司制)以PCR扩增了CAO来源的叶绿体移行信号(0.2kbp)。PCR，进行30个变性(94℃、15秒)、退火(55℃、30秒)、延伸(68℃、15秒)的循环。
将这样获得PCR产物连结到具有氨苄青霉素抗性的pTA2载体(TOYOBO公司制，KOD-Plus-用TA克隆载体，2.9kbp)后，通过热激法转化到大肠杆菌(JM109)，用含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行选择。在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养出现的菌落，纯化质粒(pTACAO)。用限制性内切酶BamH1和Sac1切断质粒pTACAO，切出CAO来源的叶绿体移行信号，通过凝胶回收进行纯化。以这种纯化的CAO来源的叶绿体移行信号作为插入物，与预先除去GUS基因的pBI121载体连结。用热激法将其转化到大肠杆菌(JM109)后，用含有卡那霉素的LB琼脂培养基进行选择。在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养出现的菌落，纯化质粒(pBICAO，13.1kbp)。用限制性内切酶Sac1切断pBICAO，为了防止自我连结，进行CIP处理后，通过凝胶回收纯化载体片段。
然后，以从集胞藻属中提取的基因组作为模板，使用具有限制性内切酶Sac1识别位点的引物Sac slr1790 fr.(序列号14)和Sac slr1790rev.(序列号15)和KOD-Plus-聚合酶(TOYOBO公司制)以PCR扩增了slr1790基因(0.6kbp)。PCR，进行30个变性(94℃、15秒)、退火(55℃、30秒)、延伸(68℃、35秒)的循环。将这样获得的PCR产物连结到具有氨苄青霉素抗性的pTA2载体后，通过热激法转化到大肠杆菌(JM109)，用含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行选择。在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养出现的菌落，纯化质粒(pTAslr1790Sac)。用限制性内切酶Sac1切断质粒pTAslr1790Sac，切出slr1790基因，通过凝胶回收进行纯化。以这种纯化的slr1790基因作为插入物，与预先通过限制性内切酶Sac1切断的pBICAO连结。用热激法将其转化到大肠杆菌(JM109)后，用含有卡那霉素的LB琼脂培养基进行选择。在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养出现的菌落，纯化质粒(pBIslr1790，13.6kbp)。pBIslr1790的概略图示于图6。
接着，通过冷冻法，使用导入了pBIslr1790的根瘤农杆菌C58株，通过in planta法转化拟南芥。
首先，将其悬浮于300ml转化缓冲液(5％蔗糖，0.02％SilwetL-77)中，使得带有pBIslr1790的根瘤农杆菌C58株的菌体浓度为OD600＝0.8～1.0附近。然后，将带有芽的罐植的拟南芥的地上部分浸渍于前述悬浮液中30秒，然后，用乙烯袋覆盖各罐2天。取下覆盖物后，再继续培养，获得种子。在玻璃房(24h光照，温度22℃，光强度70μmols-1m-2)中进行栽培。对获得的种子进行杀菌，播种于含有35ppm的卡那霉素、0.6％的琼脂的1/2浓度的Murashige-Skoog的培养基[T.Murashige andF.Skoog Physiol.Plant(1962)15：pp473]中，获得转化体(slr系)。将该转化体移植到土中，在玻璃房中栽培，获得第二代的种子。
实施例7
(转化体的对三氟羧草醚的抗性效果)
对三氟羧草醚的抗性效果是在转化体第二代中，对可以确认基因导入者研究对三氟羧草醚的抗性。
通过以下方法确认基因导入的有无。
从玻璃房内生长到草的高度为1～2cm左右的转化拟南芥slr系，直径2mm左右的各个转化体中回收叶，提取基因组DNA。将该基因组DNA作为模板，使用与导入的基因的N末端和C末端退火的引物AtCAO-tra-up(序列号16)和Sac slr1790rev.(序列号15)和Taq DNA聚合酶(SIGMA公司制)通过PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确认条带的有无。PCR，进行40个变性(95℃、30秒)、退火(55℃、45秒)、延伸(72℃、60秒)的循环。
对于可以确认基因导入的转化体，研究了其对三氟羧草醚的抗性效果。三氟羧草醚通过混合并溶解二甲基甲酰胺和聚氧乙烯山梨糖醇酐系表面活性剂，制成有效成分为4％的乳剂。将其用水稀释成三氟羧草醚的终浓度为10μM，用微量移液管向玻璃房内生长到草的高度为1～2cm左右的拟南芥野生株和确认了基因导入的转化拟南芥slr系的叶面分别滴下5μl。
持续研究直至药液处理7天后，通过目测评价坏死的程度(0～5六个等级评价，0表示没影响)。处理7天后的结果示于表4。其结果是，与拟南芥野生株相比，可以确认导入slr1790的拟南芥对三氟羧草醚的抗性。
[表4]
表4导入slr1790的拟南芥对三氟羧草醚的抗性效果(处理7天后)
通过目测以5表示完全枯死、0表示没有影响的0-5的6个等级进行评价。
实施例8
(原卟啉原氧化酶抑制剂的抑制能力试验)
使用实施例1获得的AT株和通过实施例4的方法破坏了AT株的slr1790基因的ATΔslr1790株。培养基使用前述的BG11液体培养基，为了抑制基因缺失和回复突变，由于在AT株中导入原卟啉原氧化酶的同时也导入氯霉素抗性基因，因此添加氯霉素至终浓度为25μg/ml，由于ATΔslr1790株在其基因破坏时导入卡那霉素抗性基因，因此添加卡那霉素至终浓度为25μg/ml。收集在BG11液体培养基中进行振荡前培养的增殖期的AT株、ATΔslr1790株，悬浮于添加了抗生素的新的BG11液体培养基中，使A730达到0.1，然后用于研究。
被验化合物的原药溶解于DMSO中，添加到各孔中，使最终药剂处理浓度为1.0×10-4M-1.0×10-9.5M(最终DMSO浓度为0.5％)。试验以96孔板每孔中100μl的规模实施，培养温度30℃，光强度1000lux的条件下振荡培养。试验开始6天后，测定浊度，与溶剂处理区进行比较，计算pI50值。
pI50值＝-log(50％活性抑制处理浓度(M))
(除草处理活性)
在200cm2的罐中填充土壤，在表层播下苋的种子，轻轻铺上土后，使之在温室中生长至草长为5～10cm。用小型喷雾器在苋的茎叶部位以1000升/ha撒播量撒播各被验化合物的水稀释液直至规定的药量。使之在室温下生长，处理两周后按照下述研究标准研究苋的除草效果，以杀草指数来表示。结果示于下表。
[表5]
研究标准
  杀草率   杀草指数
  0％   0
  20～29％   2
  40～49％   4
  60～69％   6
  80～89％   8
  100％   10
※1，3，5，7，9的数值分别表示0与2，2与4，4与6，6与8，8与10的中间值。
[表6]
[表7]
被验化合物
  原卟啉原氧化酶抑制剂三氟羧草醚(二苯基醚系)吡草醚(苯基吡唑系)丙炔氟草胺(二羧酰亚胺系)
  非原卟啉原氧化酶抑制剂敌草快
ATΔslr1790株对作为二苯基醚系型原卟啉原氧化酶抑制剂的三氟羧草醚之外的试剂也显示出感受性，原卟啉原氧化酶抑制剂全部显示出抑制活性。而且，各被验化合物对ATΔslr1790株的pI50值的倾向分别反映各个茎叶处理活性，可以认为对抑制原卟啉原氧化酶活性能力的评价有效。
实施例9
(对原卟啉原氧化酶抑制剂特异的化合物筛选法)
根据上述实施例，原卟啉原氧化酶抑制剂对AT株没有显示出感受性，对ATΔslr1790株显示出感受性。另一方面，对非原卟啉原抑制剂用AT株和ATΔslr1790株两者都显示出同等程度的抑制活性。这样一来，通过比较AT株和ATΔslr1790株对化合物的抑制能力，判断各被验化合物的原卟啉原氧化酶抑制能力。
工业上利用的可能性
由于本发明的原卟啉原氧化酶具有与已知的该酶差异很大的结构，因此可期待在新的原卟啉原氧化酶抑制除草剂的选择中的应用。而且，可预期本发明的原卟啉原氧化酶应用于对原卟啉原氧化酶抑制除草剂具有抗性的光合成植物的育种或对恶劣条件具有抵抗性的植物的育种中。而且，如果按照本发明的基因的分离方法，可以提供即使在其它生物种类的基因数据库中无法发现与已知的蛋白质同源的其它生物种类来源的蛋白质时，也可以分离其它生物种类的基因的有效方法。
序列表
<110>日本曹达株式会社
     国立大学法人北海道大学
<120>具有给予对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因
<130>00F00753
<150>JP2005-278942
<151>2005-09-26
<160>20
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>582
<212>DNA
<213>集胞藻属PCC6803
<400>1
atggcctact actggtttaa agccttccac ttgattggca ttgttgtttg gtttgctgga  60
ttattttatt tagtgcgtct ttttgtctat cacgccgagg cagaccagga gccggaacca  120
gctaaaacta tcctcaaaaa acagtatgag ttgatggaaa agcggcttta caacatcatc  180
actacccccg gcatggtagt tacggtggct atggcgatcg gtctcatttt cacagaaccc  240
gaaattctca aatccggctg gctccacatc aaactcacct ttgtggcgtt actgttgctt  300
taccatttct attgtggtcg ggtgatgaaa aagctagccc agggggaatc ccaatggagt  360
gggcaacagt tccgggcttt aaatgaggca ccgactattt tgctcgtggt gattgtccta  420
ctggcggtgt ttaagaataa tttgcccctg gatgcgacca cttggttaat tgtagctttg  480
gttattgcca tggctgcttc gattcaactc tacgctaaaa aacgtcgccg ggaccaagca  540
ctattaacgg aacagcaaaa agcggcttct gctcagaatt ag                     582
<210>2
<211>193
<212>PRT
<213>集胞藻属PCC6803
<400>2
Met Ala Tyr Tyr Trp Phe Lys Ala Phe His Leu Ile Gly Ile Val Val
1               5                   10                  15
Trp Phe Ala Gly Leu Phe Tyr Leu Val Arg Leu Phe Val Tyr His Ala
            20                  25                  30
Glu Ala Asp Gln Glu Pro Glu Pro Ala Lys Thr Ile Leu Lys Lys Gln
        35                  40                  45
Tyr Glu Leu Met Glu Lys Arg Leu Tyr Asn Ile Ile Thr Thr Pro Gly
    50                  55                  60
Met Val Val Thr Val Ala Met Ala Ile Gly Leu Ile Phe Thr Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Ile Leu Lys Ser Gly Trp Leu His Ile Lys Leu Thr Phe Val Ala
                85                  90                  95
Leu Leu Leu Leu Tyr His Phe Tyr Cys Gly Arg Val Met Lys Lys Leu
            100                 105                 110
Ala Gln Gly Glu Ser Gln Trp Ser Gly Gln Gln Phe Arg Ala Leu Asn
        115                 120                 125
Glu Ala Pro Thr Ile Leu Leu Val Val Ile Val Leu Leu Ala Val Phe
    130                 135                 140
Lys Asn Asn Leu Pro Leu Asp Ala Thr Thr Trp Leu Ile Val Ala Leu
145                 150                 155                 160
Val Ile Ala Met Ala Ala Ser Ile Gln Leu Tyr Ala Lys Lys Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Asp Gln Ala Leu Leu Thr Glu Gln Gln Lys Ala Ala Ser Ala Gln
            180                 185                 190
Asn
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ATHPPOX.Aself
<400>3
ggggattaat ggagttatct cttctccgt             29
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ATHPPOX.r
<400>4
ttacttgtaa gcgtaccgtg                       20
<210>5
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Chloram.r
<400>5
gctaaccgtt tttatcacct ggggggcacc ttatttt    37
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物SPE2Xbal.r
<400>6
tgtttctaga taatcctggt c                     21
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Chloram.Xbal.f
<400>7
ggtctagatg atgtccggcg gtgctttt                           28
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Slr1790km EcoR1 f
<400>8
ggggaattct gcttgcatca atatggtggc                         30
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Slr1790km Hind3r
<400>9
gggaagctta ccctggagat ccactggtt                          29
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Km Nhel f
<400>10
ggggctagcg cgaagaactc cagcatgaga                         30
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Km Nhel r
<400>11
ggggctagca gcttcacgct gccgcaagca ct                      32
<210>12
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物BamSma CAO fr.
<400>12
gaggatcccc gggtggtcag tcccttatga acgccgccgt gtttagtc     48
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Sac CAO rev.
<400>13
ttacttgtaa gcgtaccgtg                                              20
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Sac slr1790fr.
<400>14
ccgagctcgc ctactactgg tttaaagcct tc                                32
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Sac slr1790rev
<400>15
ccgagctcct aattctgagc agaagccgc                                    29
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AtCAO-tra-up
<400>16
aacgccgccg tgtttagtcc                                              20
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KAN-2fr
<400>17
ggcctgttga acaagtctgg aa                                           22
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KAN-2-rev
<400>18
ggcgtttccc gttgaatatg gctc                                         24
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KAN-2F P1
<400>19
acctacaaca aagctctcat caacc    25
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>KAN-2R P1
<400>20
gcaatgtaac atcagagatt ttgag    25

Claims (27)

1. 原卟啉原氧化酶，其特征在于，具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性并且来源于蓝藻。
2. 根据权利要求1记载的原卟啉原氧化酶，其特征在于，所述蓝藻为属于集胞藻属的蓝藻。
3. 根据权利要求1或2记载的原卟啉原氧化酶，其特征在于，所述生物为植物。
4. 下述(a)～(c)任一项所示的蛋白质：
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质；
(b)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质，其特征在于，由序列号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性；
(c)具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质，其特征在于，与序列号2所示的氨基酸序列的同源性为20％以上，并且具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性。
5. 根据权利要求4记载的蛋白质，其特征在于，来源于蓝藻。
6. 编码权利要求1～3中任一项记载的原卟啉原氧化酶或权利要求4或5记载的蛋白质的原卟啉原氧化酶基因DNA。
7. 下述(d)或(e)所示的原卟啉原氧化酶基因DNA：
(d)由序列号1所示的碱基序列构成的原卟啉原氧化酶基因DNA；
(e)原卟啉原氧化酶基因DNA，由序列号1所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个碱基的碱基序列构成，并且编码具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。
8. 原卟啉原氧化酶基因DNA，在严谨条件下与由与序列号1所示的碱基序列互补的序列构成的DNA杂交，并且编码具有给予生物对三氟羧草醚的抗性的活性且具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质。
9. 根据权利要求7或8任一项记载的原卟啉原氧化酶基因DNA，其特征在于，具有原卟啉原氧化酶活性的蛋白质来源于蓝藻。
10. 组入了权利要求6～9中任一项记载的原卟啉原氧化酶基因DNA的重组载体。
11. 转化体，其特征在于，导入了权利要求10记载的重组载体。
12. 根据权利要求11记载的转化体，其特征在于，具有对三氟羧草醚的抗性。
13. 根据权利要求11或12记载的转化体，其特征在于，所述转化体为微生物。
14. 根据权利要求11或12记载的转化体，其特征在于，所述转化体为植物。
15. 根据权利要求14记载的转化体，其特征在于，光合成能力提高了。
16. 评价原卟啉原氧化酶抑制活性能力的方法，其特征在于，使用权利要求11～15中任一项记载的转化体。
17. 筛选原卟啉原氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，使用权利要求11～16中任一项记载的转化体。
18. 包括以下(f)～(j)工序的蓝藻的原卟啉原氧化酶基因的分离方法：(f)在蓝藻中导入拟南芥的原卟啉原氧化酶基因的工序；
(g)使用转座子破坏蓝藻的基因的工序；
(h)选择原卟啉原氧化酶基因被破坏的菌株的工序；
(i)确定被破坏的原卟啉原氧化酶基因的工序；
(j)分离被破坏的原卟啉原氧化酶基因的工序。
19. 权利要求4或5记载的蛋白质作为原卟啉原氧化酶的使用方法。
20. 人为地使权利要求4或5记载的蛋白质与原卟啉原IX接触转换成原卟啉IX的方法。
21. 权利要求6～9中任一项记载的DNA作为原卟啉原氧化酶基因的使用方法。
22. 人为地使权利要求6～9中任一项记载的DNA表达，使其表达产物与原卟啉原IX接触转换成原卟啉IX的方法。
23. 包括以下的1)～5)工序的分离特定生物中编码具有规定功能的蛋白质的基因的方法：
1)在特定生物中导入来源于特定生物以外的其它生物的编码互补规定功能的蛋白质的基因来制备转化体的工序；
2)随机破坏转化体的基因来制备转化体的变异株的工序；
3)通过使用作用于互补规定功能的蛋白质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂，或者改变培养条件，从而选择编码具有规定功能的蛋白质的基因被破坏的变异株的工序；
4)确定被破坏的编码具有规定功能的蛋白质的基因的工序；
5)分离被破坏的编码具有规定功能的蛋白质的基因的工序。
24. 根据权利要求23记载的基因的分离方法，其特征在于，变异处理为使用转座子的变异处理。
25. 根据权利要求23或24记载的基因的分离方法，其特征在于，所述来源于特定生物以外的其它生物的互补规定功能的蛋白质为拟南芥的原卟啉原氧化酶。
26. 根据权利要求25记载的基因的分离方法，其特征在于，所述作用于互补规定功能的蛋白质而不作用于具有规定功能的蛋白质的药剂为三氟羧草醚。
27. 根据权利要求25或26记载的基因的分离方法，其特征在于，特定生物中的具有规定功能的蛋白质为蓝藻的原卟啉原氧化酶。
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