JPH11346787A - プロトポルフィリノ―ゲンオキシダ―ゼ活性阻害能評価方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼ活性阻害能を評価するための簡便な方法を提供するこ
と。 【解決手段】化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシ
ダーゼ活性阻害能を評価する方法であって、（１）プロ
トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能
の欠損した宿主細胞に、宿主細胞内で機能可能なプロモ
ーター、およびプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
遺伝子が機能可能な形で結合されてなるＤＮＡ断片が導
入されてなり、前記ＤＮＡ断片に在するプロトポルフィ
リノーゲンオキシダーゼ遺伝子を発現する形質転換体
を、被験化合物の存在下または非存在下に、プロトポル
フィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損
を補完する化合物を実質的に含まない培地で培養して各
条件下における該形質転換体の増殖度を測定する工程、
（２）該増殖度の差異に基づき被験化合物の接触による
前記形質転換体の増殖阻害度を求め、被験化合物のプロ
トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性阻害能を判定す
る工程、を含むことを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、化合物のプロトポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼ活性阻害能評価方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】植物、
動物、および微生物は５-アミノレブリン酸を初発とす
るポルフィリン生合成系を持ち、ヘム生合成等の前駆物
質であるプロトポルフィリンを生産する。このポルフィ
リン生合成系の最後の段階であるプロトポルフィリノー
ゲンを酸化しプロトポルフィリンを生成する反応を触媒
する酵素が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
（protoporphyrinogen IX oxidase；EC 1.3.3.4）（以
下、ＰＰＯと記す。）である（R. J. Porra, and J. E.
Falk、（1964年）Biochem.J. 90巻、69-75頁）。ＰＰ
Ｏ活性は、植物、動物、および微生物の生育に影響を及
ぼし、例えば、一般に植物ＰＰＯ活性を阻害する化合物
が除草活性を有することが知られている。そこで、ＰＰ
Ｏ阻害型の除草剤を効率よく開発するうえで、化合物の
ＰＰＯ活性阻害能を評価するための簡便な方法が切望さ
れていた。

【０００３】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、ＰＰＯ活性に基づく増
殖能が欠損した宿主細胞に所望のＰＰＯ遺伝子を発現さ
せた形質転換体を用い、化合物による該形質転換体の増
殖阻害度を調べることにより、化合物のＰＰＯ活性阻害
能を評価することが可能であることを見出し、本発明に
至った。即ち、本発明は、 １）化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活
性阻害能を評価する方法であって、（１）プロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損し
た宿主細胞に、宿主細胞内で機能可能なプロモーター、
およびプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が
機能可能な形で結合されてなるＤＮＡ断片が導入されて
なり、前記ＤＮＡ断片に在するプロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ遺伝子を発現する形質転換体を、被験化
合物の存在下または非存在下に、プロトポルフィリノー
ゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損を補完する
化合物を実質的に含まない培地で培養して各条件下にお
ける該形質転換体の増殖度を測定する工程、（２）該増
殖度の差異に基づき被験化合物の接触による前記形質転
換体の増殖阻害度を求め、被験化合物のプロトポルフィ
リノーゲンオキシダーゼ活性阻害能を判定する工程、を
含むことを特徴とする方法。 ２）化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活
性阻害能を評価する方法であって、（１）プロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損し
た宿主細胞に、宿主細胞内で機能可能なプロモーター、
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子、および
宿主細胞内で機能可能なターミネーターが機能可能な形
で結合されてなるＤＮＡ断片が導入されてなり、前記Ｄ
ＮＡ断片に在するプロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼ遺伝子を発現する形質転換体を、被験化合物の存在下
または非存在下に、プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ活性に基づく増殖能の欠損を補完する化合物を実質
的に含まない培地で培養して各条件下における該形質転
換体の増殖度を測定する工程、（２）該増殖度の差異に
基づき被験化合物の接触による前記形質転換体の増殖阻
害度を求め、被験化合物のプロトポルフィリノーゲンオ
キシダーゼ活性阻害能を判定する工程、を含むことを特
徴とする方法、 ３）化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活
性阻害能を評価する方法であって、（１）プロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損し
た宿主細胞に、（ａ）宿主細胞内で機能可能でありかつ
転写活性が制御されうるプロモーター、およびプロトポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が機能可能な形で
結合されてなるＤＮＡ断片、および（ｂ）該ＤＮＡ断片
のプロモーターの転写活性を制御可能な遺伝子、および
該遺伝子により転写活性を制御されずかつ宿主細胞内で
機能可能なプロモーターが機能可能な形で結合されてな
るＤＮＡ断片が導入されてなり、（ａ）のＤＮＡ断片に
在するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を
発現する形質転換体を、被験化合物の存在下または非存
在下に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に
基づく増殖能の欠損を補完する化合物を実質的に含まな
い培地で培養して各条件下における該形質転換体の増殖
度を測定する工程、（２）該増殖度の差異に基づき被験
化合物の接触による前記形質転換体の増殖阻害度を求
め、被験化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼ活性阻害能を判定する工程、を含むことを特徴とする
方法、 ４）化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活
性阻害能を評価する方法であって、（１）プロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損し
た宿主細胞に、（ａ）宿主細胞内で機能可能でありかつ
転写活性が制御されうるプロモーター、プロトポルフィ
リノーゲンオキシダーゼ遺伝子、および宿主細胞内で機
能可能なターミネーターが機能可能な形で結合されてな
るＤＮＡ断片、および（ｂ）該ＤＮＡ断片のプロモータ
ーの転写活性を制御可能な遺伝子、該遺伝子により転写
活性を制御されずかつ宿主細胞内で機能可能なプロモー
ターおよび宿主細胞内で機能可能なターミネーターが機
能可能な形で結合されてなるＤＮＡ断片が導入されてな
り、（ａ）のＤＮＡ断片に在するプロトポルフィリノー
ゲンオキシダーゼ遺伝子を発現する形質転換体を、被験
化合物の存在下または非存在下に、プロトポルフィリノ
ーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損を補完す
る化合物を実質的に含まない培地で培養して各条件下に
おける該形質転換体の増殖度を測定する工程、（２）該
増殖度の差異に基づき被験化合物の接触による前記形質
転換体の増殖阻害度を求め、被験化合物のプロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ活性阻害能を判定する工程、
を含むことを特徴とする方法 前記方法に関するＰＰＯ遺伝子、該遺伝子の部分塩基配
列を有するＤＮＡ断片、該遺伝子を含有するベクター、
該ベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体を提
供するものである。

【０００４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。

【０００５】まず、本発明のＰＰＯ活性阻害能評価方法
について説明する。本発明の評価方法において使用され
るＰＰＯ遺伝子は、宿主細胞内で発現した際にＰＰＯ活
性を有するタンパク質をコードする遺伝子であればよ
く、例えば、植物または動物に由来するＰＰＯ遺伝子か
ら選ぶことができる。具体的には、例えば、シロイヌナ
ズナ、ダイズ、アブラナ、テンサイ、ジャガイモ、タバ
コなどの双子葉類植物、トウモロコシ、イネ、コムギ、
オオムギ、エンバク、ライムギ、サトウキビ、ソルガム
などの単子葉類植物、コナミドリムシ、クロレラなどの
藻類植物、マウス、ラット、ヒトなどの哺乳類動物、ニ
ジマス、ブルーギル、コイ、メダカ、グッピー、ゼブラ
フィッシュ、ファットヘッドミノーなどの魚類動物、ハ
エ、カ、ゴキブリ、テントウムシ、トンボ、カイコガな
どの昆虫類動物等に由来するＰＰＯ遺伝子をあげること
ができる。本発明の評価方法において使用される「宿主
細胞内で機能可能なプロモーター」とは、形質転換され
る宿主細胞内で転写活性を示すDNA断片であって、例え
ば、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lac
P）、トリプトファンオペロンのプロモーター（trp
P）、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラ
クトースオペロンのプロモーター（galP）、tacプロモ
ーター、T7プロモーター、T3プロモーター、λファージ
のプロモーター（λ-pL、λ-pR）、酵母のアルコールデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH）プロモーター、アデノウ
イルス・メジャーレート（Ad.ML）プロモーター、SV40
の初期プロモーター、バキュロウイルスプロモーター、
ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）プロモーター、オクト
ピン合成酵素遺伝子（OCT）プロモーター、カリフラワ
ーモザイクウイルス(CaMV）由来の19Sおよび35Sプロモ
ーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL）
遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（CHS）遺伝
子プロモーター等をあげることができる。また、本発明
の評価方法において必要に応じて使用される「宿主細胞
内で機能可能なターミネーター」としては、形質転換さ
れる宿主細胞内で転写終結活性を示すDNA断片であれば
よい。例えば、大腸菌のラクトースオペロンのターミネ
ーター、アルギニンオペロンのターミネーター、ガラク
トースオペロンのターミネーター、酵母のHIS ターミネ
ーター、ADH1ターミネーター、SV40のearly splicing r
egion、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）ターミネータ
ー、ニンニクウイルスGV1、GV2のターミネーターなどを
あげることができる。ここで、「機能可能な形で結合さ
れてなるＤＮＡ断片」とは、前記ＰＰＯ遺伝子が、導入
される宿主細胞において前記プロモーター、必要に応じ
て使用されるターミネーター、の制御下に発現するよう
に、これらのプロモーターおよびターミネーターと結合
された状態にあるＤＮＡ断片（以下、発現ＤＮＡ断片と
記す。）を意味する。

【０００６】かかる発現ＤＮＡ断片を、ＰＰＯ活性に基
づく増殖能の欠損した宿主細胞に導入して、導入したＰ
ＰＯ遺伝子を発現する形質転換体を取得する。形質転換
される宿主細胞としては、増殖に必要なＰＰＯ活性の欠
損した宿主細胞であればよく、簡便に培養できる点で微
生物が好ましい。増殖に必要なＰＰＯ活性の欠損した微
生物として、例えば、K.Miyamoto、K.Nakahigashi、K.N
ishimura、T.Nakayashiki、H.Inokuchi、（1991年）Jou
rnal of Molecular Biology 、219巻、393-398頁、及
び、 K.Nishimura、T.Nakayashiki、H.Inokuchi、（199
3年）Gene、133巻、109-113頁等に記載されているＰＰ
Ｏ遺伝子（hemG遺伝子座）欠損突然変異系統大腸菌VSR7
51株、あるいは、F.Yamamoto、H.Inokuchi、H.Ozeki、
（1988年）Jpn.J.Genet.、63巻、237-249項等に記載さ
れているＰＰＯ遺伝子（hemG遺伝子座）欠損突然変異系
統大腸菌BT3株、J.-M.Camadro、D.Urban-Grimal、 and
P. Labbe (1982) Biochem.Biophys.Res.Commun.、106
巻、724-730頁等に記載されているＰＰＯ遺伝子（hem14
-1遺伝子座）突然変異系統酵母hem14-1株等をあげるこ
とができる。ここで、前記の発現ＤＮＡ断片は、ベクタ
ーに組み込んで宿主細胞に導入するとよい。該発現ＤＮ
Ａ断片を含むベクターは公知の手段に準じて宿主細胞に
導入することができる。例えば、宿主細胞が微生物の場
合、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法（Me
thods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulse
r System, Bio-Rad Laboratories, 1993年)等により上
記ベクターを微生物細胞内に導入することができる。ま
た、宿主細胞が植物の場合、アグロバクテリウム感染方
法（特公平2-58917及び特開昭60-70080）、プロトプラ
ストへのエレクトロポレーション方法（特開昭60-25188
7及び特開平5-68575）、又はパーティクルガン方法（特
表平5-508316及び特開昭63-258525）等により上記ベク
ターを植物細胞に導入することができる。導入したＰＰ
Ｏ遺伝子を発現する形質転換体は、上記ベクターを導入
した宿主細胞を、該ベクターに座上・連結させた選抜マ
ーカーに対応する増殖阻害剤を含み、ＰＰＯ活性に基づ
く増殖能の欠損を補完する化合物を実質的に含まない培
地で培養し、該培地において増殖可能なクローンを単離
することにより、取得することができる。

【０００７】上記のようにして得られる形質転換体を、
まず、種々の濃度の被験化合物の存在下または非存在下
に、ＰＰＯ活性に基づく増殖能の欠損を補完する化合物
を実質的に含まない培地中で培養し、各々の条件下にお
ける該形質転換体の増殖度を測定する。次に、各条件で
の被験化合物との接触による該形質転換体の増殖度の差
異に基づき、被験化合物による前記形質転換体の増殖阻
害度を求める。例えば、被験化合物の非存在下での増殖
度に対する被験化合物の存在下での増殖度の比率（％）
を算出し、この値を１００（％）から差し引くことによ
って、増殖阻害度（％）が求められる。このようにして
求められる増殖阻害度を、複数の被験化合物について比
較することにより、ＰＰＯ活性阻害能の高低が判定され
る。より具体的には、例えば、化合物を添加しない系に
おける上記形質転換体の増殖度を１００％として、該形
質転換体の増殖度を５０％阻害する化合物濃度を求め
る。該濃度が低い化合物は、それが高い化合物よりもＰ
ＰＯ活性阻害能が高いと判定することができる。また、
例えば、ＰＰＯ活性を阻害することが既に知られている
化合物（陽性対照）を、被験化合物の１つとして同時に
試験に付することにより、各被験化合物の増殖阻害度の
指標とすることもできる。ここで、「ＰＰＯ活性に基づ
く増殖能の欠損を補完する化合物」とは、宿主細胞のＰ
ＰＯ活性に基づく増殖能の欠損を補完することのできる
化合物であって、例えば、プロトヘムやヘミンをあげる
ことができ、該化合物をある程度以上含む培地において
は、ＰＰＯ活性に基づく増殖能の欠損した宿主細胞が増
殖可能となる。また、「ＰＰＯ活性に基づく増殖能の欠
損を補完する化合物を実質的に含まない培地」とは、Ｐ
ＰＯ活性に基づく増殖能の欠損を補完する化合物を全く
含まないか、または、ＰＰＯ活性に基づく増殖能の欠損
した宿主細胞を、該増殖能を欠損していないこと以外は
前記細胞と遺伝的に同等の宿主細胞と同レベルにまで増
殖させることができる程には前記化合物を含まない培地
を意味する。かかる培地としては、例えば、ヘミンのよ
うなＰＰＯ活性に基づく増殖能の欠損を補完する化合物
を全く含まない人工培地や、通常の濃度の天然抽出物
（例えば、YeastextractやMalt extract等）を含むもの
の、ＰＰＯ活性に基づく増殖能の欠損を補完する化合物
が添加されていない培地等を挙げることが出来る。本発
明方法の精度の面から、ＰＰＯ活性に基づく増殖能の欠
損を補完する化合物が培地に含まれる量は出来るだけ少
ないことが好ましい。尚、ここで、被験化合物による増
殖阻害がＰＰＯ活性阻害によるものであることは、前記
形質転換体の培養を、例えばヘミンのようなＰＰＯ活性
に基づく増殖能の欠損を補完する化合物を実質的に含む
培地で行うことにより確認できる。

【０００８】本発明の評価方法において、さらに、前記
発現ＤＮＡ断片のプロモーターに「宿主細胞で機能可能
でありかつ転写活性が制御されうるプロモーター」を用
い、「該発現ＤＮＡ断片のプロモーターの転写活性を制
御可能な遺伝子、および該遺伝子により転写活性を制御
されずかつ宿主細胞内で機能可能なプロモーター、なら
びに必要に応じて宿主細胞内で機能可能なターミネータ
ーが機能可能な形で結合されてなるＤＮＡ断片」（以
下、調節ＤＮＡ断片と記す。）を、前記宿主細胞に導入
することにより、形質転換体におけるＰＰＯ遺伝子の発
現量を変化させることができ、被験化合物のＰＰＯ活性
阻害能を、より少量の化合物でしかもより精度よく評価
することが可能となる。即ち、形質転換体におけるＰＰ
Ｏ遺伝子の発現量を少なくなるように調節することによ
り、低濃度の被験化合物でも精度よくＰＰＯ活性阻害能
を評価でき、例えば、水溶性の低い被験化合物の評価も
可能になると共に、極めて少量の被験化合物の評価も可
能となる。また、ＰＰＯ活性阻害能が著しく高く、有効
希釈倍率に達しても過度に高いＰＰＯ活性阻害を呈する
被験化合物の場合には、形質転換体におけるＰＰＯ遺伝
子の発現量を増加させるように調節することにより、該
被験化合物のＰＰＯ活性阻害能を精度よく評価すること
も可能となる。ここで、「発現ＤＮＡ断片のプロモータ
ーの転写活性を制御可能な遺伝子」とは、発現ＤＮＡ断
片の「転写活性が制御されうるプロモーター」の転写活
性を抑制または亢進する機能を持つ遺伝子を意味する。
ＰＰＯ遺伝子の発現量を少なくする場合は、上記発現Ｄ
ＮＡ断片のプロモーターの転写活性を抑制する遺伝子を
用い、ＰＰＯ遺伝子の発現量を増やす場合は、該プロモ
ーターの転写活性を亢進する遺伝子を用いればよい。具
体的には、転写活性を抑制する組み合わせとしては、大
腸菌のラクトースオペロンのプロモーターとlacI 、ア
ルギニンオペロンのプロモーターとargR 、ガラクトー
スオペロンのプロモーターとGalRの組み合わせ等が、逆
に転写活性を亢進する組み合わせとしては、大腸菌のラ
クトースオペロンのプロモーターとcrp 、肺炎桿菌のマ
ルトースレギュロンとmalTの組み合わせ等があげられ
る。また、上記調節ＤＮＡ断片のプロモーターは、自身
が制御する遺伝子に影響されないプロモーターであれば
よい。例えば、前記のラクトースオペロンのリプレッサ
ー遺伝子に組み合わせるプロモーターにはラクトースオ
ペロンのプロモーターやノパリン合成酵素遺伝子（NO
S）プロモーター等を利用することができる。上記発現
ＤＮＡ断片および調節ＤＮＡ断片は、同一または異なる
ベクターに組み込んで宿主細胞に導入することができ、
これらのＤＮＡ断片は、宿主細胞の染色体に組み込まれ
ていてもよい。

【０００９】本発明の評価方法は、ＰＰＯ活性阻害能に
基づく化合物の生理活性の評価に利用することができ、
例えば、光要求型除草剤の効力評価、または除草活性を
有する化合物のスクリーニング等に利用できる他、悪性
細胞の増殖阻害能を有する医薬品等のスクリーニングに
も利用し得る。本発明の評価方法を光要求型除草剤の効
力評価または除草活性を有する化合物のスクリーニング
手段として利用する場合は、例えば、シロイヌナズナ等
の高等植物由来のＰＰＯ遺伝子、コナミドリムシ等の藻
類由来のＰＰＯ遺伝子等を用いて、本発明のＰＰＯ活性
阻害能評価方法を実施する。その結果、高等植物や藻類
等由来のＰＰＯ遺伝子を導入した形質転換体の生育を阻
害する化合物は、除草剤有効成分として有用である可能
性が示される。

【００１０】次に、本発明のＰＰＯ活性阻害能評価方法
に使用され得る遺伝子についてより詳細に説明する。例
えば、「ＰＰＯ活性を有するタンパク質をコードするラ
ット由来の遺伝子」（以下、本発明ラットＰＰＯ遺伝子
と記す。）は、ラットから得られる約1.64 kbpの長さを
有する遺伝子であり、具体的には例えば、配列番号１で
示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする
ＰＰＯ遺伝子、ＰＰＯ活性を有し、配列番号1で示され
るアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換、修飾もしくは付加されたアミノ酸配列からな
るタンパク質をコードする遺伝子があげられる。より具
体的には例えば、配列番号2で示される塩基配列を有す
るＰＰＯ遺伝子等を挙げることができる。また、例え
ば、「ＰＰＯ活性を有するタンパク質をコードするコナ
ミドリムシ由来の遺伝子」（以下、本発明コナミドリム
シＰＰＯ遺伝子と記す。）は、コナミドリムシから得ら
れる約2kbpの長さを有する遺伝子であり、具体的には例
えば、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするＰＰＯ遺伝子、ＰＰＯ活性を有し、
配列番号9で示されるアミノ酸配列において1もしくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、修飾もしくは付加されたア
ミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子があ
げられる。より具体的には例えば、配列番号10で示され
る塩基配列を有するＰＰＯ遺伝子等を挙げることができ
る。

【００１１】本発明ラットＰＰＯ遺伝子は、ラットから
例えば下記の方法により得られる。例えば、ラットの肝
臓、腎臓等の組織を採取し、採取した組織から、例え
ば、増補版ラボマニュアル遺伝子工学（村松編、丸善株
式会社1990年）76-77頁等に記載されている方法に準じ
て操作を行うことにより、RNAを抽出する。該抽出操作
には、市販のRNA抽出キット、具体的には例えば、ISOGE
N（日本ジーン社）等を利用しても良い。得られたRNAか
ら、例えば、市販のpoly(A)RNA分画キット、具体的には
例えば、 BIOMAG mRNA Purification kit（パーセプテ
ィブバイオシステム社）等を用い付属のマニュアルに準
じて操作を行いpoly(A)RNAを調製する。得られたpoly
(A)RNAから、例えば、クローニングとシークエンス：植
物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編、
農村文化社1989年）74-103頁等に記載されている方法に
準じて操作を行いcDNAライブラリーを作製する。このcD
NAライブラリー作製操作には、市販のcDNAライブラリー
作製キット、具体的には例えば、ZAP-cDNA Gigapack Cl
oning Kit（STRATAGENE社）等を利用しても良い。この
ようにして作製したcDNAライブラリー、または、市販の
cDNAライブラリー、具体的には例えば、STRATAGENE社の
ラット肝臓由来のcDNAライブラリー等から、Molecular
Cloning 2nd edition ( J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Ma
niatis 著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 198
9年)2.60-2.81頁等に記載されている方法によりDNAを調
製することができる。このように調製されたDNAを鋳型
に、例えば、配列番号3および4で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラ
ーゼチェイン反応を行うことにより、ＰＰＯ遺伝子の部
分塩基配列を有するDNA断片を増幅することができる。
この増幅されたＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列を有するDN
A断片を、増補版ラボマニュアル遺伝子工学（村松編、
丸善株式会社1990年）117-120頁等に記載される通常の
方法、または市販のDNAクローニングキット、例えば、T
A cloning kit（Invitrogen社製）等を用いることによ
りプラスミドにクローニングし、塩基配列の決定に供す
ることができる。塩基配列の決定は、例えば、 Molecul
ar Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.
Maniatis著、ColdSpring Harbor Laboratory Press 198
9年）13.42-13.74等に記載されるダイデオキシ法によっ
て行うことができる。ダイデオキシ法による塩基配列の
決定には、例えば、蛍光ラベルされたダイデオキシヌク
レオチドを用いるシークエンスキット、具体的には例え
ば、Dye terminator cycle sequencing kit（PEアプラ
イドバイオシステムズ社製）等を利用し、市販のオート
シークエンサー、例えば、DNAシークエンサー373S（PE
アプライドバイオシステムズ社製）等を用いることがで
きる。この様にしてラットＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を有するＤＮＡ断片（以下、本発明ラットＰＰＯＤＮＡ
断片と記す。）を得ることができる。本発明ラットＰＰ
ＯＤＮＡ断片としては、例えば、配列番号２の塩基番号
639〜1333に示される塩基配列を有する遺伝子断片をあ
げることができる。本発明ラットＰＰＯＤＮＡ断片は、
例えば、後述するポリメラーゼチェイン反応法において
使用されるＰＰＯ遺伝子特異的なプライマーを作製する
際に利用したり、また、後述するハイブリダイゼーショ
ン法においてＰＰＯ遺伝子検出用プローブとして使用す
ることができる。

【００１２】本発明ラットＰＰＯＤＮＡ断片を基に、以
下に示す(１)ポリメラーゼチェイン反応法、または(２)
ハイブリダイゼーション法によりＰＰＯをコードする全
塩基配列を有する本発明ラットＰＰＯ遺伝子を取得する
ことができる。ポリメラーゼチェイン反応法を利用し
て、本発明ラットＰＰＯ遺伝子を取得するには、まず、
本発明ラットＰＰＯＤＮＡ断片の塩基配列中の約15bpか
ら約40bpの塩基配列を有するプライマー（3'下流領域増
幅用プライマー）、および、本発明ラットＰＰＯＤＮＡ
断片の塩基配列に相補的な塩基配列の中の約15bpから約
40bpの塩基配列を有するプライマー（5'上流領域増幅用
プライマー）を作製する。具体的に例えば、3'下流領域
増幅用プライマーとしては配列番号２の塩基番号1175〜
1198に示される塩基配列を有する遺伝子断片等が、5'上
流領域増幅用プライマーとしては配列番号２の塩基番号
776〜799に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有す
る遺伝子断片等が挙げられる。次いで、ラット由来のDN
Aの末端にアダプターDNAが付加されてなるDNA断片また
はラット由来のDNA断片の挿入されたベクターのDNAを鋳
型とし、かつ、アダプターDNAの部分塩基配列を有する
プライマーもしくはベクターDNAの部分塩基配列を有す
るプライマーと5'上流領域増幅用プライマーとの組み合
わせ及びアダプターDNAの部分塩基配列を有するプライ
マーもしくはベクターDNAの部分塩基配列を有するプラ
イマーと3'下流領域増幅用プライマーとの組み合わせを
用いてポリメラーゼチェイン反応を行い、本発明ラット
ＰＰＯＤＮＡ断片の5'上流側の塩基配列を含むDNA断片
及び本発明ラットＰＰＯＤＮＡ断片の3'下流側の塩基配
列を含むDNA断片をポリメラーゼチェイン反応で増幅す
る。ここで鋳型として用いられるラット由来のDNAの末
端にアダプターDNAが付加されてなるDNA断片は、例え
ば、上述のように調製されたラット由来のcDNAにターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼでシト
シン等の塩基のポリマーをアダプターDNAとして付加す
るか、または、市販のＲＡＣＥ（rapid amplification
of cDNA ends）反応用キットのアダプター、具体的には
例えば、Clontech社のMarathon cDNA amplification ki
tに付属のアダプター等をラット由来のcDNAに付加する
ことにより調製することができる。また、アダプターDN
Aの部分塩基配列を有するプライマーとしては、例え
ば、市販のＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA en
ds）反応用キットに付属のアダプターに特異的なプライ
マー、具体的には例えば、Clontech社のMarathon cDNA
amplification kitに付属のAP-1プライマーやAP-2プラ
イマーをあげることができる。ヘ゛クターDNAの部分配列を有
するプライマーとしては、例えばヘ゛クターがλファージに
由来するヘ゛クターである場合、λファージのアーム領域に
特異的なプライマー、具体的には例えば、λgt11リバー
スプライマーやλgt11フォワードプライマー等を用いる
ことができる。このようにして増幅された2種のDNA断片
は、増補版ラボマニュアル遺伝子工学（村松編、丸善株
式会社1990年）117-120頁等に記載される通常の方法、
あるいは市販のDNAクローニングキット、例えば、TA cl
oning kit（Invitrogen社製）等を用いることによりプ
ラスミドにクローニングし、塩基配列の決定に供するこ
とができる。塩基配列の決定は、例えば、Molecular Cl
oning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Mania
tis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
年）13.42-13.74等に記載されるダイデオキシ法によっ
て行うことができる。ダイデオキシ法による塩基配列の
決定には、例えば、蛍光ラベルされたダイデオキシヌク
レオチドを用いるシークエンスキット、具体的には例え
ば、Dye terminator cycle sequencing kit（PEアプラ
イドバイオシステムズ社製）等を利用し、市販のオート
シークエンサー、例えば、DNAシークエンサー373S（PE
アプライドバイオシステムズ社製）等を用いることがで
きる。ここで決定された塩基配列と上述のプライマー作
成の際に参照した本発明ラットＰＰＯＤＮＡ断片の塩基
配列において重複する領域を重ねあわせてこれらの塩基
配列を連結することにより一つの塩基配列を作成する。
作成された塩基配列について遺伝子解析ソフト、例え
ば、GENETYX（SDC社製）等を用いてオープンリーディン
グフレームの検索を行うことにより、該塩基配列にＰＰ
Ｏをコードするオープンリーディングフレームの全領域
が含まれているか検討することができる。決定された塩
基配列に1.6kbp以上のオープンリーディングフレームの
全体が含まれず、翻訳開始コドンまたは翻訳停止コドン
が含まれない場合は、該塩基配列に完全長ＰＰＯ遺伝子
の全塩基配列が含まれていないと判断し、ＰＰＯをコー
ドする全塩基配列を有するＰＰＯ遺伝子が得られるまで
上記のポリメラーゼチェイン反応法による遺伝子断片の
取得工程を繰り返し行う。また、上記のように決定され
た塩基配列に見出されるオープンリーディングフレーム
が、決定された塩基配列の5'上流側または3'下流側のい
ずれかにおいてのみ欠けている場合、すなわち、オープ
ンリーディングフレームに翻訳開始コドンまたは翻訳停
止コドンのいずれかが含まれない場合は、その欠けてい
る側の塩基配列を含むDNA断片の取得について上述と同
様にポリメラーゼチェイン反応法による遺伝子断片の取
得を繰り返せばよい。このようにして決定された塩基配
列の情報をもとに、ＰＰＯ遺伝子の塩基配列の翻訳開始
コドン付近の塩基配列を含むプライマー（N末端プライ
マー）及び翻訳停止コドン付近の塩基配列に相補的な塩
基配列を含むプライマー（C末端プライマー）を作製
し、ラット由来のDNAを鋳型としかつ前記両末端プライ
マーを用いてポリメラーゼチェイン反応を行うことによ
り、ＰＰＯをコードする全塩基配列を有する本発明ラッ
トＰＰＯ遺伝子を増幅しこれをクローニングすることが
できる。N末端プライマーとしては、例えば、配列番号
５で示される塩基配列を有するプライマー、配列番号７
で示される塩基配列を有するプライマーなどをあげるこ
とができ、C末端プライマーとしては、例えば、配列番
号６で示される塩基配列を有するプライマー、配列番号
８で示される塩基配列を有するプライマーなどをあげる
ことができる。また、上述の遺伝子断片の取得工程で得
られたDNA断片を、重複している領域に存在する制限酵
素認識部位で結合することによっても、ＰＰＯをコード
する全塩基配列を有する本発明ラットＰＰＯ遺伝子を取
得することができる。

【００１３】（２）ハイブリダイゼーション法を利用し
て本発明ラットＰＰＯ遺伝子を取得するには、ラット由
来のDNAに対して、前述の本発明ラットＰＰＯＤＮＡ断
片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、
ＰＰＯ遺伝子をコードするDNA断片を特定し、特定され
たDNA断片を単離すればよい。ここでハイブリダイゼー
ション法に用いるプローブは上記のようにして得られた
本発明ラットＰＰＯＤＮＡ断片を、例えば、Molecular
Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Man
iatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
年）10.6-10.26頁等に記載される通常の方法で、標識化
合物を用いて標識することにより調製できる。標識化合
物は、例えば、放射性同位元素（以下、RIと記す。）を
含む化合物や蛍光試薬等の標識化合物を用いることがで
きる。RIを含む化合物を用いた標識は、例えば、〔α-
³²P〕dCTP（アマシャム社製）及びランダムプライムラ
べリングキット（ベーリンガーマンハイム社製）等を用
いてキットに付属のプロトコールに準じて行うことがで
きる。また、非RI標識は、例えば、DIG-High Prime DNA
Labeling and Detection Starter KitI（ベーリンガー
・マンハイム社製）等とこれに付属の試薬を用い付属の
プロトコールに準じて行うことができる。プローブをハ
イブリダイズさせるラット由来のDNAとしては、例え
ば、ラット由来のcDNAを適当なリンカーでλファージ由
来のベクター等に連結し、該cDNAをファージ粒子内にパ
ッケージングすることにより得られるラットcDNAライブ
ラリー等を用いることができる。このような遺伝子ライ
ブラリーは、例えば、クローニングとシークエンス：植
物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編、
農村文化社1989年）74-103頁等に記載される方法に準じ
て調製することができる。また、Clontech社、STRATAGE
NE社等から市販されているラット遺伝子ライブラリーを
用いることもできる。本発明の遺伝子を単離するには、
例えば、上述の方法により作製されたプローブを用いて
上記のラット遺伝子ライブラリーに対して、コロニーハ
イブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーショ
ン法等を行うとよい。これらは、例えば、組換えＤＮＡ
実験（J.R.Dillon,A.Nasim,E.R.Nestmann編、東京科学
同人 1987年）98-101頁等に記載される方法、あるい
は、Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.
F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laborat
oryPress 1989年）1.90-1.104頁または2.108-2.117頁等
に記載される通常の方法で行うことができる。得られた
クローンに組み込まれているDNA断片の塩基配列決定
は、例えば、 Molecular Cloning 2nd edition（J.Samb
rook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1989年）13.42-13.74頁等に記載さ
れるダイデオキシ法によって行うことができる。ダイデ
オキシ法による塩基配列の決定には、例えば、蛍光ラベ
ルされたダイデオキシヌクレオチドを用いるシークエン
スキット、具体的には例えば、Dye terminator cycle s
equencing kit（PEアプライドバイオシステムズ社製）
等を利用し、市販のオートシークエンサー、例えば、DN
Aシークエンサー373S（PEアプライドバイオシステムズ
社製）等を用いることができる。決定された塩基配列を
市販の遺伝子解析ソフト、例えば、GENETYX（SDC社）を
用いて解析することにより、本発明ラットＰＰＯ遺伝子
の全塩基配列を明らかにする。

【００１４】また、本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子
は、コナミドリムシから例えば下記の方法により得られ
る。基本的な操作は、本発明ラットＰＰＯ遺伝子取得に
関する上記の記載に準じて行なうことが可能である。ま
ず、コナミドリムシを培養して細胞を集め、集めた細胞
から、RNAを抽出する。得られたRNAから、前記の本発明
ラットＰＰＯ遺伝子の取得方法に準じてcDNAライブラリ
ーを作製し、そのDNAを調製する。このように調製され
たDNAを鋳型に、例えば、配列番号11および12で示され
る塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーと
して、ポリメラーゼチェイン反応を行うことにより、コ
ナミドリムシＰＰＯ遺伝子の塩基配列を有するDNA断片
を増幅することができる。増幅されたＰＰＯ遺伝子の塩
基配列を有するDNA断片を、プラスミドにクローニング
し、塩基配列の決定に供することができる。

【００１５】このようにして得られた本発明ラットＰＰ
Ｏ遺伝子のcDNAもしくは本発明ラットＰＰＯＤＮＡ断
片、または本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子のcDNAを
用いて下記の方法により本発明ラットＰＰＯ遺伝子また
は本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子のゲノムDNAクロ
ーンを取得しその塩基配列を決定することができる。ま
ず、本発明ラットＰＰＯ遺伝子のゲノムDNAクローンの
場合、例えば、ラットの肝臓、腎臓等の組織を採取し、
採取した組織から、例えば、増補版ラボマニュアル遺伝
子工学（村松編、丸善株式会社1990年）76-77頁等に記
載される方法に準じて操作を行うことによりゲノムDNA
を抽出する。また、本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子
のゲノムDNAクローンの場合、例えば、コナミドリムシ
を培養して細胞を集め、集めた細胞から同様の操作によ
りゲノムDNAを抽出する。該抽出操作には、市販のゲノ
ムDNA抽出キット、具体的には例えば、ISOTISSUE（日本
ジーン社）等を用いることができ、キットに付属のプロ
トコールに準じて操作を行うことでゲノムDNAを得るこ
とができる。該ゲノムDNAを適当な制限酵素で切断した
後、得られたゲノムDNA断片を、例えば、クローニング
とシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュア
ル（渡辺、杉浦編、農村文化社1989年）276-279頁等に
記載されるNaCl密度勾配遠心法に準じて分画する。分画
された各ゲノムDNA断片画分のうちベクターに組み込む
のに適している大きさのゲノムDNA断片を含む画分、具
体的には、ファージべクターを用いる場合は9kbp〜23kb
pのゲノムDNA断片を含む画分、コスミドベクターを用い
る場合は30kbp〜42kbpのゲノムDNA断片を含む画分を選
択すると一般的によい。得られたゲノムDNA断片を用
い、例えば、クローニングとシークエンス：植物バイオ
テクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編、農村文化
社1989年）96ー103頁および280-284頁等に記載される方
法に準じて、または、市販のゲノムDNAライブラリー作
製キット、具体的には例えば、Lambda EMBL3/Gigapack
cloning kit（STRATAGENE社）を用いて付属のプロトコ
ールに準じて操作を行い、ゲノムDNAライブラリーを作
製する。作製したゲノムDNAライブラリー、または市販
のゲノムDNAライブラリー、具体的には例えば、STRATAG
ENE社のラットゲノムDNAライブラリー等に対して、本発
明ラットＰＰＯ遺伝子のcDNAもしくは本発明ラットＰＰ
ＯＤＮＡ断片、または、本発明コナミドリムシＰＰＯ遺
伝子のcDNAをプローブとして、例えば、クローニングと
シークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル
（渡辺、杉浦編、農村文化社1989年）106-147頁等に記
載される方法に準じてハイブリダイゼーションによるス
クリーニングを行うことにより、本発明ラットＰＰＯ遺
伝子、または、本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子の塩
基配列を含むゲノムDNAクローンを取得することができ
る。得られたゲノムDNAクローンは、例えば、クローニ
ングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニ
ュアル（渡辺、杉浦編、農村文化社1989年）152-174頁
に記載される方法に準じて、塩基配列の解析に適当なベ
クター、例えば、プラスミド等にサブクローニングした
後、例えば、Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambr
ook、 E.F.Frisch、T.Maniatis著、Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1989年）13.15等に記載されるプラ
イマーエクステンション法に準じて、ダイデオキシ法等
により塩基配列の決定を行うことができる。ダイデオキ
シ法による塩基配列の決定は、市販されているキット、
具体的には例えば、PEアプライドバイオシステムズ社製
のDye terminator cycle sequencing kitを用い、DNAシ
ークエンサー、例えば、PEアプライドバイオシステムズ
社のModel 373Sを用いて行うことができる。

【００１６】さらに、Bina-Stem Met et al.、（1979
年）Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.、76巻、731頁やSolln
er-Webb and R.H.Reeder、（1979年）Cell、18巻、485
頁などに記載されるプライマーエクステンション法また
はA.J.Berk and P.A.Sharp、（1978年）Proc.Natl.Aca
d.Sci. U.S.A.、75巻、1274頁等に記載されるS1マッピ
ング法等により、本発明ラットＰＰＯ遺伝子、または、
本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子のゲノムＤＮＡのそ
れぞれの転写開始点を決定することができる。通常この
転写開始点の上流約1kbから約10kbに遺伝子発現の制御
を担うプロモーター配列がある。

【００１７】また、本発明ラットＰＰＯ遺伝子および本
発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子は、光要求型除草剤と
して知られるＰＰＯ活性阻害剤に対する耐性遺伝子を得
るか、または作り出すための手段にも利用できる。例え
ば、本発明ラットＰＰＯ遺伝子または本発明コナミドリ
ムシＰＰＯ遺伝子にコードされるＰＰＯのアミノ酸配列
に変更を加える変異をＰＰＯ遺伝子に導入し、光要求型
除草剤耐性を示すＰＰＯのアミノ酸配列をコードする遺
伝子をスクリーニングすることによって新たな除草剤耐
性遺伝子を作り出すことが可能になる。具体的には、例
えば、A.Greener, M.Callahan、Strategies、1994年、7
巻、32-34頁等に記載される方法により本発明ラットＰ
ＰＯ遺伝子または本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子の
塩基配列にランダムな突然変異を誘導してアミノ酸配列
に変異を導入する方法によって新たな光要求型除草剤耐
性遺伝子を作り出すことが可能となる。また、W.Krame
r,et al.、Nucleic Acids Research、1984年、12巻、94
41頁もしくはW. Kramer,H.J.Frits、Methods in Enzymo
logy、1987年、154巻、350頁等に記載のギャップド・デ
ュープレックス（gapped duplex）法、または、T.A.Kun
kel、Proc. of Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1985年、82
巻、488頁もしくはT.A.Kunkel,et al.、Methods in Enz
ymology、1987年、154巻、367頁等に記載のクンケル（K
unkel）法等に準じて、本発明ラットＰＰＯ遺伝子また
は本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子の塩基配列に部位
特異的に変異を導入してアミノ酸配列を改変する方法に
よっても新たな光要求型除草剤耐性遺伝子を作り出すこ
とが可能になる。さらに、本発明ラットＰＰＯ遺伝子ま
たは本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子がコードするＰ
ＰＯのアミノ酸配列のうち一ヶ所ないし数カ所の部分ア
ミノ酸配列を、本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子、本
発明ラットＰＰＯ遺伝子、または他の生物由来のＰＰＯ
のアミノ酸配列の一部と入れ換えたキメラ酵素タンパク
質をコードする遺伝子を作製することによっても新たな
光要求型除草剤耐性遺伝子を作り出すことが可能にな
る。このようにして作製された光要求型除草剤耐性遺伝
子の効果（除草剤耐性発現）は、例えば、作製された除
草剤耐性遺伝子をＰＰＯ欠損の微生物または対象とする
除草剤に対して感受性のＰＰＯを持つ微生物に導入し、
形質転換微生物を選抜した後、該形質転換微生物を、対
象とする除草剤で処理し除草剤耐性コロニーを再選抜す
る方法で効率的に確認することができる。

【００１８】本発明ラットＰＰＯ遺伝子または本発明コ
ナミドリムシＰＰＯ遺伝子を含有するベクターとして
は、具体的には、例えば、配列番号１または配列番号９
で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
ＰＰＯ遺伝子をpCR2.1（Invitrogen社）にクローニング
し作成したプラスミドがあげられ、該プラスミドはベク
ター部分が小さく、大腸菌でコピー数が多いという特徴
を有しており、DNA調製やDNA構造解析を行うのに適して
いる。

【００１９】本発明ラットＰＰＯ遺伝子または本発明コ
ナミドリムシＰＰＯ遺伝子を宿主細胞内で発現させるこ
とのできるベクターは、例えば、（1）宿主細胞内で機
能可能なプロモーター、および（2）本発明ラットＰＰ
Ｏ遺伝子または本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子、な
らびに必要に応じて（3）宿主細胞内で機能可能なター
ミネーターを機能可能な形で前記の順序に結合させたＤ
ＮＡ断片をベクターに挿入することにより構築すること
ができる。ここで、「機能可能な形で」とは、該ベクタ
ーを宿主細胞に導入し宿主細胞を形質転換させた際に、
該ベクターに在する本発明ラットＰＰＯ遺伝子または本
発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子が、プロモーター（お
よびターミネーター）の制御下に発現するように、これ
らのプロモーター（およびターミネーター）と結合され
た状態にあることを意味する。「宿主細胞で機能可能な
プロモーター」としては、形質転換される宿主生物内で
転写活性を示すものであれば特に制限はない。例えば、
大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、酵母のア
ルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH）プロモータ
ー、アデノウイルス・メジャーレート（Ad.ML）プロモ
ーター、SV40の初期プロモーター、バキュロウイルスプ
ロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）プロモー
ター、オクトピン合成酵素遺伝子（OCT）プロモータ
ー、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV）由来の19Sお
よび35Sプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリ
アーゼ（PAL）遺伝子プロモーター、カルコンシンター
ゼ（CHS）遺伝子プロモーター等をあげることができ
る。また、「宿主細胞内で機能可能なターミネーター」
としては、形質転換される宿主生物内で転写終結活性を
示すものであれば特に制限はなく、必要に応じて使用す
ればよい。かかるターミネーターとしては、具体的には
例えば、大腸菌のラクトースオペロンのターミネータ
ー、酵母のHIS ターミネーター、ADH1ターミネーター、
SV40のearly splicing region、ノパリン合成酵素遺伝
子（NOS）ターミネーター、ニンニクウイルスGV1、GV2
のターミネーターなどをあげることができる。

【００２０】上記のようなベクターを宿主細胞に導入す
ることにより該宿主細胞を形質転換できる。例えば、宿
主細胞が微生物の場合、上記ベクターを塩化カルシウム
法、エレクトロポレーション法（Methods in Electropo
ration:Gene Pulser /E.coliPulser System, Bio-Rad L
aboratories, 1993年)等の公知の手段によって微生物細
胞内に導入することができる。また、宿主細胞が植物の
場合、上記のような本発明のベクターをアグロバクテリ
ウム感染方法（特公平2-58917及び特開昭60-70080）、
プロトプラストへのエレクトロポレーション方法（特開
昭60-251887及び特開平5-68575）、又はパーティクルガ
ン方法（特表平5-508316及び特開昭63-258525）などの
公知の手段により植物細胞に導入し、本発明ラットＰＰ
Ｏ遺伝子または本発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子が導
入された細胞を選抜することによって形質転換植物細胞
を得ることができる。得られた形質転換植物細胞から、
例えば、植物遺伝子操作マニュアル：トランスジェニッ
ク植物の作り方（内宮著、講談社サイエンティフィック
1990年）、27-55頁などに記載の植物細胞培養方法によ
り形質転換植物を再生することによって形質転換された
植物体を得ることができる。

【００２１】さらに本発明ラットＰＰＯ遺伝子または本
発明コナミドリムシＰＰＯ遺伝子を用いて、（１）宿主
細胞内で機能可能なプロモーター、および（2）本発明
ラットＰＰＯ遺伝子または本発明コナミドリムシＰＰＯ
遺伝子、ならびに必要に応じて（3）宿主細胞内で機能
可能なターミネーターが機能可能な形で結合されてなる
ＤＮＡ断片を含有するベクターを宿主細胞に導入し該宿
主細胞を形質転換させることにより、前記宿主細胞のＰ
ＰＯ活性またはＰＰＯ活性阻害剤に対する感受性を改変
することもできる。ここで、「宿主細胞で機能可能なプ
ロモーター」としては、形質転換される宿主生物内で転
写活性を示すものであれば特に制限はない。例えば、大
腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、酵母のアル
コールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH）プロモーター、
アデノウイルス・メジャーレート（Ad.ML）プロモータ
ー、SV40の初期プロモーター、バキュロウイルスプロモ
ーター、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）プロモータ
ー、オクトピン合成酵素遺伝子（OCT）プロモーター、
カリフラワーモザイクウイルス(CaMV）由来の19Sおよび
35Sプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアー
ゼ（PAL）遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（C
HS）遺伝子プロモーター等をあげることができる。ま
た、「宿主細胞内で機能可能なターミネーター」として
は、形質転換される宿主生物内で転写終結活性を示すも
のであれば特に制限はなく、必要に応じて使用すればよ
い。かかるターミネーターとしては、具体的には例え
ば、大腸菌のラクトースオペロンのターミネーター、酵
母のHIS ターミネーター、ADH1ターミネーター、SV40の
early splicing region、ノパリン合成酵素遺伝子（NO
S）ターミネーター、ニンニクウイルスGV1、GV2のター
ミネーターなどをあげることができる。上記のような宿
主細胞の改変方法により、例えば、ＰＰＯをターゲット
とする光要求型除草剤に対する耐性を植物に付与するこ
とができる。

【００２２】本発明のＰＰＯ活性阻害能評価方法に使用
される他のＰＰＯ遺伝子は、上述の本発明ラットＰＰＯ
遺伝子の取得方法に準じて取得し、利用することができ
る。例えば、ウサギ由来のＰＰＯ遺伝子を取得するに
は、市販のウサギcDNAライブラリー、配列番号3で示さ
れる塩基配列からなるプライマーおよび配列番号4で示
される塩基配列からなるプライマー等を用いるとよい。

【００２３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００２４】実施例1（ラットＰＰＯＤＮＡ断片のクロ
ーニング） 配列番号3で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドおよび配列番号4で示される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを調製した。オリゴヌクレオチドはDNA
合成装置（PEアプライドシステムズ社：Model 394 DNA/
RNA Synthesizer）を用い、合成用溶媒としてModel 394
DNA/RNA Synthesizer用溶媒（PEアプライドシステムズ
社）を用い、DNA合成試薬としてアデニン、シトシン、
グアニンおよびチミンに相当するフォスフォアミダイト
試薬（ PEアプライドシステムズ社）を用いて合成し
た。合成したオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド
精製用カートリッジ（ PEアプライドシステムズ社：OPC
カートリッジ）で精製したのち減圧乾燥しオリゴヌク
レオチドを調製した。ラット肝臓由来のcDNAの挿入され
たλZAPIIベクターからなるライブラリー（STRATAGENE
社製）（以下、ラットcDNAライブラリーと記す。）をMo
lecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisc
h, T.Maniatis著、Cold Spring HarborLaboratory Pres
s 1989年）2.60から2.65に記載の方法にしたがって、NZ
CYM寒天培地、数プレートに広げて増幅し、寒天培地か
らSMバッファーで各々のプレート毎にファージ粒子を溶
出した(以下、増幅ライブラリーと記す。)。増幅ライブ
ラリーから、DNA抽出キット（Lambda-TRAP PLUS：Clont
ech社製）を用いてDNAを抽出しファージクローンDNAを
調製した。このファージクローンDNAを鋳型としてポリ
メラーゼチェイン反応を行い、DNA断片を増幅した。ポ
リメラーゼチェイン反応における反応液は、10pmolの配
列番号3で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ド、10pmolの配列番号4で示される塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチド、5μlの10× PCR Buffer（宝酒造社
製）、0.25μlのTaKaRa Taq（宝酒造社製）、各々10 nm
olの4種類の塩基（dATP、dCTP、dGTP、dTTP：宝酒造社
製）、及び、10ngのファージクローンDNAを0.5ml容ポリ
メラーゼチェイン反応用チューブに採り、滅菌蒸留水を
加えて全量を50μlとして調製した。ポリメラーゼチェ
イン反応における各工程は下記の条件で行った。変性工
程は95℃で1分間保温し、アニーリング工程は55℃で2分
間保温し、DNAポリメラーゼによる伸長工程は72℃で3分
間保温する第1サイクルを1回行った後、変性工程は95℃
で1分間保温し、アニーリング工程は55℃で1.5分間保温
し、ポリメラーゼによる伸長工程は72℃で2分間保温す
る第2サイクルを34回行った。ポリメラーゼチェイン反
応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動で分析し、
約700bpの増幅DNA断片が検出される増幅ライブラリーを
選択した。次いで、選択された増幅ライブラリーを大腸
菌に感染させ、上記ラットcDNAライブラリーに添付のマ
ニュアルに記載の方法に従い、ラットcDNAを含むpBlues
criptベクターを調製し、これを大腸菌に形質転換し、
大腸菌ライブラリーを作製した。次いで、この大腸菌ラ
イブラリーを用いて、組換えＤＮＡ実験（J.R.Dillon,
A.Nasim,E.R.Nestmann編、東京科学同人 1987年）98-1
00頁等に記載されている方法に従いハイブリダイゼーシ
ョン用のメンブランを作製した。さらに、このメンブラ
ンを用いて、 DIG-High Prime DNA Labeling and Detec
tion StarterKit I（ベーリンガー・マンハイム社製）
等とこれに付属の試薬を用い付属のプロトコールに準じ
てハイブリダイゼーションを行った。プローブとして、
配列番号2の塩基番号639〜1333に示される塩基配列を有
するＤＮＡ断片を使用した。その結果、プローブと強く
ハイブリダイズするクローンを2個得た。得られたクロ
ーンが有するDNA断片の塩基配列をDye terminator cycl
e sequencing kit（PEアプライドバイオシステムズ社
製）およびDNAシークエンサー373S（PEアプライドバイ
オシステムズ社製）を用い決定した。その結果、配列番
号２の塩基番号270〜1636に示される塩基配列が明らか
となり、得られた2クローンは同一の塩基配列を有するD
NA断片を保持していることが判明した。また、決定され
た塩基配列には翻訳開始コドンが欠落していることか
ら、クローニングされたDNA断片にコードされるＰＰＯ
遺伝子は翻訳開始コドン付近を含む5'上流領域が欠けて
いることが判明した。

【００２５】実施例2（完全長ＰＰＯ遺伝子のクローニ
ング） 実施例1で得られたＰＰＯＤＮＡ断片において欠けてい
るＰＰＯ遺伝子の5'上流領域をクローニングするため、
ラットcDNAライブラリーから抽出したDNAを鋳型として
ポリメラーゼチェイン反応を行い、DNA断片を増幅し
た。ポリメラーゼチェイン反応における反応液は、10pm
olの配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチド、10pmolのT3プライマー(宝酒造社製)、0.5μl
のTaKaRa LATaq（宝酒造社製）、5.0μlの10x LA PCR b
uffer（宝酒造社製）、各々20 nmolの4種類の塩基（dAT
P、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）、及び、10ngの
ファージクローンDNAを0.5ml容ポリメラーゼチェイン反
応用チューブに採り、滅菌蒸留水を加えて全量を50μl
として調製した。ポリメラーゼチェイン反応における各
工程は下記の条件で行った。変性工程は95℃で1分間保
温し、アニーリング工程は55℃で2分間保温し、DNAポリ
メラーゼによる伸長工程は72℃で3分間保温する第1サイ
クルを1回行った後、変性工程は95℃で1分間保温し、ア
ニーリング工程は55℃で1.5分間保温し、ポリメラーゼ
による伸長工程は72℃で2分間保温する第2サイクルを34
回行った。ポリメラーゼチェイン反応終了後、反応液を
MicroSpin S-400HR（ファルマシアバイオテク社製）で
濾過することによりポリメラーゼチェイン反応によって
増幅されたDNA断片を精製した。次に、1.5ml容マイクロ
チューブに、上記のポリメラーゼチェイン反応で増幅さ
れたDNA断片の精製溶液2μl、直鎖化pCR2.1（Invitroge
n社製）50ng、1μlの10x Ligation buffer（Invitrogen
社製）、4Weiss unitのT4 DNA Ligase（Invitrogen社
製）を採り、滅菌蒸留水を加えて全量を10μlとして混
合した後、14℃で16時間保温することによりDNA連結反
応を行い、ポリメラーゼチェイン反応で増幅されたDNA
断片をpCR2.1に連結した。連結反応終了後、該反応液1
μlで大腸菌INVαF'株のコンピテントセル（Invitrogen
社製）を形質転換し、アンピシリン耐性となった株を選
抜した。さらに、選抜された株からプラスミドDNAを抽
出しこれらを制限酵素で切断した後アガロースゲル電気
泳動で分析することにより、ポリメラーゼチェイン反応
で増幅された約1.4 kbpのDNA断片がクローニングされて
いるプラスミドを選抜した。選抜されたプラスミドが有
するDNA断片の塩基配列をDye terminator cycle sequen
cing kit（PEアプライドバイオシステムズ社製）および
DNAシークエンサー373S（PEアプライドバイオシステム
ズ社製）を用い決定した。決定された塩基配列を解析し
たところ、クローニングされた約1.4 kbpのDNA断片は、
実施例1で得られたDNA断片と約1.1 kbp重複し、かつ翻
訳開始点より上流約150 bpを含んでいることが判った。
約1.4 kbpのDNA断片を有する上記のプラスミドを制限酵
素EcoRIおよびHincII(いずれも宝酒造社製)で切断し、
約550 bpの断片を回収した。一方、実施例1で得られた
クローンの保持するプラスミドを制限酵素EcoRIおよびH
incII(いずれも宝酒造社製)で切断し、5'末端を仔牛小
腸アルカリホスファターゼ(宝酒造社製)で脱リン酸化し
た。前述の2つのDNA断片をマイクロチューブに採り、DN
Aライゲーションキット(宝酒造社製)を用いて結合し
た。得られた反応液で大腸菌HB101のコンピテントセル
(宝酒造社製)を形質転換しアンピシリン耐性となった株
を選抜した。選抜した株に保持されていたプラスミドを
制限酵素EcoRIおよびXhoI(いずれも宝酒造社製)で切断
した後アガロースゲル電気泳動で分析することにより、
約1.7 kbpのDNA断片がクローニングされているプラスミ
ドを選抜した。得られたクローンが有するDNA断片の塩
基配列をDye terminator cycle sequencing kit（PEア
プライドバイオシステムズ社製）およびDNAシークエン
サー373S（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用い
決定した。その結果、配列番号2に示した塩基配列が明
らかとなり、クローニングされたDNA断片はラット由来
ＰＰＯをコードする構造遺伝子全長（1431 bp）を含む
ことが判明した。

【００２６】実施例3（ＰＰＯアミノ酸配列の解析） 実施例2で決定されたラット由来のＰＰＯ遺伝子cDNAの
塩基配列を、遺伝子解析ソフト（GENETYX：SDC社製）を
用いてアミノ酸配列に翻訳する解析を行った。その結
果、クローニングされたラット由来のＰＰＯ遺伝子cDNA
がコードするタンパク質は477個のアミノ酸残基より構
成され、そのアミノ酸配列は配列番号1に示したアミノ
酸配列であった。

【００２７】実施例4（ラットＰＰＯ遺伝子の大腸菌発
現用ベクターの構築） 配列番号5で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドおよび配列番号6で示される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを調製した。オリゴヌクレオチドはDNA
合成装置（PEアプライドシステムズ社：Model 394 DNA/
RNA Synthesizer）を用い、合成用溶媒としてModel 394
DNA/RNA Synthesizer用溶媒（PEアプライドシステムズ
社）を用い、DNA合成試薬としてアデニン、シトシン、
グアニンおよびチミンに相当するフォスフォアミダイト
試薬（ PEアプライドシステムズ社）を用いて合成し
た。合成したオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド
精製用カートリッジ（ PEアプライドシステムズ社：OPC
カートリッジ）で精製したのち減圧乾燥しオリゴヌク
レオチドを調製した。実施例2で得られたラット由来の
ＰＰＯをコードする全長遺伝子cDNAを鋳型とし、かつ、
配列番号5で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド及び配列番号6で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼチ
ェイン反応を行い、ＰＰＯをコードする約1.5kbpのDNA
断片を増幅した。ポリメラーゼチェイン反応における反
応液は10pmolの配列番号5で示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド、10pmolの配列番号6で示される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチド、0.5μlのTaKaRa L
ATaq（宝酒造社製）、5.0μlの10x LA PCR buffer（宝
酒造社製）、各々20nmolの4種類の塩基（dATP、dCTP、d
GTP、dTTP：Clontech社製）、及び、10ngの実施例2によ
り得られたラットＰＰＯの全長cDNAを含むプラスミドを
0.5ml容ポリメラーゼチェイン反応用チューブに採り、
滅菌蒸留水を加えて全量を50μlとして調製した。ポリ
メラーゼチェイン反応における各工程は下記の条件で行
った。変性工程は95℃で1分間保温し、アニーリング工
程は55℃で2分間保温し、DNAポリメラーゼによる伸長工
程は72℃で3分間保温する第1サイクルを1回行った後、
変性工程は95℃で1分間保温し、アニーリング工程は55
℃で1.5分間保温し、ポリメラーゼによる伸長工程は72
℃で2分間保温する第2サイクルを34回行った。ポリメラ
ーゼチェイン反応終了後、反応液をMicroSpin S-400HR
（ファルマシアバイオテク社製）で濾過することにより
ポリメラーゼチェイン反応によって増幅されたDNA断片
を精製した。このDNA断片の末端を制限酵素SacIIおよ
び、SmaIで切断した。一方、pBluescriptII SK+（Strat
agene社製）を制限酵素SacIIおよび、Sma I（いずれも
宝酒造社製）で切断し、5' 末端を仔牛小腸アルカリフ
ォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化した。前述
の2つのDNA断片をマイクロチューブに採り、DNAライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いて結合した。得ら
れた反応液で大腸菌 JM109 のコンピテントセル（宝酒
造社製）を形質転換してアンピシリン耐性となった株を
選抜し、該アンピシリン耐性株からプラスミドDNAを調
製し、ラットＰＰＯ遺伝子の大腸菌発現用ベクターを取
得した。

【００２８】実施例5（ラットＰＰＯ遺伝子による大腸
菌hemG欠損株の相補性試験） 実施例4で得た発現ベクターをF.Yamamoto、H.Inokuch
i、H.Ozeki、（1988年）Japanese Journal of Genetic
s、63巻、237-249項等に記載されているＰＰＯ遺伝子
（hemG遺伝子座）欠損突然変異系統大腸菌BT3株に導入
し、カナマイシンを終濃度10μｇ／ｍｌ、アンピシリン
を終濃度50μｇ／ｍｌとなるよう含むLB寒天培地に塗抹
接種し、37℃で2日間培養を行った。BT3株はLBプレート
上で増殖不良となり小さなコロニーしか形成しなかった
のに対し、ラットＰＰＯ遺伝子発現ベクターを導入した
株では比較的大きなコロニーが形成された。

【００２９】参考例１（ラットＰＰＯ活性に対する化合
物の阻害能試験） 実施例5で得られたラットPPO遺伝子発現ベクターが導入
された大腸菌BT3株の終夜培養液を濁度（OD600）が1.0
になるように希釈する。この希釈菌液を、各種被験化合
物が種々の濃度となるよう添加されたYPT液体培地およ
び前記化合物が添加されていないYPT液体培地に、培地
容量の0.05%相当接種して37℃で振とう培養し、培養16
時間後の濁度（OD600）を測定する。被験化合物を添加
しない系の濁度を100%として、各種の被験化合物により
50%増殖阻害の見られた濃度を算出する。各種の被験化
合物における当該濃度を比較することにより、被験化合
物のPPO活性阻害能を判定する。

【００３０】実施例６（lacリプレッサー遺伝子を導入
したラットＰＰＯ遺伝子発現大腸菌BT3株の取得） pBR322を制限酵素HindIIIおよび、AvaI（いずれも宝酒
造社製）で切断し、約1.4kbの断片を回収した。また、p
REP4を制限酵素HindIIIおよび、AvaI（いずれも宝酒造
社製）で切断し、約2.4kbの断片を回収し、その5'末端
を仔牛小腸アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）で
脱リン酸化した。前述の2つのDNA断片をマイクロチュー
ブに採り、DNAライゲーションキット（宝酒造社製）を
用いて結合した。得られた反応液で大腸菌 JM109のコン
ピテントセル（宝酒造社製）を形質転換して、カナマイ
シン・テトラサイクリン耐性となった株を選抜し、該カ
ナマイシン・テトラサイクリン耐性株からプラスミドDN
Aを調製し、lacリプレッサー発現用ベクターを取得し
た。該ベクターをBT3株に導入し、カナマイシン・テト
ラサイクリン耐性となった株を選抜した。さらに、該テ
トラサイクリン耐性株に実施例4で得た発現ベクターを
導入し、カナマイシン・テトラサイクリン・アンピシリ
ン耐性となった株を選抜し、ラットＰＰＯ遺伝子ならび
に、lacリプレッサー遺伝子が導入された大腸菌BT3株を
取得した。

【００３１】実施例７（lacリプレッサー遺伝子を導入
したラットＰＰＯ遺伝子発現大腸菌BT3株を用いた化合
物の活性阻害能の検定） 実施例６で得られたlacリプレッサー遺伝子を導入した
ラットＰＰＯ遺伝子発現大腸菌BT3株の終夜培養菌液を
濁度(OD600)が0.5になるように希釈した。この希釈菌液
を、各種の被験化合物が種々の濃度となるよう添加され
たYPT液体培地および前記化合物が添加されていないYPT
液体培地に、培地容量の0.1%相当接種して37℃で振とう
培養し、培養20時間後の濁度(OD600)を測定した。被験
化合物を添加しない系の濁度を100%として、図4に示す
構造の化合物により50%増殖阻害の見られた濃度を算出
した結果、0.11ppmであった。

【００３２】実施例８（コナミドリムシＰＰＯＤＮＡ断
片のクローニング） コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）CC407
株を、Chlamydomonas Genetics Center (address: DCM
B Group, Department of Botany, Box 91000, Duke Uni
versity, Durham, NC 27708-1000, USA)より入手し、20
0μE/m²/秒の光合成活性照明下、7mM NH₄Cl、0.4mM MgS
O₄・7H₂O、0.34mM CaCl₂・2H₂O、25mM リン酸カリウム、
0.5mM トリス（pH 7.5）、1ml/L ハトナー微量要素、お
よび 1ml/L 氷酢酸からなる TAP 液体培地（E. H. Harr
is、The Chlamydomonas Sourcebook、Academic Press、
San Diego、1989年、576-577頁）中で５日間培養し、初
期定常増殖期の細胞を含む培養液 200ml（1.0x10⁶ cell
s/ml）を得た。この細胞から、ISOGEN（日本ジーン社）
を用いて付属のマニュアルにしたがって操作を行ない、
全 RNA を調製した。さらに、BioMag mRNA Purificatio
n Kit（パーセプティブバイオシステム社）を用いて付
属のマニュアルに従って操作を行ない、poly(A)RNA を
分画した。得られた poly(A)RNA から、Marathon cDNA
Amplification Kit（Clontech 社）を用いて付属のマニ
ュアルに従って操作を行ない cDNA を合成し、ポリメラ
ーゼチェイン反応の鋳型とした。ポリメラーゼチェイン
反応のプライマーとして、配列番号11で示される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号12で示さ
れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを調製した。
オリゴヌクレオチドはDNA合成装置（PEアプライドシス
テムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を用い、
合成用溶媒としてModel 394 DNA/RNA Synthesizer用溶
媒（PEアプライドシステムズ社）を用い、DNA合成試薬
としてアデニン、シトシン、グアニンおよびチミンに相
当するフォスフォアミダイト試薬（PEアプライドシステ
ムズ社）を用いて合成した。合成したオリゴヌクレオチ
ドはオリゴヌクレオチド精製用カートリッジ（PEアプラ
イドシステムズ社：OPC カートリッジ）で精製したのち
減圧乾燥しオリゴヌクレオチドを調製した。ポリメラー
ゼチェイン反応は、Advantage cDNA PCR Kit（Clontech
社）を用いて付属のマニュアルに従って反応液を調製
し、94℃ 1分間、次いで70℃ 4分間のサイクルを１回、
94℃ 10秒間、次いで70℃ 4分間のサイクルを４回、94
℃ 10秒間、次いで68℃ 4分間のサイクルを５回、94℃
10秒間、次いで65℃ 5分間のサイクルを25回繰り返す条
件で反応を行ない、反応液の一部をアガロース電気泳動
にかけて、約2kbpの長さの増幅断片が得られることを確
認した。さらに、MicroSpin S400HR カラム（Pharmacia
Biotech社）を用いて付属のマニュアルに従って操作を
行ない反応液中の余剰のプライマーを除去し、TA Cloni
ng Kit（Invitrogen社）を用いて付属のマニュアルに従
って操作を行ない増幅断片をpCR2.1プラスミドにクロー
ニングした。得られた組換えプラスミドが有するDNA断
片の塩基配列をDye terminator cycle sequencing kit
（PEアプライドバイオシステムズ社製）およびDNAシー
クエンサー373S（PEアプライドバイオシステムズ社製）
を用い決定した。その結果、配列番号10で示される塩基
配列が明らかとなり、遺伝子解析ソフト GENETYX（SDC
社）を用いた解析により、配列番号９で示されるアミノ
酸配列をコードする完全長cDNAであることが判明した。

【００３３】実施例９（コナミドリムシＰＰＯ遺伝子の
大腸菌発現用ベクターの構築） 配列番号13で示される、末端に制限酵素 SacI の認識配
列を導入した塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、お
よび配列番号14で示される、末端に制限酵素 SalIの認
識配列を導入した塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を調製した。オリゴヌクレオチドはDNA合成装置（PEア
プライドシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesize
r）を用い、合成用溶媒としてModel 394 DNA/RNA Synth
esizer用溶媒（PEアプライドシステムズ社）を用い、DN
A合成試薬としてアデニン、シトシン、グアニンおよび
チミンに相当するフォスフォアミダイト試薬（ PEアプ
ライドシステムズ社）を用いて合成した。合成したオリ
ゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド精製用カートリッ
ジ（ PEアプライドシステムズ社：OPC カートリッジ）
で精製したのち減圧乾燥しオリゴヌクレオチドを調製し
た。実施例８で得られたコナミドリムシ由来のＰＰＯを
コードする全長遺伝子cDNAを鋳型とし、かつ、配列番号
13で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び
配列番号14で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェイン反
応を行い、ＰＰＯをコードする約2kbpのDNA断片を増幅
した。ポリメラーゼチェイン反応における反応液は10pm
olの配列番号13で示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチド、10pmolの配列番号14で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチド、0.5μlのTaKaRa LATaq（宝酒
造社製）、5.0μlの10x LA PCR buffer（宝酒造社
製）、各々20 nmolの4種類の塩基（dATP、dCTP、dGTP、
dTTP：Clontech社製）、及び、10ngの実施例９により得
られたコナミドリムシＰＰＯの全長cDNAを含むプラスミ
ドを0.5ml容ポリメラーゼチェイン反応用チューブに採
り、滅菌蒸留水を加えて全量を50μlとして調製した。
ポリメラーゼチェイン反応における各工程は下記の条件
で行った。変性工程は95℃で1分間保温し、アニーリン
グ工程は55℃で2分間保温し、DNAポリメラーゼによる伸
長工程は72℃で3分間保温する第1サイクルを1回行った
後、変性工程は95℃で1分間保温し、アニーリング工程
は55℃で1.5分間保温し、ポリメラーゼによる伸長工程
は72℃で2分間保温する第2サイクルを34回行った。ポリ
メラーゼチェイン反応終了後、反応液をMicroSpin S-40
0HR（ファルマシアバイオテク社製）で濾過することに
よりポリメラーゼチェイン反応によって増幅されたDNA
断片を精製した。このDNA断片の末端を制限酵素 SacI
および、SalIで切断した。一方、プラスミド pUC118
（宝酒造社製）を制限酵素 SacI およびSalI（いずれも
宝酒造社製）で切断し、5' 末端を仔牛小腸アルカリフ
ォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化した。前述
の2つのDNA断片をマイクロチューブに採り、DNAライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いて結合した。得ら
れた反応液で大腸菌 JM109 のコンピテントセル（宝酒
造社製）を形質転換してアンピシリン耐性となった株を
選抜し、該アンピシリン耐性株からプラスミドDNAを調
製し、コナミドリムシＰＰＯ遺伝子の大腸菌発現用ベク
ターを取得した。

【００３４】実施例１０（コナミドリムシＰＰＯ遺伝子
による大腸菌hemG欠損株の相補性試験） 実施例９で得た発現ベクターをF.Yamamoto、H.Inokuch
i、H.Ozeki、（1988年）Japanese Journal of Genetic
s、63巻、237-249項等に記載されているＰＰＯ遺伝子
（hemG遺伝子座）欠損突然変異系統大腸菌BT3株に導入
し、カナマイシンを終濃度10μｇ／ｍｌ、アンピシリン
を終濃度50μｇ／ｍｌとなるよう含むLB寒天培地に塗抹
接種し、37℃で2日間培養を行った。BT3株はLBプレート
上で生育不良となり小さなコロニーしか形成しなかった
のに対し、コナミドリムシＰＰＯ遺伝子発現ベクターを
導入した株では比較的大きなコロニーが形成された。

【００３５】参考例２（直接導入用ＰＰＯ遺伝子発現ベ
クターの構築） ラット由来のＰＰＯ遺伝子を植物細胞で発現させるため
に、植物直接導入用ＰＰＯ遺伝子発現ベクターを構築す
る。配列番号7で示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドおよび配列番号8で示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチドを調製する。オリゴヌクレオチドは
DNA合成装置（PEアプライドシステムズ社：Model 394 D
NA/RNA Synthesizer）を用い、合成用溶媒としてModel
394 DNA/RNA Synthesizer用溶媒（PEアプライドシステ
ムズ社）を用い、DNA合成試薬としてアデニン、シトシ
ン、グアニンおよびチミンに相当するフォスフォアミダ
イト試薬（PEアプライドシステムズ社）を用いて合成す
る。合成したオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド
精製用カートリッジ（PEアプライドシステムズ社：OPC
カートリッジ）で精製したのち減圧乾燥しオリゴヌクレ
オチドを調製する。実施例2により得られたラット由来
のＰＰＯの全長cDNAを鋳型とし、かつ、配列番号7で示
される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番
号8で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いてポリメラーゼチェイン反応を行
い、ラットＰＰＯをコードする約1.5kbpのDNA断片を増
幅する。該ポリメラーゼチェイン反応は、0.2ml容ポリ
メラーゼチェイン反応用チューブに10pmolの配列番号7
で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、10pm
olの配列番号8で示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチド、0.5μlのAdvantage KlenTaq Polymerase Mix
（Clontech社製）、2.5μlの10x KlenTaq PCR reacion
buffer（Clontech社製）、各々5nmolの4種類の塩基（dA
TP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）、及び、実施例
2により得られたラット由来のＰＰＯの全長cDNA10ngを
加え、全量を25μlとして行う。該ポリメラーゼチェイ
ン反応における各工程は下記の条件で行う。変性工程は
94℃で1分間保温し、アニーリング工程およびDNAポリメ
ラーゼによる伸長工程は65℃で4分間保温する第1 サイ
クルを1回行った後、変性工程は94℃で30秒間保温し、
アニーリング工程およびDNAポリメラーゼによる伸長工
程は65℃で4分間保温する第2サイクルを15回行う。ポリ
メラーゼチェイン反応終了後、反応液をMicroSpin S-40
0HR（ファルマシアバイオテク社製）で濾過することに
よりポリメラーゼチェイン反応によって増幅されたDNA
断片を精製する。このDNA断片の末端をDNAブランティン
グキット（宝酒造社製）を用いて平滑化した後、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）で5'末端にリン酸
基を付与する。一方、pUC19由来のGUS発現ベクターpBI2
21（Clontech社製）を制限酵素SmaＩおよびSacI（いず
れも宝酒造社製）で切断し、GUS構造遺伝子を取り除い
た2.8kbpのDNA断片を回収し、末端をDNAブランティング
キット（宝酒造社製）を用いて平滑末端化した後、バク
テリアアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リ
ン酸化する。前述の2つのDNA断片をマイクロチューブに
採り、DNAライゲーションキット（宝酒造社製）を用い
て結合する。得られる反応液で大腸菌 HB101のコンピテ
ントセル（宝酒造社製）を形質転換しアンピシリン耐性
となった株を選抜する。さらに、選抜された株に含有さ
れるプラスミドのうちカリフラワーモザイクウィルス由
来35Sプロモーター、ノパリンシンターゼ由来ターミネ
ーターに対してラット由来のＰＰＯのコード領域が順方
向に挿入されているプラスミドを選抜し植物直接導入用
ラットＰＰＯ遺伝子発現ベクターを得る。

【００３６】参考例３（間接導入用ＰＰＯ遺伝子発現ベ
クターの構築） ラット由来のＰＰＯ遺伝子を植物細胞に導入して発現さ
せるために、植物間接導入用ＰＰＯ遺伝子発現ベクター
を構築する。配列番号7で示される塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドおよび配列番号8で示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドを調製する。オリゴヌクレ
オチドはDNA合成装置（PEアプライドシステムズ社：Mod
el 394 DNA/RNA Synthesizer）を用い、合成用溶媒とし
てModel 394 DNA/RNA Synthesizer用溶媒（ PEアプライ
ドシステムズ社）を用い、DNA合成試薬としてアデニ
ン、シトシン、グアニンおよびチミンに相当するフォス
フォアミダイト試薬（ PEアプライドシステムズ社）を
用いて合成する。合成したオリゴヌクレオチドはオリゴ
ヌクレオチド精製用カートリッジ（ PEアプライドシス
テムズ社：OPC カートリッジ）で精製したのち減圧乾燥
しオリゴヌクレオチドを調製する。実施例2により得ら
れたラット由来のＰＰＯの全長cDNAを鋳型とし、配列番
号7及び配列番号8で示される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドを用いてポリメラーゼチェイン反応を行い、
ラット由来のＰＰＯをコ−ドする約1.5kbpのDNA断片を
増幅する。該ポリメラーゼチェイン反応は、0.2ml容ポ
リメラーゼチェイン反応用チューブに10pmolの配列番号
7で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、10p
molの配列番号8で示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチド、0.5μlのAdvantage KlenTaq Polymerase Mix
（Clontech社製）、2.5μlの10x KlenTaq PCR reacion
buffer（Clontech社製）、各々5nmolの4種類の塩基（dA
TP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）、及び、実施例
2により得られたラット由来のＰＰＯの全長cDNAを含むD
NA10ngを加え、全量を25μlとしポリメラーゼチェイン
反応を行う。該ポリメラーゼチェイン反応における各工
程は下記の条件で行う。変性工程は94℃で1分間保温
し、アニーリング工程およびDNAポリメラーゼによる伸
長工程は65℃で4分間保温する第1サイクルを1回行った
後、変性工程は94℃で30秒間保温し、アニーリング工程
およびDNAポリメラーゼによる伸長工程は65℃で4分間保
温する第2サイクルを15回行う。ポリメラーゼチェイン
反応終了後、反応液をMicroSpin S-400HR（ファルマシ
アバイオテク社製）で濾過することによりポリメラーゼ
チェイン反応によって増幅されたDNA断片を精製する。
このDNA断片の末端をDNAブランティングキット（宝酒造
社製）を用いて平滑化した後、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造社製）で5'末端にリン酸基を付与する。一
方、pBIN19由来のGUS発現バイナリーベクターpBI121（C
lontech社製）を制限酵素SmaＩ、及び、SacI（いずれも
宝酒造社製）で切断し、GUS構造遺伝子を取り除いたDNA
断片を回収し、末端をDNAブランティングキット（宝酒
造社製）を用いて平滑末端化した後、バクテリアアルカ
リフォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化する。
前述の2つのDNA断片をマイクロチューブに採り、DNAラ
イゲーションキット（宝酒造社製）を用いて結合する。
得られる反応液で大腸菌 HB101のコンピデントセル（宝
酒造社製）を形質転換しカナマイシン耐性となった株を
選抜する。さらに、選抜された株に含有されるプラスミ
ドのうちカリフラワーモザイクウィルス由来35Sプロモ
ーター、ノパリンシンターゼ由来ターミネーターに対し
てラットＰＰＯのコード領域が順方向に挿入されている
プラスミドを選抜し植物間接導入用ラットＰＰＯ遺伝子
発現ベクターを得る。

【００３７】参考例４（コナミドリムシＰＰＯ遺伝子発
現ベクターの構築） コナミドリムシ由来のＰＰＯを植物細胞で発現させるた
めに、植物直接導入用ＰＰＯ遺伝子発現ベクターを構築
する。実施例８で得られたコナミドリムシ由来ＰＰＯ遺
伝子 cDNA 増幅断片を持つ pCR2.1 プラスミドを、制限
酵素 NotI および SpeI（いずれも宝酒造社製）で消化
し、末端に NotI および SpeI の粘着末端を持つ長さ約
2kbp のコナミドリムシ由来ＰＰＯ遺伝子 cDNA 断片を
得る。一方、pBluescriptII KS+（Stratagene社製）を
制限酵素 NotI および SpeI（いずれも宝酒造社製）で
切断し、5' 末端を仔牛小腸アルカリフォスファターゼ
（宝酒造社製）で脱リン酸化する。ふたつのDNA断片を
マイクロチューブに採り、DNAライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて結合する。得られる反応液で大
腸菌 HB101のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転
換しアンピシリン耐性となった株を選抜する。さらに、
選抜された株に含有されるプラスミドを選抜し、コナミ
ドリムシ由来ＰＰＯ遺伝子 cDNA断片がプラスミドpBlue
scriptII KS+に挿入されているクローンを得る。得られ
たプラスミドを制限酵素 BamHI および SacI（いずれも
宝酒造社製）で消化し、末端に BamHI および SacI の
粘着末端を持つ長さ約 2kbp のコナミドリムシ由来ＰＰ
Ｏ遺伝子 cDNA 断片を得る。一方、pBI221 および pBI1
21（いずれも Clontech 社製）を、それぞれ、制限酵素
BamHI および SacI（いずれも宝酒造社製）で切断し、
β-グルクロニダーゼ遺伝子を除いたベクター断片を得
て、5' 末端を仔牛小腸アルカリフォスファターゼ（宝
酒造社製）で脱リン酸化する。コナミドリムシ由来ＰＰ
Ｏ遺伝子 cDNA 断片と、pBI221 あるいは pBI121のベク
ター断片のふたつのDNA断片をマイクロチューブに採
り、DNAライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて
結合する。得られる反応液で大腸菌 HB101のコンピテン
トセル（宝酒造社製）を形質転換し、pBI221 ベクター
断片とのライゲーションの場合にはアンピシリン耐性、
pBI121 ベクター断片とのライゲーションの場合にはカ
ナマイシン耐性となった株を選抜する。さらに、選抜さ
れた株に含有されるプラスミドを選抜し、コナミドリム
シ由来ＰＰＯ遺伝子 cDNA 断片がpBI221 ベクター断片
に挿入された直接導入用プラスミド、あるいは pBI121
ベクター断片に挿入された間接導入用プラスミドを得
る。

【００３８】参考例５（ラットまたはコナミドリムシ由
来のＰＰＯ発現ベクター導入形質転換植物の作出） 参考例３で得られる間接導入用ラットＰＰＯ遺伝子発現
ベクターまたは参考例４で得られる間接導入用コナミド
リムシＰＰＯ遺伝子発現ベクターをバイナリーベクター
法（Clontech社製：GUS ジーンフュージョンシステム）
により、Agrobacterium tumefaciens LBA4404に移す。
この菌株を、植物遺伝子操作マニュアル（内宮著、講談
社サイエンティフィック、1990年）に記載の方法に準じ
て、無菌培養したタバコ葉片に感染させ、形質転換タバ
コを得る。同様に、N.Pawlickiet al.、（1992年）Pla
nt cell, Tissue and Organ Culture、第31巻、129-139
頁に記載の方法に準じて、無菌培養したニンジン実生の
葉柄に感染させ形質転換ニンジンを得る。同様に、J.Pu
onti-Kaerlas et al.、（1990年）Theoreticaland Ap
plied Genetics、第80巻、246-252頁に記載の方法に準
じて、無菌的に発芽させたエンドウ実生の上胚軸または
子葉に感染させ、形質転換エンドウを得る。さらに、参
考例２で得られる直接導入用ラットＰＰＯ遺伝子発現ベ
クターまたは参考例５で得られる直接導入用コナミドリ
ムシＰＰＯ遺伝子発現ベクターを特開平3-291501に記載
されている方法で、パーティクルガンによりダイズ不定
胚に導入し、形質転換ダイズを得る。同様に、島田ら
著、（1994年）育種学会雑誌、第44巻、別冊1号、66頁
に記載の方法に準じて、パーティクルガンにより無菌培
養したイネ未熟胚盤に導入し、形質転換イネを得る。同
様に、宅見ら著、（1995年）育種学会雑誌、第44巻、別
冊1号、57頁に記載されている通常の方法に準じて、パ
ーティクルガンにより無菌培養したコムギ未熟胚盤に導
入し、形質転換コムギを得る。同様に、萩尾ら著、（19
95年）育種学会雑誌、第44巻、別冊1号、67頁に記載の
方法に準じて、パーティクルガンにより無菌培養したオ
オムギ未熟胚盤に導入し、形質転換オオムギを得る。同
様に、 M.E. Fromm et al.、（ 1990年）BIO/TECHNOL
OGY、第8巻 833-839頁に記載の方法に準じて、パーティ
クルガンによりトウモロコシ不定胚に導入し、形質転換
トウモロコシを得る。

【００３９】

【発明の効果】本発明により、化合物のＰＰＯ活性阻害
能を評価するための簡便な方法が提供可能となる。

【００４０】（配列表フリーテキスト） 配列番号３ ラット由来のＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列を含むDNA断
片の増幅用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号４ ラット由来のＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列を含むDNA断
片の増幅用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号５ ラット由来のＰＰＯ遺伝子の大腸菌発現ベクターの構築
用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号６ ラット由来のＰＰＯ遺伝子の大腸菌発現ベクターの構築
用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号７ 直接導入用ラット由来ＰＰＯ遺伝子発現ベクターおよび
間接導入用ラット由来ＰＰＯ発現ベクターの構築用に設
計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号8 直接導入用ラット由来ＰＰＯ遺伝子発現ベクターおよび
間接導入用ラット由来ＰＰＯ発現ベクターの構築用に設
計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１１ コナミドリムシ由来のＰＰＯ遺伝子を含むDNA断片の増
幅用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１２ コナミドリムシ由来のＰＰＯ遺伝子含むDNA断片の増幅
用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１３ コナミドリムシ由来のＰＰＯ遺伝子の大腸菌発現ベクタ
ーの構築用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー 配列番号１４ コナミドリムシ由来のＰＰＯ遺伝子の大腸菌発現ベクタ
ーの構築用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー

【００４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> A Method for evaluating the ability of a compound to inhibit the p rotoporphyrinogen oxidase activity <130> P150260 <150> JP 10/099619 <151> 1998-04-10 <160> 14 <210> 1 <211> 477 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 1 Met Ala Arg Thr Val Ile Val Leu Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ser Tyr His Leu Thr Arg Ser Pro Ser Pro Pro Lys Val Ile Leu 20 25 30 Val Glu Gly Ser Lys Arg Leu Gly Gly Trp Ile Arg Ser Val Arg Gly 35 40 45 Ser Asp Gly Ala Ile Phe Glu Leu Gly Pro Arg Gly Ile Arg Pro Ala 50 55 60 Gly Ala Leu Gly Ala Arg Thr Leu Leu Leu Val Ser Glu Leu Gly Leu 65 70 75 80 Glu Ser Glu Val Leu Pro Val Arg Gly Asp His Pro Ala Ala Gln Asn 85 90 95 Arg Phe Leu Tyr Val Gly Gly Ala Leu His Pro Leu Pro Ser Gly Leu 100 105 110 Arg Gly Leu Leu Arg Pro Ser Pro Pro Phe Ser Lys Pro Leu Phe Trp 115 120 125 Ala Gly Leu Arg Glu Leu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Glu Pro Asp Glu 130 135 140 Thr Val His Ser Phe Ala Gln Arg Arg Leu Gly Pro Glu Val Ala Ser 145 150 155 160 Leu Ala Met Asp Ser Leu Cys Arg Gly Val Phe Ala Gly Asn Ser Gln 165 170 175 Glu Leu Ser Ile Arg Ser Cys Phe Pro Ser Leu Phe Gln Ala Glu Gln 180 185 190 Thr His Gly Ser Met Leu Leu Gly Leu Leu Leu Gly Ala Gly Gln Thr 195 200 205 Pro Gln Pro Asn Ser Ser Leu Ile Arg Gln Ala Arg Ala Glu Arg Trp 210 215 220 Ser Gln Trp Ser Leu Arg Gly Gly Leu Glu Met Leu Pro Gln Ala Leu 225 230 235 240 His Asn Tyr Leu Thr Ser Lys Gly Val Thr Ile Leu Ser Gly Gln Pro 245 250 255 Ala Cys Gly Leu Ser Leu Gln Pro Glu Gly His Trp Lys Val Ser Leu 260 265 270 Gly Asp Ser Ser Leu Glu Ala Asp His Ile Ile Ser Thr Ile Pro Ala 275 280 285 Ser Val Leu Ser Lys Leu Leu Pro Ala Glu Ala Ala Pro Leu Ala His 290 295 300 Ile Leu Ser Thr Ile Gln Ala Val Ser Val Ala Val Val Asn Leu Gln 305 310 315 320 Tyr Lys Gly Ala Cys Leu Pro Val Gln Gly Phe Gly His Leu Val Pro 325 330 335 Ser Ser Glu Asp Pro Thr Val Leu Gly Ile Val Tyr Asp Ser Val Ala 340 345 350 Phe Pro Glu Gln Asp Gly Asn Pro Pro Gly Leu Arg Leu Thr Val Met 355 360 365 Leu Gly Gly Tyr Trp Leu Gln Lys Leu Lys Ala Asn Gly His Glu Leu 370 375 380 Ser Pro Glu Leu Phe Gln Arg Ala Ala Gln Glu Ala Ala Ala Thr Gln 385 390 395 400 Leu Gly Leu Lys Glu Gln Pro Ser His Cys Leu Val His Leu His Lys 405 410 415 Asn Cys Ile Pro Gln Tyr Thr Leu Gly His Trp Gln Lys Leu Asp Ser 420 425 430 Ala Leu Gln Phe Leu Thr Ala Gln Arg Leu Pro Leu Thr Leu Ala Gly 435 440 445 Ala Ser Tyr Glu Gly Val Ala Val Asn Asp Cys Ile Glu Ser Gly Arg 450 455 460 Gln Ala Ala Ile Ala Val Leu Gly Thr Glu Ser Asn Ser 465 470 475 <210> 2 <211> 1638 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (143)...(1576) <400> 2 cgtacacgcg cgttttgcat tagttgctca ttaatcagta agtgcccaga ggtggggtac 60 gggacccgtg gggtttctgc agttgtaaag cagggtgcct cccgttctcc tggggtatct 120 cgactttccc ccaggcctta cg atg gcc cgg act gtg ata gtg ctt ggc gga 172 Met Ala Arg Thr Val Ile Val Leu Gly Gly 1 5 10 ggt atc agc gga ttg gcc gca agt tat cat ctg acc cga agc ccc agt 220 Gly Ile Ser Gly Leu Ala Ala Ser Tyr His Leu Thr Arg Ser Pro Ser 15 20 25 cct cct aag gtg atc tta gtg gag ggc agc aaa cgt ttg gga ggc tgg 268 Pro Pro Lys Val Ile Leu Val Glu Gly Ser Lys Arg Leu Gly Gly Trp 30 35 40 atc cgt tca gtc cga gga tca gat ggt gcg atc ttt gaa ctt gga cct 316 Ile Arg Ser Val Arg Gly Ser Asp Gly Ala Ile Phe Glu Leu Gly Pro 45 50 55 cga gga att agg ccg gct gga gcc ctg gga gcc cgg acc ctg ctc ctg 364 Arg Gly Ile Arg Pro Ala Gly Ala Leu Gly Ala Arg Thr Leu Leu Leu 60 65 70 gtt tct gaa ctt ggc ttg gaa tcc gaa gtc ttg cct gtc cga ggg gat 412 Val Ser Glu Leu Gly Leu Glu Ser Glu Val Leu Pro Val Arg Gly Asp 75 80 85 90 cat cca gct gcc cag aac cgg ttc ctg tat gta ggc ggt gcc ctg cac 460 His Pro Ala Ala Gln Asn Arg Phe Leu Tyr Val Gly Gly Ala Leu His 95 100 105 ccc cta ccc tct ggc ctc agg ggg cta ctt cgt cct tca ccc ccc ttc 508 Pro Leu Pro Ser Gly Leu Arg Gly Leu Leu Arg Pro Ser Pro Pro Phe 110 115 120 tca aaa cct cta ttt tgg gct gga ctg agg gag ttg acg aag ccc agg 556 Ser Lys Pro Leu Phe Trp Ala Gly Leu Arg Glu Leu Thr Lys Pro Arg 125 130 135 ggc aaa gag cct gat gag act gtg cac agt ttt gcc cag cgc cgc ctt 604 Gly Lys Glu Pro Asp Glu Thr Val His Ser Phe Ala Gln Arg Arg Leu 140 145 150 gga cct gag gtg gcg tct ctg gct atg gac agc ctt tgc aga gga gtg 652 Gly Pro Glu Val Ala Ser Leu Ala Met Asp Ser Leu Cys Arg Gly Val 155 160 165 170 ttt gct ggc aac agc caa gag ctc agc atc cgg tcc tgc ttt ccc agt 700 Phe Ala Gly Asn Ser Gln Glu Leu Ser Ile Arg Ser Cys Phe Pro Ser 175 180 185 ctc ttc caa gct gaa caa acc cac ggg tcc atg tta ctg ggg ctg ctg 748 Leu Phe Gln Ala Glu Gln Thr His Gly Ser Met Leu Leu Gly Leu Leu 190 195 200 ctg ggg gca ggg caa act cca cag ccc aat tcc tca tta att cgt cag 796 Leu Gly Ala Gly Gln Thr Pro Gln Pro Asn Ser Ser Leu Ile Arg Gln 205 210 215 gcc cgc gct gag cga tgg agt cag tgg tca ctc cgt gga ggg ctg gag 844 Ala Arg Ala Glu Arg Trp Ser Gln Trp Ser Leu Arg Gly Gly Leu Glu 220 225 230 atg ttg ccc cag gcc ctt cat aac tac cta aca agt aaa ggg gtc act 892 Met Leu Pro Gln Ala Leu His Asn Tyr Leu Thr Ser Lys Gly Val Thr 235 240 245 250 atc ctc agt ggt cag cca gcc tgc ggg ctc agc ctt cag cca gaa ggg 940 Ile Leu Ser Gly Gln Pro Ala Cys Gly Leu Ser Leu Gln Pro Glu Gly 255 260 265 cac tgg aag gtg tct cta ggg gac agc agt ctg gag gct gac cac att 988 His Trp Lys Val Ser Leu Gly Asp Ser Ser Leu Glu Ala Asp His Ile 270 275 280 ata agc acc att cca gct tca gtg ctc agc aag ctg ctc cct gcc gag 1036 Ile Ser Thr Ile Pro Ala Ser Val Leu Ser Lys Leu Leu Pro Ala Glu 285 290 295 gct gca cct ctg gct cac atc ctg agt acc atc caa gct gtg tct gtg 1084 Ala Ala Pro Leu Ala His Ile Leu Ser Thr Ile Gln Ala Val Ser Val 300 305 310 gcc gtg gtg aat ctg cag tac aaa gga gct tgt ctg cct gtg cag gga 1132 Ala Val Val Asn Leu Gln Tyr Lys Gly Ala Cys Leu Pro Val Gln Gly 315 320 325 330 ttt gga cat ctg gtg cca tcc tca gaa gac ccg acc gtc ctg gga atc 1180 Phe Gly His Leu Val Pro Ser Ser Glu Asp Pro Thr Val Leu Gly Ile 335 340 345 gtg tat gac tcg gtt gct ttt cct gag cag gat ggg aac ccc cca ggc 1228 Val Tyr Asp Ser Val Ala Phe Pro Glu Gln Asp Gly Asn Pro Pro Gly 350 355 360 ctc aga ctg act gtg atg ttg gga ggt tac tgg tta cag aag ctg aaa 1276 Leu Arg Leu Thr Val Met Leu Gly Gly Tyr Trp Leu Gln Lys Leu Lys 365 370 375 gcc aat ggc cat gaa ttg tct cca gag cta ttc caa cga gca gca cag 1324 Ala Asn Gly His Glu Leu Ser Pro Glu Leu Phe Gln Arg Ala Ala Gln 380 385 390 gaa gcg gct gcc aca cag tta gga ctg aaa gag caa cca agc cat tgc 1372 Glu Ala Ala Ala Thr Gln Leu Gly Leu Lys Glu Gln Pro Ser His Cys 395 400 405 410 ttg gtc cat cta cac aaa aac tgt atc cct cag tat aca cta ggc cac 1420 Leu Val His Leu His Lys Asn Cys Ile Pro Gln Tyr Thr Leu Gly His 415 420 425 tgg caa aaa cta gac tca gct ctg caa ttc ctg acg gcc cag agg ttg 1468 Trp Gln Lys Leu Asp Ser Ala Leu Gln Phe Leu Thr Ala Gln Arg Leu 430 435 440 ccc ctg act ttg gct ggg gcc tcc tat gag ggg gta gct gtc aat gac 1516 Pro Leu Thr Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Glu Gly Val Ala Val Asn Asp 445 450 455 tgt ata gag agt ggg cgc cag gca gca att gct gtc ctg ggc aca gaa 1564 Cys Ile Glu Ser Gly Arg Gln Ala Ala Ile Ala Val Leu Gly Thr Glu 460 465 470 tcg aac agc tga cccccactct cctactcatg aaagtaaaag ttgatggagc 1614 Ser Asn Ser 475 ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1636 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for amplifying a DNA fragment containing a partial nucleotide sequence of a rat-derived PPO gene <400> 3 tttgcagagg agtgtttgct ggcaacag 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for amplifying a DNA fragment containing a partial nucleotide sequence of a rat-derived PPO gene <400> 4 agccgcttcc tgtgctgctc gttggaata 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for constructing a vector exp ressing a rat-derived PPO gene in Escherichia coli <400> 5 aggccttacc gcggcccgga ctgtg 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for constructing a vector exp ressing a rat-derived PPO gene in Escherichia coli <400> 6 taggagagcc cgggtcagat gttcg 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for constructing a rat-derive d PPO gene expression vector for direct introduction and a rat-derived P PO expression vector for indirect introduction <400> 7 atggcccgga ctgtgatagt gcttg 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for constructing a rat-derive d PPO gene expression vector for direct introduction and a rat-derived P PO expression vector for indirect introduction <400> 8 ttcatgagta ggagagtggg ggtca 25 <210> 9 <211> 563 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 9 Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser Arg Arg 1 5 10 15 Ser Gln Ile Arg Ser Ala Ala His Val Ser Ala Lys Val Ala Pro Arg 20 25 30 Pro Thr Pro Phe Ser Val Ala Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ser Pro Ala 35 40 45 Thr Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Arg Thr Ala Ala Ala Ala Thr 50 55 60 Gly Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Val Ala Lys Thr Leu Asp Asn 65 70 75 80 Val Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu Val Thr 85 90 95 Gly Gln Ala Leu Ala Ala Gln His Lys Ile Gln Asn Phe Leu Val Thr 100 105 110 Glu Ala Arg Glu Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Ser Met Ser Gly Asp 115 120 125 Gly Tyr Val Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Asn Asp Ser 130 135 140 Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu Val Phe 145 150 155 160 Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys Leu Arg 165 170 175 Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met Ser Ile 180 185 190 Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn Gly 195 200 205 Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg Asn 210 215 220 Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly 225 230 235 240 Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Asn 245 250 255 Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly Ala 260 265 270 Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg Asp 275 280 285 Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg 290 295 300 Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro Asp 305 310 315 320 Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala Asp 325 330 335 Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys Val 340 345 350 Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val Ala Asp 355 360 365 Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser Phe 370 375 380 Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser Ala 385 390 395 400 Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Ser Asp Gly Ser Val Pro Gly Phe Gly 405 410 415 Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Ile Thr Thr Leu Gly Thr Ile Tyr 420 425 430 Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Glu Gly His Met Leu Leu 435 440 445 Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Gly Ile Val Asn Gln Thr 450 455 460 Thr Glu Gln Leu Val Glu Gln Val Asp Lys Asp Leu Arg Asn Met Val 465 470 475 480 Ile Lys Pro Asp Ala Pro Lys Pro Arg Val Val Gly Val Arg Val Trp 485 490 495 Pro Arg Ala Ile Pro Gln Phe Asn Leu Gly His Leu Glu Gln Leu Asp 500 505 510 Lys Ala Arg Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Leu Gln Gly Val His Leu 515 520 525 Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Lys Val Val Glu His 530 535 540 Gly Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Leu Ala Lys Ser Val Ser Lys Ala Ala 545 550 555 560 Val Lys Ala 563 <210> 10 <211> 1838 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <220> <221> CDS <222> (2)...(1793) <400> 10 a atg atg ttg acc cag act cct ggg acc gcc acg gct tct agc cgg 46 Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser Arg 1 5 10 15 cgg tcg cag atc cgc tcg gct gcg cac gtc tcc gcc aag gtc gcg cct 94 Arg Ser Gln Ile Arg Ser Ala Ala His Val Ser Ala Lys Val Ala Pro 20 25 30 cgg ccc acg cca ttc tcg gtc gcg agc ccc gcg acc gct gcg agc ccc 142 Arg Pro Thr Pro Phe Ser Val Ala Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ser Pro 35 40 45 gcg acc gcg gcg gcc cgc cgc aca ctc cac cgc act gct gcg gcg gcc 190 Ala Thr Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Arg Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 act ggt gct ccc acg gcg tcc gga gcc ggc gtc gcc aag acg ctc gac 238 Thr Gly Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Val Ala Lys Thr Leu Asp 65 70 75 aat gtg tat gac gtg atc gtg gtc ggt gga ggt ctc tcg ggc ctg gtg 286 Asn Val Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu Val 80 85 90 95 acc ggc cag gcc ctg gcg gct cag cac aaa att cag aac ttc ctt gtt 334 Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ala Gln His Lys Ile Gln Asn Phe Leu Val 100 105 110 acg gag gct cgc gag cgc gtc ggc ggc aac att acg tcc atg tcg ggc 382 Thr Glu Ala Arg Glu Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Ser Met Ser Gly 115 120 125 gat ggc tac gtg tgg gag gag ggc ccg aac agc ttc cag ccc aac gat 430 Asp Gly Tyr Val Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Asn Asp 130 135 140 agc atg ctg cag att gcg gtg gac tct ggc tgc gag aag gac ctt gtg 478 Ser Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu Val 145 150 155 ttc ggt gac ccc acg gct ccc cgc ttc gtg tgg tgg gag ggc aag ctg 526 Phe Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys Leu 160 165 170 175 cgc ccc gtg ccc tcg ggc ctg gac gcc ttc acc ttc gac ctc atg tcc 574 Arg Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met Ser 180 185 190 atc ccc ggc aag atc cgc gcc ggg ctg ggc gcc atc ggc ctc atc aac 622 Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn 195 200 205 gga gcc atg ccc tcc ttc gag gag agt gtg gag cag ttc atc cgc cgc 670 Gly Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg 210 215 220 aac ctg ggc gat gag gtg ttc ttc cgc ctg atc gag ccc ttc tgc tcc 718 Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser 225 230 235 ggc gtg tac gcg ggc gac ccc tcc aag ctg tcc atg aag gcg gcc ttc 766 Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe 240 245 250 255 aac agg atc tgg att ctg gag aag aac ggc ggc agc ctg gtg gga ggt 814 Asn Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly 260 265 270 gcc atc aag ctg ttc cag gaa cgc cag tcc aac ccg gcc ccg ccg cgg 862 Ala Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg 275 280 285 gac ccg cgc ctg ccg ccc aag ccc aag ggc cag acg gtg ggc tcg ttc 910 Asp Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe 290 295 300 cgc aag ggc ctg aag atg ctg ccg gac gcc att gag cgc aac atc ccc 958 Arg Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro 305 310 315 gac aag atc cgc gtg aac tgg aag ctg gtg tct ctg ggc cgc gag gcg 1006 Asp Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala 320 325 330 335 gac ggg cgg tac ggg ctg gtg tac gac acg ccc gag ggc cgt gtc aag 1054 Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys 340 345 350 gtg ttt gcc cgc gcc gtg gct ctg acc gcg ccc agc tac gtg gtg gcg 1102 Val Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val Ala 355 360 365 gac ctg gtc aag gag cag gcg ccc gcc gcc gcc gag gcc ctg ggc tcc 1150 Asp Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser 370 375 380 ttc gac tac ccg ccg gtg ggc gcc gtg acg ctg tcg tac ccg ctg agc 1198 Phe Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser 385 390 395 gcc gtg cgg gag gag cgc aag gcc tcg gac ggg tcc gtg ccg ggc ttc 1246 Ala Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Ser Asp Gly Ser Val Pro Gly Phe 400 405 410 415 ggt cag ctg cac ccg cgc acg cag ggc atc acc act ctg ggc acc atc 1294 Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Ile Thr Thr Leu Gly Thr Ile 420 425 430 tac agc tcc agc ctg ttc ccc ggc cgc gcg ccc gag ggc cac atg ctg 1342 Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Glu Gly His Met Leu 435 440 445 ctg ctc aac tac atc ggc ggc acc acc aac cgc ggc atc gtc aac cag 1390 Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Gly Ile Val Asn Gln 450 455 460 acc acc gag cag ctg gtg gag cag gtg gac aag gac ctg cgc aac atg 1438 Thr Thr Glu Gln Leu Val Glu Gln Val Asp Lys Asp Leu Arg Asn Met 465 470 475 gtc atc aag ccc gac gcg ccc aag ccc cgt gtg gtg ggc gtg cgc gtg 1486 Val Ile Lys Pro Asp Ala Pro Lys Pro Arg Val Val Gly Val Arg Val 480 485 490 495 tgg ccg cgc gcc atc ccg cag ttc aac ctg ggc cac ctg gag cag ctg 1534 Trp Pro Arg Ala Ile Pro Gln Phe Asn Leu Gly His Leu Glu Gln Leu 500 505 510 gac aag gcg cgc aag gcg ctg gac gcg gcg ggg ctg cag ggc gtg cac 1582 Asp Lys Ala Arg Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Leu Gln Gly Val His 515 520 525 ctg ggg ggc aac tac gtc agc ggt gtg gcc ctg ggc aag gtg gtg gag 1630 Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Lys Val Val Glu 530 535 540 cac ggc tac gag tcc gca gcc aac ctg gcc aag agc gtg tcc aag gcc 1678 His Gly Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Leu Ala Lys Ser Val Ser Lys Ala 545 550 555 gca gtc aag gcc taa gcggctgcag cagtagcagc agcagcatcg ggctgtagct 1733 Ala Val Lys Ala 560 563 ggtaaatgcc gcagtggcac cggcagcagc aattggcaag cacttggggc aagcggagtg 1793 gaggcgaggg gggggctacc attggcgctt gctgggatgt gtagt 1838 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for amplifying a DNA fragment containing a Chlamydomonas reinhardtii-derived PPO gene <400> 11 aatgatgttg acccagactc ctgggacc 28 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for amplifying a DNA fragment containing a Chlamydomonas reinhardtii-derived PPO gene <400> 12 tactacacat cccagcaagc gccaatg 27 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for constructing a vector for expressing a Chlamydomonas reinhardtii-derived PPO gene in Escherichia coli <400> 13 tcgagctcaa tgatgttgac ccagactcct gg 32 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer used for constructing a vector for expressing a Chlamydomonas reinhardtii-derived PPO gene in Escherichia coli <400> 14 ttgtcgacta ctacacatcc cagcaagcgc ca 32

【図面の簡単な説明】

【図１】ラット由来のプロトポルフィリノーゲンオキシ
ダーゼcDNA全長を含有するベクターの構築方法を示す。
「PPO fragment 1」は実施例2のポリメラーゼチェイン
反応により得られたDNA断片を、「PPO fragment 2」は
実施例1で得られたクローンが有するDNA断片を、「PP
O」はラット由来プロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼcDNAを示し、その他の記号は制限酵素認識部位を示
す。

【図２】ラット由来のプロトポルフィリノーゲンオキシ
ダーゼを大腸菌に導入して発現させるために構築される
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ発現ベクターの
構築方法を示す。「PPO」はラット由来プロトポルフィ
リノーゲンオキシダーゼcDNAを、「lacZ」はベーターガ
ラクトシダーゼ遺伝子を示し、その他の記号は制限酵素
認識部位を示す。

【図３】lacリプレッサーを大腸菌に導入して発現させ
るために構築されるlacリプレッサー発現ベクターの構
築方法を示す。「lac repr.」はlacリプレッサー遺伝子
を、「Tet」はテトラサイクリン耐性遺伝子を、その他
の記号は制限酵素認識部位を示す。

【図４】ラットプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
活性に対する化合物の阻害能試験に供した化合物の構造
を示す。

【図５】ラット由来のプロトポルフィリノーゲンオキシ
ダーゼを植物細胞に導入して発現させるために構築され
る直接導入用プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ発
現ベクターの構築方法を示す。「35S」はカリフラワー
モザイクウィルス由来の35Sプロモーターを、「NOS」は
アグロバクテリウム由来のノパリンシンターゼターミネ
ーターを、「PPO」はラット由来のプロトポルフィリノ
ーゲンオキシダーゼcDNAを、その他の記号は制限酵素認
識部位を示す。

【図６】ラット由来のプロトポルフィリノーゲンオキシ
ダーゼを植物細胞に導入して発現させるために構築され
る間接導入用プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ発
現ベクターの構築方法を示す。「35S」はカリフラワー
モザイクウィルス由来の35Sプロモーターを、「NOS」は
アグロバクテリウム由来のノパリンシンターゼターミネ
ーターを、「PPO」はラット由来のプロトポルフィリノ
ーゲンオキシダーゼcDNAを、「NTPII」はカナマイシン
耐性遺伝子を、「NOSp」はアグロバクテリウム由来のノ
パリンシンターゼプロモーターを、「LB」および「RB」
はそれぞれアグロバクテリウムT-DNA由来の左端境界塩
基配列および右端境界塩基配列を、その他の記号は制限
酵素認識部位を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシ
   ダーゼ活性阻害能を評価する方法であって、（１）プロ
   トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能
   の欠損した宿主細胞に、宿主細胞内で機能可能なプロモ
   ーター、およびプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
   遺伝子が機能可能な形で結合されてなるＤＮＡ断片が導
   入されてなり、前記ＤＮＡ断片に在するプロトポルフィ
   リノーゲンオキシダーゼ遺伝子を発現する形質転換体
   を、被験化合物の存在下または非存在下に、プロトポル
   フィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損
   を補完する化合物を実質的に含まない培地で培養して各
   条件下における該形質転換体の増殖度を測定する工程、
   （２）該増殖度の差異に基づき被験化合物の接触による
   前記形質転換体の増殖阻害度を求め、被験化合物のプロ
   トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性阻害能を判定す
   る工程、を含むことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシ
   ダーゼ活性阻害能を評価する方法であって、（１）プロ
   トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能
   の欠損した宿主細胞に、宿主細胞内で機能可能なプロモ
   ーター、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝
   子、および宿主細胞内で機能可能なターミネーターが機
   能可能な形で結合されてなるＤＮＡ断片が導入されてな
   り、前記ＤＮＡ断片に在するプロトポルフィリノーゲン
   オキシダーゼ遺伝子を発現する形質転換体を、被験化合
   物の存在下または非存在下に、プロトポルフィリノーゲ
   ンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損を補完する化
   合物を実質的に含まない培地で培養して各条件下におけ
   る該形質転換体の増殖度を測定する工程、（２）該増殖
   度の差異に基づき被験化合物の接触による前記形質転換
   体の増殖阻害度を求め、被験化合物のプロトポルフィリ
   ノーゲンオキシダーゼ活性阻害能を判定する工程、を含
   むことを特徴とする方法。
3. 【請求項３】化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシ
   ダーゼ活性阻害能を評価する方法であって、（１）プロ
   トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能
   の欠損した宿主細胞に、（ａ）宿主細胞内で機能可能で
   ありかつ転写活性が制御されうるプロモーター、および
   プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が機能可
   能な形で結合されてなるＤＮＡ断片、および（ｂ）該Ｄ
   ＮＡ断片のプロモーターの転写活性を制御可能な遺伝
   子、および該遺伝子により転写活性を制御されずかつ宿
   主細胞内で機能可能なプロモーターが機能可能な形で結
   合されてなるＤＮＡ断片が導入されてなり、（ａ）のＤ
   ＮＡ断片に在するプロトポルフィリノーゲンオキシダー
   ゼ遺伝子を発現する形質転換体を、被験化合物の存在下
   または非存在下に、プロトポルフィリノーゲンオキシダ
   ーゼ活性に基づく増殖能の欠損を補完する化合物を実質
   的に含まない培地で培養して各条件下における該形質転
   換体の増殖度を測定する工程、（２）該増殖度の差異に
   基づき被験化合物の接触による前記形質転換体の増殖阻
   害度を求め、被験化合物のプロトポルフィリノーゲンオ
   キシダーゼ活性阻害能を判定する工程、を含むことを特
   徴とする方法。
4. 【請求項４】化合物のプロトポルフィリノーゲンオキシ
   ダーゼ活性阻害能を評価する方法であって、（１）プロ
   トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能
   の欠損した宿主細胞に、（ａ）宿主細胞内で機能可能で
   ありかつ転写活性が制御されうるプロモーター、プロト
   ポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子、および宿主細
   胞内で機能可能なターミネーターが機能可能な形で結合
   されてなるＤＮＡ断片、および（ｂ）該ＤＮＡ断片のプ
   ロモーターの転写活性を制御可能な遺伝子、該遺伝子に
   より転写活性を制御されずかつ宿主細胞内で機能可能な
   プロモーターおよび宿主細胞内で機能可能なターミネー
   ターが機能可能な形で結合されてなるＤＮＡ断片が導入
   されてなり、（ａ）のＤＮＡ断片に在するプロトポルフ
   ィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を発現する形質転換体
   を、被験化合物の存在下または非存在下に、プロトポル
   フィリノーゲンオキシダーゼ活性に基づく増殖能の欠損
   を補完する化合物を実質的に含まない培地で培養して各
   条件下における該形質転換体の増殖度を測定する工程、
   （２）該増殖度の差異に基づき被験化合物の接触による
   前記形質転換体の増殖阻害度を求め、被験化合物のプロ
   トポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性阻害能を判定す
   る工程、を含むことを特徴とする方法。
5. 【請求項５】プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
   伝子が動物または植物に由来するプロトポルフィリノー
   ゲンオキシダーゼ遺伝子である請求項１〜４記載の方
   法。
6. 【請求項６】プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
   伝子がラットまたはコナミドリムシに由来するプロトポ
   ルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子である請求項１〜
   ５記載の方法。
7. 【請求項７】宿主細胞が微生物である請求項１〜６記載
   の方法。
8. 【請求項８】プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活
   性を有するタンパク質をコードするラット由来の遺伝
   子。
9. 【請求項９】配列番号１で示されるアミノ酸配列からな
   るタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲンオ
   キシダーゼ遺伝子。
10. 【請求項１０】プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
    活性を有し、配列番号1で示されるアミノ酸配列におい
    て1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾もしく
    は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
    する遺伝子。
11. 【請求項１１】配列番号1で示されるアミノ酸配列をコ
    ードする塩基配列を有するプロトポルフィリノーゲンオ
    キシダーゼ遺伝子。
12. 【請求項１２】配列番号2で示される塩基配列を有する
    プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子。
13. 【請求項１３】請求項８〜１２記載のプロトポルフィリ
    ノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列を有するＤ
    ＮＡ断片。
14. 【請求項１４】請求項８〜１２記載のプロトポルフィリ
    ノーゲンオキシダーゼ遺伝子を含有するベクター。
15. 【請求項１５】請求項８〜１２記載の遺伝子を含有する
    ベクターであって、（1）宿主細胞内で機能可能なプロ
    モーター、および（2）請求項８〜１２記載のプロトポ
    ルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子が機能可能な形で
    結合されてなるＤＮＡ断片を含有するベクター。
16. 【請求項１６】請求項８〜１２記載の遺伝子を含有する
    ベクターであって、（1）宿主細胞内で機能可能なプロ
    モーター、（2）請求項８〜１２記載のプロトポルフィ
    リノーゲンオキシダーゼ遺伝子、および（3）宿主細胞
    内で機能可能なターミネーターが機能可能な形で結合さ
    れてなるＤＮＡ断片を含有するベクター。
17. 【請求項１７】請求項１４〜16記載のベクターが宿主細
    胞に導入されてなる形質転換体。
18. 【請求項１８】宿主細胞が微生物である請求項１７記載
    の形質転換体。
19. 【請求項１９】宿主細胞が植物である請求項１７記載の
    形質転換体。
20. 【請求項２０】プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
    活性を有するタンパク質をコードするコナミドリムシ由
    来の遺伝子。
21. 【請求項２１】配列番号９で示されるアミノ酸配列から
    なるタンパク質をコードするプロトポルフィリノーゲン
    オキシダーゼ遺伝子。
22. 【請求項２２】プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ
    活性を有し、配列番号9で示されるアミノ酸配列におい
    て1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾もしく
    は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
    する遺伝子。
23. 【請求項２３】配列番号9で示されるアミノ酸配列をコ
    ードする塩基配列を有するプロトポルフィリノーゲンオ
    キシダーゼ遺伝子。
24. 【請求項２４】配列番号10で示される塩基配列を有する
    プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子。
25. 【請求項２５】請求項２０〜２４に記載のプロトポルフ
    ィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列を有す
    るＤＮＡ断片。
26. 【請求項２６】請求項２０〜２４記載のプロトポルフィ
    リノーゲンオキシダーゼ遺伝子を含有するベクター。
27. 【請求項２７】請求項２０〜２４記載の遺伝子を含有す
    るベクターであって、（1）宿主細胞内で機能可能なプ
    ロモーター、および（2）請求項２０〜２４記載のプロ
    トポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺が機能可能な形で
    結合されてなるＤＮＡ断片を含有するベクター。
28. 【請求項２８】請求項２０〜２４記載の遺伝子を含有す
    るベクターであって、（1）宿主細胞内で機能可能なプ
    ロモーター、（2）請求項２０〜２４記載のプロトポル
    フィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子、および（3）宿主
    細胞内で機能可能なターミネーターが機能可能な形で結
    合されてなるＤＮＡ断片を含有するベクター。
29. 【請求項２９】請求項２６〜２８記載のベクターが宿主
    細胞に導入されてなる形質転換体。
30. 【請求項３０】宿主細胞が微生物である請求項２９記載
    の形質転換体。
31. 【請求項３１】宿主細胞が植物である請求項２９記載の
    形質転換体。