JPH1118775A - プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドおよびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を効率よくクローニング
するためのプライマー用オリゴヌクレオチド等を提供す
る。 【解決手段】下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列か
らなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。 （ａ）GGITTPGGICAQPTICAPCCIAGIACICAAGG（配列番号
1） （ｂ）GGITTPGGICAQPTICAPCCIAGIACICAGGG（配列番号
2） （ｃ）GGITTPGGICAQPTICAPCCICGIACICAAGG（配列番号
3） （ｄ）GGITTPGGICAQPTICAPCCICGIACICAGGG（配列番号
4） （ｅ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCACC（配列番号5） （ｆ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCCCC（配列番号6） （ｇ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCGCC（配列番号7） （ｈ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCTCC（配列番号8） （ここで、Aはアデニンを表し、Cはシトシンを表し、G
はグアニンを表し、Tはチミンを表し、Iはイノシンを表
し、Pは4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-c][1,
2]オキサジン-7-オンを表し、Qは6-(メトキシイミノ)-
6,9-ジヒドロ-1H-2-プリンアミンを表す。）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロトポルフィリ
ノーゲンオキシダーゼ（protoporphyrinogen IXoxidas
e；EC 1.3.3.4）遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドおよ
びその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】プロトポルフィリンは光合成、エネルギ
ー代謝等の生命活動に関わる重要な物質である。植物は
５-アミノレブリン酸を初発とするポルフィリン生合成
系を持ち、プロトポルフィリンを生産する。ポルフィリ
ン生合成系の最後の段階であるプロトポルフィリノーゲ
ンを酸化しプロトポルフィリンを生成する反応を触媒す
る酵素が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（以
下、ＰＰＯと記す。）である（ R.J.Porra,and J.E.Fal
k、1964年、Biochem. J. 9巻、69−75頁）。そこで、遺
伝子組換え技術を用いて植物におけるＰＰＯの活性や薬
剤感受性を改変することにより該植物のポルフィリン生
合成を人工的に調節することができれば、植物の光合成
能やエネルギー代謝能力を向上させて早生・多収品種を
創出することや、ＰＰＯ活性を阻害する光要求性型除草
剤に対する耐性品種を創出することが可能となる。この
ような植物育種を行うには、種々のＰＰＯ遺伝子をクロ
ーニングして育種目的に適した性質を有するＰＰＯ遺伝
子を探索する必要がある。しかしながらこれまでに、微
生物由来のＰＰＯ遺伝子として、大腸菌、枯草菌等由来
の遺伝子、動物由来のＰＰＯ遺伝子として、マウス、ヒ
ト由来の遺伝子、植物由来のＰＰＯ遺伝子として、シロ
イヌナズナ、トウモロコシ、緑藻由来の遺伝子がクロー
ニングされているに過ぎない。これらＰＰＯ遺伝子をク
ローニングする方法として、ＰＰＯ活性を指標にして目
的のＰＰＯ遺伝子を選抜する方法や、塩基配列またはア
ミノ酸配列の相同性を利用して目的のＰＰＯ遺伝子を取
得する方法がある。前者の方法は、具体的には、目的の
ＰＰＯ遺伝子が欠損している微生物における導入遺伝子
の欠損ＰＰＯ遺伝子に対する相補能力を指標とする方
法、微生物にＰＰＯ活性を付与する能力を指標とする方
法などである。後者の方法は、具体的には、ポリメラー
ゼチェイン反応法、サザンハイブリダイゼーション法な
どである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、ＰＰＯ活性を
指標にして目的のＰＰＯ遺伝子を選抜する方法では、Ｐ
ＰＯ活性のあるクローンはすべて陽性として選抜される
ため、タイプの異なる遺伝子を区別して取得することは
できない。一方、塩基配列またはアミノ酸配列の相同性
を利用して目的のＰＰＯ遺伝子を選抜する方法は、特定
のタイプのＰＰＯ遺伝子をクローニングすることはでき
るものの、用いられるプライマーまたはプローブの配列
によって遺伝子の選抜が困難となるという問題があっ
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を効率よくクローニング
するためのプライマー用オリゴヌクレオチドについて鋭
意研究を行った結果、特定の塩基配列からなる葉緑体型
ＰＰＯ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドを見出すことに
成功し、本発明に至った。即ち、本発明は、 １）下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列からなるこ
とを特徴とするオリゴヌクレオチド （ａ）GGITTPGGICAQPTICAPCCIAGIACICAAGG（配列番号
1） （ｂ）GGITTPGGICAQPTICAPCCIAGIACICAGGG（配列番号
2） （ｃ）GGITTPGGICAQPTICAPCCICGIACICAAGG（配列番号
3） （ｄ）GGITTPGGICAQPTICAPCCICGIACICAGGG（配列番号
4） （ｅ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCACC（配列番号5） （ｆ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCCCC（配列番号6） （ｇ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCGCC（配列番号7） （ｈ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCTCC（配列番号8） （ここで、Aはアデニンを表し、Cはシトシンを表し、G
はグアニンを表し、Tはチミンを表し、Iはイノシンを表
し、Pは式 化５

【化５】 を表し、Qは式 化６

【化６】 を表し、Pを塩基とするデオキシリボヌクレオシドは式
化７

【化７】 で示され、Qを塩基とするデオキシリボヌクレオシドは
式 化８

【化８】 で示される。）（以下、本発明オリゴヌクレオチドと記
す。）、 ２）植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼチェイン
反応において、請求項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴ
ヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1記載の（ｅ）〜
（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つとをプラ
イマーとして用いてDNA断片を増幅することを特徴とす
る葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝
子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得方法、 ３）高等植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼチェ
イン反応において、前項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリ
ゴヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1記載の（ｅ）
〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つとをプ
ライマーとして用いてDNA断片を増幅することを特徴と
する葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得方法、 ４）双子葉植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼチ
ェイン反応において、前項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオ
リゴヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1記載の
（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ
とをプライマーとして用いてDNA断片を増幅することを
特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得方
法、 ５）マメ科植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼチ
ェイン反応において、前項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオ
リゴヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1記載の
（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ
とをプライマーとして用いてDNA断片を増幅することを
特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得方
法、 ６）ダイズ植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼチ
ェイン反応において、前項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオ
リゴヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1記載の
（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ
とをプライマーとして用いてDNA断片を増幅することを
特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得方
法、 ７）エンドウ植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼ
チェイン反応において、前項1記載の（ａ）〜（ｄ）の
オリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1記載の
（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ
とをプライマーとして用いてDNA断片を増幅することを
特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得方
法、 ８）ナス科植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼチ
ェイン反応において、前項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオ
リゴヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1記載の
（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ
とをプライマーとして用いてDNA断片を増幅することを
特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得方
法、 ９）タバコ植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼチ
ェイン反応において、前項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオ
リゴヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1記載の
（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ
とをプライマーとして用いてDNA断片を増幅することを
特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得方
法、 １０）ジャガイモ植物由来のDNAを鋳型とするポリメラ
ーゼチェイン反応において、前項1記載の（ａ）〜
（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1
記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくと
も1つとをプライマーとして用いてDNA断片を増幅するこ
とを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキ
シダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得
方法、 １１）植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼチェイ
ン反応で増幅されるDNA断片であって、前項1記載の
（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ
と、前項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチド
の少なくとも1つとをプライマーとして用いて増幅され
ることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片、 １２）高等植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼチ
ェイン反応で増幅されるDNA断片であって、前項1記載の
（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ
と、前項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチド
の少なくとも1つとをプライマーとして用いて増幅され
ることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片、 １３）双子葉植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼ
チェイン反応で増幅されるDNA断片であって、前項1記載
の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1
つと、前項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチ
ドの少なくとも1つとをプライマーとして用いて増幅さ
れることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断
片、 １４）マメ科植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼ
チェイン反応で増幅されるDNA断片であって、前項1記載
の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1
つと、前項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチ
ドの少なくとも1つとをプライマーとして用いて増幅さ
れることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断
片、 １５）ダイズ植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼ
チェイン反応で増幅されるDNA断片であって、前項1記載
の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1
つと、前項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチ
ドの少なくとも1つとをプライマーとして用いて増幅さ
れることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断
片、 １６）エンドウ植物由来のDNAを鋳型とするポリメラー
ゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であって、前項1記
載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも
1つと、前項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチ
ドの少なくとも1つとをプライマーとして用いて増幅さ
れることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断
片、 １７）ナス科植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼ
チェイン反応で増幅されるDNA断片であって、前項1記載
の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1
つと、前項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチ
ドの少なくとも1つとをプライマーとして用いて増幅さ
れることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断
片、 １８）タバコ植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼ
チェイン反応で増幅されるDNA断片であって、前項1記載
の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1
つと、前項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチ
ドの少なくとも1つとをプライマーとして用いて増幅さ
れることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲ
ンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断
片、 １９）ジャガイモ植物由来のDNAを鋳型とするポリメラ
ーゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であって、前項1
記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくと
も1つと、前項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオ
チドの少なくとも1つとをプライマーとして用いて増幅
されることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノー
ゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断
片、 ２０）工程（Ｃ）〜（Ｅ）を１回以上含む以下の工程か
らなることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノー
ゲンオキシダーゼ遺伝子の取得方法、 （Ａ）植物由来のDNAを鋳型とし、前項1記載の（ａ）〜
（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、前項1
記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくと
も1つとをプライマーとして用いて、葉緑体型プロトポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列か
らなるDNA断片をポリメラーゼチェイン反応で増幅す
る。 （Ｂ）増幅されたDNA断片の塩基配列を決定する。 （Ｃ）前記（Ｂ）で決定された塩基配列の中の15bpから
40bpの塩基配列を有する3'下流領域増幅用プライマー、
および、前記（Ｂ）で決定された塩基配列に相補的な塩
基配列の中の15bpから40bpの塩基配列を有する5'上流領
域増幅用プライマーを作製する。 （Ｄ）植物由来のDNAの末端にアダプターDNAが付加され
てなるDNA断片を鋳型とし、アダプターDNAの部分塩基配
列を有するプライマーと前記（Ｃ）で作製された5'上流
領域増幅用プライマーとの組み合わせおよびアダプター
DNAの部分塩基配列を有するプライマーと前記（Ｃ）で
作製された3'下流領域増幅用プライマーとの組み合わせ
を用い、前記（Ｂ）で決定された塩基配列の5'上流側の
塩基配列を含むDNA断片および前記（Ｂ）で決定された
塩基配列の3'下流側の塩基配列を含むDNA断片をポリメ
ラーゼチェイン反応で増幅する。 （Ｅ）前記（Ｄ）で増幅された2種のDNA断片の塩基配列
を決定し、決定された塩基配列と前記（Ｂ）で決定され
た塩基配列において重複する領域を重ね合せてこれらの
塩基配列を連結することにより一つの塩基配列を作成す
る。 （Ｆ）前記（Ｅ）で作成された塩基配列の情報をもと
に、葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
伝子の塩基配列の5'非翻訳領域の塩基配列を含む15bpか
ら40bpの塩基配列を持つN末端プライマーおよび3'非翻
訳領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む15bpから40
bpの塩基配列を持つC末端プライマーを作製し、植物由
来のDNAを鋳型としかつ前記両末端プライマーを用い
て、葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
伝子をポリメラーゼチェイン反応で増幅し、単離する
か、または、前記（Ａ）および（Ｄ）で増幅されたDNA
断片を、重複している領域に存在する制限酵素認識部位
で結合し葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼ遺伝子を合成し、単離する。（ここで、（Ｃ）〜
（Ｅ）の繰り返し工程においては「（Ｂ）」を「前回の
（Ｅ）」と読み替える。） ２１）工程（Ａ）（Ｂ）に続き工程（Ｃ）〜（Ｅ）を少
なくとも１回実施した後、（Ｂ）で決定された塩基配列
の5'上流側の塩基配列を含むDNA断片および（Ｂ）で決
定された塩基配列の3'下流側の塩基配列を含むDNA断片
のいずれかの増幅についてのみ工程（Ｃ）〜（Ｅ）を１
回以上繰り返し行うことを特徴とする前項２０記載の葉
緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の
取得方法、 ２２）鋳型として用いられる植物由来のDNAが高等植物
由来のDNAであることを特徴とする前項20または21記載
の取得方法、 ２３）鋳型として用いられる植物由来のDNAが双子葉植
物由来のDNAであることを特徴とする前項20または21記
載の取得方法、 ２４）鋳型として用いられる植物由来のDNAがマメ科植
物由来のDNAであることを特徴とする前項20または21記
載の取得方法、 ２５）鋳型として用いられる植物由来のDNAがダイズ植
物由来のDNAであることを特徴とする前項20または21記
載の取得方法、 ２６）鋳型として用いられる植物由来のDNAがエンドウ
植物由来のDNAであることを特徴とする前項20または21
記載の取得方法、 ２７）鋳型として用いられる植物由来のDNAがナス科植
物由来のDNAであることを特徴とする前項20または21記
載の取得方法、 ２８）鋳型として用いられる植物由来のDNAがタバコ植
物由来のDNAであることを特徴とする前項20または21記
載の取得方法、 ２９）鋳型として用いられる植物由来のDNAがジャガイ
モ植物由来のDNAであることを特徴とする前項20または2
1記載の取得方法、 ３０）前項24、25、26、27、28または29記載の取得方法
により得られることを特徴とする葉緑体型プロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子、 ３１）植物由来のDNAに対して前項2、3、4、5、6、7、
8、9または10記載の方法によって得られるDNA断片をプ
ローブとしてハイブリダイズさせるハイブリダイゼーシ
ョンにより葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ遺伝子を特定し、該遺伝子を単離する工程からなる
ことを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオ
キシダーゼ遺伝子の取得方法、 ３２）ハイブリダイゼーションに用いられる植物由来の
DNAが高等植物由来のDNAであることを特徴とする前項31
記載の取得方法、 ３３）ハイブリダイゼーションに用いられる植物由来の
DNAが双子葉植物由来のDNAであることを特徴とする前項
31記載の取得方法、 ３４）ハイブリダイゼーションに用いられる植物由来の
DNAがマメ科植物由来のDNAであることを特徴とする前項
31記載の取得方法、 ３５）ハイブリダイゼーションに用いられる植物由来の
DNAがダイズ植物由来のDNAであることを特徴とする前項
31記載の取得方法、 ３６）ハイブリダイゼーションに用いられる植物由来の
DNAがエンドウ植物由来のDNAであることを特徴とする前
項31記載の取得方法、 ３７）ハイブリダイゼーションに用いられる植物由来の
DNAがナス科植物由来のDNAであることを特徴とする前項
31記載の取得方法、 ３８）ハイブリダイゼーションに用いられる植物由来の
DNAがタバコ植物由来のDNAであることを特徴とする前項
31記載の取得方法、 ３９）ハイブリダイゼーションに用いられる植物由来の
DNAがジャガイモ植物由来のDNAであることを特徴とする
前項31記載の取得方法、 ４０）前項31、32、33、34、35、36、37、38または39記
載の方法により得られることを特徴とする葉緑体型プロ
トポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子、 ４１）配列番号９で示されるアミノ酸配列または該アミ
ノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸配列が欠
損、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタ
ンパク質をコードすることを特徴とする葉緑体型プロト
ポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子、 ４２）配列番号9に示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有することを特徴とする前項41記載の葉緑体
型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子、 ４３）配列番号10に示される塩基配列を有することを特
徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼ遺伝子、 ４４）配列番号11に示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有することを特徴とする葉緑体移送シグナル
ペプチドをコードするDNA断片（以下、本発明シグナル
ペプチドと記す。）、 ４５）配列番号12に示される塩基配列を有することを特
徴とする葉緑体移送シグナルペプチドをコードするDNA
断片、 ４６）配列番号13に示される塩基配列を有することを特
徴とするダイズゲノムDNA由来の葉緑体型プロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子、 ４７）前項41、42、43または46記載の葉緑体型プロトポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を含有することを
特徴とするプラスミド（以下、本発明プラスミドと記
す。）、 ４８）（1）宿主細胞内で機能可能なプロモーター、
（2）前項41、42、43または46記載の遺伝子および（3）
宿主細胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形
で前記の順序となるよう結合させることを特徴とする発
現プラスミドの構築方法、 ４９）（1）宿主細胞内で機能可能なプロモーター、
（2）前項41、42、43または46記載の遺伝子および（3）
宿主細胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形
で前記の順序となるよう結合させてなることを特徴とす
る発現プラスミド（以下、本発明発現プラスミドと記
す。）、 ５０）（1）宿主細胞内で機能可能なプロモーター、
（2）前項41、42、43または46記載の遺伝子および（3）
宿主細胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形
で前記の順序となるよう結合させてなる発現プラスミド
を宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換させること
により形質転換体のプロトポルフィリノーゲンオキシダ
ーゼ活性を増強することを特徴とするプロトポルフィリ
ノーゲンオキシダーゼ活性の増強方法、 ５１）前項47記載のプラスミドまたは前項49記載の発現
プラスミドが宿主生物に導入されてなることを特徴とす
る形質転換体、 ５２）宿主生物が微生物であることを特徴とする前項51
記載の形質転換体、 ５３）宿主生物が植物であることを特徴とする前項51記
載の形質転換体、 ５４）配列番号14で示される塩基配列を有することを特
徴とするプロモーター（以下、本発明プロモーターと記
す。）、 ５５）前項54記載のプロモーターを含有することを特徴
とするプラスミド、 ５６）前項55記載のプラスミドが宿主生物に導入されて
なることを特徴とする形質転換体、を提供するものであ
る。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。

【０００６】本発明オリゴヌクレオチドは、例えば、Cu
rrent Protocols In Molecular Biology（F.M.Ausubel
ら編集、John Wiley＆Sons,Inc. 1997年）2.11等に記載
のフォスフォアミダイト法等で化学的に合成することに
より調製することができ、市販のDNA合成装置、例え
ば、PEアプライドシステム社の394DNA/RNA Synthesyzer
等を用いて合成することもできる。

【０００７】本発明オリゴヌクレオチドを葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子増幅用プライマーとして以下のように利用する
ことにより葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列を有す
るDNA断片を得ることができる。例えば、ダイズ、エン
ドウ等のマメ科植物、タバコ、ジャガイモ等のナス科植
物等の双子葉植物で代表される植物由来のDNAを鋳型と
し、かつ配列番号1〜4に示される塩基配列からなる本発
明オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｄ）の少なくとも一つ
と、配列番号5〜8に示される塩基配列からなる本発明オ
リゴヌクレオチド（ｅ）〜（ｈ）の少なくとも一つとを
プライマーとして用いてポリメラーゼチェイン反応を行
うことにより、葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列か
らなるDNA断片を増幅することができる。具体的には、
ポリメラーゼチェイン反応において鋳型に用いるDNAと
しては、植物に由来するcDNAまたはゲノムDNAを用いる
ことができ、これらは、例えば、クローニングとシーク
エンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡
辺、杉浦編集、農村文化社1989年）等に記載される方法
で植物体から調製することができる。また、植物由来の
cDNAもしくはゲノムDNAを用いて、例えば、クローニン
グとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュ
アル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）等に記載さ
れる方法で作製したcDNAライブラリーもしくはゲノムラ
イブラリーからMolecular Cloning 2nd edition（J.Sam
brook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbo
r Laboratory Press 1989年）等に記載される方法で調
製したDNA、または、市販のcDNAライブラリーもしくは
ゲノムライブラリーから同様の方法で調製したDNAを鋳
型として利用することもできる。ポリメラーゼチェイン
反応の反応液は、これらのDNAを終濃度0.05μMから4.0
μM、好ましくは終濃度0.1μMから2.0μMとなるように
含有し、プライマーとして配列番号1〜4に示される塩基
配列からなる本発明オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｄ）
の少なくとも一つと、配列番号5〜8に示される塩基配列
からなる本発明オリゴヌクレオチド（ｅ）〜（ｈ）の少
なくとも一つとをそれぞれ、例えば、終濃度10μMから5
00μM、好ましくは、終濃度100μMから200μMとなるよ
うに含有し、DNAポリメラーゼとして、市販の耐熱性DNA
ポリメラーゼ、例えば、Taqポリメラーゼ（東洋紡社
製）、Tthポリメラーゼ（東洋紡社製）、もしくはPfuポ
リメラーゼ（STRATAGENE社製）等、または複数の耐熱性
DNAポリメラーゼを混合した酵素液、例えば、ExTaqポリ
メラーゼ（宝酒造社製）、KlenTaqポリメラーゼ（Clont
ech社製）等を、例えば、終濃度1unit/μlから4unit/μ
l、好ましくは2unit/μlから3unit/μlとなるように含
有し、4種類の塩基（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）をそれ
ぞれ、例えば、終濃度50μMから500μM、好ましくは100
μMから300μMとなるように含有するよう調製する。ポ
リメラーゼチェイン反応を行うバッファーとしては、マ
グネシウムイオンを、例えば、0.5mMから5mMの終濃度、
好ましくは3mMから4mMの終濃度となるよう含有し、カリ
ウムイオンを、例えば、10mMから50mMの終濃度となるよ
う含有し、72℃でpHが8.3から8.8となるようTris-HCl、
Tricine-KOH等で調製されたバッファーを用いることが
できる。ポリメラーゼチェイン反応は、例えば、20回か
ら50回、好ましくは25回から40回DNA増幅工程を繰り返
して行い、市販のサーマルサイクラー、例えば、GeneAm
p2400（PEアプライドバイオシステムズ社製）またはTP-
3000（宝酒造社製）等を用いることにより行うことがで
きる。DNA増幅工程の各工程において、変性工程は、例
えば、90℃から95℃にて10秒間から3分間、好ましくは9
4℃から95℃にて30秒間から2分間保温することにより行
い、アニーリング工程は、例えば、40℃から60℃にて1
分間から3分間、好ましくは50℃から55℃にて1分間から
2分間保温することにより行い、ポリメラーゼによる伸
長工程は、例えば、70℃から74℃にて1分間から5分間、
好ましくは72℃から73℃にて2分間から3分間保温するこ
とにより行う。このようなポリメラーゼチェイン反応に
よって増幅されたDNA断片は、Molecular Cloning 2nd e
dition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989年）等に記載さ
れる方法、または市販のDNAクローニングキット、例え
ば、TA cloning kit（Invitrogen社製）等を用いること
によりプラスミドにクローニングし、塩基配列の分析に
供することができる。塩基配列の分析は、例えば、 Mol
ecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisc
h, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss 1989年）13.42から13.74等に記載されるダイデオキ
シ法によって行うことができる。また、蛍光ラベルされ
たダイデオキシヌクレオチドを用いるシークエンスキッ
ト、例えば、Dye terminator cycle sequencing kit（P
Eアプライドバイオシステムズ社製）等を利用し、市販
のオートシークエンサー、例えば、DNAシークエンサー3
73S（PEアプライドバイオシステムズ社製）等を用いる
ことにより塩基配列を分析することもできる。上記のよ
うにして得られた葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を有するDNA断片（以下、本発明DNA断片と記す。）は、
例えば、後述のポリメラーゼチェイン反応法を利用する
葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の取得方法において葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子特異的なプライマーを作製する際に利用した
り、また、後述のハイブリダイゼーション法を利用する
葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の取得方法において葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子検出用プローブとして使用することができる。

【０００８】次に、葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の取得方法に
ついて述べる。葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を取得するには、
例えば、工程（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ）を1回以上含む以下の
（Ａ）から（Ｆ）の工程からなる方法（以下、本発明Ｐ
ＣＲ反応取得法と記す。）を用いることができる。 （Ａ）植物由来のDNAを鋳型とし、請求項1記載の（ａ）
〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請
求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少
なくとも1つとをプライマーとして用いて、葉緑体型プ
ロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基
配列からなるDNA断片をポリメラーゼチェイン反応で増
幅する。 （Ｂ）増幅されたDNA断片の塩基配列を決定する。 （Ｃ）前記（Ｂ）で決定された塩基配列の中の15bpから
40bpの塩基配列を有する3'下流領域増幅用プライマー、
および、前記（Ｂ）で決定された塩基配列に相補的な塩
基配列の中の15bpから40bpの塩基配列を有する5'上流領
域増幅用プライマーを作製する。 （Ｄ）植物由来のDNAの末端にアダプターDNAが付加され
てなるDNA断片を鋳型とし、アダプターDNAの部分塩基配
列を有するプライマーと前記（Ｃ）で作製された5'上流
領域増幅用プライマーとの組み合わせおよびアダプター
DNAの部分塩基配列を有するプライマーと前記（Ｃ）で
作製された3'下流領域増幅用プライマーとの組み合わせ
を用い、前記（Ｂ）で決定された塩基配列の5'上流側の
塩基配列を含むDNA断片および前記（Ｂ）で決定された
塩基配列の3'下流側の塩基配列を含むDNA断片をポリメ
ラーゼチェイン反応で増幅する。 （Ｅ）前記（Ｄ）で増幅された2種のDNA断片の塩基配列
を決定し、決定された塩基配列と前記（Ｂ）で決定され
た塩基配列において重複する領域を重ね合せてこれらの
塩基配列を連結することにより一つの塩基配列を作成す
る。 （Ｆ）前記（Ｅ）で作成された塩基配列の情報をもと
に、葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
伝子の塩基配列の5'非翻訳領域の塩基配列を含む15bpか
ら40bpの塩基配列を持つN末端プライマーおよび3'非翻
訳領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む15bpから40
bpの塩基配列を持つC末端プライマーを作製し、植物由
来のDNAを鋳型としかつ前記両末端プライマーを用い
て、葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
伝子をポリメラーゼチェイン反応で増幅し、単離する
か、または、前記（Ａ）および（Ｄ）で増幅されたDNA
断片を、重複している領域に存在する制限酵素認識部位
で結合し葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼ遺伝子を合成し、単離する。（ここで、（Ｃ）〜
（Ｅ）の繰り返し工程においては「（Ｂ）」を「前回の
（Ｅ）」と読み替える。）

【０００９】（Ａ）において、ポリメラーゼチェイン反
応の鋳型として用いられるDNAとしては、ダイズ、エン
ドウなどのマメ科植物、タバコ、ジャガイモなどのナス
科植物などの双子葉植物で代表される植物に由来するcD
NAまたはゲノムDNAを用いることができ、これらは、例
えば、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノ
ロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社19
89年）等に記載される通常の方法で植物体から調製する
ことができる。また、植物由来のcDNAもしくはゲノムDN
Aを用いて、例えば、クローニングとシークエンス：植
物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編
集、農村文化社1989年）等に記載される方法で作製した
cDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリーからMole
cular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch,
T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press
1989年）等に記載される方法で調製したDNA、または、
市販のcDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリーか
ら同様の方法で調製したDNAを鋳型として利用すること
もできる。ポリメラーゼチェイン反応の反応液は、これ
らのDNAを終濃度0.05μMから4.0μM、好ましくは終濃度
0.1μMから2.0μMとなるように含有し、プライマーとし
て配列番号1〜4に示される塩基配列からなる本発明オリ
ゴヌクレオチド（ａ）〜（ｄ）の少なくとも一つと、配
列番号5〜8に示される塩基配列からなる本発明オリゴヌ
クレオチド（ｅ）〜（ｈ）の少なくとも一つとをそれぞ
れ、例えば、終濃度10μMから500μM、好ましくは、終
濃度100μMから200μMとなるように含有し、DNAポリメ
ラーゼとして、市販の耐熱性DNAポリメラーゼ、例え
ば、Taqポリメラーゼ（東洋紡社製）、Tthポリメラーゼ
（東洋紡社製）、もしくはPfuポリメラーゼ（STRATAGEN
E社製）等、または複数の耐熱性DNAポリメラーゼを混合
した酵素液、例えば、ExTaqポリメラーゼ（宝酒造社
製）、KlenTaqポリメラーゼ（Clontech社製）等を、例
えば、終濃度1unit/μlから4unit/μl、好ましくは2uni
t/μlから3unit/μlとなるように含有し、4種類の塩基
（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）をそれぞれ、例えば、終濃
度50μMから500μM、好ましくは100μMから300μMとな
るように含有するよう調製する。ポリメラーゼチェイン
反応を行うバッファーとしては、マグネシウムイオン
を、例えば、0.5mMから5mMの終濃度、好ましくは3mMか
ら4mMの終濃度となるよう含有し、カリウムイオンを、
例えば、10mMから50mMの終濃度となるよう含有し、72℃
でpHが8.3から8.8となるようTris-HCl、Tricine-KOH等
で調製されたバッファーを用いることができる。ポリメ
ラーゼチェイン反応は、例えば、20回から50回、好まし
くは25回から40回DNA増幅工程を繰り返して行い、市販
のサーマルサイクラー、例えば、GeneAmp2400（PEアプ
ライドバイオシステムズ社製）またはTP-3000（宝酒造
社製）等を用いることにより行うことができる。DNA増
幅工程の各工程において、変性工程は、例えば、90℃か
ら95℃にて10秒間から3分間、好ましくは94℃から95℃
にて30秒間から2分間保温することにより行い、アニー
リング工程は、例えば、40℃から60℃にて1分間から3分
間、好ましくは50℃から55℃にて1分間から2分間保温す
ることにより行い、ポリメラーゼによる伸長工程は、例
えば、70℃から74℃にて1分間から5分間、好ましくは72
℃から73℃にて2分間から3分間保温することにより行
う。（Ｂ）において、ポリメラーゼチェイン反応によっ
て前記（Ａ）で増幅された葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分
塩基配列からなるDNA断片をプラスミドにクローニング
し、塩基配列の分析に供する。該DNA断片のプラスミド
へのクローニングは、Molecular Cloning 2nd edition
（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press 1989年）等に記載される通
常の方法、または市販のDNAクローニングキット、例え
ば、TA cloning kit（Invitrogen社製）等を用い、付属
のマニュアルに準じて操作することで行なうことができ
る。プラスミドにクローニングされたDNA断片の塩基配
列の分析は、例えば、 Molecular Cloning 2nd edition
（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Sprin
gHarbor Laboratory Press 1989年）13.42から13.74等
に記載されるダイデオキシ法等によって行うことができ
る。また、蛍光ラベルされたダイデオキシヌクレオチド
を用いるシークエンスキット、例えば、Dye terminator
cycle sequencing kit（PEアプライドバイオシステム
ズ社製）等を利用し、市販のオートシークエンサー、例
えば、DNAシークエンサー373S（PEアプライドバイオシ
ステムズ社製）等を用いることにより塩基配列を分析す
ることもできる。（Ｃ）において、5'上流領域増幅用プ
ライマーおよび3'下流領域増幅用プライマーの塩基配列
には、前記（Ｂ）で決定された塩基配列に相補的な塩基
配列および前記（Ｂ）で決定された塩基配列の中の、Ｇ
/Ｃ比が50%から70%であり、Tm値が60℃以上であり、塩
基配列中にセルフアニールするような相補的な配列を含
まない15bpから40bpの長さの塩基配列を用いることがで
き、より好ましくはTm値が70℃以上であり、塩基配列中
に同じ塩基が3塩基を超えて連続する配列およびセルフ
アニールするような相補的な配列を含まない15bpから40
bpの長さの塩基配列を用いる。具体的な例として、ダイ
ズＰＰＯ遺伝子の5'上流領域増幅用プライマーとしては
配列番号15に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チド、および、ダイズＰＰＯ遺伝子の3'下流領域増幅用
プライマーとしては配列番号16に示される塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドを用いることができる。これら
のプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、
例えば、Current ProtocolsIn Molecular Biology
（F.M.Ausubelら編集、John Wiley＆Sons,Inc. 1997
年）2.11等に記載のフォスフォアミダイト法でオリゴヌ
クレオチドを化学的に合成することにより調製すること
ができ、市販のDNA合成装置、例えば、PEアプライドシ
ステム社の394DNA/RNA Synthesyzer等を用いることに
よっても合成できる。（Ｄ）において、植物由来のDNA
の末端にアダプターDNAが付加されてなるDNA断片を鋳型
とし、アダプターDNAの部分塩基配列を有するプライマ
ーと前記（Ｃ）で作製した5'上流領域増幅用プライマー
との組み合わせを用いてポリメラーゼチェイン反応を行
うことにより、前記（Ｂ）で決定された塩基配列の5'上
流側の塩基配列を含むDNA断片（以下、上流側DNA断片と
記す。）が増幅される。また同様に、アダプターDNAの
部分塩基配列を有するプライマーと前記（Ｃ）で作製し
た3'下流領域増幅用プライマーとの組み合わせを用いて
ポリメラーゼチェイン反応を行うことにより、前記
（Ｂ）で決定された塩基配列の3'下流側の塩基配列を含
むDNA断片（以下、下流側DNA断片と記す。）が増幅され
る。ポリメラーゼチェイン反応において鋳型として用い
られるDNA断片としては、前記（Ａ）で鋳型として用い
たDNAが由来する植物と同じ植物に由来するcDNAまたは
ゲノムDNAにアダプターDNAが付加されてなるDNA断片を
用いることができる。これらは、例えば、クローニング
とシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュア
ル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）等に記載され
る通常の方法で植物体から調製したcDNAまたはゲノムDN
Aに、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼでシトシン等の塩基のポリマーをアダプターDNA
として付加する、または、市販のＲＡＣＥ（rapid ampl
ification of cDNA ends）反応用キットのアダプター、
具体的には例えば、Clontech社のMarathon cDNA amplif
ication kitに付属のアダプター等を付加することによ
り調製することができる。また、植物由来のcDNAもしく
はゲノムDNAを用いて、クローニングとシークエンス：
植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編
集、農村文化社1989年）等に記載されている方法で作製
したcDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリー、ま
たは、市販のcDNAライブラリーもしくはゲノムライブラ
リー等から、Molecular Cloning2nd edition（J.Sambro
ok, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor L
aboratory Press 1989年）等に記載されている方法でDN
Aを調製することにより得られるDNA断片は、アダプター
DNAが付加されたDNA断片であり、これらは鋳型として利
用できる。ポリメラーゼチェイン反応のプライマーは、
前記（Ｃ）で作製した5'上流領域増幅用プライマーまた
は3'下流領域増幅用プライマーのいずれかと、アダプタ
ーDNAの部分塩基配列を有するプライマーを組み合わせ
て用いる。アダプターDNAの部分塩基配列を有するプラ
イマーとしては、例えば、市販のＲＡＣＥ（rapid ampl
ification of cDNA ends）反応用キットに付属のアダプ
ターに特異的なプライマー、具体的には例えば、Clonte
ch社のMarathon cDNA amplification kitに付属のAP-1
プライマーやAP-2プライマー、または、λファージのア
ーム領域に特異的なプライマー、具体的には例えば、gt
11リバースプライマーやλgt11フォワードプライマー等
を用いることができる。ポリメラーゼチェイン反応の反
応液は、前述の鋳型として用いるDNA断片を、終濃度0.0
5μMから4.0μM、好ましくは終濃度0.1μMから2.0μMと
なるように含有し、プライマーとして用いるオリゴヌク
レオチドをそれぞれ、例えば、終濃度10μMから500μ
M、好ましくは、終濃度100μMから200μMとなるように
含有し、DNAポリメラーゼとして、市販の耐熱性DNAポリ
メラーゼ、例えば、Taqポリメラーゼ（東洋紡社製）、T
thポリメラーゼ（東洋紡社製）、もしくはPfuポリメラ
ーゼ（STRATAGENE社製）等、または複数の耐熱性DNAポ
リメラーゼを混合した酵素液、例えば、ExTaqポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）、KlenTaqポリメラーゼ（Clontech
社製）等を、例えば、終濃度1unit/μlから4unit/μl、
好ましくは2unit/μlから3unit/μlとなるように含有
し、4種類の塩基（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）をそれぞ
れ、例えば、終濃度50μMから500μM、好ましくは100μ
Mから300μMとなるように含有するよう調製する。ポリ
メラーゼチェイン反応を行うバッファーとしては、マグ
ネシウムイオンを、例えば、0.5mMから5mMの終濃度、好
ましくは3mMから4mMの終濃度となるよう含有し、カリウ
ムイオンを、例えば、10mMから50mMの終濃度となるよう
含有し、72℃でpHが8.3から8.8となるようTris-HCl、Tr
icine-KOH等で調製されたバッファーを用いることがで
きる。ポリメラーゼチェイン反応は、例えば、20回から
50回、好ましくは25回から40回DNA増幅工程を繰り返し
て行い、市販のサーマルサイクラー、例えば、GeneAmp2
400（PEアプライドバイオシステムズ社製）またはTP-30
00（宝酒造社製）等を用いることにより行うことができ
る。DNA増幅工程の各工程において、変性工程は、例え
ば、90℃から95℃にて10秒間から3分間、好ましくは94
℃から95℃にて30秒間から2分間保温することにより行
い、アニーリング工程は、例えば、40℃から60℃にて1
分間から3分間、好ましくは50℃から55℃にて1分間から
2分間保温することにより行い、ポリメラーゼによる伸
長工程は、例えば、70℃から74℃にて1分間から5分間、
好ましくは72℃から73℃にて2分間から3分間保温するこ
とにより行う。（Ｅ）において、前記（Ｄ）で増幅され
た2種のDNA断片（上流側DNA断片と下流側DNA断片）は、
例えば、Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook,
E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Labo
ratory Press 1989年）等に記載される通常の方法、ま
たは市販のDNAクローニングキット、例えば、TA clonin
g kit（Invitrogen社製）等を用い、付属のマニュアル
に準じて操作を行うことによりプラスミドにクローニン
グすることができ、得られるプラスミドは組み込まれて
いるDNA断片の塩基配列の分析に供することができる。
塩基配列の分析は、例えば、 Molecular Cloning 2nd e
dition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989年）13.42から1
3.74等に記載されるダイデオキシ法等によって行うこと
ができ、蛍光ラベルされたダイデオキシヌクレオチドを
用いるシークエンスキット、例えば、Dye terminator c
yclesequencing kit（PEアプライドバイオシステムズ社
製）等を利用し、市販のオートシークエンサー、例え
ば、DNAシークエンサー373S（PEアプライドバイオシス
テムズ社製）等を用いることにより塩基配列の分析を行
うことができる。得られた塩基配列を市販の遺伝子解析
ソフト、例えば、GENETYX（SDC社製）等を用いて重複部
分が重なるよう結合し、葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の塩基配
列を決定することができる。このようにして決定された
葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の塩基配列について遺伝子解析ソ
フト、例えば、GENETYX（SDC社製）等を用いてオープン
リーディングフレームの検索を行うことにより、ＰＰＯ
遺伝子の全領域が含まれているか検討することができ
る。ここで決定された葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の塩基配列
に1.6kbp以上のオープンリーディングフレームの全体が
含まれていない場合は、該塩基配列にＰＰＯ遺伝子の全
領域が含まれていないと判断し、ＰＰＯ遺伝子の全領域
を含む塩基配列が得られるまで工程（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ）
を繰り返し行う。また、上記の決定された葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子の塩基配列に見出されるオープンリーディング
フレームが、（Ｂ）で決定された塩基配列の5'上流側ま
たは3'下流側のいずれかにおいてのみ欠けている場合
は、その欠けている側の塩基配列を含むDNA断片（上流
側DNA断片または下流側DNA断片）の取得について工程
（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ）を繰り返せばよい。なお、該繰り返
し工程においては「（Ｂ）」を「前回の（Ｅ）」と読み
替える。（Ｆ）において、作製されるN末端プライマー
の塩基配列は前記（Ｅ）で決定された葉緑体型ＰＰＯ遺
伝子の塩基配列の5'末端非翻訳領域に含まれる塩基配列
の中で、Ｇ/Ｃ比が50%から70%であり、Tm値が60℃以上
であり、塩基配列中にセルフアニールするような相補的
な配列を含まない15bpから40bpの長さの塩基配列を用い
ることができ、より好ましくはTm値が70℃以上であり、
塩基配列中に同じ塩基が3塩基を超えて連続する配列お
よびセルフアニールするような相補的な配列を含まない
15bpから40bpの長さの塩基配列を用いる。また、C末端
プライマーの塩基配列としては前記（Ｅ）で決定された
葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の塩基配列の3'末端非翻訳領域に
含まれる塩基配列に相補的な塩基配列の中で、Ｇ/Ｃ比
が50%から70%であり、Tm値が60℃以上であり、塩基配列
中にセルフアニールするような相補的な配列を含まない
15bpから40bpの長さの塩基配列を用いることができ、よ
り好ましくはTm値が70℃以上であり、塩基配列中に同じ
塩基が3塩基を超えて連続する配列およびセルフアニー
ルするような相補的な配列を含まない15bpから40bpの長
さの塩基配列を用いる。具体的な例として、ダイズ葉緑
体型ＰＰＯ遺伝子のC末端プライマーとして配列番号19
に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い
ることができる。これらのプライマーは、例えば、Curr
ent Protocols In Molecular Biology（F.M.Ausube
lら編集、John Wiley＆Sons,Inc. 1997年）2.11等に
記載のフォスフォアミダイト法等でオリゴヌクレオチド
を化学的に合成することにより調製することができ、市
販のDNA合成装置、例えば、PEアプライドシステム社の3
94DNA/RNA Synthesyzer等を用いることにより合成でき
る。ポリメラーゼチェイン反応において鋳型として用い
られるDNAとしては、前記（Ａ）で鋳型として用いたDNA
が由来する植物と同じ植物に由来するcDNAまたはゲノム
DNAを用いることができ、これらは、例えば、クローニ
ングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニ
ュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）等に記載
される通常の方法で植物体から調製できる。また、植物
由来のcDNAもしくはゲノムDNAを用いて、例えば、クロ
ーニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験
マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）等に
記載される方法で作製したcDNAライブラリーもしくはゲ
ノムライブラリーからMolecular Cloning 2nd edition
（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press 1989年）等に記載される方
法で調製したDNA、または、市販のcDNAライブラリーも
しくはゲノムライブラリーから同様の方法で調製したDN
Aを鋳型として利用することもできる。ポリメラーゼチ
ェイン反応の反応液は、前述の鋳型として用いるDNA断
片を終濃度0.05μMから4.0μM、好ましくは終濃度0.1μ
Mから2.0μMとなるように含有し、N末端プライマーおよ
びC末端プライマーをそれぞれ、例えば、終濃度10μMか
ら500μM、好ましくは、終濃度100μMから200μMとなる
ように含有し、DNAポリメラーゼとして、市販の耐熱性D
NAポリメラーゼ、例えば、Taqポリメラーゼ（東洋紡社
製）、Tthポリメラーゼ（東洋紡社製）、もしくはPfuポ
リメラーゼ（STRATAGENE社製）等、または複数の耐熱性
DNAポリメラーゼを混合した酵素液、例えば、ExTaqポリ
メラーゼ（宝酒造社製）、KlenTaqポリメラーゼ（Clont
ech社製）等を、例えば、終濃度1unit/μlから4unit/μ
l、好ましくは2unit/μlから3unit/μlとなるように含
有し、4種類の塩基（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）をそれ
ぞれ、例えば、終濃度50μMから500μM、好ましくは100
μMから300μMとなるように含有するよう調製する。ポ
リメラーゼチェイン反応を行うバッファーとしては、マ
グネシウムイオンを、例えば、0.5mMから5mMの終濃度、
好ましくは3mMから4mMの終濃度となるよう含有し、カリ
ウムイオンを、例えば、10mMから50mMの終濃度となるよ
う含有し、72℃でpHが8.3から8.8となるようTris-HCl、
Tricine-KOH等で調製されたバッファーを用いることが
できる。ポリメラーゼチェイン反応は、例えば、20回か
ら50回、好ましくは25回から40回DNA増幅工程を繰り返
して行い、市販のサーマルサイクラー、例えば、GeneAm
p2400（PEアプライドバイオシステムズ社製）またはTP-
3000（宝酒造社製）等を用いることにより行うことがで
きる。DNA増幅工程の各工程において、変性工程は、例
えば、90℃から95℃にて10秒間から3分間、好ましくは9
4℃から95℃にて30秒間から2分間保温することにより行
い、アニーリング工程は、例えば、40℃から60℃にて1
分間から3分間、好ましくは50℃から55℃にて1分間から
2分間保温することにより行い、ポリメラーゼによる伸
長工程は、例えば、70℃から74℃にて1分間から5分間、
好ましくは72℃から73℃にて2分間から3分間保温するこ
とにより行う。また、別法としては、まず前記（Ａ）で
増幅されたDNA断片および前記（Ｄ）で増幅されたDNA断
片の塩基配列を遺伝子解析ソフト、例えば、GENETYX（S
DC社製）等で解析して、葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の全塩基
配列を含み得るDNA断片の組み合わせを選択し、さら
に、選択されたDNA断片の組み合わせのうち、となりあ
うDNA断片の重複部分に存在する制限酵素認識配列を遺
伝子解析ソフトで検索する。次いで、見出された制限酵
素認識配列でDNA断片を切断した後、前記（Ｅ）で決定
された葉緑体型ＰＰＯの塩基配列となるようにDNA断片
を結合することにより葉緑体型ＰＰＯの全塩基配列をコ
ードしているDNA断片を合成することができる。本発明
ＰＣＲ反応取得法により、例えば、配列番号９で示され
るアミノ酸配列または該アミノ酸配列において1もしく
は複数個のアミノ酸配列が欠損、置換または付加された
アミノ酸配列からなり、かつプロトポルフィリノーゲン
オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする葉緑
体型ＰＰＯ遺伝子、配列番号9に示されるアミノ酸配列
をコードする塩基配列を有する葉緑体型ＰＰＯ遺伝子、
配列番号10に示される塩基配列を有する葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子を得ることができる。

【００１０】葉緑体型ＰＰＯ遺伝子は、例えば、植物由
来のDNAに対して、前述の本発明DNA断片をプローブとし
てハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション法によ
り、葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を特定し、単離する工程から
なる方法（以下、本発明ハイブリダイゼーション取得法
と記す。）によっても得られる。本発明ハイブリダイゼ
ーション取得法に用いるプローブは前述のようにして得
られた本発明DNA断片を、例えば、Molecular Cloning 2
nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、
Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）等に記
載される方法で、標識化合物を用いて標識することによ
り調製できる。標識化合物は、例えば、放射性同位元素
（以下、RIと記す。）を含む化合物や蛍光試薬等の標識
化合物を用いることができる。RIを含む化合物を用いた
標識は、例えば、〔α-³²P〕dCTP（アマシャム社製）お
よびランダムプライムラべリングキット（ベーリンガー
マンハイム社製）等を用いてキットに付属のプロトコー
ルに準じて行うことができる。また、蛍光試薬を用いた
標識は、例えば、ECL DirectNucleic Acid Labeling an
d Detection System（アマシャム社製）等とこれに付属
の蛍光試薬を用い付属のプロトコールに準じて行うこと
ができる。プローブをハイブリダイズさせる植物由来の
DNAには、ダイズ、エンドウなどのマメ科植物、タバ
コ、ジャガイモなどのナス科植物等の双子葉植物に代表
される植物に由来するDNAであって、例えば、植物体か
らゲノムDNAを調製し、適当な制限酵素で切断後λファ
ージ由来のベクター等に連結し、ファージ粒子内にパッ
ケージングすることにより得られる植物ゲノムライブラ
リー、または、植物体由来のcDNAを適切なリンカーでλ
ファージ由来のベクター等に連結し、ファージ粒子内に
パッケージングすることにより得られる植物cDNAライブ
ラリーを用いることができる。これらの遺伝子ライブラ
リーは、例えば、クローニングとシークエンス：植物バ
イオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農
村文化社1989年）等に記載される方法で植物体から調製
することができる。また、Clontech社、STRATAGENE社等
から市販されている植物遺伝子ライブラリーを用いるこ
ともできる。葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を特定し、単離する
工程は、例えば、前述の方法により作製したプローブを
用いてサザンハイブリダイゼーションやプラークハイブ
リダイゼーション法等により行うことができる。これら
は、例えば、クローニングとシークエンス：植物バイオ
テクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文
化社1989年）に記載されている方法、または、Molecula
r Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.
Maniatis著、Cold Spring Harbor LaboratoryPress 198
9年）等に記載されている方法で行うことができる。具
体的には、例えば、Molecular Cloning 2nd edition
（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press 1989年）2.60から2.65等に
記載されている方法に準じて、NZY寒天培地に寒天培地1
mm²当り0.1〜1.0pfuの密度で、約9.0×10⁵pfuの植物ゲ
ノムライブラリーまたは植物cDNAライブラリー等の植物
遺伝子ライブラリー、具体的には例えば、ダイズ植物ゲ
ノムライブラリー（STRATAGENE社製）等を広げ、37℃で
6〜10時間培養する。クローニングとシークエンス：植
物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編
集、農村文化社1989年）等に記載の方法に準じて、前記
寒天培地の上にニトロセルロースフィルターまたはナイ
ロンフィルター等、例えば、Hybond-N+（アマシャム社
製）を置き、約1分間静置してファージ粒子を吸着させ
る。次に、該フィルターをアルカリ溶液（1.5M NaCl、
0.5N NaOH）に約3分間浸してファージ粒子を溶解させて
フィルターにファージDNAを結合させた後、中和溶液
（1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl、pH7.5）に約5分間浸す処
理を行う。該フィルターを洗浄溶液（300mM NaCl、30mM
Sodium Citrate、200mM Tris-HCl）で約5分間洗った
後、例えば、約80℃で約90分間ベーキングすることによ
りファージDNAをフィルターに固定する。上記のように
して作製したフィルターを、フィルター1cm²当り50〜20
0μlのプレハイブリダイゼーション溶液に浸して42〜68
℃で1〜4時間、好ましくは、45℃で2時間保温し、プレ
ハイブリダイゼーションを行う。ここで、プレハイブリ
ダイゼーション溶液としては、例えば、450〜900mMのNa
Cl、45〜90mMのSodium Citrateを含み、SDSを0.1〜1.0
％の濃度で含み、アルブミン、Ficoll、ポリビニルピロ
リドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含み、変性した非
特異的DNAを0〜200μg/mlの濃度で含むプレハイブリダ
イゼーション溶液、好ましくは、750mMのNaCl、75mMのS
odium Citrate、0.1%のFicoll400、0.1%のポリビニルピ
ロリドン、0.1%のウシ血清アルブミン、0.5%のSDS、100
μg/mlの変性Calf-thymus DNAを含むプレハイブリダイ
ゼーション溶液を用いる。前述の方法で得られる本発明
DNA断片を、例えば、Molecular Cloning 2nd edition
（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press 1989年）10.13から10.17等
に記載されているランダムプライムラべリング法等で標
識する。具体的には例えば、ランダムプライムラべリン
グキット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いキット
に付属のプロトコールに準じて操作を行い〔α-³²P〕dC
TP（0.74Mbq、アマシャム社製）で標識することにより
プローブを調製する。フィルター1cm²当り1.0×10⁴〜2.
0×10⁶cpm相当量のプローブを含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液をフィルター1cm²当り50〜200μlとなるよう調
製し、このハイブリダイゼーション溶液にプレハイブリ
ダイゼーション後のフィルターを浸して42〜68℃で4〜2
0時間、好ましくは、45℃で16時間保温しハイブリダイ
ゼーション反応を行う。ここで、ハイブリダイゼーショ
ン溶液としては、例えば、450〜900mMのNaCl、45〜90mM
のSodium Citrateを含み、SDSを0.1〜1.0％の濃度で含
み、アルブミン、Ficoll、ポリビニルピロリドン等をそ
れぞれ0〜0.2%の濃度で含むハイブリダイゼーション溶
液、好ましくは、750mMのNaCl、75mMのSodium Citrat
e、0.1%のFicoll400、0.1%のポリビニルピロリドン、0.
1%のウシ血清アルブミン、0.5%のSDSを含む溶液を用い
る。該ハイブリダイゼーション反応後、42〜68℃の15〜
300mMのNaCl、1.5〜30mMのSodium Citrate、0.1〜1.0%
のSDS等を含む洗浄溶液、好ましくは、55℃の150mMのNa
Cl、15mMのSodium Citrate、0.1%のSDSを含む溶液等に
フィルターを浸し、10〜60分間の洗浄を1〜4回、好まし
くは15分間の洗浄を2回行う。2×SSC溶液（300mM NaC
l、30mM Sodium Citrate）でフィルターを軽くすすいだ
のち乾燥させオートラジオグラフィーを行う。具体的に
は例えば、フィルターをイメージングプレート（富士フ
ィルム）に4時間露光させ、BAS2000（富士フィルム）を
用いて解析し、シグナルを検出する。植物ゲノムライブ
ラリーまたは植物cDNAライブラリーを広げてフィルター
の作製に用いた寒天培地のシグナルが検出された位置に
相当する部分を約5mm角にくり抜き、約500μlのSMバッ
ファー（50mMTris-HCl pH7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO₄、
0.01%ゼラチン）に2〜16時間、好ましくは3時間浸して
ファージ粒子を溶出させる。得られたファージ粒子溶出
液をMolecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.
F.Frisch, T.Maniatis著、ColdSpring Harbor Laborato
ry Press 1989年）2.60から2.65に記載の方法に準じて
寒天培地に広げ、37℃で6〜10時間培養する。この寒天
培地を用いて前述の方法と同様の方法でファージDNAを
フィルターに固定し、このフィルターと前述のプローブ
を用いてハイブリダイゼーションを行う。ファージ粒子
溶出液を広げてフィルターの作製に用いた寒天培地のシ
グナルが検出された位置に相当する部分からファージ粒
子を溶出し、再度、寒天培地に広げ、前述の方法と同様
にフィルターを作製し、ハイブリダイゼーションを行
う。このようなファージクローンの特定と単離を繰り返
すことにより、ＰＰＯ遺伝子を含むと予想されるファー
ジクローンが得られる。得られたファージクローンをMo
lecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Fris
ch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess 1989年）2.60から2.65等に記載の方法に準じてNZYM
液体培地で増幅する。得られたファージ液から、例え
ば、Lambda-TRAP PLUS DNA Isolation Kit（Clontech社
製）等を用いてファージクローンDNAを抽出する。抽出
したファージクローンDNAを鋳型として、例えば、Dye t
erminator cycle sequencing kit（PEアプライドバイオ
システムズ社製）等を利用し、市販のオートシークエン
サー、例えば、DNAシークエンサー373S（PEアプライド
バイオシステムズ社製）等を用い塩基配列の分析を行う
ことでダイズ葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の塩基配列を決定す
ることができる。上述のような本発明ハイブリダイゼー
ション取得法により、例えば、配列番号13に示す塩基配
列を有するダイズゲノムDNA由来の葉緑体型ＰＰＯ遺伝
子を得ることができる。

【００１１】上記のようにして得られうる「配列番号９
で示されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において
1もしくは複数個のアミノ酸配列が欠損、置換または付
加されたアミノ酸配列からなり、かつプロトポルフィリ
ノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコード
する葉緑体型ＰＰＯ遺伝子」、「配列番号9に示される
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する葉緑体型Ｐ
ＰＯ遺伝子」、「配列番号10に示される塩基配列を有す
る葉緑体型ＰＰＯ遺伝子」、および「配列番号13に示さ
れる塩基配列を有することを特徴とするダイズゲノムDN
A由来の葉緑体型ＰＰＯ遺伝子」（以下、本発明遺伝子
と記す。）は、光要求型除草剤耐性遺伝子を得るための
手段に利用できる。例えば、本発明遺伝子がコードする
ＰＰＯのアミノ酸配列に変更を加え、光要求型除草剤耐
性を示すＰＰＯのアミノ酸配列をスクリーニングするこ
とによって新たな除草剤耐性遺伝子を作り出すことが可
能になる。具体的には、例えば、A.Greener, M.Callaha
n、Strategies、1994年、7巻、32-34頁等に記載される
方法により本発明遺伝子の塩基配列にランダムな突然変
異を誘導してアミノ酸配列に変異を導入する方法によっ
て新たな光要求型除草剤耐性遺伝子を作り出すことが可
能となる。また、W.Kramer,et al.、NucleicAcids Rese
arch、1984年、12巻、9441頁もしくはW. Kramer,H.J.Fr
its、Methods in Enzymology、1987年、154巻、350頁等
に記載のギャップド・デュープレックス（gapped duple
x）法、または、T.A.Kunkel、Proc. of Natl. Acad. Sc
i. U.S.A.、1985年、82巻、488頁もしくはT.A.Kunkel,e
t al.、Methods in Enzymology、1987年、154巻、367頁
等に記載のクンケル（Kunkel）法等に準じて、本発明遺
伝子の塩基配列に部位特異的に変異を導入してアミノ酸
配列を改変する方法によっても新たな光要求型除草剤耐
性遺伝子を作り出すことが可能になる。さらに、本発明
遺伝子がコードするＰＰＯのアミノ酸配列のうち1ヶ所
ないし数カ所の部分アミノ酸配列を、他の生物由来のＰ
ＰＯのアミノ酸配列の一部と入れ換えたキメラ酵素タン
パク質をコードする遺伝子を作製することによっても新
たな光要求型除草剤耐性遺伝子を作り出すことが可能に
なる。このようにして作製された光要求型除草剤耐性遺
伝子の効果（除草剤耐性発現）は、例えば、作製された
除草剤耐性遺伝子をＰＰＯ欠損の微生物または対象とす
る除草剤に対して感受性なＰＰＯを持つ微生物に導入
し、形質転換微生物を選抜した後、対象とする除草剤で
該形質転換微生物を処理し除草剤耐性コロニーを選抜す
る方法で効率的に確認することができる。

【００１２】本発明ＰＣＲ反応取得法または本発明ハイ
ブリダイゼーション取得法によって得られうる葉緑体型
ＰＰＯ遺伝子の5末端側の塩基配列には、葉緑体移送シ
グナルペプチドのアミノ酸配列がコードされている。こ
のアミノ酸配列は、例えば、前記の本発明ＰＣＲ反応取
得法または本発明ハイブリダイゼーション取得法により
葉緑体型ＰＰＯ遺伝子をクローニングして塩基配列を決
定し、コードされているアミノ酸配列を解析することに
よって決定することができる。具体的には例えば、前述
のように、ダイズ植物のcDNAライブラリーを用いて本発
明ＰＣＲ反応取得法により葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を単離
し該遺伝子にコードされるアミノ酸配列の解析を行い、
例えば、配列番号11に示される本発明シグナルペプチド
のアミノ酸配列を決定することができる。本発明シグナ
ルペプチドは配列番号11に示されるアミノ酸配列からな
る葉緑体移送シグナルペプチドであり、具体的には例え
ば、配列番号12に示される塩基配列にコードされる。本
発明シグナルペプチドを、例えば、葉緑体に移送したい
酵素タンパク質のN末端に存在させることにより目的の
酵素タンパク質を葉緑体内に局在化させることができ
る。この場合、本発明シグナルペプチドをコードするDN
A断片、例えば、配列番号12に示される塩基配列を有す
るDNA断片等の下流に葉緑体に移送したい酵素タンパク
質をコードするDNA断片を連結した融合遺伝子を構築
し、この融合遺伝子を通常の遺伝子工学的手法を用いて
発現させる方法を用いることができる。

【００１３】上記の本発明遺伝子を含有することを特徴
とするプラスミドが本発明プラスミドである。具体的な
プラスミドとしては、例えば、配列番号9で示されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＰＰＯの遺伝
子をpCR2.1（Invitrogen社）にクローニングし作成した
プラスミドがあり、ベクター部分が小さく、大腸菌でコ
ピー数が多いという特徴を有しており、DNA調製やDNA構
造解析または遺伝子の改変などの通常の遺伝子操作を行
うのに適している。

【００１４】本発明発現プラスミドは（1）宿主細胞内
で機能可能なプロモーター、（2）本発明遺伝子および
（3）宿主細胞内で機能可能なターミネーターを機能可
能な形で前期の順序となるよう結合させることにより構
築することができる。ここで、「宿主細胞で機能可能な
プロモーター」とは該プロモーターの下流に目的とする
タンパク質の構造遺伝子を連結した場合、該タンパク質
の宿主細胞内における発現を制御する能力を有するプロ
モーターを意味し、「宿主細胞内で機能可能なターミネ
ーター」とは宿主細胞内で目的の構造遺伝子の転写を効
率的に終結させる能力を有するようなターミネーターを
意味し、「機能可能な形で」とは、構築されたプラスミ
ドを宿主細胞に導入し形質転換させた場合に、該宿主細
胞内で本発明遺伝子のコードするタンパク質を発現させ
る機能を有するように、プロモーターの制御下に本発明
遺伝子を組み込んだ状態になることを意味する。宿主細
胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、大腸菌
のラクトースオペロンのプロモーター、酵母のアルコー
ルデヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH）プロモーター、アデ
ノウイルス・メジャーレート（Ad.ML）プロモーター、S
V40の初期プロモーター、バキュロウイルスプロモータ
ー、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）プロモーター、オ
クトピン合成酵素遺伝子（OCT）プロモーター、カリフ
ラワーモザイクウイルス(CaMV）由来の19Sおよび35Sプ
ロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PA
L）遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（CHS）遺
伝子プロモーター、Pathogenesis-related protein（P
R）遺伝子のプロモーター等をあげることができ、ま
た、後述する本発明プロモータも機能可能なプロモータ
ーとして利用できる。また、宿主細胞内で機能可能なタ
ーミネーターとしては、例えば、大腸菌のラクトースオ
ペロンのターミネーター、酵母のHIS ターミネーター、
ADH1ターミネーター、SV40のearly splicing region、
ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）ターミネーター、ニン
ニクウイルスGV1、GV2のターミネーター等をあげること
ができる。

【００１５】このようなプラスミド（本発明（発現）プ
ラスミド）を宿主細胞に導入することにより該宿主細胞
を形質転換することができる。例えば、宿主細胞が微生
物の場合、本発明（発現）プラスミドを、例えば、Mole
cular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisc
h, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss 1989年）1.82から1.84等に記載の塩化カルシウム
法、またはMethods in Electroporation:Gene Pulser /
E.coli Pulser System, （Bio-Rad Laboratories,1993
年）等に記載されるエレクトロポレーション法等によっ
て微生物細胞内に導入することができる。また、宿主細
胞が植物の場合、本発明（発現）プラスミドをアグロバ
クテリウム感染方法（特公平2-58917および特開昭60-70
080）、プロトプラストへのエレクトロポレーション方
法（特開昭60-251887および特開平5-68575）またはパー
ティクルガン方法（特表平5-508316および特開昭63-258
525）などの手段により植物細胞に導入し、本発明遺伝
子が導入された細胞を選抜することによって形質転換植
物細胞を得ることができる。得られた形質転換植物細胞
から、例えば、植物遺伝子操作マニュアル：トランスジ
ェニック植物の作り方（内宮著、講談社サイエンティフ
ィック1990年）、27-55頁などに記載の植物細胞培養方
法により形質転換植物を再生することによって形質転換
された植物体を得ることができる。

【００１６】さらに本発明は、(1)宿主細胞内で機能可
能なプロモーター、（2）本発明遺伝子および本発明遺
伝子および（3）宿主細胞内で機能可能なターミネータ
ーを機能可能な形で前記の順序に結合させてなる発現プ
ラスミドを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換さ
せることにより形質転換体のＰＰＯ活性を増強すること
を特徴とする宿主細胞のＰＰＯ活性の増強方法（以下、
本発明ＰＰＯ活性増強方法と記す。）を提供する。本発
明ＰＰＯ活性増強方法において宿主細胞で機能可能なプ
ロモーターとしては、例えば、大腸菌のラクトースオペ
ロンのプロモーター、酵母のアルコールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ADH）プロモーター、アデノウイルス・メジ
ャーレート（Ad.ML）プロモーター、SV40の初期プロモ
ーター、バキュロウイルスプロモーター、ノパリン合成
酵素遺伝子（NOS）プロモーター、オクトピン合成酵素
遺伝子（OCT）プロモーター、カリフラワーモザイクウ
イルス(CaMV）由来の19Sおよび35Sプロモーター、フェ
ニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL）遺伝子プロモ
ーター、カルコンシンターゼ（CHS）遺伝子プロモータ
ー、Pathogenesis-related protein（PR）遺伝子のプ
ロモーター等をあげることができ、また、後述する本発
明プロモーターも機能可能なプロモーターとして利用で
きる。また、宿主細胞内で機能可能なターミネーターと
しては、例えば、大腸菌のラクトースオペロンのターミ
ネーター、酵母のHIS ターミネーター、ADH1ターミネー
ター、SV40のearly splicing region、ノパリン合成酵
素遺伝子（NOS）ターミネーター、ニンニクウイルスGV
1、GV2のターミネーター等をあげることができ、さら
に、これに限定されない公知のターミネーターを用いる
こともできる。本発明ＰＰＯ活性増強方法により、ＰＰ
Ｏをターゲットとする光要求型除草剤に対する耐性を植
物に付与することができる。

【００１７】本発明プロモーターは配列番号14で示され
る塩基配列を有するプロモーターである。本発明プロモ
ーターは目的とするタンパク質を植物細胞内で発現させ
るために利用することができ、通常、(1)該プロモータ
ー、(2)目的とするタンパク質の構造遺伝子、(3)植物細
胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形で前記
の順序となるよう結合させた発現プラスミドの形で利用
される。ここで、「植物細胞内で機能可能なターミネー
ター」とは植物細胞内で目的の構造遺伝子の転写を効率
的に終結させる能力を有するようなターミネーターを意
味し、このようなターミネーターとしては、例えば、ノ
パリン合成酵素遺伝子（NOS）ターミネーター、ニンニ
クウイルスGV1、GV2のターミネーター等があげられる。
本発明プロモーターは、例えば、前述のような本発明発
現プラスミドの構築等に好適に利用できる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるもの
ではない。

【００１９】実施例1（本発明オリゴヌクレオチドの調
製） 配列番号１〜８に示される塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドをDNA合成装置（PEアプライドバイオシステム
ズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を用いてフォ
スフォアミダイト法で合成した。DNA合成用溶媒はModel
394 DNA/RNA Synthesizer 用溶媒（PEアプライドシス
テムズ社製）を、DNA合成用のカラムは40nMスケールのL
V40カラム（PEアプライドシステムズ社製）を、DNA合成
試薬はアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびイ
ノシンに相当するフォスフォアミダイト試薬（PEアプラ
イドシステムズ社製）および式 化５および式 化６に
示される化合物に相当するフォスフォアミダイト試薬
（和光純薬製）を用いた。オリゴヌクレオチドの合成は
DNA合成装置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model
394 DNA/RNA Synthesizer）を用いて該装置のオペレー
ションマニュアルに従って操作した。合成終了後、合成
したオリゴヌクレオチドをアンモニア水でカラムから溶
出し、55℃で8時間保温して塩基に結合されている保護
基を取り除き、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ
（OPCカートリッジ：PEアプライドバイオシステムズ
社）で精製した後、減圧乾燥することで、精製オリゴヌ
クレオチドを調製した。このようにして調製されたオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとし、シロイヌナズナ（Ar
abidopsis thaliana, ecotype Columbia）cDNAライブ
ラリーのDNAを鋳型としてポリメラーゼチェイン反応を
行った。シロイヌナズナcDNAライブラリ−のDNAは以下
の方法に従って調製した。シロイヌナズナ（Arabidopsi
s thaliana, ecotype Columbia）cDNAライブラリー
（Clontech社製）約10⁷pfuをMolecular Cloning 2nd e
dition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.60から2.
65に記載の方法に準じて、NZCYM寒天培地に広げて増幅
し、寒天培地からSMバッファー（50mM Tris-HCl pH7.
5、0.1M NaCl、7mM MgSO₄、0.01%ゼラチン）でファージ
粒子を溶出した。溶出したファージ粒子約10¹¹pfuからD
NA抽出キット（Lambda-TRAP PLUS：Clontech社製）を用
いてDNAを抽出してシロイヌナズナのcDNAライブラリー
のDNAを調製した。ポリメラーゼチェイン反応における
反応液は、1.25pmolの配列番号1に示される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号2に示
される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmol
の配列番号3に示される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチド、1.25pmolの配列番号4に示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号5に示さ
れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの
配列番号6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド、1.25pmolの配列番号7に示される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号8に示され
る塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、0.5μlのAdva
ntage KlenTaq Polymerase Mix（Clontech社製）、2.5
μlの10x KlenTaq PCR reaction buffer（Clontech社
製）、各々5nmolの4種類の塩基（dATP、dCTP、dGTP、dT
TP：Clontech社製）および約3.5×10^-15molのシロイヌ
ナズナcDNAライブラリーのDNAを0.2ml容ポリメラーゼチ
ェイン反応用チューブに採り、滅菌蒸留水を加えて全量
を25μlとして調製した。ポリメラーゼチェイン反応に
おける各工程は下記の条件で行った。変性工程は94℃で
1分間保温し、アニーリング工程は53℃で2分間保温し、
DNAポリメラーゼによる伸長工程は72℃で2分間保温する
第1サイクルを1回行った後、変性工程は94℃で30秒間保
温し、アニーリング工程は53℃で2分間保温し、DNAポリ
メラーゼによる伸長工程は72℃で2分間保温する第2サイ
クルを34回行った。ポリメラーゼチェイン反応終了後、
反応液25μlをMicroSpin S-400HR（ファルマシアバイオ
テク社製）で濾過することで精製し、ポリメラーゼチェ
イン反応で増幅されたDNA断片の精製溶液を得た。1.5ml
容マイクロチューブに、ポリメラーゼチェイン反応で増
幅されたDNA断片の精製溶液2μl、直鎖化されたプラス
ミドベクターpCR2.1（Invitrogen社製）50ng、1μlの10
x Ligation buffer（Invitrogen社製）、4Weiss unitの
T4 DNA Ligase（Invitrogen社製）を採り、滅菌蒸留水
を加えて全量を10μlとして混合後、12℃で16時間保温
することによりDNA連結反応を行い、ポリメラーゼチェ
イン反応で増幅されたDNA断片をpCR2.1に連結した。連
結反応終了後、得られた反応液1μlで大腸菌INVαF'株
のコンピテントセル（Invitrogen社製）を形質転換し、
アンピシリン耐性となった株を選抜した。さらに、選抜
された株に含有されたプラスミドにクローニングされて
いるDNA断片の塩基配列をDye terminator cycle sequen
cing kit（PEアプライドバイオシステムズ社製）および
DNAシークエンサー373S（PEアプライドバイオシステム
ズ社製）を用いて決定した。決定された塩基配列を、遺
伝子解析ソフト（GENETYX：SDC社製）を用いて解析し
た。その結果、配列番号1ないし8に示される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポ
リメラーゼチェイン反応により、シロイヌナズナの葉緑
体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列(313bp)を有するDNA断
片が増幅されることが明らかになった。したがって、配
列番号1ないし8に示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドは葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列を有す
るDNA断片を増幅することができることが確認された。

【００２０】実施例2（ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子の部分塩基配列を有するDNA断片のクローニン
グ） ダイズ（Glycine max, var. Resnik）cDNAライブラリー
（Clontech社製）約10 ⁷pfuをMolecular Cloning 2nd e
dition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.60から2.
65に記載の方法にしたがって、NZCYM寒天培地に広げて
増幅し、寒天培地からSMバッファーでファージ粒子を溶
出した。溶出したファージ粒子約10¹¹pfuからDNA抽出キ
ット（Lambda-TRAP PLUS：Clontech社製）を用いてDNA
を抽出してダイズcDNAライブラリーのDNAを調製した。
該ダイズcDNAライブラリーのDNAを鋳型として実施例1で
調製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ポリメ
ラーゼチェイン反応を行った。ポリメラーゼチェイン反
応における反応液は、1.25pmolの配列番号1に示される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列
番号2に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ド、1.25pmolの配列番号3に示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号4に示される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列
番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ド、1.25pmolの配列番号6に示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号7に示される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列
番号8に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ド、0.5μlのAdvantage KlenTaq Polymerase Mix（Clon
tech社製）、2.5μlの10x KlenTaq PCR reaction buffe
r（Clontech社製）、各々5nmolの4種類の塩基（dATP、d
CTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）および約3.5×10^-15m
olの上記ダイズcDNAライブラリーのDNAを0.2ml容ポリメ
ラーゼチェイン反応用チューブに採り、滅菌蒸留水を加
えて全量を25μlとして調製した。ポリメラーゼチェイ
ン反応における各工程は下記の条件で行った。変性工程
は94℃で1分間保温し、アニーリング工程は53℃で2分間
保温し、DNAポリメラーゼによる伸長工程は72℃で2分間
保温する第1サイクルを1回行った後、変性工程は94℃で
30秒間保温し、アニーリング工程は53℃で2分間保温
し、DNAポリメラーゼによる伸長工程は72℃で2分間保温
する第2サイクルを34回行った。ポリメラーゼチェイン
反応終了後、反応液25μlをMicroSpin S-400HR（ファル
マシアバイオテク社製）で濾過することで精製し、ポリ
メラーゼチェイン反応で増幅されたDNA断片の精製溶液
を得た。1.5ml容マイクロチューブに、ポリメラーゼチ
ェイン反応で増幅されたDNA断片の精製溶液2μl、直鎖
化されたプラスミドベクターpCR2.1（Invitrogen社製）
50ng、1μlの10x Ligation buffer（Invitrogen社
製）、4Weiss unitのT4 DNA Ligase（Invitrogen社製）
を採り、滅菌蒸留水を加えて全量を10μlとして混合
後、12℃で16時間保温することによりDNA連結反応を行
い、ポリメラーゼチェイン反応で増幅されたDNA断片をp
CR2.1に連結した。連結反応終了後、得られた反応液1μ
lで大腸菌INVαF'株のコンピテントセル（Invitrogen社
製）を形質転換し、アンピシリン耐性となった株を選抜
した。さらに、選抜された株からプラスミドDNAを抽出
しこれらを制限酵素で切断した後アガロース電気泳動で
分析することにより、ポリメラーゼチェイン反応で増幅
された約0.37kbpのDNA断片がクローニングされているプ
ラスミドを選抜した。選抜されたプラスミドが有するDN
A断片の塩基配列をDye terminator cycle sequencing k
it（PEアプライドバイオシステムズ社製）およびDNAシ
ークエンサー373S（PEアプライドバイオシステムズ社
製）を用い決定した。その結果、配列番号10の第1235番
目の塩基から第1547番目の塩基の313塩基の塩基配列が
明らかになった。決定された塩基配列を、遺伝子解析ソ
フト（GENETYX：SDC社製）を用いてアミノ酸配列に翻訳
する解析を行った。その結果、配列番号9の第406番目の
アミノ酸残基から第509番目のアミノ酸残基の104アミノ
酸残基のアミノ酸配列が明らかになった。上記ダイズ植
物由来のDNA断片を有するプラスミドを保有するクロー
ンをSoy371と命名した。

【００２１】実施例3（エンドウ植物由来の葉緑体型Ｐ
ＰＯ遺伝子の部分塩基配列を有するDNA断片のクローニ
ング） エンドウ（Pisum sativum, var. Alaska）cDNAライブラ
リー（Clontech社製）約10⁷pfuをMolecular Cloning 2n
d edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、
Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.60か
ら2.65に記載の方法にしたがって、NZCYM寒天培地に広
げて増幅し、寒天培地からSMバッファーでファージ粒子
を溶出した。溶出したファージ粒子約10¹¹pfuからDNA抽
出キット（Lambda-TRAP PLUS：Clontech社製）を用いて
DNAを抽出してエンドウcDNAライブラリーのDNAを調製し
た。該エンドウcDNAライブラリーのDNAを鋳型として実
施例1で調製したオリゴヌクレオチドをプライマーと
し、ポリメラーゼチェイン反応を行った。ポリメラーゼ
チェイン反応における反応液は、1.25pmolの配列番号1
に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25
pmolの配列番号2に示される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチド、1.25pmolの配列番号3に示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号4に
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pm
olの配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチド、1.25pmolの配列番号6に示される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号7に示
される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmol
の配列番号8に示される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチド、0.5μlのAdvantage KlenTaq Polymerase Mix
（Clontech社製）、2.5μlの10x KlenTaq PCR reaction
buffer（Clontech社製）、各々5nmolの4種類の塩基（d
ATP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）および約3.5×
10^-15molのエンドウcDNAライブラリーのDNAを0.2ml容ポ
リメラーゼチェイン反応用チューブに採り、滅菌蒸留水
を加えて全量を25μlとして調製した。ポリメラーゼチ
ェイン反応における各工程は下記の条件で行った。変性
工程は94℃で1分間保温し、アニーリング工程は53℃で2
分間保温し、DNAポリメラーゼによる伸長工程は72℃で2
分間保温する第1サイクルを1回行った後、変性工程は94
℃で30秒間保温し、アニーリング工程は53℃で2分間保
温し、DNAポリメラーゼによる伸長工程は72℃で2分間保
温する第2サイクルを34回行った。ポリメラーゼチェイ
ン反応終了後、反応液25μlをMicroSpin S-400HR（ファ
ルマシアバイオテク社製）で濾過することで精製し、ポ
リメラーゼチェイン反応で増幅されたDNA断片の精製溶
液を得た。1.5ml容マイクロチューブに、ポリメラーゼ
チェイン反応で増幅されたDNA断片の精製溶液2μl、直
鎖化されたプラスミドベクターpCR2.1（Invitrogen社
製）50ng、1μlの10x Ligation buffer（Invitrogen社
製）、4Weiss unitのT4 DNA Ligase（Invitrogen社製）
を採り、滅菌蒸留水を加えて全量を10μlとして混合
後、12℃で16時間保温することによりDNA連結反応を行
い、ポリメラーゼチェイン反応で増幅されたDNA断片をp
CR2.1に連結した。連結反応終了後、得られた反応液1μ
lで大腸菌INVαF'株のコンピテントセル（Invitrogen社
製）を形質転換し、アンピシリン耐性となった株を選抜
した。さらに、選抜された株からプラスミドDNAを抽出
しこれらを制限酵素で切断した後アガロース電気泳動で
分析することにより、ポリメラーゼチェイン反応で増幅
された約0.37kbpのDNA断片がクローニングされているプ
ラスミドを選抜した。選抜されたプラスミドが有するDN
A断片の塩基配列をDye terminator cycle sequencing k
it（PEアプライドバイオシステムズ社製）およびDNAシ
ークエンサー373S（PEアプライドバイオシステムズ社
製）を用い決定した。その結果、配列番号20に示される
313塩基の塩基配列が明らかになった。決定された塩基
配列を、遺伝子解析ソフト（GENETYX：SDC社製）を用い
てアミノ酸配列に翻訳する解析を行った。その結果、配
列番号21に示される104アミノ酸残基のアミノ酸配列が
明らかになった。上記エンドウ植物由来のDNA断片を有
するプラスミドを保有するクローンをPea371と命名し
た。

【００２２】実施例4（タバコ植物由来の葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子の部分塩基配列を有するDNA断片のクローニン
グ） タバコ（Nicotiana tabacum, cv. Xanthi-nc）cDNAライ
ブラリー（Clontech社製）約10⁷pfuをMolecular Clonin
g 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis
著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.
60から2.65に記載の方法にしたがって、NZCYM寒天培地
に広げて増幅し、寒天培地からSMバッファーでファージ
粒子を溶出した。溶出したファージ粒子約10¹¹pfuからD
NA抽出キット（Lambda-TRAP PLUS：Clontech社製）を用
いてDNAを抽出してタバコcDNAライブラリーのDNAを調製
した。該タバコcDNAライブラリーのDNAを鋳型とし、実
施例1で調製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て、ポリメラーゼチェイン反応を行った。ポリメラーゼ
チェイン反応における反応液は、1.25pmolの配列番号1
に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25
pmolの配列番号2に示される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチド、1.25pmolの配列番号3に示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号4に
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pm
olの配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチド、1.25pmolの配列番号6に示される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号7に示
される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmol
の配列番号8に示される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチド、0.5μlのAdvantage KlenTaq Polymerase Mix
（Clontech社製）、2.5μlの10x KlenTaq PCR reaction
buffer（Clontech社製）、各々5nmolの4種類の塩基（d
ATP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）および約3.5×
10^-15molのタバコcDNAライブラリーのDNAを0.2ml容ポリ
メラーゼチェイン反応用チューブに採り、滅菌蒸留水を
加えて全量を25μlとして調製した。ポリメラーゼチェ
イン反応における各工程は下記の条件で行った。変性工
程は94℃で1分間保温し、アニーリング工程は53℃で2分
間保温し、DNAポリメラーゼによる伸長工程は72℃で2分
間保温する第1サイクルを1回行った後、変性工程は94℃
で30秒間保温し、アニーリング工程は53℃で2分間保温
し、DNAポリメラーゼによる伸長工程は72℃で2分間保温
する第2サイクルを34回行った。ポリメラーゼチェイン
反応終了後、反応液25μlをMicroSpin S-400HR（ファル
マシアバイオテク社製）で濾過することで精製し、ポリ
メラーゼチェイン反応で増幅されたDNA断片の精製溶液
を得た。1.5ml容マイクロチューブに、ポリメラーゼチ
ェイン反応で増幅されたDNA断片の精製溶液2μl、直鎖
化されたプラスミドベクターpCR2.1（Invitrogen社製）
50ng、1μlの10x Ligation buffer（Invitrogen社
製）、4Weiss unitのT4 DNA Ligase（Invitrogen社製）
を採り、滅菌蒸留水を加えて全量を10μlとして混合
後、12℃で16時間保温することによりDNA連結反応を行
い、ポリメラーゼチェイン反応で増幅されたDNA断片をp
CR2.1に連結した。連結反応終了後、得られた反応液1μ
lで大腸菌INVαF'株のコンピテントセル（Invitrogen社
製）を形質転換し、アンピシリン耐性となった株を選抜
した。さらに、選抜された株からプラスミドDNAを抽出
しこれらを制限酵素で切断した後アガロース電気泳動で
分析することにより、ポリメラーゼチェイン反応で増幅
された約0.37kbpのDNA断片がクローニングされているプ
ラスミドを選抜した。該プラスミドが有するDNA断片の
塩基配列をDye terminator cycle sequencingkit（PEア
プライドバイオシステムズ社製）およびDNAシークエン
サー373S（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用い
決定した。その結果、配列番号22に示される313塩基の
塩基配列が明らかになった。決定された塩基配列を、遺
伝子解析ソフト（GENETYX：SDC社製）を用いてアミノ酸
配列に翻訳する解析を行った。その結果、配列番号23に
示される104アミノ酸残基のアミノ酸配列が明らかにな
った。上記タバコ植物由来のDNA断片を有するプラスミ
ドを保有するクローンをTob371と命名した。

【００２３】実施例5（ジャガイモ植物由来の葉緑体型
ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列を有するDNA断片のクロー
ニング） ジャガイモ（Solanum tuberosum, cv. Desiree）cDNAラ
イブラリー（Clontech社製）約10⁷pfuをMolecular Clon
ing 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch,T.Maniati
s著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）
2.60から2.65に記載の方法にしたがって、NZCYM寒天培
地に広げて増幅し、寒天培地からSMバッファーでファー
ジ粒子を溶出した。溶出したファージ粒子約10¹¹pfuか
らDNA抽出キット（Lambda-TRAP PLUS：Clontech社製）
を用いてDNAを抽出してジャガイモcDNAライブラリーのD
NAを調製した。該ジャガイモcDNAライブラリーのDNAを
鋳型とし実施例1で調製したオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとしてポリメラーゼチェイン反応を行った。ジャ
ガイモcDNAライブラリ−のDNAは以下の方法に従って調
製した。ポリメラーゼチェイン反応における反応液は、
1.25pmolの配列番号1に示される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号2に示される塩基
配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号
3に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.2
5pmolの配列番号4に示される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチド、1.25pmolの配列番号5に示される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチド、1.25pmolの配列番号6に
示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、1.25pm
olの配列番号7に示される塩基配列からなるオリゴヌク
レオチド、1.25pmolの配列番号8に示される塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチド、0.5μlのAdvantage KlenTa
q Polymerase Mix（Clontech社製）、2.5μlの10x Klen
Taq PCR reaction buffer（Clontech社製）、各々5nmol
の4種類の塩基（dATP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社
製）および約3.5×10^-15molのジャガイモcDNAライブラ
リーのDNAを0.2ml容ポリメラーゼチェイン反応用チュー
ブに採り、滅菌蒸留水を加えて全量を25μlとして調製
した。ポリメラーゼチェイン反応における各工程は下記
の条件で行った。変性工程は94℃で1分間保温し、アニ
ーリング工程は53℃で2分間保温し、DNAポリメラーゼに
よる伸長工程は72℃で2分間保温する第1サイクルを1回
行った後、変性工程は94℃で30秒間保温し、アニーリン
グ工程は53℃で2分間保温し、DNAポリメラーゼによる伸
長工程は72℃で2分間保温する第2サイクルを34回行っ
た。ポリメラーゼチェイン反応終了後、反応液25μlをM
icroSpin S-400HR（ファルマシアバイオテク社製）で濾
過することで精製し、ポリメラーゼチェイン反応で増幅
されたDNA断片の精製溶液を得た。1.5ml容マイクロチュ
ーブに、ポリメラーゼチェイン反応で増幅されたDNA断
片の精製溶液2μl、直鎖化されたプラスミドベクターpC
R2.1（Invitrogen社製）50ng、1μlの10x Ligation buf
fer（Invitrogen社製）、4Weiss unitのT4 DNA Ligase
（Invitrogen社製）を採り、滅菌蒸留水を加えて全量を
10μlとして混合後、12℃で16時間保温することによりD
NA連結反応を行い、ポリメラーゼチェイン反応で増幅さ
れたDNA断片をpCR2.1に連結した。連結反応終了後、得
られた反応液1μlで大腸菌INVαF'株のコンピテントセ
ル（Invitrogen社製）を形質転換し、アンピシリン耐性
となった株を選抜した。さらに、選抜された株からプラ
スミドDNAを抽出しこれらを制限酵素で切断した後アガ
ロース電気泳動で分析することにより、ポリメラーゼチ
ェイン反応で増幅された約0.37kbpのDNA断片がクローニ
ングされているプラスミドを選抜した。該プラスミドが
有するDNA断片の塩基配列をDye terminator cycle sequ
encingkit（PEアプライドバイオシステムズ社製）およ
びDNAシークエンサー373S（PEアプライドバイオシステ
ムズ社製）を用い決定した。その結果、配列番号24に示
される313塩基の塩基配列が明らかになった。決定され
た塩基配列を、遺伝子解析ソフト（GENETYX：SDC社製）
を用いてアミノ酸配列に翻訳する解析を行った。その結
果、配列番号25に示される104アミノ酸残基のアミノ酸
配列が明らかになった。上記ジャガイモ植物由来のDNA
断片を有するプラスミドを保有するクローンをPot371と
命名した。

【００２４】実施例6（Soy371、Pea371、Tob371、Pot37
1が有するDNA断片がコードするアミノ酸配列の比較） 実施例2〜5により得られたクローン（Soy371、Pea371、
Tob371およびPot371）が保有するプラスミドが有するDN
A断片にコードされるアミノ酸配列（配列番号9、21、23
および25）緑藻（Chlamydomonas reinhardtii）の葉緑
体型ＰＰＯおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis thali
ana, ecotype Columbia）の葉緑体型ＰＰＯのアミノ酸
配列を遺伝子解析ソフト（GENYETYX：SDC社製）を用い
て比較した。その結果、図1に示すように、これらのア
ミノ酸配列で保存されている共通配列の存在が示され
た。したがって、実施例2〜5で得られたクローン（Soy3
71、Pea371、Tob371およびPot371）が保有するプラスミ
ドが有するDNA断片には葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩
基配列が含まれることが確認された。

【００２５】実施例7（ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子のcDNAの塩基配列の決定） 実施例２で得られたSoy371クローンが有するDNA断片の
塩基配列を参考にして、5'上流領域増幅用プライマーと
して配列番号16に示される塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドを、3'下流領域増幅用プライマーとして配列番
号17に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを
調製した。オリゴヌクレオチドはDNA合成装置（PEアプ
ライドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthe
sizer）を用いてフォスフォアミダイト法で合成した。D
NA合成用溶媒はModel 394 DNA/RNA Synthesizer 用溶媒
（PEアプライドシステムズ社製）を用いた。DNA合成用
のカラムは40nMスケールのLV40カラム（PEアプライドシ
ステムズ社製）を用いた。DNA合成試薬はアデニン、シ
トシン、グアニン、チミンに相当するフォスフォアミダ
イト試薬を用いた。オリゴヌクレオチドの合成はDNA合
成装置（PEアプライドバイオシステムズ社：Model 394
DNA/RNA Synthesizer）を用い該装置のオペレーション
マニュアルに従って操作した。合成終了後、合成したオ
リゴヌクレオチドをアンモニア水でカラムから溶出し、
55℃で8時間保温して塩基に修飾されている保護基を取
り除き、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ（OPC
カートリッジ：PEアプライドバイオシステムズ社）で精
製した後、減圧乾燥することで、精製オリゴヌクレオチ
ドを調製した。実施例２で得られたSoy371クローンが有
するDNA断片にコードされているダイズ植物由来の葉緑
体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列に対して5'上流領域に
相当する領域を含むDNA断片（上流側DNA断片）をポリメ
ラーゼチェイン反応で増幅した。ポリメラーゼチェイン
反応における反応液は、10pmolの前記5'上流領域増幅用
プライマー、10pmolのラムダgt11 リバースプライマー
（宝酒造社製）、0.5μlのAdvantage KlenTaq Polymera
se Mix（Clontech社製）、2.5μlの10x KlenTaqPCR rea
ction buffer（Clontech社製）、各々5nmolの4種類の塩
基（dATP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）および約
3.5×10^-15molの実施例2で得たダイズcDNAライブラリー
のDNAを0.2ml容ポリメラーゼチェイン反応用チューブに
採り、滅菌蒸留水を加えて全量を25μlとして調製し
た。ポリメラーゼチェイン反応における各工程は下記の
条件で行った。変性工程は94℃で1分間保温し、アニー
リング工程およびDNAポリメラーゼによる伸長工程は65
℃で5分間保温する第1サイクルを1回行った後、変性工
程は94℃で30秒間保温し、アニーリング工程およびDNA
ポリメラーゼによる伸長工程は65℃で5分間保温する第2
サイクルを29回行った。その結果、上流側DNA断片の増
幅物が得られた。次に、Soy371クローンが有するDNA断
片にコードされているダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子の部分塩基配列に対して3'下流領域に相当する領
域を含むDNA断片（下流側DNA断片）をポリメラーゼチェ
イン反応で増幅した。ポリメラーゼチェイン反応におけ
る反応液は、10pmolの前記3'末端領域増幅用プライマ
ー、10pmolのラムダgt11 リバースプライマー（宝酒造
社製）、0.5μlのAdvantage KlenTaq Polymerase Mix
（Clontech社製）、2.5μlの10x KlenTaq PCR reaction
buffer（Clontech社製）、各々5nmolの4種類の塩基（d
ATP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）および約3.5×
10^{-1 5}molの実施例2で得たダイズcDNAライブラリーのDNA
を0.2mlポリメラーゼチェイン反応用チューブに採り、
滅菌蒸留水を加えて全量を25μlとして調製した。ポリ
メラーゼチェイン反応における各工程は下記の条件で行
った。変性工程は94℃で1分間保温し、アニーリング工
程およびDNAポリメラーゼによる伸長工程は65℃で5分間
保温する第1サイクルを1回行った後、変性工程は94℃で
30秒間保温し、アニーリング工程およびDNAポリメラー
ゼによる伸長工程は65℃で5分間保温する第2サイクルを
29回行った。その結果、下流側DNA断片の増幅物が得ら
れた。ポリメラーゼチェイン反応終了後、前記5'上流領
域増幅物を含むポリメラーゼチェイン反応液および前記
3'下流領域増幅物を含むポリメラーゼチェイン反応液そ
れぞれ25μlをMicroSpin S-400HR（ファルマシアバイオ
テク社製）で濾過することで精製し、ポリメラーゼチェ
イン反応で増幅されたDNA断片の精製溶液を得た。前記
上流側DNA断片増幅物の精製溶液2μlおよび前記下流側D
NA断片増幅物の精製溶液2μlを各々1.5ml容マイクロチ
ューブに採り、各々に、直鎖化されたプラスミドベクタ
ーpCR2.1（Invitrogen社製）50ng、1μlの10x Ligatio
n buffer（Invitrogen社製）、4Weiss unitのT4 DNA L
igase（Invitrogen社製）、滅菌蒸留水を加えて全量を1
0μlとして混合後、12℃で16時間保温することによりプ
ラスミドベクターとポリメラーゼチェイン反応で増幅さ
れたDNA断片との連結反応を行った。連結反応終了後、
得られた各々の反応液1μlで大腸菌INVαF'株のコンピ
テントセル（Invitrogen社製）を形質転換し、アンピシ
リン耐性となった株を選抜した。選抜された株からプラ
スミドDNAを抽出し、各プラスミドの有するDNA断片の塩
基配列の一部をDye terminator cycle sequencing kit
（PEアプライドバイオシステムズ社製）およびDNAシー
クエンサー373S（PEアプライドバイオシステムズ社製）
を用い分析した。このようにして上流側DNA断片増幅物
由来のプラスミドのうちSoy371クローンが有するDNA断
片と相同な塩基配列を含むDNA断片がクローニングされ
ているプラスミドを選抜することで、Soy371クローンが
有するDNA断片にコードされているダイズ植物由来の葉
緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列に対して5'上流領域
に相当する領域を含むDNA断片を有するクローン（SoyN
1）を得た。また、下流側DNA断片増幅物由来のプラスミ
ドのうちSoy371クローンと相同な塩基配列を含むDNA断
片がクローニングされているプラスミドを選抜し、Soy3
71クローンが有するDNA断片にコードされているダイズ
植物由来の葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列に対し
て3'下流領域に相当する領域を含むDNA断片を有するク
ローン（SoyC1）を得た。得られたSoyN1クローンおよび
SoyC1クローンが保有するプラスミドが有するDNA断片の
塩基配列をDye terminator cycle sequencing kit（PE
アプライドバイオシステムズ社製）およびDNAシークエ
ンサー373S（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用
い決定した。決定されたSoy371、SoyN1、SoyC1クローン
が有するDNA断片の塩基配列を遺伝子解析ソフト（GENET
YX：SDC社製）を用いて解析し、これらの塩基配列を重
複部分で結合した。その結果、配列番号10の第432番目
の塩基から第1959番目の塩基の塩基配列が明らかになっ
た。判明した塩基配列のオープンリーディングフレーム
を遺伝子解析ソフト（GENETYX：SDC社製）を用いて検索
した。その結果、配列番号9の第139番目の残基から第54
3番目の残基のアミノ酸配列をコードするオープンリー
ディングフレームが判明し、判明したオープンリーディ
ングフレームはタンパク質のＮ末端部分をコードする塩
基配列が欠けており、葉緑体型ＰＰＯの全領域が得られ
ていないことが判明した。そこで、さらに前記ダイズ葉
緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列を参考にして、5'上
流領域増幅用プライマー２として配列番号17で示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを調製した。オリ
ゴヌクレオチドはDNA合成装置（PEアプライドバイオシ
ステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を用い
てフォスフォアミダイト法で合成した。DNA合成用溶媒
はModel 394 DNA/RNA Synthesizer用溶媒（PEアプライ
ドシステムズ社製）を用いた。DNA合成用のカラムは40n
MスケールのLV40カラム（PEアプライドシステムズ社
製）を用いた。 DNA合成試薬はアデニン、シトシン、グ
アニン、チミンに相当するフォスフォアミダイト試薬を
用いた。オリゴヌクレオチドの合成はDNA合成装置（PE
アプライドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Sy
nthesizer）を用い該装置のオペレーションマニュアル
に従って操作した。合成終了後、合成したオリゴヌクレ
オチドをアンモニア水でカラムから溶出し、55℃で8時
間保温して塩基に修飾されている保護基を取り除き、オ
リゴヌクレオチド精製用カートリッジ（OPCカートリッ
ジ：PEアプライドバイオシステムズ社）で精製した後、
減圧乾燥することで、精製オリゴヌクレオチドを調製し
た。調製した5'上流領域増幅用プライマー２をプライマ
ーとして用い、前記ダイズ葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分
塩基配列に対して5'上流領域に相当する領域をコードす
るDNA断片をポリメラーゼチェイン反応で増幅し、プラ
スミドベクターにクローニングした。ポリメラーゼチェ
イン反応における反応液は、10pmolの前記5'上流領域増
幅用プライマー２、10pmolのラムダgt11 リバースプラ
イマー（宝酒造社製）、0.5μlのAdvantage KlenTaq Po
lymerase Mix（Clontech社製）、2.5μlの10x KlenTaq
PCR reacion buffer（Clontech社製）、各々5nmolの4種
類の塩基（dATP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）、
および、約3.5×10^-15molの実施例2で得たダイズcDNAラ
イブラリーのDNAを0.2ml容ポリメラーゼチェイン反応用
チューブに採り、滅菌蒸留水を加えて全量を25μlとし
て調製した。ポリメラーゼチェイン反応における各工程
は下記の条件で行った。変性工程は94℃で1分間保温
し、アニーリング工程およびDNAポリメラーゼによる伸
長工程は65℃で5分間保温する第1サイクルを1回行った
後、変性工程は94℃で30秒間保温し、アニーリング工程
およびDNAポリメラーゼによる伸長工程は65℃で5分間保
温する第2サイクルを34回行った。ポリメラーゼチェイ
ン反応終了後、反応液25μlをMicroSpin S-400HR（ファ
ルマシアバイオテク社製）で濾過することで精製し、ポ
リメラーゼチェイン反応で増幅されたDNA断片の精製溶
液を得た。1.5ml容マイクロチューブに、上記ポリメラ
ーゼ反応で増幅されたDNA断片の精製溶液2μl、直鎖化
されたプラスミドベクターpCR2.1（Invitrogen社製）50
ng、1μlの10x Ligation buffer（Invitrogen社
製）、4Weiss unitのT4 DNA Ligase（Invitrogen社製）
を採り、滅菌蒸留水を加えて全量を10μlとして混合
後、12℃で16時間保温することによりDNA連結反応を行
い、ポリメラーゼチェイン反応で増幅された生成物をプ
ラスミドベクターに連結した。連結反応終了後、得られ
た反応液1μlで大腸菌INVαF'株のコンピテントセル（I
nvitrogen社製）を形質転換し、アンピシリン耐性とな
った株を選抜した。選抜された株からプラスミドDNAを
抽出し、各プラスミドの有するDNA断片の塩基配列の一
部をDye terminatorcycle sequencing kit（PEアプライ
ドバイオシステムズ社製）およびDNAシークエンサー373
S（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用い分析し
た。このように選抜された株に含有されたプラスミドの
うち、前記ダイズ葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
と相同な塩基配列を含むDNA断片がクローニングされて
いるプラスミドを選抜することで、ダイズ葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子の部分塩基配列の5'上流領域に相当する領域を
含むDNA断片を有するクローン（SoyN2）を得た。得られ
たSoyN2クローンが有するDNA断片の塩基配列をDye term
inator cycle sequencing kit（PEアプライドバイオシ
ステムズ社製）およびDNAシークエンサー373S（PEアプ
ライドバイオシステムズ社製）を用い決定した。その結
果、配列番号10の第1番目の塩基から第431番目の塩基の
塩基配列が明らかになった。決定されたSoy371、SoyN
1、SoyC1、SoyN2の有するDNA断片の塩基配列を遺伝子解
析ソフト（GENETYX：SDC社製）を用いて重複部分で結合
した。その結果、配列番号10に示されるダイズ植物由来
の葉緑体型ＰＰＯのcDNAの全塩基配列（1959bp）が決定
された。決定された塩基配列を遺伝子解析ソフト（GENE
TYX：SDC社製）を用いてアミノ酸配列に翻訳した。その
結果、ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯのcDNAがコード
するタンパク質のアミノ酸配列は配列番号9に示される5
43アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であった。また、
このアミノ酸配列のN末端側のアミノ酸には、葉緑体移
送シグナルペプチドのアミノ酸配列が存在していた。こ
のアミノ酸配列を配列番号11に、このアミノ酸配列をコ
ードするDNA断片の塩基配列を配列番号12に示す。

【００２６】実施例8（ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子の全長cDNAクローンの取得1） ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の全長を含むDN
A断片の増幅に用いるプライマーはDNA合成装置（PEアプ
ライドバイオシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthe
sizer）を用いてフォスフォアミダイト法で合成した。D
NA合成用溶媒はModel 394 DNA/RNA Synthesizer 用溶媒
（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用いた。DNA
合成用のカラムは40nMスケールのLV40カラム（PEアプラ
イドバイオシステムズ社製）を用いた。 DNA合成試薬は
アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびイノシン
に相当するフォスフォアミダイト試薬を用いた。オリゴ
ヌクレオチドの合成はDNA合成装置（PEアプライドバイ
オシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）を
用い該装置のオペレーションマニュアルにしたがって操
作し、N末端プライマーとして配列番号18に示される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチド、C末端プライマー
として配列番号19に示される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドを合成した。合成終了後、合成したオリゴヌ
クレオチドをアンモニア水でカラムから溶出し、55℃で
8時間保温して塩基に修飾されている保護基を取り除
き、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ（OPCカー
トリッジ：PEアプライドバイオシステムズ社）で精製し
た後、減圧乾燥することで、N末端プライマーおよびC末
端プライマーを調製した。ダイズ（Glycine max, var.
Williams82 ）を播種後25℃で20日間栽培し、緑葉を
採取した。採取した緑葉5gを液体窒素10mlで凍結させ、
乳鉢、乳棒により磨砕し細かい粉末状にした。液体窒素
を気化させた後、RNA抽出試薬（ISOGEN：日本ジーン社
製）で付属のマニュアルに準じて操作を行い、RNAを抽
出した。得られたRNA抽出液からエタノール沈殿で全RNA
を回収し、得られた全RNAからpoly(A)RNA分画キット（B
IOMAG mRNA Purification kit：パーセプティブバイオ
システム社製）を用い、付属のマニュアルに準じて操作
を行い、poly(A)RNAを分画し、回収した。得られたpoly
(A)RNA 1μgから、Marathon cDNA amplification kit
（Clontech社製）に含まれているcDNA合成試薬を用い、
付属のマニュアルに準じて操作を行いcDNAを合成した。
得られたcDNAを鋳型にしてポリメラーゼチェイン反応で
ダイズ植物の葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を増幅した。具体的
には、ポリメラーゼチェイン反応における反応液は、10
pmolの前記N末端プライマー、10pmolの前記C末端プライ
マー、0.5μlのAdvantage KlenTaq Polymerase Mix（Cl
ontech社製）、2.5μlの10x KlenTaq PCR reaction buf
fer（Clontech社製）、各々5nmolの4種類の塩基（dAT
P、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）、および、約0.5
×10 ^-15molの前記ダイズcDNAライブラリーDNAを0.2ml容
ポリメラーゼチェイン反応用チューブに取り、滅菌蒸留
水を加えて全量を25μlとして調製した。ポリメラーゼ
チェイン反応における各工程は下記の条件で行った。変
性工程は94℃で1分間保温し、アニーリング工程およびD
NAポリメラーゼによる伸長工程は65℃で5分間保温する
第1サイクルを1回行った後、変性工程は94℃で15秒間保
温し、アニーリング工程およびDNAポリメラーゼによる
伸長工程は65℃で5分間保温する第2サイクルを29回行っ
た。ポリメラーゼチェイン反応終了後、反応液25μlをM
icroSpinS-400HR（ファルマシアバイオテク社製）で濾
過することで精製し、ポリメラーゼチェイン反応で増幅
されたDNA断片の精製溶液を得た。1.5ml容マイクロチュ
ーブに、ポリメラーゼ反応で増幅されたDNA断片の精製
溶液2μl、直鎖化されたプラスミドベクターpCR2.1（In
vitrogen社製）50ng、1μlの10x Ligation buffer（I
nvitrogen社製）、4Weiss unitのT4 DNA Ligase（Invit
rogen社製）を採り、滅菌蒸留水を加えて全量を10μlと
して混合後、12℃で16時間保温することによりDNA連結
反応を行い、ポリメラーゼチェイン反応で増幅された生
成物をpCR2.1に連結した。連結反応終了後、得られた反
応液1μlで大腸菌INVαF'株のコンピテントセル（Invit
rogen社製）を形質転換し、アンピシリン耐性となった
株を選抜した。次いで、選抜された株に含有されたプラ
スミドのDNAを抽出し、該プラスミドに含まれるDNA断片
の塩基配列をDye terminator cycle sequencing kit（P
Eアプライドバイオシステムズ社製）およびDNAシークエ
ンサー373S（PEアプライドバイオシステムズ社製）を用
い決定した。その結果、ダイズ植物の葉緑体型ＰＰＯ遺
伝子の全塩基配列を含むDNA断片がクローニングされて
いるプラスミドを見出し、該プラスミドをpSPPO-Pと命
名した。pSPPO-Pにクローニングされたダイズ植物の葉
緑体型ＰＰＯ遺伝子の全塩基配列を含むDNA断片の取得
方法の概略を図２に示す。

【００２７】実施例9（ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子の全長cDNAクローンの取得2） 実施例7で得られた3つのクローン（SoyN1、SoyN2、SoyC
1）が保有するプラスミドの有するDNA断片をMolecular
Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Ma
niatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
年）等に記載されている通常の方法に準じ、下記の方法
で結合してダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の全
長cDNAを合成した。本方法によるダイズ植物由来の葉緑
体型ＰＰＯ遺伝子の全長cDNAを有するプラスミドの取得
方法を図3に示す。まず、SoyN2を制限酵素Aor51HIおよ
びBamHIで切断し、得られる約0.5kbpのDNA断片をpBlues
criptIIKS(+)（Stratagene社製）のSmaI-BamHIサイトに
組み込み、プラスミド（pSPPO-N2）を作製した。次に、
SoyC1を制限酵素BamHIおよびSpeIで切断することで得ら
れる約0.5kbpのDNA断片をpSPPO-N2のBamHI-SpeIサイト
に組み込み、プラスミド（pSPPO-N2C1）を作製した。さ
らに、SoyN1をBamHIで切断することで得られる約1kbpの
DNA断片をpSPPO-N2C1のBamHIサイトに組み込み、ダイズ
ＰＰＯ遺伝子の全塩基配列を含むDNA断片が組み込まれ
ているプラスミド（pSPPO-E）を得た。

【００２８】実施例10（ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子のゲノムクローンの取得） Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Fr
isch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory
Press 1989年）2.60から2.65に記載されている方法に準
じて、NZY寒天培地に約9.0×10⁵pfuのダイズ（Glycine
max, var. Williams82 ）植物ゲノムライブラリー（ S
TRATAGENE社製）を広げ、37℃で8時間培養した。この寒
天培地の上にナイロンフィルター（Hybond-N+：アマシ
ャム社製）を置き、1分間静置してファージ粒子を吸着
させた。次に、フィルターをアルカリ溶液（1.5M NaC
l、0.5N NaOH）に3分間浸してファージ粒子を溶解させ
てフィルターにファージDNAを結合させた後、該フィル
ターを中和溶液（1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl、pH7.5）
に5分間浸した。次いで、このフィルターを洗浄溶液（3
00mM NaCl、30mM Sodium Citrate、200mM Tris-HCl）で
5分間洗った後、80℃で90分間ベーキングすることによ
りファージDNAをフィルターに固定した。上記のように
して作製したフィルターを容器に入れ、プレハイブリダ
イゼーション溶液（750mM NaCl、75mM Sodium Citrat
e、0.1% Ficoll400、0.1% ポリビニルピロリドン、0.1%
ウシ血清アルブミン、0.5% SDS、100μg/ml 変性Calf-
thymus DNA）を入れて、45℃で2時間保温し、プレハイ
ブリダイゼーションを行った。実施例2で得られたクロ
ーン（Soy371）が保有するプラスミドが有するダイズ植
物の葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列をコードする
DNA断片をランダムプライムラべリングキット（ベーリ
ンガーマンハイム社製）を用いて〔α-³²P〕dCTP（0.74
Mbq、アマシャム社製）で標識しプローブを調製した。
このプローブ2000kcpm相当量、10mlのハイブリダイゼー
ション溶液（750mM NaCl、75mM Sodium Citrate、0.1%
Ficoll400、0.1% ポリビニルピロリドン、0.1% ウシ血
清アルブミン、0.5% SDS、100μg/ml ）および上記フィ
ルターを容器に入れて45℃で16時間保温した。ハイブリ
ダイゼーション反応後、該フィルターについて、55℃の
洗浄溶液（150mM NaCl、15mM Sodium Citrate、0.1% SD
S）200mlに浸して15分間振とうする洗浄を２回行った。
ついで、フィルターを2×SSC溶液（300mM NaCl、30mMSo
dium Citrate）で軽くすすいだ後、イメージングプレー
ト（富士フィルム社製）に4時間露光させ、BAS2000（富
士フィルム社製）を用いて解析し、シグナルを検出し
た。フィルターの作製に用いたダイズ植物ゲノムライブ
ラリーを広げたNZY寒天培地のシグナルが検出された位
置に相当する部分を5mm角にくり抜き、これを500μlのS
Mバッファー（50mM Tris-HCl pH7.5、0.1M NaCl、7mM M
gSO₄、0.01%ゼラチン）に3時間浸してファージを溶出さ
せた。得られたファージ粒子溶出液をMolecular Clonin
g 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis
著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.
60から2.65に記載の方法に準じてNZY寒天培地に広げ、3
7℃で8時間培養した。前述の方法と同様の方法でフィル
ターを作製しハイブリダイゼーションを行った。フィル
ターの作製に用いたファージ粒子溶出液を広げたNZY寒
天培地のシグナルが検出された位置に相当する部分から
ファージ粒子を溶出し、再度NZY寒天培地に広げ、フィ
ルターを作製し、ハイブリダイゼーションを行った。そ
の結果、プローブと強くハイブリダイズするファージク
ローンを36個得た。この内の１つのクローンについて以
下の解析を行った。該クローンにクローニングされたDN
A断片の塩基配列の分析はMolecular Cloning 2nd edit
ion（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press 1989年）13.15に記載さ
れているプライマーエクステンション法に準じて行っ
た。 具体的には、得られたファージクローンをMolecul
ar Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch,
T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press
1989年）2.60から2.65に記載の方法に準じてNZYM液体培
地で増幅し、得られたファージ液からLambda-TRAP PLUS
DNA Isolation Kit（Clontech社製）を用いてファージ
クローンのDNAを抽出した。抽出したファージクローン
のDNAを鋳型としてDye terminator cycle sequencing k
it（PEアプライドバイオシステムズ社製）およびDNAシ
ークエンサー373S（PEアプライドバイオシステムズ社
製）を用い、付属のプロトコールに準じて塩基配列の分
析を行いダイズ葉緑体型ＰＰＯゲノム遺伝子の全領域の
塩基配列（10455bp）を決定した。決定したダイズ葉緑
体型ＰＰＯゲノム遺伝子の塩基配列を配列番号13に示
す。

【００２９】実施例１１（ダイズ植物由来の葉緑体型Ｐ
ＰＯ遺伝子のゲノムクローンの塩基配列解析） 実施例10により得られたＰＰＯ遺伝子の塩基配列を遺伝
子解析ソフト（GENETYX：SDC社製）で解析した。その結
果、イントロン領域の塩基配列、エキソンの構成が明ら
かになった。該ＰＰＯ遺伝子のイントロン領域の配列お
よびエキソンの構成を配列番号13に示す。また、ＰＰＯ
遺伝子のプロモーターの塩基配列が明らかになった。Ｐ
ＰＯ遺伝子のプロモーターの塩基配列を配列番号14に示
す。

【００３０】実施例１２（直接導入用葉緑体型ＰＰＯ遺
伝子発現プラスミドの構築） ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯを植物細胞で発現させ
るために、植物用直接導入発現プラスミドを構築する。
まず、ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ遺伝子のオープ
ンリーディングフレームを含むDNA断片の増幅に用いる
配列番号26および配列番号27に示される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチドをDNA合成装置（PEアプライドバ
イオシステムズ社：Model 394 DNA/RNA Synthesizer）
を用いてフォスフォアミダイト法で合成する。DNA合成
用溶媒はModel 394 DNA/RNA Synthesizer 用溶媒（PEア
プライドバイオシステムズ社製）を、DNA合成用のカラ
ムは40nMスケールのLV40カラム（PEアプライドバイオシ
ステムズ社製）を、DNA合成試薬はアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミンおよびイノシンに相当するフォス
フォアミダイト試薬を用いる。オリゴヌクレオチドの合
成はDNA合成装置（PEアプライドバイオシステムズ社：M
odel 394 DNA/RNA Synthesizer）のオペレーションマニ
ュアルにしたがって操作する。合成終了後、合成したオ
リゴヌクレオチドをアンモニア水でカラムから溶出し、
55℃で8時間保温して塩基に修飾されている保護基を取
り除き、オリゴヌクレオチド精製用カートリッジ（OPC
カートリッジ：PEアプライドバイオシステムズ社）で精
製した後、減圧乾燥することで、配列番号26および配列
番号27に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を調製する。次に、実施例6により得られたダイズ植物
由来の葉緑体型ＰＰＯの全長cDNAを鋳型とし、かつ、配
列番号26および配列番号27に示される塩基配列からなる
上記のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポ
リメラーゼチェイン反応を行い、ダイズ葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子のオープンリーディングフレームを含む約1.75kb
pのDNA断片を増幅する。該ポリメラーゼチェイン反応は
0.2ml容ポリメラーゼチェイン反応用チューブに10pmol
の配列番号26に示される塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチド、10pmolの配列番号27に示される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチド、0.5μlのAdvantage KlenTaq Po
lymerase Mix（Clontech社製）、2.5μlの10x KlenTaq
PCR reaction buffer（Clontech社製）、5nmolの４種類
の各々の塩基（dATP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社
製）、および、1ngの実施例6により得られたダイズ植物
由来の葉緑体型ＰＰＯの全長cDNAを加え、全量を25μl
として行う。該ポリメラーゼチェイン反応における各工
程は下記の条件で行う。変性工程は94℃で1分間保温
し、アニーリング工程およびDNAポリメラーゼによる伸
長工程は65℃で4分間保温する第1サイクルを1回行った
後、変性工程は94℃で30秒間保温し、アニーリング工程
およびDNAポリメラーゼによる伸長工程は65℃で4分間保
温する第2サイクルを30回行う。ポリメラーゼチェイン
反応終了後、反応液をMicroSpin S-400HR（ファルマシ
アバイオテク社製）で濾過することによりポリメラーゼ
チェイン反応によって増幅されたDNA断片を精製する。
このDNA断片の末端をDNAブランティングキット（宝酒造
社製）を用いて平滑化した後、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造社製）で5'末端にリン酸基を付与する。一
方、pUC19由来のGUS発現ベクターpBI221（Clontech社
製）を制限酵素SmaＩおよびSacI（いずれも宝酒造社
製）で切断し、GUS構造遺伝子を取り除いた2.8kbpのDNA
断片を回収し、末端をDNAブランティングキット（宝酒
造社製）を用いて平滑末端化した後、バクテリアアルカ
リフォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化する。
前述の2つのDNA断片をマイクロチューブに採り、DNAラ
イゲーションキット（宝酒造社製）を用いて結合する。
得られる反応液で大腸菌 HB101のコンピテントセル（宝
酒造社製）を形質転換しアンピシリン耐性となった株を
選抜する。さらに、選抜された株に含有されるプラスミ
ドのうちカリフラワーモザイクウィルス由来35Sプロモ
ーター、ノパリンシンターゼ由来ターミネーターに対し
てダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯのコード領域が順方
向に挿入されているプラスミドを選抜し直接導入用ダイ
ズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ発現プラスミド（pSPPO-
1）を得る。

【００３１】実施例１３（間接導入用葉緑体型ＰＰＯ遺
伝子発現プラスミドの構築） ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯを植物細胞に導入して
発現させるために、植物用間接導入発現プラスミドを構
築する。実施例6で得られたダイズ植物由来の葉緑体型
ＰＰＯの全長cDNAを鋳型とし、配列番号26および配列番
号27に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを
用いてポリメラーゼチェイン反応を行い、ダイズ植物由
来の葉緑体型ＰＰＯをコ−ドする約1.75kbpのDNA断片を
増幅する。該ポリメラーゼチェイン反応は、0.2ml容ポ
リメラーゼチェイン反応用チューブに10pmolの配列番号
26に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、10
pmolの配列番号27に示される塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチド、0.5μlのAdvantage KlenTaq Polymerase M
ix（Clontech社製）、2.5μlの10x KlenTaq PCR reacio
n buffer（Clontech社製）、5nmolの4種類の各々の塩基
（dATP、dCTP、dGTP、dTTP：Clontech社製）、および、
1ngの実施例6で得られたダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰ
Ｏの全長cDNAを加え、全量を25μlとしポリメラーゼチ
ェイン反応を行う。該ポリメラーゼチェイン反応におけ
る各工程は下記の条件で行う。変性工程は94℃で1分間
保温し、アニーリング工程およびDNAポリメラーゼによ
る伸長工程は65℃で4分間保温する第1サイクルを1回行
った後、変性工程は94℃で30秒間保温し、アニーリング
工程およびDNAポリメラーゼによる伸長工程は65℃で4分
間保温する第2サイクルを30回行う。ポリメラーゼチェ
イン反応終了後、反応液をMicroSpin S-400HR（ファル
マシアバイオテク社製）で濾過することによりポリメラ
ーゼチェイン反応によって増幅されたDNA断片を精製す
る。このDNA断片の末端をDNAブランティングキット（宝
酒造社製）を用いて平滑化した後、T4ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造社製）で5'末端にリン酸基を付与す
る。一方、pBIN19由来のGUS発現バイナリーベクターpBI
121（Clontech社製）を制限酵素SmaＩ、および、SacI
（いずれも宝酒造社製）で切断し、GUS構造遺伝子を取
り除いたDNA断片を回収し、末端をDNAブランティングキ
ット（宝酒造社製）を用いて平滑末端化した後、バクテ
リアアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン
酸化する。前述の2つのDNA断片をマイクロチューブに採
り、DNAライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて
結合する。得られる反応液で大腸菌 HB101のコンピテン
トセル（宝酒造社製）を形質転換しアンピシリン耐性と
なった株を選抜する。さらに、選抜された株に含有され
るプラスミドのうちカリフラワーモザイクウィルス由来
35Sプロモーター、ノパリンシンターゼ由来ターミネー
ターに対してダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯのコード
領域が順方向に挿入されているプラスミドを選抜し間接
導入用ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ発現プラスミド
（pSPPO-2）を得る。

【００３２】実施例１４（ダイズ植物由来の葉緑体型Ｐ
ＰＯ遺伝子発現プラスミド導入形質転換植物の作出） 実施例１２で得られるpSPPO-1を特開平3ー291501に記載
されている方法で、パーティクルガンによりダイズ不定
胚に導入し、形質転換ダイズを得る。同様に、J. Puont
i-Kaerlas et al.、Theoretical and Applied Genetic
s、1990年、第80巻、246-252頁に記載の方法に準じて、
無菌的に発芽させたエンドウ実生の上胚軸または子葉に
感染させ、形質転換エンドウを得る。同様に、島田ら
著、育種学会雑誌、1994年、第44巻、別冊1号、66頁に
記載の方法に準じて、パーティクルガンにより無菌培養
したイネ未熟胚盤に導入し、形質転換イネを得る。同様
に、宅見ら著、育種学会雑誌、1995年、第44巻、別冊1
号、57頁に記載の方法に準じて、パーティクルガンによ
り無菌培養したコムギ未熟胚盤に導入し、形質転換コム
ギを得る。同様に、萩尾ら著、育種学会雑誌、1995年、
第44巻、別冊1号、67頁に記載の方法に準じて、パーテ
ィクルガンにより無菌培養したオオムギ未熟胚盤に導入
し、形質転換オオムギを得る。同様にM. E. Fromm et a
l.、BIO/TECHNOLOGY、1990年、第8巻、833-839頁に記載
の方法に準じて、パーティクルガンによりトウモロコシ
不定胚に導入し、形質転換トウモロコシを得る。さら
に、実施例１３で得られる間接導入用ダイズ植物由来の
葉緑体型ＰＰＯ遺伝子発現プラスミド、pSPPO-2をバイ
ナリーベクター法（Clontech社製：GUS ジーンフュージ
ョンシステム）により、Agrobacterium tumefaciens LB
A4404に移す。この菌株を、植物遺伝子操作マニュアル
（内宮著、講談社サイエンティフィック、1990年）に記
載の方法に準じて、無菌培養したタバコ葉片に感染さ
せ、形質転換タバコを得る。同様に、N. Pawlicki et a
l.、Plant cell, Tissue and Organ Culture、1992年、
第31巻、129-139頁に記載の方法に準じて、無菌培養し
たニンジン実生の葉柄に感染させ形質転換ニンジンを得
る。

【００３３】

【発明の効果】本発明により、葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を
効率よくクローニングするためのプライマー用オリゴヌ
クレオチド、それを利用したＰＰＯ遺伝子の取得方法、
および新規なＰＰＯ遺伝子等を提供することが可能とな
った。

【００３４】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例2から5で取得されたDNA断片にコードさ
れているアミノ酸配列、緑藻およびシロイヌナズナ由来
のＰＰＯのアミノ酸配列を比較した結果を示す。

【図２】葉緑体型ＰＰＯ遺伝子のポリメラーゼチェイン
反応を用いた取得方法を模式図で示す。

【図３】葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を有するプラスミドの制
限酵素を用いた合成方法を模式図で示す。

【図４】ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を植物
細胞に導入して発現させるために用いる直接導入用ＰＰ
Ｏ発現プラスミドpSPPO-1の構築方法を示す。図中、「3
5S」はカリフラワーモザイクウィルス由来の35Sプロモ
ーターを、「NOS」はアグロバクテリウム由来のノパリ
ンシンターゼターミネーターを、「SPPO」はダイズ植物
由来の葉緑体型ＰＰＯcDNAを、その他の記号は制限酵素
認識部位を示す。

【図５】ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ遺伝子を植物
細胞に導入して発現させるために用いる間接導入用ＰＰ
Ｏ発現プラスミドpSPPO-2の構築方法を示す。図中、「3
5S」はカリフラワーモザイクウィルス由来の35Sプロモ
ーターを、「NOS」はアグロバクテリウム由来のノパリ
ンシンターゼターミネーターを、「SPPO」はダイズ植物
由来の様緑体型ＰＰＯcDNAを、「NTPII」はカナマイシ
ン耐性遺伝子を、「NOSp」はアグロバクテリウム由来の
ノパリンシンターゼプロモーターを、「LB」および「R
B」はそれぞれアグロバクテリウムT-DNA由来の左端境界
塩基配列および右端境界塩基配列を、その他の記号は制
限酵素認識部位を示す。

【００３５】

【配列の簡単な説明】 １．配列番号１：葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を含むDNA断片の増幅に用いるオリゴヌクレオチドの塩
基配列を示す。 ２．配列番号２：葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を含むDNA断片の増幅に用いるオリゴヌクレオチドの塩
基配列を示す。 ３．配列番号３：葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を含むDNA断片の増幅に用いるオリゴヌクレオチドの塩
基配列を示す。 ４．配列番号４：葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を含むDNA断片の増幅に用いるオリゴヌクレオチドの塩
基配列を示す。 ５．配列番号５：葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を含むDNA断片の増幅に用いるオリゴヌクレオチドの塩
基配列を示す。 ６．配列番号６：葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を含むDNA断片の増幅に用いるオリゴヌクレオチドの塩
基配列を示す。 ７．配列番号７：葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を含むDNA断片の増幅に用いるオリゴヌクレオチドの塩
基配列を示す。 ８．配列番号８：葉緑体型ＰＰＯ遺伝子の部分塩基配列
を含むDNA断片の増幅に用いるオリゴヌクレオチドの塩
基配列を示す。 ９．配列番号９：ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ遺伝
子のcDNAにコードされている葉緑体型ＰＰＯのアミノ酸
配列を示す。 １０．配列番号１０：ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子のcDNAクローンの塩基配列を示す。 １１．配列番号１１：ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子の葉緑体移送シグナルペプチドのアミノ酸配列を
示す。 １２．配列番号１２：ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子の葉緑体移送シグナルペプチドの塩基配列を示
す。 １３．配列番号１３：ダイズ植物のゲノムDNA由来の葉
緑体型ＰＰＯ遺伝子の塩基配列を示す。 １４．配列番号１４：ダイズ植物のゲノムDNA由来の葉
緑体型ＰＰＯ遺伝子のプロモーターの塩基配列を示す。 １５．配列番号１５：ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子の上流側DNA断片を取得するために5'上流領域増
幅用プライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの塩基
配列を示す。 １６．配列番号１６：ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子の下流側DNA断片を取得するために3'下流領域増
幅用プライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの塩基
配列を示す。 １７．配列番号１７：ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
のN末端領域を含むDNA断片を取得するための5'上流領域
増幅用プライマー２として用いたオリゴヌクレオチドの
塩基配列を示す。 １８．配列番号１８：ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子の全長cDNAクローンを増幅するためのN末端プラ
イマーとして用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示
す。 １９．配列番号１９：ダイズ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子の全長cDNAクローンを増幅するためのC末端プラ
イマーとして用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示
す。 ２０．配列番号２０：エンドウ植物由来の葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子の部分塩基配列を含むDNA断片の塩基配列を示
す。 ２１．配列番号２１：エンドウ植物由来の葉緑体型ＰＰ
Ｏ遺伝子の部分塩基配列を含むDNA断片にコードされて
いるアミノ酸配列を示す。 ２２．配列番号２２：タバコ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子の部分塩基配列を含むDNA断片の塩基配列を示
す。 ２３．配列番号２３：タバコ植物由来の葉緑体型ＰＰＯ
遺伝子の部分塩基配列を含むDNA断片にコードされてい
るアミノ酸配列を示す。 ２４．配列番号２４：ジャガイモ植物由来の葉緑体型Ｐ
ＰＯ遺伝子の部分塩基配列を含むDNA断片の塩基配列を
示す。 ２５．配列番号２５：ジャガイモ植物由来の葉緑体型Ｐ
ＰＯ遺伝子の部分塩基配列を含むDNA断片にコードされ
ているアミノ酸配列を示す。 ２６．配列番号２６：ダイズ植物由来の直接導入用葉緑
体型ＰＰＯ発現プラスミドおよび間接導入用葉緑体型Ｐ
ＰＯ発現プラスミドの構築でN末端プライマーとして用
いたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 ２７．配列番号２７：ダイズ植物由来の直接導入用葉緑
体型ＰＰＯ発現プラスミドおよび間接導入用葉緑体型Ｐ
ＰＯ発現プラスミドの構築でC末端プライマーとして用
いたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

【００３６】

【配列表】

【００３７】配列番号：1 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：6 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 特徴を表す記号：modified base存在位置：12 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：13 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：18 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 配列 GGITTNGGIC ANNTICANCC IAGIACICAA GG 32

【００３８】配列番号：2 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：6 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：12 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：13 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：18 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 配列 GGITTNGGIC ANNTICANCC IAGIACICAG GG 32

【００３９】配列番号：3 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：6 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：12 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：13 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：18 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 配列 GGITTNGGIC ANNTICANCC ICGIACICAA GG 32

【００４０】配列番号：4 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：6 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：12 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：13 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：18 他の情報：N=4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-ピリミド[4,5-
c][1,2]オキサジン-7-オン 配列 GGITTNGGIC ANNTICANCC ICGIACICAG GG 32

【００４１】配列番号：5 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：15 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：18 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 配列 GCIACICCIG AIACNTANTTI CCACC 25

【００４２】配列番号：6 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：15 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：18 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 配列 GCIACICCIG AIACNTANTTI CCCCC 25

【００４３】配列番号：7 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：15 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：18 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 配列 GCIACICCIG AIACNTANTT ICCGCC 25

【００４４】配列番号：8 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：15 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 特徴を表す記号：modified base 存在位置：18 他の情報：N=6-(メトキシイミノ)-6,9-ジヒドロ-1H-2-
プリンアミン 配列 GCIACICCIG AIACNTANTT ICCTCC 25

【００４５】配列番号：9 配列の長さ：543 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ダイズ（Glycine max） 品種名：ウイリアム82（Williams82） 配列の特徴 特徴を表す記号：transit peptide 存在位置：1..60 特徴を決定した方法：P 配列 Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu 1 5 10 15 Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr 20 25 30 Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile 35 40 45 Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly 100 105 110 Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met 115 120 125 Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly 130 135 140 Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro 145 150 155 160 Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile 165 170 175 Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro 180 185 190 Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu 195 200 205 Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val 210 215 220 Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys 225 230 235 240 Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe 245 250 255 Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro 260 265 270 Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly 275 280 285 Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val 290 295 300 Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu 305 310 315 320 Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys 325 330 335 Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu 340 345 350 Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr 355 360 365 Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg 370 375 380 Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His 385 390 395 400 Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser 405 410 415 Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr 420 425 430 Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu 435 440 445 Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro 450 455 460 Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala 465 470 475 480 Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys 485 490 495 Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn 500 505 510 Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu 515 520 525 Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys 530 535 540 543

【００４６】配列番号：10 配列の長さ：1959 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ダイズ（Glycine max） 品種名：ウイリアム82（Williams82） 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：18..1646 特徴を決定した方法：P 配列 CATTACTGTA ACCAACC ATG GTT TCC GTC TTC AAC GAG ATC CTA TTC CCG 50 Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro 1 5 10 CCG AAC CAA ACC CTT CTT CGC CCC TCC CTC CAT TCC CCA ACC TCT TTC 98 Pro Asn Gln Thr Leu Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe 15 20 25 TTC ACC TCT CCC ACT CGA AAA TTC CCT CGC TCT CGC CCT AAC CCT ATT 146 Phe Thr Ser Pro Thr Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile 30 35 40 CTA CGC TGC TCC ATT GCG GAG GAA TCC ACC GCG TCT CCG CCC AAA ACC 194 Leu Arg Cys Ser Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr 45 50 55 AGA GAC TCC GCC CCC GTG GAC TGC GTC GTC GTC GGC GGA GGC GTC AGC 242 Arg Asp Ser Ala Pro Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser 60 65 70 75 GGC CTC TGC ATC GCC CAG GCC CTC GCC ACC AAA CAC GCC AAT GCC AAC 290 Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn 80 85 90 Val Val Val Thr Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr 95 100 105 ATG GAG AGG GAC GGA TAC CTC TGG GAA GAA GGC CCC AAC AGC TTC CAG 386 Met Glu Arg Asp Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln 110 115 120 CCT TCT GAT CCA ATG CTC ACC ATG GTG GTG GAC AGT GGT TTA AAG GAT 434 Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp 125 130 135 GAG CTT GTT TTG GGG GAT CCT GAT GCA CCT CGG TTT GTG TTG TGG AAC 482 Glu Leu Val Leu Gly Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn 140 145 150 155 AGG AAG TTG AGG CCG GTG CCC GGG AAG CTG ACT GAT TTG CCT TTC TTT 530 Arg Lys Leu Arg Pro Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe 160 165 170 GAC TTG ATG AGC ATT GGT GGC AAA ATC AGG GCT GGC TTT GGT GCG CTT 578 Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu 175 180 185 GGA ATT CGG CCT CCT CCT CCA GGT CAT GAG GAA TCG GTT GAA GAG TTT 626 Gly Ile Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe 190 195 200 GTT CGT CGG AAC CTT GGT GAT GAG GTT TTT GAA CGG TTG ATA GAG CCT 674 Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro 205 210 215 TTT TGT TCA GGG GTC TAT GCA GGC GAT CCT TCA AAA TTA AGT ATG AAA 722 Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys 220 225 230 235 GCA GCA TTC GGG AAA GTT TGG AAG CTG GAA AAA AAT GGT GGT AGC ATT 770 Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile 240 245 250 ATT GGT GGA ACT TTC AAA GCA ATA CAA GAG AGA AAT GGA GCT TCA AAA 818 Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys 255 260 265 CCA CCT CGA GAT CCG CGT CTG CCA AAA CCA AAA GGT CAG ACT GTT GGA 866 Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly 270 275 280 TCT TTC CGG AAG GGA CTT ACC ATG TTG CCT GAT GCA ATT TCT GCC AGA 914 Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg 285 290 295 CTA GGC AAC AAA GTA AAG TTA TCT TGG AAG CTT TCA AGT ATT AGT AAA 961 Leu Gly Asn Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys 300 305 310 315 CTG GAT AGT GGA GAG TAC AGT TTG ACA TAT GAA ACA CCA GAA GGA GTG 1010 Leu Asp Ser Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val 320 325 330 GTT TCT TTG CAG TGC AAA ACT GTT GTC CTG ACC ATT CCT TCC TAT GTT 1058 Val Ser Leu Gln Cys Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val 335 340 345 GCT AGT ACA TTG CTG CGT CCT CTG TCT GCT GCT GCT GCA GAT GCA CTT 1106 Ala Ser Thr Leu Leu Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu 350 355 360 TCA AAG TTT TAT TAC CCT CCA GTT GCT GCA GTT TCC ATA TCC TAT CCA 1154 Ser Lys Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro 365 370 375 AAA GAA GCT ATT AGA TCA GAA TGC TTG ATA GAT GGT GAG TTG AAG GGG 1202 Lys Glu Ala Ile Arg Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly 380 385 390 395 TTT GGT CAA TTG CAT CCA CGT AGC CAA GGA GTG GAA ACA TTA GGA ACT 1250 Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr 400 405 410 ATA TAC AGC TCA TCA CTA TTC CCC AAC CGA GCA CCA CCT GGA AGG GTT 1298 Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val 415 420 425 CTA CTC TTG AAT TAC ATT GGA GGA GCA ACT AAT ACT GGA ATT TTA TCG 1346 Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser 430 435 440 AAG ACG GAC AGT GAA CTT GTG GAA ACA GTT GAT CGA GAT TTG AGG AAA 1394 Lys Thr Asp Ser Glu Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys 445 450 455 ATC CTT ATA AAC CCA AAT GCC CAG GAT CCA TTT GTA GTG GGG GTG AGA 1442 Ile Leu Ile Asn Pro Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg 460 465 470 475 CTG TGG CCT CAA GCT ATT CCA CAG TTC TTA GTT GGC CAT CTT GAT CTT 1490 Leu Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu 480 485 490 CTA GAT GTT GCT AAA GCT TCT ATC AGA AAT ACT GGG TTT GAA GGG CTC 1538 Leu Asp Val Ala Lys Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu 495 500 505 TTC CTT GGG GGT AAT TAT GTG TCT GGT GTT GCC TTG GGA CGA TGC GTT 1586 Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val 510 515 520 GAG GGA GCC TAT GAG GTA GCA GCT GAA GTA AAC GAT TTT CTC ACA AAT 1634 Glu Gly Ala Tyr Glu Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn 525 530 535 AGA GTG TAC AAA TAG TAGCAGTTTT TGTTTTTGTG GTGGAATGGG TGATGGGACT 1689 Arg Val Tyr Lys 540 CTCGTGTTCC ATTGAATTAT AATAATGTGA AAGTTTCTCA AATTCGTTCG ATAGGTGTTT 1749 GGCGGCTTCT ATTGCTGATA ATGTAGAATC CTCTTTAAGT GTGATTCATT ATCTACATCA 1809 TCCGTATTTA GCAAGGTAGC TATCAATCTG CCTCTCCATT ATTCCCCTCT ATTCTTGGAG 1869 AGTTGGTAGA TCTTAACTTG TTACTATATA TGTAAGTCCA GGCAATGCTC TGTACCAATA 1929 CATGAGTTAC ATGATTAAAA AAAAAAAAAA 1959

【００４７】配列番号：11 配列の長さ：60 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ダイズ（Glycine max） 品種名：ウイリアム82（Williams82） 配列の特徴 特徴を表す記号：transit peptide 存在位置：1..60 特徴を決定した方法：P 配列 Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu 1 5 10 15 Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr 20 25 30 Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile 35 40 45 Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg 50 55 60

【００４８】配列番号：12 配列の長さ：180 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ダイズ（Glycine max） 品種名：ウイリアム82（Williams82） 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..180 特徴を決定した方法：P 配列 ATG GTT TCC GTC TTC AAC GAG ATC CTA TTC CCG CCG AAC CAA ACC CTT 48 Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu 1 5 10 15 CTT CGC CCC TCC CTC CAT TCC CCA ACC TCT TTC TTC ACC TCT CCC ACT 96 Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr 20 25 30 CGA AAA TTC CCT CGC TCT CGC CCT AAC CCT ATT CTA CGC TGC TCC ATT 144 Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile 35 40 45 GCG GAG GAA TCC ACC GCG TCT CCG CCC AAA ACC AGA 180 Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg 50 55 60

【００４９】配列番号：13 配列の長さ：10455 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ダイズ（Glycine max） 品種名：ウイリアム82（Williams82） 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..4760 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：exon 存在位置：4761..5156 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：intron 存在位置：5157..5774 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：exon 存在位置：5775..5960 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：intron 存在位置：5961..6076 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：exon 存在位置：6077..6161 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：intron 存在位置：6162..7208 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：exon 存在位置：7209..7356 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：intron 存在位置：7357..7427 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：exon 存在位置：7428..7508 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：intron 存在位置：7509..7598 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：exon 存在位置：7599..7770 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：intron 存在位置：7771..8588 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：exon 存在位置：8589..8748 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：intron 存在位置：8749..8905 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：exon 存在位置：8906..9009 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：intron 存在位置：9010..9500 特徴を決定した方法：P 特徴を表す記号：exon 存在位置：9501..9800 特徴を決定した方法：P 配列 TCTTGCATAC GCGCATCATT ACAAAGTGGT AAGTGATGGA GACTTGATGG TGTGAATAAG 60 TGGGACTCAC TAAGGGCAGA CCTTGGGTTT TGCGAGCCCT GTTGAGGATT GACCAAGGAC 120 GCACTGGAGA TGTGGTGATA TGCTCTTGCA TATATGCCAC TCGTCGTGGG TGACATATAC 180 TAGAGTTGTA GTAGGATGCT CGTGCGCACA TGTCGTGGGT GGCATGTACT AGAGGCTTTG 240 TAGTATGTTT TTGCATATAT TCCACTCGCC GTGGGTGACA CATACTAGAG ACATAGTGTT 300 ATGCTCTTGC ATGTGCGTCA CTCGATGTAG GTGACACACA CTGGAGACAT AGTGTTATGA 360 TCTTGCGTGT GTGTCACTCG CTGTGGGTAG CACACACTAG AGTCTTAATG ATAATATGCT 420 TTTGCATGTA TGTCACTCAT CGTGGGTGTC ATACACTAGA GACTTAGTAG GATGCTCGTG 480 CGCACATATC GGGGATGACA CGTACTGAAG GCTTAGTAGG ATGTTCGTGT CCACATGCCA 540 CTCGGTGTGG GTGACATGTA CTAGAGTCAT AAATGGTACG CTCTTGTGTG TGTGTAACTT 600 GCCGTGGGTG GCACACACTA TATCCGTGAT AGTAATATTC TCTTGCAGGC ATGCCACTTG 660 TCGTGGGTGG CACACACTGG AGGCTTGGTA GGGTGCTCGT GTGCACATGT CACTCGTCAT 720 GGGTGACATG TACTGGAGTC ATCATCGTGA TACGGTCTTG CATGTGTGTC ACTCGCCGTG 780 GGTGACATGT ACTGGAGTCA CCATCGTGAT ATGCTCTTGC ATTCGTGTCC CTCGCCGTGC 840 GTGGCACACG CTGGAGTCGT AATGCTAGAA AAAGAGCTCA CCAAGGACGA ACCTTGGGTT 900 TTAAGAGTCT CATAGGTACG ACTATAGATG TTTTTGTTTT GATAAGAGAG ATGCGAGAAT 960 GAAGGGATGC AAAATTTTAA TCAATGTATA TAATTGAGTA CAAATTCCCT TGTTACCCCA 1020 GATGAGCCGC ATTAAAAACC CTCCAAGCCA AAACCCTAGA TTTTGTATTT TTGGGACAAA 1080 AGACTTGAGT AGGGAAAAAA GTACAATATT GGGTTCAGAG TGTAGGTCAA CTGAAGTAGA 1140 ACTTCAGGTG GGTGGTATTC CATGTTCGTG GGATTGCTTT ACCATCCAGT TCTTGTAGTT 1200 GGTACGCTCT GTTATCGAGG TTAGTTGTGA CCCAGAAGGG ACCTTCCCAA TTGGGGCTAA 1260 GCTTTCCCAC TTGGGGATTT TTTCTGGCTT CACCTTTGAC TCTTTATACG AGGTCGCCAG 1320 GTTGAAAGGC TCGTGGTTGA ACCTTTGTAT TGTATCTTCT GGCCGCTCAA AGTTTAGCTG 1380 CTTCCTCCTT AATACTTGCC ATTTCGCGAA CTTCTTTGGT GGTTTCAAGT TCTATCCTCA 1440 TATTCTCTTC ATTCTGCTAT TGCTGAAATA GTAGTCTCCT TGTCAACGAT TCCTTGACTT 1500 CTACGAGGAT CATGGCGTTT GTGTCATATG TGAGTCGGTA AGGAGTTTCG TTGGTGGTTG 1560 TCTAGGGTGT GCAATGGTAC GCCCAGAGTA TTTGTGGAGT TCTTCTTTCC ATAGGCCCTT 1620 AGACTTATTG AGCCTAGTTT GCAAGGCCCT GAGGATGACT ATGTTAGCTG CCTCTGACTG 1680 TCCGTTAGTT TAGGTATGCT CGACAGAGGT GATTAGGTGC TTGATGCCTA GCCTTGTCAA 1740 GAAGTCTTCA TAAGTCTGAG CTTTGAATTG GGTGTCGTTG TCCGTGACAA TGGCGTATGA 1800 GAGGTCGTAC TTGTAGATGA AGTGATTTCA GGTGAATTTT TCCACCTTGT TGGTCGTAAT 1860 GTCCCGAAGT GGTCTTGATT CTATCCACTT GGTGAAGTAG TCAATTGCGA CTAGTAAGTA 1920 TGTGACAGCT CCTAGGGCTT TTGGCAGCGG TCCTAATATG TCCATTCCCC ACATGGAAAA 1980 GGGCCAAGGA GAGCTCAGGC TTAAGGTTAT TAGGTGGAGT ATGTGGCACA TTTGCAAACT 2040 ATTGACATCG TTTGCATCTC TTGGTGAAGT CAAGGGCGTC TGCCCTCAGT GTTGGCTAGT 2100 AGTAGCCTGC TCGCACCATT TTGGTGGCTA GGGAGCGTCC TCTAGTGTAG AGTCCATAGA 2160 TTCCTTCGTG AAGTTCTCTC ATGACGTAGT TTGCCTGTTG GTTGTTTAGG CATTTGAGTA 2220 GGGGTGTTGT CAACCCCTTT TGAATAGCTT GCCATCAAGG ATGACTTAGC AGTTGGTCTT 2280 TCGTCTAAGG CGTTGGGCTT CGTCCTCATT CATTGGTAGG ACCCCCACCC CCCGTATTAA 2340 GAAGTTCTTA TAAGGGGTCA TCCGGTTTGG TTTCTCCTTT TCTTTAGTCA TAATTTCCTT 2400 AGCATCTGTG GTGACAGTTT GGAGCGTCTC TTGGATGATG GTCTTAAGGT GCCCAACCTT 2460 CTTGTTGCTG GCTAGCTTGG AGGGTAGATC CGCTTAGGTG TCGCTTTCCC TGGGATGAGA 2520 GACTTCGTTA TGTGAAATTA CTTGAGTAGC ACTGTTTCCT TGGTTTGGTA GCCATGTAGG 2580 ATGCCACATA GAATTTGTGG GTCCTGGACA GAACATAAGC CCCCCAAGCT CTGAGTTGGT 2640 TTGCGGGCGA AAGAGGTTGT CCAATACTGA AAGAGTTTTG TCCCGTGTCG AGGGAGCTTG 2700 TCTGATGTCA AGAATGGTAA TCTTGACAAG CAGAGGATGA CGAGTTTGTC AAATCCCCCA 2760 AGTATGGACG AGCGTTGTCC ATAAAATTTA CCTTTGGCCA TAAAATTTCT TAACATAACC 2820 TTAATCACCA CCAATATGAA TAATTATCAT TATTGTCATC ATTATCATAA CTATTATTGA 2880 TCATTATTAG CATTATCATT GTTATAAGTA TTTAGAAATT TTTAATATCT CTAAACAATA 2940 TTTTTTCCGA TATGGTTCCT AAAACTTATA TTTGTTTTTT AATTGAGTAT TTGTCATTAA 3000 TTTTCCTTAA CAAAGTTAAA CGAAAGGATC CAATTAACAA AATAAATACA GGTTCAAAGA 3060 CTCTATTTTA AAAAAAAAAG TTCAATAAAC CTAATTAAAA ATTATCAAAT AATCAAGGAC 3120 TTACAAATTA ATTTAACCTT TTTTATCACC CAAGCTACTA AAGTGAAACT TTAATCTTAA 3180 TTAGAAAATA GGATAAAATG TGTTTGAAGT CTTTTAAGAT TTGATTTGAA TTGATTTTAG 3240 TCCTTATTAC CTTCATTCCA AAATAAGTAT CACATTTAGT TTTTCAATGT AATCTTAATT 3300 TTTTCCACCA ATAATCCTAA TAAATGTTAC TTTAGTTTTT TTAATATAAT ATTAATACTA 3360 ATATTTTTCT TCTATTTAAT AAAGTTAGTT TTATAAAACT ATCATTCTAT TTTATCTATT 3420 TATTATTTTG TCAAATTAAA ATGTAATATT CAAAAACCAA ATTCTATCAC TTTTAAAAAA 3480 GAAGAGGGAT TAAGAAGCTT ACAAAGAGAT TGGGAACTAA AACTACTTAA AAAAAAAGGA 3540 ATTAAAATCA ATTTCAACCA AATTATAAGA GACTTAAGAT ACATTTTATT CTAGGAAACA 3600 ATATTACTTC TGGACTTTTA AACAAGAAAC AAAAAATAAA TTAATTAAGA TCAATTGAAT 3660 AGTTAATTTA ATTATTTTTA ATCAATAATA TTATAAATTT ATATTTTATT CTAAAAATGT 3720 TTATCAAACT AAGTAACATC TGGTTTTATA TTTGTTCAGA GAAAATGCGT AGCTAACTCT 3780 ATGCATTAAA CAAAAAAAAG AAAATTTTCT TTCAATTTTT CGATTTTTCC ATTTGATTTT 3840 ATTGTTTGGG AATTATTTTT CCTTAATTCT TTCCATTCTA TCAATGAAGA ATCTATAAGA 3900 ATTCTCAATT CCATATCATT TCATTTTTAA AAATTTAATC GTAATGGAAA TAAGAAAGAC 3960 TAATATTCCT TTGGAAATAT TACCCGAATG ATATTTCTTC TCTTATAGGT AATAAGTATA 4020 TTATTTGTAA TTCAATAGAA CAAATTTCTT ATATTGTTAT TAGTTCAATA AATATATTTA 4080 TTTACATAAA AAATAATAAA AGGAGATCTA TCTTAAATTC TTGTATATGA AATTTGATTC 4140 TCGTGAATGA AACAAAACAT AAAAAAAGAT CATGAGTAAC TTGATGATGC TATTGCCATT 4200 ATTAATAGTT TAATAATTAT TCCTTAAAAT AAATAGTTCA ATAACTATAT CTACTTACAA 4260 AGAAAATAAA ATGAGCGACT TATATTTTTT ATTAGCTTTA ATGATTAATC TTTATAAAAA 4320 ATTACTAAAA ATATTTAATG ATACGTCATT TTTCAATTAT GTTTCTTTCC TTTACTAAAC 4380 TCGAATCAAA TACAAAAATA AATTGTTTGA GTGCCGAAAG TCCGAAACTT ATTATTTGAC 4440 TTCAAAATAA GTTATTGTTT TTATCTTATA ATAATCGTCC TATAAAAAAA ATTATTCTAA 4500 ATATTAGCTT TTATTTGACT TCAAAATAAG TTATTGCTTT TATAATAATA ATGATATGAT 4560 AAAAAAAAAA AACTAATAGA TAAAAAAAGT ACTTAGAAAA CATTTTTTCA AGAACGTTAA 4620 AGGTAAAGTT TAGATGGAGG CAATTGTGTA TTTTACTGTA ACCAACCAAG GCCGAGTACT 4680 ATCAGCGTGT TGCACATTTT GGTTATCTTT AGCACAGTGT TGAAGATAAC GAACGAATAG 4740 TGCCATTACT GTAACCAACC ATG GTT TCC GTC TTC AAC GAG ATC CTA TTC CCG 4793 Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro 1 5 10 CCG AAC CAA ACC CTT CTT CGC CCC TCC CTC CAT TCC CCA ACC TCT TTC 4841 Pro Asn Gln Thr Leu Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe 15 20 25 TTC ACC TCT CCC ACT CGA AAA TTC CCT CGC TCT CGC CCT AAC CCT ATT 4889 Phe Thr Ser Pro Thr Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile 30 35 40 CTA CGC TGC TCC ATT GCG GAG GAA TCC ACC GCG TCT CCG CCC AAA ACC 4937 Leu Arg Cys Ser Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr 45 50 55 AGA GAC TCC GCC CCC GTG GAC TGC GTC GTC GTC GGC GGA GGC GTC AGC 4985 Arg Asp Ser Ala Pro Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser 60 65 70 75 GGC CTC TGC ATC GCC CAG GCC CTC GCC ACC AAA CAC GCC AAT GCC AAC 5033 Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn 80 85 90 GTC GTC GTC ACG GAG GCC CGA GAC CGC GTC GGC GGC AAC ATC ACC ACG 5081 Val Val Val Thr Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr 95 100 105 ATG GAG AGG GAC GGA TAC CTC TGG GAA GAA GGC CCC AAC AGC TTC CAG 5129 Met Glu Arg Asp Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln 110 115 120 CCT TCT GAT CCA ATG CTC ACC ATG GTG GTATGTGATG TTTCTTTCGC 5176 Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val 125 130 132 GGAATTCGGT TTTGAGCCTA ACTTGACCCT AAAAGTTAAT TCGGGTTCAA TAGGTCAATT 5236 ATTTGTATTA TCATTTCAAA ATTATCTTTT TTTATCTCTT TATCCACTTA ATTGTTTCTC 5296 ATTGATGTTT GCAGAGAGAA TAATTAAGTA AAAATATGTA GGGAAAAAAA TAATTAATGC 5356 ATCTAAAAGT TAGAAATTGA TCTTATAAAA ATGGACAAAC AAATTTCTGA AAATTATCTT 5416 TTATTTAGGG ATAGAGGGAG TAGCTCATAG GATAAGGGTT ACTTCCACTT ACTATTTTGG 5476 TCATATTATT ACTGATGTGG GATCTGCAAC ACAATTCAAT GTCTTTGTTT GAGTGAGAAA 5536 TGCTAGGAAC AAAGTAGTAC TTTCTAACAC AACATTATAC CATTGAGTGT TGTCTGAAAT 5596 TTATTGGAAA TTACAAATTT TCATTGGTCC CACTACTTAC TTAATGAGTC TTTATCATTA 5656 TTTTGTAGTT TTCAATAATT TTTAACTATT AGTAGAGTGT CTAGTAAAAA TAGTGTGTCT 5716 CTAGCACTCC TCGCAGTTGA ATTGTTGGTA ATGTAGTTTT GGTTTTTGCA TTTGGCAG 5774 GTG GAC AGT GGT TTA AAG GAT GAG CTT GTT TTG GGG GAT CCT GAT GCA 5822 Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly Asp Pro Asp Ala 133 135 140 145 CCT CGG TTT GTG TTG TGG AAC AGG AAG TTG AGG CCG GTG CCC GGG AAG 5870 Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro Val Pro Gly Lys 150 155 160 CTG ACT GAT TTG CCT TTC TTT GAC TTG ATG AGC ATT GGT GGC AAA ATC 5918 Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile 165 170 175 180 AGG GCT GGC TTT GGT GCG CTT GGA ATT CGG CCT CCT CCT CCA 5960 Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro Pro Pro 185 190 194 GTGTGTCCTC TTTCCTTTCT TTGATTTTGT TTGTCAAATG CAATGTCCGG AAGGATAAAG 6020 GGCAACTGTT CTTAATTTTG TTTTCTCATG GAATATAATG TTGACAAAGG TGACAG GGT 6079 Gly 195 CAT GAG GAA TCG GTT GAA GAG TTT GTT CGT CGG AAC CTT GGT GAT GAG 6127 His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu 200 205 210 GTT TTT GAA CGG TTG ATA GAG CCT TTT TGT TCA G GTTGGAGCAT 6171 Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser 215 220 222 TGACTTGTTT GCTCTCTTTT TTGTTATTCT TGTTAACCTC TAACCAACCT TCTATTATTA 6231 TGTGTTACTT TTTGACCCAG GGATATTCAG TTTTTAGCCA TTAAAATGTA ATCCATCATG 6291 ATGGCTGACT AATAGCTCAA TTGAATAAGA CATTTATAGA CTCCTGAAAG AATGTTTCAT 6351 ATTCATTGTC TAACTTGTCT TTTGAAAACC CTCTGATTTA TATTGCATAT AAGGGAAAAG 6411 TTTTTCTTAA TTAATGACTA TATTTCTATG TTCATAATGA CACTTGAATC TGTGACAGAT 6471 CTGGAAATTT TAAGTAAAGG GCACAATACT TGTATATTTA AAATTGTGGG AGCATTACTA 6531 ATATTATGGG TTAACTTTTT GTACTGCATT TCAAATTATT GGGTTAATTT AGTATTATAC 6591 ATGTATATTA TATTAAGAAA AATTAAAAAT CCTGTGGAGG CAGCTTCCCC CAAACATCAC 6651 AACATAGATC CTGCTTGAAT TATTGTAATT GACCACTTTT TGGTGCAGTT CAGTATCTTT 6711 TTTATTATTA TGTAGTGCTC CCTTTAATCC ACATGTAAAA CTCAACCAAA TACATGATTT 6771 TCCTGTTTGG GAGTTTGTTA GGGCCAGGGG AAGGAGAATA ACTTGTGAAG AAACAAGTCC 6831 AATATGTCCT AGTTCATCAT GGTTCATAGC ATGTGGTGGT TTTGACATGT TAGAACACTT 6891 AAAACTTGAG TTAGCACATT AGCAAGTAAT ATCAACAAAA GCACCATTTT CTCTCTTCCC 6951 TCTGTTCCTC TTATAAATGT TATTGAAGTA TATTTACAAA TAAATAAACC ATTGGACAAG 7011 CACATGCAAA TTTTATATAA GTCAGCTGCA ATGCCCCATA AAAGACTTGA GTGTGTCCTA 7071 TACTATGCTT TCTTTTTTAT GTAATCAGTG ATAAGCTTAC TTCATCTAGC TTTTCTCTCC 7131 TATTATGAAT TTTCTTCTGT TTTTCAGCAG TCTTTTTTAT TGAAAATTCT GTTGCTTACC 7191 TGAATTTTGT TATATAG GG GTC TAT GCA GGC GAT CCT TCA AAA TTA AGT ATG 7243 Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met 223 225 230 AAA GCA GCA TTC GGG AAA GTT TGG AAG CTG GAA AAA AAT GGT GGT AGC 7291 Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser 235 240 245 250 ATT ATT GGT GGA ACT TTC AAA GCA ATA CAA GAG AGA AAT GGA GCT TCA 7339 Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser 255 260 265 AAA CCA CCT CGA GAT CC GTAATAATAT ATTTGCTCTG GATTTTTGCC 7386 Lys Pro Pro Arg Asp Pro 270 272 ATAATTTATT GAGTATTTCA CTAATTCAAT TAATCATGTA G G CGT CTG CCA AAA 7440 Arg Leu Pro Lys 273 275 CCA AAA GGT CAG ACT GTT GGA TCT TTC CGG AAG GGA CTT ACC ATG TTG 7488 Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu 280 285 290 CCT GAT GCA ATT TCT GCC AG GTACTACATG TTGCCTAATA CCAATGTCCT 7538 Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg 295 299 AGTTAAGTTT CTCCTATTCT CCAGATTGAT GATCCTAGCC AATTGTGATC CTGTTAACAG 7598 A CTA GGC AAC AAA GTA AAG TTA TCT TGG AAG CTT TCA AGT ATT AGT AAA 7647 Leu Gly Asn Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys 300 305 310 315 CTG GAT AGT GGA GAG TAC AGT TTG ACA TAT GAA ACA CCA GAA GGA GTG 7695 Leu Asp Ser Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val 320 325 330 GTT TCT TTG CAG TGC AAA ACT GTT GTC CTG ACC ATT CCT TCC TAT GTT 7743 Val Ser Leu Gln Cys Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val 335 340 345 GCT AGT ACA TTG CTG CGT CCT CTG TCT GTAAGTTTCT TTCTCAAAAG 7790 Ala Ser Thr Leu Leu Arg Pro Leu Ser 350 355 356 AGGATTATAT CATTTATTTA TGTTAATTAA TAACTGTTTT ATCTGTGGAA TCTTTTTAAC 7850 TTGGGCCATA TGTTAGTTTT CTTTGCGTGC CTTGGCACAT GTATGTGCAT ATGCTTTTGT 7910 TCCTACAGTT GCATATGTCT CTGTTTATTA TCCTCTGAAT TTTTCAGAGA CAAAATTGAC 7970 TTCCTGTGCA TCCCACCCAC ACTCGCACAT AGTGCAAAGA AAAGCACAAC TAAGCCCTGG 8030 TATACTTTTT TCCAGGCCTC AATTTTCATT GCAAGAGTTA CCATATTTCC TAAAACCTAT 8090 ATTATCATTT GAAAATTTAC AAAATATGGA CAATTTTGTG CCTTTTCCAT TAACAAAGTA 8150 TCAGCTGATC GACCATAGAC ATTTTTCAGA ATCAAGCTAG AGAGACATTT TTCAGGATCA 8210 AACAAGAGAG TAGGCATTTT TCATAATCAA ACTAAGTAGA GCAGGACACG ACCATAGTGT 8270 ACATGCTGTG AAATTTATTG TCTTCGATGC TGAATAAACC AGTCTCCTTA TATCAAAATT 8330 CCTTGTTTAT TTTTTCCTGA TTAAATTTAG AATGCCTTGT AATTTGTAAA CTTTTTAGGG 8390 TATGGTATCC CACTGGTCTC TTTCTAAAGC AGGGGTTTAA GGACATGTCA TCCCCTGTGG 8450 CAGGCTTTTC TTTGAGTCAT ATTACAAAAA TGCATGTAAA AAATTAGTTG TTTGGAAATG 8510 GCCAAATTTT GGCATGATAA TCCTGAATGT AAACGTTGAG GGCTGTTATT CACGACAACC 8570 TTTTACTATC TCTTGCAG GCT GCT GCT GCA GAT GCA CTT TCA AAG TTT TAT 8621 Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr 357 360 365 TAC CCT CCA GTT GCT GCA GTT TCC ATA TCC TAT CCA AAA GAA GCT ATT 8669 Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile 370 375 380 AGA TCA GAA TGC TTG ATA GAT GGT GAG TTG AAG GGG TTT GGT CAA TTG 8717 Arg Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu 385 390 395 CAT CCA CGT AGC CAA GGA GTG GAA ACA TTA G GTGAGTATTG ATTTAATAAA 8768 His Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu 400 405 409 GAAAAATTGG AGGCTTTCAA CACAGTAAGT TCCACGTGTT TTTAATTATT ACCATTCATG 8828 TTAGAACTGG GGACTGTGGA GTGCTTTCTA GTGCTATGAC TTGTTTGATA ACAAGAACAT 8888 ATTTGTGGGT TTGGCAG GA ACT ATA TAC AGC TCA TCA CTA TTC CCC AAC CGA 8940 Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg 410 415 420 GCA CCA CCT GGA AGG GTT CTA CTC TTG AAT TAC ATT GGA GGA GCA ACT 8988 Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr 425 430 435 AAT ACT GGA ATT TTA TCG AAG GTGTGATATT TATATGATAC ATGAACAGTT 9039 Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys 440 444 AACGTAGATG CAGTTGGTTG AGCTGTTATG GTGTCCAATA TGGTGAACAT GAACTAGTTT 9099 TTCTGGGAAA CTTCAAGGAT TTTGTAAAGA GCTATTAATC ATTTTCACAA GCTGGTTATT 9159 TGGGTGTTTT AAACAACTCT GGTCCAATGG CATTGTTTCA AATGTTTACA CTCTTATGCA 9219 TAAATAATAA AATATTGAGA TTTTTGTTTC TTCAGAGAGC ATTTGATATC CTAGAAGAGT 9279 ACTGTCGGCC TTTCATTCTG CATTATTTTT TATGATTGGT GGTTCTGGGT TTTAGTCATC 9339 ATCTCTGTTA TTTGATTTCA AATGCTTTGA TCCATACCTG TCATATATTT TATGTGTTTT 9399 GTTATTTTGC AACAAGAGCC ATTTCTCTAT TTGTATGATT AGATTTGTTT CCTTTCTTTT 9459 TCTTTTTTTA TTTCTTCCTA AATTCTCTTG TTTAATGGCA G ACG GAC AGT GAA CTT 9515 Thr Asp Ser Glu Leu 445 GTG GAA ACA GTT GAT CGA GAT TTG AGG AAA ATC CTT ATA AAC CCA AAT 9563 Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro Asn 450 455 460 465 GCC CAG GAT CCA TTT GTA GTG GGG GTG AGA CTG TGG CCT CAA GCT ATT 9611 Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala Ile 470 475 480 CCA CAG TTC TTA GTT GGC CAT CTT GAT CTT CTA GAT GTT GCT AAA GCT 9659 Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys Ala 485 490 495 TCT ATC AGA AAT ACT GGG TTT GAA GGG CTC TTC CTT GGG GGT AAT TAT 9707 Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr 500 505 510 GTG TCT GGT GTT GCC TTG GGA CGA TGC GTT GAG GGA GCC TAT GAG GTA 9755 Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Val 515 520 525 GCA GCT GAA GTA AAC GAT TTT CTC ACA AAT AGA GTG TAC AAA TAG 9800 Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys 530 535 540 543 TAGCAGTTTT TGTTTTTGTG GTGGAATGGG TGATGGGACT CTCGTGTTCC ATTGAATTAT 9860 AATAATGTGA AAGTTTCTCA AATTCGTTCG ATAGGTTTTT GGCGGCTTCT ATTGCTGATA 9920 ATGTAAAATC CTCTTTAAGT TTGATTCATT ATCTACTTCA TCCGTATTTA GCAAGGTAGC 9980 TATCAGTCTG CCTCTCCATT ATTCCCCTCT ATTCTTGGAG AGTTGGTAGA TTTTAACTTG 10040 TTACTATATA TGTAAGTCCA GGCAATGCTC TGTAACAATG CATGAGTTAC ATGATTATAA 10100 TATGTCTTTT TATTTGAATC TATGTATTTT ATTTGGGAAG TAGTTTACAA GTTCATTTTG 10160 AGGTTAAACG TAAACCATGC GGTATAAATA CTTAAATTAA AATTGAGATG CCAAGTTGCT 10220 TCAATTCTGG CCCCAAGGGT AATTAATGAT AATTTACTGA TATTGATGAA ATGAGGAGAG 10280 TTAAGCAAGA TGCATGACGG AATCTGGAGT TCATCTAGTT ATACAAGTTA CAGATTGTGT 10340 TTGGATTAAT GTTTGGAAGC CTTTGTACAT AACAAAACAA TGGGCTAAGA AAACAATATC 10400 TAAACGTCAA CTTTTGGCTC CCAAATAAAA AGGTATTGTA TCCCCGAAAA ATCAC 10455

【００５０】配列番号：14 配列の長さ：4760 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ダイズ（Glycine max） 品種名：ウイリアム82（Williams82） 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..4760 特徴を決定した方法：P 配列 TCTTGCATAC GCGCATCATT ACAAAGTGGT AAGTGATGGA GACTTGATGG TGTGAATAAG 60 TGGGACTCAC TAAGGGCAGA CCTTGGGTTT TGCGAGCCCT GTTGAGGATT GACCAAGGAC 120 GCACTGGAGA TGTGGTGATA TGCTCTTGCA TATATGCCAC TCGTCGTGGG TGACATATAC 180 TAGAGTTGTA GTAGGATGCT CGTGCGCACA TGTCGTGGGT GGCATGTACT AGAGGCTTTG 240 TAGTATGTTT TTGCATATAT TCCACTCGCC GTGGGTGACA CATACTAGAG ACATAGTGTT 300 ATGCTCTTGC ATGTGCGTCA CTCGATGTAG GTGACACACA CTGGAGACAT AGTGTTATGA 360 TCTTGCGTGT GTGTCACTCG CTGTGGGTAG CACACACTAG AGTCTTAATG ATAATATGCT 420 TTTGCATGTA TGTCACTCAT CGTGGGTGTC ATACACTAGA GACTTAGTAG GATGCTCGTG 480 CGCACATATC GGGGATGACA CGTACTGAAG GCTTAGTAGG ATGTTCGTGT CCACATGCCA 540 CTCGGTGTGG GTGACATGTA CTAGAGTCAT AAATGGTACG CTCTTGTGTG TGTGTAACTT 600 GCCGTGGGTG GCACACACTA TATCCGTGAT AGTAATATTC TCTTGCAGGC ATGCCACTTG 660 TCGTGGGTGG CACACACTGG AGGCTTGGTA GGGTGCTCGT GTGCACATGT CACTCGTCAT 720 GGGTGACATG TACTGGAGTC ATCATCGTGA TACGGTCTTG CATGTGTGTC ACTCGCCGTG 780 GGTGACATGT ACTGGAGTCA CCATCGTGAT ATGCTCTTGC ATTCGTGTCC CTCGCCGTGC 840 GTGGCACACG CTGGAGTCGT AATGCTAGAA AAAGAGCTCA CCAAGGACGA ACCTTGGGTT 900 TTAAGAGTCT CATAGGTACG ACTATAGATG TTTTTGTTTT GATAAGAGAG ATGCGAGAAT 960 GAAGGGATGC AAAATTTTAA TCAATGTATA TAATTGAGTA CAAATTCCCT TGTTACCCCA 1020 GATGAGCCGC ATTAAAAACC CTCCAAGCCA AAACCCTAGA TTTTGTATTT TTGGGACAAA 1080 AGACTTGAGT AGGGAAAAAA GTACAATATT GGGTTCAGAG TGTAGGTCAA CTGAAGTAGA 1140 ACTTCAGGTG GGTGGTATTC CATGTTCGTG GGATTGCTTT ACCATCCAGT TCTTGTAGTT 1200 GGTACGCTCT GTTATCGAGG TTAGTTGTGA CCCAGAAGGG ACCTTCCCAA TTGGGGCTAA 1260 GCTTTCCCAC TTGGGGATTT TTTCTGGCTT CACCTTTGAC TCTTTATACG AGGTCGCCAG 1320 GTTGAAAGGC TCGTGGTTGA ACCTTTGTAT TGTATCTTCT GGCCGCTCAA AGTTTAGCTG 1380 CTTCCTCCTT AATACTTGCC ATTTCGCGAA CTTCTTTGGT GGTTTCAAGT TCTATCCTCA 1440 TATTCTCTTC ATTCTGCTAT TGCTGAAATA GTAGTCTCCT TGTCAACGAT TCCTTGACTT 1500 CTACGAGGAT CATGGCGTTT GTGTCATATG TGAGTCGGTA AGGAGTTTCG TTGGTGGTTG 1560 TCTAGGGTGT GCAATGGTAC GCCCAGAGTA TTTGTGGAGT TCTTCTTTCC ATAGGCCCTT 1620 AGACTTATTG AGCCTAGTTT GCAAGGCCCT GAGGATGACT ATGTTAGCTG CCTCTGACTG 1680 TCCGTTAGTT TAGGTATGCT CGACAGAGGT GATTAGGTGC TTGATGCCTA GCCTTGTCAA 1740 GAAGTCTTCA TAAGTCTGAG CTTTGAATTG GGTGTCGTTG TCCGTGACAA TGGCGTATGA 1800 GAGGTCGTAC TTGTAGATGA AGTGATTTCA GGTGAATTTT TCCACCTTGT TGGTCGTAAT 1860 GTCCCGAAGT GGTCTTGATT CTATCCACTT GGTGAAGTAG TCAATTGCGA CTAGTAAGTA 1920 TGTGACAGCT CCTAGGGCTT TTGGCAGCGG TCCTAATATG TCCATTCCCC ACATGGAAAA 1980 GGGCCAAGGA GAGCTCAGGC TTAAGGTTAT TAGGTGGAGT ATGTGGCACA TTTGCAAACT 2040 ATTGACATCG TTTGCATCTC TTGGTGAAGT CAAGGGCGTC TGCCCTCAGT GTTGGCTAGT 2100 AGTAGCCTGC TCGCACCATT TTGGTGGCTA GGGAGCGTCC TCTAGTGTAG AGTCCATAGA 2160 TTCCTTCGTG AAGTTCTCTC ATGACGTAGT TTGCCTGTTG GTTGTTTAGG CATTTGAGTA 2220 GGGGTGTTGT CAACCCCTTT TGAATAGCTT GCCATCAAGG ATGACTTAGC AGTTGGTCTT 2280 TCGTCTAAGG CGTTGGGCTT CGTCCTCATT CATTGGTAGG ACCCCCACCC CCCGTATTAA 2340 GAAGTTCTTA TAAGGGGTCA TCCGGTTTGG TTTCTCCTTT TCTTTAGTCA TAATTTCCTT 2400 AGCATCTGTG GTGACAGTTT GGAGCGTCTC TTGGATGATG GTCTTAAGGT GCCCAACCTT 2460 CTTGTTGCTG GCTAGCTTGG AGGGTAGATC CGCTTAGGTG TCGCTTTCCC TGGGATGAGA 2520 GACTTCGTTA TGTGAAATTA CTTGAGTAGC ACTGTTTCCT TGGTTTGGTA GCCATGTAGG 2580 ATGCCACATA GAATTTGTGG GTCCTGGACA GAACATAAGC CCCCCAAGCT CTGAGTTGGT 2640 TTGCGGGCGA AAGAGGTTGT CCAATACTGA AAGAGTTTTG TCCCGTGTCG AGGGAGCTTG 2700 TCTGATGTCA AGAATGGTAA TCTTGACAAG CAGAGGATGA CGAGTTTGTC AAATCCCCCA 2760 AGTATGGACG AGCGTTGTCC ATAAAATTTA CCTTTGGCCA TAAAATTTCT TAACATAACC 2820 TTAATCACCA CCAATATGAA TAATTATCAT TATTGTCATC ATTATCATAA CTATTATTGA 2880 TCATTATTAG CATTATCATT GTTATAAGTA TTTAGAAATT TTTAATATCT CTAAACAATA 2940 TTTTTTCCGA TATGGTTCCT AAAACTTATA TTTGTTTTTT AATTGAGTAT TTGTCATTAA 3000 TTTTCCTTAA CAAAGTTAAA CGAAAGGATC CAATTAACAA AATAAATACA GGTTCAAAGA 3060 CTCTATTTTA AAAAAAAAAG TTCAATAAAC CTAATTAAAA ATTATCAAAT AATCAAGGAC 3120 TTACAAATTA ATTTAACCTT TTTTATCACC CAAGCTACTA AAGTGAAACT TTAATCTTAA 3180 TTAGAAAATA GGATAAAATG TGTTTGAAGT CTTTTAAGAT TTGATTTGAA TTGATTTTAG 3240 TCCTTATTAC CTTCATTCCA AAATAAGTAT CACATTTAGT TTTTCAATGT AATCTTAATT 3300 TTTTCCACCA ATAATCCTAA TAAATGTTAC TTTAGTTTTT TTAATATAAT ATTAATACTA 3360 ATATTTTTCT TCTATTTAAT AAAGTTAGTT TTATAAAACT ATCATTCTAT TTTATCTATT 3420 TATTATTTTG TCAAATTAAA ATGTAATATT CAAAAACCAA ATTCTATCAC TTTTAAAAAA 3480 GAAGAGGGAT TAAGAAGCTT ACAAAGAGAT TGGGAACTAA AACTACTTAA AAAAAAAGGA 3540 ATTAAAATCA ATTTCAACCA AATTATAAGA GACTTAAGAT ACATTTTATT CTAGGAAACA 3600 ATATTACTTC TGGACTTTTA AACAAGAAAC AAAAAATAAA TTAATTAAGA TCAATTGAAT 3660 AGTTAATTTA ATTATTTTTA ATCAATAATA TTATAAATTT ATATTTTATT CTAAAAATGT 3720 TTATCAAACT AAGTAACATC TGGTTTTATA TTTGTTCAGA GAAAATGCGT AGCTAACTCT 3780 ATGCATTAAA CAAAAAAAAG AAAATTTTCT TTCAATTTTT CGATTTTTCC ATTTGATTTT 3840 ATTGTTTGGG AATTATTTTT CCTTAATTCT TTCCATTCTA TCAATGAAGA ATCTATAAGA 3900 ATTCTCAATT CCATATCATT TCATTTTTAA AAATTTAATC GTAATGGAAA TAAGAAAGAC 3960 TAATATTCCT TTGGAAATAT TACCCGAATG ATATTTCTTC TCTTATAGGT AATAAGTATA 4020 TTATTTGTAA TTCAATAGAA CAAATTTCTT ATATTGTTAT TAGTTCAATA AATATATTTA 4080 TTTACATAAA AAATAATAAA AGGAGATCTA TCTTAAATTC TTGTATATGA AATTTGATTC 4140 TCGTGAATGA AACAAAACAT AAAAAAAGAT CATGAGTAAC TTGATGATGC TATTGCCATT 4200 ATTAATAGTT TAATAATTAT TCCTTAAAAT AAATAGTTCA ATAACTATAT CTACTTACAA 4260 AGAAAATAAA ATGAGCGACT TATATTTTTT ATTAGCTTTA ATGATTAATC TTTATAAAAA 4320 ATTACTAAAA ATATTTAATG ATACGTCATT TTTCAATTAT GTTTCTTTCC TTTACTAAAC 4380 TCGAATCAAA TACAAAAATA AATTGTTTGA GTGCCGAAAG TCCGAAACTT ATTATTTGAC 4440 TTCAAAATAA GTTATTGTTT TTATCTTATA ATAATCGTCC TATAAAAAAA ATTATTCTAA 4500 ATATTAGCTT TTATTTGACT TCAAAATAAG TTATTGCTTT TATAATAATA ATGATATGAT 4560 AAAAAAAAAA AACTAATAGA TAAAAAAAGT ACTTAGAAAA CATTTTTTCA AGAACGTTAA 4620 AGGTAAAGTT TAGATGGAGG CAATTGTGTA TTTTACTGTA ACCAACCAAG GCCGAGTACT 4680 ATCAGCGTGT TGCACATTTT GGTTATCTTT AGCACAGTGT TGAAGATAAC GAACGAATAG 4740 TGCCATTACT GTAACCAACC 4760

【００５１】配列番号：15 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCCAACTAAG AACTGTGGAA TAGCTTGAGG 30

【００５２】配列番号：16 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CATCACTATT CCCCAACCGA GCACCACCTG 30

【００５３】配列番号：17 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CACCGGCCTC AACTTCCTGT TCCACAACAC 30

【００５４】配列番号：18 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACCATGGTTT CCGTCTTCAA CGAGATCCTA TTCC 34

【００５５】配列番号：19 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGCAATAGAA GCCGCCAAAC ACCTATCG 28

【００５６】配列番号：20 配列の長さ：313 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：エンドウ（Pisum sativum） 品種名：Alaska 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：2..313 特徴を決定した方法：S 配列 A GTG CAA ACG TTA GGA ACT ATA TAT AGC TCA TCA CTT TTC CCT AAC CGA 49 Val Gln Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg 1 5 10 15 GCA CCA CCT GGA AGG GTT CTT CTC TTG AAT TAC ATT GGA GGG GCC ACC 97 Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr 20 25 30 AAT TCT GGG ATT TTA TCA AAG ACG GAG AGT GAG CTT GTT GAA GCA GTT 145 Asn Ser Gly Ile Leu Ser Lys Thr Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val 35 40 45 GAT CGA GAT TTG AGA AAT ATC CTT CTA AAG CCA AAT GCT CAG GAC CCA 193 Asp Arg Asp Leu Arg Asn Ile Leu Leu Lys Pro Asn Ala Gln Asp Pro 50 55 60 TTT GTT TTG GGT GTT AGA CTG TGG CCT CAA GCT ATT CCA CAG TTC TTG 241 Phe Val Leu Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu 65 70 75 80 ATT GGG CAT CTC GAT CTT CTA GAT GCT GCT AAA GCT TCT CTA AAC AAT 289 Ile Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Ala Ala Lys Ala Ser Leu Asn Asn 85 90 95 ACT GGG TTT GAG GGA TTA TTC CTT 313 Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu 100 104

【００５７】配列番号：21 配列の長さ：104 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：エンドウ（Pisum sativum） 品種名：Alaska 配列 Val Gln Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg 1 5 10 15 Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr 20 25 30 Asn Ser Gly Ile Leu Ser Lys Thr Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val 35 40 45 Asp Arg Asp Leu Arg Asn Ile Leu Leu Lys Pro Asn Ala Gln Asp Pro 50 55 60 Phe Val Leu Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu 65 70 75 80 Ile Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Ala Ala Lys Ala Ser Leu Asn Asn 85 90 95 Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu 100 104

【００５８】配列番号：22 配列の長さ：313 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：タバコ（Nicotiana tabacum） 品種名： Xanthi-nc 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：2..313 特徴を決定した方法：S 配列 A GTG GAA ACA CTA GGA ACG ATA TAT AGT TCA TCA CTC TTC CCT AAC CGT 49 Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg 1 5 10 15 GCC CCA AAA GGT CGG GTG CTA CTC TTG AAC TAC ATT GGA GGA GCA AAA 97 Ala Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Lys 20 25 30 AAT CCT GAA ATT TTG TCT AAG ACG GAG AGC CAA CTT GTG GAA GTA GTT 149 Asn Pro Glu Ile Leu Ser Lys Thr Glu Ser Gln Leu Val Glu Val Val 35 40 45 GAT CGT GAC CTC AGA AAA ATG CTT ATA AAA CCC AAA GCT CAA GAT CCT 193 Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Lys Ala Gln Asp Pro 50 55 60 CTT GTT GTG GGT GTG CGA GTA TGG CCA CAA GCT ATC CCA CAG TTT TTG 241 Leu Val Val Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu 65 70 75 80 GTT GGT CAT CTG GAT ACG CTA AGT ACT GCA AAA GCT GCT ATG AAT GAT 289 Val Gly His Leu Asp Thr Leu Ser Thr Ala Lys Ala Ala Met Asn Asp 85 90 95 AAT GGG CTT GAA GGG CTG TTT CTT 313 Asn Gly Leu Glu Gly Leu Phe Leu 100 104

【００５９】配列番号：23 配列の長さ：104 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：タバコ（Nicotiana tabacum） 品種名：Xanthi-nc 配列 Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg 1 5 10 15 Ala Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Lys 20 25 30 Asn Pro Glu Ile Leu Ser Lys Thr Glu Ser Gln Leu Val Glu Val Val 35 40 45 Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Lys Ala Gln Asp Pro 50 55 60 Leu Val Val Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu 65 70 75 80 Val Gly His Leu Asp Thr Leu Ser Thr Ala Lys Ala Ala Met Asn Asp 85 90 95 Asn Gly Leu Glu Gly Leu Phe Leu 100 104

【００６０】配列番号：24 配列の長さ：313 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ジャガイモ（Solanum tuberosum） 品種名：Desiree 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：2..313 特徴を決定した方法：S 配列 A GTG GAA ACA CTA GGA ACA ATA TAT AGT TCA TCA CTC TTC CCT AAC CGT 49 Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg 1 5 10 15 GCT CCA AAT GGC CGG GTG CTA CCC TTG AAC TAC ATT GGA GGA GCA ACA 97 Ala Pro Asn Gly Arg Val Leu Pro Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr 20 25 30 AAT ACT GAA ATT GTG TCA AAG ACG GAG AGC CAA CTT GTG GAA GCA GTT 145 Asn Thr Glu Ile Val Ser Lys Thr Glu Ser Gln Leu Val Glu Ala Val 35 40 45 GAC CGT GAC CTC AGA AAA ATG CTT ATA AAA CCC AAA GCA CAA GAT CCC 193 Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Lys Ala Gln Asp Pro 50 55 60 TTC GTT ACG GGT GTG CGA GTA TGG CCA CAA GCT ATC CCA CAG TTT TTG 241 Phe Val Thr Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu 65 70 75 80 GTC GGA CAT CTG GAT ACA CTA GGT ACT GCA AAA ACT GCT CTA AGT GAT 289 Val Gly His Leu Asp Thr Leu Gly Thr Ala Lys Thr Ala Leu Ser Asp 85 90 95 AAT GGG CAT GAC GGG CTA TTC CTT 313 Asn Gly His Asp Gly Leu Phe Leu 100 104

【００６１】配列番号：25 配列の長さ：104 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ジャガイモ（Solanum tuberosum） 品種名：Desiree 配列 Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg 1 5 10 15 Ala Pro Asn Gly Arg Val Leu Pro Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr 20 25 30 Asn Thr Glu Ile Val Ser Lys Thr Glu Ser Gln Leu Val Glu Ala Val 35 40 45 Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Lys Ala Gln Asp Pro 50 55 60 Phe Val Thr Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu 65 70 75 80 Val Gly His Leu Asp Thr Leu Gly Thr Ala Lys Thr Ala Leu Ser Asp 85 90 95 Asn Gly His Asp Gly Leu Phe Leu 100 104

【００６２】配列番号：26 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATGGTTTCCG TCTTCAACGA GATCCTATTC 30

【００６３】配列番号：27 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AACTGCTACT ATTTGTACAC TCTATTTG

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列か
   らなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。 （ａ）GGITTPGGICAQPTICAPCCIAGIACICAAGG（配列番号
   1） （ｂ）GGITTPGGICAQPTICAPCCIAGIACICAGGG（配列番号
   2） （ｃ）GGITTPGGICAQPTICAPCCICGIACICAAGG（配列番号
   3） （ｄ）GGITTPGGICAQPTICAPCCICGIACICAGGG（配列番号
   4） （ｅ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCACC（配列番号5） （ｆ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCCCC（配列番号6） （ｇ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCGCC（配列番号7） （ｈ）GCIACICCIGAIACQTAQTTICCTCC（配列番号8） （ここで、Aはアデニンを表し、Cはシトシンを表し、G
   はグアニンを表し、Tはチミンを表し、Iはイノシンを表
   し、Pは式 化１ 【化１】 を表し、Qは式 化２ 【化２】 を表し、Pを塩基とするデオキシリボヌクレオシドは式
   化３ 【化３】 で示され、Qを塩基とするデオキシリボヌクレオシドは
   式 化４ 【化４】 で示される。）
2. 【請求項２】植物由来のDNAを鋳型とするポリメラーゼ
   チェイン反応において、請求項1記載の（ａ）〜（ｄ）
   のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請求項1記載
   の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1
   つとをプライマーとして用いてDNA断片を増幅すること
   を特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシ
   ダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の取得方
   法。
3. 【請求項３】高等植物由来のDNAを鋳型とするポリメラ
   ーゼチェイン反応において、請求項1記載の（ａ）〜
   （ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請求
   項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少な
   くとも1つとをプライマーとして用いてDNA断片を増幅す
   ることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲン
   オキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の
   取得方法。
4. 【請求項４】双子葉植物由来のDNAを鋳型とするポリメ
   ラーゼチェイン反応において、請求項1記載の（ａ）〜
   （ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請求
   項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少な
   くとも1つとをプライマーとして用いてDNA断片を増幅す
   ることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲン
   オキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の
   取得方法。
5. 【請求項５】マメ科植物由来のDNAを鋳型とするポリメ
   ラーゼチェイン反応において、請求項1記載の（ａ）〜
   （ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請求
   項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少な
   くとも1つとをプライマーとして用いてDNA断片を増幅す
   ることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲン
   オキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の
   取得方法。
6. 【請求項６】ダイズ植物由来のDNAを鋳型とするポリメ
   ラーゼチェイン反応において、請求項1記載の（ａ）〜
   （ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請求
   項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少な
   くとも1つとをプライマーとして用いてDNA断片を増幅す
   ることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲン
   オキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の
   取得方法。
7. 【請求項７】エンドウ植物由来のDNAを鋳型とするポリ
   メラーゼチェイン反応において、請求項1記載の（ａ）
   〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請
   求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少
   なくとも1つとをプライマーとして用いてDNA断片を増幅
   することを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲ
   ンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片
   の取得方法。
8. 【請求項８】ナス科植物由来のDNAを鋳型とするポリメ
   ラーゼチェイン反応において、請求項1記載の（ａ）〜
   （ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請求
   項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少な
   くとも1つとをプライマーとして用いてDNA断片を増幅す
   ることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲン
   オキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の
   取得方法。
9. 【請求項９】タバコ植物由来のDNAを鋳型とするポリメ
   ラーゼチェイン反応において、請求項1記載の（ａ）〜
   （ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請求
   項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少な
   くとも1つとをプライマーとして用いてDNA断片を増幅す
   ることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲン
   オキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA断片の
   取得方法。
10. 【請求項１０】ジャガイモ植物由来のDNAを鋳型とする
    ポリメラーゼチェイン反応において、請求項1記載の
    （ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ
    と、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチ
    ドの少なくとも1つとをプライマーとして用いてDNA断片
    を増幅することを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリ
    ノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDN
    A断片の取得方法。
11. 【請求項１１】植物由来のDNAを鋳型とするポリメラー
    ゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であって、請求項1
    記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくと
    も1つと、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレ
    オチドの少なくとも1つとをプライマーとして用いて増
    幅されることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノ
    ーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からなるDNA
    断片。
12. 【請求項１２】高等植物由来のDNAを鋳型とするポリメ
    ラーゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であって、請
    求項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少
    なくとも1つと、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴ
    ヌクレオチドの少なくとも1つとをプライマーとして用
    いて増幅されることを特徴とする葉緑体型プロトポルフ
    ィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列からな
    るDNA断片。
13. 【請求項１３】双子葉植物由来のDNAを鋳型とするポリ
    メラーゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であって、
    請求項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの
    少なくとも1つと、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリ
    ゴヌクレオチドの少なくとも1つとをプライマーとして
    用いて増幅されることを特徴とする葉緑体型プロトポル
    フィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列から
    なるDNA断片。
14. 【請求項１４】マメ科植物由来のDNAを鋳型とするポリ
    メラーゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であって、
    請求項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの
    少なくとも1つと、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリ
    ゴヌクレオチドの少なくとも1つとをプライマーとして
    用いて増幅されることを特徴とする葉緑体型プロトポル
    フィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列から
    なるDNA断片。
15. 【請求項１５】ダイズ植物由来のDNAを鋳型とするポリ
    メラーゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であって、
    請求項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの
    少なくとも1つと、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリ
    ゴヌクレオチドの少なくとも1つとをプライマーとして
    用いて増幅されることを特徴とする葉緑体型プロトポル
    フィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列から
    なるDNA断片。
16. 【請求項１６】エンドウ植物由来のDNAを鋳型とするポ
    リメラーゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であっ
    て、請求項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチ
    ドの少なくとも1つと、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）の
    オリゴヌクレオチドの少なくとも1つとをプライマーと
    して用いて増幅されることを特徴とする葉緑体型プロト
    ポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列
    からなるDNA断片。
17. 【請求項１７】ナス科植物由来のDNAを鋳型とするポリ
    メラーゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であって、
    請求項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの
    少なくとも1つと、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリ
    ゴヌクレオチドの少なくとも1つとをプライマーとして
    用いて増幅されることを特徴とする葉緑体型プロトポル
    フィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列から
    なるDNA断片。
18. 【請求項１８】タバコ植物由来のDNAを鋳型とするポリ
    メラーゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であって、
    請求項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの
    少なくとも1つと、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリ
    ゴヌクレオチドの少なくとも1つとをプライマーとして
    用いて増幅されることを特徴とする葉緑体型プロトポル
    フィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列から
    なるDNA断片。
19. 【請求項１９】ジャガイモ植物由来のDNAを鋳型とする
    ポリメラーゼチェイン反応で増幅されるDNA断片であっ
    て、請求項1記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチ
    ドの少なくとも1つと、請求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）の
    オリゴヌクレオチドの少なくとも1つとをプライマーと
    して用いて増幅されることを特徴とする葉緑体型プロト
    ポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基配列
    からなるDNA断片。
20. 【請求項２０】工程（Ｃ）〜（Ｅ）を１回以上含む以下
    の工程からなることを特徴とする葉緑体型プロトポルフ
    ィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の取得方法。 （Ａ）植物由来のDNAを鋳型とし、請求項1記載の（ａ）
    〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つと、請
    求項1記載の（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドの少
    なくとも1つとをプライマーとして用いて、葉緑体型プ
    ロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子の部分塩基
    配列からなるDNA断片をポリメラーゼチェイン反応で増
    幅する。 （Ｂ）増幅されたDNA断片の塩基配列を決定する。 （Ｃ）前記（Ｂ）で決定された塩基配列の中の15bpから
    40bpの塩基配列を有する3'下流領域増幅用プライマー、
    および、前記（Ｂ）で決定された塩基配列に相補的な塩
    基配列の中の15bpから40bpの塩基配列を有する5'上流領
    域増幅用プライマーを作製する。 （Ｄ）植物由来のDNAの末端にアダプターDNAが付加され
    てなるDNA断片を鋳型とし、アダプターDNAの部分塩基配
    列を有するプライマーと前記（Ｃ）で作製された5'上流
    領域増幅用プライマーとの組み合わせおよびアダプター
    DNAの部分塩基配列を有するプライマーと前記（Ｃ）で
    作製された3'下流領域増幅用プライマーとの組み合わせ
    を用い、前記（Ｂ）で決定された塩基配列の5'上流側の
    塩基配列を含むDNA断片および前記（Ｂ）で決定された
    塩基配列の3'下流側の塩基配列を含むDNA断片をポリメ
    ラーゼチェイン反応で増幅する。 （Ｅ）前記（Ｄ）で増幅された2種のDNA断片の塩基配列
    を決定し、決定された塩基配列と前記（Ｂ）で決定され
    た塩基配列において重複する領域を重ね合せてこれらの
    塩基配列を連結することにより一つの塩基配列を作成す
    る。 （Ｆ）前記（Ｅ）で作成された塩基配列の情報をもと
    に、葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
    伝子の塩基配列の5'非翻訳領域の塩基配列を含む15bpか
    ら40bpの塩基配列を持つN末端プライマーおよび3'非翻
    訳領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む15bpから40
    bpの塩基配列を持つC末端プライマーを作製し、植物由
    来のDNAを鋳型としかつ前記両末端プライマーを用い
    て、葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
    伝子をポリメラーゼチェイン反応で増幅し、単離する
    か、または、前記（Ａ）および（Ｄ）で増幅されたDNA
    断片を、重複している領域に存在する制限酵素認識部位
    で結合し葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダー
    ゼ遺伝子を合成し、単離する。（ここで、（Ｃ）〜
    （Ｅ）の繰り返し工程においては「（Ｂ）」を「前回の
    （Ｅ）」と読み替える。）
21. 【請求項２１】工程（Ａ）（Ｂ）に続き工程（Ｃ）〜
    （Ｅ）を少なくとも１回実施した後、（Ｂ）で決定され
    た塩基配列の5'上流側の塩基配列を含むDNA断片および
    （Ｂ）で決定された塩基配列の3'下流側の塩基配列を含
    むDNA断片のいずれかの増幅についてのみ工程（Ｃ）〜
    （Ｅ）を１回以上繰り返し行うことを特徴とする請求項
    ２０記載の葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダ
    ーゼ遺伝子の取得方法。
22. 【請求項２２】鋳型として用いられる植物由来のDNAが
    高等植物由来のDNAであることを特徴とする請求項20ま
    たは21記載の取得方法。
23. 【請求項２３】鋳型として用いられる植物由来のDNAが
    双子葉植物由来のDNAであることを特徴とする請求項20
    または21記載の取得方法。
24. 【請求項２４】鋳型として用いられる植物由来のDNAが
    マメ科植物由来のDNAであることを特徴とする請求項20
    または21記載の取得方法。
25. 【請求項２５】鋳型として用いられる植物由来のDNAが
    ダイズ植物由来のDNAであることを特徴とする請求項20
    または21記載の取得方法。
26. 【請求項２６】鋳型として用いられる植物由来のDNAが
    エンドウ植物由来のDNAであることを特徴とする請求項2
    0または21記載の取得方法。
27. 【請求項２７】鋳型として用いられる植物由来のDNAが
    ナス科植物由来のDNAであることを特徴とする請求項20
    または21記載の取得方法。
28. 【請求項２８】鋳型として用いられる植物由来のDNAが
    タバコ植物由来のDNAであることを特徴とする請求項20
    または21記載の取得方法。
29. 【請求項２９】鋳型として用いられる植物由来のDNAが
    ジャガイモ植物由来のDNAであることを特徴とする請求
    項20または21記載の取得方法。
30. 【請求項３０】請求項24、25、26、27、28または29記載
    の取得方法により得られることを特徴とする葉緑体型プ
    ロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子。
31. 【請求項３１】植物由来のDNAに対して請求項2、3、4、
    5、6、7、8、9または10記載の方法によって得られるDNA
    断片をプローブとしてハイブリダイズさせるハイブリダ
    イゼーションにより葉緑体型プロトポルフィリノーゲン
    オキシダーゼ遺伝子を特定し、該遺伝子を単離する工程
    からなることを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノ
    ーゲンオキシダーゼ遺伝子の取得方法。
32. 【請求項３２】ハイブリダイゼーションに用いられる植
    物由来のDNAが高等植物由来のDNAであることを特徴とす
    る請求項31記載の取得方法。
33. 【請求項３３】ハイブリダイゼーションに用いられる植
    物由来のDNAが双子葉植物由来のDNAであることを特徴と
    する請求項31記載の取得方法。
34. 【請求項３４】ハイブリダイゼーションに用いられる植
    物由来のDNAがマメ科植物由来のDNAであることを特徴と
    する請求項31記載の取得方法。
35. 【請求項３５】ハイブリダイゼーションに用いられる植
    物由来のDNAがダイズ植物由来のDNAであることを特徴と
    する請求項31記載の取得方法。
36. 【請求項３６】ハイブリダイゼーションに用いられる植
    物由来のDNAがエンドウ植物由来のDNAであることを特徴
    とする請求項31記載の取得方法。
37. 【請求項３７】ハイブリダイゼーションに用いられる植
    物由来のDNAがナス科植物由来のDNAであることを特徴と
    する請求項31記載の取得方法。
38. 【請求項３８】ハイブリダイゼーションに用いられる植
    物由来のDNAがタバコ植物由来のDNAであることを特徴と
    する請求項31記載の取得方法。
39. 【請求項３９】ハイブリダイゼーションに用いられる植
    物由来のDNAがジャガイモ植物由来のDNAであることを特
    徴とする請求項31記載の取得方法。
40. 【請求項４０】請求項31、32、33、34、35、36、37、38
    または39記載の方法により得られることを特徴とする葉
    緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子。
41. 【請求項４１】配列番号９で示されるアミノ酸配列また
    は該アミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸
    配列が欠損、置換または付加されたアミノ酸配列からな
    り、かつプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を
    有するタンパク質をコードすることを特徴とする葉緑体
    型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子。
42. 【請求項４２】配列番号9に示されるアミノ酸配列をコ
    ードする塩基配列を有することを特徴とする請求項41記
    載の葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺
    伝子。
43. 【請求項４３】配列番号10に示される塩基配列を有する
    ことを特徴とする葉緑体型プロトポルフィリノーゲンオ
    キシダーゼ遺伝子。
44. 【請求項４４】配列番号11に示されるアミノ酸配列をコ
    ードする塩基配列を有することを特徴とする葉緑体移送
    シグナルペプチドをコードするDNA断片。
45. 【請求項４５】配列番号12に示される塩基配列を有する
    ことを特徴とする葉緑体移送シグナルペプチドをコード
    するDNA断片。
46. 【請求項４６】配列番号13に示される塩基配列を有する
    ことを特徴とするダイズゲノムDNA由来の葉緑体型プロ
    トポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子。
47. 【請求項４７】請求項41、42、43または46記載の葉緑体
    型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を含有
    することを特徴とするプラスミド。
48. 【請求項４８】（1）宿主細胞内で機能可能なプロモー
    ター、（2）請求項41、42、43または46記載の遺伝子お
    よび（3）宿主細胞内で機能可能なターミネーターを機
    能可能な形で前記の順序となるよう結合させることを特
    徴とする発現プラスミドの構築方法。
49. 【請求項４９】（1）宿主細胞内で機能可能なプロモー
    ター、（2）請求項41、42、43または46記載の遺伝子お
    よび（3）宿主細胞内で機能可能なターミネーターを機
    能可能な形で前記の順序となるよう結合させてなること
    を特徴とする発現プラスミド。
50. 【請求項５０】（1）宿主細胞内で機能可能なプロモー
    ター、（2）請求項41、42、43または46記載の遺伝子お
    よび（3）宿主細胞内で機能可能なターミネーターを機
    能可能な形で前記の順序となるよう結合させてなる発現
    プラスミドを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換
    させることにより形質転換体のプロトポルフィリノーゲ
    ンオキシダーゼ活性を増強することを特徴とするプロト
    ポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性の増強方法。
51. 【請求項５１】請求項47記載のプラスミドまたは請求項
    49記載の発現プラスミドが宿主生物に導入されてなるこ
    とを特徴とする形質転換体。
52. 【請求項５２】宿主生物が微生物であることを特徴とす
    る請求項51記載の形質転換体。
53. 【請求項５３】宿主生物が植物であることを特徴とする
    請求項51記載の形質転換体。
54. 【請求項５４】配列番号14で示される塩基配列を有する
    ことを特徴とするプロモーター。
55. 【請求項５５】請求項54記載のプロモーターを含有する
    ことを特徴とするプラスミド。
56. 【請求項５６】請求項55記載のプラスミドが宿主生物に
    導入されてなることを特徴とする形質転換体。