JP2003506036A - 植物中のプリン代謝遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼをコードする単離された核酸フラグメント、該核酸フラグメントを含んで成る形質転換された宿主細胞、および該核酸フラグメントを含んで成るトランスジェニック植物に関する。本発明はまた、ＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼの全部もしくは実質的な一部分をコードするキメラ遺伝子、および単離されたフラグメントをセンスもしくはアンチセンスの向きで含んで成るキメラ遺伝子の構築にも関する。本発明は、形質転換された宿主細胞中でのＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼの発現レベルを変える方法、およびＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼの活性に影響を及ぼす化合物の評価方法にさらに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９９年７月３０日に出願された米国仮出願第６０／１４６４７
３号明細書の利益を主張する。

【０００２】 （発明の背景） プリンはＤＮＡおよびＲＮＡの成分である。プリン三リン酸は細胞の化学的エ
ネルギー貯蔵媒体としてもまた作用する。細胞内のプリン合成および代謝の調節
は全細胞の機能に決定的に重要である。ヌクレオチド生合成酵素に影響を及ぼす
大部分の突然変異は致死的であるが、とは言えある種の冗長および救済経路がこ
れらの突然変異のいくつかの有害な影響を和らげることができる。

【０００３】 アデノシンデアミナーゼおよびＡＭＰデアミナーゼは、アデノシンをイノシン
に転化する２種の酵素である。これらの遺伝子中の突然変異は、アデノシンおよ
びＡＭＰの救済および異化作用の崩壊を引き起こす。ヒトでは、これらの突然変
異は、白血球（リンパ球）の死につながることができ、これは順に重症の免疫不
全を引き起こす（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１２７
８−１２８４；ＭｏｒｇａｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｎｎ Ｒｅｖ
Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：１９１−２１７；Ｍａｒｋｅｒｔ（１９９４）Ｉｍｍｕ
ｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ５：１４１−１５７）。アデノシンもしくはＡＭＰ
デアミナーゼの活性の選択的崩壊を、新規の除草剤、殺虫剤および殺真菌剤の同
定および製造で活用することができる。

【０００４】 （発明の要約） 本発明は：（ａ）長さが最低３５アミノ酸でありかつ配列番号２、４、６、８
、１２、１４、１６、１８、２０および２２より成る群から選択されるポリペプ
チドに比較される場合にＣｌｕｓｔａｌ整列方法に基づき最低８５％の同一性を
有するポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド、もしくは（ｂ）第一のヌ
クレオチド配列の相補物である第二のヌクレオチド配列を含んで成る、単離され
たポリヌクレオチドに関する。

【０００５】 第二の態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１、
３、５、７、１１、１３、１５、１７、１９および２１より成る群から選択され
る核酸配列を有するヌクレオチドを含んで成る。

【０００６】 第三の態様において、本発明は、配列番号１、３、５、７、１１、１３、１５
、１７、１９および２１より成る群から選択されるメンバーもしくはそれらの相
補物由来の最低３０（好ましくは最低４０、最も好ましくは最低６０）の連続す
るヌクレオチドを含んで成る、単離されたポリヌクレオチドに関する。

【０００７】 第四の態様において、本発明は、最低１種の適する調節配列に操作可能に連結
された、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んで成るキメラ遺伝子に関す
る。

【０００８】 第五の態様において、本発明は、本発明のキメラ遺伝子もしくは単離されたポ
リヌクレオチドを含んで成る単離された宿主細胞に関する。該宿主細胞は酵母も
しくは植物細胞のような真核生物、または細菌細胞のような原核生物であること
ができる。本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドもしくはキメラ遺伝
子を含んで成るウイルス、好ましくはバキュロウイルスにもまた関する。

【０００９】 第六の態様において、本発明は単離された宿主細胞の製造方法にもまた関し、
該方法は、適するキメラ遺伝子もしくは単離されたポリヌクレオチドで、単離さ
れた宿主細胞を形質転換もしくはトランスフェクションのいずれかをすることを
含んで成る。

【００１０】 第七の態様において、本発明は、長さが最低３５アミノ酸でありかつ配列番号
２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０および２２より成る群から選択
されるポリペプチドに比較してＣｌｕｓｔａｌ整列方法に基づき最低８５％の同
一性を有する、単離されたポリペプチドに関する。

【００１１】 第八の態様において、本発明は、宿主細胞、好ましくは植物細胞中のＡＭＰも
しくはアデノシンデアミナーゼの発現レベルもしくは活性に影響を及ぼす単離さ
れたポリヌクレオチドの選択方法に関する。本発明により、該方法は：（ａ）本
発明の単離されたポリヌクレオチドもしくは単離されたキメラ遺伝子を構築する
こと；（ｂ）該単離されたポリヌクレオチドもしくは単離されたキメラ遺伝子を
宿主細胞中に導入すること；（ｃ）該単離されたポリヌクレオチドを含有する宿
主細胞中のＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼのポリペプチドもしくは酵素
活性のレベルを測定すること；および（ｄ）該単離されたポリヌクレオチドを含
有する宿主細胞中のＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼのポリペプチドもし
くは酵素活性のレベルを、該単離されたポリヌクレオチドを含有しない宿主細胞
中のＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼのポリペプチドもしくは酵素活性の
レベルと比較することを介して、適するポリヌクレオチドを選択すること、を含
んで成る。

【００１２】 第九の態様において、本発明は、配列番号１、３、５、７、１１、１３、１５
、１７、１９および２１より成る群から選択されるヌクレオチド配列、もしくは
こうしたヌクレオチド配列の相補物由来の最低３０の連続するヌクレオチドを含
んで成るオリゴヌクレオチドプライマー（好ましくは最低４０のもの、最も好ま
しくは最低６０のもの）を合成すること；ならびに、該オリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用して核酸フラグメント（好ましくはクローニングベクターに挿入さ
れたｃＤＮＡ）を増幅することを含んで成る、ＡＭＰもしくはアデノシンデアミ
ナーゼポリペプチド、好ましくは植物のＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼ
ポリペプチドの実質的な一部分をコードする核酸フラグメントを得る方法に関す
る。増幅された核酸フラグメントは、好ましくは、ＡＭＰもしくはアデノシンデ
アミナーゼのアミノ酸配列の実質的な一部分をコードすることができる。

【００１３】 第十の態様において、本発明は：本発明の標識された単離されたポリヌクレオ
チドでｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーをプロービングすること；該単離
されたポリヌクレオチドとハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定すること；
および同定されたＤＮＡクローンを単離することを含んで成る、ＡＭＰもしくは
アデノシンデアミナーゼの全部もしくは実質的な一部分をコードする核酸フラグ
メントを得る方法に関する。

【００１４】 第十一の態様において、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含
んで成る、ハイブリダイゼーション混合物のような組成物に関する。

【００１５】 第十二の態様において、本発明は：（ａ）本発明のキメラ遺伝子もしくは本発
明の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る発現カセットで宿主細胞を形質転
換すること；および（ｂ）ヌル突然変異を補完するのに十分な量でのポリヌクレ
オチドの発現を可能にする条件下で、形質転換された宿主細胞、好ましくは単子
葉もしくは双子葉植物細胞のような植物細胞を成長させることを含んで成る、形
質転換された細胞を得る方法に関する。

【００１６】 第十三の態様において、本発明は：（ａ）本発明のキメラ遺伝子で宿主細胞を
形質転換すること；および（ｂ）該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で、形質
転換された宿主細胞を成長させること（ここで、該キメラ遺伝子の発現は、形質
転換された宿主細胞中のプリン代謝に関与する酵素のレベルを変える）を含んで
成る、宿主細胞中のプリン代謝に関与する酵素の発現のレベルを変える方法に関
する。

【００１７】 本発明のさらなる一態様は、プリン代謝に関与する酵素の活性を阻害するその
能力についての最低１種の化合物の評価方法であって、該方法は：（ａ）本発明
のキメラ遺伝子で宿主細胞を形質転換すること；（ｂ）該キメラ遺伝子の発現に
適する条件下で、該形質転換された宿主細胞を成長させること（ここで、該キメ
ラ遺伝子の発現は形質転換された宿主細胞中で酵素の産生をもたらし）；（ｃ）
場合によっては、形質転換された宿主細胞により発現された酵素を精製すること
；（ｄ）試験されるべき化合物で該酵素を処理すること；および（ｅ）処理され
た酵素の活性を処理されない酵素の活性と比較し、それにより、阻害活性をもつ
化合物を選択すること、の段階を含んで成る。

【００１８】 本発明は、以下の詳述された記述ならびに付随する図面および配列表からより
完全に理解することができる。

【００１９】 図１は、発明にかかる、プリンの異化作用につながる生化学的経路を描く。Ａ
ＭＰデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼにより調節される段階を示す。

【００２０】 図２は、発明にかかる、トウモロコシ、コメ、ダイズおよびコムギのＡＭＰデ
アミナーゼ（それぞれ配列番号１４、１６、１８および２０）、ならびにシロイ
ヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＡＭＰデアミナーゼ
（配列番号２３［ｇｉ ７４８４８０７］）のアミノ酸配列の比較を示す。

【００２１】 図３は、発明にかかる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のアデ
ノシンデアミナーゼ（配列番号２４［ｇｉ ２５０６３４２］）とのダイズのア
デノシンデアミナーゼ（配列番号１２）のアミノ酸配列の比較を示す。

【００２２】 発明にかかる、本明細書に記述されるポリペプチド、これらのポリペプチドの
全部もしくは実質的な一部分を表すポリペプチドをコードする核酸フラグメント
を含んで成るｃＤＮＡクローンの呼称、および付属される配列表で使用されると
ころの対応する識別名（配列番号）を列挙する。これに付属される配列の記述お
よび配列表は、Ｃ．Ｆ．Ｒ第３７条§１．８２１−１．８２５に示されるところ
の特許出願におけるヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸配列の開示に適用さ
れる規則に従う。

【００２３】

【表１】

【００２４】 配列表は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢの下での標準的なヌクレオチドの一文字記
号およびアミノ酸の三文字記号（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：
３０２１−３０３０（１９８５）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．２１９（Ｎｏ
．２）：３４５−３７３（１９８４））を含有する。ヌクレオチドおよびアミノ
酸配列データに使用される記号および形式は、Ｃ．Ｆ．Ｒ．第３７条§１．８２
２に示される規則に従う。配列番号１〜１２に開示される情報は、１９９９年７
月３０日に出願された米国仮出願第６０／１４６４７３号明細書に含有される。

【００２５】 （発明の詳細な記述） 本開示の情況において、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、
「核酸配列」および「核酸フラグメント」もしくは「単離された核酸フラグメン
ト」という用語を互換性に使用する。ポリヌクレオチドはＲＮＡもしくはＤＮＡ
であることができ、それらは一本鎖もしくは二本鎖であることができかつ合成、
非天然もしくは変えられたヌクレオチド塩基を含有することができる。ＤＮＡポ
リヌクレオチドはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡの１種もしくはそれ以上
のセグメント、またはそれらの混合物より構成されることができる。本発明の単
離されたポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５
、１７、１９および２１由来の最低３０の連続するヌクレオチドのもの、好まし
くは最低４０の連続するヌクレオチドのもの、最も好ましくは最低６０の連続す
るヌクレオチドのもの、もしくはこうした配列の相補物を包含することができる
。

【００２６】 「単離された」ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドという用語は、その天
然に存在する環境中で見出される際にそれと通常付随もしくは相互作用する他の
染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡもしくは他のタンパク質のような他の
細胞性分子を実質的に含まない分子を指す。単離されたポリヌクレオチドもしく
はポリペプチドは、それらが天然に存在する宿主細胞から精製することができる
。慣習的な核酸もしくはタンパク質精製法は当業者に公知である。該用語は、組
換えのおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドもしくはポリペプチドもまた
包含する。

【００２７】 「組換えの」という用語は、例えば、核酸配列が、化学合成もしくは遺伝子工
学技術による２種もしくはそれ以上の別の方法で分離された核酸フラグメントの
人工的結合により作成もしくは改変されることを意味する。

【００２８】 本明細書で使用されるところの「コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）」は、配列の相
同性の有意の共通のもしくは重なり合う領域を共有しかつ単一の連続するヌクレ
オチド配列に集成して「コンティグ」を形成することができる、２種もしくはそ
れ以上の構成的ヌクレオチド配列から集成される連続するヌクレオチド配列を指
す。比較方法および 本明細書で使用されるところの「実質的に類似の」は、その中で１個もしくは
それ以上のヌクレオチド塩基の変化が１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換を
もたらすがしかし該ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの機能特
性に影響を及ぼさない核酸フラグメントを指す。「実質的に類似の」はまた、そ
の中で１個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、例えばアンチセンス
もしくは共抑制による遺伝子沈黙（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を介して遺
伝子発現のパターンもしくはレベルを変える核酸フラグメントもしくはその転写
物の能力に影響を及ぼさない、核酸フラグメントも指す。

【００２９】 実質的に類似の核酸フラグメントは、本発明の核酸フラグメントの下位フラグ
メント（ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ）もしくは改変を表す核酸フラグメント（ここ
で、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドが置換、欠失および／もしくは挿入さ
れる）を、植物もしくは植物細胞中の改変されない核酸フラグメントによりコー
ドされるポリペプチドのレベルに影響を及ぼすそれらの能力についてスクリーニ
ングすることにより得ることができる。

【００３０】 本核酸フラグメント由来の最低３０の連続するヌクレオチドを表す実質的に類
似の核酸フラグメントを構築しかつ植物もしくは植物細胞中に導入することがで
きる。実質的に類似の核フラグメントに曝露された植物もしくは植物細胞中に存
在する改変されない核酸フラグメントによりコードされるポリペプチドのレベル
を、その後、実質的に類似の核酸フラグメントに曝露されない植物もしくは植物
細胞中のポリペプチドのレベルと比較することができる。

【００３１】 例えば、遺伝子発現のアンチセンス抑制および共抑制は、実質的に類似の核酸
フラグメント、すなわち、遺伝子のコーディング領域全体未満を表す、もしくは
抑制されるべき遺伝子と１００％未満の配列の同一性を有する核酸分子を使用し
て達成することができることが、当該技術分野で公知である。

【００３２】 実質的に類似のポリペプチドは、該ポリペプチドの機能に有意に影響を及ぼさ
ない１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失を有するポリペ
プチドを指す。当業者は、それによりある残基が類似の特徴をもつ別のもので置
換される保存的置換は、実質的に類似の機能をもつポリペプチドをもたらすこと
を認識している。典型的なこうした置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌ
ｅの間；ＳｅｒとＴｈｒとの間；ＡｓｐとＧｌｕとの間；ＡｓｎとＧｌｎとの間
；ならびにＬｙｓとＡｒｇとの間；もしくはＰｈｅとＴｙｒとの間である。実質
的に類似のポリペプチドは、いずれかの組み合わせで置換、欠失もしくは付加さ
れた数個の、５〜１０、１〜５、１〜３、１〜２もしくは１個のアミノ酸を有す
ることができる。

【００３３】 従って、疎水性アミノ酸、アミノ酸アラニンのコドンは、グリシンのような別
のより少なく疎水性の残基、またはバリン、ロイシンもしくはイソロイシンのよ
うなより疎水性の残基をコードするコドンにより置換されることができる。同様
に、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のような１個の負に荷電した残基の
代わりの別のもの、もしくはアルギニンの代わりにリシンのような、１個の正に
荷電した残基の代わりの別のものの置換をもたらす変化もまた、機能的に同等な
産物を生じさせると期待することができる。

【００３４】 ポリペプチド分子のＮ末端およびＣ末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変
化もまた、該ポリペプチドの活性を変えると期待されないとみられる。提案され
た改変のそれぞれは、コードされた産物の生物学的活性の保持の決定がそうであ
るように、当該技術分野の慣例の熟練内に十分にある。

【００３５】 結果として、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９お
よび２１より成る群から選択されるヌクレオチド配列、ならびにこうしたヌクレ
オチド配列の相補物由来の最低３０の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列
を含んで成る単離されたポリヌクレオチド（好ましくは最低４０のもの、最も好
ましくは最低６０のもの）を、ＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼの発現に
影響を及ぼす単離されたポリヌクレオチドの選択方法で使用することができる。

【００３６】 従って、本発明は特定の例示的ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列以上を包含
しかつそれらの機能的同等物を包含することが理解される。「実質的に類似の」
および「実質的に対応する」という用語は本明細書で互換性に使用する。

【００３７】 ウイルスもしくは宿主細胞（植物もしくは酵母のような真核生物、細菌のよう
な原核生物）中での遺伝子の発現のレベルに影響を及ぼす単離されたポリヌクレ
オチドの選択方法は：本発明の単離されたポリヌクレオチドもしくは本発明のキ
メラ遺伝子を構築すること；単離されたポリヌクレオチドもしくは単離されたキ
メラ遺伝子を、該単離されたポリヌクレオチドの本来の同等物を発現する宿主細
胞に導入すること；該宿主細胞中の本来の遺伝子の発現のレベルを測定すること
；および単離されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞中のポリペプチドもし
くは酵素活性のレベルを、単離されたポリヌクレオチドを含有しない宿主細胞中
のポリペプチドもしくは酵素活性のレベルと比較すること、を含むことができる
。

【００３８】 さらに、実質的に類似の核酸フラグメントは、ハイブリダイズするそれらの能
力によってもまた特徴づけることができる。こうした相同性の推定は、当業者に
より十分に理解されるとおり、ストリンジェンシーの条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡ
もしくはＤＮＡ−ＲＮＡのいずれかのハイブリダイゼーションにより提供される
（ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、ＩＲＬ プレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、英国オック
スフォード）。ストリンジェンシーの条件は、遠く関係した生物体からの相同配
列のような中程度に類似のフラグメント、ないし緊密に関係した生物体からの機
能的酵素を再現する遺伝子のような高度に類似のフラグメントについてスクリー
ニングするように調節することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄がス
トリンジェンシーの条件を決定する。一組の好ましい条件は、６×ＳＳＣ、０．
５％ＳＤＳ、室温で１５分間を用いて開始し、その後２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤ
Ｓ、４５℃で３０分間を用いて反復され、そしてその後０．２×ＳＳＣ、０．５
％ＳＤＳ、５０℃３０分間を用いて２回反復される一連の洗浄を使用する。より
好ましい一組のストリンジェントな条件はより高温を使用し、ここでは洗浄は０
．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中の最後の２回の３０分の洗浄の温度を６０℃に
増大させたことを除き上のものに同一である。別の好ましい組の高度にストリン
ジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での２回の最後の
洗浄を使用する。

【００３９】 本発明の実質的に類似の核酸フラグメントは、当業者により普遍的に使用され
るアルゴリズムにより決定されるとおり、それらがコードするアミノ酸配列の同
一性のパーセントによってもまた特徴づけることができる。本発明の適する単離
されたポリヌクレオチドは、本明細書に報告されるアミノ酸配列に最低約７０％
同一、好ましくは最低約８０％、より好ましくは最低約８５％、なおより好まし
くは最低約９０％、および最も好ましくは最低約９５％同一であるポリペプチド
をコードする。

【００４０】 適する核酸フラグメントは、上の同一性を有するのみならず、しかし典型的に
は、最低１０、好ましくは２０、より好ましくは３０、なおより好ましくは５０
、より好ましくは最低１００、より好ましくは最低１５０、なおより好ましくは
最低２００、および最も好ましくは最低２５０アミノ酸を有するポリペプチドを
コードする。

【００４１】 配列の整列および同一性のパーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生物情報
科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ インク（ＤＮ
ＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン）のＭｅｇａｌｉｇｎプ
ログラムを使用して実施した。配列の複数の整列は、デフォルトのパラメータ（
ギャップ ペナルティ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナルテ
ィ（ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いるＣｌｕｓｔａｌ
整列方法（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１
−１５３）を使用して実施した。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用する対にした整列のた
めのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ １、ギャップ ペナルティ＝３
、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズ セイブド（ＤＩＡＧ
ＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５であった。

【００４２】 アミノ酸およびヌクレオチド配列は、当業者により人的に、もしくはＢＬＡＳ
Ｔ（基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
／ＢＬＡＳＴ／もまた参照されたい）のようなアルゴリズムを使用するコンピュ
ータに基づく配列比較および同定ツールを使用することによるかのいずれかでも
また評価することができる。一般に、あるポリペプチドもしくは核酸配列を既知
のタンパク質もしくは遺伝子に相同と推定で同定するためには、１０もしくはそ
れ以上の連続するアミノ酸、または３０もしくはそれ以上の連続するヌクレオチ
ドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、３０もしくはそ
れ以上の連続するヌクレオチドを含んで成る遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド
プローブを、遺伝子の同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離
（例えば、細菌コロニーもしくはバクテリオファージプラークのインシトゥハイ
ブリダイゼーション）の配列依存的方法で使用することができる。加えて、１２
もしくはそれ以上のヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドは、プライマーを含
んで成る特定の核酸フラグメントを得るために、ＰＣＲでの増幅プライマーとし
て使用することができる。

【００４３】 従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、該配列を含んで成る核酸フラ
グメントの特異的同定および／もしくは単離を提供することができるヌクレオチ
ド配列を含んで成る。

【００４４】 本明細は、１種もしくはそれ以上の特定の植物タンパク質を含んで成るポリペ
プチドをコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。これらの配列
の利益を有する当業者は、今や、当業者に既知の目的上、開示される配列の全部
もしくは実質的な一部分を使用することができる。従って、本発明が付随する配
列表に報告されるような配列を含んで成る完全長の分子の完全な配列、ならびに
それらの実質的部分を包含することを企図している。

【００４５】 「コドンの縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼ
すことなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝暗号中の逸脱を指す。従っ
て、本発明は、本明細書に示されるアミノ酸配列の全部もしくは実質的な一部分
をコードするヌクレオチド配列を含んで成るいかなる核酸フラグメントも指す。

【００４６】 当業者は、所定のアミノ酸をコードするヌクレオチドコドンの使用頻度の特定
の宿主細胞により表される「コドンの偏り」を十分に知っている。従って、宿主
細胞中の改善された発現のために核酸フラグメントを合成する場合、コドン使用
頻度のその頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度の頻度に近づくような核酸
フラグメントを設計することが望ましく、かつ当業者の通常の熟練内である。

【００４７】 「合成の核酸フラグメント」は、オリゴヌクレオチド基礎単位から集成するこ
とができ、これらは当業者に既知の手順を使用して化学的に合成することができ
る。これらの基礎単位を連結もしくはアニーリングしてより大きな核酸フラグメ
ントを形成させ、それらをその後酵素的に集成して所望の核酸フラグメント全体
を構築することができる。核酸フラグメントに関するところの「化学的に合成さ
れる」は、成分のヌクレオチドをインビトロで集成したことを意味する。核酸フ
ラグメントの人的化学合成は、確立した手順を使用して達成することができる。
多数の商業的に入手可能な機械の１つを使用して、自動化化学合成を実施するこ
とができる。

【００４８】 ポリヌクレオチドの化学合成は、宿主細胞のコドンの偏りを反映するヌクレオ
チド配列の至適化に基づく、至適の遺伝子発現のためのポリヌクレオチドの特定
の目的に合わせた製作（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）を可能にする。当業者は、コドン
使用頻度が宿主により好まれるそれらのコドンに向かって偏らされる場合に、成
功裏の遺伝子発現がよりありそうであることを認識している。好ましいコドンの
決定は、配列情報が入手可能である場合に宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づく
ことができる。

【００４９】 「遺伝子」は、ポリペプチド分子をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝
子はＲＮＡ分子をコードすることもまたできる。一般に理解されるとおり、遺伝
子は、コーディング配列に先行する（５’非コーディング配列）およびその後に
続く（３’非コーディング配列）調節配列、ならびに個々のコーディングセグメ
ント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を包含する。「本来の遺伝子」
はその本来の調節配列を含む遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に
見出されない調節およびコーディング配列を含んで成る、本来の遺伝子でないい
かなる遺伝子も指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源由来である調節配
列およびコーディング配列、もしくは同一の供給源由来だがしかし天然に見出さ
れるものと異なる様式で配置される調節配列およびコーディング配列を含むこと
ができる。「固有の遺伝子」は、生物体のゲノム中のその天然の位置の本来の遺
伝子を指す。「外来遺伝子」は、通常は宿主生物体中で見出されないがしかし遺
伝子移入により宿主生物体に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は非本来の生
物体に挿入された本来の遺伝子であることができるか、もしくはそれらはキメラ
遺伝子であることができる。「トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は形質
転換手順によりゲノム中に導入された遺伝子である。

【００５０】 「コーディング配列」は特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
指す。「調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、
その内もしくは下流（３’非コーディング配列）に配置され、かつ、転写、ＲＮ
Ａのプロセシングもしくは安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影
響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列
、イントロンおよびポリアデニル酸化認識配列を包含することができる。

【００５１】 「プロモーター」は、コーディング配列もしくは機能的ＲＮＡの発現を制御す
ることが可能なヌクレオチド配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモー
ター配列の３’に配置される。プロモーター配列は、近位のおよびより遠位の上
流要素より成り、後者の要素はしばしばエンハンサーと称される。従って、「エ
ンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができかつプロモーターのレ
ベルもしくは組織特異性を高めるように挿入されたプロモーターの生来の要素も
しくは異種要素であることができるヌクレオチド配列である。プロモーターはそ
っくりそのまま本来の遺伝子由来であることができるか、もしくは天然に見出さ
れる異なるプロモーター由来の異なる要素から構成されることができるか、もし
くは合成のヌクレオチドセグメントさえ含むことができる。異なるプロモーター
が、異なる組織もしくは細胞型において、または発生の異なる段階で、または異
なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指図することができることが、当業者
により理解される。大部分の時点で大部分の細胞型においてある核酸フラグメン
トを発現させるプロモーターは、普遍的に「構成プロモーター」と称される。植
物細胞中で有用な多様な型の新たなプロモーターが定常的に発見されており；多
数の例をＯｋａｍｕｒｏとＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２による編集物で見出すことができる
。（より最近の参考文献を使用されたい）大部分の場合で調節配列の正確な境界
が完全には定義されていないため、異なる長さの核酸フラグメントが同一のプロ
モーター活性を有することができることがさらに認識される。

【００５２】 「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との
間に配置されるヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシ
ングされたｍＲＮＡ中に翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、
ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性もしくは翻訳効率に
影響を及ぼすことができる。翻訳リーダー配列の例が記述されている（Ｔｕｒｎ
ｅｒとＦｏｓｔｅｒ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５−
２３６）。

【００５３】 「３’非コーディング配列」という用語は、コーディング配列の下流に配置さ
れるヌクレオチド配列を指し、そして、ポリアデニル酸化認識配列、およびｍＲ
ＮＡのプロセシングもしくは遺伝子発現の他の局面に影響を及ぼすことが可能な
調節シグナルをコードする他の配列を包含する。ポリアデニル酸化シグナルは、
通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸ホモポリマーの付加を達成す
ることを特徴とする。多様な３’非コーディング配列の使用はＩｎｇｅｌｂｒｅ
ｃｈｔら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０により例示さ
れる。

【００５４】 「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から
生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合
、それは一次転写物と称される。一次転写物が転写後プロセシングを受けた場合
、それは成熟ＲＮＡとなる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イント
ロンを含まずかつ細胞によりポリペプチドに翻訳されることができるＲＮＡを指
す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的でありかつそれから生じられるＤＮ
Ａを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であることができるか、もしくは例えばＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウフラグメントを使用して二本鎖の形態に転化することがで
きる。「センスＲＮＡ」は、ｍＲＮＡを包含しかつ従ってポリペプチドに翻訳さ
れることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次
転写物もしくはｍＲＮＡの全部もしくは一部に相補的であり、かつ、標的遺伝子
の発現を封鎖することができる、ＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，
０６５号明細書（引用により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。アン
チセンスＲＮＡの相補性は、標的遺伝子のいずれかの部分と、すなわち５’非コ
ーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンもしくはコーディング配
列でであることができる。「機能的ＲＮＡ」は、センスＲＮＡ、アンチセンスＲ
ＮＡ、リボザイムＲＮＡ、もしくは翻訳されなくてもよいがしかしそれでもなお
細胞の過程に対する影響を有する他のＲＮＡを指す。

【００５５】 「操作可能に連結される」という用語は、単一のポリヌクレオチドを形成する
２個もしくはそれ以上の核酸フラグメントの結合を指し、その結果、一方のフラ
グメントの機能が他方により影響を及ぼされる。例えば、プロモーターは、それ
があるコーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能である（すなわち、コ
ーディング配列が該プロモーターの転写制御下にある）場合にそのコーディング
配列と操作可能に連結される。コーディング配列は、センスもしくはアンチセン
スの向きで調節配列に操作可能に連結することができる。例えば、コーディング
領域は、センスもしくはアンチセンス転写物が発現されるようなプロモーターに
連結することができる。加えて、いくつかの調節要素は向きに依存しない様式で
機能することができる。

【００５６】 本明細書で使用されるところの「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメ
ント由来のセンス（ｍＲＮＡ）もしくはアンチセンスＲＮＡの転写を指す。発現
はポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳もまた指すことができる。

【００５７】 「アンチセンス阻害」はアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指し、これは順に
標的遺伝子の発現を抑制する。「過剰発現」は、正常のもしくは形質転換されな
い生物体における産生のレベルを越える、トランスジェニック生物体における遺
伝子産物の産生を指す。「共抑制」はセンスＲＮＡ転写物の産生を指し、これは
同一もしくは実質的に類似の外来のもしくは固有の遺伝子の発現を抑制する（米
国特許第５，２３１，０２０号明細書（引用により本明細書に組み込まれる））
。

【００５８】 「変えられたレベル」の発現、もしくは「変えられた発現」は、正常のもしく
は形質転換されない生物体のものと異なる量もしくは比率でのトランスジェニッ
ク生物体における遺伝子産物（１種もしくは複数）の産生を指す。

【００５９】 細胞を指すのに使用される場合の「ヌル突然変異体」は、細胞が、ある種の遺
伝子産物の発現を欠くか、または不活性であるかもしくはいかなる検出可能な期
待される機能も有しない遺伝子産物を発現するかのいずれかであることを意味す
る。

【００６０】 「成熟タンパク質」、もしくはタンパク質の記述において使用される場合の「
成熟」という用語は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド；すなわち、そ
れから一次翻訳産物中に存在するいかなるプレもしくはプロペプチドも除去され
たものを指す（機能的参考文献の必要性）。「前駆体タンパク質」もしくはタン
パク質の記述において使用される場合の「前駆体」という用語は、ｍＲＮＡの翻
訳の一次産物（すなわちなお存在するプレおよびプロペプチドを伴う）を指す。
プレおよびプロペプチドは、限定されるものでないが細胞内局在化シグナルであ
ることができる。

【００６１】 「葉緑体輸送ペプチド」は、タンパク質とともに翻訳されかつ葉緑体もしくは
該タンパク質が作成される植物細胞中に存在する他のプラスチド型に該タンパク
質を向けるアミノ酸配列である。「葉緑体輸送配列」は、葉緑体輸送ペプチドを
コードするヌクレオチド配列を指す。「シグナルペプチド」は、タンパク質とと
もに翻訳されかつ該タンパク質を分泌系に向けるアミノ酸配列である（Ｃｈｒｉ
ｓｐｅｅｌｓ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３）。タンパク質が液胞に向けられるべき
である場合、液胞ターゲッティングシグナル（以前に出現していない）がさらに
付加されることができるか、もしくは、小胞体に向けられるべきである場合、小
胞体保持シグナルが付加されることができる。タンパク質が核に向けられるべき
である場合、存在するいかなるシグナルペプチドも除去されるはずであり、そし
て代わりに核局在化シグナルが包含されるはずである（Ｒａｉｋｈｅｌ（１９９
２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１６２７−１６３２）。

【００６２】 「形質転換」は、好ましくは遺伝子的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物体の
ゲノム中への核酸フラグメントの移入を指す。形質転換された核酸フラグメント
を含有する宿主生物体は「トランスジェニック」生物体と称される。植物の形質
転換法の例は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に媒介さ
れる形質転換（Ｄｅ Ｂｌａｅｒｅら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
１４３：２７７）（いずれかのより新しい参考文献）および粒子に加速されるも
しくは「ジーンガン」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号明細書（引用により本
明細書に組み込まれる））を包含する。従って、本発明の単離されたポリヌクレ
オチドは、宿主細胞中への導入およびその中での複製が可能な組換え構築物、典
型的にはＤＮＡ構築物中に組込むことができる。こうした構築物は、複製系、お
よび所定の宿主細胞中のポリペプチドをコードする配列の転写および翻訳が可能
である配列を包含するベクターであることができる。植物細胞の安定なトランス
フェクションもしくはトランスジェニック植物の樹立に適する多数のベクターが
、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８５、増補１９８７；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈと
Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
、１９８９；およびＦｌｅｖｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ、クラワー アカデミック パブリッシャーズ（Ｋｌｕ
ｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９９０に記述されてい
る。典型的には、植物の発現ベクターは、例えば、５’および３’調節配列の転
写制御下の１種もしくはそれ以上のクローン化された植物遺伝子および優位の選
択可能なマーカーを包含する。こうした植物の発現ベクターは、プロモーター調
節領域（例えば、誘導可能なもしくは構成的な、環境でもしくは発生的に調節さ
れる、または細胞もしくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始の
開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終止部位お
よび／あるいはポリアデニル酸化シグナルもまた含有することができる。

【００６３】 本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該
技術分野で公知であり、かつ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）：コールドスプリングハーバー、１９８９
（下で「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）に、より完全に記述される。

【００６４】 「ＰＣＲ」もしくは「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントの
増幅に使用される技術として当業者により公知である（米国特許第４，６８３，
１９５号および同第４，８００，１５９号明細書）。

【００６５】 本発明は：（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、
２０および２２より成る群から選択されるポリペプチドに比較される場合に、Ｃ
ｌｕｓｔａｌ整列方法に基づき、最低、最低３０％、好ましくは３５％、なお好
ましくは４０％、より好ましくは４５％、なおより好ましくは５０％、より好ま
しくは５５％、より好ましくは６０％、なお好ましくは６５％、なおより好まし
くは７０％、なお好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８
５％、および最も好ましくは９０％の同一性を有する、最低３０、好ましくは６
０、なお好ましくは１００、より好ましくは１５０、なおより好ましくは２００
、より好ましくは２５０、より好ましくは３００、なお好ましくは３５０、なお
より好ましくは４００、なお好ましくは４５０、より好ましくは５００、より好
ましくは５５０、および最も好ましくは６５０アミノ酸のポリペプチドをコード
する第一のヌクレオチド配列、もしくは（ｂ）第一のヌクレオチド配列の相補物
を含んで成る第二のヌクレオチド配列、より成る群から選択されるヌクレオチド
配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチドに関する。

【００６６】 好ましくは、第一のヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１
、１３、１５、１７、１９および２１より成る群から選択される核酸配列を含ん
で成る。本発明のとりわけ好ましいポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、
１０、１２、１４、１６、１８、２０もしくは２２のアミノ酸配列を有する。

【００６７】 本発明は、数種のＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼの最低一部分をコー
ドする核酸フラグメントを提供する。これらの核酸は、単離され、かつ、当業者
に公知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するヌクレオチドおよびタンパク質配列
を含有する公的データベースとの植物のｃＤＮＡ配列の比較により同定されてい
る。

【００６８】 本発明の核酸フラグメントを使用して、同一もしくは他の植物種からの相同な
タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離することができる。配列に
依存するプロトコルを使用する相同な遺伝子の単離は当該技術分野で公知である
。配列に依存するプロトコルの例は、限定されるものでないが、核酸ハイブリダ
イゼーションの方法、ならびに核酸増幅技術の多様な用途により例示されるよう
なＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ
連鎖反応）を挙げることができる。

【００６９】 例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのいずれかとしてＡＭＰもしくはアデ
ノシンデアミナーゼをコードする遺伝子は、当業者に公知の方法論を使用して、
いずれかの所望の植物からのライブラリーをスクリーニングするためのＤＮＡハ
イブリダイゼーションプローブとして本核酸フラグメントの全部もしくは一部分
を使用することにより、直接単離することができた。本核酸配列に基づく特異的
オリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野で既知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）により設計かつ合成することができる。さらに、配列全体を使用して、ランダ
ムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、末端標識技術のような当
業者に既知の方法によりＤＮＡプローブを、もしくは利用可能なインビトロ転写
系を使用してＲＮＡプローブを直接合成することができる。加えて、特異的プラ
イマーを設計かつ使用して、本配列の一部もしくは全部を増幅することができる
。生じる増幅産物は、増幅反応の間に直接標識することができるか、もしくは増
幅反応後に標識することができ、そして適切なストリンジェンシーの条件下で完
全長のｃＤＮＡもしくはゲノムフラグメントを単離するためのプローブとして使
用することができる。

【００７０】 加えて、本核酸フラグメントの２個の短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応
のプロトコルで使用して、ＤＮＡもしくはＲＮＡからの相同な遺伝子をコードす
るより長い核酸フラグメントを増幅することができる。例えば、一方のプライマ
ーは現在開示されるポリヌクレオチド分子の配列に基づくことができ、他方のプ
ライマーは、増幅で使用される鋳型に依存してポリＡもしくはベクター上の配列
に基づくことができる。

【００７１】 とりわけ、クローン化された核酸フラグメントのライブラリーでＰＣＲを実施
することができ、ここで、一方のプライマーの配列は本核酸フラグメント由来で
あり、そして他方のプライマーの配列は植物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体
の３’端のポリアデニル酸区域（ｔｒａｃｔ）の存在を利用する。あるいは、第
二のプライマー配列は、クローニングベクター由来の配列に基づくことができる
。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら（１９８８）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８−９００２）に従
って、ＰＣＲを使用して転写物中の単一の点と３’もしくは５’端との間の領域
のコピーを増幅することによりｃＤＮＡを生成させることができる。３’および
５’の方向に向けられたプライマーを本配列から設計することができる。商業的
に入手可能な３’ＲＡＣＥもしくは５’ＲＡＣＥ系（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲ
Ｌ）を使用して、特異的な３’もしくは５’ｃＤＮＡフラグメントを単離するこ
とができる（Ｏｈａｒａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：５６７３−５６７７；Ｌｏｈら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４３：２１７−２２０）。３’および５’ＲＡＣＥ手順により生成された産物
を組み合わせて完全長のｃＤＮＡを生成させることができる（Ｆｒｏｈｍａｎと
Ｍａｒｔｉｎ（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １：１６５）。結果として、
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１より成
る群から選択されるヌクレオチド配列、もしくはこうしたヌクレオチド配列の相
補物由来の３０の連続するヌクレオチドの最低１種（好ましくは最低４０の１種
、最も好ましくは最低６０の１種）のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレ
オチドを、ポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な一部分をコードする核酸フラ
グメントを得るためのこうした方法で使用することができる。

【００７２】 本発明は：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９およ
び２１より成る群から選択されるヌクレオチド配列、もしくはこうしたヌクレオ
チド配列の相補物由来の最低３０の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列（
好ましくは最低４０のもの、最も好ましくは最低６０のもの）を含んで成る第一
のオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；適する第二のオリゴヌクレオ
チドプライマーを合成すること、ならびに該オリゴヌクレオチドプライマーを使
用して核酸フラグメント（好ましくはクローニングベクター中に挿入されたｃＤ
ＮＡ）を増幅すること、の段階を含んで成る、植物のＡＭＰもしくはアデノシン
デアミナーゼの実質的な一部分をコードする核酸フラグメントを得る方法にさら
に関する。増幅された核酸フラグメントは、好ましくはＡＭＰもしくはアデノシ
ンデアミナーゼの実質的な一部分をコードすることができる。

【００７３】 本ヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列の利用可能性は、ｃＤＮＡ発現
ライブラリーの免疫学的スクリーニングを助長する。本アミノ酸配列の部分の全
体を表す合成ペプチドを合成する。これらのペプチドを使用して動物を免疫化し
て、該合成ペプチドのアミノ酸配列を含んで成るペプチドもしくはタンパク質に
対する特異性をもつポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生させる。
その後、これらの抗体を使用してｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし
て、目的の完全長のｃＤＮＡクローンを単離することができる（Ｌｅｒｎｅｒ（
１９８４）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１−３４；Ｍａｎｉａｔｉｓ）。

【００７４】 別の態様において、本発明は、本発明のキメラ遺伝子もしくは本発明の単離さ
れたポリヌクレオチドのいずれかを含んで成るウイルスおよび宿主細胞に関する
。本発明を実施するのに使用することができる宿主細胞の例は、限定されるもの
でないが、酵母細胞、細菌細胞および植物細胞を挙げることができる。適するウ
イルスの例は（書かれた記述の一覧を必要とする）を包含する。

【００７５】 上に示されたとおり、本発明の核酸フラグメントは、開示されたポリペプチド
が過剰発現されるかもしくはそれらの発現が抑制されるトランスジェニック植物
を創製するのに使用することができる。これは、それらの細胞中での花の（ｆｌ
ｏｒａｌ）遺伝子発現のレベルおよび／もしくはこれらのポリヌクレオチドを含
んで成るトランスジェニック植物の花の発生を変えるとみられる。

【００７６】 本発明のタンパク質の過剰発現は、コーディング領域が所望の発生段階で所望
の組織中での遺伝子発現を指図することが可能なプロモーターに操作可能に連結
されるキメラ遺伝子を最初に構築することにより達成することができる。該キメ
ラ遺伝子は、同一の遺伝子由来のプロモーター配列および翻訳リーダー配列、な
らびに転写終止シグナルをコードする３’非コーディング配列を含むことができ
る。本キメラ遺伝子は、遺伝子発現を助長するため、１個もしくはそれ以上のイ
ントロンもまた含むことができる。

【００７７】 本単離されたポリヌクレオチド（もしくはキメラ遺伝子）を含んで成るプラス
ミドベクターを構築することができる。当業者は、プラスミドベクターの選択が
、タンパク質発現のためのベクターの場合は遺伝子の過剰発現もしくは抑制、該
ベクターがどの型の宿主細胞中で繁殖されるか、および宿主植物を形質転換する
のに使用することができる方法のような、多くの因子に依存することを容易に認
識している。

【００７８】 当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換、選択かつ繁
殖させるためにプラスミドベクターに存在しなくてはならない要素を十分に知っ
ている。

【００７９】 当業者は、異なる形質転換事象が発現の異なるレベルおよびパターンをもたら
すことができること（Ｊｏｎｅｓら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−
２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ２１８：７８−８６）、ならびに、所望の発現レベルおよびパターンを表
す系統を得るために複数の形質転換事象をスクリーニングしなくてはならないか
もしれないこともまた認識している。こうしたスクリーニングは、ＤＮＡのサザ
ン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析、もし
くは表現型分析により達成することができる。

【００８０】 本ポリペプチドを多様な細胞区画に向けること、もしくは細胞からのそれらの
分泌を助長することが有用であることができる。従って、本発明のキメラ遺伝子
に、既に存在するターゲッティング配列を除去することを伴いもしくは伴わずに
、運搬（ｔｒａｎｓｉｔ）配列（Ｋｅｅｇｓｔｒａ（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６
：２４７−２５３）、シグナル配列もしくは小胞体局在化をコードする配列（Ｃ
ｈｒｉｓｐｅｅｌｓ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３）、または核局在化シグナル（Ｒ
ａｉｋｈｅｌ（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２
）のような適切な細胞内ターゲッティング配列をさらに補充することができる。
引用される参考文献はこれらのそれぞれの例を与える一方、該一覧は網羅的でな
く、そして使用すべきより多くのターゲッティングシグナルが将来発見されるか
もしれない。

【００８１】 アンチセンス抑制の共抑制を介して植物中の本ポリペプチドをコードする遺伝
子の発現を低下もしくは除外することもまた望ましいことができる。センスの向
きもしくはアンチセンスの向きのいずれかで同じ読み枠で目的のポリペプチドを
コードする遺伝子もしくは遺伝子フラグメントを、適する植物プロモーター配列
に連結することにより、キメラ遺伝子を構築することができる。該キメラ遺伝子
は、形質転換を介して植物に導入することができ、ここで、対応する内在性遺伝
子の発現が低下もしくは除外される。

【００８２】 変えられた遺伝子発現をもつ植物の生成への分子遺伝学的解決策は、より伝統
的な植物育種のアプローチを上回る決定的な利点を有する。植物の表現型の変化
は、アンチセンス阻害もしくは共抑制により１種もしくはそれ以上の遺伝子の発
現を特異的に阻害することにより生じさせることができる（米国特許第５，１９
０，９３１号、同第５，１０７，０６５号および同第５，２８３，３２３号明細
書）。アンチセンスもしくは共抑制構築物は、最もありそうには遺伝子の活性の
優性ネガティブの調節物質として作用するとみられる。慣習的な突然変異は遺伝
子活性のネガティブの調節を生じる可能性がある一方、これらの影響はもっとも
ありそうには劣性である。トランスジェニックのアプローチで利用可能な優性ネ
ガティブの調節は、植物育種の見地から有利であることができる。加えて、組織
特異的プロモーターを使用しての、特定の植物組織に特定の表現型の発現を限定
する能力は、突然変異体の遺伝子が普通に発現される全組織中で影響を有するこ
とができる慣習的突然変異に関して、作物学上の利点を賦与することができる。

【００８３】 当業者は、特定の遺伝子の発現を低下させるために、特別の考慮がアンチセン
スもしくは共抑制の技術の使用と関連していることを知っているであろう。例え
ば、センスもしくはアンチセンス遺伝子の適正な発現レベルは、当業者に既知の
適切な調節要素を利用する多様なキメラ遺伝子の使用を必要とすることができる
。トランスジェニック植物が得られれば、所望の表現型を最も効果的に表すもの
について、個々のトランスジェニック植物をスクリーニングすることが必要とな
ることができる。適切なスクリーニング法は一般に実務の状況で選ぶことができ
、そして当業者の熟練内にある。例えば、抑制されている遺伝子によりコードさ
れるタンパク質に特異的な抗体を使用することにより遺伝子発現の変化を探すこ
とにより、もしくは関連した酵素活性をアッセイすることにより、スクリーニン
グすることができる。好ましい一方法は、多数のサンプルが迅速に処理されるこ
とを可能にする。

【００８４】 別の態様において、本発明は、配列番号２、４、６、８，１０、１２、１４、
１６、１８、２０および２２より成る群から選択されるポリペプチドに比較され
る場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ整列方法に基づき、最低８５％の同一性を有する最低
３５アミノ酸のポリペプチドに関する。

【００８５】 本ポリペプチド（もしくはその部分）は、異種宿主細胞、とりわけ微生物中で
産生することができ、そして当業者に公知の方法によりこれらのタンパク質に対
する抗体を製造するのに使用する。該抗体は、インシトゥもしくはインビトロで
本発明のポリペプチドを検出するのに有用である。本ポリペプチドの産生に好ま
しい異種宿主細胞は微生物宿主である。微生物の発現系、および外来タンパク質
の高レベル発現を指図する調節配列を含有する発現ベクターは、当業者に公知で
あり、そして本発明に使用することができる。その後、形質転換を介してこのキ
メラ遺伝子を適切な微生物に導入して、コードされた花の発生のタンパク質の高
レベル発現を提供することができる。細菌宿主中での本ポリペプチドの高レベル
発現のためのベクターの一例を提供する（実施例７）。

【００８６】 加えて、本ポリペプチドは、それらの酵素活性を阻害する除草剤を設計もしく
は同定するのに使用することができる。本明細書に記述される酵素の１種もしく
はそれ以上の活性の阻害は植物の成長の阻害もしくは植物の死にさえつながる可
能性があるため、これは望ましい。

【００８７】 本発明のポリヌクレオチドの全部もしくは実質的な一部分は、それらが構成す
る遺伝子を遺伝子的にかつ物理的に地図作製するためのプローブとしてもまた使
用することができ（Ｈｏｈｅｉｓｅｌら Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏ
ｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ、（１９９６
）アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）中、ｐｐ．３１９−
３４６、およびその中で引用される参考文献を参照されたい）、また、それらの
遺伝子に結びつけられる特質のマーカーとして使用することができる。こうした
情報は、所望の表現型をもつ系統を開発するために、植物育種で有用であること
ができる。

【００８８】 例えば、本核酸フラグメントは、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）マーカーとして
使用することができる。制限消化された植物ゲノムＤＮＡのサザンブロットを本
発明の核酸フラグメントでプロービングすることができる。その後、遺伝子地図
を構築するために、生じるバンド形成パターンを、ＭａｐＭａｋｅｒ（Ｌａｎｄ
ｅｒら（１９８７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １：１７４−１８１）のようなコンピュ
ータプログラムを使用する遺伝子分析にかけることができる。

【００８９】 加えて、本発明の核酸フラグメントは、定義された遺伝子交雑の親および子孫
を表す一組の別個の植物の制限エンドヌクレアーゼ処理されたゲノムＤＮＡを含
有するサザンブロットをプロービングするのに使用することができる。ＤＮＡ多
形の分離を使用して、この集団を使用して既に得られた遺伝子地図中の本核酸配
列の位置を計算する（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅ
ｎｅｔ．３２：３１４−３３１）。

【００９０】 遺伝子地図作製での使用のための植物遺伝子由来のプローブの製造および使用
は、例えばＢｅｒｎａｔｚｋｙとＴａｎｋｓｌｅｙ（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ４：３７−４１に記述される。Ｆ２交雑集
団、戻し交配集団、無作為に交配された集団、近親同系系統、および他の組の個
体を地図作製に使用することができる。こうした方法論は当業者に公知である。
ＰＣＲに基づく遺伝子地図作製を使用する方法において、本核酸配列に対応する
領域中の地図作製交雑（ｍａｐｐｉｎｇ ｃｒｏｓｓ）の親の間のＤＮＡ配列の
差異を同定することが必要であることができる。しかしながら、これは地図作製
法に一般に必要でない。

【００９１】 本核酸配列由来の核酸プローブは、物理的地図作製（すなわち、物理的地図上
の配列の配置；Ｈｏｈｅｉｓｅｌら Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ、アカデミック
プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９９６中、ｐｐ．３１９−３４６、
およびその中で引用される参考文献を参照されたい）にもまた使用することがで
きる。

【００９２】 別の態様において、本核酸配列由来の核酸プローブは、直接蛍光インシトゥハ
イブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）地図作製（Ｔｒａｓｋ（１９９１）Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：１４９−１５４）で使用することができる。ＦＩＳＨ地
図作製の現在の方法は大きなクローンの使用を好む（数ないし数百ＫＢ；Ｌａａ
ｎら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．５：１３−２０を参照されたい）とは
言え、感受性の向上はより短いプローブを使用するＦＩＳＨ地図作製の実施を可
能にすることができる。

【００９３】 遺伝子および物理的地図作製の多様な核酸増幅に基づく方法を、本核酸配列を
使用して実施することができる。例は、対立遺伝子特異的増幅（Ｋａｚａｚｉａ
ｎ（１９８９）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１：９５−９６）、ＰＣＲ増
幅されたフラグメントの多形（ＣＡＰＳ；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら（１９９３）Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ １６：３２５−３３２）、対立遺伝子特異的ライゲーション（
Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８
０）、ヌクレオチド伸長反応（Ｓｏｋｏｌｏｖ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓ．１８：３６７１）、放射ハイブリッド地図作製（Ｗａｌｔｅｒ
ら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：２２−２８）およびハッピーマッピン
グ（Ｈａｐｐｙ Ｍａｐｐｉｎｇ）（ＤｅａｒとＣｏｏｋ（１９８９）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：６７９５−６８０７）を包含する。

【００９４】 これらの方法には、核酸フラグメントの配列を使用して、増幅反応もしくはプ
ライマー伸長反応での使用のためのプライマー対を設計かつ製造する。こうした
プライマーの設計は当業者に公知である。

【００９５】 標的を定められた遺伝子崩壊プロトコル、もしくは全部の可能な遺伝子中に突
然変異を担持する植物集団に含有されるこれらの遺伝子に特異的な突然変異体を
同定することのいずれかにより、本ｃＤＮＡクローンについて機能喪失突然変異
体の表現型を同定することができる（ＢａｌｌｉｎｇｅｒとＢｅｎｚｅｒ（１９
８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：９４０２−９４
０６；Ｋｏｅｓら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ
９２：８１４９−８１５３；Ｂｅｎｓｅｎら（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ
ｌ ７：７５−８４）。後者のアプローチは２方法で達成することができる。第
一に、突然変異誘発トランスポゾンもしくはいくつかの他の突然変異を引き起こ
すＤＮＡ要素が導入された植物の集団から調製されたＤＮＡでの突然変異標識配
列プライマーとともに、本核酸フラグメントの短いセグメントを、ポリメラーゼ
連鎖反応プロトコルで使用することができる（Ｂｅｎｓｅｎ、上記を参照された
い）。これらのプライマーでの特異的ＤＮＡフラグメントの増幅は、本ポリペプ
チドをコードする植物遺伝子中もしくはその近くでの突然変異標識要素の挿入を
示す。あるいは、本核酸フラグメントは、制限酵素部位に固定された合成アダプ
ターのもののような自由裁量のゲノム部位プライマーとともに突然変異標識配列
プライマーを使用して突然変異集団から生成されたＰＣＲ増幅産物に対するハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用することができる。いずれの方法でも、
本ポリペプチドをコードする内在性遺伝子中に突然変異を含有する植物を同定し
かつ得ることができる。その後、この突然変異体の植物を使用して、本明細書で
開示される本ポリペプチドの本来の機能を決定もしくは確認することができる。
実施例 本発明は以下の実施例においてさらに定義され、ここで、別の方法で述べられ
ない限り、部分およびパーセンテージは重量でありかつ度は摂氏である。これら
の例は、本発明の好ましい態様を示す一方、具体的説明のみとして示されること
が理解されるべきである。上の論考およびこれらの実施例から、当業者は本発明
の本質的な特徴を確かめることができ、そして、その技術思想および範囲から離
れることなく、それを多様な使用および条件に適合させるように本発明の多様な
変更および改変を行うことができる。従って、本明細書に示されかつ記述される
ものに加えての本発明の多様な改変は、前述の記述から当業者に明らかであろう
。こうした改変もまた付属として付けられる請求の範囲の範囲内にあることを意
図している。

【００９６】 本明細書に示される各参考文献の開示は、そっくりそのまま引用により本明細
書に組み込まれる。 実施例１ ｃＤＮＡライブラリーの組成；ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定 多様なトウモロコシ、コメ、ダイズおよびコムギ組織からのｍＲＮＡを表すｃ
ＤＮＡライブラリーを調製した。該ライブラリーの特徴を下述する。

【００９７】

【表２】

【００９８】 ｃＤＮＡライブラリーは利用可能な多くの方法のいずれか１つにより調製する
ことができる。例えば、ｃＤＮＡは、最初に、製造元のプロトコル（ストラタジ
ーン クローニング システムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州ラホヤ）に従ってユニ−ザップ［Ｕｎｉ−Ｚ
ＡＰ］（商標）ＸＲベクター中でｃＤＮＡライブラリーを調製することにより、
プラスミドベクターに導入することができる。ユニ−ザップ［Ｕｎｉ−ＺＡＰ］
（商標）ＸＲライブラリーを、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により
提供されるプロトコルに従ってプラスミドライブラリーに転化する。転化に際し
て、ｃＤＮＡ挿入物はプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に含有され
ることができる。加えて、ｃＤＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー イング
ランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））を使用し
て、予め切断されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクター（ストラ
タジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に直接導入することができ、次いで製造元
のプロトコル（ギブコ ＢＲＬ プロダクツ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ））に従ってＤＨ１０Ｂ細胞にトランスフェクションすることができる。
ｃＤＮＡ挿入物がプラスミドベクター中にあれば、組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔプラスミドを含有する無作為に拾われた細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを
調製するか、もしくは、挿入されたｃＤＮＡ配列に隣接するベクター配列に特異
的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を介して挿入物ｃＤＮＡ配列を
増幅する。増幅された挿入物ＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡを、色素プライマ
ー（ｄｙｅ−ｐｒｉｍｅｒ）配列決定反応で配列決定して部分的ｃＤＮＡ配列（
発現される配列標識もしくは「ＥＳＴ」；Ａｄａｍｓら、（１９９１）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２５２：１６５１−１６５６を参照されたい）を生成させる。生じるＥ
ＳＴを、パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）モデル３７７蛍光シ
ークェンサーを使用して分析する。

【００９９】 完全な挿入物配列（ＦＩＳ）データを、改変された転位プロトコルを利用して
生成させる。ＦＩＳについて同定されたクローンを、保管されたグリセロールス
トックから単一コロニーとして回収し、そして、アルカリ溶解を介してプラスミ
ドＤＮＡを単離する。単離されたＤＮＡ鋳型を、ＰＣＲに基づく配列決定反応で
Ｍ１３順および逆オリゴヌクレオチドでプライミングされたベクターと反応させ
、そして自動化シークェンサーに負荷する。ＦＩＳの要求がなされる元のＥＳＴ
配列との配列の整列により、クローンの同定の確認を実施する。

【０１００】 確認された鋳型は、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）Ｔｙ１転位可能要素（ＤｅｖｉｎｅとＢｏｅｋｅ（１９９４）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：３７６５−３７７２）に基づくプライ
マー アイランド（Ｐｒｉｍｅｒ Ｉｓｌａｎｄ）転位キット（ＰＥ アプライ
ド バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリ
フォルニア州フォスターシティ）を介して転位させる。インビトロ転位系は、大
きなＤＮＡ分子の集団全体に無作為に唯一の結合部位を配置する。その後、転位
されたＤＮＡを使用して、電気穿孔法を介してＤＨ１０Ｂ電気コンピテント（ｅ
ｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（ギブコ ＢＲＬ／ライフ テクノロ
ジーズ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリー
ランド州ロックビル）を形質転換する。転位可能要素は、組込まれたトランスポ
ゾンを含有するサブクローンのみのアガープレート上での二重の選択を見込む、
付加的な選択可能なマーカー（ＤＨＦＲと命名される；ＦｌｉｎｇとＲｉｃｈａ
ｒｄｓ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：５１４７−５
１５８）を含有する。各転位反応から複数のサブクローンを無作為に選択し、ア
ルカリ溶解を介してプラスミドＤＮＡを調製し、そして、トランスポゾン内の結
合部位に特異的な独特のプライマーを利用して、転位事象部位から外へ鋳型を配
列決定する（ＡＢＩ プリズム ダイ−ターミネーター レディリアクション（
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉ
ｏｎ）混合物）。

【０１０１】 配列データを収集し（ＡＢＩ プリズム コレクションズ（ＡＢＩ Ｐｒｉｓ
ｍ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ））、そしてＰｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ（Ｐ．Ｇｒｅ
ｅｎ、シアトル、ワシントン大学）を使用して集成する。Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａ
ｐは、ＡＢＩ配列データを再読み込み、塩基を再呼び出し、質値（ｑｕａｌｉｔ
ｙ ｖａｌｕｅ）を割り当て、そして塩基のコールおよび質値を編集可能な出力
ファイルに書く、公的ドメインソフトウェアプログラムである。Ｐｈｒａｐ配列
集成プログラムは、これらの質値を使用して、集成された配列のコンティグの正
確さを増大させる。アセンブリはＣｏｎｓｅｄ配列エディタ（Ｄ．Ｇｏｒｄｏｎ
、シアトル、ワシントン大学）により見られる。 実施例２ ｃＤＮＡクローンの同定 ＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼをコードするｃＤＮＡクローンを、Ｂ
ＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全部の非冗長ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）
ＣＤＳ翻訳、三次元構造のブルックヘイヴン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク
質データバンク由来の配列、スイス−プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパ
ク質配列データベースの最近の主要な発表、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベ
ースを含んで成る）中に含有される配列への類似性についてのＢＬＡＳＴ（基本
的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａ
ｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も
また参照されたい）検索を実施することにより同定した。実施例１で得られたｃ
ＤＮＡ配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（
ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して「ｎｒ」デー
タベース中に含有される全部の公的に利用可能なＤＮＡ配列への類似性について
分析した。ＤＮＡ配列を全部の読み枠で翻訳し、そしてＮＣＢＩにより提供され
るＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ＧｉｓｈとＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔ．Ｇ
ｅｎｅｔ．３：２６６−２７２）を使用して「ｎｒ」データベースに含有される
全部の公的に利用可能なタンパク質配列への類似性について比較した。便宜上、
ＢＬＡＳＴにより計算されるような、単に偶然によってのみ検索されたデータベ
ース中に含有される配列とのｃＤＮＡ配列の合致を観察することのＰ値（確率）
を本明細書で「ｐＬｏｇ」値として報告し、これは報告されるＰ値の対数の負数
を表す。従って、ｐＬｏｇ値が大きくなるほど、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴ
の「ヒット」が相同なタンパク質を表す見込みが大きくなる。

【０１０２】 分析に提出されたＥＳＴを上述されたようなジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）
データベースと比較する。より多くの５もしくは３’配列を含有するＥＳＴは、
配列の相同性の共通のもしくは重なり合う領域を共有するヌクレオチド配列を比
較するデュポン（Ｄｕ Ｐｏｎｔ）の専有のデータベースに対してＢＬＡＳＴｎ
アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２。）を使用することにより見出すことができ
る。２種もしくはそれ以上の核酸フラグメントの間に共通のもしくは重なり合う
配列が存在する場合、該配列は単一の連続するヌクレオチド配列に集成すること
ができ、従って元のフラグメントを５もしくは３’のいずれかの方向に伸長する
。大部分の５’のＥＳＴが同定されれば、その完全な配列は実施例１に記述され
たような完全な挿入物の配列決定（Ｆｕｌｌ Ｉｎｓｅｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ）により決定することができる。ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを使用してＥ
ＳＴデータベースに対して既知の遺伝子（専有の供給源もしくは公的データベー
スのいずれかから）のアミノ酸配列を比較することにより、異なる種に属する相
同な遺伝子を見出すことができる。ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムは、全６種の読
み枠で翻訳されるヌクレオチドデータベースに対してアミノ酸のクエリを検索す
る。この検索は、異なる種の間のヌクレオチドのコドン使用頻度の差異およびコ
ドンの縮重を見込む。 実施例３ ＡＭＰデアミナーゼをコードするｃＤＮＡクローンの特徴づけ 表３に列挙されるクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、
ヒト［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］（ＮＣＢＩ一般同定番号ｇｉ６４４５０９）
および酵母［ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）］（ＮＣＢＩ一般同定番号ｇｉ３５１９１６）からのＡＭＰデアミナーゼへ
の、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの類似性を示した。個々のＥＳ
ＴについてのＢＬＡＳＴの結果（「ＥＳＴ」）、示されたｃＤＮＡクローンを含
んで成るｃＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）、２種もしくはそれ以上のＥ
ＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ」）、ＦＩＳおよび１種
もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ*
」）、またはＦＩＳ、コンティグもしくはＦＩＳおよびＰＣＲ由来のタンパク質
全体をコードする配列（「ＣＧＳ」）を表３に示す。

【０１０３】

【表３】

【０１０４】 表３に列挙されるクローン中のｃＤＮＡ挿入物全体の配列を決定した。表４に
列挙されたクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、アラビド
プシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）［シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｔｈａｌｉａｎａ）］（ＮＣＢＩ一般同定番号ｇｉ ７４８４８０７）から
のＡＭＰデアミナーゼへの、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの類似
性を示した。個々のＥＳＴについてのＢＬＡＳＴの結果（「ＥＳＴ」）、示され
たｃＤＮＡクローンを含んで成るｃＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）、２
種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ
」）、ＦＩＳおよび１種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの
配列（「Ｃｏｎｔｉｇ*」）、またはＦＩＳ、コンティグ、もしくはＦＩＳおよ
びＰＣＲ由来のタンパク質全体をコードする配列（「ＣＧＳ」）を表４に示す：

【０１０５】

【表４】

【０１０６】 図２は、配列番号１４、１６、１８および２０に示されるアミノ酸配列、なら
びにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の配列（配
列番号２３）の整列を提示する。表５中のデータは、配列番号２、４、６、８、
１４、１６、１８および２０に示されるアミノ酸配列、ならびにヒト（ＮＣＢＩ
一般同定番号ｇｉ ６４４５０９）、酵母（ＮＣＢＩ一般同定番号ｇｉ ３５１
９１６）、およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
）の配列（配列番号２３）の同一性のパーセントの計算を表す。

【０１０７】

【表５】

【０１０８】 配列の整列、および同一性のパーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生物情
報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ インク（Ｄ
ＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン）のＭｅｇａｌｉｇｎ
プログラムを使用して実施した。配列の複数の整列は、デフォルトのパラメータ
（ギャップ ペナルティ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナル
ティ（ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いるＣｌｕｓｔａ
ｌ整列方法（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５
１−１５３）を使用して実施した。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用する対にした整列の
ためのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ １、ギャップ ペナルティ＝
３、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズ セイブド（ＤＩＡ
ＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５であった。配列の整列、ならびにＢＬＡＳＴス
コアおよび確率は、本ｃＤＮＡクローンを含んで成る核酸フラグメントがＡＭＰ
デアミナーゼの実質的な一部分をコードすることを示す。これらの配列は、発明
者に既知のＡＭＰデアミナーゼをコードする最初のトウモロコシ、コメ、ダイズ
およびコムギの配列を表す。 実施例４ アデノシンデアミナーゼをコードするｃＮＤＡクローンの特徴づけ 表６に列挙されるクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、
アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）［シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）］（ＮＣＢＩ一般同定番号ｇｉ ４１１５９４
９）および酵母（ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ））（ＮＣＢＩ一般同定番号ｇｉ １７０３１６６）からのアデノシンデ
アミナーゼへの、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの類似性を示した
。個々のＥＳＴについてのＢＬＡＳＴの結果（「ＥＳＴ」）、示されたｃＤＮＡ
クローンを含んで成るｃＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）、２種もしくは
それ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ」）、ＦＩ
Ｓおよび１種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの配列（「Ｃ
ｏｎｔｉｇ*」）、またはＦＩＳ、コンティグ、もしくはＦＩＳおよびＰＣＲ由
来のタンパク質全体をコードする配列（「ＣＧＳ」）を表６に示す：

【０１０９】

【表６】

【０１１０】 表６に列挙されるクローン中のｃＤＮＡ挿入物全体の配列を決定した。表７に
列挙されたダイズクローンからのＣＧＳ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＮＣＢＩ一般同定番号ｇｉ ２５
０６３４２）からのアデノシンデアミナーゼへの、該ｃＤＮＡによりコードされ
るポリペプチドの類似性を示した。個々のＥＳＴについてのＢＬＡＳＴの結果（
「ＥＳＴ」）、示されたｃＤＮＡクローンを含んで成るｃＤＮＡ挿入物全体の配
列（「ＦＩＳ」）、２種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたコンティグの
配列（「Ｃｏｎｔｉｇ」）、ＦＩＳおよび１種もしくはそれ以上のＥＳＴから集
成されたコンティグの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ*」）、またはＦＩＳ、コンティグ
、もしくはＦＩＳおよびＰＣＲ由来のタンパク質全体をコードする配列（「ＣＧ
Ｓ」）を表７に示す：

【０１１１】

【表７】

【０１１２】 図３は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の配列（配列番号２４）の整列を提示する。表８中のデ
ータは、配列番号１０、１２および２２に示されるアミノ酸配列、ならびにアラ
ビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ＮＣＢＩ一般同定番号ｇｉ ４１１
５９４９）、酵母（ＮＣＢＩ一般同定番号ｇｉ １７０３１６６）、および大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の配列（配列番号２４）の同一性のパ
ーセントの計算を表す。

【０１１３】

【表８】

【０１１４】 配列の整列、および同一性のパーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生物情
報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ インク（Ｄ
ＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン）のＭｅｇａｌｉｇｎ
プログラムを使用して実施した。配列の複数の整列は、デフォルトのパラメータ
（ギャップ ペナルティ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナル
ティ（ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いるＣｌｕｓｔａ
ｌ整列方法（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５
１−１５３）を使用して実施した。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用する対にした整列の
ためのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ １、ギャップ ペナルティ＝
３、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズ セイブド（ＤＩＡ
ＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５であった。配列の整列、ならびにＢＬＡＳＴス
コアおよび確率は、本ｃＤＮＡクローンを含んで成る核酸フラグメントがアデノ
シンデアミナーゼの実質的な一部分をコードすることを示す。これらの配列は、
発明者に既知のアデノシンデアミナーゼをコードする最初のダイズの配列を表す
。 実施例５ 単子葉細胞中でのキメラ遺伝子の発現 本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡフラグメントの５’に配置されるトウモ
ロコシの２７ｋＤゼインプロモーター、および該ｃＤＮＡフラグメントの３’に
配置される１０ｋＤのゼインの３’端に関してセンスの向きで該ｃＤＮＡを含ん
で成るキメラ遺伝子を構築することができる。この遺伝子のｃＤＮＡフラグメン
トは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するｃＤＮＡクローンのポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成させることができる。クローニング部位
（ＮｃｏＩもしくはＳｍａＩ）を該オリゴヌクレオチド中に組込み、下述される
ような消化されたベクターｐＭＬ１０３に挿入される場合に該ＤＮＡフラグメン
トの適正な向きを提供することができる。その後、標準的ＰＣＲで増幅を実施す
る。その後、増幅されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｍａＩで消化し、そ
してアガロースゲル上で分画する。適切なバンドをゲルから単離し、そしてプラ
スミドｐＭＬ１０３の４．９ｋｂのＮｃｏＩ−ＳｍａＩフラグメントと結合させ
ることができる。プラスミドｐＭＬ１０３は、ブダペスト条約の約定のもとにＡ
ＴＣＣ（アメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９）に寄
託され、そして受託番号ＡＴＣＣ ９７３６６をもつ。ｐＭＬ１０３からのＤＮ
Ａセグメントは、ベクターｐＧｅｍ９Ｚｆ（＋）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
）中に、トウモロコシの２７ｋＤのゼイン遺伝子の１．０５ｋｂのＳａｌＩ−Ｎ
ｃｏＩプロモーターフラグメント、およびトウモロコシの１０ｋＤのゼイン遺伝
子の３’端からの０．９６ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｌＩフラグメントを含有する。
ベクターおよび挿入物ＤＮＡは、本質的に記述されたとおり（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）に１５℃で一夜連結することができる。その後、連結されたＤＮＡを使用して
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（エピキュリアン コライ ＸＬ−１
ブルー［Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ］（商標）；ス
トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を形質転換することができる。プラス
ミドＤＮＡの制限酵素消化、およびチェーンターミネーター法（シークェナーゼ
［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）ＤＮＡ配列決定キット；Ｕ．Ｓ．バイオケミカ
ル（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））を使用する限定されたヌクレオチド配
列分析により、細菌の形質転換体をスクリーニングすることができる。生じるプ
ラスミド構築物は、５’から３’の向きに、トウモロコシの２７ｋＤのゼインプ
ロモーター、本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡフラグメント、および１０ｋ
Ｄのゼインの３’領域をコードするキメラ遺伝子を含むことができる。

【０１１５】 その後、上述されたキメラ遺伝子を、以下の手順によりトウモロコシ細胞に導
入することができる。近親交配トウモロコシ系統Ｈ９９およびＬＨ１３２の交雑
由来の発生する穎果から、未熟なトウモロコシ胚を切開することができる。受粉
後１０ないし１１日に、胚が１．０ないし１．５ｍｍ長である場合に、それらを
単離する。その後、胚を、軸側を下に向けかつアガロースで固化されたＮ６培地
（Ｃｈｕら（１９７５）Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．Ｐｅｋｉｎｇ １８：６５９−６６８
）と接触させて置く。胚は２７℃で暗所に保存する。胚柄構造上に運ばれる体性
の（ｓｏｍａｔｉｃ）前胚様体および胚様体をもつ細胞の未分化の塊より成る砕
けやすい胚形成性カルスが、これらの未熟な胚の胚盤から増殖する。一次外植体
から単離された胚形成性カルスを、Ｎ６培地上で培養することができ、そしてこ
の培地上で２ないし３週間ごとに継代培養することができる。

【０１１６】 選択可能なマーカーを提供するために、形質転換実験でプラスミドｐ３５Ｓ／
Ａｃ（Ｐｅｔｅｒ Ｅｃｋｅｓ博士、ヘキスト株式会社（Ｈｏｅｃｈｓｔ ＡＧ
）、独国フランクフルトから得られた）を使用することができる。このプラスミ
ドは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードする
Ｐａｔ遺伝子（欧州特許公開第０ ２４２ ２３６号明細書を参照されたい）を
含有する。酵素ＰＡＴは、ホスフィノトリシンのような除草性のグルタミン合成
酵素阻害剤に対する耐性を賦与する。ｐ３５Ｓ／Ａｃ中のｐａｔ遺伝子はカリフ
ラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）
Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）およびアグロバクテリウム ツメファ
シエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラ
スミドのＴ−ＤＮＡからのノパリン合成酵素遺伝子の３’領域の制御下にある。

【０１１７】 粒子砲撃法（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３）
を使用してカルス培養細胞に遺伝子を移入することができる。この方法によれば
、金粒子（直径１μｍ）を、以下の技術を使用してＤＮＡで被覆する。１０μｇ
のプラスミドＤＮＡを金粒子の懸濁液（１ｍＬあたり６０ｍｇ）５０μＬに添加
する。塩化カルシウム（２．５Ｍ溶液５０μＬ）およびスペルミジンを含まない
塩基（１．０Ｍ溶液２０μＬ）を粒子に添加する。該懸濁液は、これらの溶液の
添加の間、ボルテックス攪拌する。１０分後にチューブを短く遠心分離（１５，
０００ｒｐｍで５秒）し、そして上清を除去する。粒子を２００μＬの無水エタ
ノールに再懸濁し、再度遠心分離し、そして上清を除去する。エタノールすすぎ
を再度実施し、そして粒子を３０μＬの最終容積のエタノールに再懸濁する。Ｄ
ＮＡ被覆された金粒子のアリコート（５μＬ）をカプトン［Ｋａｐｔｏｎ］（商
標）飛行円板（ｆｌｙｉｎｇ ｄｉｓｃ）（バイオ−ラッド ラブス（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ Ｌａｂｓ））の中央に置くことができる。その後、１０００ｐｓｉのヘ
リウム圧、０．５ｃｍのギャップ距離および１．０ｃｍの飛行距離を使用して、
バイオリスティック［Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ］（商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（
バイオ−ラッド インストゥルメンツ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、粒子をトウモロコシ組織中
に加速する。

【０１１８】 砲撃のためには、アガロースで固化されたＮ６培地上の濾紙上に胚形成性組織
を置く。組織を薄い芝生のように配置し、そして直径約５ｃｍの円形の領域を覆
う。組織を含有するペトリ皿を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅのチャンバー中で停止
スクリーンからおよそ８ｃｍに置くことができる。その後、チャンバー中の空気
を２８インチのＨｇの真空まで排気する。衝撃チューブ中のＨｅ圧が１０００ｐ
ｓｉに到達する場合に破裂する破裂膜を使用して、ヘリウム衝撃波を用いてマク
ロキャリアーを加速する。

【０１１９】 砲撃の７日後に、グルホシネート（１リットルあたり２ｍｇ）を含有しかつカ
ゼインもしくはプロリンを欠くＮ６培地に組織を移すことができる。組織はこの
培地上でゆっくりと成長することを継続する。追加の２週間後、グルホシネート
を含有する新鮮なＮ６培地に組織を移すことができる。６週間後、活発に成長す
るカルスの直径約１ｃｍの領域を、グルホシネートを補充された培地を含有する
プレートのいくつかで同定することができる。これらのカルスは、選択培地上で
継代培養される場合に成長することを継続することができる。

【０１２０】 １リットルあたり０．２ｍｇの２，４−Ｄを補充されたＮ６培地に組織のクラ
スターを最初に移すことにより、トランスジェニックカルスから植物を再生する
ことができる。２週間後に、組織を再生培地（Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９）に移すことができる。 実施例６ 双子葉細胞中でのキメラ遺伝子の発現 マメ、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）からの種子貯
蔵タンパク質、ファセオリンのβサブユニットをコードする遺伝子からのプロモ
ーターおよび転写ターミネーターより構成される種子特異的発現カセット（Ｄｏ
ｙｌｅら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８）
を、形質転換されたダイズ中での本ポリペプチドの発現に使用することができる
。該ファセオリンカセットは、ファセオリンの翻訳開始コドンから上流（５’）
の約５００ヌクレオチド、および翻訳終止コドンから下流（３’）の約１６５０
ヌクレオチドを包含する。該５’と３’領域の間に、唯一の制限エンドヌクレア
ーゼ部位、Ｎｃｏ Ｉ（ＡＴＧ翻訳開始コドンを包含する）、Ｓｍａ Ｉ、Ｋｐ
ｎ ＩおよびＸｂａ Ｉがある。カセット全体はＨｉｎｄ ＩＩＩ部位により隣
接される。

【０１２１】 本遺伝子のｃＤＮＡフラグメントは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを
使用する該ｃＤＮＡクローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成させ
ることができる。発現ベクターに挿入される場合に、該ＤＮＡフラグメントの適
正な向きを提供するようにオリゴヌクレオチド中にクローニング部位を組込むこ
とができる。その後、上述されたとおり増幅を実施し、そして単離されたフラグ
メントを、種子発現カセットを担持するｐＵＣ１８ベクターに挿入する。

【０１２２】 その後、ダイズ胚を、本ポリペプチドをコードする配列を含んで成る発現ベク
ターで形質転換することができる。体性胚を誘導するために、ダイズ栽培変種Ａ
２８７２の表面滅菌された未熟な種子から切開された長さ３〜５ｍｍの子葉を、
適切なアガー培地上、２６℃で６〜１０週間、明もしくは暗中で培養することが
できる。その後、二次胚を生じさせる体性胚を摘出し、そして適する液体培地に
入れる。早期の球形の段階の胚として繁殖した体性胚のクラスターについての反
復された選択の後に、懸濁物を下述されるとおり維持する。

【０１２３】 ダイズの胚形成性懸濁培養物を、１６：８時間の昼／夜スケジュールで、蛍光
灯を用いて、回転振とう器、１５０ｒｐｍ上、２６℃で３５ｍＬの液体培地中で
維持することができる。およそ３５ｍｇの組織を３５ｍＬの液体培地に接種する
ことにより、培養物を２週間ごとに継代培養する。

【０１２４】 その後、ダイズの胚形成性懸濁培養物を、粒子銃砲撃の方法（Ｋｌｅｉｎら（
１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３、米国特許第４，
９４５，０５０号明細書）により形質転換することができる。デュポン（ＤｕＰ
ｏｎｔ）バイオリスティック［Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ］（商標）ＰＤＳ１０００／
ＨＥ機器（ヘリウム逆嵌合（ｒｅｔｒｏｆｉｔ））をこれらの形質転換に使用す
ることができる。

【０１２５】 ダイズの形質転換を助長するのに使用することができる選択可能なマーカー遺
伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ
ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）、プラスミドｐＪＲ２
２５からのヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）から；Ｇｒｉｔｚら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１７９−１８８）、お
よびアグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリン合成酵素
遺伝子の３’領域より構成されるキメラ遺伝子である。ファセオリンの５’領域
、本ポリペプチドをコードするフラグメント、およびファセオリンの３’領域を
含んで成る種子発現カセットを、制限フラグメントとして単離することができる
。その後、このフラグメントを、マーカー遺伝子を担持するベクターの唯一の制
限部位に挿入することができる。

【０１２６】 ６０ｍｇ／ｍＬの１μｍ金粒子懸濁液５０μＬに（順序よく）：５μＬのＤＮ
Ａ（１μｇ／μＬ）、２０μｌスペルミジン（０．１Ｍ）および５０μＬ Ｃａ
Ｃｌ₂（２．５Ｍ）を添加する。その後、粒子調製物を３分間攪拌し、微小遠心
器で１０秒間回転し、そして上清を除去する。その後、ＤＮＡ被覆された粒子を
４００μＬの７０％エタノールで１回洗浄し、そして４０μＬの無水エタノール
に再懸濁する。ＤＮＡ／粒子懸濁物を各１秒間３回超音波処理することができる
。その後、ＤＮＡ被覆された金粒子５μＬを各マクロキャリアー円板に負荷する
。

【０１２７】 ２週齢の懸濁培養物のおよそ３００〜４００ｍｇを空の６０×１５ｍｍペトリ
皿に入れ、そしてピペットを用いて残余の液体を組織から除去する。各形質転換
実験について、通常はおよそ５〜１０枚のプレートの組織を砲撃する。膜破裂圧
は１１００ｐｓｉに設定し、そしてチャンバーを２８インチ水銀の真空まで排気
する。組織は保持スクリーンからおよそ３．５インチ離して置き、そして３回砲
撃する。砲撃後、組織を半分に分割しかつ液体中に戻し、そして上述されたとお
り培養することができる。

【０１２８】 砲撃後５ないし７日に、液体培地を新鮮な培地で、そして砲撃後１１ないし１
２日に５０ｍｇ／ｍＬヒグロマイシンを含有する新鮮な培地で交換することがで
きる。この選択培地は毎週更新することができる。砲撃後７ないし８週間で、緑
色の形質転換された組織が、形質転換されない壊死胚形成性クラスターから成長
するのを観察することができる。孤立した緑色組織を取り出し、そして別個のフ
ラスコに接種して、新たな、クローン的に繁殖される形質転換された胚形成性懸
濁培養物を生成させる。それぞれの新たな系統は独立した形質転換事象として処
理することができる。その後、これらの懸濁物を継代培養しかつ未熟な胚のクラ
スターとして維持することができるか、もしくは個々の体性胚の成熟および発芽
により植物全体に再生することができる。 実施例７ 微生物細胞中でのキメラ遺伝子の発現 本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、Ｔ７大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベ
クターｐＢＴ４３０に挿入することができる。本ベクターは、バクテリオファー
ジＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系を使用するｐＥＴ−３ａ（Ｒ
ｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５）の誘導体で
ある。プラスミドｐＢＴ４３０は、それらの元の位置のｐＥＴ−３ａ中のＥｃｏ
Ｒ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を最初に破壊することにより構築した。Ｅｃ
ｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を含有するオリゴヌクレオチドアダプター
を、ｐＥＴ−３ａのＢａｍＨ Ｉ部位に挿入した。これは、該発現ベクター中へ
の遺伝子の挿入のための付加的な唯一のクローニング部位をもつｐＥＴ−３ａＭ
を創製した。その後、オリゴヌクレオチド特異的（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発を使用して、翻訳開始の位置のＮｄｅ
Ｉ部位をＮｃｏ Ｉ部位に転化した。この領域のｐＥＴ−３ａＭのＤＮＡ配列、
５’−ＣＡＴＡＴＧＧを、ｐＢＴ４３０中の５’−ＣＣＣＡＴＧＧに転化した。

【０１２９】 ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡは、該タンパク質をコードする核酸フラ
グメントを遊離するように適切に消化することができる。その後、このフラグメ
ントを１％低融アガロースゲル上で精製することができる。緩衝液およびアガロ
ースは、ＤＮＡフラグメントの可視化のため、１０μｇ／ｍｌの臭化エチジウム
を含有する。その後、製造元の説明書に従ったＧＥＬアーゼ［ＧＥＬａｓｅ］（
商標）（エピセンター テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）、ウィスコンシン州マディソン）での消化により、該フラグメント
をアガロースゲルから精製し、エタノール沈殿し、乾燥しかつ２０μＬの水に再
懸濁することができる。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ニュー イングランド バイオ
ラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＮＥＢ）、マサチューセ
ッツ州ビバリー）を使用して、適切なオリゴヌクレオチドアダプターを該フラグ
メントに連結することができる。連結されたアダプターを含有するフラグメント
は、上述されたような低融アガロースを使用して過剰のアダプターから精製する
ことができる。ベクターｐＢＴ４３０を消化し、アルカリホスファターゼ（ＮＥ
Ｂ）で脱リン酸化し、そして上述されたとおりフェノール／クロロホルムで除タ
ンパクする。その後、調製されたベクターｐＢＴ４３０およびフラグメントを１
６℃で１５時間連結し、次いでＤＨ５電気コンピテント細胞（ギブコ（ＧＩＢＣ
Ｏ）ＢＲＬ）に形質転換する。ＬＢ培地および１００μｇ／ｍＬアンピシリンを
含有するアガープレート上で形質転換体を選択することができる。その後、本ポ
リペプチドをコードする遺伝子を含有する形質転換体を、制限酵素分析により、
Ｔ７プロモーターに関して正しい向きについてスクリーニングする。

【０１３０】 高レベル発現のためには、Ｔ７プロモーターに関して正しい向きのｃＤＮＡ挿
入物をもつプラスミドクローンを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３
）（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１
３０）に形質転換することができる。アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有す
るＬＢ培地中、２５℃で培養物を成長させる。およそ１の６００ｎｍでの光学密
度で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導物質）を０．４ｍ
Ｍの最終濃度まで添加することができ、そしてインキュベーションを２５°で３
時間継続することができる。その後、細胞を遠心分離により収穫し、かつ、０．
１ｍＭ ＤＴＴおよび０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有するｐ
Ｈ８．０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ５０μＬに再懸濁する。少量の１ｍｍガラ
スビーズを添加することができ、そして、混合物を、マイクロプローブ超音波処
理装置を用いて各回約５秒間３回超音波処理することができる。混合物を遠心分
離し、そして上清のタンパク質濃度を測定する。培養物の可溶性画分からの１μ
ｇのタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離するこ
とができる。期待された分子量で移動するタンパク質バンドについてゲルを観察
することができる。 実施例８ プリン代謝に関与する酵素の活性を阻害するそれらの能力についての化合物の評
価 本明細書に記述されるポリペプチドは、当業者に既知のいずれかの数の方法を
使用して産生させることができる。こうした方法は、限定されるものでないが、
実施例７に記述されたような細菌中での発現、または真核生物細胞培養物中、植
物中で、および適して感染した生物体もしくは細胞系中でのウイルス発現系を使
用する発現を挙げることができる。本ポリペプチドは、インビボで観察されるよ
うな成熟形態のタンパク質、または多様な酵素、タンパク質もしくは親和性標識
への共有結合による融合タンパク質のいずれかとして発現させることができる。
普遍的な融合タンパク質パートナーは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（
「ＧＳＴ」）、チオレドキシン（「Ｔｒｘ」）、マルトース結合タンパク質、な
らびにＣおよび／もしくはＮ末端ヘキサヒスチジンポリペプチド（「（Ｈｉｓ） ₆ 」）を包含する。融合タンパク質は、融合パートナーがプロテアーゼ消化によ
り分離されて無傷の成熟タンパク質を生じることができるように、融合点にプロ
テアーゼ認識部位をもって工作することができる。こうしたプロテアーゼの例は
トロンビン、エンテロキナーゼおよび第Ｘａ因子を包含する。しかしながら、融
合タンパク質および酵素を結合するペプチドを特異的に切断するいかなるプロテ
アーゼも使用することができる。

【０１３１】 本ポリペプチドの精製は、所望の場合は、タンパク質精製の当業者に馴染みの
あるいずれかの数の分離技術を利用することができる。こうした方法の例は、限
定されるものでないが、均質化、濾過、遠心分離、熱変性、硫酸アンモニウム沈
殿、脱塩、ｐＨ沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマト
グラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー（ここで、親和性リガンド
は基質、基質類似物もしくは阻害剤を表す）を挙げることができる。本ポリペプ
チドが融合タンパク質として発現される場合、精製プロトコルは、発現された酵
素に結合された融合タンパク質標識に特異的である親和性樹脂、もしくは酵素に
特異的であるリガンドを含有する親和性樹脂の使用を包含することができる。例
えば、本ポリペプチドはチオレドキシンのＣ末端に結合された融合タンパク質と
して発現させることができる。加えて、融合されたチオレドキシン部分のＮ末端
に（Ｈｉｓ）₆ペプチドを工作して、親和性精製の付加的な機会を提供すること
ができる。他の適する親和性樹脂は、適切なリガンドをセファロース−４Ｂのよ
うないずれかの適する樹脂に連結することにより合成することができる。代替の
一態様において、チオレドキシン融合タンパク質はジチオスレイトールを使用し
て溶出することができるが；しかしながら、溶出は樹脂からチオレドキシンを置
き換えるように相互作用する他の試薬を使用して達成することができる。これら
の試薬は、β−メルカプトエタノールもしくは他の還元されたチオールを包含す
る。溶出された融合タンパク質は、所望の場合は、上に述べられたような伝統的
手段によるさらなる精製にかけることができる。チオレドキシン融合タンパク質
および酵素のタンパク質分解性の切断は、融合タンパク質が精製された後、また
は該タンパク質がチオボンド［ＴｈｉｏＢｏｎｄ］（商標）親和性樹脂もしくは
他の樹脂になお結合されている間に達成することができる。

【０１３２】 単独でもしくは融合タンパク質としてのいずれかで、粗、部分的に精製された
、もしくは精製された酵素は、本明細書に開示される本ポリペプチドの酵素の活
性化を阻害するそれらの能力についての化合物の評価のためのアッセイで利用す
ることができる。アッセイは、至適の酵素活性を可能にする公知の実験条件下で
実施することができる。例えば、ＡＭＰデアミナーゼについてのアッセイは、Ｍ
ｅｙｅｒｓら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ ２８：８７３４−８７４３により提
示される。アデノシンデアミナーゼについてのアッセイは、Ｐｅｌｃｈｅｒによ
り米国特許第５，４７４，９２９号明細書に提示される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 発明にかかる、プリンの異化作用につながる生化学的経路を描く。ＡＭＰデア
ミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼにより調節される段階を示す。

【図２】 発明にかかる、トウモロコシ、コメ、ダイズおよびコムギのＡＭＰデアミナー
ゼ（それぞれ配列番号１４、１６、１８および２０）、ならびにシロイヌナズナ
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＡＭＰデアミナーゼ（配列番
号２３［ｇｉ ７４８４８０７］）のアミノ酸配列の比較を示す。

【図３】 発明にかかる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のアデノシンデ
アミナーゼ（配列番号２４［ｇｉ ２５０６３４２］）とのダイズのアデノシン
デアミナーゼ（配列番号１２）のアミノ酸配列の比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 キヤスパー，テイモシー アメリカ合衆国デラウエア19736ウイルミ ントン・ヨークリン・バーリーミルロード 2927 (72)発明者 フアルコ，サベリオ・カール アメリカ合衆国デラウエア州19810アーデ ン・ミラーロード1902 (72)発明者 サカイ，ハジメ アメリカ合衆国デラウエア州19803ウイル ミントン・バンベリードライブ105 (72)発明者 ウエング，ズード アメリカ合衆国イリノイ州60016デスプレ インズ・レスリーコート495・アパートメ ント301 (72)発明者 ヒユー，スー アメリカ合衆国アイオワ州50322アーバン デイル・ハンドレツドサードストリート 4700 Ｆターム(参考） 4B024 AA07 AA11 BA07 CA04 CA07 CA09 CA11 DA01 DA05 DA12 HA03 HA12 4B063 QA05 QA18 QQ44 QQ63 QR25 QR38 QR55 QR62 QS34 4B065 AA01 AA72 AA88 AB01 BA02 CA27 CA47 CA48 4H045 AA10 AA20 AA30 CA30 DA55 EA06 FA74

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチド： （ａ）配列番号２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０および２２より
   成る群から選択されるメンバーに比較される場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ整列方法に
   基づき最低８５％の同一性を有する最低３５アミノ酸のポリペプチドをコードす
   る第一のヌクレオチド配列；ならびに （ｂ）第一のヌクレオチド配列の相補物を含んで成る第二のヌクレオチド配列。
2. 【請求項２】 第一のヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５、７、１１
   、１３、１５、１７、１９および２１より成る群から選択される核酸配列を含ん
   で成る、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列がＤＮＡである、請求項１記載の単離され
   たポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列がＲＮＡである、請求項１記載の単離され
   たポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 最低１種の適する調節配列に操作可能に連結された、請求項
   １記載の単離されたポリヌクレオチドを含んで成るキメラ遺伝子。
6. 【請求項６】 請求項５記載のキメラ遺伝子を含んで成る単離された宿主細
   胞。
7. 【請求項７】 請求項１記載の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る宿
   主細胞。
8. 【請求項８】 宿主細胞が、酵母細胞、細菌細胞および植物細胞より成る群
   から選択される、請求項７記載の宿主細胞。
9. 【請求項９】 請求項１記載の単離されたポリヌクレオチドを含んで成るウ
   イルス。
10. 【請求項１０】 配列番号２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０
    および２２より成る群から選択されるポリペプチドに比較される場合に、Ｃｌｕ
    ｓｔａｌ整列方法に基づき最低８５％の同一性を有する最低３５アミノ酸のポリ
    ペプチド。
11. 【請求項１１】 （ａ）請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド由来の
    最低３０の連続するヌクレオチドを含んで成るポリヌクレオチド分子を提供する
    こと； （ｂ）ＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼを発現する植物細胞に該ポリヌク
    レオチド分子を導入すること；および （ｃ）該単離されたポリヌクレオチドを含有しない植物細胞中のＡＭＰもしくは
    アデノシンデアミナーゼのレベルと、該単離されたポリヌクレオチドを含有する
    植物細胞中のＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼのレベルを比較すること を含んで成る、植物細胞中のＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼの発現のレ
    ベルに影響を及ぼすポリヌクレオチド分子の選択方法。
12. 【請求項１２】 ポリヌクレオチド分子が請求項１記載の単離されたポリヌ
    クレオチドである、請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 ポリヌクレオチド分子が、配列番号１、３、５、７、１１
    、１３、１５、１７、１９および２１より成る群から選択される単離されたポリ
    ヌクレオチドである、請求項１１記載の方法。
14. 【請求項１４】 （ａ）配列番号１、３、５、７、１１、１３、１５、１７
    、１９および２１より成る群から選択されるヌクレオチド配列由来、もしくは該
    ヌクレオチド配列の相補物由来のオリゴヌクレオチドプライマーの最低３０の連
    続するヌクレオチドを提供すること；ならびに （ｂ）該オリゴヌクレオチドプライマーを使用して核酸配列を増幅すること の段階を含んで成る、ＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼポリペプチドをコ
    ードする核酸フラグメントを得る方法。
15. 【請求項１５】 （ａ）配列番号１、３、５、７、１１、１３、１５、１７
    、１９および２１より成る群から選択されるヌクレオチド配列由来、もしくはこ
    うしたヌクレオチド配列の相補物由来の最低３０の連続するヌクレオチドを含ん
    で成るヌクレオチドプローブでｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーをプロー
    ビングすること； （ｂ）該プローブとハイブリダイズするクローンを同定すること；ならびに （ｃ）該クローンを単離すること の段階を含んで成る、ＡＭＰもしくはアデノシンデアミナーゼポリペプチドをコ
    ードする核酸フラグメントを得る方法。
16. 【請求項１６】 請求項１記載の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る
    組成物。
17. 【請求項１７】 請求項１０記載の単離されたポリペプチドを含んで成る組
    成物。
18. 【請求項１８】 請求項５記載のキメラ遺伝子を含んで成る形質転換された
    植物細胞。
19. 【請求項１９】 請求項５記載のキメラ遺伝子で細胞を形質転換することを
    含んで成る、形質転換された細胞の製造方法。
20. 【請求項２０】 細胞が植物細胞である、請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項２０記載の方法
    。
22. 【請求項２２】 植物細胞が双子葉植物である、請求項２０記載の方法。
23. 【請求項２３】 （ａ）請求項５記載のキメラ遺伝子を含んで成る形質転換
    された宿主細胞を提供すること；および （ｂ）該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で、該形質転換された宿主細胞を成
    長させることであって、 ここで、キメラ遺伝子の発現が、該形質転換された宿主細胞中のＡＭＰデアミナ
    ーゼもしくはアデノシンデアミナーゼの発現レベルを変える、 を含んで成る、宿主細胞中のＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナー
    ゼの発現レベルを変える方法。
24. 【請求項２４】 （ａ）ＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナー
    ゼをコードする核酸フラグメントを含んで成るキメラ遺伝子を含む形質転換され
    た宿主細胞を提供すること； （ｂ）該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で、該形質転換された宿主細胞を成
    長させること（ここで、該発現はＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデアミ
    ナーゼを産生し）； （ｃ）場合によっては、産生されたＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデア
    ミナーゼを精製すること； （ｄ）試験されるべき化合物で、ＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデアミ
    ナーゼポリペプチドを処理すること；および （ｅ）処理されたＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼポリペプ
    チドの活性を処理されない酵素の活性と比較することにより試験された化合物の
    阻害効果を決定すること を含んで成る、ＡＭＰデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼの活性を阻
    害するその能力についての化合物の評価方法。