CN116082480A - 抗病相关蛋白OsMED16及其生物材料和应用 - Google Patents

抗病相关蛋白OsMED16及其生物材料和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗病相关蛋白OsMED16及其生物材料和应用。解决的技术问题是提高植物抗病性、减少植物分蘖数、延迟植物开花时间或制备延迟植物开花时间。具体提供了蛋白质及其生物材料，蛋白质为如下述任一项：A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；A2)将A1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具提高植物抗病性的蛋白质；A3)将A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。将植物基因组中相关基因替换位编码所述蛋白的编码基因能够提高植物抗病性、减少植物分蘖数和延迟植物开花时间，用于水稻品种改良或育种。

Description

抗病相关蛋白OsMED16及其生物材料和应用
技术领域
本申请具体涉及抗病相关蛋白OsMED16及其生物材料和应用。
背景技术
植物已经进化出了抵抗病原菌侵染的多种防卫机制。过敏性反应(Hypersensitive Response，HR)是植物中最为普遍且有效的防卫反应之一，其特征在于植物受到病原菌侵染时，在侵染位点周围迅速产生局部细胞坏死，从而限制病原菌向相邻细胞扩展。HR是一种典型的细胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)过程，通常伴随着活性氧迸发、胼胝质沉积、自由基产生、病程相关(Pathogenesis-related)基因诱导表达及细胞壁增厚等生理过程。尽管HR在植物抗病性中的作用得到了广泛认可，但其分子机理尚不明晰。
植物类病斑突变体(Lesion mimic mutant，LMM)是指在未遭受明显的逆境胁迫、机械损伤或病原菌侵染时，在植物的叶片或叶鞘上自发形成类似坏死病斑的一类突变体，是研究植物HR介导的PCD和抗病机制的重要实验材料。目前已在拟南芥、小麦、玉米、水稻和大豆等植物中鉴定出一批类病斑突变体，并分离出60多个类病斑基因。这些基因编码多种类型的蛋白并参与多种生理过程，例如钙离子信号转导、蛋白质泛素化和磷酸化、活性氧迸发、转录调节和mRNA剪接。然而，目前这些已知基因相较于复杂的植物抗病反应调控网络来说还只是冰山一角，还有许多未知的部分需要进一步研究。
因此，如何找到一种与抗病相关的关蛋白及其生物材料和应用是本领域要解决的问题。
发明内容
本申请所解决的技术问题是提供如何提高植物抗病性、减少植物分蘖数、延迟植物开花时间和提高植物OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达和/或制备提高植物OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达。
为了解决上述问题，本申请提供了下述应用。。
蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下述任一种的应用：
A1)调控植物抗病性中的应用和/或制备调控植物抗病产品中的应用；
A2)调控植物分蘖数和/或制备调控植物分蘖数产品中的应用；
A3)调控植物开花时间和/或制备调控植物开花时间中的应用；
A4)调控植物OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达和/或制备调控植物OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达产品中的应用；
所述蛋白质为如下任一种：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗病性相关的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
序列2(SEQ ID No.2)具体如下：
MTSSSAPNPSPLVPTPTPSPPTANAAAAAAGAVPVSSPTPPPKDQQQEGQGGGGGVGDGGGVEEVGVGGGEAMEVDGGAGGGGGGVGDVEGGGGGGGAGGGGGGGGGGQQASPATVFRIRLKQPPSSLRHKMRVPELCRNFSAVAWCGKLNAIACASETCARIPSSNSSPPFWIPIHILNPERPTECSVFNVKADSPRDFVQFIEWSPRSCPRALLVANFHGRITIWTQPTKGPTNLVRDASSWQCEHEWRQDLSVVTKWLSGISPYRWLPANSSTSSNLKTFEEKFLTQQPQSSAGWPNILCVCSVFSSGSVQLHWSQWPSQNSAQPRWFSTSKGLLGAGPSGIMAADAIITETGALHVAGVPLVNPSTVVVWEVMPGLGNGIQATAKINATSSLPPSLNPPLWAGFAPLASYLFSLQDYLVSEGAQTKKQAQVDNETTEVASIHCCPVSNFSAYVSPEAAAQSATTTTWGSGVTSVAFDPTRGGSVITVVIVEGQYMSPYDPDEGPSITGWRVQCWESSVQPVVLHPIFGSPANFGGQPPTQTVWSTRVNKSIPPSEDLKNPQSYVPMPTTSDERSSSECSVDRANRLSFDPYDLPNDVRQLAQIVYSAHGGEVAVAFLRGGVHIFSGPNFEQVDSYHVNVGSAIAPPAFSSSGCCLASVWHDTLKDRTILKIIRVLPPAILNAQTKVSSAVWERAIADRFWWSLLAGVDWWDAVGCTQSAAEDGIVSLNSVIALLDADFHCLPTIQQRQQHCPNLDRIKCRLLEGTNAQDVRALVLDMQARLLLDMLGKGIESALINPSTLLPEPWQASSDMLSSIGPDKMTVDPALLLSIQGYVDAVLDLASHFITRLRRYASFCRTLASHAVGASSGSGNSRNMVTSPTNSSPSPSTNQGNQGGVASTTGSSQMQEWVQGAIAKISNNTDGAANAAPNPISGRSSFMPISINTGTFPGTPAVRLIGDCHFLHRLCQLLLFCLLFRRRQSPRIPANAQKSSDSSMQKQHLMNSKTEDNTLAVRSGLGAAKLEDGTTSRGQMVGAKGAEENPVGNKSARIGSGNAGQGYTSDEVKVLFLILVDLCKRTATLQHPLPSSQVGSSNIIIRLHYIDGNYTVLPEVVEASLGPHMQNMPRPRGADAAGLLLRELELQPPAEEWHRRNMFGGPWSEPDDLGPLDNTRQLKINGSTNRHLSDMEEDGDSSFGIQNLWPRKRRLSERDAAFGLKTSVGLGSFLGVMGSRRDVITAVWKTGLEGEWYKCIRCLRQTCAFAQPGALAPNTSNELEAWWISRWTHACPMCGGTWVKVV；
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白质中，序列2(SEQ ID No.2)由1301个氨基酸残基组成。将其命名为蛋白质OsMED16。
本申请中，所述与植物抗病性相关可为抗病性。
所述抗病性可为真菌病害抗抗病性或细菌病害抗抗病性。
本申请中，所述真菌病害抗抗病性可为稻瘟病抗病性。细菌病害抗抗病性可为白叶枯病抗病性。
所述稻瘟病可为稻瘟菌生理小种TH12、CH131或CH199。所述白叶枯病可为白叶枯病菌株PXO71、PXO99或PXO112。
本申请中，所述调控可为敲除或抑制或降低或下调。
上文中，所述敲除或抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因表达或上述蛋白的活性或含量可实现下述C1)-C4)；
C1)提高植物抗病性中的应用和/或制备调控植物抗病产品中的应用；
C2)减少植物分蘖数和/或制备调控植物分蘖数产品中的应用；
C3)推迟植物开花时间和/或制备调控植物开花时间中的应用；
C4)上调植物OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达和/或制备调控植物OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达产品中的应用。
上述用途中，所述蛋白来源于水稻。
上文中，所述水稻可为粳稻品种Taichung65(TC65)或日本晴(Nipponbare)。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述的用途中，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
D1)抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；
D2)表达D1)所述核酸分子的编码基因；
D3)含有D2)所述基因的表达盒；
D4)含有D2)所述基因的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D2)所述基因的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物；
D6)含有D2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有D3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有D4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
D7)含有D2)所述基因的转基因植物组织、或含有D3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有D4)所述重组载体的转基因植物组织；
D8)含有D2)所述基因的转基因植物器官、或含有D3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有D4)所述重组载体的转基因植物器官。
D2)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的抑制或降低或下调蛋白质OsMED16编码基因表达的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的抑制或降低或下调蛋白质OsMED16编码基因表达的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，且具有抑制或降低或下调蛋白质OsMED16编码基因表达的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述D4)中，所述重组载体可为用植物基因编辑载体。所述植物基因编辑载体可为BGK032载体。
作为一个具体实施例，上述所述重组载体为重组载体BGK032-OsMED16-sgRNA。所述重组载体BGK032-OsMED16-sgRNA是将核苷酸序列GTATGGGAATCCAAAATGGT插入到BGK032载体的限制性核酸内切酶BsaI识别位点间，保持BGK032载体的其它核苷酸序列不变得到的重组质粒。
上述D5)所述的微生物可为农杆菌。所述农杆菌为EHA105。
上述的用途中，D1)所述核酸分子为靶向权利要求1或2中所述蛋白编码基因的gRNA，所述gRNA的靶标序列为序列表中序列7。
上述得用途中，所述植物为如下任一种：
G1)双子叶植物或单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)稻属植物；
G4)水稻。
为了解决上述问题，本申请提供了一种培育高抗病性植物的方法。
所述方法包括敲除或抑制或降低或下调目的植物中如上所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到高抗病性植物，所述高抗病性植物的抗病性高于所述目的植物。
为了解决上述问题，本申请提供了一种培育晚花植物的方法。
所述方法包括敲除或抑制或降低或下调目的植物中如上所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到晚花植物，所述晚花植物的开花时间晚于于所述目的植物。
本申请中，所述与植物抗病性相关可为抗病性。
所述抗病性可为真菌病害抗抗病性或细菌病害抗抗病性。
本申请中，所述真菌病害抗抗病性可为稻瘟病抗病性。细菌病害抗抗病性可为白叶枯病抗病性。
所述稻瘟病可为稻瘟菌生理小种TH12、CH131或CH199。所述白叶枯病可为白叶枯病菌株PXO71、PXO99或PXO112。
上述方法中，所述敲除或抑制或降低或下调植物中上述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入以序列7为靶序列的基因敲除载体。
上文中，上述所述重组载体为重组载体BGK032-OsMED16-sgRNA。所述重组载体BGK032-OsMED16-sgRNA是将核苷酸序列GTATGGGAATCCAAAATGGT插入到BGK032载体的限制性核酸内切酶BsaI识别位点间，保持BGK032载体的其它核苷酸序列不变得到的重组质粒。
为了解决上述问题，本申请提供了一种培育高抗病性植物和/或晚花植物的方法。
所述方法包括将目的植物的基因组进行如下任一操作：
K1)将目的植物基因组序列表中序列3的第1648位至1649位之间插入1个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸残基；
K2)将目的植物基因组序列表中序列3的第1646位至1649位之间缺失2个脱氧核糖核苷酸残基；
K3)将目的植物基因组序列表中序列3的第1641位至1652位之间序列为CCCACCATT的脱氧核糖核苷酸残基突变为序列为TCTAA的脱氧核糖核苷酸残基；
K4)将目的植物基因组序列表中序列3的第1624位至1658位之间的33个脱氧核糖核苷酸残基进行缺失突变；
K5)将目的植物基因组序列表中序列3的第1646位至1648位之间缺失1个脱氧核糖核苷酸残基；
K6)将目的植物基因组序列表中序列3的第1647位至1648位之间插入1个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。
序列3(SEQ ID No.3)具体如下所示：
CCTCCCTCTGACTCTCTCCCCGTCGTCGTCATCGTCATCGTCGTTCGTCGTCGTCGTCTCCCCTTTCCACGGCCGCATCCCATTCCCCACCCAACCTGAAAGCGACGCCGCCGCAGCGCACACGCAGGAGGCAGCAGCAAAGCGAGGAGGGGAGGAAACCCTCCCCCCGCGACAGCAACGGGCGGTCGCTTCCAGTGACCTAAGCCTCCCCCTCCCCCCCTCGCGCGCGCTTCCCTCCCCTTCGCCTTTTTGTCTCCTCCGCCCCTTATGACCTCTTCCTCCGCCCCAAACCCTAGCCCCCTCGTCCCCACCCCCACCCCCTCTCCCCCCACCGCCAACGCCGCCGCCGCCGCCGCCGGAGCCGTGCCCGTCTCCTCGCCGACGCCGCCGCCCAAGGATCAGCAGCAGGAGGGCCAGGGGGGTGGAGGAGGAGTGGGGGATGGGGGTGGAGTGGAGGAGGTGGGCGTAGGGGGAGGCGAGGCCATGGAGGTGGATGGTGGCGCGGGAGGTGGTGGTGGGGGGGTTGGGGATGTGGAGGGGGGTGGGGGTGGTGGTGGTGCGGGGGGAGGAGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGGCAGCAGGCGTCGCCGGCGACCGTGTTCCGGATCCGGCTCAAGCAGCCGCCCTCGAGCCTCCGCCACAAGATGCGCGTGCCCGAGCTCTGCAGGAACTTCAGGTGCGTTTCGAGATTAGTTGTGGTTTTTTTGGGGGTGTTTTTTCTTTCTGGGATTTAAATATGTTGGGGGAAGCTTAGGTGTGATGAATTTAAACCCTGATCTGTTTCAGCTTATTCATCGATTTATTGAAATGGTTTTTTTCCCCCCGAAAGAAATTTTCCTCTACTGTATTGCTTAGACCACTTGTTTTAAGCTATTTGTTAAGTTTGTCTCTCAAAATATCTAATTTATCCCTATAATATATCCATGACAATAATCCACTCAATAATCTAAATCAAACGATCTGGGTTTACTTTTTTTTTCCTCTTCAAATTTGGGTGGCGTTTCAATGATTGGGATGAACAATCTAGTGACTCAAACTTGCAGAAGCATTAGCGTGGGCATGGAATTGTGATTGCTTTGAATGATTGTATCCTGTGCAGGCTTCTACTATACTAGATCAAATACAGTTATAACATGTAGTGTCATTATTTCACATAACTAAGTTTAGTCAGGTCAAACTGGTTACTTTGTTCACCAGTTAGAAAATACCGAACGTGATAACTCCATTTTTAAAATCCACATTATTTTTTTTTGTTTAAAACTGCTTTGATCTTGTAGGATGAGGTTGCCTTGTCTGCTTTAGCCTACACTATATCGGGAACAACTAGTAACTATCTTATCTATGGTTTTTTTTTTATTGCAGTGCAGTTGCTTGGTGCGGGAAGCTCAATGCAATTGCATGCGCATCAGAGACTTGTGCACGCATACCAAGGTATACATTTTTCCATCCTTTCCCTGAAAATTTACTTTCCTCTGACCTTTAGTTATCCATAAATAAGTTTGTTCTGTTAGCTTGTCTTAGTGGGATATTCAACCATTTGGTAGAATTGTTTGCTTACAGTTTCTGGTTATGAAGGTTTCTTTGCCGTAAAACGATCTAATGTATATTTTCAGCTCTAATTCAAGCCCACCATTTTGGATTCCCATACACATTCTAAATCCAGAGAGACCAACAGAATGTTCTGTTTTCAATGTGAAAGCAGGTAATCCATGGCTAAATCTCAATTGTTTTGGTAATGTGATTACGTTATGCATGTGCAAATCACTGTCCATTGGGCATTTTATAGTCAGGTGAAGGGTGAGATTCAAACTCACTTTTGTTTATATACGAGTTTTTCTACCTCCAATCCTAACTCACTGTAATTTTGAACAGATTCTCCACGCGACTTTGTTCAATTCATTGAATGGTCTCCTCGATCATGCCCTCGTGCATTACTGGTGGCAAATTTTCATGGAAGGATTACTATATGGACACAGCCAACTAAGGTACATCTCTACCTTAAGCAAATTTCGGTATGCATATCATTTTTTTTTGTTAGTAGTACCATTGAACTTACTTTGTTAATTTGCGAAACACTCAGGATTTTCTTTTTTCATTTCAAGTCTATATACATATCATGCTGTTTTGTGTTTTTTCTCTAATACTTGTTTCTTTCTTGATATGGTGAAGGGTCCTACTAATCTTGTACGTGATGCCAGTTCCTGGCAATGTGAACACGAATGGCGTCAAGATCTTTCGGTGGTGACTAAGTGGTTGTCAGGAATTTCTCCGGTTTGTTGCCAATTTGCAAACTTACAGTCTGCTTCTCTTGTTTTTGATAATTAGCACTTTACACTTGGAATGCAAATATGCAATACGATTGACCCAGCAGTTTATACAGTCCGCTTCACAATTTAACATTCGAGATTTATATACTTTTCAGTGTCAATTGTTAATCATTATTTTTTTAAAATATAATATTTTATAAAGCAGTGACAATAGACTTGAGTTTAAACTGTTCTAAGATTTTTTCACTGGACATTTATCATAAACAATTGCAACAATTAGGTAAAAAAGATTCTGGCTCAGTTTATGTCTGAGTAAGTACTTTGATCTATTTCAAATGACACTACCTGTGTTTGATTACCCTTTTGGCCTGAAATAAGTGGATCTTAGAATCGAAGGAATATAATTACTAAGCTGTTGCCACGGCTAAATTTGTTTTGTTTCTTTGACTTTGCAGTATAGATGGCTTCCTGCAAACTCTAGTACTTCATCAAACTTGAAAACCTTTGAGGAAAAGTTCCTTACCCAGCAGCCTCAAAGTTCGGGTTGGTTAAACACATATATTACTGAGCATATATTTTTTTTGGAGGAGAAAGCAAGCATGCTTCTTTACGCTACTCTGACATATTGCTGTTTACTGCAGCTGGGTGGCCAAACATTCTATGTGTCTGTTCAGTTTTTTCATCGGGTTCTGTTCAGCTTCATTGGTCACAATGGCCTTCTCAAAACTCAGCACAACCTAGATGGTTTTCTACTAGCAAAGGGCTTTTAGGAGCAGGGCCAAGCGGCATAATGGCTGCTGATGCTATTATTACTGAAACTGGAGCATTACATGTTGCTGGTGTTCCCCTTGTTAATCCATCTACTGTAGTGGTTTGGGAGGTGATGCCAGGCCTTGGCAATGGTATTCAGGCAACTGCAAAGATAAATGCAACAAGCTCTCTTCCTCCATCACTAAATCCCCCACTCTGGGCTGGTTTTGCTCCACTTGCATCTTACCTCTTCTCTTTGCAAGACTACCTTGTTTCCGAGGGCGCACAGACAAAAAAACAGGCACAGGTAGATAATGAGACCACTGAGGTAGCATCGATCCATTGTTGTCCAGTTTCCAACTTTTCAGCTTACGTCAGTCCTGAAGCTGCTGCCCAGTCAGCCACTACCACAACATGGGGATCTGGGGTTACCTCAGTTGCTTTTGATCCCACTCGAGGGGGATCAGTTATTACAGTTGTAATAGTTGAAGGTGCGTATATGACACCTGGGAAATGAATTAGTATGATGCAATTGTCACATCTCACTATGACTATTTGTTTCTGATGAATGGCATGAACATCAATGCCATTCATAATCACCACACTAATCCTATGATCATCCAACAGCTTTAATAGTAGGAGAGTTAATCTAACTATGTATGTCCAGAGCATGCTTATACATGTTTTAGCTCCCTTTAGTTGCTTTTGTTGTTTCTTTGATTTGCTCTGGTAGCTTGTGCCATGGTAATAAAAGTTCTTGTCTGTAAATGCTATATGCATATTCTTTTAAGGACTTTTGGGGTCTCTGAAATTTATTAAGTGAATCGGTTGATCTTAGGCTCTTGGCTAATGCTTATTTATTTTTTCTGACAATTGTTAAACCACATACTTCCAGGGCAGTACATGTCTCCTTATGATCCTGATGAAGGACCTTCCATCACTGGATGGAGAGTCCAGTGCTGGGAATCTTCAGTCCAACCTGTTGTTCTTCATCCAATATTTGGAAGCCCTGCAAACTTTGGTGGACAGCCACCTACACAGACTGTTTGGTCCACAAGAGTTAACAAAAGCATCCCACCATCTGAGGACCTTAAGAACCCTCAATCATATGTTCCAATGCCAACAACTTCAGATGAGCGGAGTTCTTCTGAGTGCAGTGTTGACAGGGCGAACCGACTTAGCTTTGACCCTTATGATCTTCCAAATGATGTCAGACAATTGGCCCAAATAGTTTATTCTGCTCATGGTGGTGAGGTTGCAGTTGCATTCCTGCGTGGAGGTGTGCACATTTTTTCAGGTCCAAACTTTGAACAGGTTGATAGCTATCATGTCAATGTTGGCTCAGCAATTGCTCCACCAGCCTTCTCCTCCAGTGGTTGTTGCTTGGCATCAGTATGGCATGACACACTCAAAGATCGAACCATACTAAAGATAATACGTGTGCTTCCTCCTGCAATTCTTAATGCTCAGACAAAGGTTAGCTCAGCTGTTTGGGAACGAGCAATAGCAGATAGGTATCCACCCAAGTTAACAGAGGTTGATTGAAATGATTTATTTGTTGAAAATGTTTTTTTTTATAACTGCGATCTTTTTAGCAGATTTTGGTGGAGTCTATTGGCTGGTGTGGATTGGTGGGATGCTGTTGGCTGCACACAAAGTGCTGCTGAAGATGGTATTGGTAAGGATGCTTATGCAGATGCAATTTAAAATTTGTGTATAGTATTTGCATTTCAATTGTGTTCTAGCTGTCCACACAATTAGAAAAGTAGGGATTATCTGCTACACGGTAGAATTTCCACAACTGTCACTCAACCTCTTAAAGTATATACTTCCTCCGTTTCATAATGTAAGTCATTCTAGCTTTTTCCACATTCATATTGATGTTAATGAATCTAGATAGATATATATGTCTAGATTCATTAACATCAATATGAATGTGGAAAATGTTAGAATGACTTACATTGTGAAACGGAGGGAGTAATTAAGAACAGTGTAACCAAGCAAATCTCTGTTTGGTTGTTTATAATGTTAAGACTTTAGAGCTGATTGCACATTTATGCTCCCAATTTGAAAGCATTGTGCATCTGCAGTATGATGAATTGTGTTTTGCTTCATTTTTCCCATTTGGATGTCTCAATATGTTAACATTATTTCCTGGTGTGAGTTGCAATACATCTTTTTAAGCTGATACAGAACTTTTCAGTAAGTTTCATCATTTTCTACATATGGTTGGTTAACTATTTCAGCACCTGTAACATTTATATTTGTCCATGATAAACTAAATCTCTTGCTTTTCCTTCCAGTCTCACTGAACAGTGTGATAGCTTTGCTGGACGCGGACTTCCATTGTCTTCCAACTATACAACAGAGGCAACAACACTGTCCTGTAAGTGTGCTGTGCTTTTAGTACATTATGTGCAGTTTTAAGCACAGGCCTTCAATTTTTCATCATCTACTGCCTACTGCCATTACTATGTGACATGCATGTCACAATATCTTTTTGGGTTCTTAAAGATTGTACATTCACCAATCACCAGTCTTTATTCCACCAGTAGTTGAAAGGGGGATACGAATCAAAATATAATCAAGATGACTTTTTTCCTTTTCTTTCCTGGACATAGTTTTTTAGTATTCTTGTGACAAGTCACTAGCACTGCTTTGCAGTTCTGAATGAACATTTTAGCATGAAGCTTGCCAAACTTTTCTATGAACATAAATTATATCTCTGGATGTATTGGTCAGAGACCATTTACGGTAGTATGTAGTTTGCTACTTTATTCATAATGCAATATATTGTAATTTGTGAGTTGGACAAGATTTGTTTTTCTAATTGTGTGTTTACCTTTTACTTCAGATTTTGAGGACTTGAAGTTGCAAGGCTATTGCTTTCTTCTGTTACTGATTAGTCTATTTTACTTATTGCAGAATCTTGATAGGATAAAGTGTAGATTGTTGGAAGGAACAAATGCTCAAGATGTCAGAGCACTTGTGTTGGACATGCAAGCAAGATTGCTTCTGGATATGCTTGGCAAGGGAATTGAGTCTGCCCTGATAAATCCATCAACTCTGCTACCTGAACCGTGGCAAGCTTCCAGTGACATGTTATCTAGCATTGGGCCTGACAAAATGACTGTTGACCCAGCTCTACTTTTAAGCATCCAGGTATACTGTGTTTCATGTTCTTTTGATTTCCTGGTCCACAGTTTCAGTTCAATTTGCTAATCTCGTTTTCCTTTTTTTGGCTATAGACTTAATATGGGCAAATGATGTTGCAAACCTTTTTGAATGATAAGCTATTTGTAAACCACAACCTATTCATGCATGAGGATGAGGCATGATATGCCACAGATTAACCATGCCATGTATGGAATTTACAGTATTTACAGCAGTATTTTGCTGTTTTTATGTTCCAAACCGACTACGATTCAAACAGCCTCCAGATAGCTTTCATCATAAGCTTTGCTCCTAGGTGTGCAGGAATTATGCTCAGCCCATCAACTGCCTCCAATGCCTTAGCAATTTGTGCACACATTTCAGCATAAGCGGTCTGCATATGAACTTTCATGTTACTATTTTGTGGATTTAATTTTTTTTTGAACATGGACTGCAGGGGTACGTTGATGCTGTTCTAGATTTAGCGTCACATTTTATCACACGCTTGCGACGCTATGCGAGCTTCTGCCGAACTTTGGCTAGCCATGCAGTTGGAGCATCTTCTGGTTCAGGCAATTCTAGGAATATGGTTACAAGTCCAACCAACAGTTCTCCTTCACCTTCAACTAACCAAGGTTAATTTTGATTCCGTCTATCTTGCTAAAGCTTGTGCTTTTTTTTTTGGTGCTAAATAAAACCACCTATGAATTATTTGTTTCTTTATTTAATTTTTTGGAAAATGACAAGTTGCTGGCACATTTCAAACTTAGCAATGATGCTAATGTTTCAGGTAATCAAGGTGGAGTAGCGTCTACAACAGGGAGCTCACAAATGCAAGAGTGGGTCCAAGGTGCCATTGCTAAGATTAGTAACAATACTGATGGTGCTGCAAATGCTGCACCAAATCCAATTAGCGGGAGGTCATCATTCATGCCTATTAGCATAAATACGGGAACATTCCCTGGCACACCAGCTGTTAGACTTATTGGGGACTGCCATTTCCTTCATAGATTATGTCAGCTGTTGCTATTTTGTTTGCTTTTTCGGAGAAGGCAATCTCCAAGGATACCTGCAAATGCACAAAAAAGTTCTGATTCTAGCATGCAGAAACAACACTTGATGAACAGTAAGACAGAGGATAATACTTTGGCAGTCAGATCTGGTCTAGGTGCTGCCAAATTGGAAGATGGCACAACTTCACGTGGACAGATGGTTGGAGCAAAGGGTGCTGAAGAAAATCCAGTGGGCAACAAATCTGCTAGGATAGGTTCTGGCAATGCTGGCCAAGGTTATACTTCAGACGAGGTAACAAACAAATAACCCATAAATATGGATTTTCTCAGCCTGAATTGTTCAATAAGAAAACTTTTTTCAATCTGAAAATAGTGATAGTTATACATATAACAGTATTTTTGTATGTGCGCTTCGACATCAATATCTAGCCTGTATTGTTTCTGAATCAACATTTAGATTAGAGCTGTTATATAGTGTGGTTATATGTCTGCATATCATATATCATGTGTGTGTCTAAATTGTTTGCAAGTGCCATATGATTAAGGGTAATTAGACATGATTGGATAATTTACCTAGTATAATCTTTGATCGGTGATTTGCCCGACATGTTTCTCCCGATTTTATTAGTTGCCTTTCTGAAAGTATTATTTGTGTAGCACTGTAATACATCTAGTTTCTGAATTATTTGTTTCATGCTTGCAGGTGAAAGTCCTTTTTCTCATATTAGTTGACCTATGTAAACGGACTGCAACCTTGCAACATCCGTTGCCTTCTTCTCAGGTTGGTTCGAGCAATATTATTATAAGGCTGCATTACATCGATGGCAATTACACTGTGCTCCCTGAGGTAGTGGAAGCATCTCTTGGCCCTCATATGCAGGTACAATACAGATTTATTGTGGAAGTTTATTTCTGTATTCTCTGTGTACTCATTAGAGCATTCAATGTTCTCTTCTCAGCAATACATTATAGTAATTCTCAATTGTGTTGGAGAAATAGAGATATAGTATTTTGCAAGTTCTACTCTACTTACCTGGGTTAACGATGGATTGATCCAGCAAAAGAATATTGTTGTCCAAGTTAATTATGGAAATTTTCATTTATACAAGCACACGTGCATAATTGGTTTTTATGATTTCTTTTGTTCATACGTTCTCCATCTGCCTATATAATTTATTACTCATGGCCTCAGCGCCCTCTTGTCACCATTTAGGAGTTCTCATTTTCATCAGCATGTACATCTTTGGTAAGAGTAGTGAGCATGTACATGTCCAACAAGAGCTGTGTACACGCATTTCTGTCGAGAATTTATACCAATGTTGCCCATTTGTTCCAATATTTATTGCAGAATATGCCTCGTCCACGTGGAGCTGATGCTGCTGGCCTTCTACTTCGAGAATTAGAACTGCAGCCCCCTGCTGAAGAATGGCATAGACGCAACATGTTTGGTGGGCCATGGTCAGAACCAGATGATCTTGGTCCATTGGATAATACGCGACAGCTAAAAATCAATGGCTCTACCAATCGCCACTTATCGGACATGGAAGAGGATGGCGACAGCTCCTTTGGGATTCAAAATCTTTGGCCAAGAAAGCGCCGGTTGTCTGAAAGAGATGCAGCATTTGGTCTGAAAACATCCGTGGGGCTGGGATCTTTTCTAGGTGTGATGGGTTCTCGGAGAGATGTTATTACAGCTGTGTGGAAAACAGGCCTCGAAGGTGAATGGTACAAGGTAAGCATACTTGATAGTAGTAGTCTCTAACTTCAGTATTCTTTCAGAATTAATTATCGACGCACTCTATCCAATTCACCATTTGCCGTGACACCGAGACATGCTATCTTTTGCAGTGCATACGATGTTTGAGGCAAACCTGTGCATTTGCTCAGCCTGGTGCTCTAGCTCCGAACACGTCGAATGAGCTTGAGGCATGGTGGATCAGCCGATGGACCCATGCTTGCCCAATGTGCGGTGGGACATGGGTGAAAGTCGTTTGAATTTGACGCCTCCGGGCGACACCTTCACCGTACTAACCACTCTGCCAATAGCTTTCTCGGCCAAATCTGTGTAGGCGCCATCGGTTTTTGGACAATTTTGTATCTAACTTTAGATTGTTTGGTCTCAGGCCCTCCCTGGTATGGTATCATAGTTTACCTGCAGCAGTCAGAGCAGATTGCACCAGCAGCTGTGTAAAACGGTAGGAAAAAACAGGATTAGGACATGCCCAAACACTGTCAGAGTCAGCAGTTGTGTTGTGCGATCCTTTTGTACATAAATGTAGTGTACTAATTTGCAACATTGGAAAAGAAACTCCGTTAGATACTGCTTGATGTCAATAATATTTGCTGGTGATTGAAAAGACCATGTATGTAATAGCATGTTCAATTGGGTGTTTCTCTCA；
上述用途、方法中，所述植物为如下任一种：J1)双子叶植物或单子叶植物；J2)禾本科植物；J3)稻属植物；J4)水稻。
上文中，所述水稻可为日本晴(Nipponbare)。
有益效果
本申请公开了抗病相关蛋白OsMED16及其生物材料和应用。本申请找到了一种蛋白质及抗病相关蛋白OsMED16及其编码基因。将野生型TC65基因组中序列3区域(OsMED16编码基因)的第8024位鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸残基转变为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸残基，获得纯合突变体，命名为突变体spl38。突变体spl38与野生型TC65相比，抗病性明显升高、分蘖数减少、开花时间延迟、OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达和/或制备提高植物OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达量升高。
并在野生型TC65中克隆具有原始启动子的OsMED16编码基因(序列3)，以pCAMBIA1300载体为介质导入突变体spl38中，获得回复突变突变体spl38-C，变突变体spl38-C与突变体spl38相比，表型得到恢复，因此，突变体spl38基因组中序列3区域(OsMED16编码基因)的第8024位鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸残基转变为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸残基是引起上述效果的因素。
进一步，本申请构建了osmed16-3、osmed16-5、osmed16-6和osmed16-8 OsMED16基因敲除植株。
osmed16-5纯合体与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中OsMED16的基因发生了突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的OsMED16的基因组基因均发生了如下变化：序列表中序列3的第1648位至1649位之间插入了的1个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在204位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除。
osmed16-3杂合体与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中OsMED16的基因发生了突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的OsMED16的基因组基因分别发生了如下变化：一条染色体的序列表中序列3的第1646位至1649位之间缺失了2个脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在203位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除；另一条染色体的序列表中序列3的第1641位至1652位之间的10个脱氧核糖核苷酸(CCCACCATTT)突变为5个脱氧核糖核苷酸(TCTAA)，导致编码蛋白在202位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除。
osmed16-6杂合体与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中OsMED16的基因发生了突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的OsMED16的基因组基因分别发生了如下变化：一条染色体的序列表中序列3的第1648位至1649位之间插入了的1个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在204位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除；另一条染色体的序列表中序列3的第1624位至1658位之间缺失了33个脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在169位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除。
osmed16-8杂合体与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中OsMED16的基因发生了突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的OsMED16的基因组基因分别发生了如下变化：一条染色体的序列表中序列3的第1646位至1648位之间缺失了1个脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在178位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除；另一条染色体的序列表中序列3的第1647位至1648位之间插入了的1个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在204位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除。将osmed16-3、osmed16-5、osmed16-6和osmed16-8与野生型水稻日本晴在光周期为14h光照/10h黑暗，温度为28℃的温室环境下进行持续培养。结果表明，与野生型日本晴(Nip)相比，OsMED16敲除株系也产生了类病斑表型，同时所有4个株系均在营养发育阶段表现出极其弱小、矮化和产生病斑的表型，培养60天后表型十分显著，并最终在生长70天后死亡。
进一步，本申请为分离、鉴定新的类病斑突变体及其突变基因、解析其类病斑形成及参与植物防卫反应的机制以及深入了解植物抗病机制打下基础。
在生产实践中，可进行如下操作：
(1)本领域人员可以通过基因编辑的方式对水稻实现定点突变，引入中序列3区域(OsMED16编码基因)的第8024位鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸残基转变为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸残基的变异，从而获得具有上述表型的植株，进而选育目的植株。
(2)本领域人员可利用水稻类病斑突变体spl38及OsMED16突变基因，通过常规杂交、分子标记辅助选择或基因工程等手段将OsMED16的突变基因引入水稻，可以显著增强转基因水稻对真菌病害(如稻瘟病等)及细菌病害(如稻白叶枯病等)的抗性，进而改良水稻品种。
(3)对于一些需要延迟开花的作物而言，本领域人员可以通过异源表达OsMED16突变基因的方式来达到延迟开花的目的。
附图说明
图1为野生型(WT)和类病斑突变体spl38的表型比较。其中，(a)为野生型(WT)和类病斑突变体spl38的叶片表型，左为野生型，右为spl38；(b)为分蘖期野生型(WT)和类病斑突变体spl38的植株比较，左为野生型，右为spl38；(c)为成熟期野生型(WT)和类病斑突变体spl38的植株比较，左为野生型，右为spl38。
图2为野生型(WT)和类病斑突变体spl38接种稻瘟菌及水稻白叶枯菌后的表型。其中，(a)为喷雾接种稻瘟菌生理小种TH12后的表型；(b)为喷雾接种稻瘟菌生理小种CH131后的表型；(c)为喷雾接种稻瘟菌生理小种CH199后的表型；(d)为喷雾接种稻瘟菌后的真菌相对生物量的量化结果；(e)为剪叶接种水稻白叶枯菌生理小种PXO71后的表型；(f)为剪叶接种水稻白叶枯菌生理小种PXO99后的表型；(g)为剪叶接种水稻白叶枯菌生理小种PXO112后的表型；(h)剪叶接种水稻白叶枯菌后的病斑长度统计结果。
图3为野生型(WT)和类病斑突变体spl38中6个防御相关基因的表达量检测。星号表示野生型和突变体之间在统计学意义上的差异显著性(**:P<0.01，t测验)。
图4为水稻OsMED16(LOC_Os10g35560)基因的定位和克隆。其中，(a)为OsMED16初步被定位在第10号染色体标记M8和M9之间；(b)为OsMED16最终被定位在标记IN28和IN8之间；(c)为OsMED16的基因结构图，通过对该区域的野生型和突变体亲本基因组DNA序列进行测序比对，发现在基因OsMED16的CDS序列第3320个碱基由G突变成A，导致编码氨基酸由甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)。
图5是OsMED16突变体基因功能互补验证，其中，(a)为野生型(WT)、突变体(spl38)和转基因互补植株(spl38-C)的植株表型；(b)为野生型(WT)、突变体(spl38)和转基因互补植株(spl38-C)的叶片表型。
图6为荧光定量PCR检测OsMED16基因组织表达情况。
图7为OsMED16的亚细胞定位结果。其中，(a)为OsMED16-YFP在烟草表皮细胞中的定位结果；(b)为OsMED16-YFP在水稻原生质体中的定位结果。
图8为OsMED16 CRISPR-cas9敲除株系的测序结果。其中，(a)为OsMED16的基因结构图，sgRNA在第3个外显子处标明；(b)为所有4个株系的DNA编辑区的测序结果，osmed16-3、osmed16-6和osmed16-8为杂合体植株，osmed16-5为单碱基插入的纯合体植株。
图9为OsMED16 CRISPR-cas9敲除株系的表型。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用SPSS18.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
稻瘟菌生理小种TH12、CH131和CH199记载于下述文献中：Deng,Y.,Zhu,X.,Shen,Y.et al.Genetic characterization and fine mapping ofthe blast resistancelocus Pigm(t)tightly linkedt o Pi2 andPi9 in abroad-spectrum resistantChinese variety.TheorAppl Genet 113,705–713(2006).https://doi.org/10.1007/s00122-006-0338-7.
水稻白叶枯菌菌株PXO71、PXO99和PXO112记载于下述文献中：An E3 UbiquitinLiga se-BAG Protein Module Controls Plant Innate Immunity and Broad-SpectrumDisease Resistance.
籼稻品种Dular记载于下述文献中：Pyrophosphate-fructose 6-phosphate 1-phosphotransfer ase(PFP1)regulates starch biosynthesis and seeddevelopmentvia heterotetramer formation in rice(Oryza sativa L.)
中间载体pQBV3记载于下述文献中：Pyrophosphate-fructose 6-phosphate 1-phosphotransf erase(PFP1)regulates starch biosynthesis and seeddevelopmentvia heterotetramer formation in rice(Oryza sativa L.)
载体pEarleyGate101记载于下述文献中：Pyrophosphate-fructose 6-phosphate1-phosphotra nsferase(PFP1)regulates starch biosynthesis and seeddevelopmentvia heterotetramer formation in rice(Oryza sativa L.)
BGK032记载于下述文献中：Lu,Y.,Ye,X.,Guo,R.,Huang,J.,Wang,W.,Tang,J.,Tan,L.,Zhu,J.K.,Chu,C.,&Qian,Y.(2017).Genome-wide Targeted Mutagenesis inRice Using the CRIS PR/Cas9 System.Molecular plant,10(9),1242–1245.https://doi.org/10.1016/j.molp.2017.06.007.
公众可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1：突变体的获得及其表型
通过EMS化学诱变粳稻品种Taichung65(TC65)，在突变体库中筛选获得一个类病斑突变体并命名为spl38。在上海和三亚两地的常规水稻种植季节，正常播种条件下，突变体spl38的种子发芽势和生长势明显弱于其野生型。突变体spl38在分蘖前期没有出现任何自发性的细胞坏死，但是在分蘖后期植株上部叶片从叶尖开始出现红褐色类病斑，而且一直持续到成熟期，而野生型在整个生长期内未产生任何病斑。在分蘖期，突变体spl38的分蘖显著少于野生型；在成熟期，突变体并没有引起植株早衰，但是开花期延迟了约20天(图1)。
实施例2：抗病性鉴定和防御相关基因的表达量检测
稻瘟菌生理小种TH12、CH131和CH199菌液的制备：
(1)燕麦培养基的配制：先按200mL体积，称取燕麦片6g，于加有150mL蒸馏水的豆浆机中打碎匀浆；倒入蓝盖瓶中，加入琼脂粉4g，搅匀定容至200mL；121℃高温高压灭菌15分钟，待冷却至60℃左右，将培养基均匀倒入无菌的塑料培养皿(直径9cm)中，冷却凝固待用。
(2)稻瘟菌的培养：分别将保存有稻瘟菌生理小种TH12、CH131和CH199孢子的纸片接种到燕麦培养基上，于25℃暗培养2-3天；待菌丝萌发长出后，进行光照培养；两周内，待稻瘟菌长满整个培养皿时，用含有0.01％(V/V)Tween-20蒸馏水刮洗菌丝(含有大量分生孢子)，并用双层纱布过滤，利用显微镜和血球计数板计算孢子密度，将孢子悬浮液浓度调至1×105个孢子/mL(10×10倍镜下检查大概20-30个)，获得稻瘟菌生理小种TH12、CH131和CH199菌液，用于稻瘟菌接种(喷雾法)。
水稻白叶枯菌菌株PXO71、PXO99和PXO112菌液的制备：
(1)NA培养基的配制：分别称取3g牛肉膏、5g蛋白胨、2.5g葡萄糖加入到1L蓝盖瓶中，将培养基pH调至7.0，后加入琼脂粉15g，搅匀定容至1L；121℃高温高压灭菌15分钟，待冷却至60℃左右，将培养基均匀倒入无菌的塑料培养皿(直径9cm)中，冷却凝固待用。
(2)水稻白叶枯菌的培养：将-80℃冰箱中保藏的水稻白叶枯菌菌株PXO71、PXO99和PXO112菌株取出，分别在NA培养基上划线，于28℃黑暗培养2-3天；挑取较大的单菌落，重新划线转接于NA培养基上，再次28℃黑暗培养2-3天；轻轻刮取培养基上的菌落溶解于无菌水中配制接种所需菌液，摇晃均匀并将浓度调至OD600＝1.0，获得水稻白叶枯菌菌株PXO71、PXO99和PXO112菌液，用于水稻白叶枯菌接种(剪叶法)。
(3)剪叶法接种：当温室(光周期为14h光照/10h黑暗，温度为28℃)中的水稻生长至60天时，用蘸取白叶枯菌液的剪刀剪去叶尖1-3cm，每株接种3-5片完全展开的叶片，避免接种黄叶。接种14天后测量病斑长度，具体根据发病情况而定。
稻瘟菌菌株接种
(1)稻瘟菌生理小种TH12菌液接种：
(3)喷雾法接种：将野生型(粳稻品种Taichung65(TC65))和突变体spl38水稻种子脱壳后，75％酒精消毒30秒，然后1％次氯酸钠消毒15分钟左右，无菌水清洗3-4遍后，接种在1/2MS培养基上发芽和长苗，7天后移栽到装有无土基质的小塑料盆(8cm×7cm，高×直径)中；待水稻苗长至三叶一心时，将其放在大的塑料收纳箱中，随机选取野生型水稻(粳稻品种Taichung65(TC65))和突变体spl38各20株，用上述准备好的稻瘟菌生理小种TH12菌悬液均匀喷施至不同植株的每一片叶子上，稻瘟菌生理小种TH12菌悬液用量为0.5ml/株，然后保险膜将塑料收纳箱封口，将其在28℃，湿度≥80％室内条件下黑暗处理24小时；然后恢复正常光照，7天后调查发病情况。同时，野生型和突变体spl38剪取相同长度带病斑叶片提取DNA，利用qRT-PCR方法检测稻瘟菌28S rDNA与水稻OsActin1基因DNA含量比值，以指示稻瘟菌的相对生物量，以此量化比较野生型和突变体spl38对稻瘟病的抗性水平。
(2)稻瘟菌生理小种CH131菌液接种：
操作同上。
(3)稻瘟菌生理小种CH199菌液接种：
操作同上。
结果发现野生型叶片上的病斑数量和大小显著多于突变体spl38，说明突变体spl38对稻瘟病的抗性显著增强(图2中a-d)。
水稻白叶枯病菌株接种
(1)水稻白叶枯病菌株PXO71菌液接种：
剪叶法接种：将野生型(粳稻品种Taichung65(TC65))和突变体spl38水稻种子脱壳后，75％酒精消毒30秒，然后1％次氯酸钠消毒15分钟左右，无菌水清洗3-4遍后，接种在1/2MS培养基上发芽和长苗，7天后移栽到装有无土基质的小塑料盆(8cm×7cm，高×直径)中；在光周期为14h光照/10h黑暗，温度为28℃的环境下培养至60天时，随机选取野生型水稻(粳稻品种Taichung65(TC65))和突变体spl38各20株，用蘸取上述制备的水稻白叶枯菌菌株PXO71菌液的剪刀剪去不同植株叶尖1-3cm，每株接种3-5片完全展开的叶片，避免接种黄叶。接种14天后测量病斑长度，具体根据发病情况而定。
(2)水稻白叶枯病菌株PXO99菌液接种：
操作同上。
(3)水稻白叶枯病菌株PXO112菌液接种：
操作同上。
结果发现突变体spl38叶片的病斑长度明显缩短，抗性明显优于野生型(图2中e-h)。这些结果表明突变体spl38既显著提高对真菌病害的抗性，也显著提高对细菌病害的抗性。
相关基因表达的检测
利用qRT-PCR方法检测了野生型和突变体spl38中6个防御相关基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR10、OsNPR1、OsWRKY45和OsAOS2的表达情况。以水稻OsActin1基因作为内参，qRT-PCR引物见表1，qRT-PCR反应体系及PCR程序参照ChamQ Universal SYBR qPCR MasterMix试剂盒(Vazyme，#Q711-02)，使用罗氏LightCycler480定量PCR仪进行检测。结果显示，与野生型相比，6个基因的表达量在突变体spl38中均显著上调(图3)，目的基因的突变激活了体内防御相关基因的表达。
表1防御相关基因的qRT-PCR引物
Figure BDA0004059493310000161
Figure BDA0004059493310000171
实施例3：OsMED16基因的定位和克隆
对上述实施例1所获得的突变体spl38进行遗传分析，将突变体spl38和籼稻品种Dular进行杂交获得F1，之后自交获取F2分离群体。F1中所有个体均表型正常，说明spl38受隐性核基因控制。F2中出现类病斑表型与正常表型的分离，在138个F2单株个体中，正常表型与类病斑表型的植株的比例为102:36。经卡方检验符合3:1的分离关系(表2)，表明突变体spl38的类病斑表型是由1对单隐性核基因控制，符合孟德尔遗传定律。
表2突变体spl38的遗传分析
Figure BDA0004059493310000172
利用本实验室保存的均匀分布于水稻12条染色体的217对插入/缺失(InDel)标记和简单序列重复(SSR)标记，对两个亲本spl38和Dular进行多态性分析，筛选到120对标记具有多态性，将这些标记用于突变基因的初步定位。在F2群体中选取90株类病斑表型单株并用CTAB法提取DNA，构建DNA混池。利用两亲本间具有多态性的标记，对混池的基因型进行分析，筛选与spl38突变位点连锁的标记。结果在第10染色体长臂上筛选到M8和M9两个连锁标记，遗传距离约10.0cM(图4a)。在初定位的M8和M9两个标记之间，开发新的InDel标记(表3)。利用1652个F2群体植株进行进一步的精细定位，将目的基因定位在IN28和IN8之间大约44.09kb的区间内(图4b)。
表3基因定位所用分子标记
Figure BDA0004059493310000181
根据水稻基因组数据库(Rice Genome Annotation Project)进行分析，发现该区间有6个开放阅读框(ORF)(图4b)。利用PCR方法将突变体spl38和野生型TC65中这6个基因所在的基因组序列扩增出来并测序分析，发现在LOC_Os10g35560第7个外显子第3320位核苷酸发生点突变，即由G变为A，导致编码氨基酸由甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)(图4c)，但是其他5个0RF的序列和野生型完全一致，因此将其定为目标基因的候选基因。
其蛋白质序列如序列5(SEQ ID No.5)所示。
序列5序列具体如下：
MTSSSAPNPSPLVPTPTPSPPTANAAAAAAGAVPVSSPTPPPKDQQQEGQGGGGGVGDGGGVEEVGVGGGEAMEVDGGAGGGGGGVGDVEGGGGGGGAGGGGGGGGGGQQASPATVFRIRLKQPPSSLRHKMRVPELCRNFSAVAWCGKLNAIACASETCARIPSSNSSPPFWIPIHILNPERPTECSVFNVKADSPRDFVQFIEWSPRSCPRALLVANFHGRITIWTQPTKGPTNLVRDASSWQCEHEWRQDLSVVTKWLSGISPYRWLPANSSTSSNLKTFEEKFLTQQPQSSAGWPNILCVCSVFSSGSVQLHWSQWPSQNSAQPRWFSTSKGLLGAGPSGIMAADAIITETGALHVAGVPLVNPSTVVVWEVMPGLGNGIQATAKINATSSLPPSLNPPLWAGFAPLASYLFSLQDYLVSEGAQTKKQAQVDNETTEVASIHCCPVSNFSAYVSPEAAAQSATTTTWGSGVTSVAFDPTRGGSVITVVIVEGQYMSPYDPDEGPSITGWRVQCWESSVQPVVLHPIFGSPANFGGQPPTQTVWSTRVNKSIPPSEDLKNPQSYVPMPTTSDERSSSECSVDRANRLSFDPYDLPNDVRQLAQIVYSAHGGEVAVAFLRGGVHIFSGPNFEQVDSYHVNVGSAIAPPAFSSSGCCLASVWHDTLKDRTILKIIRVLPPAILNAQTKVSSAVWERAIADRFWWSLLAGVDWWDAVGCTQSAAEDGIVSLNSVIALLDADFHCLPTIQQRQQHCPNLDRIKCRLLEGTNAQDVRALVLDMQARLLLDMLGKGIESALINPSTLLPEPWQASSDMLSSIGPDKMTVDPALLLSIQGYVDAVLDLASHFITRLRRYASFCRTLASHAVGASSGSGNSRNMVTSPTNSSPSPSTNQGNQGGVASTTGSSQMQEWVQGAIAKISNNTDGAANAAPNPISGRSSFMPISINTGTFPGTPAVRLIGDCHFLHRLCQLLLFCLLFRRRQSPRIPANAQKSSDSSMQKQHLMNSKTEDNTLAVRSGLGAAKLEDGTTSRGQMVGAKGAEENPVGNKSARIGSGNAGQGYTSDEVKVLFLILVDLCKRTATLQHPLPSSQVGSSNIIIRLHYIDDNYTVLPEVVEASLGPHMQNMPRPRGADAAGLLLRELELQPPAEEWHRRNMFGGPWSEPDDLGPLDNTRQLKINGSTNRHLSDMEEDGDSSFGIQNLWPRKRRLSERDAAFGLKTSVGLGSFLGVMGSRRDVITAVWKTGLEGEWYKCIRCLRQTCAFAQPGALAPNTSNELEAWWISRWTHACPMCGGTWVKVV。
上述蛋白质的CDS序列如序列4(SEQ ID No.4)所示，具体如下：
ATGACCTCTTCCTCCGCCCCAAACCCTAGCCCCCTCGTCCCCACCCCCACCCCCTCTCCCCCCACCGCCAACGCCGCCGCCGCCGCCGCCGGAGCCGTGCCCGTCTCCTCGCCGACGCCGCCGCCCAAGGATCAGCAGCAGGAGGGCCAGGGGGGTGGAGGAGGAGTGGGGGATGGGGGTGGAGTGGAGGAGGTGGGCGTAGGGGGAGGCGAGGCCATGGAGGTGGATGGTGGCGCGGGAGGTGGTGGTGGGGGGGTTGGGGATGTGGAGGGGGGTGGGGGTGGTGGTGGTGCGGGGGGAGGAGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGGCAGCAGGCGTCGCCGGCGACCGTGTTCCGGATCCGGCTCAAGCAGCCGCCCTCGAGCCTCCGCCACAAGATGCGCGTGCCCGAGCTCTGCAGGAACTTCAGTGCAGTTGCTTGGTGCGGGAAGCTCAATGCAATTGCATGCGCATCAGAGACTTGTGCACGCATACCAAGCTCTAATTCAAGCCCACCATTTTGGATTCCCATACACATTCTAAATCCAGAGAGACCAACAGAATGTTCTGTTTTCAATGTGAAAGCAGATTCTCCACGCGACTTTGTTCAATTCATTGAATGGTCTCCTCGATCATGCCCTCGTGCATTACTGGTGGCAAATTTTCATGGAAGGATTACTATATGGACACAGCCAACTAAGGGTCCTACTAATCTTGTACGTGATGCCAGTTCCTGGCAATGTGAACACGAATGGCGTCAAGATCTTTCGGTGGTGACTAAGTGGTTGTCAGGAATTTCTCCGTATAGATGGCTTCCTGCAAACTCTAGTACTTCATCAAACTTGAAAACCTTTGAGGAAAAGTTCCTTACCCAGCAGCCTCAAAGTTCGGCTGGGTGGCCAAACATTCTATGTGTCTGTTCAGTTTTTTCATCGGGTTCTGTTCAGCTTCATTGGTCACAATGGCCTTCTCAAAACTCAGCACAACCTAGATGGTTTTCTACTAGCAAAGGGCTTTTAGGAGCAGGGCCAAGCGGCATAATGGCTGCTGATGCTATTATTACTGAAACTGGAGCATTACATGTTGCTGGTGTTCCCCTTGTTAATCCATCTACTGTAGTGGTTTGGGAGGTGATGCCAGGCCTTGGCAATGGTATTCAGGCAACTGCAAAGATAAATGCAACAAGCTCTCTTCCTCCATCACTAAATCCCCCACTCTGGGCTGGTTTTGCTCCACTTGCATCTTACCTCTTCTCTTTGCAAGACTACCTTGTTTCCGAGGGCGCACAGACAAAAAAACAGGCACAGGTAGATAATGAGACCACTGAGGTAGCATCGATCCATTGTTGTCCAGTTTCCAACTTTTCAGCTTACGTCAGTCCTGAAGCTGCTGCCCAGTCAGCCACTACCACAACATGGGGATCTGGGGTTACCTCAGTTGCTTTTGATCCCACTCGAGGGGGATCAGTTATTACAGTTGTAATAGTTGAAGGGCAGTACATGTCTCCTTATGATCCTGATGAAGGACCTTCCATCACTGGATGGAGAGTCCAGTGCTGGGAATCTTCAGTCCAACCTGTTGTTCTTCATCCAATATTTGGAAGCCCTGCAAACTTTGGTGGACAGCCACCTACACAGACTGTTTGGTCCACAAGAGTTAACAAAAGCATCCCACCATCTGAGGACCTTAAGAACCCTCAATCATATGTTCCAATGCCAACAACTTCAGATGAGCGGAGTTCTTCTGAGTGCAGTGTTGACAGGGCGAACCGACTTAGCTTTGACCCTTATGATCTTCCAAATGATGTCAGACAATTGGCCCAAATAGTTTATTCTGCTCATGGTGGTGAGGTTGCAGTTGCATTCCTGCGTGGAGGTGTGCACATTTTTTCAGGTCCAAACTTTGAACAGGTTGATAGCTATCATGTCAATGTTGGCTCAGCAATTGCTCCACCAGCCTTCTCCTCCAGTGGTTGTTGCTTGGCATCAGTATGGCATGACACACTCAAAGATCGAACCATACTAAAGATAATACGTGTGCTTCCTCCTGCAATTCTTAATGCTCAGACAAAGGTTAGCTCAGCTGTTTGGGAACGAGCAATAGCAGATAGATTTTGGTGGAGTCTATTGGCTGGTGTGGATTGGTGGGATGCTGTTGGCTGCACACAAAGTGCTGCTGAAGATGGTATTGTCTCACTGAACAGTGTGATAGCTTTGCTGGACGCGGACTTCCATTGTCTTCCAACTATACAACAGAGGCAACAACACTGTCCTAATCTTGATAGGATAAAGTGTAGATTGTTGGAAGGAACAAATGCTCAAGATGTCAGAGCACTTGTGTTGGACATGCAAGCAAGATTGCTTCTGGATATGCTTGGCAAGGGAATTGAGTCTGCCCTGATAAATCCATCAACTCTGCTACCTGAACCGTGGCAAGCTTCCAGTGACATGTTATCTAGCATTGGGCCTGACAAAATGACTGTTGACCCAGCTCTACTTTTAAGCATCCAGGGGTACGTTGATGCTGTTCTAGATTTAGCGTCACATTTTATCACACGCTTGCGACGCTATGCGAGCTTCTGCCGAACTTTGGCTAGCCATGCAGTTGGAGCATCTTCTGGTTCAGGCAATTCTAGGAATATGGTTACAAGTCCAACCAACAGTTCTCCTTCACCTTCAACTAACCAAGGTAATCAAGGTGGAGTAGCGTCTACAACAGGGAGCTCACAAATGCAAGAGTGGGTCCAAGGTGCCATTGCTAAGATTAGTAACAATACTGATGGTGCTGCAAATGCTGCACCAAATCCAATTAGCGGGAGGTCATCATTCATGCCTATTAGCATAAATACGGGAACATTCCCTGGCACACCAGCTGTTAGACTTATTGGGGACTGCCATTTCCTTCATAGATTATGTCAGCTGTTGCTATTTTGTTTGCTTTTTCGGAGAAGGCAATCTCCAAGGATACCTGCAAATGCACAAAAAAGTTCTGATTCTAGCATGCAGAAACAACACTTGATGAACAGTAAGACAGAGGATAATACTTTGGCAGTCAGATCTGGTCTAGGTGCTGCCAAATTGGAAGATGGCACAACTTCACGTGGACAGATGGTTGGAGCAAAGGGTGCTGAAGAAAATCCAGTGGGCAACAAATCTGCTAGGATAGGTTCTGGCAATGCTGGCCAAGGTTATACTTCAGACGAGGTGAAAGTCCTTTTTCTCATATTAGTTGACCTATGTAAACGGACTGCAACCTTGCAACATCCGTTGCCTTCTTCTCAGGTTGGTTCGAGCAATATTATTATAAGGCTGCATTACATCGATGACAATTACACTGTGCTCCCTGAGGTAGTGGAAGCATCTCTTGGCCCTCATATGCAGAATATGCCTCGTCCACGTGGAGCTGATGCTGCTGGCCTTCTACTTCGAGAATTAGAACTGCAGCCCCCTGCTGAAGAATGGCATAGACGCAACATGTTTGGTGGGCCATGGTCAGAACCAGATGATCTTGGTCCATTGGATAATACGCGACAGCTAAAAATCAATGGCTCTACCAATCGCCACTTATCGGACATGGAAGAGGATGGCGACAGCTCCTTTGGGATTCAAAATCTTTGGCCAAGAAAGCGCCGGTTGTCTGAAAGAGATGCAGCATTTGGTCTGAAAACATCCGTGGGGCTGGGATCTTTTCTAGGTGTGATGGGTTCTCGGAGAGATGTTATTACAGCTGTGTGGAAAACAGGCCTCGAAGGTGAATGGTACAAGTGCATACGATGTTTGAGGCAAACCTGTGCATTTGCTCAGCCTGGTGCTCTAGCTCCGAACACGTCGAATGAGCTTGAGGCATGGTGGATCAGCCGATGGACCCATGCTTGCCCAATGTGCGGTGGGACATGGGTGAAAGTCGTTTGA。
上述蛋白质的基因组序列如序列6(SEQ ID No.6)所示，具体如下：
CCTCCCTCTGACTCTCTCCCCGTCGTCGTCATCGTCATCGTCGTTCGTCGTCGTCGTCTCCCCTTTCCACGGCCGCATCCCATTCCCCACCCAACCTGAAAGCGACGCCGCCGCAGCGCACACGCAGGAGGCAGCAGCAAAGCGAGGAGGGGAGGAAACCCTCCCCCCGCGACAGCAACGGGCGGTCGCTTCCAGTGACCTAAGCCTCCCCCTCCCCCCCTCGCGCGCGCTTCCCTCCCCTTCGCCTTTTTGTCTCCTCCGCCCCTTATGACCTCTTCCTCCGCCCCAAACCCTAGCCCCCTCGTCCCCACCCCCACCCCCTCTCCCCCCACCGCCAACGCCGCCGCCGCCGCCGCCGGAGCCGTGCCCGTCTCCTCGCCGACGCCGCCGCCCAAGGATCAGCAGCAGGAGGGCCAGGGGGGTGGAGGAGGAGTGGGGGATGGGGGTGGAGTGGAGGAGGTGGGCGTAGGGGGAGGCGAGGCCATGGAGGTGGATGGTGGCGCGGGAGGTGGTGGTGGGGGGGTTGGGGATGTGGAGGGGGGTGGGGGTGGTGGTGGTGCGGGGGGAGGAGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGGCAGCAGGCGTCGCCGGCGACCGTGTTCCGGATCCGGCTCAAGCAGCCGCCCTCGAGCCTCCGCCACAAGATGCGCGTGCCCGAGCTCTGCAGGAACTTCAGGTGCGTTTCGAGATTAGTTGTGGTTTTTTTGGGGGTGTTTTTTCTTTCTGGGATTTAAATATGTTGGGGGAAGCTTAGGTGTGATGAATTTAAACCCTGATCTGTTTCAGCTTATTCATCGATTTATTGAAATGGTTTTTTTCCCCCCGAAAGAAATTTTCCTCTACTGTATTGCTTAGACCACTTGTTTTAAGCTATTTGTTAAGTTTGTCTCTCAAAATATCTAATTTATCCCTATAATATATCCATGACAATAATCCACTCAATAATCTAAATCAAACGATCTGGGTTTACTTTTTTTTTCCTCTTCAAATTTGGGTGGCGTTTCAATGATTGGGATGAACAATCTAGTGACTCAAACTTGCAGAAGCATTAGCGTGGGCATGGAATTGTGATTGCTTTGAATGATTGTATCCTGTGCAGGCTTCTACTATACTAGATCAAATACAGTTATAACATGTAGTGTCATTATTTCACATAACTAAGTTTAGTCAGGTCAAACTGGTTACTTTGTTCACCAGTTAGAAAATACCGAACGTGATAACTCCATTTTTAAAATCCACATTATTTTTTTTTGTTTAAAACTGCTTTGATCTTGTAGGATGAGGTTGCCTTGTCTGCTTTAGCCTACACTATATCGGGAACAACTAGTAACTATCTTATCTATGGTTTTTTTTTTATTGCAGTGCAGTTGCTTGGTGCGGGAAGCTCAATGCAATTGCATGCGCATCAGAGACTTGTGCACGCATACCAAGGTATACATTTTTCCATCCTTTCCCTGAAAATTTACTTTCCTCTGACCTTTAGTTATCCATAAATAAGTTTGTTCTGTTAGCTTGTCTTAGTGGGATATTCAACCATTTGGTAGAATTGTTTGCTTACAGTTTCTGGTTATGAAGGTTTCTTTGCCGTAAAACGATCTAATGTATATTTTCAGCTCTAATTCAAGCCCACCATTTTGGATTCCCATACACATTCTAAATCCAGAGAGACCAACAGAATGTTCTGTTTTCAATGTGAAAGCAGGTAATCCATGGCTAAATCTCAATTGTTTTGGTAATGTGATTACGTTATGCATGTGCAAATCACTGTCCATTGGGCATTTTATAGTCAGGTGAAGGGTGAGATTCAAACTCACTTTTGTTTATATACGAGTTTTTCTACCTCCAATCCTAACTCACTGTAATTTTGAACAGATTCTCCACGCGACTTTGTTCAATTCATTGAATGGTCTCCTCGATCATGCCCTCGTGCATTACTGGTGGCAAATTTTCATGGAAGGATTACTATATGGACACAGCCAACTAAGGTACATCTCTACCTTAAGCAAATTTCGGTATGCATATCATTTTTTTTTGTTAGTAGTACCATTGAACTTACTTTGTTAATTTGCGAAACACTCAGGATTTTCTTTTTTCATTTCAAGTCTATATACATATCATGCTGTTTTGTGTTTTTTCTCTAATACTTGTTTCTTTCTTGATATGGTGAAGGGTCCTACTAATCTTGTACGTGATGCCAGTTCCTGGCAATGTGAACACGAATGGCGTCAAGATCTTTCGGTGGTGACTAAGTGGTTGTCAGGAATTTCTCCGGTTTGTTGCCAATTTGCAAACTTACAGTCTGCTTCTCTTGTTTTTGATAATTAGCACTTTACACTTGGAATGCAAATATGCAATACGATTGACCCAGCAGTTTATACAGTCCGCTTCACAATTTAACATTCGAGATTTATATACTTTTCAGTGTCAATTGTTAATCATTATTTTTTTAAAATATAATATTTTATAAAGCAGTGACAATAGACTTGAGTTTAAACTGTTCTAAGATTTTTTCACTGGACATTTATCATAAACAATTGCAACAATTAGGTAAAAAAGATTCTGGCTCAGTTTATGTCTGAGTAAGTACTTTGATCTATTTCAAATGACACTACCTGTGTTTGATTACCCTTTTGGCCTGAAATAAGTGGATCTTAGAATCGAAGGAATATAATTACTAAGCTGTTGCCACGGCTAAATTTGTTTTGTTTCTTTGACTTTGCAGTATAGATGGCTTCCTGCAAACTCTAGTACTTCATCAAACTTGAAAACCTTTGAGGAAAAGTTCCTTACCCAGCAGCCTCAAAGTTCGGGTTGGTTAAACACATATATTACTGAGCATATATTTTTTTTGGAGGAGAAAGCAAGCATGCTTCTTTACGCTACTCTGACATATTGCTGTTTACTGCAGCTGGGTGGCCAAACATTCTATGTGTCTGTTCAGTTTTTTCATCGGGTTCTGTTCAGCTTCATTGGTCACAATGGCCTTCTCAAAACTCAGCACAACCTAGATGGTTTTCTACTAGCAAAGGGCTTTTAGGAGCAGGGCCAAGCGGCATAATGGCTGCTGATGCTATTATTACTGAAACTGGAGCATTACATGTTGCTGGTGTTCCCCTTGTTAATCCATCTACTGTAGTGGTTTGGGAGGTGATGCCAGGCCTTGGCAATGGTATTCAGGCAACTGCAAAGATAAATGCAACAAGCTCTCTTCCTCCATCACTAAATCCCCCACTCTGGGCTGGTTTTGCTCCACTTGCATCTTACCTCTTCTCTTTGCAAGACTACCTTGTTTCCGAGGGCGCACAGACAAAAAAACAGGCACAGGTAGATAATGAGACCACTGAGGTAGCATCGATCCATTGTTGTCCAGTTTCCAACTTTTCAGCTTACGTCAGTCCTGAAGCTGCTGCCCAGTCAGCCACTACCACAACATGGGGATCTGGGGTTACCTCAGTTGCTTTTGATCCCACTCGAGGGGGATCAGTTATTACAGTTGTAATAGTTGAAGGTGCGTATATGACACCTGGGAAATGAATTAGTATGATGCAATTGTCACATCTCACTATGACTATTTGTTTCTGATGAATGGCATGAACATCAATGCCATTCATAATCACCACACTAATCCTATGATCATCCAACAGCTTTAATAGTAGGAGAGTTAATCTAACTATGTATGTCCAGAGCATGCTTATACATGTTTTAGCTCCCTTTAGTTGCTTTTGTTGTTTCTTTGATTTGCTCTGGTAGCTTGTGCCATGGTAATAAAAGTTCTTGTCTGTAAATGCTATATGCATATTCTTTTAAGGACTTTTGGGGTCTCTGAAATTTATTAAGTGAATCGGTTGATCTTAGGCTCTTGGCTAATGCTTATTTATTTTTTCTGACAATTGTTAAACCACATACTTCCAGGGCAGTACATGTCTCCTTATGATCCTGATGAAGGACCTTCCATCACTGGATGGAGAGTCCAGTGCTGGGAATCTTCAGTCCAACCTGTTGTTCTTCATCCAATATTTGGAAGCCCTGCAAACTTTGGTGGACAGCCACCTACACAGACTGTTTGGTCCACAAGAGTTAACAAAAGCATCCCACCATCTGAGGACCTTAAGAACCCTCAATCATATGTTCCAATGCCAACAACTTCAGATGAGCGGAGTTCTTCTGAGTGCAGTGTTGACAGGGCGAACCGACTTAGCTTTGACCCTTATGATCTTCCAAATGATGTCAGACAATTGGCCCAAATAGTTTATTCTGCTCATGGTGGTGAGGTTGCAGTTGCATTCCTGCGTGGAGGTGTGCACATTTTTTCAGGTCCAAACTTTGAACAGGTTGATAGCTATCATGTCAATGTTGGCTCAGCAATTGCTCCACCAGCCTTCTCCTCCAGTGGTTGTTGCTTGGCATCAGTATGGCATGACACACTCAAAGATCGAACCATACTAAAGATAATACGTGTGCTTCCTCCTGCAATTCTTAATGCTCAGACAAAGGTTAGCTCAGCTGTTTGGGAACGAGCAATAGCAGATAGGTATCCACCCAAGTTAACAGAGGTTGATTGAAATGATTTATTTGTTGAAAATGTTTTTTTTTATAACTGCGATCTTTTTAGCAGATTTTGGTGGAGTCTATTGGCTGGTGTGGATTGGTGGGATGCTGTTGGCTGCACACAAAGTGCTGCTGAAGATGGTATTGGTAAGGATGCTTATGCAGATGCAATTTAAAATTTGTGTATAGTATTTGCATTTCAATTGTGTTCTAGCTGTCCACACAATTAGAAAAGTAGGGATTATCTGCTACACGGTAGAATTTCCACAACTGTCACTCAACCTCTTAAAGTATATACTTCCTCCGTTTCATAATGTAAGTCATTCTAGCTTTTTCCACATTCATATTGATGTTAATGAATCTAGATAGATATATATGTCTAGATTCATTAACATCAATATGAATGTGGAAAATGTTAGAATGACTTACATTGTGAAACGGAGGGAGTAATTAAGAACAGTGTAACCAAGCAAATCTCTGTTTGGTTGTTTATAATGTTAAGACTTTAGAGCTGATTGCACATTTATGCTCCCAATTTGAAAGCATTGTGCATCTGCAGTATGATGAATTGTGTTTTGCTTCATTTTTCCCATTTGGATGTCTCAATATGTTAACATTATTTCCTGGTGTGAGTTGCAATACATCTTTTTAAGCTGATACAGAACTTTTCAGTAAGTTTCATCATTTTCTACATATGGTTGGTTAACTATTTCAGCACCTGTAACATTTATATTTGTCCATGATAAACTAAATCTCTTGCTTTTCCTTCCAGTCTCACTGAACAGTGTGATAGCTTTGCTGGACGCGGACTTCCATTGTCTTCCAACTATACAACAGAGGCAACAACACTGTCCTGTAAGTGTGCTGTGCTTTTAGTACATTATGTGCAGTTTTAAGCACAGGCCTTCAATTTTTCATCATCTACTGCCTACTGCCATTACTATGTGACATGCATGTCACAATATCTTTTTGGGTTCTTAAAGATTGTACATTCACCAATCACCAGTCTTTATTCCACCAGTAGTTGAAAGGGGGATACGAATCAAAATATAATCAAGATGACTTTTTTCCTTTTCTTTCCTGGACATAGTTTTTTAGTATTCTTGTGACAAGTCACTAGCACTGCTTTGCAGTTCTGAATGAACATTTTAGCATGAAGCTTGCCAAACTTTTCTATGAACATAAATTATATCTCTGGATGTATTGGTCAGAGACCATTTACGGTAGTATGTAGTTTGCTACTTTATTCATAATGCAATATATTGTAATTTGTGAGTTGGACAAGATTTGTTTTTCTAATTGTGTGTTTACCTTTTACTTCAGATTTTGAGGACTTGAAGTTGCAAGGCTATTGCTTTCTTCTGTTACTGATTAGTCTATTTTACTTATTGCAGAATCTTGATAGGATAAAGTGTAGATTGTTGGAAGGAACAAATGCTCAAGATGTCAGAGCACTTGTGTTGGACATGCAAGCAAGATTGCTTCTGGATATGCTTGGCAAGGGAATTGAGTCTGCCCTGATAAATCCATCAACTCTGCTACCTGAACCGTGGCAAGCTTCCAGTGACATGTTATCTAGCATTGGGCCTGACAAAATGACTGTTGACCCAGCTCTACTTTTAAGCATCCAGGTATACTGTGTTTCATGTTCTTTTGATTTCCTGGTCCACAGTTTCAGTTCAATTTGCTAATCTCGTTTTCCTTTTTTTGGCTATAGACTTAATATGGGCAAATGATGTTGCAAACCTTTTTGAATGATAAGCTATTTGTAAACCACAACCTATTCATGCATGAGGATGAGGCATGATATGCCACAGATTAACCATGCCATGTATGGAATTTACAGTATTTACAGCAGTATTTTGCTGTTTTTATGTTCCAAACCGACTACGATTCAAACAGCCTCCAGATAGCTTTCATCATAAGCTTTGCTCCTAGGTGTGCAGGAATTATGCTCAGCCCATCAACTGCCTCCAATGCCTTAGCAATTTGTGCACACATTTCAGCATAAGCGGTCTGCATATGAACTTTCATGTTACTATTTTGTGGATTTAATTTTTTTTTGAACATGGACTGCAGGGGTACGTTGATGCTGTTCTAGATTTAGCGTCACATTTTATCACACGCTTGCGACGCTATGCGAGCTTCTGCCGAACTTTGGCTAGCCATGCAGTTGGAGCATCTTCTGGTTCAGGCAATTCTAGGAATATGGTTACAAGTCCAACCAACAGTTCTCCTTCACCTTCAACTAACCAAGGTTAATTTTGATTCCGTCTATCTTGCTAAAGCTTGTGCTTTTTTTTTTGGTGCTAAATAAAACCACCTATGAATTATTTGTTTCTTTATTTAATTTTTTGGAAAATGACAAGTTGCTGGCACATTTCAAACTTAGCAATGATGCTAATGTTTCAGGTAATCAAGGTGGAGTAGCGTCTACAACAGGGAGCTCACAAATGCAAGAGTGGGTCCAAGGTGCCATTGCTAAGATTAGTAACAATACTGATGGTGCTGCAAATGCTGCACCAAATCCAATTAGCGGGAGGTCATCATTCATGCCTATTAGCATAAATACGGGAACATTCCCTGGCACACCAGCTGTTAGACTTATTGGGGACTGCCATTTCCTTCATAGATTATGTCAGCTGTTGCTATTTTGTTTGCTTTTTCGGAGAAGGCAATCTCCAAGGATACCTGCAAATGCACAAAAAAGTTCTGATTCTAGCATGCAGAAACAACACTTGATGAACAGTAAGACAGAGGATAATACTTTGGCAGTCAGATCTGGTCTAGGTGCTGCCAAATTGGAAGATGGCACAACTTCACGTGGACAGATGGTTGGAGCAAAGGGTGCTGAAGAAAATCCAGTGGGCAACAAATCTGCTAGGATAGGTTCTGGCAATGCTGGCCAAGGTTATACTTCAGACGAGGTAACAAACAAATAACCCATAAATATGGATTTTCTCAGCCTGAATTGTTCAATAAGAAAACTTTTTTCAATCTGAAAATAGTGATAGTTATACATATAACAGTATTTTTGTATGTGCGCTTCGACATCAATATCTAGCCTGTATTGTTTCTGAATCAACATTTAGATTAGAGCTGTTATATAGTGTGGTTATATGTCTGCATATCATATATCATGTGTGTGTCTAAATTGTTTGCAAGTGCCATATGATTAAGGGTAATTAGACATGATTGGATAATTTACCTAGTATAATCTTTGATCGGTGATTTGCCCGACATGTTTCTCCCGATTTTATTAGTTGCCTTTCTGAAAGTATTATTTGTGTAGCACTGTAATACATCTAGTTTCTGAATTATTTGTTTCATGCTTGCAGGTGAAAGTCCTTTTTCTCATATTAGTTGACCTATGTAAACGGACTGCAACCTTGCAACATCCGTTGCCTTCTTCTCAGGTTGGTTCGAGCAATATTATTATAAGGCTGCATTACATCGATGACAATTACACTGTGCTCCCTGAGGTAGTGGAAGCATCTCTTGGCCCTCATATGCAGGTACAATACAGATTTATTGTGGAAGTTTATTTCTGTATTCTCTGTGTACTCATTAGAGCATTCAATGTTCTCTTCTCAGCAATACATTATAGTAATTCTCAATTGTGTTGGAGAAATAGAGATATAGTATTTTGCAAGTTCTACTCTACTTACCTGGGTTAACGATGGATTGATCCAGCAAAAGAATATTGTTGTCCAAGTTAATTATGGAAATTTTCATTTATACAAGCACACGTGCATAATTGGTTTTTATGATTTCTTTTGTTCATACGTTCTCCATCTGCCTATATAATTTATTACTCATGGCCTCAGCGCCCTCTTGTCACCATTTAGGAGTTCTCATTTTCATCAGCATGTACATCTTTGGTAAGAGTAGTGAGCATGTACATGTCCAACAAGAGCTGTGTACACGCATTTCTGTCGAGAATTTATACCAATGTTGCCCATTTGTTCCAATATTTATTGCAGAATATGCCTCGTCCACGTGGAGCTGATGCTGCTGGCCTTCTACTTCGAGAATTAGAACTGCAGCCCCCTGCTGAAGAATGGCATAGACGCAACATGTTTGGTGGGCCATGGTCAGAACCAGATGATCTTGGTCCATTGGATAATACGCGACAGCTAAAAATCAATGGCTCTACCAATCGCCACTTATCGGACATGGAAGAGGATGGCGACAGCTCCTTTGGGATTCAAAATCTTTGGCCAAGAAAGCGCCGGTTGTCTGAAAGAGATGCAGCATTTGGTCTGAAAACATCCGTGGGGCTGGGATCTTTTCTAGGTGTGATGGGTTCTCGGAGAGATGTTATTACAGCTGTGTGGAAAACAGGCCTCGAAGGTGAATGGTACAAGGTAAGCATACTTGATAGTAGTAGTCTCTAACTTCAGTATTCTTTCAGAATTAATTATCGACGCACTCTATCCAATTCACCATTTGCCGTGACACCGAGACATGCTATCTTTTGCAGTGCATACGATGTTTGAGGCAAACCTGTGCATTTGCTCAGCCTGGTGCTCTAGCTCCGAACACGTCGAATGAGCTTGAGGCATGGTGGATCAGCCGATGGACCCATGCTTGCCCAATGTGCGGTGGGACATGGGTGAAAGTCGTTTGAATTTGACGCCTCCGGGCGACACCTTCACCGTACTAACCACTCTGCCAATAGCTTTCTCGGCCAAATCTGTGTAGGCGCCATCGGTTTTTGGACAATTTTGTATCTAACTTTAGATTGTTTGGTCTCAGGCCCTCCCTGGTATGGTATCATAGTTTACCTGCAGCAGTCAGAGCAGATTGCACCAGCAGCTGTGTAAAACGGTAGGAAAAAACAGGATTAGGACATGCCCAAACACTGTCAGAGTCAGCAGTTGTGTTGTGCGATCCTTTTGTACATAAATGTAGTGTACTAATTTGCAACATTGGAAAAGAAACTCCGTTAGATACTGCTTGATGTCAATAATATTTGCTGGTGATTGAAAAGACCATGTATGTAATAGCATGTTCAATTGGGTGTTTCTCTCA。
由于LOC_Os10g35560基因编码了水稻中介体复合物亚基16，因此命名为OsMED16。
实施例4：OsMED16基因功能互补验证
根据日本晴参考序列，设计目的基因OsMED16的特异性引物(OsMED16-COM-F:TCCCTCTGACTCTCTCCCCG，OsMED16-COM-R:ATCTGCTCTGACTGCTGCAGG)。
以OsMED16-COM-F/OsMED16-COM-R为引物，以野生型TC65的基因组DNA为模板扩增OsMED16基因的包括启动子在内的基因组DNA片段，称作DNA片段1，利用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(Vazyme)将其连接到pCAMBIA1300载体上，获得重组载体pCAMBIA1300-OsMED16-COM。
重组载体pCAMBIA1300-OsMED16-COM是将核苷酸序列是正常OsMED16基因的基因组序列(序列3)第3位-第9371位的DNA片段1替换pCAMBIA1300载体(abcam公司)的限制性核酸内切酶KpnI和SalI识别位点间的片段，保持pCAMBIA1300载体的其它核苷酸序列不变，得到重组载体pCAMBIA1300-OsMED16-COM。
将上述重组载体pCAMBIA1300-OsMED16-COM转入农杆菌EHA105中。通过农杆菌介导的遗传转化方法转入突变体spl38成熟胚诱导的愈伤组织中，经过预培养、侵染、共培养、筛选等步骤，获得转基因植株并进行阳性鉴定。获得阳性植株spl38-C。
在上海的常规水稻种植季节(6月中旬)，将野生型(粳稻品种Taichung65(TC65))和突变体spl38和转基因互补植株(spl38-C)水稻种子在田间播种，10天左右后插秧，进行常规水肥管理；待水稻苗生长60天左右时，对植株大小、长势和叶片的类病斑表型进行观察，结果显示互补苗植株大小恢复到正常表型，叶片未出现类病斑(图5)，证明突变体spl38是由于OsMED16基因突变造成的。图5中：(a)左侧起第1株为野生型(WT)、2-3株为突变体(spl38)和4-5株为转基因互补植株(spl38-C)的植株表型；(b)左侧起第1株为野生型(WT)、2-3株为突变体(spl38)、4-5株为转基因互补植株(spl38-C)的叶片表型。
实施例5：OsMED16基因的表达模式
提取野生型TC65的根、茎、叶、叶鞘和圆锥花序组织的RNA，反转录为cDNA，通过qRT-PCR技术检测OsMED16基因的表达情况：引物如下所示，qRT-PCR反应体系及PCR程序参照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(Vazyme，#Q711-02)，使用罗氏LightCycler480定量PCR仪进行检。
结果显示OsMED16在茎、根、叶、叶鞘、圆锥花序中都有表达(图6)。
qRT-PCR所用的引物序列为：
OsMED16-F:GATGCTGTTGGCTGCACA；
OsMED16-R:TCCAGCAAAGCTATCACACTG；
OsActin1-F:CTGCGATAATGGAACTGGT；
OsActin1-F:ACAATGCTGGGGAAGACA。
实施例6：OsMED16及其突变体的亚细胞定位
提取野生型TC65和突变体spl38的RNA,反转录为cDNA，分别扩增正常OsMED16基因和其突变体的全长CDS序列，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)将其连接到中间载体pQBV3上，获得重组载体pQBV3-OsMED16和pQBV3-OsMED16M。重组载体pQBV3-OsMED16是将核苷酸序列为正常OsMED16基因的CDS序列(序列1)的DNA片段2替换pQBV3载体的限制性核酸内切酶EcoR32I和EcoR32I识别位点间的片段，保持pQBV3载体的其它核苷酸序列不变，得到重组载体pQBV3-OsMED16。
重组载体pQBV3-OsMED16M是将核苷酸序列为突变OsMED16基因的CDS序列(序列4)的DNA片段3替换pQBV3载体的限制性核酸内切酶EcoR32I和EcoR32I识别位点间的片段，保持pQBV3载体的其它核苷酸序列不变，得到重组载体pQBV3-OsMED16M。
序列1(SEQ ID No.1)具体如下：
ATGACCTCTTCCTCCGCCCCAAACCCTAGCCCCCTCGTCCCCACCCCCACCCCCTCTCCCCCCACCGCCAACGCCGCCGCCGCCGCCGCCGGAGCCGTGCCCGTCTCCTCGCCGACGCCGCCGCCCAAGGATCAGCAGCAGGAGGGCCAGGGGGGTGGAGGAGGAGTGGGGGATGGGGGTGGAGTGGAGGAGGTGGGCGTAGGGGGAGGCGAGGCCATGGAGGTGGATGGTGGCGCGGGAGGTGGTGGTGGGGGGGTTGGGGATGTGGAGGGGGGTGGGGGTGGTGGTGGTGCGGGGGGAGGAGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGGCAGCAGGCGTCGCCGGCGACCGTGTTCCGGATCCGGCTCAAGCAGCCGCCCTCGAGCCTCCGCCACAAGATGCGCGTGCCCGAGCTCTGCAGGAACTTCAGTGCAGTTGCTTGGTGCGGGAAGCTCAATGCAATTGCATGCGCATCAGAGACTTGTGCACGCATACCAAGCTCTAATTCAAGCCCACCATTTTGGATTCCCATACACATTCTAAATCCAGAGAGACCAACAGAATGTTCTGTTTTCAATGTGAAAGCAGATTCTCCACGCGACTTTGTTCAATTCATTGAATGGTCTCCTCGATCATGCCCTCGTGCATTACTGGTGGCAAATTTTCATGGAAGGATTACTATATGGACACAGCCAACTAAGGGTCCTACTAATCTTGTACGTGATGCCAGTTCCTGGCAATGTGAACACGAATGGCGTCAAGATCTTTCGGTGGTGACTAAGTGGTTGTCAGGAATTTCTCCGTATAGATGGCTTCCTGCAAACTCTAGTACTTCATCAAACTTGAAAACCTTTGAGGAAAAGTTCCTTACCCAGCAGCCTCAAAGTTCGGCTGGGTGGCCAAACATTCTATGTGTCTGTTCAGTTTTTTCATCGGGTTCTGTTCAGCTTCATTGGTCACAATGGCCTTCTCAAAACTCAGCACAACCTAGATGGTTTTCTACTAGCAAAGGGCTTTTAGGAGCAGGGCCAAGCGGCATAATGGCTGCTGATGCTATTATTACTGAAACTGGAGCATTACATGTTGCTGGTGTTCCCCTTGTTAATCCATCTACTGTAGTGGTTTGGGAGGTGATGCCAGGCCTTGGCAATGGTATTCAGGCAACTGCAAAGATAAATGCAACAAGCTCTCTTCCTCCATCACTAAATCCCCCACTCTGGGCTGGTTTTGCTCCACTTGCATCTTACCTCTTCTCTTTGCAAGACTACCTTGTTTCCGAGGGCGCACAGACAAAAAAACAGGCACAGGTAGATAATGAGACCACTGAGGTAGCATCGATCCATTGTTGTCCAGTTTCCAACTTTTCAGCTTACGTCAGTCCTGAAGCTGCTGCCCAGTCAGCCACTACCACAACATGGGGATCTGGGGTTACCTCAGTTGCTTTTGATCCCACTCGAGGGGGATCAGTTATTACAGTTGTAATAGTTGAAGGGCAGTACATGTCTCCTTATGATCCTGATGAAGGACCTTCCATCACTGGATGGAGAGTCCAGTGCTGGGAATCTTCAGTCCAACCTGTTGTTCTTCATCCAATATTTGGAAGCCCTGCAAACTTTGGTGGACAGCCACCTACACAGACTGTTTGGTCCACAAGAGTTAACAAAAGCATCCCACCATCTGAGGACCTTAAGAACCCTCAATCATATGTTCCAATGCCAACAACTTCAGATGAGCGGAGTTCTTCTGAGTGCAGTGTTGACAGGGCGAACCGACTTAGCTTTGACCCTTATGATCTTCCAAATGATGTCAGACAATTGGCCCAAATAGTTTATTCTGCTCATGGTGGTGAGGTTGCAGTTGCATTCCTGCGTGGAGGTGTGCACATTTTTTCAGGTCCAAACTTTGAACAGGTTGATAGCTATCATGTCAATGTTGGCTCAGCAATTGCTCCACCAGCCTTCTCCTCCAGTGGTTGTTGCTTGGCATCAGTATGGCATGACACACTCAAAGATCGAACCATACTAAAGATAATACGTGTGCTTCCTCCTGCAATTCTTAATGCTCAGACAAAGGTTAGCTCAGCTGTTTGGGAACGAGCAATAGCAGATAGATTTTGGTGGAGTCTATTGGCTGGTGTGGATTGGTGGGATGCTGTTGGCTGCACACAAAGTGCTGCTGAAGATGGTATTGTCTCACTGAACAGTGTGATAGCTTTGCTGGACGCGGACTTCCATTGTCTTCCAACTATACAACAGAGGCAACAACACTGTCCTAATCTTGATAGGATAAAGTGTAGATTGTTGGAAGGAACAAATGCTCAAGATGTCAGAGCACTTGTGTTGGACATGCAAGCAAGATTGCTTCTGGATATGCTTGGCAAGGGAATTGAGTCTGCCCTGATAAATCCATCAACTCTGCTACCTGAACCGTGGCAAGCTTCCAGTGACATGTTATCTAGCATTGGGCCTGACAAAATGACTGTTGACCCAGCTCTACTTTTAAGCATCCAGGGGTACGTTGATGCTGTTCTAGATTTAGCGTCACATTTTATCACACGCTTGCGACGCTATGCGAGCTTCTGCCGAACTTTGGCTAGCCATGCAGTTGGAGCATCTTCTGGTTCAGGCAATTCTAGGAATATGGTTACAAGTCCAACCAACAGTTCTCCTTCACCTTCAACTAACCAAGGTAATCAAGGTGGAGTAGCGTCTACAACAGGGAGCTCACAAATGCAAGAGTGGGTCCAAGGTGCCATTGCTAAGATTAGTAACAATACTGATGGTGCTGCAAATGCTGCACCAAATCCAATTAGCGGGAGGTCATCATTCATGCCTATTAGCATAAATACGGGAACATTCCCTGGCACACCAGCTGTTAGACTTATTGGGGACTGCCATTTCCTTCATAGATTATGTCAGCTGTTGCTATTTTGTTTGCTTTTTCGGAGAAGGCAATCTCCAAGGATACCTGCAAATGCACAAAAAAGTTCTGATTCTAGCATGCAGAAACAACACTTGATGAACAGTAAGACAGAGGATAATACTTTGGCAGTCAGATCTGGTCTAGGTGCTGCCAAATTGGAAGATGGCACAACTTCACGTGGACAGATGGTTGGAGCAAAGGGTGCTGAAGAAAATCCAGTGGGCAACAAATCTGCTAGGATAGGTTCTGGCAATGCTGGCCAAGGTTATACTTCAGACGAGGTGAAAGTCCTTTTTCTCATATTAGTTGACCTATGTAAACGGACTGCAACCTTGCAACATCCGTTGCCTTCTTCTCAGGTTGGTTCGAGCAATATTATTATAAGGCTGCATTACATCGATGGCAATTACACTGTGCTCCCTGAGGTAGTGGAAGCATCTCTTGGCCCTCATATGCAGAATATGCCTCGTCCACGTGGAGCTGATGCTGCTGGCCTTCTACTTCGAGAATTAGAACTGCAGCCCCCTGCTGAAGAATGGCATAGACGCAACATGTTTGGTGGGCCATGGTCAGAACCAGATGATCTTGGTCCATTGGATAATACGCGACAGCTAAAAATCAATGGCTCTACCAATCGCCACTTATCGGACATGGAAGAGGATGGCGACAGCTCCTTTGGGATTCAAAATCTTTGGCCAAGAAAGCGCCGGTTGTCTGAAAGAGATGCAGCATTTGGTCTGAAAACATCCGTGGGGCTGGGATCTTTTCTAGGTGTGATGGGTTCTCGGAGAGATGTTATTACAGCTGTGTGGAAAACAGGCCTCGAAGGTGAATGGTACAAGTGCATACGATGTTTGAGGCAAACCTGTGCATTTGCTCAGCCTGGTGCTCTAGCTCCGAACACGTCGAATGAGCTTGAGGCATGGTGGATCAGCCGATGGACCCATGCTTGCCCAATGTGCGGTGGGACATGGGTGAAAGTCGTTTGA。
利用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix(Invitrogen)将中间载体上的DNA片段1和DNA片段2分别重组到植物表达载体pEarleyGate101上。
将上述重组载体转入农杆菌GV3101中。利用农杆菌介导的方法将其转化到烟草叶肉细胞，48h后利用激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位情况。结果显示OsMED16蛋白在烟草叶肉细胞中定位于细胞核，OsMED16蛋白突变体在烟草叶肉细胞中定位于细胞核和细胞质膜(图7中a)。另外，利用水稻原生质体进行亚细胞定位的结果与烟草叶肉细胞亚细胞定位的结果相同(图7中b)。
实施例7：OsMED16 CRISPR-cas9敲除株系的表型
使用CRISPR-P网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR/)筛选合适条件的sgRNA，最终选择MED16基因第3个外显子上的序列(GTATGGGAATCCAAAATGGT)作为sgRNA，将其构建到CRISPR载体BGK032上，获得重组载体BGK032-OsMED16-sgRNA。重组载体BGK032-OsMED16-sgRNA是将核苷酸序列GTATGGGAATCCAAAATGGT(SEQ ID No.7，即序列7)插入到BGK032载体的限制性核酸内切酶BsaI识别位点间，保持BGK032载体的其它核苷酸序列不变，得到重组载体BGK032-OsMED16-sgRNA。
将上述重组载体BGK032-OsMED16-sgRNA转入农杆菌EHA105中，通过农杆菌介导的遗传转化方法转入水稻品种日本晴(Nipponbare)成熟胚诱导的愈伤组织中，经过预培养、侵染、共培养、筛选等步骤，获得转基因植株并进行阳性鉴定。获得T0代阳性植株osmed16-3、osmed16-5、osmed16-6和osmed16-8，其中osmed16-5为纯合体，其余3个株系均为杂合体(图8)。
osmed16-5纯合体与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中OsMED16的基因发生了突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的OsMED16的基因组基因均发生了如下变化：序列表中序列3的第1648位至1649位之间插入了的1个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在204位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除。
osmed16-3杂合体与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中OsMED16的基因发生了突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的OsMED16的基因组基因分别发生了如下变化：一条染色体的序列表中序列3的第1646位至1649位之间缺失了2个脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在203位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除；另一条染色体的序列表中序列3的第1641位至1652位之间的10个脱氧核糖核苷酸(CCCACCATTT)突变为5个脱氧核糖核苷酸(TCTAA)，导致编码蛋白在202位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除。
osmed16-6杂合体与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中OsMED16的基因发生了突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的OsMED16的基因组基因分别发生了如下变化：一条染色体的序列表中序列3的第1648位至1649位之间插入了的1个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在204位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除；另一条染色体的序列表中序列3的第1624位至1658位之间缺失了33个脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在169位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除。
osmed16-8杂合体与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中OsMED16的基因发生了突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的OsMED16的基因组基因分别发生了如下变化：一条染色体的序列表中序列3的第1646位至1648位之间缺失了1个脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在178位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除；另一条染色体的序列表中序列3的第1647位至1648位之间插入了的1个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，导致编码蛋白在204位氨基酸处提前终止，从而将OsMED16基因敲除。
将osmed16-3、osmed16-5、osmed16-6和osmed16-8与野生型水稻日本晴在光周期为14h光照/10h黑暗，温度为28℃的温室环境下进行持续培养。
结果表明，与野生型日本晴(Nip)相比，OsMED16敲除株系也产生了类病斑表型，同时所有4个株系均在营养发育阶段表现出极其弱小、矮化和产生病斑的表型，培养60天后表型十分显著,并最终在生长70天后死亡。另外，纯合株系osmed16-5的表型比其它3个杂合株系的表型更加严重并且更早死亡(图9)。
实施例8：水稻类病斑基因OsMED16在育种中的应用
(1)在生产实践中，可利用水稻类病斑突变体spl38及OsMED16突变基因，通过常规杂交、分子标记辅助选择或基因工程等手段将OsMED16的突变基因引入水稻，可以显著增强转基因水稻对真菌病害(如稻瘟病等)及细菌病害(如水稻白叶枯病等)的抗性，进而改良水稻品种。
(2)在生产实践中，对于一些需要延迟开花的作物而言，可以通过异源表达OsMED16突变基因的方式来达到延迟开花的目的。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。对于本领域的普通技术人员来说，从本发明公开的内容直接导出或修改或对其中部分技术特征进行等同替换，均应认为是本发明的保护范围。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在下述任一种的应用：
A1)调控植物抗病性中的应用和/或制备调控植物抗病产品中的应用；
A2)调控植物分蘖数和/或制备调控植物分蘖数产品中的应用；
A3)调控植物开花时间和/或制备调控植物开花时间中的应用；
A4)调控植物OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达和/或制备调控植物OsPR1a基因、OsPR1b基因、OsPR10基因、OsNPR1基因、OsWRKY45基因和OsAOS2基因的表达产品中的应用；
所述蛋白质为如下任一种：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗病性相关的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白来源于水稻。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
D1)抑制或降低或下调权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；
D2)表达D1)所述核酸分子的编码基因；
D3)含有D2)所述基因的表达盒；
D4)含有D2)所述基因的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D2)所述基因的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物；
D6)含有D2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有D3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有D4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
D7)含有D2)所述基因的转基因植物组织、或含有D3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有D4)所述重组载体的转基因植物组织；
D8)含有D2)所述基因的转基因植物器官、或含有D3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有D4)所述重组载体的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，D1)所述核酸分子为靶向权利要求1或2中所述蛋白编码基因的gRNA，所述gRNA的靶标序列为序列表中序列7。
5.如权利要求1-4中任一所述的用途，其特征在于，所述植物为如下任一种：
G1)双子叶植物或单子叶植物；
G2)禾本科植物；
G3)稻属植物；
G4)水稻。
6.一种培育高抗病性植物的方法，其特征在于，其特征在于包括敲除或抑制或降低或下调目的植物中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到高抗病性植物，所述高抗病性植物的抗病性高于所述目的植物。
7.一种培育晚花植物的方法，其特征在于，包括敲除或抑制或降低或下调目的植物中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量得到晚花植物，所述晚花植物的开花时间晚于于所述目的植物。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述敲除或抑制或降低或下调植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入以序列7为靶序列的基因敲除载体。
9.一种培育高抗病性植物和/或晚花植物的方法，将目的植物的基因组进行如下任一操作：
K1)将目的植物基因组序列表中序列3的第1648位至1649位之间插入1个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸残基；
K2)将目的植物基因组序列表中序列3的第1646位至1649位之间的2个脱氧核糖核苷酸残基进行缺失突变；
K3)将目的植物基因组序列表中序列3的第1641位至1652位之间序列为CCCACCATT的脱氧核糖核苷酸残基突变为序列为TCTAA的脱氧核糖核苷酸残基；
K4)将目的植物基因组序列表中序列3的第1624位至1658位之间的33个脱氧核糖核苷酸残基进行缺失突变；
K5)将目的植物基因组序列表中序列3的第1646位至1648位之间缺失1个脱氧核糖核苷酸残基；
K6)将目的植物基因组序列表中序列3的第1647位至1648位之间插入1个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。
10.如权利要求1-5任一所述的用途、权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述植物为如下任一种：
J1)双子叶植物或单子叶植物；
J2)禾本科植物；
J3)稻属植物；
J4)水稻。
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